FR2553420A1 - Nouveaux oligodesoxynucleotides et polydesoxynucleotides utiles comme agents antiviraux - Google Patents

Abstract

NOUVEAUX OLIGODESOXYNUCLEOTIDES ET POLYDESOXYNUCLEOTIDES UTILES COMME AGENTS ANTIVIRAUX; CES NOUVEAUX COMPOSES SONT IDENTIQUES PAR LA SEQUENCE D'ADN A UNE PORTION DE LA STRUCTURE D'ADN HYBRIDABLE A UN ARN MESSAGER PRODUIT LORS DE LA PROPAGATION D'UN VIRUS, LA STRUCTURE ETANT CAPABLE D'HYBRIDATION AVEC L'ARN MESSAGER; L'APPORT D'UN OU PLUSIEURS DE CES COMPOSES A UN EMPLACEMENT OU IL EXISTE UN ARN MESSAGER PRODUIT PAR LA PROPAGATION D'UN VIRUS, INHIBE LA PROPAGATION DE CE VIRUS ET PERMET DONC LE TRAITEMENT DE MALADIES VIRALES.

Description

La présente invention concerne de nouveaux oligodésoxynucléotides et

polydésoxynucléotides utiles comme agents antiviraux. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé 5 pour inhiber la propagation d'un virus dans lequel on applique un oligo ou polydésoxynucléotide à l'emplacement infecté par un

virus, ainsi qu'un agentantiviral contenant un oligo ou polydésoxynucléotide spécifique.

Dans les premiers temps du traitement des maladies provoquées par les virus, des médicaments synthétisés chimiquement et des antibiotiques ont été employés comme agents antiviraux pour inhiber la propagation des virus Cependant, dans le cas des médicaments synthétisés chimiquement, leur spectre antiviral est assez étroit et des effets secondaires nuisibles provoqués par ces médi15 caments posent souvent des problèmes D'autre part, dans le cas des antibiotiques, l'inconvénient est que la mise au point de nouveaux types d'antibiotiques est toujours nécessaire en plus des efforts pour réduire tout effet secondaire nuisible manifesté par les antibiotiques, car les virus deviennent résistants aux antibiotiques utilisés et, finalement, s'immunisent contre eux au

cours du temps.

Avec le développement récent de la biotechnologie, en particulier du génie génétique, l'identification des gènes structuraux des virus est dévenue un thème important des recherches effectuées dans l'étude des micro-organismes En 1977, S C Inglis et coll ont décrit la traduction in vitro de 'ARN cytoplasmique extrait de fibroblastes d'embryon de poussin infectés par le virus grippal A dans un système de synthèse des protéines à base de germe de blé ne contenant pas de cellules, avec pour résultat 30 une diminution de la synthèse du polypeptide spécifique du virus correspondant au segment de v-ARN hybridé lVirology 78, 522-536 ( 1977)l Cependant, les expériences indiquées dans cette référence ont été effectuées dans un système dépourvu de cellules n'ayant pas de rapport avec l'étude des médicaments Une telle identification 35 structurale d'un gène est également indiquée par B M Paterson et coll dans Proc Natl Acad Sci, USA, 74, 4370-4374 ( 1977) Les expériences de Paterson et coll ont également été effeetuéee avec un système dépourvu de cellules Dans ces deux références, on utilise, pour inhiber la synthèse d'une protéine, une structure génétique énorme telle que 'ARN lui-même extrait du virus grippal 5 dans la première référence mentionnée ou de 9-g Iobine de clone PPG 1 de lapin dans la seconde référence mentionnée On ne peut pas

espérer qu'une telle structure énorme inhibe la synthèse intracellulaire d'une protéine.

En 1978, P C Zamecnik et coll ont indiqué qu'un oligodésoxynucléotide tridécamère complémentaire des nucléotides 3 ' et 5 '-terminaux réitérés du virus du sarcome de Rous (RSV) est un inhibiteur efficace de la synthèse d'une protéine spécifiée par ARN viral dans le système à base de blé dépourvu de cellules lProc Natl Acad Sci, USA, 75, 285-288 ( 1978)l et dans un

système de culture tissulaire in vitro libid, 75, 280-284 ( 1978)l.

En ce qui concerne la première référence, le système dépourvu de cellules est encore utilisé comme précédemment mais une certaine amélioration existe en ce qui concerne l'emploi d'un ADN ayant une structure moléculaire plus petite pour inhiber la traduction en la 20 protéine Dans la seconde référence, les expériences sont effectuées en utilisant le tridécamère dans un système de culture tissulaire

pour inhiber la réplication du virus et la transformation des cellules.

L'ADN utilisé dans ces références pour inhiber la réplication et la transformation est choisi dans une région autre qu'une région 25 codante spécifique et n'est pas souhaitable La même année, N D. Hastie et coll ont également indiqué que l'hybridation du m ARN de globine avec le c ADN correspondant inhibait de façon spécifique la traduction du m ARN dans un système dépourvu de cellules libid, 75, 1217-1221 ( 1978)l La seule nouveauté de cette référence est qu'une 30 certaine région codante d'ADN est choisie pour inhiber la traduction par hybridation du m ARN Cependant, les expériences mentionnées ont toujours été effectuées dans un système dépourvu de cellules On cherche à mettre au point des médicaments reposant sur cette théorie depuis la publication de ces références en 1978 Cependant, à ce jour, rien n'a été publié relativement à un dispositif pour appliquer

pratiquement cette théorie à des expériences in vivo.

En 1983, a été publiée la demande de brevet PCT US 82/01447 du 8 10 82, concernant un agent thérapeutique constitué d'un oligonucléotide et des procédés pour sa préparation (Molecular Biosystems INC, Intl Publn, n W 083/01451) Cependant, ce que révèle cette demande est la simple indication qu'un brin d'ADN (-) choisi dans une certaine région codante inhibait des cellules transformées

par le SV 40.

Bien que l'expression "in vivo" soit souvent utilisée dans l'exemple I de cette référence, les descriptions auxquelles

on se réfère suggèrent apparemment, dans le contexte, des expériences in vitro dans un système de culture cellulaire Même si de telles expériences in vitro sont considérées comme des expériences in vivo, leurs conditions concrètes ne sont pas exposées et elles ne constituent que la simple mention d'effets souhaitables prévus De toute façon, cette référence suggère pour la première fois l'emploi d'une technique d'hybridation ARNADN à un médicament, mais ne

présente pas de descriptions détaillées établissant l'utilisé comme

médicament et n'est rien d'autre qu'un simple agrégat des faits

connus à ce stade Donc, cette demande de brevet ne va pas au-delà 20 du niveau technique décrit dans les références précitées.

Dans les circonstances précédemment exposées, on s'efforce de fournir un agent antiviral d'un type entièrement nouveau par développement de la théorie de l'inhibition de la

traduction du m ARN du virus selon la technique d'hybridation ARN-ADN 25 pour réaliser l'inhibition de la propagation in vivo du virus.

Un des buts de l'invention est de fournir un procédé pour inhiber la propagation d'un virus qui comprend l'apport de l'oligo ou du polysésoxynucléotide spécifique à l'emplacement

infecté par le virus.

Un autre but de la présente invention est de fournir

un nouveau type d'agent antiviral comprenant un oligo ou polydésoxynucléotide spécifique.

Un autre but de l'invention est de permettre l'emploi d'un oligo ou polydésoxynucléotide identique par sa séquence d'ADN 35 à une portion de la structure d'un ADN bybrida$le avec un m ARN produit lors de la propagation d'un virus, la structure étant capable d'hybridation avec le m ARN, pour inhiber la propagation

du virus.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de

l'invention apparaltront mieux à la lecture de la description qui suit.

De plus, l'invention sera mieux comprise à la lecture

de la description qui suit faite en regard des dessins annexés

dans lesquels: la figure 1 est un graphique montrant le résultat d'expériences qui démontrent les effets inhibiteurs de l'oligo10 désoxynucléotide (le 20 A) sur les effets cytopathogènes de l'HSV-l; la figure 2 est un graphique montrant le résultat d'expériences qui démontrent les effets inhibiteurs de l'oligodésoxynucléotide (le 20 A) sur la propagation des virus; la figure 3 est un graphique montrant l'effet d'une 15 certaine combinaison des oligodésoxynucléotides pour l'inhibition de la multiplication des virus et de leur effet pathogène par rapport à l'emploi d'un oligodésoxynucléotide unique; et la figure 4 est un graphique montrant le résultat

d'expériences conçues pour démontrer in vivo l'efficacité de 20 l'agent antiviral de l'invention (chez un animal vivant).

L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée.

La demanderesse a découvert que, lorsqu'un oligodésoxynucléotide ou un polydésoxynucléotide identique par la séquence d'ADN à une portion de la structure d'ADN hybridable au m ARN produit 25 lors de la propagation d'un virus est apporté à l'endroit o le m ARN existe, la structure étant capable d'hybridation avec le m ARN, la propagation du virus est inhibée de façon efficace Par administration des oligo et polydésoxynucléotides à des animaux infectés par un virus, la demanderesse est parvenue à fournir un agent 30 antiviral capable d'inhiber efficacement la propagation in vivo

du virus L'invention-repose sur cette découverte.

Comme précédemment décrit, l'hybridation d'un ARN de virus ou de globine avec l'ADN correspondant pour l'inhibition de la synthèse des protéines est connue par les références précitées. 35 Cependant, la majorité des expériences qui y s'ont décrites a été effectuée dans un système dépourvu de cellules, à l'exception de

la seconde référence de Zamecnik (Proc Natl Acad Sci, USA, 75, 280-284) et de la référence de Molecular Biosystem Inc (PCT, Intl.

Publn n W 083/01451) décrivant l'inhibition de la propagation d'un virus dans un système de culture cellulaire in vitro Dans les expériences in vitro de Zamecnik, l'ADN est cependant choisi dans une région autre qu'une région spécifique codant pour le virus On entend par le terme "région codante", des régions des gènes viraux qui sont la cause (déterminent la séquence d,'aminoacides) des protéines virales et qui subissent la transcription par une ARN polymérisase 10 pour produire le m ARN D'autre part, la référence de Molecular

Biosystem Inc n'indique pas les conditions concrètes des expériences.

La demanderesse a effectué des'recherches et des expériences importantes dans des systèmes in vitro et in vivo en utilisant des oligodésoxynlucléotides ou des polydésoxynucléotides spécifiques choisis à 15 partir d'une région codante spécifique et est parvenue pour la première fois à appliquer la théorie d'inhibition de la propagation des virus reposant sur la technique d'hybridation ARN-ADN à un niveau utilisable pratiquement en thérapeutique, ce qui permet l'emploi des oligodésoxynucléotides ou polydésoxynucléotides comme médicaments pour inhiber la propagation des virus L'invention diffère donc nettement de l'art antérieur en ce qui concerne deux principes: le choix dans une région codante spécifique d'un ADN qui est hybridable avec le m ARN d'un virus et l'emploi d'un désoxynucléotide à brin unique ayant une longueur de chalne courte comme ADN choisi dans la région codante spécifique, et est également remarquable par le développement des principes ci-dessus à un niveau utilisable en

pratique grace à de nombreuses expériences in vivo.

L'invention fournit donc un procédé pour inhiber la propagation des virus qui consiste à apporter un ou plusieurs oligodésoxynucléotides ou polydésoxynucléotides en un emplacement o un m ARN produit par la propagation d'un virus existe, caractérisé en ce que les oligodésoxynucléotides ou les polydésoxynucléotides

sont identiques par la séquence d'ADN à une portion de la structure d'ADN hybridable avec le m ARN, la structure étant capable d'hybri35 dation avec le m ARN.

L'invention fournit également un agent antiviral qui comprend une quantité efficace d'un oligodésoxynucléOtide ou polydésoxynucléotide avec un véhicule ou excipient liquides classiques, caractérisé en ce que l'oligodésoxynucléotide ou le polydésoxynucléotide est identique par la séquence d'ADN à une portion de la 5 structure d'ADN hybridable avec un m ARN produit lors de la propagation du virus, la structure étant capable d'hybridation avec

le m ARN.

La demanderesse a découvert tout d'abord que, lorsqu'un ARN synthétique, tel que du m ARN, est traduit dans un système in 10 vitro de synthèse de protéine, la synthèse de protéine est inhibée

par un oligodésoxynucléotide qui s'hybride avec 1 'ARN synthétique.

(voir l'exemple 25 décrit ci-dessous).

Les oligodésoxynucléotides qui ne s'hybrident pas avec

l'ARN n'inhibent pas la synthèse de protéine dans ce système.

La demanderesse a ensuite découvert que les oligodésoxynucléotides de la séquence de brin (-) d'un ADN d'a-globine ou de

p-globine inhibent la traduction du m ARN correspondant (voir.

l'exemple 26 décrit ci-dessous) Les résultats de l'expérience ont montré que l'ADN 20 d'a-globine inhibe spécifiquement la traduction dum ARN d'aglobine dans le système in vitro De plus, ils ont montré que l'ADN de pglobine inhibe spécifiquement la traduction du m ARN de P-globine dans ce système De plus, lorsqu'on a utilisé de l'ADN qui ne s'hybride pas avec le m ARN d'a-globine, la production d'a-globine 25 n'a pas été inhibée De façon semblable, la production de P-globine n'a pas été inhibée par de l'ADN ne s'hybridant pas avec le m ARN de p-globine On a de plus découvert que non seulement de l'ADN à chaîne longue, mais également des oligodésoxynucléotides ont un effet inhibiteur puissant dans ce système par suite d'une hybridation. 30 A partir de ces expériences, des expériences complémentaires concernant une infection par l'herpèsvirus (HSV) ont été effectuées Lorsque de l'ADN ou des oligodésoxynucléotides capables d'hybridation avec le m ARN immédiat précoce de l'HSV ont été administrés à des cellules infectées par ce virus, le nombre des syncytiums (trous semblables à une plaque produits par l'HSV par fusion des cellules infectées) provoquées par i'HSV est fortement réduit. Dans les expériences ci-dessus, du Ca C 12 et du phosphate de calcium ont été utilisés ensemble avec l'ADN pour stimuler la pénétration de l'ADN dans les cellules Cependant, dans des expériences séparées, il a été constaté que l'oligodésoxynucléotide peut être fixé, même en l'absence de ces sels de calcium, et inhibe donc la propagation de i'HSV et ses effets cytopathogènes (voir

l'exemple 7 décrit ci-dessous).

Il est ressorti de ces expériences que le brin (-) d'ADN qui s'hybride avec un m ARN d'HSV-l inhibe la formation de syncytium par ce virus A partir de cette observation, la demanderesse a de plus appliqué cet ADN à des souris infectées par l'HSV et a démontré que cet ADN pouvait être utilisé comme agent antiviral in vivo pour le

traitement des maladies virales.

Il convient ici de remarquer que seul le brin négatif 15 d'ADN spécifique du m ARN de ce gène viral particulier est utilisé conmme composant efficace dans l'agent et le procédé de l'invention.

Donc, la biosynthèse d'une protéine cellulaire programmée par d'autres

m ARN ne serait pas influencée par l'emploi de l'ADN précité.

Il existe deux groupes de virus: les virus à ADN 20 (herpèsvirus, adénovirus, virus de la vaccine, etc) et les virus à ARN (virus grippal, rhinovirus et poliovirus: etc) Les virus à ARN portent comme génome soit un ARN à simple brin, soit un ARN à

double brin Les virus à ARN à simple brin sont subdivisés en ceux portant de 'ARN à brin plus et ceux portant de 'ARN à brin moins 25 comme leur génome.

Les protéines virales doivent toujours être synthétisées par traduction d'un m ARN viral qui est un ARN à brin (+) Les virus à génome d'ADN à double brin produisent un m ARN (brin (+)) à partir de leur brin (-) d'ADN Dans le cas des virus à double brin d'ARN, 30 le m ARN(à brin (+)) est produit à partir de 'ARN à brin (-) Le génome des virus à ARN à brin (+) se comporte lui-même comme un m ARN, tandis que les virus à ARN à brin (-) utilisent leur ARN comme modèle

pour la production de 'ARN à brin (#) (m ARN).

Selon l'invention, la traduction d'un m ARN viral, et donc 35 la synthèse des protéines virales, est, indépendamment du mécanisme de synthèse du m ARN, inhibée par un ADN à brin (-) hybridant Bien que suls des exemples dans lesquels on utilise l'herpèsvirus (virus à ADN à double brin) et le virus grippal (virus à ARN à simple brin) soient présentés ici, l'invention peut être utilisée de façon générale pour l'inhibition de la propagation des virus Donc, la propagation de virus, tels que le virus grippal, un adénovirus, un virus leucémique, le virus de la dengue, le virus rabique, un virus de l'hépatite, le virus morbilleux, un virus de l'encéphalite, un virus parainfluenza, un rhinovirus, le virus de la fièvre jaune et le virus Epstein-Bar,

peut être inhibée par le procédé et l'agent de l'invention.

Donc, l'invention peut être utilisée de façon générale pour la prévention ou le traitement de diverses maladies des aninaux

et des plantes provoquées par des virus Les compositions pharmaceutiques correspondantes sont donc très utiles dans divers domaines.

Selon le procédé de l'invention, la propagation de virus 15 à ARN ou à ADN et leurs effets cytopathogènes peuvent être arrêtés

sans effet sur les cellules hôtes De plus, l'infection de cellules hôtes non infectées peut être évitée par le procédé de l'invention.

La demanderesse a découvert que les oligodésoxynucléotides seuls s'hybridant au m ARN précoce immédiat de l'herpèsvirus n'ont pas d'effet sur les cellules rénales d'hamsters nouveau-nés non infectées (cellules BHK) ni d'effet sur la souris On en conclut donc que les oligodésoxynucléotides n'ont pas d'effet nuisible sur les cellules normales ou les animaux normaux ni aucun effet sur la vitesse de

développement de ces cellules.

Les désoxynucléotides à brin négatif utilisés dans l'invention peuvent être obtenus par hydrolyse enzymatique d'ADN, dénaturation puis séparation par chromatographie d'affinité Sinon, on peut utiliser des oligodésoxynucléotides à brin négatif synthétiques Il est donc évident que les désoxynucléotides à brin négatif 30 utilisés dans les expériences décrites ici peuvent être obtenus selon

divers procédés.

Dans le clonage d'un gène de virus à ARN, on peut utiliser la transcriptase réverse Dans certains cas, l'ADN viral présent dans des cellules infectées et provenant du génome de virus à ARN 35 peut être utilisé Comme véhicule de clonage, on peut utiliser

comme vecteur le phage lambda (phage Charon) ou le plasmide p BR 322.

Pour obtenir un ADN à brin (-) unique, on utilisera comme vecteur

le phage M 13.

Selon l'invention, on peut utiliser l'ADN cloné de la

région codante d'une partie quelconque des génomes viraux totaux.

Cependant, les gènes précoces ou précoces immédiats, dont l'expression est observée dans les stades primitifs de l'infection, sont particulièrement souhaitables pour la prévention de la propagation des virus

et des effets cytopathogènes concomitants.

Un phage M 13 recombinant contenant un ADN viral à brin 10 négatif ou un vecteur d'ADN recombinant contenant l'ADN viral à double brin peut être produit par culture de quantités importantes de E coli hébergeant ces vecteurs ou d'E coli infecté par le phage M 13 Des vecteurs contenant les gènes viraux ont été isolés et soumis à l'action d'une endonucléase de restriction pour produire 15 l'excision des gènes viraux Le mélange des gènes viraux excisés et de l'ADN vecteur a ensuite été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose ou une chromatographie sur une colonne de Sephadex pour séparer l'ADN de gène viral de l'ADN vecteur Les molécules d'ADN ainsi obtenues ont été raccourcies par digestion partielle avec 20 une endonucléase de restriction de l'ADN ou un traitement par les ultrasons La longueur de la chaîne des fragments d'ADN viral a été ajustée à une valeur quelconque entre 9 et 100 nucléotides par

isolement de ces brins d'ADN par électrophorèse sur gel et chromatographie sur Sephadex.

Il convient de noter que seul le brin négatif de l'ADN

viral est efficace pour inhiber la synthèse des protéines virales.

Lorsque l'ADN de vecteur, tel que le p BR 322, le phage lambda, et la forme réplicative du phage M 13, est un ADN à double brin, cet ADN à double brin doit être transformé en un ADN à simple brin, après 30 quoi on isole l'ADN a brin négatif A cet effet, on peut utiliser divers procédés Par exemple, on dénature l'ADN par chauffage à 100 C

pendant 10 min et on refroidit rapidement.

A partir d'un mélange des ADN à brins négatif et positif séparés, on peut isoler l'ADN à brin négatif, par exemple par chromatographie d'affinité A cet effet, on prépare tout d'abord l'ADN à brin positif par clonage dans le phage M 13 Celui-ci est ensuite conjugué à une matière support pour chromatographie On fait ensuite passer un mélange d'ADN à brin négatif et à brin positif à travers la colonne conjuguée à l'ADN positif Le brin négatif d'ADN est fixé à cette colonne, tandis que le brin positif d'ADN traverse

la colonne Le brin négatif d'ADN fixé est ensuite élué de la colonne.

Dans un autre procédé d'obtention du brin négatif d'ADN,

on le synthétise chimiquement sous forme d'oligo ou de polydésoxynucléotides selon un procédé de synthèse de chimie organique approprié.

Dans le cas de l'herpèsvirus,par exemple, un des gènes d'ADN précoces immédiats, Vmw 175, a un double brin constitué d'un

ADN (+) ( 5 '-ATG GCG TCG GAG) et un ADN (-) ( 3 '-TAC CGC AGC CTC).

Seul l'ADN (-) ayant une séquence commençant par TAC peut être hybridé avec un i ARN de Vmw 175 Donc, il faut sélectionner et synthétiser sous forme d'un oligodésoxynucléotide de l'ADN identique par une structure partielle au brin (-) d'ADN Le génome du virus 15 grippal comprend le gène de l'hémagglutinine et des gènes NS (non structuraux) Comme les gènes de l'hémagglutine de virus grippaux correspondant à des sérotypes différents varient par leur séquence d'ARN, la séquence d'un ADN à brin unique qui s'hybride avec le m ARN des gènes NS est préférée dans l'invention L'hybridation de brin (-) 20 d'ADN avec le m ARN des gènes NS est plus souhaitable que l'hybridation avec le m ARN du gène de l'hémogglutinine car le gène de l'hémagglutinine présente des mutations très fréquentes et le

brin (-) d'ADN s'hybridant avec le m ARN du gène de l'hémagglutinine d'une souche isolée du virus grippal peut ne pas présenter d'hybri25 dation croisée avec le m ARN du gène de l'hémagglutinine d'une souche de virus grippal correspondant à un autre sérotype.

Des détails complémentaires sur le gène NS-1 du virus grippal sont fournis par exemple par Lamb et coll lCell 21, 47

( 1980)l La séquence d'ADN qui s'hybride avec un m ARN de gène NS-1 30 est 5 '- ACT TGA CAC AGT GTT GGA ATC CAT -3 ') Donc, on peut choisir la totalité ou une partie de cette séquence et la synthétiser.

L'invention peut également s'appliquer à des virus concernant le domaine des industries des volailles et du bétail, tels que le virus du sarcome de Rous Par exemple, l'inhibition de 35 l'expression d'un des gènes úag, pol et env de ce virus inhibe la propagation de ce virus Si par exemple on désire l'inhibition de l'expression du gène úag par une molécule d'ADN s'hybridant, on peut sélectionner un oligo ou polydésoxynucléotide comprenant une partie de la séquence 5 '- AAT CAT CTT TAT GAC GGC TTC -3 ' et la synthétiser, en prenant en considération la séquence d'ARN de

P 19 qui constitue une partie du gène &ai.

Il ressort de façon évidente des explications précédentes qu'en principe, pour l'inhibition de la propagation d'un virus par un ADN à un seu brin à brin (-), il faut sélectionner un ADN à un

seul brin efficace qui s'hybride avec un m ARN de ce virus.

De façon générale, le terme "oligodésoxynucléotide" désigne 10 une molécule ayant un nombre de motifs de désoxynucléotides réduit, tandis que le terme "polydésoxynucléotide" désigne une molécule ayant un nombre de motifs de désoxynucléotides plus important Selon l'invention, par exemple, le nombre des motifs de nucléotides des oligodésoxynucléotides est ordinairement d'au plus 25 Donc, les désoxy15 nucléotides ayant plus de 25 motifs de désoxynucléotides peuvent

être appelés "polydésoxynucléotides" dans la présente invention.

Les agents antiviraux de l'invention contenant l'oligoet/ou le polydésoxynucléotide avec un véhicule ou excipient liquides appropriés et, éventuellement, un ou plusieurs additifs auxiliaires 20 sont préparés sous forme de préparations liquides, d'injections, de suppositoires, etc selon des procédés connus Pour la prescription, les oligodésoxynucléotides et polydésoxynucléotides désirés peuvent être utilisés isolément ou en combinaison avec d'autres ingrédients à activité pharmacologique Dans ce cas, il est évident que ces

autres ingrédients ne doivent pas avoir un effet nuisible sur l'activité antivirale des oligo et polydésoxynucléotides.

Les oligo et polydésoxynucléotides peuvent, au besoin, être présentés sous forme de préparations à usage externe, telles que des crèmes, pommades, liquides et emplâtres, par mélange de l'oligo30 ou du polydésoxynucléotide constituant l'ingrédient actif avec un

véhicule ou excipient inerte approprié.

Les véhicules ou excipients liquides ainsi que les additifs auxiliaires éventuels utilisés dans les agents antiviraux

de l'invention sont classiques et commercialisés.

Des exemples de véhicules ou excipients liquides et

d'additifs auxiliaires utiles pour la préparation des agents anti-

-i viraux sont par exemple l'eau distillée injectable, le soluté salé physiologique, une solution aqueuse de dextrose, des huiles végétales injectables, le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol et l'alcool benzylique (pour les préparations injectables et liquides); la vaseline, une huile végétale, une graisse animale et un polyéthyleneglycol (pour les préparations externes); et des agents d'isotonicité, des agents favorisant la dissolution, des stabilisants, des colorants, des agents antiseptiques, des agents adoucissants et des additifs semblables (comme additifs auxiliaires habituels des préparations 10 pharmaceutiques) Dans le cas des préparations injectables, l'ingrédient actif peut, de façon souhaitable, être dissous dans des véhicules liquides stérilisés Il est évident que les divers véhicules et excipients liquides et additifs auxiliaires précités ne doivent ni

inhiber ni perturber l'activité antivirale des oligo et polydésoxy15 nucléotides.

Les oligo et polydésoxynucléotides de l'invention sont additionnés des véhicules ou excipients précités éventuellement

avec les additifs auxiliaires précités selon des procédés connus.

Les préparations injectables et les suppositoires peuvent généralement 20 contenir 1 à 10 mg des oligo et polydésoxynucléotides par ampoule ou par capsule Pour les malades humains, la dose journalière est d'environ 0,11000 mg, de préférence de 1-100 mg (de 10 à 20 pg/kg à 1000 à 2000 pg/kg de poids corporel) Cependant, la posologie particulière pour chaque malade dépend d'une gamme étendue de facteurs, par exemple de l'efficacité de l'oligo ou du polydésoxynucléotide particulier utilisé, de l'âge, du poids, de l'état général de santé, du sexe, de l'alimentation, du moment et du mode d'administration, de la vitesse d'élimination, de la combinaison avec d'autres

médicaments utilisés conjointement et de la gravité des affections 30 particulières contre lesquelles on applique le traitement.

Les agents antiviraux de l'invention sont administrés par voie intraveineuse ou appliqués directement à la partie du corps d'un malade infecté par un virus pour que l'oligo ou le polydésoxynucléotide puisseêtre apporté efficacement à la région infectée.

L'invention est illustrée de façon plus détaillée par les

exemples non limitatifs et exemples de référence qui suivent.

Les exemples 1 à 5 concernent la préparation des oligoet polydésoxynucléotides utilisés dans l'invention.

Exemple 1

On isole l'ADN de l'herpèsvirus par extraction par le phénol et le chloroforme On met l'ADN isolé à digérer avec l'enzyme de restriction Bam HI. On mélange ensuite l'ADN soumis à la digestion en présence de ligase du phage T 4 avec de l'ADN du plasmide p BR 322 préalablement

traité avec Bam HI.

On met le mélange obtenu contenant les plasmides soudés en contact avec E coli et on sélectionne les bactéries contenant le plasmide recombinant en les incubant sur des boltes de gélose contenant de l'ampicilline pour former des colonies dont on teste la sensibilité à la tétracycline Parmi les colonies sensibles à la 15 tétracycline, on sélectionne celles contenant l'ADN de l'herpèsvirus selon la méthode d'hybridation sur filtre avec, comme sonde, de l'ADN d'herpèsvirus marqué au P Pour obtenir l'ADN de plasmide recombinant, on place 2 x 106 107 cellules d'E coli contenant le plasmide recombinant dans 2 ml de TSB (Tryptose Soy Broth). 20 On agite le milieu ensemencé dans un tube à essai de ml à 37 C pendant environ 15 h jusqu'à ce que l'absorption optique (densité optique: DO) du milieu de culture à 540 nm atteigne 0,5 (D 0540 = 0,5) A ce moment, on ajoute du chloramphénicol à une concentration finale de 100 ug/ml et on poursuit l'incubation 25 pendant 15 h. On centrifuge ensuite la suspension de bactéries et on remet le culot en suspension dans un tampon contenant 25 % de saccharose et 50 m M de Tris-H Cl (p H: 8,0) On laisse reposer la suspension à O O C pendant 5 min On ajoute à cette suspension 4 ml 30 de Triton X 100 et on centrifuge la solution visqueuse obtenue pendant 30 min à O C à 30 000 g Au surnageant de cette solution ( 8 ml), on ajoute 8 g de Cs C 1 l et 1 ml d'une solution de bromure d'éthidium ( 5 pgde bromure d'éthidium/ml) On centrifuge de plus le mélange pendant 48 h à 100 000 g On mélange la fraction de plasmides brute après cette centrifugation avec 2 volumes d'alcool isopropylique et on laisse reposer pendant quelques minutes On élimine la couche supérieure et on dialyse la solution contenant l'ADN contre du Tris-H Cl 0,1 M et de V'EDTA 10 m M (p H: 8,0) pendant

une nuit.

On concentre la solution dialysée et on traite la solution contenant 2001 gd'ADN avec un excès d'enzyme de restriction (Bam HI) On sépare le produit de digestion de V'ADN par électrophorèse sur agarose et on isole l'ADN de l'herpèsvirus du gel selon la méthode d'électroélution On soumet de plus l'ADN à une digestion partielle par la D Nase et on chauffe à 100 C pendant 10 min puis on refroidit rapidement On obtient ainsi de l'ADN ayant des chaînes

longues de 9 à 100 oligodésoxynucléotides.

Exemple 2

On découpe avec Bam HI V'ADN de la forme réplicative du phage M 13 (ADN à double brin) On mélange cet ADN de M 13 15 ayant subi une digestion avec de l'ADN d'herpèsvirus qui a été

soumis à une digestion par Bam HI et on isole comme décrit ci-dessus.

On soude ensuite avec la ligase du phage T 4 On introduit ensuite l'ADN soudé dans E coli en présence de Ca C 12 On étale les bactéries transformées sur des boîtes de gélose en utilisant la 20 gélose de recouvrement contenant de V'IPTG (isopropyl-9-D-thiogalactopyrannoside) et du X-gal (un indicateur) Les phages M 13 recombinants contenant l'ADN d'herpèsvirus forment des plages incolores en 24 h Les phages M 13 sans insertion forment des plages bleues On choisit donc les plages incolores Pour sélec25 tionner les phages M 13 recombinants contenant l'ADN d'HSV à brin (-), on détermine la capacité des phages à s'hybrider avec l'ADN d'HSV (+) marqué synthétisé chimiquement On sélectionne ainsi les phages M 13 contenant une partie du brin (-) de l'ADN d'HSV On multiplie les phages M 13 recombinants et on isole de ces phages, un ADN a brin unique Pour une purification complémentaire de cet ADN d'HSV à brin unique, on peut éliminer l'ADN du phage M 13 du mélange par digestion avec une enzyme de restriction en présence de certains oligodésoxynucléotides Sinon, le mélange d'ADN sans purification peut être soumis à une digestion partielle 35 avec une D Nase et les oligodésoxynucléotides ayant des longueurs

des chaines entre 9 et 100 peuvent être isolés.

Exemple 3

On utilise un synthétiseur d'ADN (Applied Biosystem Company) pour synthétiser l'ADN a brin moins du gène précoce immédiat (Vmw 175 ou ICP 4) de l'herpèsvirus Dans cet exemple, on synthétise la séquence d'ADN 3 'CGC AGC CTC TT Go TTC GTC GC-5 ' qui s'hybride avec le m ARN de Vmw 175 Ce désoxynucléotide est un eicosamère et on l'appelle ci-après pour simplifier 20 A.

Exemple 4

On utilise un synthétiseur d'ADN (Applied Biosystem 10 Company) pour synthétiser l'ADN à brin moins du gène précoce immédiat (Vmw 12) de l'herpèsvirus Dans cet exemple, on synthétise la séquence d'ADN 3 '-GCA CCC GGG ACC TTT ACC GC-5 ' qui s'hybride avec le m ARN de Vmw 12 Ce désoxynucléotide est un eicosamère et on l'appelle ci-après pour simplifier 20 B. 15 Exemple 5 On utilise un synthétiseur d'ADN (Applied Biosystem

Company) pour synthétiser l'ADN à brin moins du gène NS-1 du virus grippal Dans cet exemple, on synthétise la séquence d'ADN 3 '-CTA.

AGT TTG TGA CAC AGT TCA-5 ' qui s'hybride avec le m ARN de NS-1. 20 Ce désoxynucléotide est un heneicosamère qu'on appelle ci-après pour simplifier 20 C.

Exemple 6

Cet exemple décrit une expérience qui confirme que

l'oligodésoxynucléotide inhibe in vitro la synthèse des protéines 25 virales.

Le tableau 1 illustre l'effet inhibiteur de 20 A sur la formation de Vmw 175 et l'effet cytopathogène correspondant

(formation de syncytium) d'HSV 1.

TABLEAU 1

20 A/cupule 33,6 pg Quantité relative de Vmw 175 Effets cytopathogènes relatifs (syncytium) 0,35 0,48 On dépose des cellules BHK ( 1,5 x 10) dans chaque cupule ( 1,5 cm de diamètre) d'une bolte Limbro et on ajoute du MEM (milieu minimal essentiel) avec 10 % de sérum de veau On incube ensuite les cellules dans une atmosphère à 5 % de CO 2 à 36 C On infecte ensuite les cellules avec 5 MOI d'HSV 1 (une unité internationale "multiplicity of infection" = 1 phage par cellule) en 5 présence ou non de 20 A Après 5 h, on élimine le milieu On met ensuite les cellules en contact pendant 1 h avec de la 35 S-méthionine ( 10 p Ci/ml) et le 20 A, on les désintègre, et on analyse les protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis autoradiographie Pour évaluer l'effet cytopathogène relatif, les con10 ditions expérimentales sont identiques à celles qui précèdent, si

ce n'est qu'on compte le nombre des syncytiums 13 h après l'infection.

On n'observe pas dans ces conditions de diminution de la synthèse

de protéine cellulaire.

Exemple 7

Cet exemple décrit une expérience qui confirme que

l'oligodésoxynucléotide est fixé par les cellules.

Cette expérience indique que l'oligodésoxynucléotide à brin unique 20 A est susceptible de pénétrer dans les cellules cultivées On infecte des cellules BHK (cellules rénales de hamsters

' 4

nouveau-nés; 4,4 x 105 cellules) avec 7,6 x 10 unités de formation de plage d'HSV-l/ml Les cellules témoins ne sont pas infectées mais reçoivent la même quantité de milieu de culture On incube les cellules pendant 3 h dans un incubateur à CO 2 à 37 C Après l'incubation, on met les cellules en contact avec 7,66 pmol de 20 A marqué au 32 p Après le contact avec le 20 A marqué, on élimine le milieu de culture et on lave deux fois les cellules avec 0,3 ml de tampon salé phosphaté On laisse ensuite les cellules pendant 30 min à 36 O C dans une solution 0,1 M en Na Cl, 33 p M en Zn C 12, contenant 3360 unités de nucléase 51 et 33,3 m M en tampon acétate de sodium (p H: 4,5). 30 On lave ensuite deux fois les cellules avec le tampon décrit ci-dessus mais sans nucléase Sl On désintègre les cellules lavées dans 0,3 ml d'une solution 10 m M en EDTA à 0,6 % de dodécylsulfate de sodium et à 10 m M en tampon Tris-HC 1 (p H: 7,5) On mesure à ce moment le 20 A radioactif insoluble dans l'acide tri35 chloroacétique et sensible à la nucléase Sl On constate qu'au moins 4,68 x 103 molécules de 20 A ont été fixées par cellule pendant la période d'exposition de 8 h La quantité réelle est probablement dix fois supérieure à cette valeur en raison de l'hydrolyse rapide des phosphates terminaux marqués au 32 P. L'exemple 8 suivant montre que le 20 A a un effet d'inhibition sur la propagation des virus.

Exemple 8

On dépose environ 1,5 x 105 cellules BHK dans chaque godet ( 1,5 cm de diamètre) d'une boite Limbro On incube ces cellules dans 5 % de CO 2 36 % pendant 48 h et on infecte avec 10 l'HSV-l ( 7,6 x 104 unités de formation de plage/ml) dans 160 ml

de MEM On effectue l'infection pendant 3 h à 36 C dans 5 % de CO 2.

Apres l'infection, on applique du 20 A aux cellules infectées.

Après 8 h de contact, on remplace le milieu par du MEM normal

avec 10 % de sérum de veau 15 h après l'infection, on recueille 15 le liquide de culture et on mesure le titre viral.

Les résultats figurent dans le tableau 2 ci-dessous.

TABLEAU 2

Quantité de 20 A/cupule Quantité relative du virus O 100 îoo 0,112 pg 45 0,224 pg 35 Les exemples 9 à 13 concernent des expériences qui confirment que l'oligodésoxynucléotide inhibe la destruction in

vitro des cellules animales par des virus.

Exemple 9

(a) On place environ 1,5 x 105 cellules BHK dans chaque cupule ( 1,5 cm de diamètre) d'une boîte de culture cellulaire Limbro On incube les cellules pendant 47 heures à 36 C dans 5 Z de C 02 puis on infecte avec 160 pl d'HSV-1 ( 7,6 x 104 unités de formation de plage/ml) pendant 3 heures à 36 C On ajoute à ces cellules infectées diverses quantités d'un complexe de phosphate de calcium et de 20 A La concentration en calcium des milieux varie de 1,36 à 24,8 m Kol selon la concentration du 20 A Le complexe est préparé comme décrit par le groupe de Ruddle (Loitier et coll, Proc Nat Acad Sci 79, 422, 1982) On met les cellules infectées en contact avec le 20 A pendant 8 heures On élimine ensuite le milieu de culture et on le remplace par un

milieu de culture normal sans le 20 A et on cultive les cellules 15 pendant encore 13 heures.

(b) On traite les cellules témoins de façon identique à l'exception de l'addition du 20 A (témoin phosphate de calcium).

(c) Comme témoin additionnel, on prépare une culture infectée que l'on ne traite ni avec le phosphate de Ca, ni avec 20 le 20 A (témoin virus) On fixe les cultures cellulaires (a), (b) et (c) préparées ci-dessus, on les colore et on compte le nombre

des syncytiums.

Le résultat de cette expérience est illustré par la figure 1 dans laquelle l'axe X (abscisses) indique la quantité 25 d'ADN exprimée en pg ajoutée dans chaque cupule (c'est-à-dire "pg d'ADN/cupule") et l'axe Y (ordonnées) indique le nombre de syncytiums en pourcentage (c'est-à-dire "nombre % de syncytiums") formés dans une culture cellulaire par rapport à la valeur obtenue dans le cas de l'expérience (c) "témoin virus", la valeur étant 30 dans ce cas toujours ajustée à 100, et o le graphique en trait continu (a) (-e-) indique les résultats obtenus dans l'expérience (a), tandis que le graphique en trait discontinu (b) ( o) montre le résultat obtenu dans l'expérience (b) Comme le montre la figure 1, le 20 A inhibe remarquablement la formation de syncytiums. 35 Ni le phosphate de calcium ni le chlorure de calcium n'ont d'effet

sur le nombre des syncytiums.

Exemple 10

(a) On place environ 1,5 x 105 cellules BHK par cupule ( 1,5 cm de diamètre) d'une boîte Limbro On incube les cellules à 36 C pendant 47 heures sous 5 % de C 02 On ajoute à ces cellules 5 160 pl d'HSV-1 ( 7,6 x 104 unités de formation de plage/ml) et on laisse l'infection se poursuivre pendant 3 heures à 36 C On ajoute à ces cellules infectées diverses quantités du 20 A sous forme d'un complexe de chlorure de calcium à des concentrations finales en ions calcium de 4,55 mi M On poursuit le traite10 ment pendant 8 heures On incube ensuite de plus les cellules

pendant 14 heures.

(b) De plus, on prépare une culture identique à celle décrite en (a) cidessus, si ce n'est qu'on prépare et incube un oligodésocynucléotide n'ayant pas de rapport avec la séquence 5 '-CAC GAC AGA GGG CGA-3 ' de l'HSV-1 Toutes les autres conditions

sont identiques au cas de (a).

(c) On prépare une culture semblable sans le 20 A et on incube dans les mêmes conditions que ci-dessus On l'appelle

ici "témoin virus".

On fixe les cellules décrites ci-dessus en (a), (b) et (c), on les colore et on compte le nombre des syncytiums Les résultats de cette expérience sont illustrés par la figure 2 dans laquelle l'axe X (abscisses) représente la quantité d'ADN exprimée en og ajoutée dans chaque cupule (c'est-à-dire "pg d'ADN/cupule") 25 et l'axe Y (ordonnées) représente le nombre des syncytiums exprimé en pourcentage (c'est-à-dire "nombre % de syncytiums") formés dans une culture cellulaire par rapport à la valeur obtenue dans le cas de l'expérience (c) "témoin virus", la valeur dans ce cas étant toujours ajustée à 100, et le graphique en trait continu (a) (* -) 30 indique les résultats obtenus pour l'expérience (a), tandis que le graphique entrait discontinu (b) ( o) indique les résultats

obtenus pour l'expérience (b).

Comme le montre la figure 2, le 20 A a un effet inhibiteur sur le nombre des syncytiums produits par l'HSV-1 On peut 35 conclure de cette expérience que le 20 A inhibe la formation de

syncytiums en présence de 4,55 m M d'ions calcium Les oligo-

désoxynucléotides qui n'ont aucun rapport avec les séquences d'ADN connues de l'herpèsvirus n'ont aucun effet inhibiteur Il ressort nettement de cette expérience que le brin (-) d'ADN du virus de l'herpèsvirus inhibe de façon spécifique l'effet cytopathogène de l'herpèsvirus.

Exemple 11

L'exemple 9 illustre l'effet obtenu par emploi de

l'eicosamère synthétique 20 A apparenté au brin (-) d'ADN d'HSV.

Cette expérience décrit l'efficacité de l'ADN d'herpèsvirus cloné.

Enutilisant le vecteur p BR 322 contenant de l'ADN d'HSV-1 ( 1,45 mégadalton, obtenu par digestion d'ADN d'HSV-1 avec Bam HI), on peut inhiber la formation des syncytiums par HSV-1 Dans cette

exéprience, l'ADN d'HSV-1 n'est pas excisé du plasmide recombinant.

On introduit 0,16 pg de p BR 322 recombinant dénaturé et ayant subi une digestion partielle contenant l'ADN d'HSV-1, dans chaque cupule 15 d'une boîte Limbro, comme dans l'exemple 9 On examine l'effet, comme décrit dans l'exemple 9, et on observe une inhibition de la formation des syncytiums Comme témoin dans cette expérience, on utilise de l'ADN de p BR 322 seul Dans cette expérience témoin,

on n'observe pas d'inhibition.

Exemple 12

Cet exemple illustre un effet synergique d'un mélange des oligodésoxynucléotides.

On dépose environ 1,5 x 105 cellules BHK dans chaque cupule ( 1,5 cm de diamètre) d'une boîte Limbro On incube les cellules dans 5 % de CO 2 à 36 C pendant 47 à 48 heures et on infecte avec HSV-1 ( 7,6 x 104 unités de formation de plage/ml) dans pl de MIEM On effectue l'infection pendant 3 heures à 36 C dans 5 % de C 02 Après l'infection, on dissout dans un solvant le 20 A seul ou en mélange avec le 20 B ( 224/1) et on applique 30 0,3 ml de cette solution aux cellules en présence d'ions calcium 4,55 me On effectue le contact de ces cellules avec le 20 A et

le 20 B pendant 8 heures.

D'autre part, on soumet des cellules à des traitements identiques à ceux décrits ci-dessus mais sang 20 A ni 20 B Ceci 35 constitue un témoin virus.

On fixe les cellules, on les colore et on compte le nombre des syncytiums Les résultats de ces expériences sont illustrés par la figure 3 sur laquelle l'axe X (abscisses) indique la quantité d'ADN exprimée en mg ajoutée dans chaque cupule (c'est5 à-dire "pg d'ADN/cupule") et l'axe Y (ordonnées) indique le nombre des syncytiums en pourcentage (c'est-à-dire "nombre % de syncytiums") formés dans une culture cellulaire par rapport à la valeur obtenue dans le cas du "témoin virus", la valeur dans ce cas étant toujours ajustée à 100, et o un graphique en trait plein indiqué " 20 A" (-o) illustre les résultats obtenus dans l'expérience utilisant le 20 A seul, tandis qu'un graphique en trait plein désigné " 20 A + 20 B ( 224/1)" () illustre les résultats obtenus dans l'expérience utilisant une combinaison de 20 A et de 20 B dans le rapport de 224/1 Comme le montre la figure 3, lorsqu'on utilise 15 le mélange de 20 A et de 20 B, l'effet in vitro observé est plus important que dans le cas o on utilise le 20 A seul On peut conclure à partir de ces résultats que l'utilisation conjointe d'ADN à brin (-) correspondant à une portion ayant une séquence d'ADN

différente de l'ADN à brin (-) de l'herpèsvirus peut renforcer 20 notablement l'efficacité comme agent antiviral.

Exemple 13

Cet exemple illustre l'effet d'oligodésoxynucléotides

à brin (-) de NS-1 sur l'effet cytopathogène du virus grippal.

Les résultats de l'étude figurent dans le tableau 3 et le mode 25 d'étude est décrit en détail ci-après.

TABLEAU 3

Oligodésoxynucléotides Valeur relative correspondant (mg/ml) au nombre de cellules viables

0 0,21

0,02 0,49

1,30 0,49

,00 0,49

On cultive des cellules rénales de porc Kitazato (SKK) ( 1,5 x 105/0,1 ml) dans du MEM contenant 5 % de sérum de veau foetal 35 et on les dépose dans chaque cupule ( 0,5 cm de diamètre) d'une microplaque On incube les cellules pendant 24 heures à 35,5 C

25534 Z O

dans une atmosphère à 5 % de C 02 dans le milieu ci-dessus On prélève ensuite le milieu et on introduit dans chaque cupule pl d'un milieu contenant diverses quantités de l'oligodésoxynucléotide ( 20 C) et on incube ces cellules pendant 24 heures dans une atmosphère à 5 % de CO 2 On prélève ensuite la solution et on ajoute dans chaque cupule 50 pl d'un milieu contenant unités de dose infectant à 50 % des cultures de tissus de virus Influenza A On ajoute de plus dans chaque cupule 50 pg du milieu de culture contenant diverses quantités de 20 C On incube 10 de plus les cultures pendant 48 heures On élimine ensuite le milieu et on ajoute dans chaque cupule 100 pl de solution de Hanks contenant 0,1 Z de rouge neutre et on incube les cellules pendant 1 heure à 35,5 C dans un incubateur à 5 Z de C 02 On élimine ensuite la solution et on lave les cellules avec 10 pl 15 d'éthanol à 80 % puis on ajoute 50 pl d'H Cl 0,1 N On mesure le nombre relatif des cellules viables par absorption optique à 577 nmselon la méthode ELISA Les cellules viables fixent le rouge neutre, tandis que les cellules non viables ne le fixent

pas Donc, plus la densité optique est élevée, plus les cellules 20 viables sont nombreuses.

Les exemples 14-20 suivants illustrent l'efficacité in vivo de l'emploi des oligodésoxynucléotides comme agents antiviraux.

Exemple 14

On injecte dans les cavités intracérébrales de souris BALB/C âgées de 3 semaines environ 1 x 10 unités de formation de plage d'HSV-1 (souche F) en suspension dans 30 pl de MEM Les suspensions virales contiennent diverses quantités de 20 A De plus, on injecte chaque jour pendant 3 jours dans les cavités 30 péritonéales à partir du lendemain de l'injection de l'HSV-1, pl de MEN contenant 1 Z de pénicilline, de streptomycine, et 2 m M d'acide glutamique avec des quantités variables de 20 A. On calcule le pourcentage de mortalité au septième jour Les résultats de l'expérience sont illustrés par la figure 4 dans 35 laquelle l'axe X (abscisses) indique la quantité d'ADN exprimée en pg injectée à chaque souris (c'est-à-dire "pg d'ADN/souris") et l'axe Y (ordonnées) indique le taux de mortalité exprimé en pourcentage par rapport à celui obtenu dans le-cas du "témoin" dans lequel les souris reçoivent une injection de la même solution, mais pas de 20 A, le taux de mortalité dans le cas du "témoin" étant toujours réglé à 100 Comme le montre la figure 4, le taux de mortalité est réduit en fonction de la quantité de 20 A administrée. Le graphique indique le taux de mortalité exprimé en 10 pourcentage par rapport au groupe de souris témoins ne recevant aucun 20 A.

Exemple 15

On injecte dans les cavités intracérébrales de souris BALB/C âgées de 3 semaines environ 1 x 104 unités de formation de 15 plage d'HSV-1 (souche F) dans 30 pl de MEM contenant diverses quantités de 20 A De plus, on injecte par voie intrapéritonéale à partir du lendemain de l'injection de l'HSV-1, 200 pl d'une solution contenant diverses quantités de 20 A, 1 % de pénicilline

et de streptomycine et 2 m M d'acide glutamique.

On poursuit le traitement pendant 6 jours consécutifs.

On examine la mortalité des souris 64 à 68 heures après l'injection

de l'HSV-1 Les résultats figurent dans le tableau 4.

TABLEAU 4

Dose Mortalité des souris /19 0,224 pg/souris 0/9 2,240 pg/souris 0/10 Comme le montre ce tableau, dans le groupe témoin, 30 5 souris sur 19 souris au total meurent sans administration du A D'autre part, les souris recevant soit 0,224 pg de 20 A, soit 2,240 pg de 20 A ne meurent pas à ce moment ( 19 souris

traitées au total dans les deux cas).

Exemple 16

On injecte dans les cavités intracérébrales de souris BALB/C âgées de 3 semaines environ 5 x 10 unités de formation de plage d'HSV-1 (souche F) dans 30 pl de MEM contenant diverses quantités de 20 A On examine la mortalité des souris 64 à 68 heures ou 71 à 78 heures après l'injection Les résultats figurent dans le

tableau 5.

TABLEAU 5

* Dose Mortalité entre Mortalité entre 64 et 68 heures 71 et 78 heures

3/10 3/10

1,12 pg/souris 0/10 2/10 11,2 pg/souris 0/10 0/10 Comme le montre le tableau, dans le groupe témoin qui ne reçoit pas de 20 A, 3 souris sur 10 au total meurent D'autre part, la mortalité des souris dans le groupe recevant le virus en

présence de 20 A est fortement réduite.

Exemple 17

On injecte dans les cavités intracérébrales de souris BALB/C âgées de 3 semaines, environ 5 x 104 unites de formation de plage d'HSV-1 (souche F) dans 30 pl de MEM contenant diverses quantités de 20 A De plus, à partir du lendemain de l'injection, on injecte dans les cavités intracérébrales 30 pl de MEM contenant 20 une quantité donnée de 20 A, 1 % de pénicilline et de streptomycine

et 2 m M d'acide glutamique.

On poursuit le traitement pendant 2 jours et on examine la mortalité des souris à diverses périodes après l'injection du virus.

Les résultats figurent dans le tableau 6.

TABLEAU 6

Mortalité Dose entre entre entre 64 et 68 heures 71 et 78 heures 88 et 92 heures

1/10 3/10 7/10

1,12 pg/souris 0/20 2/20 5/20 Comme le montre ce tableau, la mortalité parmi les souris témoins qui n'ont pas reçu le 20 A est significativement supérieure à celle des souris ayant reçu le 20 A Bien que l'effi35 cacité du 20 A diminue apparemment 88 à 92 heures après l'injection, la mortalité demeure encore plus élevée parmi les souris témoins,

même dans ces conditions.

Exemple 18

On injecte dans les cavités péritonéales de souris BALB/C âgées de 3 semaines environ 1 x 106 unités de formation de plage de HSV-1 (souche F) dans 200 pl de MEM contenant 1,12 pg de 20 A. De plus, environ 3 ou 2 heures avant l'injection d'HSV-1 et 1 jour après l'injection d'HSV-1, on injecte par voie intrapéritonéale aux souris infectées 200 pl de MEM contenant diverses quantités de 20 A On poursuit les injections intrapéri10 tonéales de 20 A pendant 2 jours On examine la mortalité à 211 et 259 heures après l'injection d'HSV-1 Les résultats figurent

dans le tableau 7.

TABLEAU 7

Dose Mortalité à 211 heures Mortalité à 259 heures

1/10 2/10

0,224 pg/souris 0/10 0/10 Comme le montre ce tableau, une sur 10 au total (à 211 heures après l'injection) ou 2 sur 10 au total(à 259 heures après l'injection) des souris meurent lorsque le 20 A n'est pas 20 administré D'autre part, les souris ayant reçu 0,224 pg de 20 A

ne meurent pas dans des conditions identiques.

Exemple 19

On lèse les cornées de souris BALB/C âgées de 3 semaines en les grattant cinq fois avec une aiguille à injection pointue. 25 Sur ces cornées lésées, on applique 30 pl de MEM contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine, 2 m M d'acide glutamique et 5 % de sérum de veau avec 3 x 10 unités de formation de plage d'HSV-1 (souche F) On divise les souris traitées en 4 groupes (A), (B),

(C) et (D), comme indiqué ci-dessous et on examine les yeux de 30 ces souris en photographiant les résultats.

(A) sur les membranes cornéennes de ces souris, on instille 2 heures avant l'administration d'HSV-1 (souche F) 10 1 pl de MEM contenant 22,4 g de 20 A/ml De plus, on administre ce traitement tous les deux jours à partir du lendemain de l'administra35 tion de l'HSV-1 (souche F) De plus, ces souris reçoivent des gouttes d'une solution contenant de l'acétate de cortisone ( 2 mg/kg de poids corporel de souris) 5 heures avant l'administration d'HSV-1 (souche F) On poursuit également le traitement par la

cortisone tous les deux jours.

(B) On instille dans les yeux des souris 10 pl de MEM contenant 22,4 pg de 20 A/ml 2 heures avant l'administration d'HSV-1 (souche F) On poursuit le traitement avec le 20 A tous les deux jours. (C) Les souris reçoivent 30 pl d'une solution contenant 10 de l'acétate de cortisone ( 2 mg/kg de poids corporel), comme décrit

en (A).

(D) On applique aux membranes cornéennes des souris 10 pl de MEM 2 heures avant le traitement par l'HSV-1 (souche F).

De plus, à partir du lendemain de l'administration d'HSV-1 (souche F), 15 on poursuit un traitement semblable avec le MEM tous les deux jours.

On examine l'état des yeux et de la zone entourant les yeux de chaque souris en prêtant une attention particulière à l'inflammation et à l'obturation des paupières avec des sympt 8 mes pathologiques On effectue l'examen les quatrième, septième ou 20 douzième jours après le traitement Les souris appartenant au groupe (A) et au groupe (B) présentent beaucoup moins de symptômes pathologiques des yeux et de la région environnante par rapport aux souris appartenant au groupe (C) et au groupe (D) ne recevant pas le 20 A. On conclut de plus que l'efficacité du 20 A n'est pas

influencée par l'administration de cortisone.

Les exemples 20 à 22 suivants illustrent la préparation de divers types d'agents antiviraux de l'invention.

Exemple 20

On synthétise selon la méthode du triester (en utilisant

un triester des nucléotides correspondants en phase liquide) un oligodésoxynucléotide identique au 20 A obtenu dans l'exemple 3.

A 2 g du 20 A ainsi synthétisé, on ajoute du MEM isotonique pour obtenir un volume final de 1 litre de solution injectable et on conditionne la solution dans des ampoules pour obtenir des préparations injectables Cette préparation injectable contient 2 mg de 20 A par ml et on l'administre par voie sous-cutanée à une dose de 1-5 ml lorsqu'on observe un symptôme, aussi près que possible de la

partie infectée.

Exemple 21

On synthétise selon la méthode du triester un oligodésoxynucléotide identique au 20 B obtenu dans l'exemple 4 A 10 g du 20 B ainsi synthétisé,on ajoute du MEM isotonique pour obtenir un volume final de 1 litre constituant une solution mère pour une préparation de gouttes oculaires à 1 V% On applique cette prépara10 tion de gouttes oculaires plusieurs fois par jour à raison de 2 à

3 gouttes lorsqu'on observe un symptôme.

Exemple 22

On synthétise selon la méthode du triester un oligodésoxynucléotide identique au 20 A obtenu dans l'exemple 3 On broie 15 en poudre fine 1 g du 20 A ainsi synthétisé puis on ajoute à la poudre fine 999 g de beurre de cacao purifié On malaxe le mélange au bain-marie à 60 C puis on moule pour former des suppositoires

pesant chacun 2 g.

Chaque suppositoire contient 2 mg de 20 A et est utilisé 20 selon le symptôme.

Les exemples 23 et 24 suivants illustrent l'innocuité de l'agent antiviral de l'invention.

Exemple 23

Lorsqu'on administre du 20 A en une quantité de 100 mg/kg 25 par voie intrapéritonéale à des souris BALB/C, on n'observe pas de

changement des animaux d'étude.

Exemple 24

Dans un test de confirmation de l'effet décrit dans l'exemple précédent, on opère comme dans l'exemple 19, si ce n'est 30 qu'on n'utilise pas d'HSV-1 Dans cet essai, on n'observe pas de différence entre le groupe des animaux d'essai auquel le 20 A a

été administré et celui auquel le 20 A n'a pas été administré.

Il ressort des exemples précédents que les agents antiviraux de l'invention sont sans danger à une dose efficace des 35 oligo et polydésoxynucléotides.

Les exemples qui suivent sont présentés pour montrer que le système de synthèse in vitro des protéines est inhibé par

l'hybridation du m ARN avec l'oligodésoxynueléotide à brin (-).

Ces résultats vont à l'appui de la base théorique de l'invention.

Exemple 25 (exemple de référence 1) Cet exemple illustre l'inhibition de la synthèse de la polyphénylalanine dépendante du poly U par l'acide oligodésoxyadénylique. Le mélange réactionnel ( 40 pl) contient 140 mg de 14 5 poly U, de la 4 C-phénylalanine ( 10 cpm, 300 microcuries/micromole d'extrait d'E coli (préparé selon Nirenberg et Mathaei, Proc. Nat Acad Sci, USA, 47, 1588 ( 1961)), 13 m M d'acétate de magnésium, 1 m M d'ATP, 1 m M de phosphate de créatine, 1 pg de créatinephosphokinase, 10 m M de Tris-H Cl (p H 7,5) et diverses quantités 15 d'acide oligodésoxyadénylique On place les mélanges réactionnels dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et on incube à 37 C pendant minutes On mesure la quantité de polyphénylalanine synthétisée par comptage de la radioactivité de la matière insoluble dans l'acide trichloroacétique à 10 % chaud ( 95 C) On effectue le comptage avec 20 un compteur à scintillation liquide On calcule le pourcentage d'inhibition par rapport à la valeur de la synthèse de la polyphénylalanine en l'absence de l'acide oligodésoxyadénylique Les résultats

figurent dans le tableau 8.

TABLEAU 8

Inhibiteur Dose Inhibition de la synthèse (microgrammes) de la polyphénylalanine

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ %

T Pmai rl n(z T cvs; n Acide polydésoxyadénylique Acide oligodésoxyadénylique ( 10 nucléotides) Acide oligodésoxyadénylique ( 9 nucléotides) Acide oligodésoxyadénylique ( 8 nucléotides) Acide oligodésoxy40 adénylique ( 7 nucléotides) u Comme le montre le tableau 8, l'acide polydésoxyadénylique qui s'hybride avec l'acide polyuridylique est un inhibiteur remarquablement puissant de la synthèse de la polyphénylalanine Le tableau montre que l'acide oligodésoxyadénylique, ayant une longueur de cha Tne supérieure à 9 nucléotides, a un effet inhibiteur puissant. Exemple 26 (exemple de référence 2) L'expérience décrite ci-après démontre que les oligodésonynucléotides peuvent inhiber l'activité du m ARN eucaryotique par formation d'hybrides avec ce m ARN Le mélange réactionnel ( 30 Pl) contient 4,2 m M de phosphate de calcium, 2 m M de diméthylthiothréitol (DTT), 0,08 m M de chaque aminoacide (sauf pour la méthionine), 6 m M d'acétate de calcium, 8 m M d'acétate de magnésium, 4,5 pg de spermidine, 0,1 p Ci de 35 S-méthionine et 10 ml d'un extrait de réticulocytes de lapin préparé selon Jackson et Pelham (Europ J Biochem 67, 15 247-256, 1976) On dissout l'inhibiteur dans une solution 21 ml d'HEPES et on l'ajoute au mélange réactionnel comme décrit dans le

tableau 9.

Inhibiteur Témoin ADN de génome d'a-globine ADN de génome de P-globine ADN de thymus de veau ADN de génome d'a-globine à 15 désoxynucléotides ADN de M 13 à 15 désoxynucléotides Dose (Ji g)

TABLEAU 9

% d'inhibition de la synthèse de 1 ' a-globine o 0,06 % d'inhibition de la synthèse de la P-globine o o 65 10 o

0,06 0,06

o 10 0,06 0,06 Comme d'une "-globine inhibe la le montre le tableau 9, l'ADN à brin (-) synthèse d'a-globine, tandis que l'ADN à brin (-) de Dglobine inhibe spécifiquement la synthèse de la -globine On n'observe pas d'inhibition notable avec l'ADN de thymus de veau On peut donc conclure à partir de ces observations que l'ADN de gène eucaryotique (à brin négatif) inhibe de façon spécifique la synthèse de la protéine codée par ce gène L'oligodésoxynucléotide ayant une longueur de chaîne de 15 correspondant à la séquence d'aminoacides NH 2 terminale de l'a-globine inhibe la synthèse de 1 ' a-globine Cette observation indique que l'ADN à un brin (brin -) ayant une longueur de chaîne aussi courte que 15 suffit 10 pour l'inhibition spécifique de la synthèse de la protéine correspondante L'oligonucléotide témoin (ADN de phage M 13 ayant une longueur

de chaîne de 15 nucléotides) ne présente aucun effet inhibiteur notaie.

Il ressort des exemples illustratifs précédents que l'homme de l'art peut obtenir essentiellement les mêmes résultats 15 en modifiant, sans sortir du cadre de l'invention, les natures des

virus et la région codante.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui

viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limita20 tifs sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 Nouveau oligodésoxynucléotides ou polydésoxynucléotides caractérisés en ce qu'ils sont identiques par la séquence d'ADN à une portion de la structure d'ADN hybridable à un ARN messager produit lors de la propagation d'un virus, la structure étant capable d'hybridation avec l'AMN messager. 2 Produits selon la revendication 1,

ce que le virus est un virus à ARN.

3 Produits selon la revendication 2,

que le virus à ARN est le virus grippal.

4 Produits selon la revendication 1,

que le virus est un virus à ADN.

Produits selon la revendication 4,

que le virus à ADN est l'herpèsvirus.

caractérisés en caractérisés en ce caractérisés en ce caractérisés en ce 6. Produitsselon la revendication 1, caractérisés en ce

qu'ils consistent en un mélange d'oligodésoxynucléotides ou de polydésoxynucléotides.

7 Nouveaux médicaments utiles notamment comme agents antiviraux, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produits

actifs au moins un des oligodésoxynucléotides ou polydésoxynucléotides 20 selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.