DE69434564T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen und deren verwendung insbesondere in der behandlung von neurodegenerativen krankheiten - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Verwendung, insbesondere für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Sie betrifft ganz besonders die Verwendung von Verbindungen, die auf das Protein p53 oder auf sein Gen einwirken, zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen vorgesehen sind.
  • Das Gen p53 kodiert für ein nucleares Protein von 53 kDa. Das wilde Gen, das für das natürliche p53 kodiert, besitzt eine antionkogene Wirkung [für eine Übersicht siehe beispielsweise Oren, FASEB J. 6 (1992) 3169]. Das wilde Protein p53 ist nämlich fähig, die Bildung von Herden der Transformation in den Fibroblasten von transfektierten Nagern mit verschiedenen Kombinationen von Onkogenen zu inhibieren. Die durch Deletion und/oder Mutation dieses Gens mutierte Form ist demgegenüber bei der Entwicklung einer Vielzahl von humanen Krebszuständen einbezogen [Baker et coll., Science 244 (1989) 217]. Seine mutierten Formen sind ebenfalls fähig, mit den kurzen Onkogenen zu kooperieren, um die reifen Fibroblasten zu transformieren. Aus diesem Grunde wurde das Protein p53 und sein Gen seit langem als Zielpunkt für die Behandlung von Krebszuständen untersucht. Außerdem haben Chopp et al. [Biochem. Biophys. Res. Com 182 (1992) 2101] eine Expression von p53 im Gehirn der ischämisierten Ratte beschrieben. Jedoch deutet in diesen Ergebnissen nichts darauf hin, daß diese Expression einen Grund für die Neurodegeneration oder ein paralleles Phänomen bildet. Außerdem wird in diesem Dokument weder ein therapeutischer Ansatz ins Auge gefaßt noch vorgeschlagen.
  • Die vorliegende Erfindung resultiert teilweise aus der Erkenntnis, daß das Protein p53 einen Mediator bei der neuronalen Degeneration bildet. Sie resultiert ebenfalls aus der Erkenntnis, daß die Verwendung von Verbindungen, die fähig sind, mindestens teilweise die Aktivität des Proteins p53 zu inhibieren, ermöglichen kann, den Prozeß des neuronalen Todes zu blockieren.
  • Zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der neuronalen Degeneration hat die Anmelderin als Modell Mäuse verwendet, bei denen die Expression des Gens p53 inaktiviert wurde [Donehower et al., Nature 356 (1992) 215]. An diesen Mäusen wurden Untersuchungen der irreversiblen fokalen Ischämie praktiziert und die Infarkt-Volumina mit denen verglichen, die bei wilden Mäusen der Kontrolle beobachtet wurden (gleicher Stamm, gleiches Geschlecht, gleiches Alter, gleicher Lieferant). Die erhaltenen Ergebnisse haben eine statistisch signifikante Verringerung von 20% der Infarkt-Volumina nach der Ischämie der Mäuse gezeigt, die nicht durch das Gen p53 exprimiert wurden (vgl. Beispiele). Außerdem hat die Anmelderin ebenfalls gezeigt, daß die Verwendung von Antisens anti-p53 ermöglicht, den durch Glutamat induzierten Tod an Kulturen von kortikalen Zellen zu verlangsamen. Diese Resultate zeigen, daß das Protein p53 eine Rolle als Mediator der neuronalen Degeneration spielt, eine Beobachtung, von der noch nie im Stand der Technik berichtet wurde, und daß eine Kontrolle der Aktivität dieses Proteins ermöglicht, gegen den neuronalen Tod zu kämpfen. Das Protein p53, sein Gen und die Gesamtheit von Faktoren, die fähig sind, mit ihnen in Wechselwirkung zu treten, bilden somit neue pharmakologische Ziele bei der Behandlung von neurodegenerativen Prozessen. Die Erfindung beruht damit teilweise auf der Verwendung von Verbindungen, die fähig sind, mindestens teilweise die Aktivität von p53 bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen zu blockieren.
  • Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung beruht auf der Verwendung einer Verbindung, die mindestens teilweise die Aktivität des Proteins p53 inhibiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurodegenerativen Erkrankungen vorgesehen ist.
  • Die Verbindungen, die mindestens teilweise die Aktivität des Proteins p53 im Sinne der vorliegenden Erfindung inhibieren, können Verbindungen sein, die (i) auf die Synthese von p53 im transkriptionellen, translationellen oder post-translationellen Bereich oder (ii) auf die Bindung von p53 an die DNA einwirken.
  • Unter den Verbindungen, die auf die Synthese des Proteins p53 einwirken, kann man die nucleotidischen Antisens-Sequenzen nennen, die fähig sind, die Expression von p53 im transkriptionellen oder translationellen Bereich zu verringern oder zu unterdrücken. Derartige Sequenzen können nämlich gegen die mRNA von p53 gerichtet werden und auf die Translation von diesem in Protein einwirken: es kann sich um Oligonucleotide (synthetische, chemisch modifizierte usw. wie beispielsweise in den Patentanmeldungen EP 092 574, EP 231 495, WO 92/03568; WO 91/13080 usw. beschrieben) handeln oder um Sequenzen von DNA, die für RNA kodieren, das seinerseits fähig ist, mit der mRNA von p53 selektiv in Wechselwirkung zu treten, beispielsweise gemäß der in der Patentanmeldung EP 140 308 beschriebenen Technik.
  • Derartige Sequenzen können ebenfalls gegen das Gen gerichtet werden, das für p53 kodiert und auf die Transkription von diesem in RNA einwirkt. Diese Sequenzen können ganz besonders gegen kodierende Regionen des Gens (Struktur-Gen von p53) oder gegen nicht kodierende Regionen gerichtet werden: regulatorische Regionen der Transkription, Exons usw. Derartige Sequenzen können unter den Bedingungen hergestellt werden wie sie beispielsweise in EP 558 634, WO 91/06626, WO 92/10590, WO 93/10820 usw. beschrieben sind.
  • Unter den Verbindungen, die auf die Bindung von p53 an DNA einwirken, kann man ganz besonders Antagonisten von p53 oder Proteine nennen, die fähig sind, mit p53 in Wechselwirkung zu treten und auf diese Weise seine Aktivität der Bindung zu DNA zu modifizieren. In dieser Hinsicht kann man die negativen dominanten Mutanten von p53 nennen, die im wesentlichen aus der inaktiven mutierten Form bestehen und die fähig sind, mit dem wilden Protein für die Wechselwirkung mit DNA in Konkurrenz zu treten. Derartige Mutanten sind beispielsweise der Mutant p53Val135 oder andere Formen, wie sie beispielsweise in Michalovitz et al. [J. Cell. Bioch. 45 (1991) 22] beschrieben sind. Sie können so wie sie sind verwendet werden, aber vorzugsweise werden sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Form von genetischen Konstruktionen verwendet, die fähig sind, diese Mutanten in vivo zu exprimieren. Andere Verbindungen, die fähig sind, mindestens teilweise die Bindung von p53 an die DNA zu inhibieren, bestehen aus doppelsträngigen Nucleinsäuren, welche die Bereiche der Bindung von p53 an die DNA reproduzieren [El-Deiry et al., Nature 1 (1992) 45; Kern et al., Science 252, 1708; Friedman et al., PNAS 90 (1993) 3319]. Die Anmelderin hat nämlich gezeigt, daß derartige Nucleinsäuren fähig sein könnten, die in den Zellen anwesenden Faktoren der Transkription im Komplex zu binden und somit zu verhindern, daß sie sich an ihren endogenen Bereichen fixieren, um auf diese Weise ihre transkriptionelle Aktivität zu blockieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung eine doppelsträngige Nucleinsäure, umfassend ganz oder teilweise Bereiche der Bindung von p53 an die DNA. In noch mehr bevorzugter Weise umfaßt die Nucleinsäure ganz oder teilweise die Sequenz SEQ ID No. 2 oder eine aktive Variante davon. Der Ausdruck aktive Variante bezeichnet im Sinne der Erfindung jede Variante der Sequenz SEQ ID No. 2, welche die Eigenschaften der Fixierung an das Protein p53 beibehalten hat. Derartige Varianten können durch Mutation, Deletion, Substitution und/oder Addition von Basen an die Sequenz SEQ ID No. 2 und anschließende Verifizierung der Bindungsaktivität in vitro erhalten werden.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die im Rahmen der Erfindung verwendete Verbindung eine Nucleinsäure, die für eine mutierte Form des Proteins p53 kodiert und die fähig ist, dessen Aktivität zu antagonisieren.
  • Immer noch in der bevorzugten Ausführungsform ist die im Rahmen der Erfindung verwendete Verbindung eine Antisens-Nucleinsäure, die fähig ist, die Bereiche der Expression von Protein p53 im transkriptionellen oder translationellen Bereich zu reduzieren. Noch mehr bevorzugt handelt es sich um eine DNA, die für eine Antisens-Ribonucleinsäure kodiert, die fähig ist, die Translation von zellulärer mRNA von p53 zu inhibieren. Ein derartiges Antisens ist in der Sequenz SEQ ID No. 1 dargestellt.
  • Die Nucleinsäure kann so wie sie ist verwendet werden, beispielsweise nach Injektion an Mensch oder Tier, um einen Schutz vor der neuronalen Degeneration hervorzurufen oder sie zu behandeln. Insbesondere kann sie in Form von freier DNA injiziert werden, gemäß der in der Patentanmeldung WO 90/11092 beschriebenen Technik. Sie kann ebenfalls in komplexer Form verabreicht werden, beispielsweise mit DEAE-Dextran [Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], mit nuclearen Proteinen [Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], mit Lipiden [Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413] oder in Form von Liposomen [Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] usw.
  • Vorzugsweise bildet die im Rahmen der Erfindung verwendete Nucleinsäure den Teil eines Vektors. Die Verwendung eines derartigen Vektors ermöglicht nämlich, die Verabreichung der Nucleinsäure in die zu behandelnden Zellen zu verbessern und ebenfalls ihre Stabilität in den genannten Zellen zu erhöhen, wodurch wiederum ermöglicht wird, eine dauerhafte Inhibitorwirkung zu erhalten. Außerdem ist es möglich, mehrere Sequenzen der Nucleinsäure in den gleichen Vektor einzubringen, was ebenfalls die Wirksamkeit der Behandlung erhöht.
  • Der verwendete Vektor kann verschiedener Herkunft sein, sobald er fähig ist, die tierischen Zellen, vorzugsweise die humanen Nervenzellen zu transformieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man einen viralen Vektor, der unter den Adenoviren, den Retroviren, den adeno-assoziierten Viren (AAV), den Herpesviren usw. ausgewählt werden kann.
  • In dieser Hinsicht hat die vorliegende Erfindung ebenfalls jeden rekombinanten Virus zum Gegenstand, der eingeordnet in seinem Genom, eine Nucleinsäure umfaßt, die für eine mutierte Form von Protein p53 kodiert, die fähig ist, dessen Aktivität zu antagonisieren, und/oder eine Nucleinsäure, die ganz oder teilweise Bereiche der Bindung von p53 an die DNA umfaßt, und/oder eine Antisens-Nucleinsäure, die fähig ist, die Bereiche der Expression von Protein p53 im transkriptionellen oder translationellen Bereich zu reduzieren.
  • Der rekombinante Virus gemäß der Erfindung kann unter den Adenoviren, den Retroviren, den adeno-assoziierten Viren usw. ausgewählt werden. Vorzugsweise handelt es sich um einen Virus, der fähig ist, die Nervenzellen zu infizieren, wie insbesondere ein Adenovirus. Vektoren, die von Adenoviren, Retroviren oder von AAV abgeleitet sind und die Sequenzen von heterologen Nucleinsäuren einschließen, sind in der Literatur beschrieben [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573 , Levero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer und Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New. Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New. Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18088].
  • Vorteilhafterweise ist der rekombinante Virus gemäß der Erfindung ein defektiver Virus. Der Ausdruck "defektiver Virus" bezeichnet einen Virus, der unfähig ist, sich in der Zielzelle zu replizieren. Im allgemeinen ist das Genom des im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Virus daher mindestens von Sequenzen befreit, die für die Replikation des genannten Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind. Diese Regionen können entweder entfernt (ganz oder teilweise) oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch Nucleinsäure substituiert sein. Vorzugsweise behält dennoch der defektive Virus die Sequenzen seines Genoms bei, die für die Encapsidierung der viralen Teile notwendig sind. Es ist besonders vorteilhaft, Nucleinsequenzen der Erfindung in einer Form zu verwenden, die in einem defektiven rekombinanten Adenovirus inkorporiert ist.
  • Es existieren nämlich unterschiedliche Serotypen von Adenoviren, deren Struktur und Eigenschaften sich ein wenig unterscheiden, die jedoch für den Menschen und insbesondere für die Patienten mit keiner Immunodepression nicht pathogen sind. Außerdem integrieren sich diese Viren nicht in das Genom der durch sie infizierten Zellen, und sie können wesentliche Fragmente von exogener DNA einbringen. Unter den verschiedenen Serotypen bevorzugt man im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) zu verwenden. Im Fall des Adenovirus Ad 5 sind die für die Replikation notwendigen Sequenzen die Regionen E1A und E1B.
  • Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem insbesondere viralen Vektor, der mindestens zwei wie oben definierte Nucleinsäuren umfaßt.
  • Die defektiven rekombinanten Viren der Erfindung können durch homologe Rekombination zwischen einem defektiven Virus und einem Plasmid hergestellt werden, das unter anderem die Sequenz der Nucleinsäuren trägt wie sie oben definiert ist [Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917]. Die homologe Rekombination vollzieht sich nach Co-Transfektion der genannten Viren und Plasmide in einer geeigneten Zell-Linie. Die verwendete Zell-Linie soll vorzugsweise (i) durch die genannten Elemente transformierbar sein, und (ii) Sequenzen umfassen, die fähig sind, den Teil des defektiven Virus zu vervollständigen, vorzugsweise in integrierter Form, um Risiken der Rekombination zu vermeiden. Als Beispiel für eine verwendbare Linie zur Herstellung von defektiven rekombinanten Adenoviren kann man die Linie der humanen embryonalen Niere 293 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59] erwähnen, die insbesondere, integriert in ihrem Genom, den linken Teil des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) enthält. Als Beispiel für eine verwendbare Linie zur Herstellung von defektiven rekombinanten Retroviren kann man die Linie CRIP [Danos und Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460] erwähnen. Schließlich werden die Viren, die sich vermehrt haben, gewonnen und nach klassischen Methoden der Molekularbiologie gereinigt.
  • Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die mindestens einen wie oben definierten rekombinanten Virus umfaßt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können im Hinblick auf eine Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem usw. Wege formuliert werden.
  • Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe für eine injizierbare Formulierung. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid usw. oder Mischungen derartiger Salze) oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die gegebenenfalls durch Zugabe von sterilem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen gestatten.
  • Die für die Verabreichung verwendeten Dosen der Nucleinsäuren (Sequenz oder Vektor) können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepaßt werden, und insbesondere in Abhängigkeit von der angewendeten Verabreichungsart, der betreffenden Erkrankung, der zu exprimierenden Nucleinsäure oder auch der Dauer der gesuchten Behandlung. Im allgemeinen werden sie, was die rekombinanten Viren gemäß der Erfindung angeht, in Dosisformen zwischen einschließlich 104 und 1014 pfu/ml und vorzugsweise 106 bis 1010 pfu/ml formuliert und verabreicht. Der Ausdruck pfu ("plaque forming unit") entspricht dem Infektionsvermögen einer Viruslösung, er wird bestimmt durch Infektion einer geeigneten Zellkultur und im allgemeinen nach 48 Stunden an der Anzahl der Flächen von infizierten Zellen gemessen. Die Techniken zur Bestimmung des Titers pfu einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
  • Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können beim Menschen für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurodegenerativen Erkrankungen und insbesondere für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neuronaler Degeneration, assoziiert mit Ischämie, Hypoxie, Anoxie, Hypoglycämie, epileptischen Attacken oder auch bei cerebralen oder spinalen Traumata, oder für die Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Veitstanz, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder amyotrophischer Lateralsklerose verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird noch vollständiger mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben werden, die nur als Veranschaulichung und nicht einschränkend betrachtet werden sollen.
  • Legende der Figuren
  • 1: Inhibierung des durch Glutamat induzierten zellularen Todes an primären Kulturen von kortikalen Neuronen durch eine Antisens-Nucleinsäure anti-p53
  • Allgemeine Technik des Klonens
  • Die in der Molekularbiologie angewendeten klassischen Techniken wie die präparativen Extraktionen von plasmidischer DNA, die Zentrifugierung von plasmidischer DNA in einem Gradienten von Cäsiumchlorid, die Elektrophorese an Gelen von Agarose oder Acrylamid, die Reinigung von Fragmenten von DNA durch Elektroelution, die Extraktionen von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die Fällung von DNA im Salzmedium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw. ... sind dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der Literatur beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
  • Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Serie M13 sind im Handel verfügbar (Bethesda Research Laboratories).
  • Für die Ligaturen können die Fragmente von DNA nach ihrer Größe durch Elektrophorese in Gelen von Agarose oder Acrylamid, Extraktionen mit Phenol oder mit einer Mischung von Phenol/Chloroform, Fällung mit Ethanol und anschließende Inkubation in Anwesenheit von DNA Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferers aufgeteilt werden.
  • Das Auffüllen der vorspringenden Enden 5' kann durch das Fragment von Klenow der DNA Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferers erfolgen. Die Destruktion der vorspringenden Enden 3' wird in Anwesenheit von DNA Polymerase des Phagen T4 (Biolabs) durchgeführt, angewendet nach dem Empfehlungen des Herstellers. Die Destruktion der vorspringenden Enden 5' wird mit Hilfe einer schonenden Behandlung durch Nuclease S1 durchgeführt.
  • Die in vitro durch synthetische Oligodeoxynucleotide dirigierte Mutagenese kann nach der durch Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Technik unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt werden.
  • Die enzymatische Vergrößerung der Fragmente von DNA durch die sogenannte Technik PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullfis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann unter Verwendung einer "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt werden.
  • Die Nachprüfung der nucleotidischen Sequenzen kann durch die von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelte Technik unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Verringerung des Infarktvolumens bei ischämisierten Mäusen durch Suppression des Gens p53
  • Dieses Beispiel beschreibt die Auswirkung der Suppression des Gens p53 auf das Infarktvolumens bei ischämisierten Mäusen. Zu diesem Zweck wurden Ischämien bei den Mäusen durch Okklusion der mittleren cerebralen Arterie induziert und die Infarktvolumina bestimmt und anschließend verglichen.
  • Protokoll: Die Tiere (männliche Mäuse C57/Blc im Alter von 9 bis 12 Wochen, Genpharm, Dänemark; Homozygoten wilder Typ oder Δp53) wurden in einer Mischung von Sauerstoff, Stickstoffprotoxid und 1,8% Halothan anästhesiert und während der gesamten Dauer des chirurgischen Eingriffs unter diesen Bedingungen gehalten. Die rektale Temperatur wurde durch eine Heizdecke bei 37°C ± 0,5°C gehalten. Anschließend wurde die linke mittlere cerebrale Arterie durch Elektrokoagulation mit Hilfe einer bipolaren Pinzette kauterisiert. Die Wunde wurde danach bedeckt und die Tiere 24 Stunden lang bei 30°C in einen Raum gebracht, mit Futter und Flüssigkeit nach Bedarf. Nach Ablauf von 24 Stunden wurden die Tiere durch Enthaupten getötet. Die Gehirne wurden entnommen, bei –30°C in ein Bad von Isopentan gebracht und dann bei –80°C aufbewahrt. Anschließend wurden in einem Kryostat bei –20°C histologische Schnitte von 40 μm vorgenommen, und zwar im Verhältnis von einem Schnitt alle 500 μm, vom Auftreten des Infarktes bis zu seinem Verschwinden. Diese Schnitte wurden dann mit Kresylviolett angefärbt. Das Infarktvolumen wurde durch Bildanalyse bestimmt. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des Test t von Student für unabhängige Gruppen nach der Überprüfung der Homogenität der Varianzen vorgenommen. In dem Fall, wo die Varianzen nicht homogen sind, wurde der nicht parametrische Test von Wilcoxon angewendet.
  • Ergebnisse: Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
  • Figure 00120001
  • Diese Ergebnisse lassen eine Verringerung in der Größenordnung von 20% der Infarktvolumina nach der Ischämie bei den Mäusen erkennen, die nicht das Gen p53 exprimiert haben. Diese Ergebnisse zeigen somit, daß eine Suppression der Wirkung von p53 ermöglicht, die neuronale Degeneration zu verlangsamen.
  • Beispiel 2: Inhibierung des durch Glutamat induzierten zellularen Todes an primären Kulturen von kortikalen Neuronen durch eine Antisens-Nucleinsäure anti-p53
  • Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung einer Antisens-Nucleinsäure anti-p53 auf den durch Glutamat induzierten zellularen Tod von kortikalen Neuronen der embryonalen Ratte in primärer Kultur. Das Glutamat ist der hauptsächliche Neurotransmitter-Anreger des Zentralnervensystems. Jedoch kann eine Exposition zu Glutamat während anormal langen Perioden oder bei höheren Konzentrationen als die physiologischen Konzentrationen eine neuronale Toxizität hervorrufen, bezeichnet mit dem Begriff Excitotoxizität [Olney Adv. Exp. Med. Biol. 203 (1986) 631]. Zahlreiche experimentelle Argumente legen nahe, daß dieser Typ von Toxizität zu der neuronalen Degeneration beiträgt, assoziiert mit Ischämie, Hypoxie, Hypoglycämie. epileptischen Attacken oder auch cerebralen Traumata [Choi, J. Neurobiol. 23 (1992) 1261]. Die Excitotoxizität würde ebenfalls bei der Pathogenese von Erkrankungen wie Huntington-Veitstanz [Young et al., Science 241 (1988) 981] und Alzheimer-Krankheit [Koh et al., Brain Res. 533 (1990) 315; Mattson et al,, J. Neurosci. 12 (1992) 376] einbezogen sein. Diese Beispiele zeigen, daß die toxische Wirkung von Glutamat teilweise in Anwe senheit einer Antisens-Nucleinsäure inhibiert wird, die fähig ist, die Expressionsbereiche des Proteins p53 zu reduzieren.
  • Herstellung und Sequenz der Antisens-Nucleinsäure: Das Antisens-Oligonucleotid wurde mit Hilfe eines automatischen Synthetisierers von Nucleotiden synthetisiert (Maniatis). Die Sequenz des Oligonucleotids ist die folgende: 5'-CGACTGTGAATCCTCCAT-3' (SEQ ID No. 1).
  • Untersuchung der Inhibierung: Die Kortexzellen von embryonalen Ratten Wistar (E17) wurden nach der Methode von Dichter [Brain Res. 149 (1978) 279] isoliert, in Schalen mit 6 Vertiefungen (35 mn; Dichte 6.105 Zellen/Schale) Costar, in einem Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), enthaltend 10 μg/ml Insulin, 10 μg/ml Transferrin, 10 ng/ml Natriumselenit, 10 nM Progesteron, 1 nM Triiodthyronin, kultiviert und in einem Trockenschrank (37°C, 5% CO2) aufbewahrt. Dann wurden 2 μM Antisens-Nucleinsäure anti-p53, wie oben beschrieben, zu den Kulturen gegeben, und zwar bei der Inseminierung und anschließend zu den Tagen 1 und 2. Danach wurde das Glutamat (5 mM) am Tag 2 verabreicht, in der gleichen Zeit wie die Antisens-Nucleinsäure anti-p53. Die durch das Glutamat induzierte Toxizität wurde nach 24 Stunden Kultur durch Messung der mitochondrialen Aktivität gemäß der von Manthorpe et al. [Dev. Brain. Res. 25 (1986) 191] beschriebenen Technik bestimmt.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 1 dargestellt. Sie zeigen deutlich, daß die Antisens-Nucleinsäure anti-p53 fähig ist, etwa 25% der durch Glutamat induzierten Toxizität zu reduzieren.
  • LISTE DER SEQUENZEN
    Figure 00140001

Claims (14)

  1. Verwendung einer Verbindung, die mindestens teilweise die Aktivität von Protein p53 inhibiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurodegenerativen Erkrankungen vorgesehen ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Verbindung handelt, die auf die Synthese von Protein p53 im transkriptionellen, translationellen oder post-translationellen Bereich und/oder auf die Bindung von p53 an die DNA einwirkt.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine doppelsträngige Nucleinsäure ist, umfassend ganz oder teilweise Bereiche der Bindung von p53 an die DNA.
  4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine Nucleinsäure ist, die für eine mutierte Form von Protein p53 kodiert, die fähig ist, dessen Aktivität zu antagonisieren.
  5. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine Antisens-Nucleinsäure ist, die fähig ist, die Bereiche der Expression von Protein p53 im transkriptionellen oder translationellen Bereich zu reduzieren.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antisens-Nucleinsäure eine DNA ist, die für eine Antisens-Ribonucleinsäure kodiert, die fähig ist, die Translation von zellulärer RNAm von p53 zu inhibieren.
  7. Verwendung nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure den Teil eines Vektors bildet.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure den Teil eines viralen Vektors bildet.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor, eingeordnet in seinem Genom, mindestens eine Nucleinsäure umfaßt, die für eine mutierte Form von Protein p53 kodiert, die fähig ist, dessen Aktivität zu antagonisieren, und/oder eine Nucleinsäure, die ganz oder teilweise Bereiche der Bindung von p53 an die DNA umfaßt, und/oder eine Antisens-Nucleinsäure, die fähig ist, die Bereiche der Expression von Protein p53 im transkriptionellen oder translationellen Bereich zu reduzieren.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Adenovirus, ein Retrovirus, ein adeno-assoziierter Virus oder ein Herpesvirus ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Adenovirus handelt.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure ganz oder teilweise die Sequenz SEQ ID No. 2 oder aktive Varianten davon umfaßt.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus mehrere identische oder unterschiedliche Nucleinsäuren umfaßt, wie in Anspruch 3 bis 5 definiert.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus ein defektiver Virus ist.
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