DE69435043T2 - Kontrolle der exprimierung des igf-i gens - Google Patents

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Vektoren, die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre therapeutischen Verwendungen. Genauer gesagt, betrifft sie neue Vektoren, die es ermöglichen, auf sehr selektive und sehr wirksame Weise auf die Expression von Genen einzuwirken.
  • Die Regulation der Expression von Zielgenen mithilfe von Oligonukleotiden bildet einen sich zunehmend entwickelnden therapeutischen Ansatz. Dieser Ansatz basiert auf der Fähigkeit von Oligonukleotiden, mit komplementären Regionen einer Nukleinsäure spezifisch zu hybridisieren und so spezifisch die Expression bestimmter Gene zu hemmen. Diese Hemmung kann entweder auf translationaler Ebene (Antisense-Oligonukleotid) oder auf transkriptionaler Ebene (Anti-Gen-Oligonukleotid) eingreifen.
  • Antisense-Oligonukleotide sind Nukleinsequenzen, die selektiv mit Boten-RNAs der Zielzelle hybridisieren können, um deren Translation in Protein zu hemmen. Diese Oligonukleotide bilden durch herkömmliche Wechselwirkung des Watson-Crick-Typs mit der Ziel-mRNA lokal doppelsträngige Bereiche des Typs RNA/mRNA oder sogar DNA/mRNA. Es kann sich beispielsweise um kleine synthetische Oligonukleotide handeln, die zu den zellulären mRNAs komplementär sind und in die Zielzellen eingebracht werden. Derartige Oligonukleotide wurden zum Beispiel im Patent Nr. EP 92 574 beschrieben. Es kann sich auch um Antisense-Gene handeln, deren Expression in der Zielzelle RNAs erzeugt, die zu zellulären mRNAs komplementär sind. Derartige Gene sind zum Beispiel im Patent Nr. EP 140 308 beschrieben worden. Molecular Endocrinology, S. 172, Bd. 7(2) 1993, Blood, Bd. 80(5) 1992, S. 1207–1212.
  • Vor kurzem hat man einen neuen Typ von Oligonukleotiden entdeckt, die in der Lage sind, die Expression von Zielgenen zu regulieren. Diese Oligonukleotide hybridisieren nicht mit zellulären mRNAs, sondern direkt mit der doppelsträngigen genomischen DNA. Dieser neue Ansatz besteht darin, dass gezeigt wurde, dass bestimmte Oligonukleotide spezifisch mit der großen Furche der doppelsträngigen DNA Wechselwirken und örtlich Tripelhelices bilden können, was zu einer Hemmung der Transkription der Zielgene führt. Diese Oligonukleotide erkennen selektiv die doppelsträngige DNA an Oligopurin.Oligopyrimidin-Sequenzen, d. h. an Regionen, die eine Oligopurin-Sequenz auf einem Strang und eine Oligopyrimidin-Sequenz auf dem komplementären Strang aufweisen, und bilden dort örtlich eine Tripelhelix. Die Basen des dritten Stranges (des Oligonukleotids) bilden Wasserstoffbindungen (Hoogsteen- oder inverse Hoogsteen-Bindungen) mit den Purinen von Watson-Crick-Basenpaaren. Die Anti-Gen-Oligonukleotide können die folgenden Basen enthalten:
    • – Thymidin (T), das Tripletts mit den A.T-Dubletts der doppelsträngigen DNA bilden kann (Rajagopal et al., Biochem. 28 (1989) 7859);
    • – Adenin (A), das Tripletts mit den A.T-Dubletts der doppelsträngigen DNA bilden kann;
    • – Guanin (G), das Tripletts mit den G.C-Dubletts der doppelsträngigen DNA bilden kann;
    • – protoniertes Cytosin (C+), das Tripletts mit den G.C-Dubletts der doppelsträngigen DNA bilden kann (Rajagopal et al., siehe oben).
  • Anti-Gen-Oligonukleotide sind insbesondere von Helene in Anti-Cancer drugs design 6 (1991) 569, PNAS 90, S. 10013–10017 (1993) beschrieben worden.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt einen neuen Ansatz zur Steuerung der Expression von Zielgenen. Sie besteht insbesondere darin, dass gezeigt wurde, dass es möglich ist, genetisch in vivo therapeutische RNAs herzustellen, die Tripelhelices mit einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäuren bilden können. Vorzugsweise besteht sie in der genetischen In-vivo-Produktion von therapeutischen RNAs, die Tripelhelices mit Ribonukleinsäure-Zielen bilden können.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere doppelsträngige DNA-Sequenzen, die für derartige therapeutische RNAs codieren. Sie betrifft auch die Vektoren, die zur In-vivo-Produktion dieser therapeutischen RNAs, insbesondere im Rahmen einer Gentherapie, verwendbar sind. Sie betrifft auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche diese doppelsträngigen DNAs oder diese Vektoren enthalten.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Regulation der Expression zellulärer Gene durch Transformation von Zielzellen mit einem Vektor, wie vorstehend erwähnt.
  • Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung somit eine doppelsträngige DNA, die für eine RNA codiert, die mit einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure eine Tripelhelix bilden kann.
  • Die erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNAs codieren insbesondere für zusammengesetzte RNAs, die mindestens Folgendes enthalten:
    • – eine erste Region, die eine Doppelhelix mit der einzelsträngigen Zielnukleinsäure oder mit einem Teil davon bilden kann,
    • – eine zweite Region, die eine Tripelhelix mit der so gebildeten Doppelhelix oder mit einem Teil davon bilden kann, und
    • – einen oder zwei Arme, welche die zwei Regionen verbinden, wobei jede der Regionen kontinuierlich oder unterbrochen sein kann.
  • Bei einer ersten besonderen Ausführungsform der Erfindung bildet die erste Region der zusammengesetzten RNA eine Doppelhelix mit der einzelsträngigen Zielnukleinsäure durch herkömmliche Wechselwirkung des Watson-Crick-Typs, und dann bildet die zweite Region mit dieser Doppelhelix oder mit einem Teil davon eine Tripelhelix durch Wasserstoffbindungen (des Hoogsteen- oder inversen Hoogsteen-Typs) (siehe 1–4).
  • Bei einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung bilden die zwei Regionen der erfindungsgemäßen zusammengesetzten RNA untereinander eine Doppelhelix durch Paarung des Watson-Crick-Typs, wobei diese Doppelhelix mit der einzelsträngigen Zielnukleinsäure durch Wasserstoffbindungen (des Hoogsteen- oder inversen Hoogsteen-Typs) wechselwirkt, so dass eine Tripelhelix gebildet wird (siehe 5).
  • Die einzelsträngige Zielnukleinsäure kann eine RNA sein, wie zum Beispiel eine Boten-RNA (mRNA), eine Transfer-RNA (tRNA), eine ribosomale RNA (rRNA) oder eine virale RNA. Es kann sich auch um eine einzelsträngige DNA handeln, die beispielsweise während der Replikation von doppelsträngiger DNA auftritt, oder um eine DNA-Region, die von Natur aus lokal geöffnet ist.
  • Genauer gesagt, können die erfindungsgemäßen RNAs Tripelhelices mit den einzelsträngigen Zielnukleinsäuren in Regionen bilden, die vorzugsweise aus Purin-Basen (A und G: polyPu-Region) oder Pyrimidin-Basen (T/U und C: polyPy-Region) oder T/U- und G-Basen (polyT/U,G-Region) bestehen.
  • Wenn also die Zielnukleinsäure (oder eine bestimmte Region von dieser) im Wesentlichen aus Purin-Basen (polyPu) besteht, kann die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine erste Region umfassen, die aus komplementären Pyrimidin-Basen besteht (Watson-Crick Region), einen oder zwei Oligonukleotid-Arme und eine zweite Region (Hoogsteen-Region), die aus den Basen U, C und/oder G besteht, die mit den Purin-Basen der gebildeten Doppelhelix gemäß der nachstehend beschriebenen Paarung wechselwirkt: die Basen C und G können Wasserstoffbindungen mit dem Guanin von G.C-Dubletts bilden; die Base U kann Wasserstoffbindungen mit dem Adenin von A.T- oder A.U-Dubletts bilden.
  • Bei dieser Ausführungsform bildet die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine Schleife um die Zielnukleinsäure oder einen Teil von dieser gemäß der in 1a dargestellten Konfiguration.
  • Wenn die Zielnukleinsäure (oder eine bestimmte Region von dieser) im Wesentlichen aus Pyrimidin-Basen (polyPy) besteht, kann die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine erste Region umfassen, die aus komplementären Purin-Basen besteht (Watson-Crick-Region), einen oder zwei Oligonukleotid-Arme und eine zweite Region (Hoogsteen-Region), die aus den Basen U und G oder A und G besteht, die mit den Purin-Basen der gebildeten Doppelhelix gemäß der nachstehend beschriebenen Paarung wechselwirkt: die Base G kann Wasserstoffbindungen (inverse Hoogsteen-Bindungen) mit dem Guanin von G.C-Dubletts bilden; die Basen U und A können Wasserstoffbindungen mit dem Adenin von A.T- oder A.U-Dubletts bilden.
  • Bei dieser Ausführungsform bildet die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine Schleife parallel zur Zielnukleinsäure gemäß der in 2 dargestellten Konfiguration.
  • Wenn die Zielnukleinsäure (oder eine bestimmte Region von dieser) im Wesentlichen aus T/U,C- oder T/U,G-Basen besteht, kann die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine erste Region umfassen, die aus komplementären Purin-Basen besteht (Watson-Crick-Region), einen oder zwei Oligonukleotid-Arme und eine zweite Region, die aus zu den Purin-Basen komplementären Pyrimidin-Basen besteht (ebenfalls Watson-Crick-Region), wobei die 2 Regionen der therapeutischen RNA eine Watson-Crick-Doppelhelix bilden, deren Purin-Strang mit der Zielnukleinsäure unter Bildung von Hoogsteen- und inversen Hoogsteen-Bindungen wechselwirkt.
  • Bei dieser Ausführungsform bildet die erfindungsgemäße therapeutische RNA eine Schleife parallel zur Zielnukleinsäure gemäß der in 5 dargestellten Konfiguration.
  • Selbstverständlich kann ein Fachmann je nach der Zusammensetzung der gewählten einzelsträngigen Zielnukleinsäure andere erfindungsgemäße doppelsträngige DNA-Sequenzen festlegen, die auf der Paarung von Watson-Crick- und Hoogsteen- oder inversen Hoogsteen-Dubletts basieren.
  • Der oder die Arme, welche die zwei Regionen der erfindungsgemäßen therapeutischen RNAs verbinden, sind Oligonukleotidsequenzen, die jede Base enthalten können, die Bestandteil der RNA ist (A, U, G oder C). Die Sequenz des Arms darf sich vorzugsweise nicht selbst mit der Ziel-Nukleinsäure paaren können, um die Bildung der lokalen Tripelhelix nicht zu stören. Die Länge dieses Arms kann von einem Fachmann in Abhängigkeit von der Zielnukleinsäure angepasst werden. Im Allgemeinen umfasst er zwischen 3 und 6, vorzugsweise zwischen 3 und 5, Basen.
  • Bei einer bestimmten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNAs außerdem für zusammengesetzte RNAs codieren, die zwei Oligonukleotid-Arme enthalten, welche die Bildung von zwei Schleifen um die und/oder parallel zu der einzelsträngigen Zielnukleinsäure ermöglichen. Derartige zusammengesetzte RNAs weisen besonders vorteilhafte Eigenschaften auf:
    • – Vor allem gestatten sie es, die Stabilität der gebildeten Tripelhelix sowie ihre therapeutische Wirksamkeit aufgrund einer noch größeren sterischen Hinderung noch weiter zu erhöhen (vgl. 1b, 1c, 3 und 4).
    • – Sie gestatten es, einzelsträngige Nukleinsäuren an Oligopurin- oder Oligopyrimidin-Regionen anzusteuern, die jeweils durch Pyrimidin- oder Purin-Basen unterbrochen werden, wodurch die Hoogsteen- oder die inverse Hoogsteen-Region unterbrochen wird (vgl. 3a und 3b). Dadurch lässt sich der Anwendungsbereich dieser therapeutischen RNAs auf jeden Typ der Region einer einzelsträngigen Nukleinsäure ausweiten.
    • – Sie gestatten es ferner, einzelsträngige Nukleinsäuren anzusteuern, die aus einer Aneinanderreihung einer Oligopurin-Region und einer Oligopyrimidin-Region bestehen (4). Dies verbreitert den Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen therapeutischen RNAs noch mehr.
  • Bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung codiert die doppelsträngige DNA somit für eine zusammengesetzte RNA, umfassend:
    • – eine erste Region, die eine Doppelhelix mit der einzelsträngigen Zielnukleinsäure oder mit einem Teil von dieser bilden kann,
    • – eine zweite Region, die eine Tripelhelix mit der so gebildeten Doppelhelix oder mit einem Teil von dieser bilden kann, und
    • – 2 Arme, die jede der zwei Regionen an ihren Enden verbinden (1b, 1c, 3 und 4).
  • Bei dieser Ausführungsform ist eine der 2 Regionen der zusammengesetzten RNA (Watson-Crick (1b), Hoogsteen (1c und 3a) oder inverse Hoogsteen (3b)) unterbrochen, weil sie die Transkriptionsinitiationsstelle enthält.
  • Bei einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung codiert die doppelsträngige DNA für eine zusammengesetzte RNA, umfassend:
    • – eine erste Region, die eine Doppelhelix mit einer Oligopurin-Region der einzelsträngigen Zielnukleinsäure bilden kann,
    • – einen Arm,
    • – eine zweite Region, die eine Tripelhelix mit der so gebildeten Doppelhelix oder mit einem Teil von dieser bilden kann,
    • – eine dritte Region, anschließend an die erste, die eine Doppelhelix mit einer Oligopyrimidin-Region der einzelsträngigen Zielnukleinsäure bilden kann,
    • – einen zweiten Arm und
    • – eine vierte Region, anschließend an die dritte, die eine Tripelhelix mit der so gebildeten Doppelhelix oder mit einem Teil von dieser bilden kann (4).
  • Vorzugsweise besitzen die erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNAs (und die codierten zusammengesetzten RNAs) eine Länge von mehr als 10 Basen und noch stärker bevorzugt mehr als 15 Basen. Diese Länge wird von einem Fachmann in Abhängigkeit von der Länge der einzelsträngigen Zielnukleinsäure angepasst, um die Stabilität, die Spezifität und die Selektivität der therapeutischen RNA sicherzustellen. Um die Stabilität der Tripelhelix zu verbessern, kann es außerdem von Interesse sein, eine der Regionen der zusammengesetzten RNA, vorzugsweise die Region, die eine Doppelhelix bildet, zu verlängern.
  • Die doppelsträngige DNA kann eine synthetische oder halbsynthetische DNA sein. Sie kann durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist, und insbesondere mithilfe von Nukleinsäuresyntheseapparaturen erhalten werden. Die Sequenz dieser DNA wird in Abhängigkeit von dem gewählten zellulären Ziel festlegt, wie vorstehend angegeben.
  • Vorteilhafterweise enthält die erfindungsgemäße doppelsträngige DNA auch Signale, welche die Transkription (die Produktion) der erfindungsgemäßen therapeutischen RNAs in den Zielzellen ermöglichen. Diese Signale umfassen Sequenzen, welche die Initiation der Transkription ermöglichen (Promotoren), und gegebenenfalls Signale, die das Anhalten der Transkription ermöglichen (Terminatoren), sowie Signale, welche die Stabilisierung der RNAs ermöglichen (zum Beispiel ein polyA-Schwanz). Diese verschiedenen Signale können konstitutiv oder reguliert sein. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen eukaryotischer oder viraler Gene oder um synthetische Promotoren handeln. Es kann sich zum Beispiel um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle stammen, die man infizieren möchte. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man zum Beispiel die E1A-, MLP-, CMV-, RSV-, HIV-Promotoren usw. erwähnen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungs-, Regulationssequenzen usw. modifiziert sein. Wenn die doppelsträngige DNA keine Expressionssequenzen enthält, kann sie außerdem in einen Vektor stromabwärts einer derartigen Sequenz eingesetzt werden. Ein besonders interessantes Expressionssystem besteht aus der Verwendung von Transkriptionspromotoren, die spezifisch durch RNA-Polymerase III gesteuert werden. Tatsächlich ist die RNA-Polymerase III für die Synthese kleiner zytoplasmatischer oder nukleärer RNAs verantwortlich, die eine erhöhte Stabilität aufweisen und nicht in Protein translatiert werden. Diese kleinen RNAs sind insbesondere die tRNAs, die rRNAs oder bestimmte virale RNAs, wie insbesondere die VA-RNAs des Adenovirus. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst die doppelsträngige DNA einen Promotor, der spezifisch durch RNA Polymerase III abgelesen wird. Genauer gesagt, kann die doppelsträngige DNA in ein Gen inseriert werden, das spezifisch durch RNA-Polymerase III transkribiert wird ( FR 2,687,411 ), oder stromabwärts eines derartigen Gens fusioniert werden ( EP 387 775 ).
  • Die vorliegende Erfindung bietet viele Vorteile im Vergleich zu den Techniken des Standes der Technik zur Steuerung der Expression von Genen. Insbesondere kann durch die In-vivo-Produktion von erfindungsgemäßen RNAs, die Tripelhelices mit einzelsträngigen zellulären Nukleinsäuren bilden können, die Selektivität der therapeutischen Moleküle für ihre zellulären Ziele erhöht werden. Die Verwendung von Oligonukleotiden als Therapeutika bewirkt tatsächlich eine spezifische und selektive Erkennung des zellulären Ziels. So unterscheidet sich zum Beispiel im Falle von ras die mRNA des Onkogens von derjenigen des Protoonkogens nur in einer Punktmutation. In diesem Fall ist es wichtig, dass das Oligonukleotid die Expression des Onkogens so wirksam wie möglich hemmt, ohne jedoch diejenige des Protoonkogens zu beeinflussen. Es ist folglich entscheidend, dass man über sehr gut unterscheidende Therapeutika verfügt. Im Falle der herkömmlichen Antisense-Moleküle wird jede Base der Zielsequenz durch eine einzige Base der Oligonukleotidsequenz erkannt, und eine einzige Fehlpaarung kann nur einen kleinen Einfluss auf die Bildung und die Stabilität des Doppelstranges haben. Im Falle der erfindungsgemäßen therapeutischen Moleküle ist jedoch eine doppelte Erkennung notwendig (jede Base in der Zielsequenz wird durch 2 Basen der therapeutischen RNA erkannt), wodurch das Unterscheidungsvermögen stark erhöht wird.
  • Die im Rahmen der Erfindung produzierten therapeutischen RNAs besitzen ferner eine bessere therapeutische Wirksamkeit als die herkömmlichen Antisense-Moleküle. Tatsächlich ist die physikalische Hinderung, die durch die erfindungsgemäßen therapeutischen Moleküle erzeugt wird, größer als bei den herkömmlichen Antisense-Molekülen, weil erstere eine Schleife um das Ziel bilden, die das Absetzen einer reversen Transkriptase oder einer DNA-Polymerase hervorrufen kann, und sie folglich in Höhe der Translation der mRNA in Protein mit dem in der Elongation befindlichen Ribosom, den Enzymen und/oder anderen beteiligten Faktoren Wechselwirken können.
  • Außerdem bilden die erfindungsgemäßen Moleküle aufgrund der Bildung einer Tripelhelix (Watson-Crick- und Hoogsteen- oder inverse Hoogsteen-Bindungen) mit den Zielnukleinsäuren stabilere Komplexe als die herkömmlichen Antisense-Moleküle. Diese Eigenschaft verstärkt die Vorteile der erfindungsgemäßen Moleküle noch weiter, die somit besonders leistungsfähige Therapeutika sind.
  • Weil die erfindungsgemäßen therapeutischen Moleküle in vivo erzeugt werden können, können diese therapeutischen Moleküle schließlich in erhöhten Spiegeln ausgehend von einer einzelnen, in die Zielzelle eingeführten doppelsträngigen DNA (oder einem Vektor, der sie enthält) produziert werden. Außerdem wird dadurch die Herstellung dieser Moleküle direkt in den gewünschten Zellkompartimenten der Zielzelle ermöglicht.
  • Die erfindungsgemäße doppelsträngige DNA kann als solche, zum Beispiel nach Injektion in einen Menschen oder ein Tier, zur Regulation der Expression eines gegebenen Gens eingesetzt werden. Insbesondere kann sie in Form von nackter DNA gemäß der in der Anmeldung WO 90/11092 beschriebenen Technik injiziert werden. Sie kann auch in komplexer Form verabreicht werden, zum Beispiel mit DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), mit Kernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375) oder mit Lipiden (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413). Sie kann auch in einen Vektor eingebracht werden, wie ein Liposom (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) oder ein Nanopartikel. Liposomen sind Phospholipidvesikel, die eine interne wässrige Phase enthalten, in der die Nukleinsäuren eingekapselt werden können. Die Synthese von Liposomen und ihre Verwendung zum Transfer von Nukleinsäuren ist im Stand der Technik bekannt ( WO91/06309 , WO92/19752 , WO92/19730 ). Nanopartikel sind kleine Teilchen, im Allgemeinen kleiner als 500 nm, die ein Wirkprinzip (wie eine Nukleinsäure) in die Zellen oder im Blutkreislauf transportieren oder vektorisieren können. Die Nanopartikel können aus Polymeren bestehen, die einen Großteil an abbaubaren Einheiten enthalten, wie Polymilchsäure, die gegebenenfalls mit Polyethylenglykol copolymerisiert ist. Andere zur Herstellung von Nanopartikeln verwendbare Polymere sind im Stand der Technik beschrieben (siehe zum Beispiel EP 275 796 ; EP 520 889 ).
  • Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße doppelsträngige DNA Teil eines Vektors. Die Verwendung eines derartigen Vektors ermöglicht tatsächlich eine Verbesserung der Wirksamkeit des Transfers der doppelsträngigen DNA in die Zielzellen und gleichzeitig eine Erhöhung ihrer Stabilität in diesen Zellen, wodurch eine dauerhafte therapeutische Wirkung erhalten wird. Außerdem ermöglicht die Verwendung von Vektoren auch die Ansteuerung bestimmter Populationen von Zellen, in denen die therapeutischen Moleküle produziert werden sollen. Außerdem ist es möglich, mehrere doppelsträngige DNAs in den gleichen Vektor einzubringen, wodurch ebenfalls die Wirksamkeit der Behandlung erhöht wird.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung betrifft folglich einen Vektor, der eine doppelsträngige DNA umfasst, die für eine RNA codiert, die eine Tripelhelix mit einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure bilden kann.
  • Der verwendete Vektor kann aus verschiedenen Quellen stammen, solange er in der Lage ist, tierische Zellen, vorzugsweise menschliche Zellen, zu transformieren. Es kann sich auch um einen Plasmid- oder einen viralen Vektor handeln. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein viraler Vektor eingesetzt, der aus Adenoviren, Retroviren, adenoassoziierten Viren (AAV), dem Herpesvirus, dem Cytomegalievirus, dem Vakzinevirus usw. ausgewählt werden kann.
  • In dieser Hinsicht ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung auch jedes rekombinante Virus, das eine doppelsträngige DNA, inseriert in sein Genom, umfasst, die für eine RNA codiert, die in der Lage ist, eine Tripelhelix mit einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure zu bilden.
  • Die Vektoren, die von Adenoviren, Retroviren oder AAVs stammen und heterologe Nukleinsäuresequenzen enthalten, sind in der Literatur beschrieben [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573 , Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer und Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088 ].
  • Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße rekombinante Virus ein defektives Virus. Der Begriff "defektives Virus" bezeichnet ein Virus, das sich in der Zielzelle nicht replizieren kann. Im Allgemeinen fehlen in dem Genom der defektiven Viren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, folglich mindestens die Sequenzen, die für die Replikation des Virus in der infizierten Zelle notwendig sind. Diese Regionen können entweder (insgesamt oder teilweise) entfernt oder nicht-funktional gemacht worden sein oder durch andere Sequenzen und besonders durch die Sequenz der erfindungsgemäßen doppelsträngigen Nukleinsäure ersetzt worden sein. Vorzugsweise behält das defektive Virus dennoch die Sequenzen seines Genoms bei, die für die Einkapselung der Viruspartikel notwendig sind.
  • Es ist besonders vorteilhaft, wenn die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in einer Form eingesetzt werden, die in einem defektiven rekombinanten Adenovirus enthalten ist.
  • Tatsächlich existieren verschiedene Adenovirus-Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren, die aber für den Menschen und insbesondere für nicht-immunsupprimierte Patienten nicht pathogen sind. Außerdem integrieren sich diese Viren nicht in das Genom der Zellen, die sie infizieren, und können große exogene DNA-Fragmente aufnehmen. Unter den verschiedenen Serotypen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) eingesetzt. Im Falle der Adenoviren Ad 5 sind die für die Replikation benötigten Sequenzen die Regionen E1A und E1B. Wie vorstehend angegeben, ist es ganz besonders vorteilhaft, ein defektives rekombinantes Adenovirus zu verwenden, dass eine erfindungsgemäße doppelsträngige DNA, inseriert in ein VA-Gen, enthält.
  • Weil die erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNAs so klein sind, kann man außerdem vorteilhafterweise gleichzeitig in den gleichen Vektor mehrere dieser DNAs einbringen, die identisch (gegen die gleiche Zielnukleinsäure gerichtet) oder unterschiedlich (gegen andere Zielnukleinsäuren gerichtet) sind. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht somit aus einem, insbesondere viralen, Vektor, der mindestens zwei doppelsträngige DNAs, wie oben definiert, umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten Viren können durch homologe Rekombination zwischen einem defektiven Virus und einem Plasmid hergestellt werden, das unter anderem die doppelsträngige DNA, wie vorstehend definiert, trägt (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Die homologe Rekombination erfolgt nach Cotransfektion des Virus und des Plasmids in eine geeignete Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch diese Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen umfassen, die den defektiven Teil des Virusgenoms komplementieren können, vorzugsweise in integrierter Form, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie, die zur Herstellung defektiver rekombinanter Adenoviren oder AAVs verwendbar ist, kann man die Linie 293 aus menschlicher embryonaler Niere nennen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die integriert in ihr Genom insbesondere den linken Teil des Genoms eines Ad5-Adenovirus enthält (12%). Als Beispiel für eine Linie, die zur Herstellung defektiver rekombinanter Retroviren verwendbar ist, kann man die Linie CRIP nennen (Danos und Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
  • Anschließend werden die Viren, die sich vermehrt haben, gewonnen und gemäß herkömmlichen molekularbiologischen Techniken gereinigt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Vektor oder eine doppelsträngige DNA, wie oben definiert, enthält.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Hinblick auf ihre Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem usw. Weg formuliert werden.
  • Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen pharmazeutisch zulässige Vehikel für eine injizierbare Formulierung. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Kochsalzlösungen (Mononatrium-, Dinatriumphosphat, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid usw. oder Gemische solcher Salze) handeln oder um trockene, insbesondere gefriergetrocknete, Zusammensetzungen, mit denen je nachdem durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum injizierbare Lösungen hergestellt werden können.
  • Die Dosen an DNA (oder Vektor), die zur Verabreichung eingesetzt werden, können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepasst werden und insbesondere in Abhängigkeit von der verwendeten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie, der Nukleinsäure, die exprimiert werden soll, oder auch der gewünschten Dauer der Behandlung. Im allgemeinen werden erfindungsgemäße rekombinante Viren in Form von Dosen zwischen von 104 und 1014 pfu/ml und vorzugsweise 106 bis 1010 pfu/ml formuliert und verabreicht. Der Begriff pfu (plaque-forming unit, Plaquebildende Einheit) entspricht den Infektionsvermögen einer Viruslösung und wird festgestellt, indem man eine geeignete Zellkultur infiziert und im Allgemeinen nach 48 Stunden die Anzahl an Plaques infizierter Zellen misst. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer Viruslösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
  • Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können beim Menschen zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten, die aufgrund einer anomalen Expression von Genen entstehen (Überexpression eines zellulären Gens, Expression eines mutierten Gens usw.), oder viraler Erkrankungen (HIV, Herpes, Hepatitis usw.) eingesetzt werden.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Regulation der Expression von Genen in einer bestimmten Zelle, welches das Einbringen einer doppelsträngigen DNA, wie vorstehend definiert, in diese Zelle umfasst. Diese DNA kann als solche oder, wie oben beschrieben, nach ihrem Einbringen in einen Vektor verabreicht werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist ganz besonders im Rahmen einer Zelltherapie einsetzbar, wobei die Expression von Genen in bestimmten, aus einem Organismus entnommenen Zellpopulationen vor ihrer erneuten Verabreichung ex vivo modifiziert wird. Es kann sich um ein Gen handeln, dessen Expressionsspiegel bei der betreffenden Pathologie modifiziert sind (z. B. Onkogen, virales Gen), oder um ein Gen, dessen Expressionsspiegel nicht beeinflusst wird, aber an der Entwicklung der Pathologie beteiligt ist.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur In-vivo-Regulation der Expression von Genen, welches die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, umfasst.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten infolge einer anomalen Expression von Genen, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben definiert, die eine doppelsträngige DNA umfasst, die für eine RNA codiert, die in der Lage ist, die Expression dieser Gene zu modifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird mithilfe der folgenden Beispiele vollständiger beschrieben, die als veranschaulichend und nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.
  • Allgemeine Klonierungstechniken
  • Die herkömmlichen Verfahren, die in der Molekularbiologie verwendet werden, wie präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchlorid-Gradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die Fällung von DNA in salzhaltigem Medium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw. sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur oft beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
  • Die Plasmide des Typs pBR322, pUC und pSP65 und die Phagen der M13-Reihe stammen aus einer kommerziellen Quelle (Bethesda Research Laboratories, Promega).
  • Für Ligationen können die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe durch Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen aufgetrennt, mit Phenol oder mit einem Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und dann in Anwesenheit der DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert werden.
  • Das Auffüllen der überstehenden 5'-Enden kann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Angaben des Zuliefers durchgeführt werden. Der Abbau der überstehenden 3'-Enden wird in Anwesenheit von DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 (Biolabs) durchgeführt, die gemäß den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt wird. Der Abbau der vorstehenden 5'-Enden wird durch eine schonende Behandlung mit Nuklease S1 durchgeführt.
  • Die gerichtete In-vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynukleotide kann gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das von Taylor et al. entwickelt wurde [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764], wobei das von Amersham vertriebene Kit verwendet wird.
  • Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die so genannte PCR-Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann unter Verwendung eines "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt werden.
  • Die Bestätigung von Nukleotidsequenzen kann durch das Verfahren durchgeführt werden, das von Sanger et al. entwickelt wurde [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467], wobei das von Amersham vertriebene Kit eingesetzt wird.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 4: Synthese von doppelsträngiger DNA, die für tripelhelikale RNAs codiert, die gegen das IGF-I-(Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I-)Gen gerichtet sind
  • Dieses Beispiel beschreibt die Synthese verschiedener doppelsträngiger DNAs, die für tripelhelikale RNAs codieren, die gegen das IGF-I-Gen in Höhe einer Region zwischen den Resten 40 und 62 (SEQ ID NR: 16) gerichtet sind.
  • Diese oben genannte Region des IGF-I-Gens umfasst 23 Purin-Basen und befindet sich im 5'-Teil des Gens, der transkribiert, aber nicht translatiert wird.
  • Verschiedene doppelsträngige DNAs, die für erfindungsgemäße tripelhelikale RNAs codieren, die gegen dieses Ziel gerichtet sind, wurden synthetisiert. Die Synthese erfolgte mithilfe eines automatischen Nukleotidsynthesegerätes unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie gemäß der von Giovannangeli et al. beschriebenen Technik (J. Am. Chem. Soc. 113 (1991) 7775). Die Sequenz dieser DNAs ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.
  • Figure 00180001

Claims (8)

  1. Doppelsträngige DNA, die eine RNA codiert, die in der Lage ist, eine Tripelhelix in einer Region zwischen den Resten 40 und 62 (SEQ ID NR: 16) einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure, die IGF-I codiert, zu bilden.
  2. Doppelsträngige DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz SEQ ID NR: 17 umfasst.
  3. Expressionsvektor, umfassend eine doppelsträngige DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche.
  4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein rekombinantes Virus handelt.
  5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus aus Adenoviren, Retroviren, adenoassoziierten Viren, dem Herpesvirus, dem Cytomegalievirus und dem Vakzinevirus ausgewählt ist.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein defektives Virus handelt.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine doppelsträngige DNA oder einen Vektor nach einem der vorstehenden Ansprüche.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine doppelsträngige DNA nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in einer mit DEAE-Dextran, nukleären Proteinen oder Lipiden komplexierten Form, in einer rohen oder auch in einer in Liposomen oder Nanopartikel eingebauten Form.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CA2487328A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd. Sirna for control of gene expression
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6525185B1 (en) 1998-05-07 2003-02-25 Affymetrix, Inc. Polymorphisms associated with hypertension
JPH11335269A (ja) 1998-05-19 1999-12-07 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc 遺伝子関連医薬の経口投与固形製剤
EP2314700A1 (de) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Zusammensetzung und Verfahren zur in vivo und in vitro Abschwächung der Genexpression mittels dobbelsträngiger RNA
BR0009884A (pt) * 1999-04-21 2002-01-08 American Home Prod Processos e composições para a inibição da função das sequências de polinucleotìdeos
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
CA2369944A1 (en) * 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
FR2822476B1 (fr) 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
US20040009937A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
US20050075298A1 (en) * 2002-01-31 2005-04-07 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa
US20040043003A1 (en) * 2002-01-31 2004-03-04 Wei Chen Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions
US20030166282A1 (en) 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
EP2221377B2 (de) 2002-02-01 2017-05-17 Life Technologies Corporation Doppelsträngige Oligonukleotide
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
EP2671082B1 (de) 2011-02-02 2020-01-15 Amgen Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur hemmung von igf-1r
EP2776042B1 (de) 2011-11-11 2019-03-20 Duke University Wirkstoffkombinationstherapie zur behandlung von soliden tumoren
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
WO2017129763A1 (en) 2016-01-28 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of signet ring cell gastric cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
WO1993012234A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 Sri International Antiviral reagents based on rna-binding proteins
FR2687411A1 (fr) * 1992-02-13 1993-08-20 Nice Sophia Antipolis Universi Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn.
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby

Also Published As

Publication number Publication date
EP0737248B1 (de) 2007-11-14
IL112195A0 (en) 1995-03-15
EP0737248A1 (de) 1996-10-16
WO1995018223A1 (fr) 1995-07-06
IL112195A (en) 2004-08-31
FR2714383B1 (fr) 1996-02-09
FR2714383A1 (fr) 1995-06-30
JPH09507387A (ja) 1997-07-29
US6133024A (en) 2000-10-17
CA2180032A1 (fr) 1995-07-06
NO962707L (no) 1996-06-26
FI962693A0 (fi) 1996-06-28
NO962707D0 (no) 1996-06-26
FI120740B (fi) 2010-02-15
AU1388495A (en) 1995-07-17
ES2297830T3 (es) 2008-05-01
EP1939290A2 (de) 2008-07-02
EP1939290A3 (de) 2011-07-06
CA2180032C (fr) 2010-08-10
ATE378405T1 (de) 2007-11-15
DE69435043D1 (de) 2007-12-27
PT737248E (pt) 2008-02-25
FI962693A (fi) 1996-06-28
DK0737248T3 (da) 2008-03-25
ZA9410367B (en) 1995-09-20

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