DE69433996T2 - Verwendung pharmazeutischer zusammensetzungen zur behandlung von neurodegenerativen krankheiten - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen, die auf die Wechselwirkung zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Transkriptionsfaktor AP1 wirken, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten bestimmt ist.
  • Die vorliegende Erfindung resultiert zum Teil aus der Feststellung, dass der Faktor AP1 einen Mediator der neuronalen Degeneration bildet und dass die Verwendung von Verbindungen, die fähig sind, die Aktivität dieses Komplexes zu inhibieren, den Prozess des neuronalen Tods blockieren können. Sie resultiert auch aus der Feststellung, dass Nukleinsäuren, die der Wechselwirkungsstelle eines Transkriptionsfaktors mit DNA entsprechen, fähig sind, die Aktivität dieses Transkriptionsfaktors wenigstens teilweise zu inhibieren.
  • Um die molekularen Mechanismen der neuronalen Degeneration zu untersuchen, hat die Anmelderin die durch Glutamat induzierte Toxizität als Modell verwendet. Glutamat ist der Haupt-Neurotransmitter-Erreger des Zentralnervensystems. Jedoch kann eine Glutamat-Exposition während anormal langer Zeiträume oder bei höheren Konzentrationen als die physiologischen Konzentrationen eine neuronale Toxizität hervorrufen, die mit dem Begriff Excitotoxizität benannt ist (Olney Adv. Exp. Med. Biol. 203 (1986) 631). Zahlreiche experimentelle Argumente legen nahe, dass dieser Toxizitätstyp zur neuronalen Degeneration beiträgt, die mit Ischämie, Hypoxie, Hypoglykämie, epileptischen Anfällen oder auch cerebralen Traumata verbunden ist (Choi, J. Neurobiol. 23 (1992) 1261). Die Excitotoxizität könnte gleichermaßen in der Pathogenese von Krankheiten wie Chorea Huntington (Young et al., Science 241 (1988) 981) und Alzheimer-Krankheit (Koh et al., Brain Res. 533 (1990) 315; Mattson et al.; J. Neurosci. 12 (1992) 376) involviert sein.
  • Genauer ausgedrückt, die Anmelderin hat den durch Glutamat-induzierten Tod an kortikalen Neuronen von Rattenembryonen in Primärkultur untersucht. Frühere Arbeiten konnten zeigen, dass die Bindung des Glutamats an seine Membranrezeptoren die Depolarisation der Zellmembran und die Erhöhung des intrazellulären Calciums hervorruft, was zur Aktivierung einer Kaskade von Second Messengers führt, die mehrere Enzymfamilien umfasst. Die Anmelderin hat die Modulation der Gene der früheren Antwort, die für die Transkriptionsfaktoren codieren, die ihrerseits mit regulatorischen Sequenzen bestimmter Gene wechselwirken, die ihre Expression aktivieren oder unterdrücken, auf genetischem Niveau untersucht. Die Anmelderin konnte insbesondere in überraschenderweise zeigen, dass die Behandlung (bzw. Exposition) kortikaler Zellen mit Glutamat oder anderen Excitotoxinen, wie z. B. NMDA, die Erhöhung der Anzahl von Proteinkomplexen hervorruft, die geeignet sind, sich an die genomische Sequenz zu binden, die als "auf 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat ansprechendes Element" oder abgekürzt THE bezeichnet wird [Schönthal et al., Cell 54 (1988) 325; Lucibello et al., Oncogene 3 (1988) 43; Angel et al., Cell 49 (1987) 729; Lohmann et al., Science 238 (1988) 1386]. Die Sequenz der Region THE wird in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Darüber hinaus hat die Anmelderin auch gezeigt, dass die kortikalen Zellen vor dem Tod gerettet werden können, der durch bestimmte Bereiche der Konzentrationen an Glutamat induziert wird, indem die Faktoren, die dafür empfänglich sind, an die Sequenz SEQ ID NO: 1 zu binden, maskiert werden. Dies beweist, dass die Sequenz SEQ ID NO: 1 eine Mediatorrolle bei der neuronalen Degeneration zeigt; dies ist eine Beobachtung, die im Stand der Technik niemals berichtet wurde. Die Sequenz SEQ ID NO: 1 und die Gesamtheit der Transkriptionsfaktoren, die mit ihr wechselwirken können, bilden somit ein neues pharmakologisches Ziel in der Behandlung der neurodegenerativen Prozesse. Die Erfindung basiert somit teilweise auf der Verwendung von Verbindungen, die fähig sind, die Aktivität der Sequenz SEQ ID NO: 1 zu blockieren, für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten.
  • Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht demnach in der Verwendung einer Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Transkriptionsfaktor AP1, der mit ihr wechselwirkt, hemmt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung und/oder Prävention von neurodegenerativen Krankheiten bestimmt ist.
  • Die Verbindungen, die wenigstens teilweise die Wechselwirkung zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Transkriptionsfaktor AP1 im Sinne der vorliegenden Erfindung hemmen, können Verbindungen sein, die z. B. auf die Bindung dieser Faktoren an die Sequenz SEQ ID NO: 1 wirken.
  • Die Transkriptionsfaktoren, die mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 wechselwirken, wurden unter dem generischen Ausdruck AP1 gruppiert (Landschulz et al., Science 240 (1988) 1759). Es handelt sich um Dimere, deren Elementarbestandteile durch eine Struktureinheit "Reißverschluss mit Leucin" verbunden sind. Typischerweise gehört einer dieser Bestandteile zur Familie der Protooncogene Fos (eine Familie, die insbesondere die Proteine Fos, Fra1, Fra2 und FosB umfasst) und der andere zur Familie Jun (Familie, die insbesondere die Proteine Jun, JunB und JunD umfasst). Das Protein Fos besteht z. B. aus 380 Aminosäuren, Jun aus 354 (Übersicht in Mc Mahon und Monroe, FASEB J. 6 (1992) 2707).
  • Unter den Verbindungen, die auf die Synthese der Faktoren, die an die Sequenz SEQ ID NO: 1 binden, wirken, kann man die Antisense-Nukleotidsequenzen nennen, die gegen diese Faktoren, oder ihre Bestandteile, die die Translation der entsprechenden Gene, gerichtet sind, inhibieren. So kann man im Fall von Fos und von Jun die von Holt et al. beschriebenen Antisense-Sequenzen (PNAS 83 (1986) 4794) oder die von Kovary und Bravo (Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 4466) beschriebenen nennen. Andere Verbindungen, die auf die Regulierung der Expression der Gene dieser Faktoren wirken, können ebenfalls genannt werden, z. B. Curcumin (Huang et al., PNAS 88 (1991) 5292), 2-Aminopurin (Zinn et al., Science 240 (1988) 210) oder auch Heparin (Wright et al., PNAS 86 (1989) 3199), Verbindungen, die fähig sind, auf die Synthese von Fos und Jun zu wirken.
  • Eine andere Klasse von verwendbaren Verbindungen gruppiert die Verbindungen, die auf die molekularen Mechanismen der Modulation der Aktivität der Transkriptionsfaktoren, welche mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 wechselwirken, wirken. Diese Mechanismen beinhalten insbesondere Stufen der Multimerisation, Phosphorylierung-Dephosphorylierung usw. Was den Faktor AP1 angeht, so muss dieser phosphoryliert werden, um aktiv zu werden, wobei die Phosphorylierung durch die Proteinkinase C oder die Proteinkinase A (Übersicht in Mc Mahon und Monroe, vorstehend zitiert) sowie durch eine DNA-abhängige Proteinkinase katalysiert wird (Bannister et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 1289). Unter den Verbindungen, die auf die Phosphorylierung von AP1 im Sinne der Erfindung wirken, kann man die Verbindungen nennen, die fähig sind, die Aktivität dieser Proteinkinasen wenigstens teilweise zu inhibieren.
  • Schließlich sind die Verbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung, wie es oben angegeben wurde, fähig, die Wechselwirkung zwischen dem Transkriptionsfaktor AP1 und der Sequenz SEQ ID NO: 1 wenigstens teilweise zu hemmen. Von diesen Verbindungen können insbesondere die Antagonisten der Transkriptionsfaktoren oder Proteine, fähig sein, mit den Transkriptionsfaktoren oder ihren Bestandteilen oder der Sequenz ID NO: 1 zu wechselwirken und so die Bindungsaktivität zwischen diesen Faktoren und der Sequenz SEQ ID NO: 1 zu modulieren. Diesbezüglich kann man die Proteine der Familie CREB (Hai et Curran, PNAS 88 (1991) 3720), LFR-1 (Hsu et al., PNAS 88 (1991) 3511), IP-1 (Auwerx und Sassone-Corsi, Cell 64 (1991) 983) oder Rezeptoren für Steroide (Übersicht in Miner und Yamamoto, Trends in Biochem. Sci. 16 (1991) 423) nennen. Die Mitglieder der Familie CREB wechselwirken mit den Monomeren der Familie Fos oder Jun. Die unterschiedlichen Heterodimere haben unterschiedliche Bindungsspezifitäten. So können die Kreuzdimeren Fos-CREB oder Jun-CREB sich an die Stelle THE binden, aber auch an die Stelle CREB (Bindungsstelle der Proteine CREB auf DNA), und zwar entsprechend der Zusammensetzung des Dimers. Genauer ausgedrückt, sie weisen im Allgemeinen eine bevorzugte Bindung für die Stelle CRE auf (Hai und Curran, vorher zitiert). Die Dimerisierung eines Glieds der Familie CREB mit einem Glied der Familie Fos oder Jun induziert demnach eine Modulation der Anzahl der Faktoren, die an die Sequenz SEQ ID NO: 1 gebunden sind. Das Protein LRF-1 bindet Dimere mit c-Jun und Jun-B. Diese Dimere sind fähig, in vitro an die Stelle CRE zu binden und damit mit der Anzahl der Faktoren, die an der Sequenz SEQ ID NO: 1 gebunden ist, in Wechselwirkung zu treten (Hsu et al., vorher zitiert). IP-1 ist ein endogener Faktor, der im Kern und im Cytoplasma mehrerer Zelltypen gefunden wird. IP-1 blockiert in spezifischer Weise die Bindung an die DNA der Faktoren AP1. Es ist ein Protein mit 30 bis 40 kDa, das seine Aktivität ausübt, wenn es in phosphorylierter Form ist (Auwerx und Sassone-Corsi, vorher zitiert). Was die Rezeptoren für die Steroide (Glucocorticoide, Mineralocorticocoide, Progesteron, Androgene, usw.) angeht, so sind dies Kernrezeptoren, die zur Familie der Transkriptionsfaktoren mit Zinkbeteiligung. Sie besitzen Wechselwirkungsstellen mit der DNA, die sich von SEQ ID NO: 1 unterscheiden. Jedenfalls gibt es in den regulatorischen Regionen der Gene zusammengesetzte Antwortelemente, auf dem Niveau derer die Mitglieder der Familie der Rezeptoren für Steroide und die Mitglieder der Familie der Transkriptionsfaktoren mit Reißverschluss mit Leucin (AP1, CREB, LRF-1 usw.) wechselwirken können (über die Protein-Protein- oder Protein-DNA-Wechselwirkungen), um Regulationseffekte zu erzeugen, die in Gegenwart eines einzelnen dieser Faktoren nicht existieren. Aus diesen Gründen kann die Gesamtheit dieser Proteine, die fähig sind, direkt oder indirekt mit den Faktoren AP1 und/oder der Sequenz SEQ ID NO: 1 zu wechselwirken, im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um den Prozess der neuronalen Degeneration zu hemmen. Diese Proteine können als solche verwendet werden oder in Form genetischer Konstruktionen verwendet werden, die fähig sind, diese Proteine in vivo zu exprimieren. Andere Verbindungen, die fähig sind, die Wechselwirkung zwischen den Transkriptionsfaktoren und der Sequenz SEQ ID NO: 1 wenigstens teilweise zu inhibieren, werden durch doppelsträngige Nukleinsäuren gebildet, die die Bindungsstelle der Transkriptionsfaktoren an die DNA, d. h. die Sequenz SEQ ID NO: 1, oder jede aktive Variante dieser reproduzieren. Die Anmelderin hat tatsächlich gezeigt, dass solche Nukleinsäuren fähig sind, die Transkriptionsfaktoren (und insbesondere Faktor AP1), die in den Zellen vorliegen, zu komplexieren und sie daran zu hindern, sich an ihre endogenen Stellen zu binden, und somit ihre Transkriptionsaktivität zu blockieren.
  • In einer bevorzugten Ausführung ist die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung eine Doppelstrang-Nuklein-säure, die die Sequenz SEQ ID NO: 1 oder eine aktive Variante dieser ganz oder teilweise umfasst.
  • Der Ausdruck "aktive Variante" bezeichnet im Sinn der vorliegenden Erfindung jede Variante der Sequenz SEQ ID NO: 1, die die Eigenschaften zur Fixierung an Faktor AP1 konserviert hat. Solche Varianten können durch Mutation, Deletion, Substitution und/oder Addition von Basen an der Sequenz SEQ ID NO: 1, danach in vitro-Verifikation der Bindungsaktivität, wie es in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, erhalten werden.
  • Diese Doppelstrang-Nukleinsäure bzw. doppelsträngige Nukleinsäure kann als solche, z. B. nach Injektion in einen Menschen oder ein Tier verwendet werden, um einen Schutz zu induzieren oder die neuronale Degeneration zu behandeln. Sie kann insbesondere in Form von nackter DNA nach der Technik injiziert werden, die in der Anmeldung WO 90/11092 beschrieben ist. Sie kann auch in komplexierter Form, z. B. mit DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967 891), mit Kernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), mit Lipiden (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), in Form von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) usw. verabreicht werden.
  • Die Doppelstrang-Nukleinsäure, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise Teil eines Vektors. Die Verwendung eines solchen Vektors ermöglicht in der Tat die Verbesserung der Verabreichung der Nukleinsäure in die zu behandelnden Zellen und gleichzeitig die Erhöhung ihrer Stabilität in den Zellen, was es möglich macht, einen dauerhaften Inhibitoreffekt zu erhalten. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen in denselben Vektor einzuführen, was ebenfalls die Wirksamkeit der Behandlung erhöht.
  • Der verwendete Vektor kann unterschiedlichen Ursprungs sein, solange er die Tierzellen, vorzugsweise die menschlichen Nervenzellen, transformieren kann. In einem bevorzugten Ausführungsmodus der Erfindung verwendet man einen viralen Vektor, der unter den Adenoviren, den Retroviren, den Adeno-assoziierten Viren (AAV) und dem Herpes-Virus usw, ausgewählt werden kann.
  • Diesbezüglich verwendet die vorliegende Erfindung jedes rekombinante Virus, das in sein Genom eine doppelsträngige Nukleinsäure insertiert hat, welche der Wechselwirkungs stelle eines Transkriptionsfaktors für die DNA entspricht. Die vorliegende Erfindung beweist tatsächlich die Möglichkeit, bestimmte Pathologien zu behandeln, die aus der Expression bestimmter Gene stammen, die nicht direkt das Gen oder die Gene, die impliziert sind, noch ihre RNA-Messenger noch das Produkt ihrer Translation betreffen, aber die Aktivität der für ihre Expression verantwortlichen Transkriptionsfaktoren betreffen. Dieser Ansatz erlaubt es, die Expression zahlreicher Gene zu kontrollieren, z. B. die des Gens, das für die verschiedenen Iso-Formen des Vorläufers des Amyloidproteins (APP), welches bei der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit involviert ist, codieren. Dieses Gen trägt zwei Bindungsstellen eines Transkriptionsfaktors (AP1) mit weniger als 400 bp oberhalb der Startstelle der Transkription (Lee et al., Nature 325 (1987) 368). Gleichfalls enthält der Promotor des Gens der Tyrosinhydroxylase, das Schlüsselenzym der Synthese der Cathecholamine, das bei der Parkinson-Erkrankung impliziert ist, eine Bindungsstelle des Faktors AP1 (Icard-Liepkans et al., J. Neurosc. Res. 32 (1992) 290). Ein anderes Beispiel betrifft das Gen des NGF, das ebenfalls eine Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors besitzt S D'Mello und Heinrich, Mol Brain Res. 11 (1991) 255).
  • Das rekombinante Virus kann unter den Adenoviren, Retroviren, Adeno-assoziierten Viren usw. ausgewählt werden. Vorzugsweise handelt es sich um ein Virus, das fähig ist, die Nervenzellen zu infizieren, wie insbesondere ein Adenovirus. Vektoren, die von Adenoviren, Retroviren oder den AAV abgeleitet sind, die heterologe Nukleinsäuresequenzen einbauen, sind in der Literatur beschrieben [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 0 185 573 , Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer und Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18088].
  • Die rekombinanten Viren, wie sie oben definiert wurden, umfassen eine doppelsträngige Nukleinsäure, die der Wechselwirkungsstelle des Faktors AP1 mit der DNA entspricht. Noch bevorzugter umfasst die doppelsträngige Nukleinsäure die ganze Sequenz SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon oder eine aktive Variante derselben.
  • Vorteilhafterweise ist das rekombinante Virus ein defektives Virus. Der Ausdruck "defektives Virus" bezeichnet ein Virus, das zu einer Replikation in der Zielzelle unfähig ist. Im Allgemeinen ist das Genom der defektiven Viren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zumindest an den Sequenzen verarmt, die zur Replikation des Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind. Diese Regionen können entweder eliminiert sein (ganz oder teilweise), können nicht funktionell gemacht sein, können durch andere Sequenzen ersetzt sein und insbesondere durch doppelsträngige Nukleinsäure ersetzt sein. Vorzugsweise konserviert das defektive Virus dennoch die Sequenzen seines Genoms, die zur Einkapselung der viralen Partikel notwendig sind.
  • Es ist besonders vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung in einer in ein rekombinantes defektives Adenovirus eingebauten Form zu verwenden.
  • Es gibt in der Tat verschiedene Adenovirus-Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften wenig variieren, die für den Menschen keine Pathogene sind und insbesondere für Personen, die nicht immun-deprimiert sind, keine Pathogene sind. Im übrigen integrieren sich diese Viren nicht in das Genom der Zellen, die sie infizieren, und können wichtige Fragmente der exogenen DNA einbauen. Unter den verschiedenen Serotypen bevorzugt man die Verwendung der Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Im Falle der Adenoviren Ad 5 sind die zur Replikation notwendigen Sequenzen die Regionen E1A und E1B.
  • Im übrigen erlaubt die geringe Größe der Nukleinsäuren, die der Bindungsstelle der DNA eines Transkriptionsfaktors gemäß der Erfindung entsprechen, in vorteilhafter Weise den gleichzeitigen Einbau mehrerer Nukleinsäuren, die identisch sind (zur Blockierung desselben Transkriptionsfaktors bestimmt sind) oder unterschiedlich sind (zur Blockierung verschiedener Transkriptionsfaktoren bestimmt sind) gleichzeitig in denselben Vektor. Ein besonderer Ausführungsmodus der Erfindung besteht in der Verwendung eines Vektors, insbesondere eines viralen Vektors, der mindestens zwei Nukleinsäuren umfasst, wie sie vorstehend definiert sind.
  • Die defektiven rekombinanten Viren können durch homologe Rekombination zwischen einem defektiven Virus und einem Plasmid, das unter anderem die Sequenz der Nukleinsäuren, wie sie vorstehend definiert ist, trägt, hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3 (12) (1984) 2917). Die homologe Rekombination erfolgt nach Co-Transfektion des Virus und des Plasmids in einer geeigneten Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch die genannten Elemente transformierbar sein und (ii) Sequenzen tragen, die fähig sind, den Teil des Genoms des defektiven Virus vorzugsweise in integrierter Form zu ergänzen, um die Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Zelllinie, die zur Herstellung von rekombinanten defektiven Adenoviren geeignet ist, kann man die humane Embryozelllinie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere in ihr Genom den linken Teil des Genoms des Adenovirus Ad5 (12%) integriert enthält, nennen. Als Beispiel für eine zur Herstellung rekombinanter defektiver Retroviren geeigneten Zelllinie kann man die Linie CRIP (Danos und Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460) nennen.
  • Danach werden die Viren, die sich vermehrt haben, nach klassischen Techniken der Molekularbiologie gewonnen und gereinigt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die mindestens ein rekombinantes Virus oder eine Nukleinsäure, welche der Wechselwirkungsstelle eines Transkriptionsfaktors mit der DNA, wie sie oben definiert wurde, entspricht, umfasst. Bevorzugter betrifft die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die mindestens eine doppelsträngige Nukleinsäure umfasst, welche die Sequenz SEQ ID NO: 1 ganz oder teilweise oder eine aktive Variante dieser oder ein rekombinantes Virus, das eine solche Nukleinsäure enthält, umfasst.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Hinblick auf eine Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraocularem usw. Weg, formuliert werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten für eine injizierbare Formulierung vorzugsweise pharmazeutisch annehmbare Träger. Dabei kann es sich insbesondere um Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid oder Gemische dieser Salze), die steril, isotonisch sind, oder um trockene Zusammensetzungen, die insbesondere lyophilisiert sind und die durch Zusatz gegebenenfalls von sterilisiertem Wasser oder physiologischen Serum zu injizierbaren Präparaten rekonstituiert werden können, handeln.
  • Die Dosen an Nukleinsäuren (Sequenz oder Vektor), die zur Verabreichung verwendet werden, können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern und insbesondere in Abhängigkeit vom verwendeten Verabreichungsmodus, der betreffenden Krankheit, der zu exprimierenden Nukleinsäure oder auch in Abhängigkeit von der Dauer der angestrebten Behandlung angepasst werden. Was die rekombinanten Viren angeht, so werden diese im Allgemeinen in Form von Dosen formuliert und verabreicht, die zwischen 104 und 1014 kbE/ml, und vorzugsweise zwischen 106 und 1010 kbE/ml liegen. Der Ausdruck kbE ("kolonienbildende Einheit") entspricht der Infektionskraft einer Viruslösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur und Messen, im Allgemeinen nach 48 Stunden, der Zahl der Plaques infizierter Zellen bestimmt. Die Bestimmungstechniken des kbE-Titers einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
  • Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können beim Menschen zur Behandlung und/oder Prävention neurodegenerativer Krankheiten und insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der neuronalen Degeneration, die mit Ischämie, Hypoxie, Hypoglykämie, epileptischen Anfällen oder auch cerebralen Traumata verbunden ist, oder auch zur Behandlung und/oder Prävention von Chorea Huntington oder Alzheimer-Krankheit verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die lediglich als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen sind, vollständiger beschrieben.
  • Legende der Figuren
  • SEQ ID NO: 1: Sequenz des Fragments TRE
  • 1: Beweis der Inhibierung des durch Glutamat induzierten Zelltods durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 durch Messung der Bindung von Ouabain. Dieser Inhibitoreffekt wird in Gegenwart der Sequenz SEQ ID NO: 1, die in den Positionen 10 (T → G) und 15 (C → T) mutiert ist, nicht beobachtet.
  • 2: Beweis der Inhibierung des durch Glutamat induzierten Zelltods durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 durch Messung der freigesetzten LDH im extrazellulären Medium. Dieser Inhibitoreffekt wird in Gegenwart der Sequenz SEQ ID NO: 1, die in den Positionen 10 (T → G) und 15 (C → T) mutiert ist, nicht beobachtet.
  • 3: Beweis der Inhibierung des durch Glutamat induzierten Zelltods durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 durch Färbung mit Trypan-Blau.
  • Allgemeine Klonierungstechniken
  • Die Methoden, die klassischerweise in der Molekularbiologie verwendet werden, wie z. B. präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in Cäsiumchlorid-Gradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgel, die Reinigung der DNA-Fragmente durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die Präzipitation von DNA in Salzmilieu durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw. sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur reichlich beschrieben [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y., 1982; F. M. Ausubel et al. (Herausg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
  • Die Plasmide des Typs pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 wurden im Handel bezogen (Bethesda Research Laboratories).
  • Zur Bindung können die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe durch Elektrophorese an Agarose- oder Acrylamid-Gel getrennt, in Phenol oder ein Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert werden, in Ethanol präzipitiert werden und dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) nach Empfehlungen des Lieferanten inkubiert werden. Die Auffüllung der vorstehenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) nach den Beschreibungen des Lieferanten durchgeführt werden. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die Zerstörung der vorstehenden 5'-Enden erfolgt durch eine Behandlung, welche mit der Nuklease S1 vorgenommen wird.
  • Die gerichtete in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynukleotide kann nach dem Verfahren durchgeführt werden, das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] durchgeführt wird, wobei der Kit verwendet wird, der von Amersham im Handel ist.
  • Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente durch die genannte PCR-Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R. K. Saiki et al., Science 230 (1985) 1350–1354; K. B. Mullis und F. A. Faloona, Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann durchgeführt werden, indem ein "thermischer DNA-Cycler" (Perkin Elmer Cetus) nach den Beschreibungen des Herstellers verwendet wird.
  • Die Analyse der Nukleotidsequenzen kann durch die von Sanger et al. entwickelte Methode [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] durchgeführt werden, wobei der von Amersham vertriebene Kit verwendet wird.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Darstellung der Komplexe, die die Sequenz SEQ ID NO: 1 nach Behandlung der kortikalen Zellen mit Glutamat binden
  • Dieses Beispiel beweist eine Erhöhung der Zahl der intrazellulären Komplexe, die fähig sind, die Sequenz SEQ ID NO: 1 zu binden, nach Behandlung der kortikalen Zellen mit Glutamat. Dieser Beweis wird durchgeführt, indem die Technik der Gel-Retention verwendet wird (Lassar et al., Cell 66 (1991) 305).
  • Dafür wurden die Cortex-Zellen von embryonalen Wistar-Ratten (E17) nach dem Verfahren von Dichter (Brain Res. 149 (1978) 279) isoliert, in Costar-Platten mit 6 Vertiefungen (35 min; Dichte 6 × 105 Zellen/Platte) in DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 10 μg/ml Insulin, 10 μg/ml Transferrin, 10 ng/ml Natriumselenit, 10 nM Progesteron, 1 nM Triiodthyronin enthält, kultiviert und in einem Wärmeschrank (37°C, 5% CO2) gehalten.
  • Nach 4 bis 6 Kulturtagen wurde den Zellen Glutamat zugesetzt. 10 Minuten bis 48 Stunden später wurden die Kernextrakte der Zellen nach der von Lassar et al., vorher zitiert, beschriebenen Technik erhalten. Gemäß Beispiel 2 wurde eine radioaktive Sonde, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, danach Markierung mit Phosphor 32 nach der von Maniatis beschriebenen Technik hergestellt (typische spezifische Aktivität: 50.000 cpm/ng). 0,2 ng der so erhaltenen Sonde werden dann mit 0,5 bis 2 μg Kernextrakt in Gegenwart von 500 ng Poly D(IC)(IC) (Pharmacia) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung zu vermindern. Die Reaktion wurde für 10 min in Eis durchgeführt. Die gebildeten Komplexe wurden dann durch Elektrophorese an 5% Acrylamidgel freigesetzt. Das Vorliegen von radioaktiven Banden (durch Autoradiographie bewiesen) zeigt, dass Glutamat die zelluläre Expression von Komplexen induziert hatte, welche fähig waren, die SEQ ID NO: 1 zu binden.
  • Beispiel 2: Synthese der Sequenz SEQ ID NO: 1 und einer inaktiven Variante
  • Eine doppelsträngige Nukleinsäure, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht, wurde mit Hilfe eines automatischen Nukleotidsynthesizers (Maniatis) synthetisiert.
  • Nach dem selben Protokoll wurde eine inaktive Mutante dieser Nukleinsäure hergestellt. Diese inaktive Mutante zeigt im Vergleich zu der Sequenz SEQ ID NO: 1 Mutationen an den Positionen 10 (T → G) und 15 (C → T). Das Fehlen von Aktivität dieser Mutante wurde unter den selben Bedingungen wie von Beispiel 1 bewiesen, wobei nach radioaktiver Markierung diese Mutante als Sonde verwendet wurde. Die Inaktivität dieser Mutante wurde durch das Fehlen einer Veränderung ihres Bindungsprofils bei zellulären Extrakten im Vergleich zu SEQ ID NO: 1 nach Kultur in Gegenwart von Glutamat gezeigt.
  • Die Fähigkeit der Sequenz SEQ ID NO: 1, den durch Glutamat induzierten Tod zu inhibieren, wurde durch Messung von drei Parametern bestimmt: die Bindung von tritiiertem Ouabain an Neuronen in Kultur, die Detektion der Lactatdehydrogenase im extrazellulären Milieu und durch Zählung der Zellen nach Färbung mit Tryptan-Blau.
  • Beispiel 3: Messung der Bindung von tritiiertem Ouabain an Neuronen in Kultur (1)
  • Ouabain ist ein Ligand der Membran-ATPase. Sie bindet nur an die lebenden Neuronen. Je größer die Menge an gebundenem Ouabain ist, desto größer ist die Zahl der lebenden Zellen.
  • Die Cortex-Zellen von embryonalen Wistar-Ratten (E17) wurden nach dem Verfahren von Dichter (Brain Res. 149 (1978) 279) isoliert, an Costar-Platten mit 6 Vertiefungen (35 min; Dichte 6 × 105 Zellen/Platte) oder 24 Vertiefungen (16 min; Dichte 3 × 105 Zellen/Platte) in DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 10 μg/ml Insulin, 10 μg/ml Transferrin, 10 ng/ml Natriumselenit, 10 nM Progesteron, 1 nM Triiodthyronin enthält, kultiviert und in einem Wärmeschrank (37°C, 5% CO2) gehalten. Nach 4 oder 5 Tagen Kultur wurden 2 μM synthetische Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder ihrer inaktiven Variante (siehe Beispiel 2) den Kulturplatten zugesetzt. Nach 15 Stunden Inkubation wurde Glutamat (1 mM) zugegeben. Die Bindung von tritiiertem Ouabain wurde in den Kulturen 24 Stunden nach Zusatz von Glutamat nach dem Protokoll von Markwell et al., Brain Res. 538 (1991) I) bestimmt.
  • Die erhaltenen Resultate sind in 1 gezeigt. Sie zeigen klar, dass das Glutamat einen Verlust der Bindung von Ouabain an die Zellen induziert, dass dieser Verlust in Gegenwart der synthetischen Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 inhibiert wird, in Gegenwart der inaktiven mutierten Variante aber nicht inhibiert wird.
  • Beispiel 4: Messung der Sekretion der Lactatdehydrogenase in extrazelluläres Medium (2)
  • Die Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein cytoplasmisches Enzym, das durch die sterbenden Zellen in extrazelluläres Milieu sezerniert wird. Demnach gilt: je höher die Menge an sezernierter LDH ist, desto größer ist die Zahl der sterbenden Zellen.
  • Die Zellen wurden unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 kultiviert. Die LDH-Aktivität, die in extrazellulärem Milieu vorlag, wurde 24 Stunden nach Zugabe des Glutamats nach dem Verfahren von Berger und Brodia (Verfahren Sigma 500) bestimmt.
  • Die erhaltenen Resultate sind in 2 dargestellt. Sie zeigen klar, dass Glutamat eine Erhöhung der LDH auf extrazellulärem Niveau induziert, dass diese Erhöhung durch das Vorliegen von synthetischer Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO: 1 inhibiert wird, in Gegenwart der inaktiven mutierten Variante aber nicht inhibiert wird.
  • Beispiel 5: Zählung der Zellen nach Färbung mit Trypan-Blau (3)
  • Trypan-Blau ist ein vitales Färbemittel, das in die toten Zellen eintritt, die "blau" werden, während es von den lebenden Zellen ausgeschlossen bleibt, die "weiß" bleiben. Somit gilt: wenn die Menge der "blauen" Zellen erhöht ist, dann ist die Zahl der toten Zellen groß.
  • Die Zellen wurden unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 kultiviert. Die in diesem Beispiel verwendete Glutamat-Konzentration war 5 mM. Am Ende der Inkubation wurde Trypan-Blau in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt, und die Zellen wurden erneut 10 Minuten in den Wärmeschrank gestellt. Jede Vertiefung (6 Vertiefungen pro Bedingung) wurden dann 5 Mal durch ein Zeiss 135M-Mikroskop fotografiert. Die Zahl der blauen und weißen Zellen wurde dann willkürlich auf jedem der Fotos gezählt.
  • Die erhaltenen Resultate sind in 3 dargestellt. Sie zeigen klar, dass Glutamat einen bedeutenden Zelltod induziert und dass dieser Zelltod in Gegenwart synthetischer Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID No: 1 inhibiert ist. Die Gesamtheit dieser Resultate zeigt die Kapazität der im Rahmen der Erfindung verwendeten Nukleinsäure, den durch Glutamat induzierten neuronalen Tod zu inhibieren.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00190001

Claims (8)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung, die die Bindung des Faktors API an die Sequenz SEQ ID Nr. 1 hemmt zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurodegenerativen Krankheiten.
  2. Verwendung nach Anspruch 1 einer doppelsträngigen Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder einer aktiven Variante davon mit den Eigenschaften, daß sie sich an den Faktor API anlagert.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die doppelsträngige Nukleinsäure Bestandteil eines Vektors ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die doppelsträngige Nukleinsäure Bestandteil eines viralen Vektors ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um ein Adenovirus, ein Retrovirus, ein adeno-assoziiertes Virus oder das Herpesvirus handelt.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Adenovirus handelt.
  7. Verwendung eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus mehrere doppelsträngige Nukleinsäuren enthält, die gleich oder verschieden sein können und dem Ort der Wechselwirkung eines Transkriptionsfaktors mit der DNA entsprechen.
  8. Verwendung eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Virus um ein defektives Virus handelt.
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