JPH08512043A

JPH08512043A - 特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの利用

Info

Publication number: JPH08512043A
Application number: JP7503308A
Authority: JP
Inventors: マレ，ジヤツク; ルバ，フレデリク; ロベール，ジヤン−ジヤツク
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 1996-12-17
Anticipated expiration: 2021-03-15
Also published as: NO321455B1; FR2707880B1; FI956353A; AU696644B2; JP3755825B2; FR2707880A1; PT707644E; NO954888L; EP0707644B1; AU7188294A; EP0707644A1; US6140112A; ATE276360T1; KR100517879B1; FI120942B; DE69433996T2; EP1454984A1; FI956353A0; CA2166318A1; CA2166318C

Abstract

(57)【要約】本発明は、神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物の調製のための、転写因子の活性に影響を及ぼす化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの利用本発明は、特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの使用に関する。本発明は、より具体的には神経変性性疾患の治療が意図される薬剤学的組成物の調製のための、配列番号１の配列と転写因子との間の相互作用に作用する化合物の使用に関する。本発明は、部分的には、因子ＡＰ１が神経変性のメディエーターを構成すること、およびその複合体の活性を阻害することが可能な化合物の使用が神経死の過程を遮断することが可能であることの証明の成果である。本発明は更に、転写因子のＤＮＡとの相互作用の部位に相当する核酸が、少なくとも部分的にこの転写因子の活性を阻害することが可能であることの証明の成果でもある。神経変性の分子メカニズムを研究するためには、あるモデルとして本出願人はグルタメート誘導性毒性を用いた。グルタメートは中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。しかしながら異常に長い期間もしくは生理学的濃度を上回る濃度でのグルタメートへの露出は、用語「興奮性毒性」により表示される神経毒性を引き起こす可能性がある（ＯｌｎｅｙＡｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０３（１９８６）６３１）。実験を基にする多くの一連の論議は、この種の毒性が、虚血、低酸素症、低血糖症、および癲癇発作に関連するか、あるいは別の場合には大脳損傷に関連する神経変性に寄与することを示唆している（Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３（１９９２）１２６１）。興奮性毒性は更に、例えば、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）型の舞踏病（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８）９８１）、およびアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患（Ｋｏｈｅｔａｌ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．５３３（１９９０）３１５、Ｍａｔｔｓｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（１９９２）３７６）のような疾患の病因に関係するとも考えられる。より具体的には、出願人は、初期培養物中の胎仔ラット大脳皮質ニューロンにおいてグルタメートにより誘導される死を研究した。これまでの調査により、その膜レセプターへのグルタメートの結合が細胞膜の脱分極および細胞内カルシウムの増加を生じ、このことにより数々の酵素ファミリーが関係する第二メッセンジャーのカスケードの活性化がもたらされることを示すことが可能となった。転写因子は所定の遺伝子の調節配列に順に相互作用を行っててそれらの発現を活性化もしくは抑制するであろうが、本出願人はそのような転写因子をコードする初期応答遺伝子の調節を遺伝子レベルで調査した。より具体的には、本出願人は、驚くべきことにグルタメートもしくは他の興奮性毒素（例えばＮＭＤＡのようなもの）への大脳皮質ニューロンの露出が、「１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢酸エステル応答性要素」と表示され、ＴＲＥと省略され、そしてゲノム配列に結合することが可能な蛋白質複ｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ５４（１９８８）３２５、Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏｅｔａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ３（１９８８）４３、Ａｎｇｅｌｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ４９（１９８７）７２９、Ｂｏｈｍａｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８（１９８８）１３８６］。この配列のＴＲＥ領域を配列番号１に示す。その上、本出願人は更に、配列番号１の配列に結合可能な因子の配列決定を行うことにより大脳皮質細胞が所定の範囲のグルタメート濃度により誘導される死から救済されることをも示した。このことは、配列番号１の配列が神経変性のメディエーターの一部分の役割を演じることを示し、この所見はこれまでには当該技術分野では全く報告されていないものであった。この配列番号１の配列およびそれと相互作用することが可能な一連の転写因子は、従って神経変性過程の治療における新規の薬理学的標的を構成する。従って本発明は部分的には、配列番号１の配列の活性を遮断することが可能な神経変性性疾患の治療のための化合物の使用である。従って本発明の最初の主題は、配列番号１の配列およびそれと相互作用する転写因子との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害する、神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物の調製のための化合物の使用である。本発明の目的のための、配列番号１の配列と転写因子との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害する化合物は、例えば（ｉ）転写、翻訳、もしくは翻訳後のレベルでのこれらの因子もしくはそれらの構成成分の合成、（ｉｉ）これらの因子の活性の調節の分子メカニズム（多量体形成およびリン酸化−脱リン酸化など）、もしくは別の場合には（ｉｉｉ）配列番号１の配列へのこれらの因子の結合、に作用する化合物である可能性がある。配列番号１の配列と相互作用する転写因子は、遺伝子名称「ＡＰ１」として一緒の群に総括されている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０（１９８８）１７５９）。問題となる分子は、その単位構成成分が「ロイシンジッパー」構造モチーフを通して他のものに連結される二量体である。典型的には、それらの構成成分の内の一つはＦｏｓプロト癌遺伝子のファミリー（具体的には蛋白質Ｆｏｓ１、Ｆｒａ１、Ｆｒａ２、およびＦｏｓＢを含むファミリー）に属し、そしてもう一方のものはＪｕｎファミリー（具体的には蛋白質Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、およびＪｕｎＤを含むファミリー）に属する。一例として、Ｆｏｓ蛋白質は３８０のアミノ酸からなり、Ｊｕｎ蛋白質は３５４のアミノ酸からなる（ＭａｈｏｎａｎｄＭｏｎｒｏｅ、ＦＡＳＥＢＪ．６（１９９２）２７０７、を参照せよ）。配列番号１の配列に結合する因子の合成に作用する化合物の内でも、これらの因子もしくはそれらの構成成分に対するアンチセンスヌクレオチド配列を挙げることができ、これらのアンチセンスヌクレオチド配列は対応する遺伝子の翻訳を阻害する。従って、ＦｏｓおよびＪｕｎの場合には、Ｈｏｌｅｅｔａｌ（ＰＮＡＳ８３（１９８６）４７９４）もしくはＫｏｖａｒｙおよびＢｒａｖｏ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（１９９１）４４６６）により記載されるアンチセンス配列を用いることが可能である。これらの因子のための遺伝子の発現の調節に作用する他の化合物も本発明に関連させて記載されることがあり、それらは例えば具体的には、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８８（１９９１）５２９２）、２−アミノプリン（Ｚｉｎｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０（１９８８）２１０）、もしくは別の場合ではヘパリン（Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８６（１９８９）３１９９）のようなものであり、これらの化合物はＦｏｓおよびＪｕｎの合成に作用することが可能である。本発明に関連させて用いることができる他の種類の化合物は、配列番号１の配列と相互作用する転写因子の活性の調節の分子メカニズムに作用する化合物を一まとめに総括している。これらのメカニズムは、具体的には多量体形成およびリン酸化−脱リン酸化などの段階を必要とする。因子ＡＰ１に関しては、後者は活性を示すようになる目的ではリン酸化される必要があり、そのリン酸化は、蛋白質キナーゼＣもしくは蛋白質キナーゼＡ（先に引用されるＭｃＭａｈｏｎａｎｄＭｏｎｒｏｅを参照せよ）、ならびにＤＮＡ依存的蛋白質キナーゼ（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１（１９９３）１２８９）による酵素作用を受ける。従って、本発明の目的のためにはＡＰ１のリン酸化に作用する化合物の中でも、これらの蛋白質キナーゼの活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物を挙げることができる。最後には、先に記載されるように、本発明の目的のための他の化合物は、転写因子と配列番号１の配列との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害することが可能なものである。このような化合物は具体的には、転写因子拮抗剤、すなわち転写因子もしくはそれらの構成成分、あるいは配列番号１の配列と相互作用し、かつそのためにこれらの因子と配列番号１の配列との間の結合の活性を調節することが可能な蛋白質である可能性がある。これに関連して、ファミリーＣＲＥＢ（ＨａｉａｎｄＣｕｒｒａｎ、ＰＮＡＳ８８（１９９１）３７２０）、ＬＲＦ−１（Ｈｓｕｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８８（１９９１）３５１１）、およびＩＰ−１（ＡｕｗｅｒｘａｎｄＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、Ｃｅｌｌ６４（１９９１）９８３）の蛋白質、もしくはステロイドレセプター（ＭｉｎｅｒａｎｄＹａｍａｍｏｔｏ、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６（１９９１）４２３）を挙げることができる。ＣＲＥＢファミリーの複数の構成要員がＦｏｓもしくはＪｕｎファミリーの構成要員と相互作用する。異なるヘテロ二量体は異なる結合特異性を有する。従って、Ｆｏｓ−ＣＲＥＢもしくはＪｕｎ−ＣＲＥＢ交差二量体はＴＲＥ部位に結合する可能性があるが、その二量体の組成に依存して更にＣＲＥ部位（ＤＮＡへのＣＲＥＢ蛋白質の結合の部位）にも結合する可能性がある。より具体的には、それらは一般的にＣＲＥ部位への優先的結合を示す（先に引用されるＨａｉａｎｄＣｕｒｒａｎ）。従ってＣＲＥＢファミリーの一構成要員の、ＦｏｓもしくはＪｕｎファミリーの一構成要員との二量体形成は、配列番号１の配列に結合する因子の数の調節を誘導する。ＬＲＦ−１蛋白質はｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎ−Ｂと二量体を形成する。これらの二量体はＣＲＥ部位にインビトロで結合することが可能であり、そしてその結果、配列番号１の配列に結合する多数の因子が妨害する可能性がある（先に引用されるＨｓｕｅｔａｌ．）。ＩＰ−１は数々の種類の細胞の核および細胞質中に出現する内因性因子である。ＩＰ−１はＤＮＡへのＡＰ−１因子の結合を特異的に遮断する。これは３０〜４０ｋＤａの蛋白質であり、そしてリン酸化形態をとる際にその活性を発揮する（先に引用されるＡｕｗｅｒｘａｎｄＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ）。ステロイド（グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、プロゲステロン、およびアンドロゲンなど）のためのレセプターに関しては、これらは亜鉛フィンガー転写因子のファミリーに属する核レセプターである。これらは配列番号１とは異なるＤＮＡとの相互作用の部位を保持する。しかしながらそれらの遺伝子の調節用領域内には複合応答要素が存在し、これらの応答要素と、ステロイドレセプターファミリーの構成要員およびロイシンジッパー転写因子ファミリーの構成要員（ＡＰ１、ＣＲＥＢ、およびＬＲＦ−１など）は相互作用を行って（蛋白質−蛋白質相互作用、もしくは蛋白質−ＤＮＡ相互作用）、これらの因子の内の一つのみの存在下には存在することのない調節効果を生ずることが可能である。これらの理由については、この一連の蛋白質はＡＰ−１因子および／または配列番号１の配列と直接的もしくは間接的に相互作用することが可能であるため、これらの蛋白質を本発明に関連させて用いて神経変性の過程を阻害することが可能である。これらの蛋白質を、そのままか、あるいはインビボでこれらの蛋白質を発現することが可能な遺伝子構築物として用いることが可能である。転写因子と配列番号１の配列との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害することが可能な他の化合物は、ＤＮＡへの転写因子の結合の部位を再生する二本鎖核酸からできており、すなわちこれは配列番号１の配列もしくは後者のいずれかの活性変異体である。本出願人は実際に、このような核酸が細胞内に存在する転写因子（および特に因子ＡＰ１）と複合体形成を行うこと、それらの転写因子を内因性部位への結合から回避させること、およびそのためそれらの転写活性を遮断することが可能であることを示した。好ましい態様においては、本発明に関係して用いられる化合物は配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含む二本鎖核酸である。用語「活性変異体」は、本発明の目的のためには、因子ＡＰ１への結合の特性を保持する配列番号１の配列のいずれかの変異体を意味する。このような変異体は、配列番号１の配列上の塩基の突然変異、欠損、置換、および／または添加、ならびに実施例１および２に記載されるその後のインビトロでの結合活性の確認により取得することができる。この二本鎖核酸をそのまま用いて、例えばヒトもしくは動物内への注入後に神経変性の予防の誘導もしくは治療を行うことができる。具体的には、これを特許出願である国際公開第９０／１１０９２号に記載される技術に従って、裸のＤＮＡの形態で注入することができる。これは、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐａｇａｎｏｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、核蛋白質（Ｋａｎｅｄａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９）３７５）、脂質（Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３）との複合体の形態でか、リポソーム（Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）などの形態で投与することも可能である。本発明に関係して用いられる二本鎖核酸がベクターの一部を形成することが好ましい。このようなベクターの使用は実際に、治療予定の細胞内への核酸の投与を改善し、かつ前記細胞内におけるその核酸の安定性を増加することを可能にさせ、そのことにより持続的な阻害効果を取得することを可能にする。その上同一ベクター内に、やはり治療効果を増加させる数々の核酸配列を取り込ませることが可能である。用いられるベクターは様々な起源のものであることができ、動物細胞を形質転換させることが可能であるとするとそれはヒトの神経細胞であることが好ましい。本発明の好ましい態様では、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、およびヘルペスウイルスなどから選択することができるウイルス性ベクターが用いられる。これに関連して本発明の主題は、転写因子とＤＮＡとの相互作用の部位に相当し、そのゲノム内に挿入される二本鎖核酸を含むいずれかの組換えウイルスでもある。本発明は実際に、直接その遺伝子もしくは関連遺伝子、あるいはそれらのメッセンジャーＲＮＡ、あるいはそれらの翻訳産物に直接影響を及ぼすことによるのではなく、それらの発現の原因となる転写因子の活性に影響を及ぼすことによる、所定の遺伝子の発現から生じる所定の病気の治療の可能性を示す。この研究方法は多くの遺伝子の発現を制御することを可能にするが、それらの発現とは例えばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患の病因に関連するアミロイド蛋白質前駆体（ＡＰＰ）の様々なイソ型をコードする遺伝子の発現である。この遺伝子は実際のところ転写開始部位の上流に４００ｂｐを下回る転写因子（ＡＰ１）のための２つの結合部位を含む（Ｌｅｅｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３２５（１９８７）３６８）。同様に、カテコールアミン合成における主要酵素であり、パーキンソ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病に関わるチロシンヒドロキシラーゼのための遺伝子のプロモーターは因子ＡＰ１のための結合部位を含む（Ｉｃａｒｄ−Ｌｉｅｐｋａｎｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．３２（１９９２）２９０）。他の例はＮＧＦ遺伝子に関連しており、この遺伝子もやはり転写因子のための結合部位を保持する（ＳＤ’ＭｅｌｌｏａｎｄＨｅｉｎｒｉｃｈ、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１１（１９９１）２５５）。本発明に従う組換えウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、およびアデノ関連性ウイルスなどから選択することができる。そのウイルスが神経細胞を感染することが可能なウイルス、例えば具体的にはアデノウイルスのようなウイルスであることが好ましい。アデノウイルス、レトロウイルス、もしくはＡＡＶから取得され、異種核酸配列を取り込むベクターが刊行物に記載されている［Ａｋｌｉｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ３（１９９３）２２４、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１（１９９０）２４１、欧州特許第１８５５７３号、Ｌｅｖｒｅｒｏｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５、ＬｅＧａｌｌａＳａｌｌｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９（１９９３）９８８、ＲｏｅｍｅｒａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８（１９９２）２１１、Ｄｏｂｓｏｎｅｔａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ５（１９９０）３５３、Ｃｈｉｏｃｃａｅｔａｌ．、ＮｅｗＢｉｏｌ．２（１９９０）７３９、Ｍｉｙａｎｏｈａｒａｅｔａｌ．、ＮｅｗＢｉｏｌ．４（１９９２）２３８、国際公開第９１／１８０８８号］。本発明の特定の態様では、先に特定されるもののような組換えウイルスは、因子ＡＰ１とＤＮＡとの相互作用の部位に相当する二本鎖核酸を含む。この二本鎖核酸が配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含むことが更に一層好ましい。有利なことに、本発明に従う組換えウイルスは欠陥ウイルスである。用語「欠陥ウイルス」は、標的細胞内で複製することが不可能なウイルスを意味する。従って一般的には、本発明に関連して用いられる欠陥ウイルスのゲノムは、感染化細胞内での前記ウイルスの複製に必要とされる配列を少なくとも欠いている。これらの領域は、除去するか（完全もしくは部分的に）、あるいは非機能性にさせるか、あるいは他の配列、そして特に二本鎖核酸により置換するかのいずれかを行うことができる。それにもかかわらず欠陥ウイルスは、ウイルス粒子の包膜化に必要なそれ自体のゲノムの配列を保持する。欠陥組換えアデノウイルス内に取り込まれている形態での本発明の核酸配列を使用することが特に有利である。実際には、構造および特性が幾分異なるが、ヒトおよび特に非免疫抑制化被験者にとっては病原性ではないアデノウイルスの様々な血清型が存在する。その上これらのウイルスはそれらが感染する細胞のゲノム内への組込みは行わず、かつ外因性ＤＮＡの巨大断片を取り込むことが可能である。様々な血清型の内でもアデノウイルスタイプ２もしくは５（Ａｄ２もしくはＡｄ５）を本発明に関連させて用いることが好ましい。Ａｄ５アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域である。その上、本発明に従う転写因子のＤＮＡへの結合の部位に相当する核酸の小サイズのものは、同一ベクター内に数々の核酸を同時に取り込ませることを可能にし、それらの核酸は相同であることも（同一転写因子を遮断することが意図される）、あるいは異なることも（異なる転写因子を遮断することが意図される）可能である。従って本発明の特定の態様は、あるベクター、具体的には例えば先に特定されるもののような少なくとも２つの核酸を含むウイルス性ベクターからできている。本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスと、中でも例えば先に特定されるもののような核酸配列を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５、Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯＪ．３（１２）（１９８４）２９１７）。相同組換えは、前記ウイルスと前記プラスミドとの適切な細胞株内への同時トランスフェクション後に生じる。用いられる細胞株は、（ｉ）前記要素により形質転換可能であり、かつ（ｉｉ）欠陥ウイルスのゲノムの部分を補うことが可能な配列を組換えの危険性を回避する目的では好ましくは組み込まれた形態で含むべきであることが好ましい。欠陥組換えアデノウイルスの調製に用いることができる株の例としては、ヒト胎児の腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができ、この細胞株は、具体的にはそのゲノムに組み込まれているＡｄ５アデノウイルスゲノムの左側部分（１２％）を含む。欠陥組換えレトロウイルスの調製のために使用することができる株の例としては、ＣＲＩＰ株（ＤａｎｏｓａｎｄＭｕｌｌｉｇａｎ、ＰＮＡＳ８５（１９８８）６４６０）を挙げることができる。その後には、予め増幅させてあるウイルスを分子生物学の標準技術に従って回収および精製する。本発明の主題は、少なくとも一つの組換えウイルスもしくは転写因子とＤＮＡとの相互作用部位に相当する一つの核酸（例えば先に特定されるもの）を含む薬剤学的組成物でもある。本発明が、配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含む少なくとも一つの二本鎖核酸、あるいはそのような核酸を含む組換えウイルスを含む薬剤学的組成物に関することが一層好ましい。本発明の薬剤学的組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および眼内投与などの目的のために製剤することができる。これらの薬剤学的組成物が注射用製剤について薬剤学的に許容される賦形剤を含むことが好ましい。これらの組成物は具体的には、滅菌等張食塩水剤（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、もしくはマグネシウムなど、あるいはこれらの塩の混合物を含む）であるか、あるいは脱水、具体的には凍結乾燥される組成物であることができ、これは適切であれば滅菌水もしくは滅菌された生理学的食塩水の添加の際に注射用水剤を作成することを可能にする。投与のために用いられる核酸（配列もしくはベクター）の用量は、様々なパラメーターに従って、および特に用いられる投与の様式、問題となる病因、発現予定の核酸、あるいは別の場合では治療の所望される長さに従って適応させることができる。一般的に本発明に従う組換えウイルスに関しては、後者を、１０⁴ｐｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、そして好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの用量の形態で製剤および投与される。用語「ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）」はウイルス溶液の感染力に相当し、かつ適切な細胞培養物を感染させ、そして一般的には４８時間後に感染化細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の決定技術は刊行物に詳細に記載されている。このような薬剤学的組成物は神経変性性疾患の治療および／または予防のため、かつ具体的には虚血、低酸素症、低血糖症、および癲癇発作に関連するか、あるいは別の場合には大脳損傷に関連する神経変性の治療および／または予防のため、あるいはハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）型舞踏病もしくはアルツハイマー（Ａｌｔｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患の治療および／または予防のためにヒトに用いることができる。本発明は以下に示される実施例の手段により一層完全に記載されるであろうが、ただしこれらの実施例は説明かつ非制限として見なすべきである。図面の説明文配列番号１：ＴＲＥ断片の配列。図１：ウワバインの結合の測定によるグルタメート誘導性細胞死の配列番号１の配列による阻害の証明。この阻害効果は、位置１０（Ｔ→Ｇ）および１５（Ｃ→ Ｔ）で突然変異させた配列番号１の配列の存在下では観察されない。図２：細胞外培地中に放出されるＬＤＨの測定によるグルタメート誘導性細胞死の配列番号１の配列による阻害の証明。この阻害効果は、位置１０（Ｔ→Ｇ）および１５（Ｃ→Ｔ）で突然変異させた配列番号１の配列の存在下では観察されない。図３：トリパンブルー染色によるグルタメート誘導性細胞死の配列番号１の配列による阻害の証明。一般的クローニング技術分子生物学において通常用いられる方法（例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム濃度勾配液内でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、蛋白質のフェノールもしくはフェノール／クロロホルム抽出、食塩培地中でのＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）内での形質転換など）は当業者によく知られており、そして刊行物に詳細に記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ＣｉｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２、ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ｅｔａｌ．（ｅｄｓ）、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７］。ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、ならびにＭ１３シリーズのファージは商業的起源のものである（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。ＤＮＡ断片をアガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりそれらのサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後に供給元の推奨事項に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下でインキュベートして連結反応を実施することができる。５’突出端の充填反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて供給元の説明事項に従って実施することができる。３’突出端の破壊は、用いられるファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で、製造元の推奨事項に従って実施される。５’突出端の破壊はＳヌクレアーゼでの調節的処理により実施される。合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるインビトロでの部位特異的突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することができる。いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼ触媒化連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｓｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４、ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．ａｎｄＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ）」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を用いて、製造元の説明事項に従って実施することができる。ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡＣａｄ．ＳＣｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することができる。実施例実施例１：グルタメートへの大脳皮質細胞の露出後に配列番号１の配列と結合する複合体の証明。この実施例は、グルタメートへの大脳皮質細胞の露出後に配列番号１の配列に結合することが可能な細胞内複合体数の増加を証明する。この証明はゲル遅延技術を使用して実施した（Ｌａｓｓａｒｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ６６（１９９１）３０５）。この目的のためにはウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット胎仔の大脳皮質の細胞（Ｅ１７）をＤｉｃｈｔｅｒ（ＢｒａｉｎＲｅｓ．１４９（１９７８）２７９）の方法に従って単離し、Ｃｏｓｔａｒ社の６ウエルのディシュ内で、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎＭのプロゲステロン、および１ｎＭのトリヨードチロニンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍｕ）中で培養し（３５分、密度：６×１０⁵細胞／ディッシュ）、そしてインキュベーター内に保存した（３７℃、５％ＣＯ₂）。培養中４〜６日後にグルタメートを細胞に添加した。１０分〜４８時間後に細胞の核抽出物を、先に引用されるＬａｓｓａｒｅｔａｌ．により記載される技術に従って取得した。配列番号１の配列に相当する放射活性プローブを実施例２に従い、そしてその後にＭａｎｉａｔｉｓにより記載される技術に従ってリン −３２でラベル化することにより調製した（典型的な比活性：５００００ｃｐｍ／ｎｇ）。このことにより取得された０．２ｎｇのプローブを、その後に５００ｎｇのポリＤ（ＩＣ）（ＩＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の存在下で０．５〜２ μｇの核抽出物と共にインキュベートして非特異的結合を減少させた。この反応は氷中で１０分間実施する。形成される複合体をその後に５％のアクリルアミドゲル上での電気泳動により可視化させる。放射活性バンド（オートラジオグラフィーにより示される）の存在は、グルタメートが、配列番号１の配列と結合可能な複合体の細胞性発現を誘導することを示す。実施例２：配列番号１の配列および不活性変異体の合成。配列番号１の配列に相当する二本鎖核酸を、自動ヌクレオチド合成機の手法により合成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。この核酸の不活性突然変異体は同一のプロトコールに従って調製した。この不活性突然変異体は、配列番号１の配列と比較して、位置１０（Ｔ→Ｇ）および１５（Ｃ→Ｔ）での突然変異を保持する。この突然変異体の活性の不在は実施例１についてのものと同一条件下でこの突然変異体を放射ラベル化後にプローブとして用いて証明した。この突然変異体の不活性性は配列番号１の配列と比較した場合のグルタメート存在下での培養後の細胞抽出物への結合曲線中の変化の非存在により示される。グルタメート誘導性細胞死を阻害する配列番号１の配列の能力は、以下に示す３つのパラメーター、すなわち培養物中のニューロンへのトリチウム化ウワバインの結合、細胞外培地中のラクテートデヒドロゲナーゼの検出、およびトリパンブルー染色後の細胞計数によるパラメーターの測定により決定した。実施例３：培養物中のニューロンへのトリチウム化ウワバインの結合の測定（図１）。ウワバインは膜ＡＴＰアーゼのためのリガンドである。これは生きているニューロンニのみ結合する。従って結合するウワバインの量が多い程、生きている細胞の数は多くなる。ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット胎仔の大脳皮質の細胞（Ｅ１７）をＤｉｃｈｔｅｒ（ＢｒａｉｎＲｅｓ．１４９（１９７８）２７９）の方法に従って単離し、Ｃｏｓｔａｒ社の６ウエルのディシュ（３５分、密度：６×１０⁵細胞／ディッシュ）もしくは２４ウエルのディッシュ（１６分、密度：３×１０⁵細胞／ディッシュ）内で、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎＭのプロゲステロン、および１ｎＭのトリヨードチロニンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍｕ）中で培養し、そしてインキュベーター内に保存した（３７℃、５％ＣＯ₂）。培養の４〜５日後に配列番号１の配列もしくはその不活性変異体（実施例２を参照せよ）の２μＭの合成核酸をそれらの培養ディッシュに添加した。１５時間のインキュベーションの後にグルタメート（１ｍＭ）を添加した。この培養物へのトリチウム化ウワバインの結合をグルタメートの添加後２４時間目に、Ｍａｒｋｗｅｌｌｅｔａｌ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．５３８（１９９１）１）により記載されるプロトコールに従って評定した。得られる結果を図１に示す。これらの結果は、グルタメートが細胞へのウワバインの結合の喪失を誘導すること、およびこの喪失が配列番号１の配列の合成核酸の存在下では阻害されるが、不活化突然変異を施した変異体の存在下では阻害されないことを明白に示す。実施例４：細胞外培地内へのラクテートデヒドロゲナーゼの放出の測定（図２）。ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は死につつある細胞によって細胞外培地中に放出される細胞質酵素である。従って放出されるＬＤＨの量が多い程、死につつある細胞の数は多くなる。細胞は実施例３におけるものと同一条件下で培養した。細胞外培地中に存在するＬＤＨ活性をグルタメートの添加後２４時間目に、ＢｅｒｇｅｒおよびＢｒｏｄｉａの方法（Ｓｉｇｍａｐｒｏｃｅｄｕｒｅ５００）に従ってアッセイした。得られる結果を図２に示す。これらは、グルタメートがＬＤＨの細胞外レベルの上昇を誘導すること、およびこの上昇は配列番号１の配列の合成核酸の存在下では阻害されるが、不活性突然変異を施した変異体の存在下では阻害されないことを明白に示す。実施例５：トリパンブルー染色後の細胞の計数（図３）。トリパンブルーは、死んだ細胞（これは「青色」になる）に貫入する重要な染色であり、すなわち死んだ細胞は生きている細胞（これは「白色」のままである）から排除されるということである。従って「青色」細胞の量が多い程、死んだ細胞の数が多くなる。細胞は実施例３におけるものと同一条件下で培養した。この実施例で用いれられるグルタミン濃度は５ｍＭである。インキュベーション終了時にトリパンブルーを０．０２％の濃度で添加し、そして細胞を再度１０分間インキュベーターに入れた。その後に各ウエル（条件当たり６ウエル）をＺｅｉｓｓ社の１３５Ｍ顕微鏡を用いて５回写真撮影した。その後に青色細胞と白色細胞の数を各写真について盲検様式で計数した。得られる結果を図３に示す。これらは、グルタメートがかなりの細胞死を誘導すること、およびこの細胞死は配列番号１の配列の合成核酸の存在下では阻害されることを明白に示す。まとめると、これらの結果は、グルタメート誘導性ニューロン死を阻害する本発明の核酸の能力を明白に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロベール，ジヤン−ジヤツクフランス国エフ―92330ソ・ブールバールデグランジユ12・レジダンス“レ―ペピニエール"

Claims

【特許請求の範囲】１．神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物の調製のための、配列番号１の配列およびそれと相互作用する転写因子の間の相互作用を少なくとも部分的に阻害する化合物の使用。２．問題となる化合物が、それらの転写因子および／またはその構成因子の合成、転写、翻訳もしくは翻訳後のレベルで、および／またはこれらの因子の活性の調節の分子メカニズム（多量体形成、リン酸化−脱リン酸化）に、および／または配列番号１の配列へのこれらの因子の結合に作用することを特徴とする、請求の範囲１に記載の使用。３．配列番号１の配列への因子ＡＰ１の結合に作用する化合物の、請求の範囲２に記載の使用。４．配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含む二本鎖核酸の、請求の範囲３に記載の使用。５．二本鎖核酸がベクターの部分を形成することを特徴とする、請求の範囲４に記載の使用。６．二本鎖核酸がウイルス性ベクターの部分を形成することを特徴とする、請求の範囲５に記載の使用。７．ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当し、ゲノム中に挿入される少なくとも一つの二本鎖核酸を含む組換えウイルス。８．アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連性ウイルス、もしくはヘルペスウイルスであることを特徴とする、請求の範囲７に記載の組換えウイルス。９．アデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲８に記載の組換えウイルス。１０．二本鎖核酸が配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含むことを特徴とする、請求の範囲７〜９の内の一つに記載の組換えウイルス。１１．ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当する数々の相同もしくは異なる二本鎖核酸を含むことを特徴とする、請求の範囲７〜１０の内の一つに記載の組換えウイルス。１２．欠陥ウイルスであることを特徴とする、請求の範囲７〜１１の内の一つに記載の組換えウイルス。１３．請求の範囲７〜１２の内の一つに記載の少なくとも一つの組換えウイルスを含む薬剤学的組成物。１４．ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当する少なくとも一つの二本鎖核酸を、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、もしくは脂質との複合体形態で、未精製形態で、あるいは別の場合にはリポソームに取り込まれた形態で含む、薬剤学的組成物。