DE60119347T2

DE60119347T2 - Verwendung von chimäres il6-il6r in huntingtonskrankheit

Info

Publication number: DE60119347T2
Application number: DE60119347T
Authority: DE
Inventors: Nicole Deglon; Patrick Aebischer; Jean-Charles Bensadoun
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2021-09-11
Also published as: DK1317273T3; US20040057928A1; US20070172454A1; CY1105116T1; IL154777A0; WO2002022149A1; ES2262680T3; CA2419954C; DE60119347D1; AU2001291849B2; IL154777A; PT1317273E; JP2004508409A; EP1317273A1; AU9184901A; JP5030364B2; CA2419954A1; ATE324906T1; US20100166703A1; US8329654B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Huntington-Erkrankung (HD). Insbesondere betrifft sie die Verwendung einer IL-6R/IL-6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Huntington-Erkrankung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Huntington-Erkrankung ist eine ererbte, autosomal-dominante neurologische Erkrankung. Sie ist selten, wobei sie etwa eine von 10.000 Personen betrifft (Breighton und Hayden 1981). Die Erkrankung wird gewöhnlich bis zu einem Lebensalter von 50 Jahren klinisch nicht offenbar und führt zu psychiatrischen Störungen, unwillkürlichen Bewegungsstörungen und Wahrnehmungsrückgang verbunden mit unvermeidlichen Fortschreiten bis zum Tod, üblicherweise 17 Jahre nach dem Einsetzen.
Das für die Huntington-Erkrankung verantwortliche Gen wird als Huntingtin bezeichnet. Es ist auf Chromosom 4p lokalisiert und stellt ein effektives Mittel zur präklinischen und vorgeburtlichen Diagnose dar. Die genetische Abweichung besteht in einer überschüssigen Zahl hintereinander wiederholter CAG-Nukleotidsequenzen.
Das Huntingtin-Gen wird allgegenwärtig exprimiert (Strong et al., 1993) und ist über einen weiten Bereich von Arten konserviert (Lin et al., 1994). Die strukturelle Analyse seiner Promotorregion steht im Einklang damit, dass es sich um ein Haushaltsgen handelt (Lin et al., 1995). Das Huntingtin-Gen umfasst 67 Exons, überspannt 200 kb (Ambrose et al., 1994) und steht mit zwei Transkripten mit 10,3 kb und 13,6 kb in Zusammenhang, welche sich hinsichtlich ihrer 3'-untranslatierten Regionen unterscheiden (Lin et al., 1993). Es wird für beide Botschaften vorausgesagt, dass sie ein 348 Kilodalton Protein kodieren, welches 3144 Aminosäuren enthält. Darüber hinaus umfasst das Huntingtin-Gen eine stark polymorphe CAG-Wiederholung (Repeat), welche in gewöhnlichen Individuen in ihrer Zahl zwischen 8 und 35 schwankt (Kremer et al., 1994). Eine CAG-Erweiterung über 36 CAG-Repeats hinaus wird in Personen mit Huntington-Erkrankung angetroffen.
Der Anstieg bezüglich der Größe des CAG-Repeats in Personen mit Huntington-Erkrankung zeigt eine hohe signifikante Korrelation mit dem Alter beim Einsetzen klinischer Merkmale. Dies ist insbesondere für Personen mit Einsetzen der Huntington-Erkrankung im Jugendalter auffallend, wobei solche Personen eine sehr signifikante Erweiterung aufzeigen, gewöhnlicherweise über 50 Repeats. Die Länge des CAG-Repeats in Familien mit Huntington-Erkrankung zeigt eine gewisse Instabilität auf, welche insbesondere dann beobachtet wird, wenn Kinder das Huntingtin-Gen von betroffenen Vätern erben.
Für HD ist es nicht bekannt, wie dieses weit verbreitet exprimierte Gen zu selektivem neuronalem Absterben führt. Darüber hinaus ergab Sequenzanalyse keine offensichtliche Homologie zu anderen bekannten Genen und es wurden keine strukturellen Motive oder funktionelle Domänen identifiziert, welche auf eindeutige Weise Einsicht in seine Funktion bereitstellen. Insbesondere bleibt die Frage unbeantwortet, wie diese weit verbreitet exprimierten Gene ein selektives neuronales Absterben verursachen.
Die pathologische Hauptstelle bei HD ist das Striatum, wo bis zu 90 der Neuronen depletiert sein können. Innerhalb des Striatums liegt ein selektiver Verlust bestimmter neuronaler Populationen vor. Bedornte stritale Neuronen (striatal spiny neurons) mit mittlerer Größe, welche die neurochemischen Marker Gamma-Aminobuttersäure (GABA), Substanz P, Dynorphin und Enkephalin enthalten, sind vorzugsweise betroffen. Im Gegensatz dazu bleiben dornenlose Neuronen (aspiny neurons) mit mittlerer Größe, welche die Neuropeptide Somatostatin und Neuropeptid Y enthalten, und große dornenlose Neuronen, welche Cholinacetyltransferase (ChAT)-Aktivität enthalten, verschont (trotz eines Gesamtverlusts an ChAT-Aktivität). Dopaminerge und serotonerge afferente Projektionen bleiben ebenfalls verschont (Beal et al., 1991).
Die beeinträchtigten kognitiven Funktionen und mögliche Demenz können entweder aufgrund des Verlusts kortikaler Neuronen oder aufgrund der Störung der normalen Aktivität im kognitiven Abschnitt der Basalganglien, nämlich dem dorsolateralen präfrontalen Kreislauf und dem lateralen orbitofrontalen Kreislauf auftreten. Es wird angenommen, dass die charakteristische Chorea durch den neuronalen Verlust im Striatum verursacht wird, obwohl auch eine Verringerung der Subthalamusnukleusaktivität dazu beitragen kann. Normalerweise wird ein Gleichgewicht zwischen den Aktivitäten von drei biochemisch unterschiedlichen, aber funktionell miteinander in Beziehung stehenden Systemen aufrecht erhalten: (1) das nigrostriatale dopaminerge System; (2) die intrastriatalen cholinergen Neuronen und (3) das GABA-erge System, welches vom Striatum zum Globus pallidus und zur Substantia nigra projiziert. Ein Ungleichgewicht an einer beliebigen Stelle in den Dopamin-, Acetylcholin- oder GABA-Systemen kann unfreiwillige Bewegungen hervorrufen. Sowohl Cholinacetyltransferase, das Enzym, welches zur Bildung von Acetylcholin benötigt wird und Glutaminsäuredecarboxylase, das Enzym, welches zur Synthese von GABA benötigt wird, liegen im Striatum von Patienten mit HD deutlich verringert vor. Die Defizite an diesen Enzymen stehen mit der klinischen Beobachtung in Übereinstimmung, dass sich choreatische Symptome in Patienten mit HD im Anschluss an die Verabreichung von L-DOPA verschlechtern.
Es wird angenommen, dass Glutamat-induzierter neuronaler Zelltod zur Huntington-Erkrankung beiträgt. Glutamat ist der exzitatorische Haupttransmitter im Gehirn. Er erregt praktisch alle zentralen Neuronen und liegt in den Nervenenden in extrem hohen Konzentrationen (10^–3 M) vor. Glutamatrezeptoren werden in vier Typen eingeteilt (die nach ihren Modellagonisten benannt sind): Kainatrezeptoren, N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoren, a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat (AMPA)-Rezeptoren und metabolotrophe Rezeptoren. Viele normale synaptische Übertragungsereignisse umfassen Glutamatfreisetzung.
Glutamat kann auch Neurotoxizität induzieren sowie in hohen Mengen neuronales Absterben (Choi, 1988). Der Mechanismus des Zelltods vollzieht sich in erster Linie durch die beständige Wirkung von Glutamat auf den N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Typ von Glutamatrezeptoren und den sich ergebenden erhöhten Einstrom von Ca²⁺. Das überschüssige Ca²⁺ mobilisiert aktive Ca²⁺-abhängige Proteasen und aktiviert Phospholipase A2, welche wiederum Arachidonsäure freisetzt, wobei dies zur Erzeugung von Substanzen führt, welche Entzündung und freie Radikale verursachen, die weitere destruktive Ereignisse auslösen können. Von diesen durch Glutamat erzeugten toxischen Veränderungen, welche als Glutamatexzitotoxizität bezeichnet werden, wird angenommen, dass sie Zellschaden und -tod nach einer akuten Gehirnverletzung wie beispielsweise Gehirnschlag oder exzessiver Konvulsion verursachen. Es ist vorgeschlagen worden, dass Exzitotoxizität bei Gehirnischämie, Alzheimer-Erkrankung und HD eine Rolle spielen kann (Greenamyre et al., 1985; Choi et al., 1988).
Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, die HD-Pathologie nachahmen. Eine Infektion von Glutamatrezeptoragonisten in Rattenstriatum kann ein Muster von neuronalem Zellverlust erzeugen, welches zu HD ähnlich ist. Obwohl die Mehrheit der Neuronen an der unmittelbaren Injektionsstelle abstirbt, gibt es einen stufenweisen Übergangsbereich in der Umgebung der Injektionsstelle, welcher selektiven Zelltod aufweist. Anfängliche Studien mit Kainsäure (KA)-induzierten Läsionen zeigten eine markante Ähnlichkeit mit HD. KA wird aus dem Seegras Diginea simplex isoliert und wird im Säugergehirn nicht angetroffen. Intrastriatale Injektionen von KA führen zu neuronalem Verlust und Gliose bei Verringerung von Markern für intrinsische striatale Neuronen, aber Erhaltung von dopaminerger Afferenz. Diese KA-induzierten Läsionen stellen für HD jedoch nur ein mangelhaftes Modell dar, da sie zu einer signifikanten Verringerung an Somatostatinmengen und einem Verlust von Somatostatinneuronen führen. Durch NMDA-Rezeptoragonisten wie beispielsweise Quinolinsäure (QA) erzeugte Läsionen stellen ein besseres HD-Modell bereit, da sie trotz signifikanter Depletion von sowohl GABA- als auch Substanz P-Mengen zu einer relativen Schonung von Somatostatin und Neuropeptid Y-Mengen führen. Langfristige Überwachung (6 Monate bis zu 1 Jahr) von QA-Läsionen zeigt einen Anstieg bezüglich Somatostatin und Neuropeptid Y, sowie bezüglich Serotonin und 5-Hydroxyindolessigsäure (HIAA), welche zu den Befunden in tatsächlichen HD-Patienten ähnlich sind. Chronische QA-Läsionen sind daher den neurochemischen Merkmalen von HD sehr ähnlich (Beal et al., 1991). Andere haben bestätigt, dass eine QA-induzierte Verletzung des Striatums der Histopathologie von HD ähnlich sein kann (siehe z.B. Roberts et al., 1993).
Diese Tiermodelle sind zur Entwicklung von Strategien, welche für die Behandlung von HD relevant sein können, in großem Umfang eingesetzt worden, wie beispielsweise in Zellersatzansätzen und neuroprotektive Ansätzen. Eine signifikante Rettung vor einer Degeneration von GABA-ergen Neuronen wurde im Anschluss an die Verpflanzung fötaler Striatalzellen oder die Verabreichung neurotropher Faktoren in Ratten mit QA-Läsion beobachtet (Bemelmans et al., 1999).
Es sind weitere neurochemische Abweichungen bei HD identifiziert worden, beispielsweise verringerte Mengen an Cholinacetyltransferase und Gammaaminobuttersäure in den Basalganglien. Diese Veränderungen treten vermutlich nach dem primären neuronalen Verlust sekundär auf.
Gegenwärtig gibt es für die Huntington-Erkrankung kein Heilverfahren. Die choreatischen Symptome und die erregten Verhaltensmuster können üblicherweise nur teilweise durch antipsychotische Mittel unterdrückt werden (z.B. Chlorpromazin 100 bis 900 mg/Tag per Os oder Haloperidol 10 bis 90 mg/Tag per Os) oder Reserpin, wobei mit 0,1 mg/Tag per Os begonnen wird und die Menge erhöht wird, bis Nebenwirkungen wie Lethargie, Hypotension oder Parkinsonsyndrom auftreten. Therapeutische Strategien zum Ersetzen von Gehirn-GABA-Speichern waren nicht wirksam. Experimentelle Therapien zielen auf eine Verringerung glutamaterger Neurotransmission über den N-Methyl-D-Aspartatrezeptor und unterstützen mitochondrielle Energieproduktion. Zur Bewertung dieser Therapien werden klinische Langzeitstudien benötigt.
Alle gegenwärtig verfügbaren Behandlungsverfahren konzentrieren sich auf ein Adressieren der Erkrankungssymptome, Vorbeugen damit in Zusammenhang stehender Komplikationen und Bereitstellen von Unterstützung, sowie Hilfe für den Patienten. Für solche Personen mit diagnostizierter HD verschreiben Ärzte oft verschiedene medizinische Behandlungen, um so die Kontrolle emotionaler Probleme und von Bewegungsproblemen zu unterstützen. Benzodiazepine können choreatische Symptome mildern und antipsychotische Wirkstoffe können helfen, Halluzinationen, Wahnvorstellungen oder Gewaltausbrüche zu kontrollieren. Wenn der Patient unter Depression leidet, kann der Arzt Antidepressiva verschreiben. Beruhigungsmittel können verwendet werden, um Angstgefühl zu behandeln und Lithium kann Patienten verschrieben werden, die pathologische Nervosität oder schwere Stimmungsschwankungen zeigen. Andere medizinische Behandlungen können für die schweren obsessiven zwanghaften Verhaltensmuster einiger Personen mit HD-Entwicklung verordnet werden.
Es gibt deshalb einen ungedeckten Bedarf für ein Medikament, pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren, welche zur Behandlung von Huntington-Erkrankung nützlich sind. Derartige Medikamente, pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren stoppen idealerweise das Fortschreiten der degenerativen Erkrankung und auch eine Regeneration der beschädigten Neuronen fördern, ohne schwere nachteilige Nebenwirkungen aufzuweisen.
Mehrere neurotrophe Faktoren wurden bis jetzt in HD-Tiermodellen getestet (Andersen et al, 1996). Gehirn-abgeleiteter Wachstumsfaktor (BDNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder Neurotrophin-3 (NT-3) führten nicht zu einem Schutz striataler Neuronen vor QA-induziertem Zelltod. Ciliarer neurotropher Faktor (CNTF) stellte in einem HD-Affenmodell etwas Schutzwirkung bereit (Emerich et al, 1997).
Es sind einige neuroprotektive Strategien unter Verwendung von gentherapeutischen Ansätzen vorgeschlagen worden. Diese Ansätze beruhen auf der Entwicklung wirksamer Abgabesysteme, welche zu einer stabilen Expression des Transgens über verlängerte Zeiträume hinweg führen und welche zum Vorliegen von therapeutischem Protein in einem ausgedehnten Bereich des Striatums führen. Es wurden die Transplantation von genetisch veränderten Zellen, die Implantation von verkapselten, neurotrophe Faktoren freisetzenden Zellen und kürzlich ein Ansatz zur in vivo-Gentherapie mit einem adenoviralem Vektor getestet (Emerich et al. 1996, Bemelmans et al. 1999). Kürzlich haben sich HIV-1-abgeleitete lentivirale Vektoren als vielversprechendes Genabgabesystem im ZNS herausgestellt (Naldini et al. 1996a; Klimatcheva et al. 1999). Zur Steigerung der Sicherheit des Systems und zur Bestimmung der minimalen genetischen Information, welche für die Transduktion von HIV-1-Vektoren erforderlich ist, wurden seit 1996 signifikante Anstrengungen unternommen.
Zur Minimierung des Risikos im Hinblick auf ein Auftreten von replikationskompetenten Rekombinanten wurden sogenannte SIN (selbst-inaktivierende, self inactivating)-Vektoren entwickelt. Die SIN-Konzeption führt zur Deletion der U3-Region im langen terminalen Repeat (LTR) des Transfervektors, wobei der Hauptteil der viralen Transkriptionselemente vor der Integration entfernt wird. Diese Veränderung verringert nicht nur das Risiko eines Auftretens von replikationskompetenten Viren durch Rekombination, sondern entfernt auch eine transkriptionale Wechselwirkung zwischen der LTR und dem internen Promotor und verringert die Chance, dass Gene, welche benachbart zur Vektorintegrationsstelle liegen, aktiviert werden (Déglon et al., 2000).
Für dieses Expressionsvektorsystem mit einem SIN, welches das LacZ-Reportergen in Mäusen, Ratten und Primaten exprimiert, ist kürzlich gezeigt worden, dass es zu einer hohen und konsistenten Transduktion von neuronalen Zellen führt (Bensadoun et al. 2000; Déglon et al. 2000; Kordower et al. 1999). Darüber hinaus wurde für das Vorliegen des post-transkriptionalen Elements aus dem Waldmurmeltier (woodchuck)-Hepatitisvirus (Zufferey et al. 1999) gezeigt, dass es zu einem 3-4-fachen Anstieg der Transgenexpressionsmenge führt (Déglon et al., 2000), ähnlich zu der Beobachtung in adenoassoziierten Viren (Loeb et al. 1999).
Experimente zur Wirkung eines Cytokins, Interleukin-6 (IL-6), auf Zellen des Zentralen und Peripheren Nervensystems zeigten, dass IL-6 sowohl schützende Wirkung auf neuronale Zellen als auch einen gewissen Einfluss auf entzündliche neurodegenerative Prozesse aufweisen kann (Gadient und Otten, 1997, Mendel et al., 1998). Für IL-6 wurde herausgefunden, dass es Glutamat-induziertem Zelltod sowohl für Neuronen des Hippocampus (Yamada et al. 1994) als auch des Striatums (Toulmond et al., 1992) vorbeugt. Der IL-6 Neuroprotektions-Mechanismus vor Toxizität, welche durch NMDA, den selektiven Agonisten für den NMDA-Subtyp an Glutamatrezeptoren ausgelöst wird, ist noch immer unbekannt. Tatsächlich wurde herausgefunden, dass IL-6 die NMDA-vermittelte intrazelluläre Calciummenge erhöht. In transgenen Mäusen, welche hohe Mengen sowohl an humanem IL-6 als auch humanem löslichen IL-6R (sIL6-R) exprimieren, wurde eine beschleunigte Nervenregenerierung infolge von Verletzung des Nukleus nervi hypoglossi festgestellt, wobei dies durch retrograde Markierung von Kernen des Hypoglossus im Gehirn gezeigt wurde (Hirota et al., 1996). Kürzlich gab es einige Hinweise, dass IL-6 bei einer neurologischen Erkrankung, der Entmarkungskrankheit Multiple Sklerose (MS) eine Rolle spielt (Mendel et al., 1998). Mäuse, welchen das IL-6-Gen fehlte, waren gegenüber der experimentellen Induktion der Erkrankung resistent.
Interleukin-6 (IL-6) ist ein wohl bekanntes Cytokin, dessen biologische Aktivitäten durch ein Membranrezeptorsystem vermittelt werden, welches zwei verschiedene Proteine umfasst, wobei eines als IL-6-Rezeptor (IL-6R oder gp80) und das andere als gp130 bezeichnet wird (zusammengefasst durch Hirano et al, 1994). Lösliche Formen von IL-6R (sIL-6R), welche der extrazellulären Domäne von gp80 entsprechen, sind natürliche Produkte des menschlichen Körpers, welche als Glykoproteine in Blut und in Urin gefunden werden (Novick et al, 1990, 1992). Eine außergewöhnliche Eigenschaft der sIL-6R-Moleküle ist, dass sie als wirksame Agonisten von IL-6 auf vielen Zelltypen einschließlich humanen Zellen wirken (Taga et al, 1989; Novick et al, 1992). Auch ohne die intrazytoplasmatische Domäne von gp80 ist sIL-6R noch immer in der Lage, die Dimerisierung von gp130 in Reaktion auf IL-6 auszulösen, wobei dies wiederum die nachfolgende IL-6-spezifische Signaltransduktion und biologische Wirkungen vermittelt (Murakami et al, 1993). SIL-6R weist zwei Typen von Interaktion mit gp130 auf, wobei beide für die IL-6-spezifischen biologischen Aktivitäten wesentlich sind (Halimi et al., 1995). Für den aktiven IL-6-Rezeptorkomplex wurde vorgeschlagen, dass er eine hexamere Struktur aufweist, welche durch zwei gp130-Ketten, zwei IL-6R- sowie zwei IL-6-Liganden gebildet wird (Ward et al., 1994; Paonessa et al, 1995).
Chimäre Proteine, welche den löslichen IL-6-Rezeptor und IL-6 miteinander verbinden, sind beschrieben worden (Chebath et al., 1997, Fischer et al., 1997, WO 99/02552 und WO 97/32891). Sie sind als IL-6R/IL-6-Chimäre bzw. als Hyper-IL-6 bezeichnet worden. Die chimären IL-6R/IL-6-Moleküle wurden durch Fusionieren der vollständig kodierenden Regionen für die cDNAs, welche den löslichen IL-6-Rezeptor (sIL-6R) und IL-6 kodieren, erzeugt. Eine rekombinante IL-6R/IL-6-Chimäre wurde in CHO-Zellen erzeugt (Chebath et al, 1997, WO 99/02552). Die IL-6R/IL-6 bindet in vitro mit höherer Effizienz an die gp130-Kette als das Gemisch von IL-6 mit sIL-6R (Kollet et al, 1999).
Für die IL-6R/IL-6-Chimäre wurde ferner gezeigt, dass sie die Expression von Myelin-basischem Protein (MBP) und den Po-Genprodukten MBP und Po-RNAs und Proteinen in Kulturen dorsaler Spinalganglien (dorsal root ganglia) (DRG) von 14-Tage-alten Mausembryonen induziert (Haggiag et al., 1999). MBP und Po-Proteine werden normalerweise während der finalen postnatalen Reifung von Schwannzellen induziert und sie werden während Nervenregeneration re-induziert. Die IL-6R/IL-6-Chimäre kann deshalb bei neuronaler Myelinisation und Regeneration eine Rolle spielen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass die Verabreichung einer IL-6R/IL-6-Chimäre einen in hohem Maße günstigen Einfluss auf die Entwicklung der Huntington-Erkrankung aufweist. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Verabreichung einer IL-6R/IL-6-Chimäre sowohl zu einem signifikanten Schutz vor Verlust neuronaler Zellen im Striatum führt als auch zu einer Besserung von Verhaltensstörungen in einem etablierten HD-Tiermodell.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer IL-6R/IL-6-Chimäre, eines Muteins, einer Isoform, eines fusionierten Proteins, eines funktionellen Derivats, einer aktiven Fraktion, eines zirkulär permutierten Derivats oder eines Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Erkrankung. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Zellen und Vektoren umfassend eine IL-6R/IL-6-Chimäre, ein Mutein, eine Isoform, ein fusioniertes Protein, eine aktive Fraktion oder ein zirkulär permutiertes Derivat davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Erkrankung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Abbildung, welche die Proteinstruktur der IL-6R/IL-6-Chimäre zeigt.
2 zeigt die Expressionsrate von LacZ (Kontrolle), IL-6- und IL-6R/IL-6-Chimäre in den Überständen von 293 Zellen, welche entweder mit einem Expressionsplasmid (2A) oder einem Lentivirusexpressionsvektor (2B) infiziert worden waren, umfassend die kodierten Sequenzen von IL-6 (hellgrau) bzw. IL-6R/IL-6 (dunkelgrau).
3 zeigt die Wirkung von LacZ (Kontrolle), IL-6- (senkrechte Linien) und IL-6R/IL-6-Chimäre (waagrechte Linien) auf die Apomorphin-induzierte rotationale Asymmetrie 5, 9 und 11 Tage nach der Verabreichung von QA. Positive Werte entsprechen Wendungen ipsilateral zur Läsion. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
4 zeigt eine Quantifizierung des Ausmaßes der Läsionen basierend auf der Messung der optischen Dichte von DARPP-32-immungefärbten Striatumschnitten aus Tieren, welche mit LacZ (Kontrolle), IL-6- (senkrechte Linien) oder IL-6R/IL-6 (waagrechte Linien) behandelt worden waren. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
5 zeigt den Prozentanteil an (A) NADPH-d-Positivneuronen und (B) ChAT-Positivneuronen auf der rechten Seite (mit Läsion) gegenüber der linken Seite (ohne Läsion) (n = 6 pro Gruppe) von Tieren, welche mit LacZ (Kontrolle), IL-6 (senkrechte Linien) oder IL-6R/IL-6 (waagrechte Linien) behandelt worden waren. Die Werte werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt.
AUSFUEHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Verabreichung einer IL-6R/IL-6-Chimäre sowohl zu einem signifikanten Schutz vor Zelltod von GABA-ergen Neuronen des Striatums als auch zu einer Besserung von Verhaltensstörungen in einem zur Huntington-Erkrankung (HD) etablierten Tiermodell führt.
Die Erfindung betrifft deshalb die Verwendung einer IL-6R/IL-6-Chimäre, eines Muteins, einer Isoform, eines fusionierten Proteins, eines funktionellen Derivats, einer aktiven Fraktion, eines zirkulär permutierten Derivats oder eines Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Erkrankung.
Eine „IL-6R/IL-6-Chimäre" (auch als „IL-6R/IL-6" oder „IL-6-Chimäre" bezeichnet) wie hierin verwendet, ist ein chimäres Molekül umfassend einen löslichen Teil des Interleukin-6-Rezeptors, der an das vollständige Interleukin-6 oder eine biologisch aktive Fraktion von Interleukin-6 fusioniert ist. Die Gruppen des chimären Proteins können direkt fusioniert sein oder sie können durch einen beliebigen geeigneten Linker verknüpft sein, wie beispielsweise eine Disulfidbrücke oder einen Polypeptidlinker. Der Linker kann ein kurzes Linkerpeptid sein, welches so kurz wie 1 bis 3 Aminosäurereste lang oder länger sein kann, beispielsweise 13 oder 18 Aminosäurereste hinsichtlich der Länge. Der Linker kann beispielsweise ein Tripeptid der Sequenz E-F-M (Glu-Phe-Met) sein oder eine 13-Aminosäure-Linkersequenz umfassend Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, welche zwischen die Aminosäuresequenz des löslichen IL-6-Rezeptors und die IL-6-Sequenz eingeführt wird. Beispiele für IL-6R/IL-6 chimäre Moleküle sind im Fachbereich bekannt und sind ausführlich beschrieben worden, z.B. in WO 99/02552 oder WO 97/32891.
Die Bezeichnungen „Behandeln" und „Vorbeugen", wie sie hierin verwendet werden, sollten sowohl als ein Vorbeugen, Hemmen, Abmildern, Verbessern oder Umkehren beliebiger oder aller Symptome oder des/der Grundes/Gründe der Huntington-Erkrankung als auch von Symptomen oder Erkrankungen, welche mit HD einhergehen, und insbesondere die neuroanatomischen Veränderungen und Veränderungen der Verhaltensmuster, welche mit der Erkrankung verbunden sind, verstanden werden.
Die Bezeichnung „Huntington-Erkrankung" oder „HD", wie sie hierin verwendet wird, wird auch als Chorea Huntington, Chronische Progressive Chorea oder Vererbliche Chorea bezeichnet und ist eine autosomale dominante Erkrankung, die durch choreatische Symptome und progressiven intellektuellen Verfall gekennzeichnet ist. Sowohl die Erkrankung als auch die Gründe, Symptome und gegenwärtige Therapien sind ausführlich unter „Hintergrund der Erfindung" beschrieben worden.
Die Erfindung stellt eine neue Möglichkeit zur Behandlung und/oder Vorbeugung von HD bereit, eine bis jetzt praktisch unbehandelbare Erkrankung des Gehirns. Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt bereit, da die Medikamente, welche gegenwärtig verwendet werden, hauptsächlich auf ein Vorbeugen von damit in Zusammenhang stehenden Komplikationen gerichtet sind und dem Patienten Unterstützung und Hilfe bereitstellen, aber daher nicht einen der Gründe, von dem angenommen wird, dass er der Krankheit zugrunde liegt, direkt angreifen, d.h. der neuronale Zellverlust im Striatum. Im Vergleich mit einem anderen Protein, welches als zur Behandlung von HD nützlich vorgeschlagen worden ist, nämlich CNTF (Ciliärer Neurotropher Faktor), zeigt die IL-6R/IL-6-Chimäre im gleichen HD-Tiermodell eine noch stärker ausgeprägte günstige Wirkung. Wie es in den Beispielen weiter unten gezeigt wird, zeigte IL-6R/IL-6 eine Wirkung, welche der durch IL-6 gezeigten Wirkung überlegen ist, sowohl im Hinblick auf Neuroprotektion im Striatum als auch im Hinblick auf eine Verbesserung von Anomalien in Verhaltensmustern, welche in einem etablierten HD-Tiermodell getestet worden sind.
Wie hierin verwendet, betrifft die Bezeichnung „Muteine" Analoga einer IL-6R/IL-6-Chimäre, in welchen eine oder mehrere Aminosäurereste der natürlich vorkommenden Komponenten von IL-6R/IL-6 durch verschiedene Aminosäurereste ersetzt sind oder deletiert sind oder ein oder mehrere Aminosäurerest zu der ursprünglichen Sequenz von IL-6R/IL-6 hinzugefügt sind, ohne die Aktivität der sich ergebenden Produkte im Vergleich mit dem ursprünglichen IL-6R/IL-6 wesentlich zu verändern. Diese Muteine werden durch bekannte Synthese und/oder ortsspezifische Mutagenesetechniken (site-directed) oder beliebige andere bekannte, hierzu geeignete Techniken hergestellt.
Muteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die durch eine Nukleinsäure kodiert werden, wie beispielsweise DNA oder RNA, welche unter stringenten Bedingungen an DNA oder RNA hybridisieren, welche in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein IL-6R/IL-6 kodieren. Der Begriff „stringente Bedingungen" bezieht sich auf Hybridisierung und anschließende Waschbedingungen, auf welche sich der Durchschnittsfachmann üblicherweise hinsichtlich „stringent" bezieht. Siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 und 6.4 (1987, 1992) und Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Ohne Beschränkung umfassen Beispiele stringenter Bedingungen Waschbedingungen 12–20 °C unterhalb der berechneten Tm des zu untersuchenden Hybrids in z.B. 2 × SSC und 0,5 % SDS für 5 Minuten, 2 × SSC und 0,1 % SDS für 15 Minuten; 0,1 × SSC und 0,5 % SDS bei 37 °C für 30–60 Minuten und anschließend 0,1 × SSC und 0,5 % SDS bei 68 °C für 30–60 Minuten. Der Fachmann versteht, dass Stringenzbedingungen auch von der Länge der DNA-Sequenzen, der Oligonukleotidsonden (wie beispielsweise 10–40 Basen) oder der gemischten Oligonukleotidsonden abhängig ist. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstelle von SSC zu verwenden. Siehe Ausubel, supra.
Jedes derartige beliebige Mutein weist vorzugsweise eine Aminosäuresequenz auf, welche in einem ausreichenden Maß ein Duplikat von IL-6R/IL-6 darstellt, so dass sie eine zu IL-6R/IL-6 im Wesentlichen ähnliche oder sogar bessere Aktivität besitzt.
Eine charakteristische Aktivität von IL-6R/IL-6 ist seine Fähigkeit, an gp130 zu binden. Ein ELISA-artiger Assay zum Messen der Bindung von IL-6R/IL-6 an gp130 wurde ausführlich in Beispiel 7 auf Seite 39 von WO 99/02552 beschrieben, welcher durch Bezugnahme hierin vollständig eingeschlossen ist. Solange das Mutein eine wesentliche Bindungsaktivität an gp130 aufweist, kann angenommen werden, dass es eine im Wesentlichen ähnliche Aktivität zu IL-6R/IL-6 aufweist. Es kann daher bestimmt werden, ob ein beliebiges Mutein wenigstens im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie IL-6R/IL-6 aufweist, wobei Routineversuchen verwendet werden, umfassend das Unterziehen eines derartigen Muteins, z.B. gegenüber einem einfachen Sandwich-Bindungsassay zur Bestimmung, ob es oder ob es nicht an immobilisiertes gp130 bindet, wie es in Beispiel 7 von WO 99/02552 beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein derartiges Mutein wenigstens 40 % Identität oder Homologie mit der Sequenz gemäß IL-6R/IL-6 auf, welche von WO 99/02552 umfasst ist. Stärker bevorzugt weist es wenigstens 50 %, wenigstens 60 %, wenigstens 70 %, wenigstens 80 % oder am stärksten bevorzugt wenigstens 90 % Identität oder Homologie dazu auf.
Identität spiegelt eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen wider, wobei dies durch Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Im Allgemeinen bezieht sich Identität auf eine exakte Nukleotid-zu-Nukleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Übereinstimmung von zwei Polynukleotid- bzw. zwei Polypeptidsequenzen über die Länge der zu vergleichenden Sequenzen hinweg.
Für Sequenzen, in welchen keine genaue Übereinstimmung vorliegt, kann „%-Identität" bestimmt werden. Im Allgemeinen werden zwei zu vergleichende Sequenzen aligned, um eine maximale Zuordnung zwischen den Sequenzen zu ergeben. Dies kann das Einfügen von „Lücken" in einer oder beiden Sequenzen umfassen, um den Alignmentgrad zu erhöhen. %-Identität kann über die gesamte Länge von jeder der zu vergleichenden Sequenzen bestimmt werden (ein sogenanntes Globalalignment), welches besonders geeignet ist für Sequenzen mit der gleichen oder einer sehr ähnlichen Länge, oder über kürzere, definierte Längen (ein sogenanntes Lokalalignment), welches für Sequenzen unterschiedlicher Länge besser geeignet ist.
Verfahren zum Vergleich der Identität und Homologie von zwei oder mehr Sequenzen sind im Fachbereich wohlbekannt. Daher können beispielsweise Programme, welche im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devereux J et al 1984) zur Verfügung stehen, wie beispielsweise die Programme BESTFIT und GAP, verwendet werden, um die %-Identität zwischen zwei Polynukleotiden und die %-Identität und die %-Homologie zwischen zwei Polypeptidsequenzen zu bestimmen. BESTFIT verwendet den „Lokalhomologie"-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) und findet den besten Ähnlichkeits-Einzelabschnitt zwischen zwei Sequenzen. Andere Programme zur Bestimmung von Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind im Fachbereich ebenfalls bekannt, beispielsweise die BLAST-Programmfamilie (Altschul S. F. et al, 1990, Altschul S. F. et al, 1997, zugänglich über die Homepage des NCBI unter www.ncbi.nlm.nih.gov) sowie FASTA (Pearson W. R., 1990; Pearson, 1988).
Muteine von IL-6R/IL-6, welche in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, oder Nukleinsäuren, welche dafür kodieren, umfassen einen begrenzten Satz im Wesentlichen korrespondierender Sequenzen, wie Substitutionspeptide oder Polynukleotide, welche durch einen Durchschnittsfachmann auf Grundlage der Lehren und hierin bereitgestellten Leitlinien routinemäßig erhalten werden können, ohne übermäßige Versuche durchzuführen.
Bevorzugte Veränderungen für Muteine in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind solche Veränderungen, welche als „konservative" Substitutionen bekannt sind. Konservative Aminosäuresubstitutionen von IL-6R/IL-6 umfassen synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe, welche im Wesentlichen gleiche physiochemische Eigenschaften aufweisen, so dass Substitutionen zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls erhalten (Grantham, 1974). Es ist selbstverständlich, dass Insertionen und Deletionen von Aminosäuren in den oben definierten Sequenzen ohne Änderung von deren Funktion durchgeführt werden können, insbesondere wenn die Insertionen oder Deletionen nur wenige Aminosäuren umfassen, d.h. weniger als dreißig, und vorzugsweise weniger als 10 und nicht die Aminosäuren entfernen oder ersetzen, welche für eine funktionelle Konformation kritisch sind, d.h. Cysteinreste. Durch derartige Deletionen und/oder Insertionen erzeugte Proteine und Muteine liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.

Vorzugsweise sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, welche in Tabelle 1 definiert sind. Stärker bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, welche in Tabelle 2 definiert sind; und am stärksten bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, welche in Tabelle 3 definiert sind. Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren TABELLE 1

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys

His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Stärker bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren TABELLE 2

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg

Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

Am stärksten bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren TABELLE 3

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln

Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Beispiele für die Herstellung von Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, welche zum Erhalt von Muteinen von IL-6R/IL-6-Polypeptiden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen alle bekannten Verfahrensschritte, wie sie beispielsweise in den US-Patenten 4,959,314, 4,588,585 und 4,737,462 von Mark et al; 5,116,943 von Koths et al., 4,965,195 von Namen et al.; 4,879,111 von Chong et al; und 5,017,691 von Lee et al. dargestellt werden; sowie Lysin-substituierte Proteine, wie sie in US-Patent Nr. 4,904,584 (Shaw et al.) dargestellt werden.
Die Bezeichnung „fusioniertes Protein" betrifft ein Polypeptid umfassend ein IL-6R/IL-6 oder ein Mutein oder ein Fragment davon, welches mit einem anderen Protein fusioniert ist, welches beispielsweise eine verlängerte Verweilzeit in Körperfluiden aufweist. Ein IL-6R/IL-6 kann deshalb mit einem anderen Protein, Polypeptid oder dergleichen, z.B. einem Immunoglobulin oder einem Fragment davon fusioniert sein.
„Funktionelle Derivate" wie hierin verwendet decken Derivate von IL-6R/IL-6 ab sowie deren Muteine und fusionierte Proteine, welche aus den funktionellen Gruppen, welche als Seitenketten an den Resten oder den N- oder C-terminalen Gruppen auftreten, mittels im Fachbereich bekannter Verfahren hergestellt werden können und sind von der vorliegenden Erfindung umfasst, solange sie pharmazeutisch annehmbar bleiben, d.h. sie die Aktivität des Proteins nicht zerstören, wobei die Aktivität im Wesentlichen ähnlich zu der Aktivität von IL-6R/IL-6 ist, und solange sie Zusammensetzungen, in welchen sie enthalten sind, keine toxischen Eigenschaften verleihen.
Diese Derivate können zum Beispiel Polyethylenglycolseitenketten umfassen, welche viele antigenische Stellen markieren und die Verweilzeit eines IL-6R/IL-6 in Körperflüssigkeiten verlängern. Andere Derivate umfassen aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acylderivate von freien Aminogruppen der Aminosäurereste, welche mit Acyleinheiten gebildet werden (z.B. Alkanoyl- oder carbozyklische Aroylgruppen) oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen (beispielsweise diejenigen von Seryl oder Threonylresten), welche mit Acyleinheiten gebildet werden.
Eine „aktive Fraktion" gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise ein Fragment von IL-6R/IL-6 sein. Die Bezeichnung Fragment betrifft eine beliebige Teilmenge des Moleküls, das heißt, ein kürzeres Peptid, welches die gewünschte biologische Aktivität beibehält. Fragmente können auf einfache Weise durch Entfernen von Aminosäuren von einem der beiden Enden des IL-6R/IL-6-Moleküls hergestellt werden, sowie durch Testen des sich ergebenden Fragments hinsichtlich seiner Bindungseigenschaften an gp130. Proteasen zur Entfernung einer Aminosäure entweder am N-Terminus oder am C-Terminus eines Polypeptids sind jeweils bekannt und auch die Bestimmung von Fragmenten, welche die gewünschte biologische Aktivität beibehalten, umfasst nur Routineversuche.
Als aktive Fraktionen eines IL-6R/IL-6, Muteinen und fusionierten Proteinen davon umfasst die vorliegende Erfindung ferner jegliches Fragment oder jegliche Vorläufer der Polypeptidkette des Proteinmoleküls allein oder zusammen mit assoziierten Molekülen oder damit verknüpften Resten z.B. Zucker oder Phosphatresten, oder Aggregaten des Proteinmoleküls oder die Zuckerreste selbst, vorausgesetzt, dass die Fraktion im Wesentlichen ähnliche Aktivität gegenüber gp130 aufweist.
Die Bezeichnung „Salze" betrifft sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen des IL-6R/IL-6-Moleküls oder Analoga davon. Salze von Carboxylgruppen können durch im Fachbereich bekannte Verfahren gebildet werden und umfassen anorganische Salze, zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen Ill- oder Zinksalze und dergleichen, und Salze mit organischen Basen, wie beispielsweise diejenigen, welche mit Aminen gebildet werden, wie zum Beispiel Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen. Säureadditionssalze umfassen beispielsweise Salze mit Mineralsäuren, wie beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure oder Oxasäure. Selbstverständlich müssen alle derartigen Salze, die biologische Aktivität von IL-6R/IL-6 beibehalten, d.h. die Fähigkeit, an gp130 zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die IL-6R/IL-6-Chimäre an einer oder mehreren Stellen glykosyliert.
Eine glykosylierte Form einer IL-6R/IL-6-Chimäre ist in WO 99/02552 (PCT/IL98/00321) beschrieben worden, wobei dies das chimäre Molekül ist, welches gemäß der Erfindung stark bevorzugt ist. Die hierin beschriebene IL-6R/IL-6-Chimäre ist ein rekombinantes Glykoprotein, welches durch Fusionieren der vollständigen kodierenden Sequenz des natürlich vorkommenden löslichen IL-6-Rezeptors δ-Val (Novick et al., 1990) mit der vollständigen kodierten Sequenz des reifen natürlich vorkommenden IL-6 erhalten wurde, wobei beide von humanem Ursprung sind.
Die IL-6R/IL-6-Chimäre kann durch einen beliebigen geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Zelltyp erzeugt werden, wie beispielsweise Hefezellen, Insektenzellen, Bakterien und dergleichen. Sie wird bevorzugt in Säugerzellen hergestellt, am stärksten bevorzugt in genetisch veränderten CHO-Zellen, wie es in WO 99/02552 beschrieben ist. Während das Protein mit humanem Ursprung bevorzugt ist, wird es durch den Fachmann anerkannt, dass ein ähnliches Fusionsprotein mit einem beliebigen anderen Ursprung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, solange es die hierin beschriebene biologische Aktivität beibehält.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die IL-6R/IL-6-Chimäre nicht glykosyliert. Vorteilhafterweise kann das chimäre Molekül dann in bakteriellen Zellen hergestellt werden, welche nicht in der Lage sind, Glykosylreste zu synthetisieren, welche aber üblicherweise eine hohe Ausbeute an erzeugtem rekombinantem Protein aufweisen.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die IL-6R/IL-6-Chimäre ferner eine Immunglobulinfusion, d.h. das IL-6R/IL-6 gemäß der vorliegenden Erfindung ist mit einem vollständigem Immunglobulin oder einem Teil eines Immunglobulins fusioniert. Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinfusionsproteinen sind im Fachbereich bekannt, wie beispielsweise diejenigen, welche zum Beispiel in WO 01/03737 beschrieben sind. Der Fachmann versteht, dass sich das ergebende Fusionsprotein der Erfindung die biologische Aktivität der IL-6R/IL-6-Chimäre beibehält. Das sich ergebende Fusionsprotein weist idealerweise verbesserte Eigenschaften auf, wie beispielsweise eine verlängerte Verweilzeit in Körperfluiden (Halbwertszeit), eine erhöhte spezifische Aktivität, einen erhöhten Expressionslevel oder eine erleichterte Aufreinigung des Fusionsproteins.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die IL-6R/IL-6-Chimäre mit der beständigen Region eines Ig-Moleküls fusioniert. Vorzugsweise ist sie mit Abschnitten der schweren Kette fusioniert, wie beispielsweise den CH2- und CH3-Domänen von humanem IgG1. Andere Isoformen von Ig-Molekülen sind zur Erzeugung von Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet, wie beispielsweise die Isoformen IgG₂ oder IgG₄ oder andere Ig-Klassen, wie beispielsweise IgM oder IgA. Fusionsproteine können monomer oder multimer, hetero- oder homomultimer sein.
Funktionelle Derivate einer IL-6R/IL-6-Chimäre können mit Polymeren konjugiert sein, um die Eigenschaften des Proteins zu verbessern, wie beispielsweise die Stabilität, die Halbwertszeit, die Bioverfügbarkeit, die Toleranz durch den menschlichen Körper oder die immunogene Aktivität.
Deshalb betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein funktionelles Derivat der IL-6R/IL-6-Chimäre, umfassend wenigstens eine Einheit, welche an einer oder an mehreren funktionelle Gruppen angebracht ist, die als eine oder als mehrere Seitenketten an den Aminosäureresten auftreten.
Eine stark bevorzugte Ausführungsform betrifft ein IL-6R/IL-6, welches mit Polyethylenglycol (PEG) verknüpft ist. PEG-ylierung kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise diejenigen, die in WO 92/13095 beschrieben sind.
Die IL-6R/IL-6-Chimäre kann durch eine beliebige geeignete Formulierung an das Gehirn abgegeben werden. Vorzugsweise kann sie in Form von Zellen, welche eine IL-6R/IL-6-Chimäre, ein Mutein, ein fusioniertes Protein, eine aktive Fraktion oder ein zirkulär permutiertes Derivat davon exprimieren und/oder sekretieren, abgegeben werden. Wie in den unten beschriebenen Beispielen dargelegt, wurden Zellen, welche eine IL-6R/IL-6-Chimäre in ausreichenden Mengen exprimieren und sekretieren, durch Transfektion unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors erzeugt.
Die Erfindung betrifft deshalb ferner die Verwendung einer Zelle, welche eine IL-6R/IL-6-Chimäre, ein Mutein, ein fusioniertes Protein, eine aktive Fraktion oder ein zirkular permutiertes Derivat davon exprimiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Erkrankung. Die Zellen können in einer beliebigen geeigneten Form verabreicht werden. Eine polymerverkapselte IL-6R/IL-6-Chimäre exprimierende und vorzugsweise sekretierende Zelle ist jedoch eine stark bevorzugte Art zur Abgabe einer IL-6R/IL-6-Chimäre. Das Verkapselungsverfahren wird zum Beispiel ausführlich durch Emerich et al (1994) oder US 5,853,385 beschrieben. Geeignete Zelllinien und stabile Expressionssysteme sind im Fachbereich wohl bekannt.
Die Abgabe einer IL-6R/IL-6-Chimäre kann auch unter Verwendung eines Vektors, wie beispielsweise eines Expressionsvektors durchgeführt werden, der die kodierende Sequenz oder eine IL-6R/IL-6-Chimäre, ein Mutein, ein fusioniertes Protein, eine aktive Fraktion oder ein zirkulär permutiertes Derivat davon umfasst. Der Vektor umfasst alle regulatorischen Sequenzen, welche für die Expression des gewünschten Proteins im menschlichen Körper, vorzugsweise im Gehirn, stärker bevorzugt im Striatum, notwendig sind. Regulatorische Sequenzen für Expressionsvektoren sind dem Fachmann bekannt. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung eines Vektors umfassend die kodierende Sequenz für eine IL-6R/IL-6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Huntington-Erkrankung.
Ein beliebiger im Fachbereich bekannter Expressionsvektor kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wie in den Beispielen weiter unten gezeigt, war aber ein aus Lentivirus abgeleiteter Vektor für die Abgabe einer IL-6R/IL-6-Chimäre direkt in das Striatum besonders bevorzugt. Deshalb betrifft eine stark bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Verwendung eines lentiviralen Vektors als Expressionsvektor für die Expression einer IL-6R/IL-6-Chimäre, eines Muteins, eines fusionierten Proteins, einer aktiven Fraktion oder eines zirkulär permutierten Derivats davon. Solche lentiviralen Vektoren sind im Fachbereich bekannt. Sie werden beispielsweise speziell in Kordower et al. (1999) oder Déglon et al. (2000) beschrieben.
Die IL-6R/IL-6-Chimäre kann an einen Patienten, welcher einer Verabreichung bedarf, auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungsrouten umfassen intrakraniale, intradermale, transdermale (z.B. in langsam freisetzenden Formulierungen), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, epidurale, topische und transnasale Wege. Beliebige andere therapeutisch wirksame Verabreichungswege können verwendet werden, beispielsweise Absorption durch Epithel- oder Endothelgewebe oder durch Gentherapie, wobei ein DNA-Molekül, welches die IL-6R/IL-6-Chimäre kodiert, an den Patienten verabreicht wird (z.B. über einen Vektor), was bewirkt, dass die IL-6R/IL-6-Chimäre exprimiert und in vivo sekretiert wird. Darüber hinaus kann die IL-6R/IL-6-Chimäre zusammen mit anderen Komponenten biologisch aktiver Mittel verabreicht werden, wie beispielsweise pharmazeutisch annehmbaren oberflächenaktiven Mitteln, Hilfsmitteln, Trägern, Verdünnungsmitteln und Vehikeln.
Für eine parenterale Verabreichung (z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär) kann eine IL-6R/IL-6-Chimäre als Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophilisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Vehikel (z.B. Wasser, Salzlösung, Dextroselösung) und Additiven, die die Isotonizität (z.B. Mannitol) oder die chemische Stabilität (z.B. Konservierungsmittel und Puffer) aufrecht erhalten, formuliert werden. Die Formulierung wird durch üblicherweise verwendete Techniken sterilisiert.
Eine „wirksame Menge" betrifft eine Menge eines aktiven Inhaltsstoffs, welche ausreichend ist, den Verlauf und die Schwere der oben beschriebenen Krankheiten zu beeinflussen, wobei dies zur Verringerung oder Remission einer derartigen Pathologie führt. Die wirksame Menge ist vom Verabreichungsweg und vom Zustand des Patienten abhängig.
Die an eine Person verabreichte Dosierung, als Einzel- oder Mehrfachdosis, ist von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, einschließlich den pharmakokinetischen Eigenschaften von IL-6R/IL-6, dem Verabreichungsweg, den Zuständen und Merkmalen des Patienten (Geschlecht, Alter, Körpergewicht, Gesundheit, Größe), dem Ausmaß der Symptome, den gleichzeitig stattfindenden Behandlungen, der Häufigkeit der Behandlung und der gewünschten Wirkung. Die Anpassung und Veränderung etablierter Dosisbereiche gehören zu den Fähigkeiten des Fachmanns.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Expressionsvektor ein Vektor zur Gentherapie. Die Verwendung eines viralen Vektors, insbesondere eines lentiviralen Vektors, ist stark bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die nicht-beschränkend wirkenden Beispiele und die begleitenden Zeichnungen im Folgenden ausführlicher beschrieben.
Nachdem diese Erfindung nun vollständig beschrieben worden ist, wird der Fachmann erkennen, dass die gleiche Erfindung innerhalb eines breiten Bereichs von äquivalenten Parametern, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne vom Erfindungsgedanken und dem Bereich der Erfindung abzuweichen und ohne übermäßige Versuche durchzuführen.
Obwohl diese Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, dass weitere Variationen durchgeführt werden können. Es ist beabsichtigt, dass diese Anwendung beliebige Veränderungen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdeckt, welche im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, welche die bekannte und übliche Praxis im Bereich, welchem die vorliegende Erfindung zugehört, mit sich bringt und welche den hierin zuvor dargelegten wesentlichen Merkmalen zugerechnet werden können, wie sie im Folgenden im Bereich der angefügten Ansprüche dargelegt sind.
Bezugnahme auf bekannte Verfahrensschritte, übliche Verfahrensschritte, bekannte Verfahren oder übliche Verfahren ist in keinster Weise ein Zugeständnis, dass irgendein Aspekt, Beschreibung oder Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch den Stand der Technik offenbart, gelehrt oder vorgeschlagen wird.
Die vorausgehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen offenbart die allgemeine Art der Erfindung so vollständig, dass Andere durch Anwenden von Wissen, welches innerhalb der Fachkenntnisse liegt (einschließlich des Inhalts der hierin zitierten Referenzen), für verschiedene Anwendungen derartige spezifische Ausführungsformen auf einfache Weise modifizieren und/oder anpassen können, ohne übermäßige Versuche durchzuführen und ohne vom allgemeinen Konzept der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Deshalb ist es beabsichtigt, dass derartige Anpassungen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung eines Äquivalnetbereichs der offenbarten Ausführungsformen liegen, auf Grundlage der hierin dargelegten Lehre und Richtlinie. Es ist selbstverständlich, dass die Ausdrucksweise oder Terminologie hierin dem Zwecke der Beschreibung und nicht der Beschränkung dient, so dass die Terminologie oder Ausdrucksweise der vorliegenden Erfindung durch den Fachmann im Licht der hierin dargelegten Lehren und Richtlinie in Kombination mit dem Wissen des Durchschnittsfachmanns auszulegen ist.
BEISPIELE
Material und Verfahren
IL-6R/IL-6-Chimäre
Die cDNA-Sequenzen, welche für den löslichen IL-6-Rezeptor (natürliche Form von sIL-6, gefunden in Urin, Oh et al., 1997) kodieren, wurden mit den cDNA-Sequenzen fusioniert, welche für reifes IL-6 kodieren. Sequenzen für 3 verbrückende Aminosäuren (EFM) lagen ebenfalls vor. Das fusionierte Gen wurde in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle des CMV-Promotors insertiert und in CHO-Zellen eingefügt. Es wurde ein Herstellungsverfahren entwickelt und das sich ergebende rekombinante Protein wurde durch Immunreinigung unter Verwendung eines Anti-IL-6R monoklonalen Antikörpers gereinigt. Für die gereinigte IL-6-Chimäre ist gezeigt worden, dass sie glykosyliert vorlag und ein offensichtliches Molekulargewicht (MW) von 85.000 zeigte.
1 zeigt schematisch die Zusammensetzung des IL-6R/IL-6 chimären Proteins. Das reife Protein umfasst 524 Aminosäuren.
Ein wie oben dargelegt erzeugtes und gereinigtes Protein ist für eine Verabreichung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
Herstellung eines lentiviralen Vektors
Die cDNAs, welche für eine kernlokalisierte β-Galaktosidase (LacZ) kodieren, das humane IL-6 (Genbank M14584: 64-824bp) und die humane IL-6R/IL-6-Chimäre (Genbank NM000565: 415-1508bp; Genbank M14584: 148-702bp) (Haggiag et al., 1999; Katz et al., 1998) wurden in den SIN-W-PGK-Transfervektor (Déglon et al., 2000) kloniert. Drei verbrückende Aminosäuren (Glu-Phe-Met) lagen an der Verbindung zwischen den IL-6- und den IL-6R vor. Die viralen Partikel wurden wie zuvor beschrieben erzeugt (Hottinger et al., 2000). LacZ-, IL-6- und IL-6R/IL-6-exprimierende Viren wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)/1 % Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert und hinsichtlich ihres Partikelgehalts angeglichen (250.000 ng p24 Antigen/ml wie durch ELISA-Assay bestimmt).
In vivo-Experimente
Es wurden erwachsene weibliche Wistar Ratten (Iffa-Credo, Frankreich) mit einem Gewicht von 180–200 g verwendet. Die Tiere waren in einem temperaturgeregelten Raum untergebracht, der bei einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus gehalten wurde. Futter und Wasser waren nach Belieben verfügbar. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie (86/609/EEC) zur Behandlung und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.
a) Injektion von Lentiviren
Die konzentrierten Virenmaterialien wurden aufgetaut und anschließend durch wiederholtes Pipettieren resuspendiert. Zwei Mikroliter von IL-6-, IL-6R/IL-6- oder LacZ-exprimierenden lentiviralen Vektoren wurden stereotaktisch in das Striatum von Tieren (n = 6 pro Gruppe) injiziert, welche mit Pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) anästhesiert worden waren, wobei eine Hamiltonspritze mit einer 33 Gaugenadel mit stumpfem Ende (Hamilton, Reno, NV) verwendet wurde. Die stereotaktischen Koordinaten für die Injektion waren: 1,0 mm rostral zu Bregma; 2,2 mm lateral zur Mittellinie (LM); 5 mm ventral von der duralen Oberfläche. Die Suspension wurde mit 0,2 μl/min injiziert und man beließ die Nadel für 5 Min an der Stelle. Die Haut wurde unter Verwendung einer 6-0 Vicryl^® chirurgischen Nadel (Ethicon, Johnson and Johnson, Brüssel) verschlossen. Vor der Injektion von Quinolinsäure ließ man sich die Tiere für drei Wochen erholen.
b) Quinolinsäurelesion
Quinolinsäure (180 nmol, Sigma Chemical, St. Louis, USA) wurde in 2 M NaOH gelöst, der pH wurde auf 7,4 eingestellt und das Volumen wurde mit PBS bei pH 7,4 vervollständigt. Die Tiere wurden mit Pentobarbital (45 mg/kg) betäubt und erhielten eine intrastratiale Injektion von 1 μl Quinolinsäure (180 nmol) unter Verwendung der folgenden Koordinaten: 1,0 rostral zu Bregma; 3,2 mm lateral zur Mittellinie (LM); 5 mm ventral von der duralen Oberfläche. Das Toxin wurde über 1 Minute hinweg injiziert und man beließ die Nadel für zusätzliche 3 Minuten an dieser Stelle.
Analyse der Verhaltensmuster
Apomorphin-induzierte rotationale Asymmetrie wurde vor der Infektion des Virus zweimal gemessen. Den Tieren wurden subkutan 1,0 mg/kg Apomorphin (Amino AG, Neunhof, Schweiz) injiziert und anschließend wurden sie in einer Testkammer (Rotoscan, Rotometer v5.06, Omnitech Instruments, Columbus, USA) für eine 3 Minuten Gewöhnungsphase platziert, woran sich eine 45 Min Testsitzung anschloss. Rotationen wurden als vollständige 360 ° ipsilaterale Umdrehungen definiert und wurden als die Nettodifferenz zwischen ipsilateralen und kontralateralen Rotationen beschrieben. Es wurden Tiere ausgewählt, die kein spontanes Drehverhalten zeigten (weniger als 40 Umdrehungen pro 45 Min). Die Tiere wurden eine und zwei Wochen nach der Injektion des Virus und 5, 9 und 13 Tage nach QA-Verabreichung getestet. Die Ergebnisse werden als Nettodifferenz zwischen der Gesamtzahl an Drehungen vor und nach der Verabreichung von QA ausgedrückt. Ipsilaterale Umdrehungen wurden als positive Umdrehungen gezählt, wohingegen kontralaterale Umdrehungen als negative Drehungen gezählt wurden.
IL-6 und IL-6R/IL-6 chimäre ELISA-Assays
Die in vivo-Synthese von IL-6 und IL-6R/IL-6-Chimäre wurde aus Stanzen (2,8 × 2 mm) bestimmt, welche um die Injektionsstellen und aus den nicht-injizierten Hemispheren von Kontrollratten (n = 5 pro Gruppe) entnommen wurden. Die Proben wurden in 500 μl PBS, welches ein Gemisch von Proteaseinhibitoren enthielt (Pronase, Thermolysin, Chymotrypsin, Trypsin, Papain; Roche Pharma, Reinach, Schweiz) ultraschallbehandelt. IL-6-Erzeugung wurde durch ELISA gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt (IL-6-EASIA-45 Min; Biosource Europe SA, Nivelles, Belgien).
Die Erzeugung von IL-6R/IL-6-Chimäre wurde wie folgt bestimmt. Sechsundneunzig Wellplatten (Maxisorb; NUNC, LifeTechnologies AG, Basel, Schweiz) wurden über Nacht mit 100 μl von 1 μg/ml Anti-IL-6R monoklonalen Antikörpern (Klon 34.1, bereitgestellt von Serono International), welche in PBS verdünnt waren, beschichtet. Der Blockierungsschritt wurde mit 2 % I-Block (Tropix, Bedford, MA, USA) in PBS für 1 h bei 37 °C durchgeführt. Die Proben (100 μl/Well) wurden in 1 % I-Block, 0,1 % Tween 20 und 5 % Mausserum in PBS verdünnt und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Sekundärantikörper (IgG für sIL6-R 3466, zur Verfügung gestellt von Serono International) wurden 1/1000 in 1 % I-Block und 0,1 % Tween 20 in PBS verdünnt und anschließend für 1 h bei 37 °C inkubiert (100 μl/Well). Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, welche mit HRP konjugiert war (zur Verfügung gestellt von Serono International; Verdünnung 1/5000 in PBS, 1 % I-Block und 0,1 % Tween 20) wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert. Das Vorliegen der IL-6R/IL-6-Chimäre wurde unter Verwendung des TMB-Kits (Roche Pharma, Reinach, Schweiz) gezeigt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen.
Histologische Aufbereitung
Zwei Wochen nach der QA-Läsion wurde den Tieren eine Natriumpentobarbital-Überdosis verabreicht und sie wurden künstlich mit Salzlösung und 4 % Paraformaldehyd durchblutet. Die Gehirne wurden entfernt und in 4 % Paraformaldehyd für etwa 24 Stunden post-fixiert und abschließend in 25 % Saccharose/0,1 M Phosphatpuffer für 48 Stunden cryogeschützt. Die Gehirne wurden in Trockeneis eingefroren und 25 μm Koronalschnitte wurden auf einem gleitgelagerten Mikrotomcryostat (Cryocut 1800, Leica Microsystems, Nußloch, Deutschland) bei –20 °C geschnitten. Schnitte durch das vollständige Striatum wurden gesammelt und in 48 Well-Schalen (Costar, Cambridge, MA) als frei-schwimmende Schnitte in PBS, welches mit 0,12 μM Natriumazid supplementiert war, gelagert. Die Schalen wurden bis zur immunohistochemischen Verarbeitung bei 4 °C gelagert.
Die Proben wurden durch Immunohistochemie hinsichtlich Dopamin- und cAMP-reguliertem Phosphoprotein mit einer molekularen Masse von 32 kDa (DARPP-32), Cholinacetyltransferase (ChAT) (Roche Pharma, Reinach, Schweiz), IL-6 (R&D system, Abington, UK) und dem sauren Gliafaserprotein (glial fibrillary acidic protein) (GFAP) (Sigma-Genosys Ltd, Cambridge, UK) verarbeitet. Enzymatische Anfärbung für NADPH-Diaphorase (NADPH-d) wurde wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Ellison et al., 1987). Für immunhistochemische Anfärbungen wurde endogene Peroxydase-Aktivität mit 0,1 Diphenylhydrazin/PBS (37 °C/30') gedämpft und 3-mal in PBS gewaschen. Frei-schwimmende Schnitte wurden über Nacht in 5 % normalem Ziegenserum (NGS, Dako Diagnostics, Schweiz)/0,1 M Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 4 °C inkubiert, wobei sich eine Übernachtreaktion mit den entsprechenden Antikörpern anschloss: DARPP-32 (1:20.000), ChAT (1:50), IL-6 (1:200), GFAP (1:400), verdünnt in PBS/1 % NGS-Lösung. Nach 3 Waschschritten wurden die Abschnitte mit den entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörpern (Vector, 1:200) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und gebundene Antikörper wurden durch das ABC-System (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, West Grove, USA) mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB Metal Concentrate, Pierce, Rockford, IL, USA) als Chromogen sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden durch zweimaliges Passieren durch Ethanol und Toluol dehydriert und mit Merckoglas^®-Deckgläsern abgedeckt.
Bildanalyse
Die QA-Läsionen wurden durch Digitalisierung zwischen 9 und 12 DARPP-32-gefärbten Schnitten pro Tier (200 μm zwischen jedem Schnitt) mit einem Objektträgerscanner und durch Quantifizierung der optischen Dichte mit einem lizenzfreien Programm zur Bildanalyse (NIH-Image, Version 1.6.1, National Institutes of Health, USA) analysiert. Es wurden Schnitte über das vollständige Striatum analysiert. Die Daten sind ausgedrückt als das Verhältnis der bewerteten optischen Dichte von DARPP-32 (Stellen mit Läsion gegenüber Stellen ohne Läsion). Die optische Dichte stellt den durchschnittlichen Grauwert innerhalb des Schnitts dar, entsprechend der Summe aller Grauwerte aller Pixel im Abschnitt dividiert durch die Anzahl der Pixel. Der Corpus callosum und die Commissura anterior wurden verwendet, um den striatalen Bereich abzugrenzen. Ventrikuläre und striatale Volumen wurden bezüglich DARPP-32-gefärbter Schnitte ebenfalls über das gesamte Striatum unter Verwendung des NIH-Bildanalyseprogramms bestimmt und sind als Prozentangabe der Stelle ohne Läsion ausgedrückt. Die Zahl ChAT- und NADPH-d-gefärbter Neuronen wurde zwischen 9 und 12 Schnitten pro Tier (200 μm zwischen jedem Schnitt) über das gesamte Striatum hinweg ausgezählt und wird als Prozentangabe hinsichtlich Neuronen an der Stelle ohne Läsion ausgedrückt.
Datenanalyse
Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und zur Varianzanalyse (ANOVA) ausgewertet, wobei sich ein Scheffes PLSD post hoc-Test anschloss (JMP 3.0, SAS Institute Inc., USA). Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 gesetzt.
Beispiel 1: Expression von IL-6 und der IL-6R/IL-6-Chimäre in vitro
Um die Expression eines Kontrollgens (LacZ), von IL-6 bzw. der IL-6R/IL-6-Chimäre in einem herkömmlichen transienten Transfektionssystem gegenüber einem lentiviralen Expressionssystem zu vergleichen, wurde die humane embryonale Nierenzelllinie 293T entweder mit einem der Plasmide SIN-W-PGK-nis-LacZ, SIN-W-PGK-IL-6 oder SIN-W-PGK-IL-6R/IL-6-Chimärenplasmid oder mit lentiviralen Vektoren, welche entweder LacZ oder IL-6 oder IL-6R/IL-6-Chimäre enthielten, transfiziert.
An Tag 4 wurden IL-6 und IL-6R/IL-6-Chimäre in den Zellüberständen durch ELISA gemessen.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. IL-6 und IL-6R/IL-6-Chimäre können durch Transfektion (2A) und Infektion (2B) exprimiert werden. Transfektion mit einem Expressionsplasmid führte zu einer Expressionsrate, welche etwa dreimal höher war als bei Infektion mit einem lentiviralen Vektor. IL-6 wurde sowohl bei Transfektion als auch bei Infektion mit einer höheren Rate exprimiert, obwohl die Chimäre auch mit hohen Expressionsraten von etwa i μg/10⁶ Zellen/24 Stunden durch Transfektion und etwa 1 μg/10⁶ Zellen/24 Stunden durch Infektion exprimiert wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass beide oben dargelegten Gentransferverfahren zur Expression der IL-6R/IL-6-Chimäre geeignet sind. Sowohl rekombinante Zellen als auch lentivirale Vektoren können deshalb zur Abgabe des Proteins in den humanen Körper verwendet werden, insbesondere in das Gehirn, um seine Wirkung bei der Behandlung und/oder Prävention von HD auszuüben.
Beispiel 2: Lentivirale Vektoren, welche das IL-6 und das IL-6R/IL-6 exprimieren
Die in vivo-Erzeugung von IL-6 (n = 5) und IL-6R/IL-6 (n = 5) wurde mit Wistar Ratten gemessen, welchen 2 μl der entsprechenden lentiviralen Vektoren injiziert worden waren. Drei Wochen später wurden die Tiere geopfert und eine 2 mm lange Stanze, welche die Injektionsstelle abdeckte, wurde ausgeschnitten. Das Gewebe wurde homogenisiert und durch ELISA-Assay bezüglich IL-6 und IL-6R/IL-6 analysiert. In den injizierten Hemisphären wurden 11,9 ± 7 ng IL-6 und 2,4 ± 0,9 ng IL-6R/IL-6 detektiert, wobei in den nicht-injizierten Hemisphären die Werte unterhalb des Hintergrundniveaus lagen. Immunohistochemische Analyse von striatalen Abschnitten zeigte, dass beide Proteine, sowohl IL-6 als auch IL-6R/IL-6-Chimäre in einem großen Abschnitt des Striatums exprimiert worden waren (nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit vorausgehenden Beschreibungen stieg die Zahl von GFAP-positiven Astrocyten in den Tieren, welche mit IL-6 und IL-6R/IL-6 injiziert worden waren, im Vergleich zu den LacZ- und PBS-Gruppen (nicht gezeigt).
Beispiel 3: IL-6R/IL-6-Chimäre reduziert das Ausmaß an Apomorphin-induzierter Rotation in Mäusen
QA ist ein Exzitotoxin, welches eine charakteristische Läsion von Neuronen zusammen mit einer substantiellen Atrophie des Striatums induziert. Intrastratiale Injektion von QA ahmt das Muster selektiver neuronaler Schadensanfälligkeit, wie es bei HD beobachtet wird, nach. QA-Läsionen führen ferner zu motorischen und kognitiven Defiziten, welche zu den Hauptsymptomen zählen, welche bei HD beobachtet werden. Deshalb sind intrastratiale Injektionen von QA ein nützliches Modell für HD geworden und können dazu dienen, neue therapeutische Strategien zu bewerten, welche auf ein Vorbeugen, Abmildern oder Umkehren neuroanatomischer Veränderungen und Verhaltensänderungen, welche im Zusammenhang mit HD stehen, abzielen.
Hier ist dieses Modell verwendet worden, um die Fähigkeit von IL-6 und IL-6R/IL-6-Chimäre zur Verbesserung der schädlichen Wirkungen, welche der Huntington-Erkrankung ähnlich sind, zu bewerten.
Zur Bewertung der neuroprotektiven Wirkung beider Proteine wurden 2 μl lentivirale Vektoren, welche das humane IL-6 (n = 6), die IL-6R/IL-6-Chimäre (n = 6) und das LacZ-Reportergen (n = 6) exprimieren, stereotaktisch in das rechte Striatum erwachsener Ratten injiziert. Drei Wochen später wurde den Tieren durch intrastratiale Injektion von 180 nmol QA eine Läsion beigebracht. Die linke Hemisphäre verblieb unbehandelt und diente als interne Kontrolle. Die Apomorphin-induzierte Rotationsasymmetrie wurde verwendet, um den Schaden des Striatums 5, 9 und 11 Tage nach QA-Verabreichung zu bewerten (Borlongan et al., 1995; Nakao & Brundin, 1997). Während IL-6- und LacZ-behandelte Tiere ein typisches Rotationsverhalten zeigten, wurde eine Verringerung der Asymmetrie in der IL-6R/IL-6-Gruppe beobachtet (3).
Während das Vorliegen von IL-6 die Anzahl der Umdrehungen erhöht, wodurch die Erkrankungssymptome verschlimmert werden, verringert das Vorliegen der IL-6R/IL-6-Chimäre signifikant die Anzahl an Umdrehungen, welche durch die Tiere gezeigt werden. Diese protektive Wirkung der IL-6R/IL-6-Chimäre liegt bereits 5 Tage nach QA-Läsion vor, ist aber 9 und insbesondere 11 Tage nach der Läsion sogar noch ausgeprägter.
Beispiel 4: Schutz vor QA-induziertem Schaden
Um zu untersuchen, ob die in hohem Maße günstige Wirkung von IL-6R/IL-6-Chimäre, welche in der oben beschriebenen Verhaltensstudie gezeigt wurde, mit einer neuroprotektiven Wirkung im Striatum korreliert, wurden histologische Studien durchgeführt.
Keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Volumens des Striatums oder des Ventrikels wurden in den ipsilateralen und kontralateralen Stellen der verschiedenen Gruppen beobachtet. Wie erwartet, verursachte die QA-Läsion ein Schrumpfen des Striatums (LacZ: 92,2 % ± 2,1; IL-6: 91,7 % ± 0,9; IL-6R/IL-6: 92,6 % ± 1,7) und eine Vergrößerung des Ventrikels (LacZ: 186,5 % ± 22,2; IL-6: 199,2 % ± 22,1; IL-6R/IL-6: 180,9 % ± 29,9) mit konservierten internen Kapselfaserbündeln. Die optische Dichte von DARPP-32-gefärbten Abschnitten, eines Markers für GABA-erge striatale Neuronen wurde anschließend verwendet, um das Ausmaß der Läsion des Striatums zu bestimmen. In LacZ-injizierten Tieren induzierte QA eine starke Abnahme an DARPP-32-Färbung im Striatum in allen Tieren. Photomikrographische Abbildungen, welche die Färbungen darstellen, sind nicht gezeigt. Eine Quantifizierung des Ausmaßes der Läsion auf Grundlage der optischen Dichte von DARPP-32-immunogefärbten Läsionen des Striatums ist in 4 gezeigt, ausgedrückt als Mittelwert ± SEM. Der Verlust an DARPP-32-Immunreaktivität war in den IL-6-behandelten Ratten abgeschwächt (LacZ: 84,3 ± 2,9 %; IL-6: 63,3 ± 3,6 %; p = 0,001), aber die neuroprotektive Wirkung war hauptsächlich auf den mittleren Bereich des Striatums in Nähe zum lateralen Ventrikel beschränkt. Im Gegensatz dazu war der Großteil des Striatums in der IL-6R/IL-6-Gruppe geschützt (38,6 ± 10 %; p = 0,001).
Beispiel 5: Schutz der cholinergen und NADPH-d-positiven Interneuronen
Um ferner die Wirkungen von IL-6 und IL-6R/IL-6 zu bewerten, wurden zwei Populationen an Interneuronen untersucht: Die großen dornenfreien (aspiny) cholinergen Neuronen (ChAT-positiv) und die GABA-ergen Interneuronen, welche die Nikotinamidadenindinukleotidphasphatdiaphorase (NADPH-d) exprimieren. In der LacZ-Kontrollgruppe betrug der Prozentanteil an ChAT und NADPH-d-Positivzellen in der Stelle mit QA-Läsion 16,6 ± 3,7 % im Vergleich zu 10,2 ± 1,5 in der Stelle ohne Läsion (5A und 5B). IL6 und IL-6R/IL-6 verhinderten signifikant die Degeneration von ChAT- und NADPH-d-immunreaktiven Neuronen im Vergleich zur Kontrollgruppe (IL-6 = 39,3 ± 6,5 %; IL-6R/IL-6 = 65,4 ± 8,5 %; p = 0,02 und p = 0,0005) (5A und 5B). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu DARPP-32-Neuronen war die Stärke der Wirkung mit der IL-6-Chimäre größer.
Schlussfolgerung
IL-6R/IL-6-Chimäre wies eine signifikant günstige Wirkung in einem wohl-etablierten Versuchsmodell zu HD auf, wobei dies die therapeutische Wirksamkeit der IL-6R/IL-6-Chimäre gegen die Verhaltensstörungen von Huntington-Erkrankung zeigt. Darüber hinaus zeigte IL-6R/IL-6 eine neuroprotektive Wirkung in denjenigen Abschnitten des Gehirns, die von HD betroffen waren.
Zusammenfassend zeigen die oben beschriebenen Ergebnisse deutlich die Wirksamkeit der IL-6R/IL-6-Chimäre bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von Huntington-Erkrankung. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine neue Möglichkeit zur Behandlung und/oder Vorbeugung von HD bereit, eine bis jetzt unheilbare Erkrankung des Gehirns.
Literaturstellen

Anderson KD, Panayotatos N, Corcoran TL, Lindsay RM, Wiegand SJ. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Jul 9; 93(14): 7346-51
Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403–410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25: 389–3402, 1997
Beal MF, Ferrante RJ, Swartz KJ, Kowall NW: J Neurosci. 1991 Jun; 11(6): 1649-59.
Bemelmans AP, Horellou P, Pradier L, Brunet I, Colin P, Mallet J Hum Gene Ther. 1999 Dec 10; 10(18): 2987-97.
Bensadoun JC, Deglon N, Tseng JL, Ridet JL, Zurn AD, Aebischer P Exp Neurol. 2000 Jul; 164(1): 15–24
Borlongan, C. V., Randall, T.S., Cahill, D.W., und Sanberg, P.R. (1995). Asymmetrical motor behavior in rats with unilateral striatal excitotoxic lesions as revealed by the elevated body swing test. Brain Res., 676, 231-4.
Breighton, B und Hayden, MR: S Afr Med J. 1981 Feb 21; 59(8): 250.
Chebath, J., Fischer, D., Kumar, A., Oh, J.W., Kollet, O., Lapidot, T., Fischer, M., Rose – John, S., Nagler, A., Slavin, S. und Revel, M. Eur. Cytokine Netw. 1997 8, 359–365.
Choi, DW: Neuron. 1988 Oct; 1(8): 623-34. Review.
Deglon N, Tseng JL, Bensadoun JC, Zum AD, Arsenijevic Y, Pereira de Almeida L, Zufferey R, Trono D, Aebischer P Hum Gene Ther. 2000 Jan 1; 11(1): 179-90.
Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387–395, 1984.
Ellison DW, Kowall NW, Martin JB J Comp Neurol. 1987 Jun 8; 260(2): 233-45
Emerich DF, Cain CK, Greco C, Saydoff JA, Hu ZY, Liu H, Lindner MD Cell Transplant. 1997 May – Jun; 6(3): 249-66.
Emerich, D.F., Lindner, M.D., Winn, S.R., Chen, E.-Y., Frydel, B.R., und Kordower, J.H. (1996). J. Neurosci., 16, 5168–5181.
Emerich DF, Winn SR, Hantraye PM, Peschanski M, Chen EY, Chu Y, McDermott P, Baetge EE, Kordower JH Nature. 1997 Mar 27; 386(6623): 395-9.
Emerich DF, Hammang JP, Baetge EE, Winn SR Exp Neurol. 1994 Nov; 130(1): 141-50.
Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brakenhoff JP, Kallen KJ, Wollmer A, Grotzinger J, Rose – John S. Nat Biotechnol. 1997 Feb; 15(2): 142-5.
Gadient, R.A. und Otten, U.H: Prog. Neurobiol. 1997, 52, 379–390.
Greenamyre JT, Penney JB, Young AB, D'Amato CJ, Hicks SP, Shoulson I: Science. 1985 Mar 22; 227(4693): 1496-9.
Haggiag S, Chebath J, Revel M FEBS Lett. 1999 Aug 27; 457(2): 200-4.
Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M und Chebath J. Eur. Cytokine Netw. 1995, 6: 135–143,
Hirano T, Matsuda T und Nakajima K: Stem cells 1994, 12: 262–277.
Hirota H, Kiyama H, Kishimoto T, Taga T J Exp Med. 1996 Jun 1; 183(6): 2627-34.
Hottinger, A.F., Azzouz, M., Déglon, N., Aebischer, P., und Zum, A.D. (2000). J. Neurosci.; 20, 5587-93.
Katz, A., Chebath, J., Friedman, J., und Revel, M. (1998). Increased sensitivity of IL-6- deficient mice to carbon tetrachloride hepatotoxicity and protection with an IL-6 receptor- IL-6 chimera. Cytokines Cell Mol. Ther., 4, 221-7.
Klimatcheva E, Rosenblatt JD, Planelles V Front Biosci. 1999 Jun 1; 4: D481-96. Review. Kordower JH, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Palfi S, Roitberg BZ, Emborg M, Hantraye P, Deglon N, Aebischer P Exp Neurol. 1999 Nov; 160(1): 1–16
Kordower JH, Chen EY, Winkler C, Fricker R, Charles V, Messing A, Mufson EJ, Wong SC, Rosenstein JM, Bjorklund A, Emerich DF, Hammang J, Carpenter MK J Comp Neurol. 1997 Oct 13; 387(1): 96–113.
Kremer B, Goldberg P, Andrew SE, Theilmann J, Telenius H, Zeisler J, Squitieri F, Lin B, Bassett A, Almqvist E, et al: N Engl J Med. 1994 May 19; 330(20): 1401-6.
Loeb JE, Cordier WS, Harris ME, Weitzman MD, Hope TJ Hum Gene Ther. 1999 Sep 20; 10(14): 2295-305.
Lin B, Nasir J, Kalchman MA, McDonald H, Zeisler J, Goldberg YP, Hayden MR Genomics. 1995 Feb 10; 25(3): 707-15.
Mendel, I., Katz, A., Kozak, N., Ben – Nun, A. und Revel, M. Eur. J. Immunol. 1998 28, 1727–1737.
Murakami M, Hibi M, Nakagawa N, Nakagawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T, Kishimoto T Science. 1993 Jun 18; 260(5115): 1808-10.
Naldini L, Blomer U, Gage FH, Trono D, Verma IM Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Oct 15; 93(21): 11382-8.
Novick, D., Shulman, L.M., Chen, L. und Revel, M. Cytokine 1992 4, 6–11.
Novick D, Shulman LM, Chen L und Revel M. Cytokine 1992; 4: 6–11.
Novick D. Engelmann H. Wallach D. Leitner O. Revel M. Rubinstein M. Journal of Chromatography 1990. 510: 331-7.
Paonessa G, Graziani R, Deserio A, Savino R, Ciapponi L, Lahmm A, Salvati AL, Toniatti C und Ciliberto G. EMBO J. 1995: 14: 1942–1951.
Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63–99, 1990
Pearson W R und Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444–2448, 1988
Roberts RC, Ahn A, Swartz KJ, Beal MF, DiFiglia M Exp Neurol. 1993 Dec; 124(2): 274-82
Smith und Waterman J Mol Biol, 147, 195–197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482–489, 1981.
Strong TV, Tagle DA, Valdes JM, Elmer LW, Boehm K, Swaroop M, Kaatz KW, Collins FS, Albin RL Nat Genet. 1993 Nov; 5(3): 259-65.
Taga, T., Hibin M., Hirata, Y., Yamasaki, K., Yasukawa, K., Matsuda, T., Hirano, T. und Kishimoto, T. Cell 1989 58, 573–581.
Toulmond, S., Vige, X., Fage, D., und Benavides, J. Neurosci Lett 1992, 144, 49–52.
Ward LD, Howlett GJ, Discolo G, Yasukawa K, Hammacher A, Moritz RL und Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp130. J. Biol. Chem. 1994, 269: 23286–23289.
Yamada, M., und Hatanaka, H.: Brain Res 1994, 643, 173-80.
Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ J Virol. 1999 Apr; 73(4): 2886-92.

Claims

Verwendung einer IL-6R/IL-6 Chimäre, eines Muteins, einer Isoform, eines fusionierten Proteins, eines funktionellen Derivats, einer aktiven Fraktion oder eines zirkulär permutierten Derivats oder eines Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Huntington-Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die IL-6R/IL-6 Chimäre an einer oder mehreren Stellen glykosyiliert ist
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die IL-6R/IL-6 Chimäre nicht glykosyliert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das fusionierte Protein eine Immunglobulin (Ig)-Fusion umfasst.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das funktionelle Derivat wenigstens einen Rest umfasst, der an einer oder mehreren funktionellen Gruppen angebracht ist, die an einer oder mehreren Seitenketten an den Aminosäureresten vorliegt/vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Rest ein Polyethylenrest ist.
Verwendung einer Zelle, die eine IL-6R/IL-6 Chimäre, ein Mutein, eine Isoform, ein fusioniertes Protein, eine aktive Fraktion oder ein zirkulär permutiertes Derivat davon exprimiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Huntington-Erkrankung.
Verwendung eines Expressionsvektors umfassend die kodierende Sequenz einer IL-6R/IL-6 Chimäre, eins Muteins, einer Isoform, eines fusionierten Proteins, einer aktiven Fraktion oder eines zirkulären permutierten Derivats davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Huntington-Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein lentiviraler Vektor ist.