KR20050035151A - 당뇨성 신경병증에서 ｇｐ130 활성인자의 용도 - Google Patents

당뇨성 신경병증에서 ｇｐ130 활성인자의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 gp130을 통하여 신호하는 물질의 용도에 관한다. IL-6의 사용이 바람직하다.

Description

당뇨성 신경병증에서 ｇｐ130 활성인자의 용도{USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY}
본 발명은 당뇨병과 말초 신경계 질환에 관한다. 특히, 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 gp130을 통하여 신호하는 물질의 용도에 관한다. IL-6, 또는 IL-6R/IL-6 키메라가 이런 근치적 치료에 적합하다.
당뇨병은 탄수화물 대사 장애, 다시 말하면 인슐린 분비 및/또는 인슐린 작용에서 완전한 또는 상대적 손상에 기인한 고혈당증으로 특성화되는 증후군이다.
당뇨병의 분류는 National Diabetes Data Group과 WHO에 의해 채택된 분류에 기초한다. 이전에, 당뇨병의 분류는 발병 연령, 지속 기간, 합병증에 기초하였다. 임신성 당뇨병은 현재의 임신동안 발병하거나 처음 인식되는 다양한 심각도의 당질 불내성(carbohydrate intolerance)이다. 인슐린-의존성 DM(IDDM) 또는 소아발병형 당뇨병으로 알려져 있는 I형 당뇨병(DM)을 앓는 환자는 당뇨병성 케톤산증(diabetic ketoacidosis)(DKA)이 발생할 수 있다. 비-인슐린-의존성 DM(NIDDM)으로 알려져 있는 Ⅱ형 DM을 앓는 환자는 비케톤성 고삼투압 혼수(NKHHC)가 발생할 수 있다. 공통적인 만기 미세혈관 합병증에는 망막병증, 신증(nephropathy), 말초와 자율 신경병증 등이 포함된다.
I형 당뇨병: I형 당뇨병은 모든 연령에서 발생할 수 있지만, 어린이와 청년에서 주로 발병하고 30세 이전에 진단되는 DM의 우세 유형이다. 이런 유형의 당뇨는 전체 DM 환자의 10 내지 15%를 차지하고 임상적으로 고혈당증 및 당뇨성 케톤산증으로의 성향에 의해 특성화된다. 췌장이 인슐린을 거의(또는 전혀) 생산하지 못한다.
I형 DM 환자의 대략 80%는 탐지가능한 혈청 도세포(islet cell) 세포질 항체 및 도세포 표면 항체(글루탐산 디카르복실라제와 인슐린에 대한 항체는 유사한 비율로 발견된다)와 연관된 특이적인 HLA 표현형을 보유한다.
이들 환자에서, I형 DM은 > 90% 인슐린-분비 세포의 유전적으로 취약하고 면역-매개된 선택적 파괴에 기인한다. 이들의 췌장 도세포는 인슐린염(insulitis)을 보이는데, 이는 대식세포와 B 림프구를 동반하는 T 림프구의 침윤 및 글루카곤-분비 알파-세포의 관여없이 대부분 베타-세포의 상실로 특성화된다. 일반적으로, 진단 시점에 존재하는 항체는 수년후에는 탐지되지 않는다. 기본적으로, 이들이 베타-세포 파괴에 대한 반응이긴 하지만, 일부는 베타-세포에 세포독성을 나타내고 이들의 상실에 기여한다. 일부 환자에서 I형 DM의 임상적 발병은 기초적인 자가면역 과정의 잠해성 발병후 수년내에 진행된다. 이들 항체에 대한 스크리닝은 현재 진행되고 있는 많은 예방 연구에 포함된다.
Ⅱ형 당뇨병: Ⅱ DM은 30세 초과의 환자에서 주로 진단되는 당뇨병이지만, 어린이와 청년에게도 발병한다. 이는 임상적으로 과혈당증 및 인슐린 저항성으로 특성화된다. 당뇨병성 케톤산증은 드물다. 대부분의 환자가 식이, 훈련, 경구 약물로 치료되지만, 일부 환자는 증상성 과혈당증을 조절하고 비케톤성 고삼투압 혼수를 예방하기 위하여 인슐린을 간헐적으로/지속적으로 필요로 한다. 일란성 쌍둥이(monozygotic twins)에서 Ⅱ형 DM의 일치율(concordance rate)은 > 90%이다. 일반적으로, Ⅱ형 DM은 특히 상체(내장/복부)의 비만과 연관하고 일정 기간의 체중 증가이후에 나타난다. 노화와 연관된 당내인성 장애(impaired glucose tolerance)는 전형적인 체중 증가와 밀접하게 상관한다. 내장/복부 비만을 가진 Ⅱ형 DM 환자는 체중 감소후 정상적인 글루코오스 수준으로 회복될 수 있다.
Ⅱ형 DM은 과혈당증이 글루코오스에 대한 손상된 인슐린 분비 반응 및 골격근에 의한 글루코오스 흡수를 촉진하고 간 글루코오스 생산을 억제하는 인슐린 효력의 감소(인슐린 저항성) 모두에 기인하는 이질성 질환군이다. 하지만, 인슐린 저항성은 공통하고, 대부분의 인슐린 저항성 환자는 당뇨가 발병하지 않는데, 그 이유는 신체가 인슐린 분비를 적절히 증가시켜 보상하기 때문이다. 일반적인 다양한 Ⅱ형 DM에서 인슐린 저항성은 인슐린 수용체 또는 글루코오스 수송체에서 유전자 변형에 기인하지 않는다. 하지만, 유전적으로 결정된 포스트-수용체 세포내 결함이 일정한 역할을 할 것으로 생각된다. 결과의 고인슐린혈증은 다른 일반 질환, 예를 들면 비만(복부), 고혈압, 고지혈증, 관상동맥 질환(인슐린 저항성 증후군)을 유발할 수 있다.
유전 인자가 Ⅱ형 DM의 발생에 주요 결정인자이긴 하지만, Ⅱ형 DM 및 특이적인 HLA 표현형 또는 도세포 세포질 항체 사이에 어떤 연관도 확인되지 않았다. 예외는 HLA 표현형중 한가지를 보유하고 궁극적으로 I형 DMA이 발병하는 탐지가능한 도세포 세포질 항체를 보유하는 비-비만성 성인이다.
당뇨가 발병하기 이전에, 환자는 글루코오스에 대한 조기 인슐린 분비 반응을 상실하고 상대적으로 많은 함량의 프로인슐린을 분비한다. 확립된 당뇨의 경우에, Ⅱ형 DM 환자에서 공복시 혈장 인슐린 수준이 정상이거나 심지어 증가하긴 하지만, 글루코오스-자극된 인슐린 분비는 분명하게 감소한다. 감소된 인슐린 수준은 인슐린-매개된 글루코오스 흡수를 감소시키고 간 글루코오스 생산을 억제하지 못한다.
고혈당증은 당뇨 환자(글루코오스 독성)에서 당내인성 장애의 결과일 뿐만 아니라 원인이기도 한데, 그 이유는 고혈당증이 인슐린 감도를 감소시키고 간 글루코오스 생산을 증가시키기 때문이다. 환자의 대사 조절이 개선되면, 인슐린 또는 고혈당강화 약물 용량은 일반적으로 줄어든다.
Ⅱ형 DM의 일부 사례는 상염색체 우성 유전(autosomal dominant inheritance)으로 젊은 비-비만성 청소년에서 발생한다(장기 발현형 당뇨병)[MODY]. MODY를 갖는 가계는 글루코키나제(glucokinase) 유전자에 돌연변이를 보유한다. 이들 환자에서 인슐린 분비와 간 글루코오스 조절에서 손상이 확인되었다.
인슐린병리는 Ⅱ형 DM의 임상적 특징을 갖는 드물게 나타나는 DM 사례이고 결함 유전자의 이형접합성 유전에 기인하며 인슐린 수용체에 정상적으로 결합하지 않는 인슐린의 분비를 유발한다. 이들 환자는 외생 인슐린에 정상적인 혈장 글루코오스 반응과 연관된 현저하게 상승된 혈장 면역반응 인슐린 수준을 보유한다.
당뇨병은 췌장 질환에 기인할 수도 있다: 만성 췌장염, 특히 알코올성 만성 췌장염은 당뇨병과 빈번하게 연관한다. 이런 환자는 인슐린-분비와 글루카곤-분비 도세포를 모두 상실하게 된다. 따라서, 이들은 약간 고혈당이고 저용량의 인슐린에 민감하다. 효과적인 역조절(글루카곤에 의해 거부되지 않는 외생 인슐린)의 부재를 고려하면, 이들은 저혈당증의 급속한 발병으로 종종 고생한다. 아시아, 아프리카, 카리브 해에서, DM은 심한 단백질 결핍과 췌장 질환이 있는 나이어린 심한 영양실조 환자에서 일반적으로 관찰된다. 이들 환자는 당뇨성 케톤산증의 성향은 없지만 인슐린을 필요로 할 수 있다.
당뇨병의 진단: 무증상 환자에서, DM은 공복시 과혈당증의 진단 기준이 충족될 때 확립된다: 성인이나 어린이에서 2가지 경우에 하룻밤 단식이후 >= 140 ㎎/㎗( >= 7.77 mmol/ℓ)의 혈장(또는 혈청) 글루코오스 수준.
경구 내당능 검사(oral glucose tolerance test)는 공복시 글루코오스가 115 내지 140 ㎎/㎗(6.38 내지 7.77 mmol/ℓ)인 Ⅱ형 환자 및 진단되지 않은 DM과 관련되는 임상적 이상(예, 다중신경병증, 망막병증)을 보이는 환자를 진단하는데 도움이 된다.
당뇨병의 치료: 과혈당증은 당뇨병의 장기 미세혈관 합병증의 주요 원인이다. HbA1C 수준과 합병증의 진행 속도 사이에 선형 관계가 입증되었다. 다른 연구에서는 < 8% HbA1C가 역치이며, 역치이하에서 대부분의 합병증이 예방될 수 있다고 제안하였다. 따라서, I형 DM에 대한 요법은 저혈당 증상 발현을 피하면서 HbA1C를 낮추는 대사 조절을 강화시켜야 한다. 하지만, 치료는 저혈당증 위험이 과도하거나(예, 기대 수명이 짧은 환자와 심혈관이나 심장 질환이 있는 환자) 환자의 저혈당증 위험이 증가하면(예, 믿을 수 없거나 자율신경병증이 있는 환자) 치료를 개인에 맞춤하고 수정해야 한다.
Ⅱ형 DM를 앓는 과체중 환자에서는 체중 감소를 달성하는 식이가 가장 중요하다. 고혈당증이 식이에 의해 개선되지 않으면, 경구 약물을 시작한다.
환자는 발과 다리에서 촉각, 맥박, 감각의 검사 및 소변 알부민 검사를 비롯하여, 합병증의 증상이나 징후를 정기적으로 평가받아야 한다. 주기적인 검사실 평가에는 지질 프로필, BUN(혈중 요소 질소), 혈청 크레아티닌 수준, ECG, 연례 종합 안구 검사 등이 포함된다.
고콜레스테롤혈증 또는 고혈압은 특정 만기 합병증의 위험을 증가시키고 특별한 관심과 적절한 치료를 요한다. 베타-아드레날린 수용체 차단제 β-차단제, 예를 들면 프로프라놀롤이 대부분의 당뇨병에서 안전하게 사용될 수 있지만, 이들은 인슐린-유도된 저혈당증의 β-아드레날린 증상을 감추고 정상적인 역조절 반응을 손상시킬 수 있다. 따라서, ACE 저해물질과 칼슘 길항제가 종종 약물로 선택된다.
모든 환자는 혈장 글루코오스 모니터링을 실시해야 하고, 따라서 인슐린 치료를 받는 환자는 인슐린 용량을 적절히 조정하는 방법을 익혀야 한다. 글루코오스 수준은 손끝 혈액 한방울을 이용하여 간편하게 사용가능한 가정용 분석기로 검사할 수 있다. 스프링-추진된 랜싯이 손끝 혈액 시료를 얻는데 권장된다. 검사 빈도는 개별적으로 결정한다. 이상적으로, 인슐린 치료를 받는 당뇨병 환자는 식사전, 식사 1시간 내지 2시간후, 취침 시점에 매일 혈장 글루코오스 검사한다.
대부분의 의사는 당화된 헤모글로빈(HBA1C)을 주기적으로 측정하여 이전 1 내지 3개월동안 혈장 글루코오스 조절 평가한다. HBA1C는 혈장 글루코오스에 의한 비-효소적 당화의 안정적인 산물이며, 혈장 글루코오스 수준이 증가함에 따라 증가한다. 대부분의 검사실에서, 정상적인 HBA1C 수준은 대략 6%이다; 불량하게 조절된 당뇨병에서, 상기 수준은 9 내지 12%이다. HBA1C는 당뇨병을 진단하는 특이적인 검사 수단은 아니다; 하지만, 상승된 HBA1C는 현재하는 당뇨병을 종종 지시한다.
다른 검사에서는 프럭토스아민(fructosamine) 수준을 측정한다. 프럭토스아민은 글루코오스와 혈장 단백질의 화학적 반응으로 형성되고 이전 1 내지 3주동안 글루코오스 조절을 반영한다. 따라서, 이런 분석법은 조절 이전 HBA1C에서 변화를 보이고, 집중적인 치료가 진행되는 경우 또는 단기 임상 시험에 도움이 된다.
인슐린 치료와 관련하여, 사람 인슐린이 인슐린 치료에 선호되는데, 그 이유는 동물-유래된 종류보다 항원성이 덜하기 때문이다. 하지만, 사람 인슐린 제제를 복용하는 환자를 비롯한 대부분의 인슐린 치료를 받는 환자에서 매우 낮지만 탐지가능한 인슐린 항체가 발생한다.
일반적으로, 인슐린은 100 U/㎖을 함유하는 제제(U-100 인슐린)로 제공되고 1회용 인슐린 주사기로 피하 주사된다. <= 50 U 용량을 주사하는 환자에는 1/2-㎖ 주사기가 선호되는데, 그 이유는 이들이 좀더 용이하게 확인될 수 있고 좀더 적은 용량의 정확한 측정을 가능하게 하기 때문이다. 인슐린 펜이라고 하는 다회용 인슐린 주사 장치(NovolinPen)는 수일의 용량을 함유하는 카트리지를 이용하도록 설계된다. 인슐린은 냉각하지만 동결시키지는 않는다; 하지만, 대부분의 인슐린 제제는 수개월동안 실온에서 안정하기 때문에, 작업시 또는 이동시에 사용할 수 있다.
당뇨병은 다른 엔도크린 질환과 연관할 수 있다. Ⅱ형 DM은 쿠싱 증후군, 갈색세포종, 글루카곤증, 원발성 알도스테론증, 성장호르몬종에 종속한다. 이들 질환의 대부분은 말초 또는 간 인슐린 저항성과 연관한다. 대부분의 환자는 인슐린 분비가 감소하면서 당뇨병이 발병한다. I형 DM의 이환율은 특정 자가면역 엔도크린 질환, 예를 들면 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 특발성 아딘슨병 환자에서 증가한다.
당뇨병은 베타-세포 독소에 의해 유도될 수도 있다. 가령, 스트렙토조토신은 쥐에서 실험적 당뇨병을 유도할 수 있지만 사람에서 당뇨병을 유발하는 경우는 드물다.
당뇨병의 만기 합병증은 수년간의 조절되지 않은 과혈당증이후에 발생한다. 글루코오스 수준은 인슐린-매개된 글루코오스 흡수가 진행되는 세포(주로, 근육)를 제외하고 모든 세포에서 증가하는데, 이는 합병증에 기인하는 당화 및 다른 대사 경로 활성의 증가를 유발한다. 대부분의 미세혈관 합병증은 엄격한 혈당 조절로, 다시 말하면 정상에 가까운 당화된 헤모글로빈(HbA1C)으로 반영되는 정상에 가까운 공복과 식후 글루코오스 수준을 달성함으로써 지연, 예방 또는 반전될 수 있다. 거대혈관 질환, 예를 들면 죽상경화증은 증상성 관상동맥 질환, 파행, 피부 손상, 감염을 유발할 수 있다. 고혈당증이 죽상경화증을 가속화시키긴 하지만, 당뇨병(인슐린 저항성) 발병을 선행하는 수년간의 고인슐린혈증이 중요한 시초 역할을 수행할 수 있다. 심한 말초 혈관 질환, 간헐성 파행, 괴저로 인한 하지의 절단은 공통적이다. 당뇨배경성 망막병증(검안 검사 또는 망막 사진에서 관찰되는 초기 망막 변화)은 시력을 현저하게 변화시키진 않지만, 실명을 초래할 수 있는 황반 부종, 또는 망막박리 또는 출혈이 나타나는 증식성 망막병리로 진행될 수 있다. 모든 당뇨병의 대략 85%에서 일정 수준의 망막병증이 발병한다. 당뇨성 신경병증은 최종 신 질환이 나타날 때까지 일반적으로 무증상이지만, 신증후군(nephrotic syndrome)을 유발할 수 있다.
당뇨성 신경병증은 주로 당뇨병의 합병증이지만, 다른 질환에서도 공통한다.
다발성 단일신경병증은 일반적으로, 콜라겐 혈관 질환(예, 다발성 동맥염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 쉐그렌 증후군, 류머티스 관절염(RA)), 유육종증, 대사 질환(예, 당뇨병, 아밀로이드증) 또는 감염성 질환(예, 라임병, HIV 감염)에 종속한다. 미생물이 신경에 직접 침입하여 다발성 단일신경병증을 유발할 수도 있다(예, 나병).
급성 열병성 질환에 의한 다중신경병증은 독소(예, 디프테리아) 또는 자가면역반응(예, 귈레인-바르 중후군)에 기인할 수 있다; 종종 예방접종이후에 발생하는 다중신경병증 역시 자가면역이다.
독성 약물은 주로 다중신경병증을 유발하지만 가끔 단일신경병증을 유발하기도 한다. 여기에는 이메틴, 헥소바비탈, 바비탈, 클로로부탄올, 설폰아마이드, 페니토인, 니트로푸란토인, 빈카 알칼로이드, 중금속, 일산화탄소, 트리오르토크레실 포스페이트, 오르토디니트로페놀, 여러 용매, 다른 공업용 독물, 특정 AIDS 약물(예, 잘시타빈, 디다노신) 등이 포함된다.
영양 결핍과 대사 질환이 다중신경병증을 유발할 수 있다. 비타민 B 결핍이 주 원인이다(예, 알코올중독, 각기병, 악성 빈혈, 이소니아지드-유도된 피리독신 결핍, 흡수불량 증후군, 임신오조). 다중신경병증은 또한, 갑상선기능저하증, 포르피린증, 유육종증, 아밀로이드증, 요독증에서 발생한다.
악성 종양은 단클론 감마병증(다발성 골수종, 림프종), 아밀로이드 침입 또는 영양 결핍을 통하여, 또는 부종양성 증후군으로 다중신경병증을 유발할 수 있다.
당뇨성 질환, 예를 들면 당뇨병 또는 신부전에 의한 다중신경병증은 수개월 또는 수년동안 서서히 진행된다. 이는 하지에서 감각 비정상으로 시작되는데, 근부보다 원부에서 좀더 심하게 나타난다. 말초 자통, 마비, 작열통, 또는 관절 고유 감각과 진동 감각에서 결핍이 빈번하게 나타난다. 통증은 야간에 더욱 심하고 병든 부위를 만지거나 온도 변화에 의해 악화될 수 있다. 심각한 경우에, 전형적으로 stocking-and-glove 분포로 인하여 감각 상실의 객관적인 징후가 나타난다. 아킬레스와 다른 심부 슬개건 반사가 감소하거나 부재한다. 손가락에서 통증없는 궤양 또는 신경병증성 관절 질환은 감각 손상이 심각한 경우에 발생한다. 감각이나 고유수용감각 결함은 보행비정상을 유발할 수 있다. 운동 관여(motor involvement)는 원부 근육 약화와 위축을 유발한다. 자율신경계가 부가적으로 또는 선택적으로 관여하여 야행성 설사, 대소변 실금, 성적 불능 또는 체위성 저혈압을 유발할 수 있다. 혈관운동 장애는 다양하다. 피부는 때때로 거무스름한 변색으로 정상보다 창백하고 건조하다; 발한이 과도하다. 영양 변화(부드럽고 윤기있는 피부, 얽힌 자국이 있거나 융기된 손톱, 골다공증)는 중증의 장기 환자에서 일반적이다.
전신 질환(예, 당뇨병, 신부전, 다발성 골수종, 종양)의 치료는 진행을 중단시키고 증상을 개선할 수 있긴 하지만, 회복이 완만하다. 표착성 신경병증은 코르티코스테로이드 주사 또는 외과적 감압술을 요구할 수 있다. 물리 치료 또는 부목은 구축(contracture)의 가능성 또는 심각도를 감소시킨다.
당뇨병은 감각운동 원부 다중신경병증(가장 일반적), 다발성 단일신경병증, 국소성 단일신경병증(예, 동안 신경이나 외전 뇌 신경에서)을 유발할 수 있다. 다중신경병증은 감각 결함을 유발하는 원부의 대칭성 감각 다중신경병증으로 주로 발생하는데, 이는 일반적으로 stocking-glove 분포로 특성화된다.
일반적으로, 말초 신경병증은 감각 상실, 근육 약화와 위축, 감소된 심부 슬개골 반사, 혈관운동장애의 단독이나 조합된 증상으로 정의된다. 질환은 단일 신경(단일신경병증), 독립된 부위에서 2개 이상의 신경(다발성 단일신경병증), 또는 여러 신경에 동시에(다중신경병증) 영향을 줄 수 있다. 축색 돌기(예, 당뇨병, 라임병 또는 요독증, 또는 독성 약물에 의해); 또는 수초 또는 슈반 세포(예, 급성이나 만성 염증성 다중신경병증, 백질이영양증 또는 귈레인-바레 증후군)가 일차적으로 영향을 받는다. 소형 비수초화 섬유와 수초 섬유에 손상은 주로 온도와 통증 감각에 상실을 유발한다; 대형 수초 섬유에 손상은 운동과 고유수용감각 결함을 유발한다. 일부 신경병증(예, 납 독성, 담손 사용, 진드기에 물림, 포르피린증 또는 귈레인-바레 증후군)은 일차적으로 운동 신경에 영향을 준다; 다른 신경병증(예, 암의 뒤뿌리 신경절 염, 나병, AIDS, 당뇨병, 또는 만성 피리독신 중독)은 일차적으로 뒤뿌리 신경절이나 감각 섬유에 영향을 주고, 감각 장애를 유발한다. 가끔, 뇌 신경 역시 관여한다(예, 귈레인-바레 증후군, 라임병, 당뇨병, 디프테리아).
외상은 단일 신경에 대한 국소적 손상의 가장 일반적인 원인이다. 무리한 근육 활동 또는 관절의 강제적인 과대확장은 반복된 작은 외상(예, 작은 도구를 꽉 움켜짐, 공기 해머로부터 과도한 진동)에서처럼 국소성 신경병증을 유발할 수 있다. 압력이나 속박 마비는 일반적으로 골 융기부(예, 야위거나 악액질성 개체 및 알코올중독 환자에서 깊은 잠이나 마취동안)에서 또는 근관(예, 팔목 터널 증후군)에서 표재 신경(척골, 요골, 비골)에 영향을 준다. 압력 마비는 종양, 골화 과잉증, 석고, 목발, 또는 장기간 경직된 자세(예, 원예)에 기인할 수도 있다. 신경으로 출혈 및 냉기 또는 방사선에 노출 역시 신경병증을 유발할 수 있다. 단일신경병증은 직접적인 종양 침입으로부터 발생할 수도 있다.
당뇨성 다중신경병증은 마비, 자통, 사지에서 감각 이상을 유발할 수 있고, 빈도가 덜하긴 하지만 심신을 약화시키는 중증의 심재성 통증과 지각과민을 유발할 수 있다. 발목 반사는 일반적으로 감소하거나 부재한다. 다중신경병증의 다른 원인은 배제한다. 3번, 4번 또는 6번 뇌신경 및 다른 신경, 예를 들면 대퇴부에 영향을 주는 급성의 고통스런 단일신경병증은 수주 내지 수개월에 걸쳐 자발적으로 개선되고 노인성 당뇨병에서 좀더 빈번하게 발생하며 신경 경색에 기인한다. 자율신경병증은 다중신경병증을 보이는 당뇨병 환자에서 주로 발생하고 체위성 저혈압, 병적 발한, 남성에서 성적 불능과 역행성 사정, 손상된 방광 기능, 지연된 위 배출(때때로 덤핑 증후군과 함께), 식도 기능장애, 변비나 설사, 야행성 설사를 유발할 수 있다. 발사바 메뉴바(Valsalva maneuver)에 대한 맥박 반응의 증가 또는 깊은 숨쉬기동안 변하지 않는 맥박 변화는 당뇨병에서 자율신경병증의 증거이다.
당뇨성 다중신경병증은 당뇨병에서 사망의 중요한 원인인 족부 궤양과 관절 문제의 주원인이다. 당뇨성 다중신경병증에서, 감각 탈신경은 맞지 않는 신발 또는 자갈과 같은 일반적인 원인으로 인한 외상의 인지를 손상시킨다. 고유감각(proprioception)에서 변화는 비정상적 패턴의 체중 증가 및 때때로 신경병증성 관절 질환을 발생시킨다.
감염된 족부 궤양 환자는 신경병증으로 인하여 통증을 느끼지 못하고 전신 증상이 없기 때문에, 만기 때까지 이를 방치하게 된다. 심부 궤양, 특히 임의의 탐지가능한 붕소염과 연관된 궤양은 즉각적인 입원을 요하는데, 그 이유는 독성과 영구적인 장애가 발생할 수 있기 때문이다. 조기 외과적 표면 절제가 필수적이고, 때때로 절단이 필요하다.
인터루킨-6(IL-6)은 여러 상이한 세포형으로부터 생산되고 분비되는 다중기능성 사이토킨이다. 이런 다능성 사이토킨은 면역반응, 급성 상 반응, 조혈을 비롯한 세포 방어 기전에 중심적인 역할을 수행한다. IL-6은 이미 클론된 185개 아미노산을 보유하는 20 내지 26 kDa 당단백질이다(May et al, (1986); Zilberstein et al, (1986); Hirano et al, (1986))). IL-6은 이전에 B 세포 자극 인자 2 (BSF-2), 인터페론-베타 2, 간세포 자극 인자로 지칭되었다. IL-6은 간, 비장, 골수를 비롯한 다양한 조직 및 단해구, 섬유아세포, 내피세포, B-세포, T-세포를 비롯한 다양한 세포형에 의해 분비된다. IL-6은 바이러스, 이중 가닥 RNA, 박테리아, 박테리아 리포폴리사카라이드, 염증성 사이토킨(예, IL-1과 TNF)을 비롯한 다양한 신호에 의하여 전사 수준에서 활성화된다.
IL-6은 사람 염증성 CNS 질환의 병인에 관여한다. IL-6의 증가된 혈장과 뇌척수액 수준이 다발성 경화증 환자에서 입증되었다(Frei et al., (1991)).
중추신경계와 말초신경계 세포에 대한 IL-6 효과와 관련된 최근의 실험에서는 IL-6이 신경세포에 보호 효과를 나타내고 염증성 신경퇴행 과정에 상당한 영향을 준다는 것을 시사한다(Gadient and Otten, 1997, Mendel et al, 1998). IL-6은 해마(Yamada et al., 1994) 및 신조 뉴런(Toulmond et al., 1992)에서 글루타메이트-유도된 세포 사멸을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 높은 수준의 사람 IL-6과 사람 가용성 IL-6R(slL-6-R)을 발현하는 유전자도입 생쥐에서 설하 신경의 손상이후, 뇌에서 설하 핵의 역행 라벨링으로 확인되는 가속화된 신경 재생이 관찰되었다(Hirota et al, 1996). 게다가, IL-6이 신경질환, 탈수초성 질환 다발성 경화증(MS)에 관여하는 것으로 증거되었다(Mendel et al., 1998). IL-6 유전자가 부재하는 생쥐는 이런 질환의 실험적 유도에 저항하였다. 다른 한편, IL-6은 신경 손상이후 초기 외상후 단계동안 뉴런 생존에 부정적인 영향을 주는 것으로 보고되었다(Fisher et al., 2001).
IL-6의 생물학적 활성은 IL-6 수용체로 명명된 2가지 상이한 단백질: gp80 및 gp130으로 구성되는 막 수용체 시스템에 의해 매개된다(Hirano et al, 1994). gp130은 277개 아미노산의 세포내 도메인을 비롯한 918개 아미노산으로 구성되는 막통 당단백질이고, IL-6, IL-11, LIF, Oncostatin M, CNTF(조류 신경영양성 인자), CT-1을 비롯한 여러 사이토킨 수용체의 아단위 구성원이다. IL-6이 gp130을 통하여 작용하는 사이토킨의 원형(prototype)이기 때문에, 이런 사이토킨 계통은 "IL-6형 사이토킨"으로도 불린다.
gp130은 저친화성 수용체 사슬에 결합함으로써 이들 사이토킨에 대한 고친화성 수용체의 형성에 참여한다. 따라서, gp130은 "친화성 전환체"로도 불린다. 사이토킨 수용체에 대한 리간드 결합은 gp130의 이합체화(IL-6 수용체의 경우), 또는 LIFRbeta 아단위로 알려진 gp130-관련된 단백질과 이형이합체화(LIF, Oncostatin M, CNTF 수용체의 경우)를 유도한다. 개별 리간드의 결합은 세포내 신호 전달의 첫 번째 단계로서 Janus 키나아제(JAK)로 알려진 티로신 키나아제 계통의 활성화/결합과 연관한다. 세포내 신호전달 과정은 티로신 인산화 및 STAT (신호 전달인자와 전사 활성인자)라고 하는 활성화 인자를 수반한다.
사람 gp130 유전자 산물은 크로모좀 5와 17에서 2가지 서로 다른 크로모좀 좌위와 상동한 것으로 보인다. 2가지 상이한 gp130 유전자 서열의 존재는 영장류에만 국한되고 다른 척추동물에서는 발견되지 않는다.
IL-6, IL-11, CNTF, Oncostatin M, LIF의 신호전달 활성은 gp130을 지향하는 여러 상이한 단클론 항체에 의해 특이적으로 차단될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 사이토킨 또는 이들의 수용체의 존재와 무관하게 gp130을 직접적으로 활성화시키는 단클론 항체가 발견되었다.
gp130에 대한 다른 단클론 항체는 IL-6-매개된 기능을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 90과 110 KDa 분자량을 갖는 가용성 형태의 gp130(sgp130)이 사람 혈청에서 발견되었다. 이들은 gp130을 구성요소로 하는 수용체 시스템을 이용하여 이들 사이토킨의 생물학적 기능을 저해할 수 있다.
gp80의 세포외 도메인에 상응하는 가용성 형태의 IL-6R gp80(slL-6R)은 혈액과 소변에서 당단백질로서 발견되는 인체의 자연 산물이다(Novick et al, 1990, 1992). sIL-6R 분자의 예외적인 특성은 사람 세포를 비롯한 많은 세포형에서 이들이 IL-6의 강력한 항진제로 기능한다는 점이다(Taga et al, 1989; Novick et al, 1992). sIL-6R은 gp80의 세포질내 도메인이 없어도 IL-6에 반응하여 gp130의 이합체화를 유도할 수 있고, 상기 이합체화는 후속적인 IL-6-특이적 신호 전달과 생물학적 효과를 매개한다(Murakami et al, 1993). sIL-6R은 gp130과 2가지 유형의 상호작용을 하고, 이들 둘 모두 IL-6 특이적 생물학적 활성에 필수적인데(Halimi et al., 1995), 활성 IL-6 수용체 복합체는 2개의 gp130 사슬, 2개의 IL-6R, 2개의 IL-6 리간드로 형성되는 6합체 리간드인 것으로 제안되었다(Ward et al., 1994; Paonessa et al, 1995).
가용성 IL-6 수용체와 IL-6을 서로 연결시키는 키메라 분자가 보고되었다(Chebath et al., 1997, Fischer et al., 1997, WO 99/02552, WO 97/32891). 이들은 각각 IL-6R/IL-6 키메라와 Hyper-IL-6으로 명명되었고 본원에서는 IL-6R/IL-6이라 한다. IL-6R/IL-6 키메라는 가용성 IL-6 수용체(slL-6R)와 IL-6을 인코드하는 cDNA의 전체 코딩 영역을 융합시켜 만들었다(Fischer et al., 1997; Chebath et al., 1997). 재조합 IL-6R/IL-6 키메라는 CHO 세포에서 생산되었다(Chebath et al, 1997, W099/02552). IL-6R/IL-6 키메라는 시험관내에서 IL-6과 sIL-6R의 혼합물보다 gp130 사슬에 좀더 효과적으로 결합한다.
본 발명의 요약
본 발명에 따라, gp130을 통하여 신호하는 물질의 투여는 당뇨성 신경병증의 확립된 동물 모델에서 현저한 긍정적인 효과를 결과하는 것으로 밝혀졌다. 검사된 전형적인 물질은 IL-6과 IL-6R/IL-6 키메라이었다. 양 물질은 신경 생명력과 관련된 여러 파라미터의 개선으로 당뇨성 신경병증에 통계학적으로 유의한 효과를 보였다.
따라서, 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 gp130을 통하여 신호하는 물질의 용도에 관한다.
당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 gp130을 통하여 신호하는 물질을 발현하는 세포의 용도는 본 발명의 또 다른 목적이다. 게다가, 본 발명에는 gp130을 통하여 신호하는 물질에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터가 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용된다.
도 1에서는 실험 동물에서 체중의 발달을 도시한다.
도 2에서는 복강내 투여를 받은 일련의 실험 동물에서 10일(A)과 40일(B)의 당뇨병 유도이후 혈당증의 정도를 도시한다.
도 3에서는 복강내 투여를 받은 동물이 열원(heat source)에 위치된 꼬리를 도피하는데 걸린 시간(초)을 도시한다.
도 4에서는 복강내 투여를 받은 동물에서 초당 잠복기(latency)로 표시되는 복합 근육 활동 전압(CMAP)을 도시한다.
도 5에서는 복강내 투여를 받은 실험 동물에서 감각신경 전도 속도(SNVC)(m/sec)를 도시한다.
도 6에서는 복강내 투여를 받은 실험 동물에서 축색 돌기 직경(㎛)을 도시한다.
도 7에서는 복강내 투여를 받은 실험 동물에서 섬유 직경(㎛)을 도시한다.
도 8에서는 복강내 투여를 받은 실험 동물에서 미엘린(myelin) 두께(㎛)를 도시한다.
도 9에서는 복강내 투여를 받은 실험 동물에서 필드(field)당 수초화된 섬유의 개수를 도시한다.
도 10은 IL-6R/IL-6 키메라 구조를 예시하는 개요도이다.
도 11에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 체중의 발달을 도시한다.
도 12에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 10일과 40일의 당뇨병 유도이후 혈당증의 정도를 도시한다.
도 13에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물이 열원(heat source)에 위치된 꼬리를 도피하는데 걸린 시간(초)을 도시한다.
도 14에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 교차 스퀘어(crossed square)의 개수(A)와 사육(B)을 도시한다.
도 15에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 초당 잠복기(latency)로 표시되는 복합 근육 활동 전압(CMAP)을 도시한다.
도 16에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 감각신경 전도 속도(SNVC)(m/sec)를 도시한다.
도 17에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 섬유 직경(㎛)을 도시한다.
도 18에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 축색 돌기 직경(㎛)을 도시한다.
도 19에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 미엘린(myelin) 두께(㎛)를 도시한다.
도 20에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 퇴행 섬유의 비율을 도시한다.
도 21에서는 피하 투여를 받은 A 동물군의 실험 동물에서 수초화된 섬유의 비율을 도시한다.
도 22에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 체중의 발달을 도시한다.
도 23에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 10일과 40일의 당뇨병 유도이후 혈당증의 정도를 도시한다.
도 24에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물이 열원(heat source)에 위치된 꼬리를 도피하는데 걸린 시간(초)을 도시한다.
도 25에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 교차 스퀘어(crossed square)의 개수(A)와 사육(B)을 도시한다.
도 26에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 초당 잠복기(latency)로 표시되는 복합 근육 활동 전압(CMAP)을 도시한다.
도 27에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 감각신경 전도 속도(SNVC)(m/sec)를 도시한다.
도 28에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 섬유 직경(㎛)을 도시한다.
도 29에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 축색 돌기 직경(㎛)을 도시한다.
도 30에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 미엘린(myelin) 두께(㎛)를 도시한다.
도 31에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 퇴행 섬유의 비율을 도시한다.
도 32에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 수초화된 섬유의 비율을 도시한다.
도 33에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 체중의 발달을 도시한다.
도 34에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 10일과 40일의 당뇨병 유도이후 혈당증의 정도를 도시한다.
도 35에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물이 열원(heat source)에 위치된 꼬리를 도피하는데 걸린 시간(초)을 도시한다.
도 36에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 교차 스퀘어(crossed square)의 개수(A)와 사육(B)을 도시한다.
도 37에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 초당 잠복기(latency)로 표시되는 복합 근육 활동 전압(CMAP)을 도시한다.
도 38에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 감각신경 전도 속도(SNVC)(m/sec)를 도시한다.
도 39에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 섬유 직경(㎛)을 도시한다.
도 40에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 축색 돌기 직경(㎛)을 도시한다.
도 41에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 미엘린(myelin) 두께(㎛)를 도시한다.
도 42에서는 피하 투여를 받은 C 동물군의 실험 동물에서 퇴행 섬유의 비율을 도시한다.
도 43에서는 피하 투여를 받은 B 동물군의 실험 동물에서 수초화된 섬유의 비율을 도시한다.
본 발명은 gp130을 통하여 신호하는 물질의 투여가 당뇨성 신경병증의 확립된 동물 모델에서 현저한 항-침해수용(anti-nociceptive)와 신경 재생 효과를 결과한다는 사실에 기초한다. 따라서, 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 사람 인터루킨-6(IL-6) 수용체 gp130을 통하여 신호하는 물질의 용도에 관한다.
본원에서 "gp130을 통하여 신호하는 물질"은 gp130을 통하여 신호 캐스케이드를 활성화시키는 임의의 분자, 다시 말하면 IL-6 수용체 복합체의 gp130 부분의 항진제, 촉진인자 또는 활성인자이다. 자극은 직접적일 수 있다, 다시 말하면 gp130에 직접적인 결합으로 활성이 유도될 수 있다. 이런 직접적인 활성인자의 예는 IL-6R/IL-6 키메라이다. 자극은 gp130과 복합체를 형성하고 이를 활성화시키는 다른 세포 표면 수용체에 결합으로 간접적으로 유도될 수도 있다. gp130의 이런 간접적인 활성인자의 예는 IL-6이다. gp130을 통하여 신호하는 물질의 다른 예는 IL-11, LIF, Oncostatin M(OSM), CNTF(섬모 신경영양성 인자), 카디오트로핀-1(CT-1) 등인데, 이들은 "IL-6-형 사이토킨"으로 불린다. 이들 사이토킨은 JAK/STAT 경로를 유도하는데, 이런 경로의 첫 번째 현상은 신호-전달 수용체 아단위의 리간드-유도된 동형- 또는 이형-이합체화이다. 모든 IL-6-형 사이토킨은 수용체 복합체에 gp130을 동원한다. 이들은 gp130 단독으로, 또는 Jaks를 활성화시키고 STAT 단백질을 동원할 수 있는 LIFR이나 OSMR과 동동으로 신호한다. IL-6은 gp130-동형이합체화를 유도하고, 반면 CNTF, LIF, CT-1은 gp130과 LIFR의 이형이합체화를 통하여 신호한다.
본원에서 "치료"와 "예방"은 당뇨성 신경병증의 한가지이상 증상이나 원인 및 당뇨성 신경병증에 동반되는 증상, 질환 또는 합병증을 예방하거나, 저해하거나 약화시키거나, 완화시키거나 반전시키는 것을 의미한다. 당뇨성 신경병증을 "치료"하는 경우에, 본 발명에 따른 물질은 발병이후에 제공되고, "예방"은 환자에서 증상이 나타나기 이전에 이런 물질의 투여에 관한다. 예방적 투여는 고위험 환자, 예를 들면 장기간동안 당뇨병으로 고생하는 환자에 특히 유용하다.
"당뇨성 신경병증"은 임의 형태의 당뇨성 신경병증, 당뇨성 신경병증에 동반되는 한가지이상의 증상이나 질환, 또는 상기 도입부에서 상세하게 기술된 신경에 영향을 주는 당뇨 합병증에 관한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 당뇨성 신경병증은 다중신경병리이다. 당뇨성 다중신경병리에서는 여러 신경이 동시에 영향을 받는다.
다른 바람직한 구체예에서, 당뇨성 신경병증은 단일신경병증이다. 국소성 단일신경병증은 단일 신경, 예를 들면 동안 신경 또는 외전 두개골 신경에 영향을 준다. 서로 독립된 부위에서 2개 이상의 신경이 영향을 받는 경우에 다발성 단일신경병증이라 한다.
적절하게는, 물질은 아래에서 선택된다:
a) IL-6;
b) gp80에 결합하고 gp130을 통하여 신호하는 a)의 단편;
c) a) 또는 b)와 적어도 70% 서열 동일성을 보유하고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
d) 중간 수준으로 엄격한 조건하에 a) 또는 b)를 인코드하는 고유 DNA 서열의 보체와 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코드되고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
e) gp130을 통하여 신호하는 a), b), c) 또는 d)의 염, 융합 단백질 또는 기능성 유도체
특히 적절하게는, IL-6 자체가 본 발명에 사용된다. IL-6은 고유 IL-6, 다시 말하면 자연 출처로부터 분리된 IL-16, 또는 재조합 생산된 IL-6일 수 있다. 재조합 IL-6이 본 발명에 특히 선호된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 물질은 아래에서 선택된다:
a) IL-6R/IL-6 키메라;
b) gp130에 결합하고 gp130을 통하여 신호하는 a)의 단편;
c) a) 또는 b)와 적어도 70% 서열 동일성을 보유하고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
d) 중간 수준으로 엄격한 조건하에 a) 또는 b)를 인코드하는 고유 DNA 서열의 보체와 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코드되고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
e) gp130을 통하여 신호하는 a), b), c) 또는 d)의 염, 융합 단백질 또는 기능성 유도체.
본원에서 "IL-6R/IL-6 키메라"("IL-6R/IL-6"또는 "IL-6 키메라")는 인터루킨의 전부 또는 생물학적 활성 분획에 융합된 gp130의 가용성 부분을 포함하는 키메라 분자이다. 키메라 단백질의 일부분은 다른 부분에 직접 융합되거나 임의의 적절한 링커, 예를 들면 이황화 가교 또는 폴리펩티드 링커로 연결될 수 있다. 링커는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기, 또는 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 또는 18개 아미노산 잔기의 짧은 링커 펩티드이다. 상기 링커는 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 예를 들면 가용성 IL-6 수용체 gp130의 아미노산 서열과 IL-6 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. IL-6R/IL-6 키메라의 예는 당분야에 공지되어 있고 WO 99/02552 또는 WO 97/32891에서 상세하게 기술하였다. 본 발명에 사용될 수 있는 IL-6R/IL-6 키메라 분자의 예는 도 2에 개략적으로 도시한다.
본원에서 "변이체"는 IL-6 유사체 또는 IL-6R/IL-6 키메라를 의미하는데, 여기서 IL-6R/IL-6의 자연 발생 구성요소의 한가지이상 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 한가지이상 아미노산 잔기가 IL-6의 고유 서열 또는 IL-6R/IL-6에 부가되는데, 이때 고유 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라와 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 변이체는 공지된 합성방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 적합한 공지 기술을 활용하여 만들 수 있다.
본 발명에 따른 변이체에는 중간 수준으로 엄격하거나 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 IL-6 또는 IL-6R/IL-6을 인코드하는 DNA 또는 RNA의 보체와 혼성화되는 DNA 혹은 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한 조건"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al., supra.
제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 사용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.). "중간 수준으로 엄격한 조건"은 좀더 낮은 온도, 좀더 낮은 염 또는 좀더 낮은 세제 농도에서 세척 조건, 예를 들면 42℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS를 의미한다(Ausubel et al., 1989, supra.).
적절하게는, 임의의 이런 변이체는 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 서열과 실질적으로 중복되는 아미노산 서열, 예를 들면 IL-6 또는 IL-6R/IL-6과 비교하여 실질적으로 유사하거나 이보다 우수한 활성을 보유하는 아미노산 서열을 보유한다.
IL-6의 특징적인 활성은 IL-6 수용체의 gp80 부분에 결합하는 능력이고, IL-6R/IL-6 키메라의 특징적인 활성은 gp130에 결합하는 능력이다. gp130에 IL-6R/IL-6 키메라의 결합을 측정하는 ELISA형 분석법은 WO 99/02252의 39페이지, 실시예 7에서 상세하게 기술하였다. 당업자가 인지하는 바와 같이, gp80에 IL-6의 결합에 대하여 유사한 ELISA형 분석법이 개발될 수 있다. 변이체가 gp80 또는 gp130의 개별적인 결합 영역에 실질적인 결합 활성을 보유하면, 이는 IL-6R/IL-6 키메라에 실질적으로 유사한 활성을 보유하는 것으로 간주할 수 있다. 따라서, 임의의 변이체가 IL-6R/IL-6과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 지를 통상적인 검사법으로 결정할 수 있는데, 이런 검사법은 예로써 변이체가 WO 99/02252의 실시예 7에서 밝힌 바와 같이, 고정 gp80 또는 gp130에 결합하는 지를 측정하는 단순 샌드위치 결합 분석법을 이런 변이체에 실시하는 단계로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 임의의 이런 변이체는 WO 99/09063에 정의된 바와 같이 성숙 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라 분자의 서열과 적어도 40% 동일성이나 상동성을 보유한다. 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성이나 상동성을 보유한다.
동일성은 서열을 비교하여 확정된 2개이상 폴리펩티드 서열 또는 2개이상 폴리뉴클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열 범위에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.
정확하게 일치하지 않는 서열에서, "동일성 %"를 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 정렬시켜 서열간의 최대 상관을 제공한다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 "틈새(gap)"를 삽입할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 좀더 짧고 한정된 범위(소위, 국부정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.
2개이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열간 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의"국부 상동성(local homology)" 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www. ncbi.nlm.nih.gov에서 입수가능)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.
본 발명에 사용될 수 있는 IL-6 변이체 또는 IL-6R/IL-6 키메라, 또는 이들을 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 교시에 기초하여 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.
본 발명에 따른 변이체에 대한 바람직한 변화는"보존성"치환이다. IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(예, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.
표 1
바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, Thr, Pro
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
표 2
좀더 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser
Arg His, Lys, Arg
Leu Leu, Ile, Phe, Met
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Val, Met, Ile
Gly Gly
Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr Phe, Tyr
Cys Cys, Ser
His His, Gln, Arg
Gln Glu, Gln, His
Asn Asp, Asn
Lys Lys, Arg
Asp Asp, Asn
Glu Glu, Gln
Met Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp Trp
표 3
가장 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser
Arg Arg
Leu Leu, Ile, Met
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Ile, Met, Leu
Phe Phe
Tyr Tyr
Cys Cys, Ser
His His
Gln Gln
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
Glu Glu
Met Met, Ile, Leu
Trp Met
본 발명에 사용될 수 있는 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라의 뮤테인을 수득하는데 이용될 수 있는 단백질에서 아미노산 치환의 유도 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.
본 발명에 유용한 IL-6의 특이적인 변이체는 이미 보고되었다(WO 9403492A1). 게다가, EP 667872B1에서는 야생형 IL-6에 비하여 개선된 생물학적 활성을 보유하는 변이 IL-6을 기술한다. 이에 더하여, EP 656117B1에서는 IL-6의 초항진제(superagonist)를 분리하는 방법을 기술한다. 초항진제의 변이체는 본 발명에 사용될 수 있다.
"융합단백질"은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖는 다른 단백질과 융합되는 IL-6, IL-6R/IL-6 키메라, 또는 이들의 단편이나 변이체로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다.
본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질의 유도체가 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기에서 측쇄 또는 N- 혹은 C-말단기로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-6 또는 IL-6R/IL-6의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.
가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액에서 IL-6R/IL-6의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
본 발명에 따른 "단편"은 예로써 IL-6 또는 IL-6R/IL-6의 활성 분획이다. 단편은 상기 분자의 임의 아집합, 다시 말하면 원하는 생물학적 활성, 예를 들면 gp130의 항진 활성을 유지하는 좀더 짧은 펩티드를 의미한다. 단편은 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 분자의 단부로부터 아미노산을 제거하고 생성된 단편에서 gp80 또는 gp130에 결합하는 능력을 검사함으로써 용이하게 만들 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단이나 C-말단으로부터 한번에 하나씩 아미노산을 제거하는 프로테아제는 당분야에 공지되어 있고, 원하는 생물학적 활성을 유지하는 단편은 통상적인 검사법으로 결정할 수 있다.
본 발명에서 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질의 단편에는 단독으로 또는 연관된 분자나 이에 연결된 잔기, 예를 들면 당이나 인산염 잔기와 함께 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 단편이나 전구체, 또는 단백질 분자나 당 잔기 자체의 집합체가 포함되는데, 이들 분획은 gp130에 항진 활성을 갖는다.
본원에서 "염"은 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 분자, 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산첨가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 첨가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라의 생물학적 활성, 다시 말하면 gp130을 통한 신호전달을 활성화시키는 능력을 유지해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 물질은 하나이상의 부위에서 당화된다.
당화된 형태의 IL-6R/IL-6 키메라는 WO 99/02252(PCT/IL98/00321)에서 기술하는데, 이는 본 발명에서 선호되는 키메라 분자이다. 여기에 기술된 IL-6R/IL-6 키메라는 사람 기원의 자연-발생 가용성 IL-6 수용체 δ-Val(Novick et al., 1990)의 완전 코딩 서열을 사람 기원의 성숙 자연-발생 IL-6의 완전 코딩 서열에 융합시켜 수득한 재조합 당단백질이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 당화된 IL-6은 재조합 방법, 다시 말하면 진핵 발현계에서 발현으로 생산할 수도 있다.
본 발명에 따라, 항진제는 임의의 적절한 진핵이나 원핵 세포형, 예를 들면 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 등에서 생산할 수 있다. 항진제는 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 WO 99/02552에서 IL-6R/IL-6에 대하여 기술한 바와 같이 유전자 조작된 CHO 세포에서 생산한다. 사람 기원의 단백질이 바람직하긴 하지만, 생물학적 활성을 유지하는 다른 기원의 유사한 융합 단백질 역시 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 물질은 당화되지 않는다. 적절하게는, 키메라 분자는 글리코실 잔기를 합성할 수는 없지만 재조합 단백질을 높은 수율을 생산하는 박테리아 세포에서 생산할 수 있다. 당화되지 않은 IL-6의 생산은 예로써 EP 504751B1에서 상세하게 기술하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 물질은 면역글로불린 융합을 포함한다, 다시 말하면 본 발명에 따른 분자는 면역글로불린의 전부 또는 일부분, 특히 면역글로불린의 Fc 단편에 융합된다. 면역글로불린 융합 단백질을 만드는 방법은 예로써 WO 01/03737에 기술된 방법을 비롯하여 당분야에 공지되어 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 단백질은 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라의 생물학적 활성, 다시 말하면 gp130 신호전달의 자극을 유지한다. 이상적으로, 생성된 융합 단백질은 개선된 특성, 예를 들면 체액에서 연장된 체류 시간(반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준, 또는 융합 단백질의 용이한 정제를 보인다.
적절하게는, 본 발명에 따른 물질은 Ig의 불변 영역에 융합된다. 이는 중쇄 영역, 예를 들면 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인에 융합될 수 있다. Ig 분자의 다른 동형, 예를 들면 IgG2 또는 IgG4; 또는 다른 Ig 종류, 예를 들면 IgM 또는 IgA 역시 본 발명에 따른 융합 단백질의 생산에 적합하다.
따라서, 융합 단백질은 단위체, 또는 이형-이나 동형-다합체이다.
본 발명에 따른 물질의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 인체에서 내약성, 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 아미노산 잔기에서 측쇄로 발생하는 한가지이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 성분(moiety)을 포함하는 본 발명에 따른 물질의 기능성 유도체에 관한다.
좀더 바람직한 구체예는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된 본 발명에 따른 물질에 관한다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에 기술된 방법을 비롯한 공지된 방법으로 실시할 수 있다.
적절하게는, gp130을 통하여 신호하는 물질은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 대략 1 내지 500 ㎍, 또는 대략 100 ㎍ 미만의 함량으로 사용된다. 좀더 적절하게는, gp130을 통하여 신호하는 물질은 대략 1 ㎍/㎏, 3 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏ 또는 30 ㎍/㎏의 함량으로 사용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 매일 투여된다. 좀더 바람직한 구체예에서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 주 3회 투여된다. 더욱 바람직한 구체예에서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 주 1회 투여된다.
본 발명에 따른 물질은 적절한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명에는 피하 경로가 선호된다.
본 발명에 따른 물질은 임의의 적절한 제형으로 작용 부위에 전달될 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 물질은 IL-6, IL-6R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질 또는 이들의 활성 단편을 발현하거나 분비하는 세포 형태로 전달될 수 있다. 아래의 실시예에서 밝힌 바와 같이, 충분한 함량으로 IL-6R/IL-6 키메라를 발현하고 분비하는 세포는 적절한 발현 벡터를 세포에 트랜스펙션시켜 만들 수 있다.
따라서, 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 물질을 발현하는 세포의 용도에 관한다. 상기 세포는 임의의 적합한 형태로 투여될 수 있다. 하지만, 중합체-피포된 IL-6 또는 IL-6R/IL-6 키메라 발현, 바람직하게는 분비 세포가 IL-6R/IL-6 키메라의 전달에 선호된다. 피포(encapsulatuin) 과정은 Emerich et al(1994) 또는 US 5,853,385에서 상세하게 기술한다. 적합한 세포주와 안정적인 발현계는 당분야에 공지되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 물질의 전달은 IL-6, IL-6R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질 또는 이들의 활성 단편의 코딩 서열을 포함하는 벡터, 예를 들면 발현 벡터를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 벡터는 인체, 바람직하게는 말초 신경세포에서 원하는 단백질의 발현에 필요한 모든 조절 서열을 포함한다. 발현 벡터용 조절 서열은 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 물질의 코딩 서열을 포함하는 벡터의 용도에 관한다.
당분야에 공지된 임의의 발현 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다. 하지만, 바이러스 유래된 유전자 요법 벡터의 사용이 선호된다.
적절하게는, 본 발명에 따른 물질은 제약학적 조성물로서 인체에 투여된다. 상기 제약학적 조성물은 당뇨성 신경병증의 치료 및/또는 예방을 위하여 본 발명의 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포; 또는 IL-6, IL-6R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질 또는 이들의 활성 단편의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터, 특히 렌티바이러스 유전자 요법 벡터 및 선택적으로 한가지이상의 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 만들 수 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.
장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨성 신경병증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제시하는 것인데, 상기 방법은 사람 gp130 수용체를 통하여 신호하는 물질의 효과량 및 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체를 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
"효과량"은 앞서 기술된 질환의 과정과 심각도에 영향을 주고, 따라서 이런 병리의 감소 또는 완화를 결과하는 충분한 함량의 활성 성분을 의미한다.
효과량은 투여 경로 및 환자의 상태에 좌우된다.
개체에 투여되는 단일 또는 다중 복용량은 약동학적 특성, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 요법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 확립된 용량 범위의 조정은 당업자의 능력에 속한다.
IL-6 또는 IL-16R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질, 또는 이들의 활성 단편의 효과량을 환자에 투여하는 단계로 구성되는 당뇨성 신경병증을 치료하는 방법 역시 본 발명의 일부로 간주된다. 당뇨성 신경병증을 치료하는 방법은 IL-6 또는 IL-16R/IL-6 키메라, 변이체, 융합 단백질, 또는 이들의 활성 단편의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 유전자 요법 벡터이다. 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터의 사용이 선호된다.
본 발명은 아래의 무-제한적 실시예 및 첨부된 도면에서 좀더 상세하게 기술한다.
본원의 상세한 설명에 비추어, 본 발명은 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 광범위한 등가의 파라미터, 농도, 조건에서 동일하게 실시할 수 있다.
본 발명을 특정 구체예와 연계하여 기술하였지만, 추가적인 개변이 가능하다. 본 출원에는 본 발명의 원칙을 전반적으로 따르고 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 본 발명의 임의 변용, 활용 또는 적용이 포함된다.
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특정 구체예의 전술한 설명에서는 본 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에서 사용된 용어는 본원을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.
실시예 1: CHO 세포에서 IL-6과 IL-6R/IL-6 키메라의 생산
IL-6R/1L-6 키메라
가용성 IL-6 수용체(소변에서 발견되는 자연형 sIL-6R, Oh et al., 1997)를 인코드하는 cDNA 서열은 성숙 IL-6을 인코드하는 DNC 서열과 융합시켰다. 3개의 가교 아미노산(EFM)에 대한 서열 역시 존재하였다. 융합된 유전자는 CMV 프로모터의 조절하에 발현 벡터에 삽입하고 CHO 세포에 도입하였다. 생산 과정을 개발하고, 생성된 재조합 단백질은 항-IL-6R 단클론 항체를 이용한 면역정제로 정제하였다. 정제된 IL-6 키메라는 당화되고 85'000의 겉보기 MW를 보이는 것으로 밝혀졌다.
도 10에서는 IL-6R/IL-6 키메라의 조성을 도시한다. 성숙 단백질은 524개 아미노산으로 구성된다.
이렇게 생산되고 정제된 단백질은 본 발명에 따라 투여하는데 적합하다.
IL-6
재조합 사람 IL-6(r-hIL-6)은 유전자 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산한다. 생산 과정은 작업 세포 은행(WCB)으로부터 얻은 세포의 성장과 확대로 시작하고 r-hIL-6이 배양 배지로 분비되는 조건하에 지속한다. r-hIL-6 수확된 배양 배지는 특이적인 항-IL-6 단클론 항체(mAB)를 이용한 면역크로마토그래피로 정제한다. 추가적인 정제 단계를 실시하여 순도가 매우 높은 산물을 얻는다.
r-hIL-6은 적절한 부형제를 함유하는 동결-건조된 무균 제제로 공급된다. 이는 2가지 함량, 35 ㎍과 350 ㎍으로 구입가능하고 주사를 위하여 물로 재구성한다. 최종 산물의 1 바이알의 재구성 부피는 통상적으로 0.5 ㎖ 물이다. 완결된 산물은 25℃ 미만의 온도에서 원래 용기에 보관한다.
r-hIL-6의 구조는 원자 폭발 질량 분석법(FAB-MS), 트립틱 매핑(tryptic mapping), 아미노산 서열분석으로 결정하였다. FAB와 전기분무 질량 분석법을 이용하여 IL-6의 탄수화물 부분의 조성과 구조를 결정하였다. 잔기 아스파라긴-46은 N-당화 부위로 확인되었고, N-결합된 탄수화물의 예비 분석에서 우세 화학종은 모노시알릴 푸코실 비안텐나리(monosialyl fucosyl biantennary) 와 디시알릴 푸코실 비안텐나리 구조(disialyl fucosyl biantennary)인 것으로 밝혀졌다. O-당화 부위는 트레오닌 -138 또는-139로 확인되었다.
실시예 2: 복강내 투여직후에 스트렙토조토신-유도된 당뇨성 신경병증에서 IL-6의 효과
재료와 방법
동물
6주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest-St-lsle, France)는 무작위 표에 따라 9가지 실험군(n=10)으로 구분하였다: (a) 염수-BSA 0.02 %(weight/volume)의 무균 용액이 주사된 운반제 대조군; (b) 염수-BSA 0.02 %의 무균 용액에 용해된 100 ㎍/㎏ IL-6이 주사된 동물로 구성되는 대조군; (c) 염수-BSA 0.02 %의 무균 용액이 주사된 스트렙토조토신(STZ)-중독된 군; (d) 상이한 용량: 1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎏의 IL-6 화합물이 주사된 동물로 구성되는 5가지 스트렙토조토신(STZ)-중독된 치료군; (e) 스트렙토조토신(STZ)-중독되고 참고 화합물: 10 ㎍/㎏ 용량의 4-메틸 카테콜(4-MC)로 치료된 군.
이들은 집단 사육(우리당 2마리)하고, 온도(21-22℃)가 통제되고 어둠-밝음 사이클(12h/12h)이 반전되는 실내에 유지시키며, 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 규정에 맞게 실시하였다.
당뇨병의 유도 및 약리학적 처리
당뇨병은 외과적으로 노출된 좌측 사페나 마그나(saphena magna)에 체중 ㎏당 55 ㎎ 용량의 스트렙토조토신(Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, France) 완충액을 주사하여 유도하였다. 약물은 주사직전에 0.1 mol/ℓ 구연산염 완충액(pH 4.5)에 용해시켰다. STZ 주사 당일은 0일(D 0)로 간주하였다.
1주일후, D 10에서 꼬리 정맥혈은 혈당측정기(Glucotrend test, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 개별 동물에서 혈당증을 분석하였다. 260 ㎎/㎗ 미만의 값을 보이는 동물은 연구에서 배제하였다. 혈당증은 실험의 종결 시점, D 40에서 다시 한번 측정하였다.
IP 치료(운반제, IL-6, 4-MC)는 D 11에서 D 40까지 매일 실시하였다.
실험의 계획
체중과 생존율은 매일 기록하였다.
꼬리 도피와 EMG 검사는 아래의 시점에서 주 1회 실시하였다:
D-7 : 기준선(꼬리 도피와 EMG)
D 0 : STZ 주사에 의한 당뇨병의 유도
D 10 : 혈당증의 측정
D 11 : 치료(IL-6과 4-MC)의 시작
D 25 : EMG와 꼬리 도피 검사
D 40 : 혈당증의 조절, EMG와 꼬리 도피 검사, 좌골 신경의 제거
감수성 검사: 꼬리 도피
쥐의 꼬리는 열원으로 셔터-조절되는 램프(Bioseb, Paris, France)에 위치시켰다. 쥐가 열원으로부터 꼬리를 도피하기 이전의 잠복기(latency)를 기록하였다. 감각 변화는 도피의 잠복기를 증가시킨다. 2회 시험하여 평균값을 계산하고 특징적인 수치로 존속시켰다.
근전도(electromyography)
전기생리학적 기록은 Neuromatic 2000M 근전도계(EMG)(Dantec, Les Ulis, France)를 이용하여 실시하였다. 쥐는 60 ㎎/㎏ 케타민 클로르하이드레이트(Imalgene 500ㄾ,. Rhone Merieux, Lyon, France)를 복강내 주사하여 마취시켰다. 정상 체온은 가열 램프로 30℃에 유지시키고, 꼬리 표면에 위치된 접촉 온도계(Quick, Bioblock Scientific, Ilikirch, France)로 조절하였다.
복합 근육 활동 전압(CMAP)은 좌골 신경의 자극이후 비복근(gastrocnemius muscle)에서 기록하였다. 참고 전극과 활동성 바늘은 뒷발에 위치시켰다. 기초 바늘은 쥐의 아래쪽 등에 삽입하였다. 좌골 신경은 극최대 강도에서 단일 0.2 ms 펄스로 자극하였다. 운동 속도는 기록하고 ms로 표시하였다.
감각 신경 전도 속도(SNCV) 역시 기록하였다. 꼬리 피부 전극은 아래와 같이 위치시켰다: 참고 바늘은 꼬리의 기부에 삽입하고 양극 바늘은 참고 바늘로부터 꼬리 말단 방향으로 30 ㎜ 떨어져 위치시켰다. 기초 바늘 전극은 양극 바늘과 참고 바늘 사이에 삽입하였다. 꼬리 신경은 12.8 mA의 강도에서 일련의 20 펄스(0.2 ms 동안)로 자극하였다. 속도는 m/s로 표시하였다.
형태학적 분석
형태학적 분석은 연구의 종결 시점(D 40)에서 실시하였다. 동물은 100 ㎎/㎏ Imalgene 500ㄾ의 IP 주사로 마취시켰다. 좌골 신경의 5 ㎜-분절은 조직검사를 위하여 절제하였다. 조직은 인산염 완충액(pH = 7.4)에 녹인 4 % 글루타르알데하이드(Sigma, L'isle d'Abeau-Chesnes, France) 용액으로 하룻밤동안 고정시키고 사용 때까지 30% 수크로오스 + 4℃에 유지시켰다. 신경 시료는 인산염 완충액에 녹인 2 % 오스뮴 테트록사이드(Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) 용액에 2시간동안 고정시키고 일련의 알코올 용액에서 탈수시키며 Epon에 포매시켰다. 이후, 포매된 조직은 3일간의 중합화동안 +70℃에 유지시켰다. 마이크로톰(microtome)으로 1.5 ㎛의 횡단 절편을 절단하고 2분동안 1 % 톨루이딘 블루 용액(Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France)으로 염색하고 탈수시키며 Eukitt에 올려놓았다. 광학현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 시료당 20개 절편을 검사하고, 반-자동화된 디지털 이미지 영상 분석 소프트웨어(Biocom, France)로 6개의 무작위 선택된 조각을 분석하였다. 조각당 2개의 무작위 선택된 필드를 조사하였다. 아래의 파라미터를 계산하였다: (a) 섬유 직경, (b) 축색 돌기 직경, (c) 미엘린 두께.
신경 절편당 섬유의 전체 개수를 계산하기 위하여, 시료당 3개의 조각을 무작위로 선택하고 조각당 2개의 필드를 분석하였다.
데이터 분석
데이터의 전체적인 분석은 변이의 한 인자 또는 반복된 분산분석(ANOVA)과 일원 ANOVA로 실시하였다. ANOVA 검정에서 유의한 차이가 확인되면 Dunnett 검정을 실시하였다. post-hoc 분석은 실시하지 않았다. 유의성 수준은 p < 0.05로 설정하였다. 결과는 평균 ㅁ 표준 오차(s.e.m)로 표시한다.
결과
동물 체중
도 1에 도시된 바와 같이, 체중 변화에서 군간 유의한 차이가 본 연구에서 확인되었다[f(8, 296) = 19.47과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 5부터 D 40까지, STZ-중독된/IL-6-치료된 동물은 체중에서 현저한 감소를 보였다(p < 0.05; 일원 ANOVA 및 p < 0.05 대조 versus(vs) STZ; 대조/IL-6(100 ㎍/㎏) vs STZ; 대조 vs STZ + IL-6과 대조/IL-6(100 ㎍/㎏) vs STZ + IL-6; Dunnett 검정).
10 ㎍/㎏ 용량의 IL-6으로 치료된 당뇨성 동물은 다른 용량의 IL-6에서보다 현저하게 높은 체중을 보였다[f(5, 185) = 1.16과 p = 0.08; 반복 측정 ANOVA].
100 ㎍/㎏의 용량에서 STZ-중독된/IL-6 치료된 동물은 전체 연구 기간동안(치료의 시작 시점부터) 체중 감소를 보이는 것으로 확인되었다.
혈당증
도 2a에서는 D 10에 대조 동물이 100 ㎎/㎗에 필적하는 혈당증 수치를 갖는다는 것을 도시한다. 다른 한편, STZ-중독된 쥐는 260 ㎎/㎗보다 높은 혈장 글루코오스 농도를 보이고 당뇨성으로 간주되었다.
도 2b에서는 STZ-중독된 쥐가 D 40에도 여전히 당뇨성임을 도시한다.
감수성 검사: 꼬리 도피
꼬리-도피 결과의 변화에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(8, 16) = 2.07과 p = 0.013; 반복 측정 ANOVA](도 3). 쥐가 열원으로부터 꼬리를 도피하기 이전의 잠복기(latency)는 치료되지 않은 당뇨성 동물에서 유의하게 증가하였다(대조/운반제 vs STZ/운반제 p < 0.001; Dunnett 검정). D 25와 D 40에서, 반응 시간은 1, 3, 10, 100 ㎍/㎏ 용량의 IL-6 및 10 ㎍/㎏ 용량의 4-MC로 치료된 동물에서 증가하지 않았다. 실제로, 이들 군간 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05; Dunnett 검정).
전기생리학적 측정
복합 근육 활동 전압의 잠복기
전체 연구 기간동안 CMAP의 잠복기에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(8, 16) = 5.901과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. 잠복기는 치료되지 않은 당뇨성 쥐에서 현저하게 증가하였다(D 25와 D 40: p < 0.001; 일원 ANOVA). 이런 증가는 IL-6-치료된 군에서 덜 중요하였다; 특히, IL-6(10 ㎍/㎏)-치료된 군은 D 25일과 D 40일에, 대조/운반제 군의 잠복기 값과 유의한 차이를 보이지 않았다(도 4).
더 나아가, D 25일에 각 IL-6 치료된/STZ 군은 운반제/STZ 군의 CMAP 잠복기보다 현저하게 짧은 CMAP 잠복기를 보였다(p = 0.001, Dunnett 검정).
D 40에, 동일한 결론이 도출되었다.
IL-6 치료된/STZ 동물(10 ㎎/㎏)과 4가지 다른 IL-6 치료된 군(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎏) 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(D 25: p = 0.002, D 40: p = 0.003; 일원 ANOVA 검정). 3 ㎍/㎏과 10 ㎍/㎏ 치료된 동물은 D 25와 D 40에 1, 30, 100 ㎍/㎏IL-6 치료된/STZ 군보다 현저하게 낮은 잠복기를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
감각 신경 전도 속도
전체 연구 기간동안 SNCV에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(8, 16) = 5.518과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA](도 5). 당뇨성 쥐는 대조/부형약 군과는 대조적으로 SNCV의 유의한 감소를 보였다(D 25와 D 40: p < 0.001; 일원 ANOVA). 더 나아가, D 25에 대조/부형약 군과 10 ㎍/㎏ IL-6-치료된 군(p = 0.426; Dunnett 검정) 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않는 반면, 모든 다른 군 사이에서는 유의한 차이가 관찰되었다. D 25에, 10과 30 ㎍/㎏만 STZ/부형약 군에서 유의한 차이를 보였다(10 ㎍/㎏ vs 운반제 STZ 군: p < 0.001, 30 ㎍/㎖ vs STZ 군, p = 0.004, Dunnett 검정). D 40에, 10 ㎍/㎏으로 치료된 동물은 STZ/운반제 치료된 동물과 유의한 차이를 보이지 않았지만, 상기 군에서 SNCV 값은 다른 STZ/IL-6 치료된 동물보다 높았다.
SNCV는 말초 신경 구조의 정상적인 성숙으로 인하여 전체 연구 기간동안 대조/운반제 동물에서 점진적으로 증가하는 것으로 밝혀졌다(Gao et al., 1995, Malone et al., 1996).
형태학적 분석
축색 돌기 직경
축색 돌기 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA)(도 6). 운반제/STZ 동물은 대조 쥐와 비교하여 축색 돌기 직경의 현저한 감소를 보였다(p = 0.08; Dunnett 검정). IL-6으로 치료는 3 ㎍/㎏ 용량 이후로, 축색 돌기 직경의 이런 증가를 반전시켰다(IL-6-치료된 쥐 vs STZ/운반제 p < 0.001; Dunnett 검정). 더 나아가, 대조군과 대조/IL-6(100 ㎍/㎏) 군 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; Dunnett 검정). 대조/운반제 군과 4-MC-치료된 군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p = 0.657; Dunnett 검정).
섬유 직경
도 7에서는 섬유 직경에서 9개군 사이에 유의한 차이가 존재함을 도시한다(p < 0.001; 일원 ANOVA). STZ 투여는 섬유 직경의 유의한 감소를 유도하였다(대조/운반제 vs STZ/운반제 p = 0.005; Dunnett 검정). 부형약/STZ 쥐와 IL- 6-치료된/STZ 쥐 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.005; Dunnett 검정). IL-6-치료된 동물은 운반제/STZ 동물보다 좀더 큰 섬유 직경을 보였다. 더 나아가, 대조군과 대조/IL-6(100 ㎍/㎏)군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p < 0.001; Dunnett 검정). 10 ㎍/㎏ 용량의 4-MC로 치료된 동물은 대조/운반제 군과 유의한 차이를 보이지 않았다(p = 0.628; Dunnett 검정).
미엘린 두께
미엘린 두께의 비교에서 9개군 사이에 유의한 차이가 확인되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA)(도 8). 미엘린 두께는 대조/운반제와 IL-6-치료된 동물보다 운반제/STZ 동물에서 현저하게 작았다(3, 10, 30, 100 ㎍/㎏)(p < 0.01; Dunnett 검정). 모든 IL-6 치료된/STZ 동물은 운반제/STZ 군보다 현저하게 높은 미엘린 두께를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더 나아가, 대조/운반제와 대조/IL-6(100 ㎍/㎏) 군 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; Dunnett 검정).
수초화 섬유의 전체 개수
도 9에 도시된 바와 같이, 수초화 섬유의 전체 개수에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 운반제/STZ 동물은 대조 동물보다 작은 개수의 섬유를 보였다(p < 0.001; Dunnett 검정). 대조적으로, IL-6-치료된/STZ 동물은 운반제/STZ 동물과 비교하여 증가된 개수의 섬유를 보유하였다(p < 0.001; Dunnett 검정). 4-MC로 치료된 STZ-중독된 동물은 대조 동물에서와 유사한 전체 개수의 섬유를 보유하였다. 더 나아가, 대조/운반제 군과 대조/IL-6(100 ㎍/㎏) 군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
결론
본 연구에서, 스트렙토조토신으로 중독되고 수일후에 당뇨병이 발병한 동물을 유도된-신경병증의 모델로 이용하였다. 동물은 유도후 3-4일에 당뇨병이 발병하였다.
당뇨성 동물은 D 30에 서로 다른 용량의 IL-6(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎏)으로 장기적으로 치료하였다. 치료제는 STZ-유도 10일후에 시작하여 유도이후 D 40에 동물을 죽일 때까지 매일 복강내 투여하였다. 연장된 고혈당증에 의해 유발된 첫 분자 손상이후에 IL-6이 투여된다는 점에서, 이런 치료는 근치적 치료로 간주된다.
본 프로토콜은 D 30의 IL-6 치료가 당뇨성 신경병증으로부터 신경보호를 유도한다는 것을 보여준다. 꼬리 도피와 EMG 검사(감각과 운동 속도)의 행동 분석은 특히 3과 10 ㎍/㎏의 용량에서 IL-6의 신경보호 효과를 보여준다.
저용량 및 높은 농도는 신경보호 효과를 보였다. 실제로, 치료 용량이 증가할수록 신경보호 효과가 덜 유의해졌다. 더 나아가, 최대 용량( 100㎍/㎏)은 명백한 효과를 보이지 않았고, STZ-동물의 전반적 행동에 독성 효과를 나타내는 것으로 보인다. 100 ㎍/㎏의 IL-6으로 치료된 대조 동물(STZ로 치료되지 않음)은 낮은 농도의 IL-6으로 치료된 운반제 대조 동물 또는 STZ 쥐보다 흥분하였다. 더 나아가, 이들 동물(IL-6 100 ㎍/㎏)은 실험자가 다루기 힘들었다. 이런 현상은 STZ/IL-6 100 ㎍/㎏에서도 관찰되었다. 하지만, 이들 동물은 조금 적게 흥분하였다(아마도, 체중의 대량 감소로 인한 약화로 인하여).
이런 신경보호 효과는 감각 섬유와 운동 섬유에 집중된다(CMAP 속도는 IL-6 치료로 변화되지 않았다).
형태학적 분석과 관련하여, IL-6 치료에 의해 유도된 신경보호는 모든 연구 용량에서 매우 명백하다. STZ/운반제 동물의 섬유는 수초의 감소 및 축색 돌기의 변화를 보였는데, 이는 최종적으로 섬유의 퇴행을 유도한다(섬유의 전체 개수에서 감소로 나타난다).
본 연구에서 IL-6(특히 10 ㎍/㎏) 치료는 미엘린 수초와 축색 돌기 퇴행을 보호하는 것으로 확인되었다.
고용량의 IL-6 (100 ㎍/㎏)은 건강한 동물에서 섬유에 유해한 효과를 유도한다. 실제로, 섬유가 피해를 입는데, 섬유의 손실이 없긴 하지만 수초 및 섬유의 전반적인 상태가 변화된다. 하지만, 대용량의 IL-6으로 치료된 당뇨성 동물에서는 이런 효과가 기록되지 않는다(독성 효과는 체중의 대량 감소로 특성화되는 동물의 전반적인 행동에 주로 집중된다).
결론적으로, IL-6은 섬유에 대한 직접적인 효과로 작용하고 신경퇴행의 염증 과정을 감소시킴으로써, D 30의 만성 치료이후 운동 섬유보다 감각에 분명한 신경보호 효과를 유도한다.
실시예 3: 피하 투여직후에 스트렙토조토신-유도된 당뇨성 신경병증에서 IL-6의 효과
재료와 방법
동물
연구 A
6주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest-St-lsle, France)는 무작위 표에 따라 6가지 실험군으로 구분하였다: (a) 염수-BSA 0.02 %(weight/volume)의 무균 용액이 주사된 운반제 대조군(n=4); (b) 염수-BSA 0.02 %의 무균 용액이 주사된 스트렙토조토신(STZ)-중독된 군(n=10); (c) 상이한 용량: 1, 3, 10, 30 ㎍/㎏의 IL-6 화합물이 매일 SC 주사된 동물로 구성되는 4가지 스트렙토조토신(STZ)-중독된 치료군(n=10).
이들은 집단 사육(우리당 2마리)하고, 온도(21-22℃)가 통제되고 어둠-밝음 사이클(12h/12h)이 반전되는 실내에 유지시키며, 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 규정에 맞게 실시하였다.
연구 B
6주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest-St-lsle, France)는 무작위 표에 따라 7가지 실험군으로 구분하였다: (a) 염수-BSA 0.02 %(weight/volume)의 무균 용액이 주사된 운반제 대조군(n=4); (b) 염수-BSA 0.02 %의 무균 용액이 주사된 스트렙토조토신(STZ)-중독된 군(n=10); (c) 상이한 용량: 1, 3, 10, 30 ㎍/㎏의 IL-6 화합물이 주 3회 SC 주사된 동물로 구성되는 4가지 스트렙토조토신(STZ)-중독된 치료군(n=10); (d) 10 ㎍/㎏의 IL-6 화합물이 IP 주사된 동물로 구성되는 스트렙토조토신(STZ)-중독된 치료군(n=10).
이들은 집단 사육(우리당 2마리)하고, 온도(21-22℃)가 통제되고 어둠-밝음 사이클(12h/12h)이 반전되는 실내에 유지시키며, 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 규정에 맞게 실시하였다.
연구 C
6주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest-St-lsle, France)는 무작위 표에 따라 6가지 실험군으로 구분하였다: (a) 염수-BSA 0.02 %(weight/volume)의 무균 용액이 주사된 운반제 대조군(n=4); (b) 염수-BSA 0.02 %의 무균 용액이 주사된 스트렙토조토신(STZ)-중독된 군(n=10); (c) 상이한 용량: 1, 3, 10, 30 ㎍/㎏의 IL-6 화합물이 주 1회 SC 주사된 동물로 구성되는 4가지 스트렙토조토신(STZ)-중독된 치료군(n=10).
이들은 집단 사육(우리당 2마리)하고, 온도(21-22℃)가 통제되고 어둠-밝음 사이클(12h/12h)이 반전되는 실내에 유지시키며, 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 규정에 맞게 실시하였다.
당뇨병의 유도 및 약리학적 처리
당뇨병은 외과적으로 노출된 좌측 사페나 마그나(saphena magna)에 체중 ㎏당 55 ㎎ 용량의 스트렙토조토신(Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, France) 완충액을 주사하여 유도하였다. 약물은 주사직전에 0.1 mol/ℓ 구연산염 완충액(pH 4.5)에 용해시켰다. STZ 주사 당일은 0일(D 0)로 간주하였다.
1주일후, D 10에서 꼬리 정맥혈은 혈당측정기(Glucotrend test, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 개별 동물에서 혈당증을 분석하였다. 260 ㎎/㎗ 미만의 값을 보이는 동물은 연구에서 배제하였다. 혈당증은 실험의 종결 시점, D 40에서 다시 한번 측정하였다.
치료(운반제와 IL-6)는 D 11에서 D 40까지 실시하였다.
실험의 계획
체중과 생존율은 매일 기록하였다.
꼬리 도피와 EMG 검사는 아래의 시점에서 주 1회 실시하였다:
D-7 : 기준선(꼬리 도피, 운동 활성, EMG)
D 0 : STZ 주사에 의한 당뇨병의 유도
D 10 : 혈당증의 측정
D 11 : 치료(IL-6)의 시작
D 24 : 꼬리 도피 검사
D 25 : OF(개활지)에서 운동 활성
D 26 : EMG 검사
D 38 : 꼬리 도피 검사
D 39 : OF에서 운동 활성
D 40 : 혈당증의 조절, EMG 검사, 좌골 신경의 제거
감수성 검사: 꼬리 도피
쥐의 꼬리는 열원으로 셔터-조절되는 램프(Bioseb, Paris, France)에 위치시켰다. 쥐가 열원으로부터 꼬리를 도피하기 이전의 잠복기(latency)를 기록하였다. 감각 변화는 도피의 잠복기를 증가시킨다. 2회 시험하여 평균값을 계산하고 특징적인 수치로 존속시켰다.
개활지에서 운동 활성
동물은 Plexiglas(80 x 80 x 40 ㎝) 개활지(OF)에 위치시켰다. 작업장은 16개의 동등한 사각형으로 분할하였다. 각 동물에서 자발적 운동 활성과 사육(rearing) 개체수는 10분 동안 기록하였다.
근전도(electromyography)
전기생리학적 기록은 Neuromatic 2000M 근전도계(EMG)(Dantec, Les Ulis, France)를 이용하여 실시하였다. 쥐는 60 ㎎/㎏ 케타민 클로르하이드레이트(Imalgene 500ㄾ,. Rhone Merieux, Lyon, France)를 복강내 주사하여 마취시켰다. 정상 체온은 가열 램프로 30℃에 유지시키고, 꼬리 표면에 위치된 접촉 온도계(Quick, Bioblock Scientific, Ilikirch, France)로 조절하였다.
복합 근육 활동 전압(CMAP)은 좌골 신경의 자극이후 비복근(gastrocnemius muscle)에서 기록하였다. 참고 전극과 활동성 바늘은 뒷발에 위치시켰다. 기초 바늘은 쥐의 아래쪽 등에 삽입하였다. 좌골 신경은 극최대 강도에서 단일 0.2 ms 펄스로 자극하였다. 운동 속도는 기록하고 ms로 표시하였다.
감각 신경 전도 속도(SNCV) 역시 기록하였다. 꼬리 피부 전극은 아래와 같이 위치시켰다: 참고 바늘은 꼬리의 기부에 삽입하고 양극 바늘은 참고 바늘로부터 꼬리 말단 방향으로 30 ㎜ 떨어져 위치시켰다. 기초 바늘 전극은 양극 바늘과 참고 바늘 사이에 삽입하였다. 꼬리 신경은 12.8 mA의 강도에서 일련의 20 펄스(0.2 ms 동안)로 자극하였다. 속도는 m/s로 표시하였다.
형태학적 분석
형태학적 분석은 연구의 종결 시점(D 40)에서 실시하였다. 동물은 100 ㎎/㎏ Imalgene 500ㄾ의 IP 주사로 마취시켰다. 좌골 신경의 5 ㎜-분절은 조직검사를 위하여 절제하였다. 조직은 인산염 완충액(pH = 7.4)에 녹인 4 % 글루타르알데하이드(Sigma, L'isle d'Abeau-Chesnes, France) 용액으로 하룻밤동안 고정시키고 사용 때까지 30% 수크로오스 + 4℃에 유지시켰다. 신경 시료는 인산염 완충액에 녹인 2 % 오스뮴 테트록사이드(Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) 용액에 2시간동안 고정시키고 일련의 알코올 용액에서 탈수시키며 Epon에 포매시켰다. 이후, 포매된 조직은 3일간의 중합화동안 +70℃에 유지시켰다. 마이크로톰(microtome)으로 1.5 ㎛의 횡단 절편을 절단하고 2분동안 1 % 톨루이딘 블루 용액(Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France)으로 염색하고 탈수시키며 Eukitt에 올려놓았다. 광학현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 시료당 20개 절편을 검사하고, 반-자동화된 디지털 이미지 영상 분석 소프트웨어(Biocom, France)로 6개의 무작위 선택된 조각을 분석하였다. 조각당 2개의 무작위 선택된 필드를 조사하였다. 아래의 파라미터를 계산하였다: (a) 섬유 직경, (b) 축색 돌기 직경, (c) 미엘린 두께.
신경 절편당 섬유의 전체 개수를 계산하기 위하여, 시료당 3개의 조각을 무작위로 선택하고 조각당 2개의 필드를 분석하였다.
데이터 분석
데이터의 전체적인 분석은 변이의 한 인자 또는 반복된 분산분석(ANOVA)과 일원 ANOVA로 실시하였다. ANOVA 검정에서 유의한 차이가 확인되면 Dunnett 검정을 실시하였다. post-hoc 분석은 실시하지 않았다. 유의성 수준은 p < 0.05로 설정하였다. 결과는 평균 ㅁ 표준 오차(s.e.m)로 표시한다.
결과
연구 A
동물 체중
도 11에 도시된 바와 같이, 체중 변화에서 군간 유의한 차이가 본 연구에서 확인되었다[f(5, 185) = 9.20과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 5부터 D 40까지, STZ-중독된/IL-6-치료된 동물은 체중에서 현저한 감소를 보였다(p < 0.05; 일원 ANOVA 및 p < 0.05 대조 versus(vs) STZ; 대조 vs STZ + IL-6; Dunnett 검정).
10 ㎍/㎏ 용량의 IL-6으로 치료된 당뇨성 동물은 다른 용량의 IL-6에서보다 현저하게 높은 체중을 보였다[f(4, 148) = 2.93과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA].
혈당증
도 12에서는 D 10에 대조 동물이 120 ㎎/㎗에 필적하는 혈당증 수치를 갖는다는 것을 도시한다. 다른 한편, STZ-중독된 쥐는 260 ㎎/㎗보다 높은 혈장 글루코오스 농도를 보이고 당뇨성으로 간주되었다.
STZ-중독된 쥐는 D 41에도 여전히 당뇨성인 것으로 확인되었다(STZ/IL-6(10 ㎍/㎏) 군의 nㅀ2 쥐는 260 ㎎/㎗ 미만의 혈당증으로 인하여 본 연구에서 제외되었다).
감수성 검사: 꼬리 도피
꼬리-도피 결과의 변화에서 군간 유의한 차이가 관찰되지 않았다[F(5, 10) = 1.81과 p = 0.072; 반복 측정 ANOVA](도 13). 하지만, 쥐가 열원으로부터 꼬리를 도피하기 이전의 잠복기(latency)는 치료되지 않은 당뇨성 동물과 좀더 높은 용량의 IL-6으로 치료된 동물에서 증가하였다. D 38에서, 반응 시간은 1과 3 ㎍/㎏ 용량의 IL-6으로 치료된 동물에서 증가하지 않았다. 실제로, 이들 군간 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05; Dunnett 검정).
OF에서 운동 활성
도 14A와 14B에 도시된 바와 같이, 전체 연구 기간동안 교차 스퀘어(crossed square)의 개수와 사육(rearing)에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[각각, F(5, 10) = 5.99와 p < 0.001 및 F(5, 10) = 4.22와 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 25와 D 40에, 당뇨성 동물은 치료에 상관없이 낮은 운동 활성을 보이는데, 이는 교차 스퀘어의 개수와 사육의 현저한 감소로 특성화된다(대조 vs STZ/운반제 및 대조 vs STZ/IL-6 p < 0.01; Dunnett 검정).
1과 3 ㎍/㎏ 용량으로 치료된 동물은 STZ/운반제 쥐보다 높은 운동 활성을 보였다.
전기생리학적 측정
복합 근육 활동 전압의 잠복기
전체 연구 기간동안 CMAP의 잠복기에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(5, 10) = 5.71과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. 잠복기는 치료되지 않은 당뇨성 쥐에서 현저하게 증가하였다(D 26과 D 41: p < 0.001; 일원 ANOVA). 더 나아가, 이런 증가는 IL-6-치료된 군에서 덜 중요하였다(도 15).
D 26일과 D 41일에, 각 STZ/IL-6-치료된 군은 STZ/운반제 군의 CMAP 잠복기보다 현저하게 짧은 CMAP 잠복기를 보였다(p = 0.05; Dunnett 검정).
감각 신경 전도 속도
전체 연구 기간동안 SNCV에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(5, 10) = 3.78과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA](도 16). 당뇨성 쥐는 대조/부형약 군과는 대조적으로 SNCV의 유의한 감소를 보였다(D 26과 D 41: p < 0.01; 일원 ANOVA).
D 26과 D 41에, 모든 IL-6 치료된 동물은 STZ/운반제 군과 유의한 차이를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정). 더 나아가, D 41에 대조/부형약 군과 3과 30 ㎍/㎏ IL-6-치료된 군 사이에서는 유의한 차이가 관찰되지 않고(각각, p = 0.054와 p = 0.184; Dunnett 검정), 반면 모든 다른 군에서는 유의한 차이가 관찰되었다.
형태학적 분석
섬유 직경
도 17에 도시된 바와 같이, 섬유 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 대조/운반제 군과 비교하여 섬유 직경의 감소가 당뇨성 쥐에서 관찰되었다(p < 0.001; Dunnett 검정). 더 나아가, 모든 검사된 용량에서 IL-6 치료는 이런 직경 감소를 현저하게 예방한다(STZ/운반제 군 vs STZ/IL-6-치료된 군: p < 0.05; Dunnett 검정).
축색 돌기 직경
축색 돌기 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA)(도 18). 운반제/STZ 군은 축색 돌기 직경의 현저한 감소를 보였다(대조/운반제 vs STZ/운반제: p < 0.001; Dunnett 검정). 모든 검사 용량의 IL-6으로 치료된 동물은 치료되지 않은 당뇨성 쥐보다 현저하게 높은 축색 돌기 직경을 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
미엘린 두께
미엘린 두께에서 군간 유의한 차이가 확인되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA)(도 19). 대조/운반제 동물과 비교하여 미엘린 두께의 현저한 감소가 당뇨성 쥐에서 관찰되었다(p < 0.001; Dunnett 검정). 더 나아가, 이런 감소는 IL-6-치료된 군에서 훨씬 덜 중요하였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
퇴행 섬유의 비율
도 20과 21에 도시된 바와 같이, 치료되지 않은 당뇨성 쥐는 수초화 섬유의 현저한 감소를 보였다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 매일 3, 10, 30 ㎍/㎏ 용량의 IL-6 치료는 STZ/운반제 군과 비교하여 퇴행 섬유의 비율을 현저하게 감소시켰다(p < 0.001; Dunnett 검정).
연구 B
동물 체중
체중 변화에서 군간 유의한 차이가 확인되었다[f(6, 168) = 9.24와 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA](도 22). D 5부터 D 40까지, STZ-중독된 동물은 체중에서 현저한 감소를 보였다(p < 0.05; 일원 ANOVA 및 p < 0.001 대조/운반제 vs STZ; 대조/운반제 vs STZ-IL-6-치료된 군; Dunnett 검정).
D 5에서 D 40까지 체중에서 STZ/IL-6-치료된 군 사이에 유의한 차이는 확인되지 않았다[f(5, 125) = 1.08과 p = 0.26; 반복 측정 ANOVA].
혈당증
도 23에서 도시된 바와 같이, D 10에 STZ-중독된 쥐는 260 ㎎/㎗보다 높은 혈장 글루코오스 농도를 보이고, 반면 대조 동물은 대략 100 ㎎/㎗의 혈당증 수치를 보였다.
더 나아가, D 40에서 STZ-중독된 쥐는 혈당증이 500 ㎎/㎗ 이상으로 여전히 당뇨성이었다.
감수성 검사: 꼬리 도피
꼬리-도피 결과의 변화에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(6, 12) = 2.13과 p = 0.02; 반복 측정 ANOVA](도 24). D 24와 D 38에, 치료되지 않은 당뇨성 쥐는 대조/운반제 및 STZ/IL-6-치료된 군과 비교하여 현저하게 증가된 반응 시간을 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
더 나아가, 이런 반응 시간은 10과 30 ㎍/㎏ 용량의 IL-6으로 치료된 동물에서 덜 증가하였다.
OF에서 운동 활성
도 25A와 25B에 도시된 바와 같이, 전체 연구 기간동안 교차 스퀘어(crossed square)의 개수와 사육(rearing)에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[각각, F(5, 10) = 와 p < 0.001 및 F(5, 10) = 와 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 25와 D 40에, 당뇨성 동물은 치료에 상관없이 낮은 운동 활성을 보이는데, 이는 교차 스퀘어의 개수와 사육의 현저한 감소로 특성화된다(대조 vs STZ/운반제 및 대조 vs STZ/IL-6 p < 0.05; Dunnett 검정).
전기생리학적 측정
복합 근육 활동 전압의 잠복기
전체 연구 기간동안 CMAP의 잠복기에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(6, 12) = 3.97과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 26과 D 40에, 치료되지 않은 당뇨성 쥐 및 낮은 용량의 IL-6으로 치료된 동물에서 잠복기의 현저한 증가가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 더 나아가, 대조/운반제 군과 STZ/IL-6-치료된(10과 30 ㎍/㎏) 군 사이에 유의한 차이는 확인되지 않았다(p > 0.05; 일원 ANOVA).
감각 신경 전도 속도
전체 연구 기간동안 SNCV에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(6, 12) = 3.38과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA](도 27). D 26이후로, 치료되거나 치료되지 않은 당뇨성 쥐는 SNCV의 감소를 보였다(D 26: p < 0.001 및 D 40: p < 0.001; 일원 ANOVA).
D 26에, 대조/운반제 동물과 STZ/IL-6-치료된 동물은 STZ/운반제 쥐보다 현저하게 높은 SNCV를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
D 40에, 좀더 높은 용량으로 치료된 쥐는 STZ/운반제 군보다 훨씬 의미있는 SNCV 값을 보였다.
형태학적 분석
섬유 직경
도 28에 도시된 바와 같이, 섬유 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.045; 일원 ANOVA). STZ-중독된 동물은 대조/운반제 쥐와 비교하여 섬유 직경의 현저한 감소를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정). IL-6으로 매일 IP 치료는 이런 섬유 직경 감소를 예방하였다(STZ/운반제 vs STZ/IL-6 IP: p = 0.026; Dunnett 검정).
축색 돌기 직경
축색 돌기 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p = 0.034; 일원 ANOVA)(도 29). STZ-중독된 동물에서 축색 돌기 직경의 현저한 감소가 관찰되었다(p < 0.05; Dunnett 검정). IP 경로로 10 ㎍/㎏ IL-6 치료를 받은 쥐는 STZ/운반제 동물과 유의한 차이를 보였다(p = 0.045; Dunnett 검정).
미엘린 두께
미엘린 두께에서 군간 유의한 차이가 확인되었다(p = 0.05; 일원 ANOVA)(도 30). STZ-중독된 동물은 미엘린 두께의 현저한 감소를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정). IL-6으로 매일 IP 치료는 이런 미엘린 두께 감소를 예방하였다(STZ/운반제 vs STZ/IL-6 IP: p < 0.005; Dunnett 검정).
퇴행 섬유의 비율
도 31과 32에 도시된 바와 같이, 퇴행 섬유의 비율에서 군간 유의한 차이가 확인되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 이런 비율은 대조/운반제 군보다 STZ/운반제 군에서 현저하게 높았다(p < 0.001; Dunnett 검정). 비율은 IL-6-치료된 동물에서 현저하게 감소하였다(STZ/운반제 vs STZ/IL-6: p < 0.001; Dunnett 검정).
연구 C
동물 체중
도 33에 도시된 바와 같이, 전체 연구 기간동안 체중 변화에서 군간 유의한 차이가 확인되었다[f(5, 145) = 15.46과 p < 0.001; 반복 측정 ANOVA]. D 5부터 D 40까지, STZ-중독된 동물은 체중에서 현저한 감소를 보였다(p < 0.001; 일원 ANOVA 및 p < 0.001 대조/운반제 vs STZ; 대조/운반제 vs STZ-IL-6-치료된 군; Dunnett 검정).
더 나아가, 30 ㎍/㎏ IL-6으로 치료된 동물은 다른 IL-6 치료된 군보다 현저하게 의의가 덜한 체중 감소를 보였다[f(4, 104) = 2.17과 p = 0.001; 반복 측정 ANOVA].
혈당증
도 34에서 도시된 바와 같이, 대조/운반제 군은 D 10과 D 40에 120 ㎎/㎗보다 낮은 혈당증 수치를 보였다. 다른 한편, STZ-중독된 쥐는 260 ㎎/㎗보다 높은 혈장 글루코오스 농도를 보였고, 따라서 D 10과 D 40에서 당뇨성으로 간주되었다.
감수성 검사: 꼬리 도피
전체 연구 기간동안 반응 시간에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(5, 10) = 2.30과 p = 0.02; 반복 측정 ANOVA](도 35). 쥐가 열원으로부터 꼬리를 도피하기 이전의 잠복기(latency)는 STZ/운반제 동물에서 현저하게 증가하였다(D 24와 D 38: p < 0.005; 일원 ANOVA). D 24에, 대조/운반제와 STZ/IL-6(30 ㎍/㎏) 군 사이에 반응 잠복기에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p = 0.31; Dunnett 검정). D 38에, 10과 30 ㎍/㎏ IL-6으로 치료된 쥐는 대조 동물과 유사한 반응 시간을 보였다(p = 0.3; Dunnett 검정).
OF에서 운동 활성
전체 연구 기간동안 교차 스퀘어(crossed square)의 개수와 사육(rearing)에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[각각, F(5, 10) = 와 p < 0. 및 F(5, 10) = 2.15와 p = 0.028; 반복 측정 ANOVA](도 36A와 36B).
D 25와 D 39에, STZ-중독된 동물은 치료에 상관없이 대조 쥐보다 현저하게 낮은 운동 활성을 보인다. 이런 차이는 전체 연구 기간동안 교차 스퀘어의 평균 개수와 사육의 개체수에 확인되었다. 30 ㎍/㎏ 용량의 IL-6으로 치료된 동물군은 STZ/운반제 군보다 높은 운동 활성을 보였다.
전기생리학적 측정
복합 근육 활동 전압의 잠복기
전체 연구 기간동안 CMAP의 잠복기에서 군간 유의한 차이가 관찰되지 않았다[F(5, 10) = 1.33과 p = 0.23; 반복 측정 ANOVA](도 37). 하지만, D 26과 D 40에 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.05; 일원 ANOVA). STZ-중독된 쥐는 대조/운반제 군과 비교하여 증가된 잠복기를 보였다. 더 나아가, 이런 증가는 고용량의 IL-6으로 치료된 군에서 의의가 덜하였다, 실제로 유의한 차이는 STZ/운반제와 STZ/IL-6 군에서 관찰되었다(D 26: STZ/운반제 vs 3, 10, 30 ㎍/㎏에서 STZ/IL-6: P < 0.005 및 D 40: STZ/운반제 vs 30 ㎍/㎏에서 STZ/IL-6: P < 0.005; Dunnett 검정).
감각 신경 전도 속도
도 38에 도시된 바와 같이, 전체 연구 기간동안 감각 신경 전도 속도(SNCV)에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다[F(5, 10) = 2.18과 p = 0.025; 반복 측정 ANOVA]. 속도의 현저한 감소는 STZ-중독된 동물에서 관찰되었다(대조/운반제 vs STZ/운반제 및 STZ/IL-6군: p < 0.05; Dunnett 검정). 이에 더하여, 10과 30 ㎍/㎏ IL-6으로 치료는 당뇨성 동물에서 의의가 덜한 속도 상실을 유도한다(D 26에, 10과 30 ㎍/㎏에서 STZ/IL-6 vs STZ/운반제: p < 0.05; Dunnett 검정).
형태학적 분석
섬유 직경
도 39에 도시된 바와 같이, 섬유 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). STZ-중독된 동물은 대조/운반제 쥐와 비교하여 섬유 직경의 현저한 감소를 보였다(p < 0.005; Dunnett 검정). IL-6 치료된 동물(모든 용량에서)은 STZ/운반제 쥐보다 현저하게 높은 섬유 직경을 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
축색 돌기 직경
축색 돌기 직경에서 군간 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA)(도 40). STZ-중독된 동물에서 축색 돌기 직경의 현저한 감소가 관찰되었다(p < 0.01; Dunnett 검정). 1, 3, 10, 30 ㎍/㎏ IL-6 치료를 받은 쥐는 STZ/운반제 동물과 유의한 차이를 보였다(p < 0.05; Dunnett 검정).
미엘린 두께
미엘린 두께에서 군간 유의한 차이가 확인되었다(p < 0.01; 일원 ANOVA)(도 41). STZ-중독된 동물은 미엘린 두께의 현저한 감소를 보였다(p < 0.001; Dunnett 검정). IL-6으로 매일 SC 치료는 이런 미엘린 두께 감소를 예방하였다(STZ/운반제 vs 1과 30 ㎍/㎏에서 STZ/IL-6: p < 0.005; Dunnett 검정).
퇴행 섬유의 비율
도 42와 43에 도시된 바와 같이, 기능성 수초화 섬유의 비율에서 군간 유의한 차이가 확인되었다(p < 0.001; 일원 ANOVA). 이런 비율은 대조/운반제 군보다 STZ/운반제 군에서 현저하게 낮았다(p < 0.001; Dunnett 검정). 비율은 3, 10, 30 ㎍/㎏ IL-6으로 치료된 동물에서 현저하게 증가하였다(p < 0.001; Dunnett 검정).
결론
본 연구에서, 스트렙토조토신으로 중독되고 수일후에 당뇨병이 발병한 동물을 유도된-신경병증의 모델로 이용하였다.
당뇨성 동물은 D 30에 서로 다른 용량의 IL-6(1, 3, 10, 30 ㎍/㎏)으로 장기적으로 치료하였다. 치료제는 STZ-유도 10일후에 시작하여 유도이후 D 40에 동물을 죽일 때까지 매일 피하(연구 A), 주 3회(연구 B), 주 1회(연구 C) 투여하였다. 연장된 고혈당증에 의해 유발된 첫 분자 손상이후에 IL-6이 투여된다는 점에서, 이들 치료는 근치적 치료로 간주된다.
본 프로토콜은 D 30의 IL-6 치료가 투여 스케줄에 상관없이, 당뇨성 신경병증으로부터 신경보호를 유도한다는 것을 보여준다. 꼬리 도피와 EMG 검사(감각과 운동 속도)의 행동 분석은 피하 경로에 의해 투여된 IL-6의 신경보호 효과를 보여준다.
이런 신경보호 효과는 감각 섬유와 운동 섬유에 집중된다(CMAP 속도는 IL-6 화합물 치료로 변화되지 않았다). 상기 화합물은 섬유에서 수초의 상실 및 퇴행을 예방한다.
매일 IP 치료(Neurofit, August 2001)와 대조적으로, 피하 경로로 매일 투여된 IL-6은 모든 검사 용량에서 복강내 치료(실시예 2)만큼 유효한 것으로 보인다. 게다가, 주 1회 또는 3회 IL-6 투여로 특성화되는 저용량은 상기 화합물의 신경보호 효과의 감소를 유발하지 않는다. 주 3회 치료(특히, 10과 30 ㎍/㎏)가 STZ 동물의 전반적인 행동에 대한 부작용없이, 최적의 신경보호 효과를 보이는 것으로 보인다.
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Claims (20)

  1. 당뇨성 신경병증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 gp130을 통하여 신호하는 물질의 용도.
  2. 제 1 항에 있어서, 당뇨성 신경병증은 다중신경병증인 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1 항에 있어서, 당뇨성 신경병증은 단일신경병증인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 물질은
    a) IL-6;
    b) gp80에 결합하고 gp130을 통하여 신호하는 a)의 단편;
    c) a) 또는 b)와 적어도 70% 서열 동일성을 보유하고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
    d) 중간 수준으로 엄격한 조건하에 a) 또는 b)를 인코드하는 고유 DNA 서열의 보체와 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코드되고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
    e) gp130을 통하여 신호하는 a), b), c) 또는 d)의 염, 융합 단백질 또는 기능성 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 4 항에 있어서, IL-16은 재조합 IL-6인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 물질은
    a) IL-6R/IL-6 키메라;
    b) gp130에 결합하고 gp130을 통하여 신호하는 a)의 단편;
    c) a) 또는 b)와 적어도 70% 서열 동일성을 보유하고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
    d) 중간 수준으로 엄격한 조건하에 a) 또는 b)를 인코드하는 고유 DNA 서열의 보체와 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코드되고 gp130을 통하여 신호하는 a) 또는 b)의 변이체;
    e) gp130을 통하여 신호하는 a), b), c) 또는 d)의 염, 융합 단백질 또는 기능성 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 물질은 하나이상의 부위에서 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 있어서, 물질은 당화되지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 4 항 내지 8 항중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 4 항 내지 9 항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 유도체는 아미노산에서 측쇄로 발생하는 한가지이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 성분(moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 10 항에 있어서, 성분은 폴리에틸렌 성분인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 0.1 내지 1000 ㎍/㎏, 1 내지 500 ㎍/㎏, 또는 100㎍/㎏ 미만의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 12 항에 있어서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 1 ㎍/㎏, 3 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏ 또는 30 ㎍/㎏의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 매일 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 1 항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 주 3회 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 1 항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, gp130을 통하여 신호하는 물질은 주 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 당뇨성 신경병증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 세포에서 IL-6의 내인성 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 용도.
  18. 당뇨성 신경병증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 정의된 물질을 생산하도록 유전자 조작되는 세포의 용도.
  19. 당뇨성 신경병증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 정의된 물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도.
  20. 당뇨성 신경병증을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 정의된 물질의 효과량 및 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체를 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
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