HRP20040292A2 - USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY - Google Patents

USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY

Info

Publication number
HRP20040292A2
HRP20040292A2 HR20040292A HRP20040292A HRP20040292A2 HR P20040292 A2 HRP20040292 A2 HR P20040292A2 HR 20040292 A HR20040292 A HR 20040292A HR P20040292 A HRP20040292 A HR P20040292A HR P20040292 A2 HRP20040292 A2 HR P20040292A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
stz
substance
animals
use according
treatment
Prior art date
Application number
HR20040292A
Other languages
English (en)
Inventor
Dreano Michel
Vitte Pierre-Alain
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N.V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Publication of HRP20040292A2 publication Critical patent/HRP20040292A2/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/204—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Prisutni izum odnosi se na područje diabetes mellitusa i poremećaja perifernog živčanog sustava. Točnije, odnosi se na upotrebu tvari koje signaliziraju preko gp130 u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije. IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimer preferirano se upotrebljavaju u ovoj specifičnoj medicinskoj indikaciji.
Pozadina izuma
Diabetes mellitus je poremećaj metabolizma ugljikohidrata, tj. sindrom okarakteriziran hiperglikemijom koja nastaje kao posljedica apsolutnog ili relativnog smanjenja izlučivanja inzulina i/ili djelovanja inzulina.
Klasifikacija diabetesa mellitusa bazira se na onoj koju prihvaća Nacionalna skupina podataka o dijabetesu i WHO. Prethodno, klasifikacija se bazirala na dobi pojedinca u kojoj je došlo do pojave bolesti, trajanju i komplikacijama bolesti. Trudnički diabetes mellitus je ugljikohidratna netolerantost promjenjive jačine koji se javlja ili prvi put prepoznaje tijekom trudnoće. Kod pacijenata s tipom I diabetesa mellitusa (DM), koji je također poznat kao DM ovisan o inzulinu (IDDM) ili dijabetes koji se pojavljuje u mladenačkoj dobi može se razviti dijabetička ketoacidoza (DKA). Kod pacijenata s tipom II DM, koji je također poznat kao DM neovisan o inzulinu (NIDDM) može se razviti neketotička hiperglikemična hiperosmolarna koma (NKHHC). Općenite kasne mikrovaskularne komplikacije su retinopatiija, nefropatija, te periferne i autonomne neuropatije. Makrovaskurarne komplikacije uključuju ateroskleroznu koronarnu, te perifernu arterijsku bolest.
Tip I diabetesa mellitusa: Iako se može javiti u bilo kojoj dobi, tip I diabetesa mellitusa uobičajeno se razvija u djetinstvu ili pubertetu, te predstavlja najčešći tip DM koji se dijagnosticira prije 30. godine života. Taj tip dijabetesa javlja se u oko 10 do 15% svih slučajeva DM, a klinički je okarakteriziran hiperglikemijom i sklonošću dijabetičkoj ketoacidozi. Gušterača stvara malo inzulina ili ga uopće ne stvara.
Oko 80% pacijenata s tipom I DM ima specifične HLA fenotipe povezane s detektabilnim serumskim citoplazmatskim antitijelima odvojenih stanica i površinskim antitijelima odvojenih stanica (u sličnom omjeru nađena su antitijela na dekarboksilazi glutaminske kiseline i na inzulinu).
Kod tih pacijenata, tip I diabetesa mellitusa nastaje iz genetički susceptibilnog, selektivnog uništenja 90% stanica koje izlučuju inzulin, a kojim posreduje imunološki sustav. Odvojene stanice gušterače pokazuju inzulitis koji je okarakteriziran infiltracijom T limfocita popraćene s makrofagima i B limfocitima, te gubitkom većine beta-stanica, bez uplitanja alfa-stanica koje izlučuju glukagon. Antitjela prisutna u dijagnozi obično nakon nekoliko godina postaju nedetektabilna. Ona isprva mogu predstavljati odgovor na uništenje beta-stanica, no neka su citotoksična za beta-stanice i mogu pridonjeti njihovom gubitku. Klinički, kod nekih se pacijenata tip I DM može javiti godinama nakon neprimjetne pojave autoimunog procesa. Zaštita tih antitijela uključena je u brojnim preventivnim istraživanjima.
Tip II diabetesa mellitusa: Tip II DM je obično tip dijabetesa koji se dijagnosticira kod pacijenata starijih od 30 godina, no također se može javiti i u djetinjstvu, te pubertetu. Klinički je okarakteriziran hiperglikemijom i rezistencijom na inzulin. Dijabetička ketoacidoza je rijetka. Iako se većina pacijenata liječi dijetom, fizičkom aktivnošću i oralnim lijekovima, nekim je pacijentima periodično ili trajno potreban inzulin za kontroliranje simptomatske hiperglikemije i sprečavanje neketotičke hiperglikemične hiperosmolarne kome. Postotak podudaranja za tip II DM kod monozigotnih blizanaca je > 90%. Tip II DM obično je povezan s pretilosti, pogotovo gornjeg dijela tijela (trbuh/trbušna šupljina) i često se javi nakon perioda dobivanja na težini. Oslabljena tolerancija glukoze povezana sa starenjem blisko je vezana s tipičnim dobitkom na težini. Pacijenti tipa II DM s pretilošću u području trbuha/trbušne šupljine mogu imati normalne razine glukoze nakon mršavljenja.
Tip II DM predstavlja heterogenu skupinu poremećaja u kojima hiperglikemija nastaje kao posljedica oslabljenog odgovora izlučivanja inzulina i smanjene inzulinske učinkovitosti u stimuliranju unosa glukoze skeletnim mišićem i u spriječavanju stvaranja glukoze u jetri (inzulinska rezistencija). Inzulinska rezistencija je česta, no neće se kod svih pacijenata s inzulinskom rezistencijom javiti dijabetes, jer ga tijelo kompenzira odgovarajućim porastom izlučivanja inzulina. Inzulinska rezistencija kod tipa II DM ne nastaje kao posljedica genetskih alternacija u inzulinskim receptorima ili prenosnicima glukoze, nego genetički predodređeni postreceptorski intracelularni defekti vjerovatno imaju ulogu u pojavi inzulinske rezistencije. Hiperinzulinemija, koja nastaje kao posljedica toga, može uzrokovati pojavu ostalih stanja, kao što su pretilost (trbušna), hipertenzija, hiperlipidemija i koronarna arterijska bolest (sindrom inzulinske rezistencije).
Smatra se da su genetički faktori ključni čimbenici za razvoj tipa II DM, no još nije dokazana veza između tipa II DM i specifičnih HLA fenotipa ili citoplazmatskih antitijela odvojenih stanica. Iznimka je podskup odraslih pacijenata koji nisu pretili s detektabilnim citoplazmatskim antitijelima odvojenih stanica koje nose jedan od HLA fenotipa i koje eventualno mogu razviti tip I DM.
Prije nego što se razvije dijabetes, pacijenti općenito gube rani odgovor izlučivanja inzulina na glukozu i mogu izlučivati relativno velike količine proinzulina. Kod dijagnosticiranog dijabetesa, iako kod pacijenata s tipom II DM razine inzulina u plazmi u fazi smanjenog unosa hrane mogu biti normalne ili čak povišene, izlučivanje inzulina stimulirano glukozom očito se smanjuje. Smanjene razine inzulina smanjuju pak unos glukoze kojim posreduje inzulin i ne uspijevaju spriječiti stvaranje inzulina u jetri.
Hipoglikemija ne mora isklučivo biti posljedica, nego također može uzrokovati i smanjene u toleranciji glukoze kod dijabetičara (glukozna toksičnost) zato što hiperglikemija smanjuje osjetljivost inzulina i pojačava stvaranje glukoze u jetri. Jednom kad se poboljša pacijentova metabolička kontrola, obično se smanjuje doza inzulina ili hipoglikemičnog lijeka.
Neki slučajevi tipa II DM javljaju se kod mladih ljudi, nepretilih adolescenata (dijabetes odraslih koji se javlja u mlađoj dobi [MODY]) s autosomalnom dominantnom nasljednosti. Kod mnogih obitelji s MODY javlja se mutacija u glukokinaznom genu. Kod tih pacijenata dokazano je smanjenje u izlučivanju inzulina i u regulaciji glukoze u jetri.
Inzulinopatije su rijetki slučajevi DM, s kliničkim karakteristikama tipa II DM koje nastaju iz heterozignih nasljednih osobina defektivnog gena koji dovodi do izlučivanja inzulina koji se ne veže normalno na inzulinske receptore. Takvi pacijenti imaju izrazito povišene razine imunoreaktivnog inzulina u plazmi koje su povezane s normalnim glukoznim odgovorima u plazmi na egzogeni inzulin.
Dijabetes se također može dovesti u vezu s bolestima gušterače: Kronični pankreatitis, pogotovo kod alkoholičara, često je vezan uz dijabetes. Takvi pacijenti gube odvojene stanice koje izlučuju inzulin, te one koje izlučuju glukagon. Zato oni mogu biti blago hipoglikemični, te osjetljivi na niske doze inzulina. U nedostatku učinkovite proturegulacije (egzogenog inzulina kojeg ne ometa glukagon), kod njih se brzo javlja hipoglikemija. U Aziji, Africi i Karibima, DM se često opaža kod mladih ljudi, izrazito pothranjenih pacijenata s ozbiljnom proteinskom deficijencijom i bolesti gušterače; takvi pacijenti nisu skloni dijabetičkoj ketoacidozi, no potreban im je inzulin.
Dijagnoza dijabetesa mellitusa: Kod asimptomatičnih pacijenata, DM se dijagnosticira kada su zadovoljeni dijagnostički kriteriji hiperglikemije u gladovanju: razina glukoze u plazmi (serumu) > = 140 mg/dL (> = 7,7 mmol/L) nakon noćnog posta u dva slučaja kod odraslog čovjeka i djeteta.
Oralni test tolerancije glukoze može biti koristan za dijagnosticiranje tipa II DM kod pacijenata kod kojih je vrijednost glukoze u gladovanju između 115 i 140 mg/dL (6,38 i 7,77 mmol/L), te kod onih kod kojih je prisutno kliničko stanje koje može biti vezano uz nedijagnosticiran DM (npr. polineuropatija, retinopatija).
Liječenje diabetesa mellitusa: Hipoglikemija je odgovorna za većinu dugoročnih mikrovaskularnih komplikacija dijabetesa. Dokazan je linearan odnos između razina Hb A1C (vidi ispod) i stupnja u kojem se razvijaju komplikacije. Druga istraživanja su sugerirala da Hb A1C < 8% je prag ispod kojeg se može spriječiti većina komplikacija. Zbog toga bi se za liječenje tipa I DM trebala pokušati pojačati metabolička kontrola do niže vrijednosti Hb A1C da bi se izbjegle hipoglikemične epizode. Liječenje se mora individualizirati, te modificirati u slučaju da okolnosti tvore bilo kakav rizik od hiperglikemije neprihvatljivim (npr. kod pacijenata s kratkim očekivanim vijekom života, te kod pacijenata sa cerebrovaskularnom ili srčanom bolesti) ili u slučaju da je kod pacijenta povećan rizik od hipoglikemije (npr. kod nepouzdanih pacijenata ili kod onih s autonomnom neuropatijom).
Kod pacijenata koji boluju od tipa II DM s prekomjernom težinom za postizanje smanjenja težine najvažnija je dijeta. Ako se poboljšanje u hipoglikemiji ne uspije postići dijetom, trebalo bi se započeti s primjenom oralnog lijeka.
Pacijenta bi trebalo redovito pregledavati da bi se na vrijeme uočili znakovi ili simptomi komplikacija, uključujući pregled stopala, pulsa i osjeta u stopalima i nogama, te test urina za albumin. Periodična laboratorijska ispitivanja uključuju profil lipida, BUN (dušik iz uree u krvi) i razine serumskog kreatinina, ECG, te kompletan oftalmološki pregled jednom godišnje.
Hiperkolesterolemija ili hipertenzija povećava rizik od specifičnih kasnih komplikacija, te zahtjeva posebnu pažnju i odgovarajuće liječenje. Iako se kod većine dijabetičara na siguran način mogu upotrijebiti agensi koji blokiraju beta-adrenergične receptore (β-blokatori, kao što je propanolol), oni mogu maskirati β-adrenergične simptome hipoglikemije koju uzrokuje inzulin ili mogu oslabiti normalan proturegulacijski odgovor. Zbog toga su često ACE i antagonisti kalcija lijekovi izbora.
Praćenje glukoze u plazmi trebali bi provoditi svi pacijenti, a pacijente koji se liječe inzulinom trebalo bi podučiti kako sukladno tome podesiti dnevnu dozu inzulina. Razine glukoze mogu se ispitivati kućnim analizatorima, laganim za upotrebu, uz kap krvi iz prsta. Za dobivanje uzorka krvi iz prsta preporučuje se lanceta koja radi na principu opruge. Učestalost ispitivanja određuje se individualno. Pacijenti koji se liječe inzulinom u idealnom slučaju bi trebali dnevno ispitivati glukozu u plazmi prije obroka, 1 do 2 sata nakon obroka i prije spavanja.
Većina liječnika periodično određuje glikozilirani hemoglobin (Hb A1C) za procjenu kontrole glukoze u plazmi tijekom prethodnih 1 do 3 mjeseca. Hb A1C je stabilan produkt glikozilacije Hb glukozom iz plazme kojom ne posreduju enzimi, te se formira brzinom koja se povećava porastom razina glukoze u plazmi. U većini laboratorija je normalna vrijednost razine Hb A1C oko 6%; kod dijabetičara koji se slabo kontroliraju raspon razina je od 9 do 12%. Hb A1C nije specifičan test za dijagnosticiranje dijabetesa, no povišeni Hb A1C često ukazuje na postojanje dijabetesa.
Slijedeći test određuje razinu fruktozamina. Fruktozamin nastaje kemijskom reakcijom glukoze s proteinom iz plazme, te odražava kontrolu glukoze u prethodnih 1 do 3 tjedana. Dakle, to ispitivanje može pokazati promjenu u kontroli prije nego Hb A1C, a često je korisno kada se primjenjuje invazivno liječenje, te u dugoročnim kliničkim pokušajima liječenja.
Vezano uz liječenje inzulinom, humani inzulin se često preferira kod inicijacijskog liječenja inzulinom jer je manje antigen nego inačice dobivene iz životinja. No, kod većine se pacijenata koji se liječe inzulinom, razviju obično vrlo niske detektabilne razine inzulinskih antitijela, uključujući one koji primaju preparate humanog inzulina.
Inzulin se uobičajeno osigurava u preparatima koji sadrže 100 U/mL (U-100 inzulin), te se ubrizgava potkožno raspoloživim inzulinskim špricama za injekcije. Kod pacijenata koji redovno ubrizgavaju doze < = 50 U, preferiraju se šprice za injekcije od 1-2 mL, jer se vrijednosti mogu lakše očitati, a mogu i omogućiti precizno mjerenje manjih doza. Naprava za injektiranje višestrukih doza inzulina (NovolinPen), inzulinsko pero, osmišljeno je za upotrebu punjenja koje sadrži nekoliko dnevnih doziranja. Inzulin bi se trebao rashladiti, no nikada zamrznuti; što omogućuje njegovu upotrebu na poslu i na putovanju.
Dijabetes se može povezati s ostalim endokrinim bolestima. Tip II može se javiti kao posljedica Cushingovog sindroma, akromegalije, feokromocitoma, glukagonoma, primarnog aldosteronizma ili somatostationoma. Većina tih poremećaja povezuje se sa perifernom ili jetrenom rezistencijom inzulina. Mnogi će pacijenti postat dijabetični kada se smanji inzulinsko izlučivanje. Prevladavanje tipa I DM povećava se kod pacijenata s određenim autoimunim endokrinim bolestima, npr. Gravesova bolest, Hashimotov tiroiditis i idiopatska Addisonova bolest.
Dijabetes također mogu uzrokovati toksini beta-stanica. Na primjer, streptozotocin može potaknuti eksperimentalni dijabetes kod štakora, no rijetko uzrokuje dijabetes kod ljudi.
Kasne komplikacije dijabetesa javljaju se nakon nekoliko godina nedovoljno kontrolirane hipoglikemije. Razine glukoze povećane su u svim stanicama u kojima dolazi do unosa glukoze kojim posreduje inzulin (uglavnom mišića), što rezultira porastom glikozilacije i aktivnosti ostalih metaboličkih putova koji mogu biti potaknuti komplikacijama. Većinu mikrovaskularnih komplikacije je moguće odgoditi, spriječiti, ili čak ukloniti čvrstom glikemičnom kontrolom; tj. postizanjem smanjenog unosa hrane koje blizu normalnog i razina glukoze nakon obroka odraženih glikoziliranim hemoglobinom koji je blizu normalnog (Hb A1C). Mikrovaskularna bolest kao što je ateroskleroza može dovesti do simptomatske koronarne bolesti arterija, klaudikacije, oštećenja kože i infekcije. Iako hipoglikemija može ubrzati aterosklerozu, mnoge godine hiperinzulinemije koje prethode pojavi dijabetesa (s inzulinskom rezistencijom) mogu imati glavnu inicijacijsku ulogu. Kod ozbiljne periferne vaskularne bolesti, povremene klaudikacije i gangrene često se mora primijeniti amputacija nižeg uda. Pozadinska retinopatija (početne retinalne promjene koje se mogu uočiti oftalamoskopskim pregledom ili retinalnim snimkama) ne mijenja značajno vid, no može uznapredovati do makularmog edema ili proliferativne retinopatije s odvajanjem mrežnice ili krvarenjem, što može dovesti do sljepoće. Kod oko 85% dijabetičara eventualno se razvije neki oblik retinopatije. Dijabetička nefropatija je obično asimptomatski dio krajnjeg stadija razvoja renalne bolesti, no može uzrokovati nefrotički sindrom.
Dijabetička nefropatija je slijedeća komplikacija dijabetesa, no česta je i kod ostalih bolesti.
Multipla mononeuropatija javlja se s kolagenskim vaskularnim poremećajima (npr. poliarteritis nodoza, sistemski eritemski lupus (SLE), Sjögrenov sindrom, reumatoidni artritis (RA)), sarkoidozom, metaboličkim bolestima (npr. dijabetes, amiloidoza) ili infektivnim bolestima (npr. Lyme bolest, HIV infekcija). Mikroorganizmi mogu uzrokovati multiplu mononeuropatiju direktnim napadom na živce (npr. kod lepre).
Polineuropatija zbog akutne febrilne bolesti može nastati kao posljedica toksina (npr. difterije) ili autoimune reakcije (kod Guillain-Barréovog sindroma); polineuropatija koja ponekad nastaje nakon imunizacija vjerovatno je također autoimuna.
Toksični agensi općenito uzrokuju polineuropatiju, no ponekad i mononeuropatiju. Oni obuhvaćaju emetin, heksobarbital, barbital, klorbutanol, sulfonamide, fentoin, nitrofurantoin, vinske alkaloide, teške metale, ugljični monoksid, triortokrezil-fosfat, ortodinitrofenol, mnoga otapala, industrijske otrove i određene AIDS lijekove (npr. zalcitabin, didanozin).
Nedovoljna ishrana i metabolički poremećaji mogu rezultirati polineuropatijom. Nedostatak B vitamina njen je česti uzrok (npr. kod alkoholizma, beriberi-bolesti, perniciozne anemije, nedostatka piridoksina koji je uzrokovan izoniazidom, malapsorpcijskih sindroma i hypermesis gravidaruma). Polineuropatija se također javlja kod hipotiroidizma, sarkoidoze, porfirije, amiloidoze i uremije.
Maligne bolesti mogu uzrokovati polineuropatiju preko monoklonalne gamopatije (multipli mijelom, limfom), amiloidnog napadaja, nedovoljne ishrane ili paraneoplastičkog sindroma.
Polineuropatija koja se javlja kao posljedica metaboličkih poremećaja kao što su diabetes mellitus ili zatajenje bubrega, razvija se polagano, često tijekom nekoliko mjeseci ili godina. Često započinje osjetilnim poremećajima u nižim ekstremitetima od kojih su često ozbiljniji distalni nego proksimalni. Perifererno drhtanje, obamrlost, jaka bol ili poremećaji u zglobnoj propiocepciji i osjećaj podrhtavanja često su prominentni. Bol se često pogoršava noću, a može se pojačati i dodirivanjem oboljelog područja, te temperaturnim promjenama. U ozbiljnijim slučajevima postoje objektivni znakovi gubitka osjeta, obično u području stopala i šaka. Ahilov i ostali refleksi dubokih tetiva su oslabljeni ili ih nema. U slučaju intenzivnog gubitka osjeta mogu se razviti bezbolne rane na prstima ili Charcotovim zglobovima. Osjetilni ili propriocepcijski deficiti mogu dovesti do nepravilnog držanja. Poteškoće vezane uz motorički sustav mogu dovesti do slabosti i atrofije distalnih mišića. Dodatno ili selektivno može biti uključen i autonomni živčani sustav, što dovodi do noćnih proljeva, mokraćne ili fekalne ikontinencije, impotencije ili posturalnog tipa hipotenzije. Vazomotorni simptomi variraju. Koža može postati blijeđa ili suša od normalne, ponekad uz tamna mrlje; znojenje može biti pretjerano. Promjene vezane uz prehranu (glatka i sjajna koža, oštećeni i izbrazdani nokti, osteoporoza) česte su u ozbiljnijim, dugotrajnim slučajevima.
Liječenje sistematskog poremećaja (npr. diabetesa mellitusa, zatajenja bubrega, multiplog mijeloma, tumora) može spriječiti progresiju i olakšati simptome, no oporavak je spor. U liječenju neuropatija mogu biti potrebne kortikosteroidne injekcije ili kirurška dekompresija. Fizikalna terapija i udlage smanjuju mogućnost pojave, te ozbiljnost kontraktura.
Diabetes mellitus može uzrokovati senzorimotorički distalnu polineuropatiju (najčešća), multiplu mononeuropatiju i fokusnu mononeuropatiju (npr. kranijalnih živaca ili okulomotoričkih). Polineuropatija se često javlja kao distalna, simetrična, pretežno osjetilna polineuropatija koja uzrokuje osjetilne deficite koji započinju promjenama u području stopala i šaka.
Općenito, periferna neuropatija definira se kao sindrom gubitka osjeta, slabosti mišića i atrofije, koja smanjuje reflekse dubokih tetiva, te vazomotoričkih simptoma, samih ili u kombinaciji. Bolest može zahvatiti jedan živac (mononeuropatija), dva ili više živaca na odvojenim područjima (multipla mononeuropatija) ili mnogo živaca istovremeno (polineuropatija). Primarno može biti zahvaćen akson (kao kod diabetesa mellitusa, Lyme bolesti, uremije ili uz toksične agense), mijelinska ovojnica ili Schwannova stanica (kao kod akutne ili kronične upalne polineuropatije, leukodistrofija ili Guillain-Barréovog sindroma). Oštećanje malih demijeliniziranih i mijeliniziranih vlakana primarno rezultira gubitkom osjeta bola i temperture, oštećenje velikih mijeliniranih vlakana rezultira motoričkim ili propriocepcijskim poremećajima. Neke neuropatije (npr. zbog toksičnosti, upotrebe dapsona, porfirije ili Guillain-Barréovog sindroma) primarno zahvaćaju motorička vlakna, ostale (npr. zbog dorzalnog korjenskog ganglionitisa karcinoma, lepre, diabetesa mellitusa ili kronične piridoksinske intoksikacije) primarno zahvaćaju dorzalne korjenske ganglije ili osjetilna vlakna, uz nastanak osjetilnih simptoma. Povremeno također mogu biti uključeni i kranijalni živci (npr. kod Guillain-Barréovog sindroma, Lyme bolesti, diabetesa mellitusa i difterije).
Trauma je najčešći uzrok lokalizirane ozljede živčanog vlakna. Prekomjerna mišićna aktivnost ili jako prenaprezanje zgloba može dovesti do fokusne neuropatije, jednako kao i ponavljanje malih trauma (npr. čvrsti stisak malih alatki, pretjerana vibracija iz pneumatskih čekića). Kompresijska ili entrapment paraliza obično zahvaća površinske živce (ulnarna, radijalna, peronealna) na košćanim ispupčenjima (npr, tijekom hrkanja ili anestezije kod mršavih i boležljivih pacijenata, često i kod alkoholičara) ili uskim kanalima (npr. kod sindroma karparalnog tunela). Kompresijska paraliza može također nastati kao posljedica tumora, košćane hiperostoze, gipsa, štaka ili dugotrajnih zgrčenih položaja (npr. kod vrtlarenja). Krvarenja u živce, te izloženost hladnoći ili zračenju također mogu izazvati neuropatiju. Mononeuropatija može biti posljedica direktnog tumorskog širenja.
Dijabetička polineuropatija može uzrokovati ukočenost, trnce i parestezije u ekstremitetima, te rijeđe oslabljujuću, jaku, dubinsku bol i hiperestezije. Grčevi gležnja su obično smanjeni ili ih nema. Ostali se uzroci polineuropatije mogu isključiti. Akutne bolne polineuropatije koje zahvaćaju treći, četvrti ili šesti kranijalni živac, kao i ostale živce, npr. femoralni živac, mogu se spontano zaliječiti nakon nekoliko tjedana ili mjeseci, rijeđe su kod starijih dijabetičara i pripisuju se infarkcijama živaca. Autonomna neuropatija primarno se javlja kod dijabetičara s polineuropatijom i uzrokuje posturalnu hipotenziju, poremećeno znojenje, impotenciju ili retrogradnu ejakulaciju kod muškaraca, oslabljenu funkciju mokraćnog mjehura, dugotrajno pražnjenje želuca (ponekad uz sindrom povraćanja), ezofagealnu disfunkciju, zatvor ili proljev i noćne proljeve. Smanjeni otkucaji srca nastaju kao posljedica Valsalvinog manevra ili stajanja, a nepromijenjene varijacije u otkucajima srca tijekom dubokog disanja predstavljaju dokaz autonomne neuropatije kod dijabetičara.
Dijabetička polineuropatija glavni je uzrok rana na stopalima i problema sa zglobovima koji su važni uzroci smrtnosti dijabetičara. Kod dijabetičke polineuropatije osjetilna denervacija oslabljuje percepciju traume kao što je slučaj prilikom nošenja posebno izrađene obuće i hodanja po pijesku. Alternacije propriocepcije dovode do abnormalnih primjera vezanih uz nošenje težine, te ponekad do razvoja Charcotovih zglobova.
Pacijenti s inficiranim ranama na stopalima često ne osjećaju bol i nemaju sistemskih simptoma sve do kranjeg zanemarivanja istih. Duboke rane, a posebno rane koje su povezane s detektabilnim celulitisom zahtjevaju trenutnu hospitalizaciju, budući da se može razviti sistemska toksičnost i trajna onesposobljenost. Rano kirurško čišćenje takvih rana bitan je dio liječenja, no amputacija je ponekad neophodna.
Interleukin-6 (IL-6) je multifunkcionalan citokin kojeg stvaraju i izlučuju različiti tipovi stanica. Pleiotropni citokin ima glavnu ulogu u mehanizmima obrane stanica uklučujući imunološki odgovor, odgovor akutne faze i hematopoezu. IL-6 je glikopotein molekulske mase od 20 do 26 kDa s 185 aminokiselina koji je ranije kloniran (May i ostali, (1986); Zilberstein i ostali, (1986); Hirano i ostali, (1986)). Ranije se IL-6 navodio kao stimulacijski faktor B-stanica 2 (BSF-2), interferon-beta 2 i hepatocitni stimulacijski faktor. IL-6 izlučuje veliki broj različitih tkiva, uključujući jetru, slezenu i koštanu srž, te različiti tipovi stanica uključujući monocite, fibroblaste, endotelijalne stanice, B- i T-stanice. IL-6 se aktivira na razini transkripcije pomoću različitih signala, uključujući viruse, dvolančanu RNA, bakterije i bakterijske lipopolisaharide, te upalne citokine kao što su IL-1 i TNF.
IL-6 je utjecao na patogenezu upalne bolesti CNS kod ljudi. Na primjer, kod pacijenata s multiplom sklerozom dokazane su povećane razine IL-6 u plazmi i cerebrospinalnoj tekućini (Frei i ostali, (1991)).
Nedavni su eksperimenti o utjecaju IL-6 stanica na centralni i periferni živčani sustav pokazali da IL-6 može imati zaštitni učinak na živčane stanice kao i neku vrstu učinka na neurodegenerativne procese (Gadient i Otten, 1997, Mendel i ostali, 1999). Nađeno je da IL-6 sprečava staničnu lizu koju uzrokuju glutamat u hipokampalnim (Yamada i ostali, 1994) kao i u strijatalnim neuronima (Toulmond i ostali, 1992). Kod transgeničnih miševa koji eksprimiraju visoke razine humanog IL-6 i topljivog humanog IL-6 (sIL-6-R) uočena je ubrzana živčana regeneracija nakon ozljede hipoglosalnog živca, kao što pokazuje retrogradno obilježavanje hipoglosalne jezgre u mozgu (Hirota i ostali, 1996). Nadalje, postoje dokazi da je IL-6 upleten u neurološku bolest, multiplu sklerozu (MS) tj. poremećaj demijelinizacije (Mendel i ostali, 1998). Miševi kojima nedostaje IL-6 gen bili su otporni na eksperimentalno izazivanje bolesti. S druge pak strane, postoje izvještaji koji ukazuju da IL-6 ima negativan učinak na održivost neurona tijekom rane posttraumatske faze nakon ozljede živaca. (Fisher i ostali, 2001).
Biološkim aktivnostima IL-6 posreduje membranski receptorski sustav koji sadrži dva različita proteina od kojih je jedan nazvan IL-6 receptor ili gp80, a drugi gp130 (Hirano i ostali). gp130 je transmembranski glikoprotein koji se sastoji od 918 aminokiselina, uključujući intracelularnu domenu od 277 aminokiselina, a kao podjedinica sastavni je dio nekoliko citokinskih receptora, uključujući one za IL-6, IL-11, LIF, onkostatin M, CNTF (cilijarni neurotrofični faktor), CT-1. Obitelj citokina u koju pripada IL-6 kao prototip citokinskog djelovanja preko gp130 također se naziva i obitelj ''citokina IL-6 tipa''.
gp130 sudjeluje u nastajanju visokoafinitetnih receptora za navedene citokine tako što se veže na niskoafinitetni receptorski lanac. Prema tome, gp130 također je nazvan ''afinitetni konverter''. Ligand koji se veže na citokinski receptor dovodi do dimerizacije gp130 (prikazane za IL-6 receptor) ili heterodimerizacije (prikazane za LIF, onkostatin M i CNTF receptore) s proteinom koji je srodan gp130 i koji je poznat pod imenom LIFRbeta podjedinica. Vezanje svakog pojedinog liganda povezuje se s aktivacijom/asocijacijom obitelji tirozinskih kinaza poznatih kao Janus kinaze (JAK), kao prvim korakom intracelularne signalne transdukcije. Intracelularni signalizirajući proces uključuje tirozinsku fosforilaciju i aktivaciju faktora nazvanih STAT (signalni transduktor i aktivator transkripcije).
Smatra se da je humani gp130 genski produkt homologan s dva različita kromosomska lokusa na kromosomima 5 i 17. Prisutnost dva različita gp130 genska slijeda ograničava se na primate i nije otkrivena kod ostalih kralježnjaka.
Pokazano je da se signalizirajuće aktivnosti IL-6, IL-11, CNTF, onkostatina M i LIF mogu specifično blokirati pomoću različitih monoklonalnih antitijela usmjerenih protiv gp130. Kao dodatak tome, otkrivena su monoklonalna antitijela koja direktno aktiviraju gp130, neovisno o prisutnosti citokina ili njihovih receptora.
Pokazano je da ostala monoklonalna antitijela usmjerena protiv gp130 inhibiraju funkcije kojima posreduje IL-6. U ljudskom serumu otkriveni su topljivi oblici gp130 (sgp130) s molekulskom masom od 90 do 110 Kda. Oni mogu inhibirati biološke funkcije citokina koji koriste receptorske sustave s gp130 kao komponentom.
Topljivi oblici IL-6R (sIL-6R), koji odgovaraju ekstracelularnoj domeni gp80, prirodni su produkti ljudskog tijela, nađeni kao glikoproteini u krvi i urinu (Novick i ostali, 1990, 1992). Izuzetno svojstvo sIL-6R molekula je to da djeluju kao potentni agonisti IL-6 na različitim tipovima stanica uključujući ljudske stanice (Taga i ostali, 1989; Novick i ostali, 1992). Čak i bez intracitoplazmatske domene gp80, sIL-6R je sposoban inicirati dimerizaciju gp130 u odgovoru na IL-6, koji posreduje u kasnijoj IL-6 specifičnoj signalnoj transdukciji i biološkim učincima (Mukarami i ostali, 1993). sIL-6R s gp130 tvori dvije vrste interakcije, a obje su bitne za specifične biološke aktivnosti IL-6 (Halimi i ostali, 1995). Predložena je heksamerna struktura aktivnog IL-6 receptorskog kompleksa koju tvore dva gp130 lanca, dva IL-6R i dva IL-6 liganda (Ward i ostali, 1994; Paonessa i ostali, 1995).
Opisane kimerne molekule koje zajedno vežu topljivi IL-6 receptor i IL-6 (Chebath i ostali, 1997, Fisher i ostali, 1997, WO 99/02552 i WO 97/32891). Označene su kao IL-6R/IL-6 kimeri, odnosno hiper-IL-6, a ubuduće će se u tekstu nazivati IL-6R/IL-6. IL-6R/IL-6 kimeri dobivaju se spajanjem cijele kodirajuće regije cDNA koje kodiraju topljivi IL-6 receptor (sIL-6R) i IL-6 (Fischer i ostali, 1997; Chebath i ostali, 1997). Rekombinantni IL-6R/IL-6 kimer nastaje u CHO stanicama (Chemath i ostali, 1997, WO 99/02552). IL-6R/IL-6 kimer veže se s većom efikasnosti na gp130 lanac in vitro nego smjesa IL-6 sa sIL-6R (Kollet i ostali, 1999).
Kratak pregled izuma
U skladu s prisutnim izumom otkriveno je da primjena tvari koje signaliziraju preko gp130 rezultirala značajnim korisnim učincima u establiranom životinjskom modelu dijabebetičke neuropatije. Ispitivane karakteristične tvari bile su IL-6 i IL6R/IL-6 kimer. Obje tvari pokazale su statistički značajne korisne učinke kod dijabetičke neuropatije poboljšavajući nekoliko parametara koji se odnose na vitalnost živaca.
Izum se zato odnosi na upotrebu tvari koje signaliziraju preko gp130 u pripravi lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
Upotreba stanica koje eksprimiraju tvari koje signaliziraju preko gp130 u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije predstavlja slijedeću svrhu izuma. Nadalje, u skladu s prisutnim izumom, u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili prevenciju dijabetičke neuropatije upotrebljavaju se vektori koji sadrže kodirajući slijed za tvari koje signaliziraju preko gp130.
Kratak opis prikaza
Slika 1 prikazuje porast tjelesne težine kod eksperimentalnih životinja.
Slika 2 prikazuje stupanj glikemije nakon 10. dana (A) i 40. dana (B) od izazivanja dijabetesa kod eksperimentalne skupine životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealno.
Slika 3 prikazuje vrijeme koje je potrebno životinjama kod kojih je primjena provedena intraperitonealno da trznu repom koji je smješten na izvor topline u sekundama.
Slika 4 prikazuje spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealo, izražen u latenciji po sekundi.
Slika 5 prikazuje brzinu kondukcije osjetilnih živaca (SNVC) u m/s kod ekperimentalnih životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealo.
Slika 6 prikazuje promjer aksona u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealo.
Slika 7 prikazuje promjer vlakna u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealo.
Slika 8 prikazuje debljinu mijelina u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja kod kojih je primjene provedena intraperitonealno.
Slika 9 prikazuje broj mijeliniziranih vlakana po jedinici površine kod eksperimentalnih životinja kod kojih je primjena provedena intraperitonealno.
Slika 10 prikazuje shematski prikaz koji opisuje strukturu IL-6R/IL-6 kimera.
Slika 11 prikazuje porast tjelesne težine kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 12 prikazuje stupanj glikemije nakon 10. dana i 41. dana od izazivanja dijabetesa kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 13 prikazuje vrijeme za trzaj repom koji je smješten na izvor topline kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 14 prikazuje broj pređenih kvadrata (A) i uzdizanja (B) kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 15 prikazuje spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) izražen u latenciji po sekundi kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 16 prikazuje brzinu kondukcije osjetilnih živaca (SNVC) u m/s kod ekperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 17 prikazuje promjer vlakna u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 18 prikazuje promjer aksona u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 19 prikazuje debljinu mijelina u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 20 prikazuje postotak degeneriranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 21 prikazuje postotak mijeliniziranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine A kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 22 prikazuje porast tjelesne težine kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 23 prikazuje stupanj glikemije nakon 10. dana i 40. dana od izazivanja dijabetesa kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 24 prikazuje vrijeme potrebno za trzaj repom koji je smješten na izvor topline kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 25 prikazuje broj pređenih kvadrata (A) i uzdizanja (B) kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 26 prikazuje spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) izražen u latenciji po sekundi kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 27 prikazuje brzinu kondukcije osjetilnih živaca (CNVS) u m/s kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 28 prikazuje promjer vlakna u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 29 prikazuje promjer aksona u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 30 prikazuje debljinu mijelina u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 31 prikazuje postotak degeneriranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 32 prikazuje postotak mijeliniziranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 33 prikazuje porast tjelesne težine kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 34 prikazuje stupanj glikemije nakon 10. dana i 40. dana od izazivanja dijabetesa kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 35 prikazuje vrijeme za trzaj repom koji je smješten na izvor topline kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 36 prikazuje broj pređenih kvadrata (A) i uzdizanja (B) kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 37 prikazuje spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) izražen u latenciji po sekundi kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 38 prikazuje brzinu kondukcije osjetilnih živaca (SNVC) u m/s kod eksperimentalnih životinja skupine B kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 39 prikazuje promjer vlakna u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 40 prikazuje promjer aksona u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 41 prikazuje debljinu mijelina u mikrometrima kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 42 prikazuje postotak degeneriranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Slika 43 prikazuje postotak mijeliniziranih vlakana kod eksperimentalnih životinja skupine C kod kojih je primjena provedena potkožno.
Detaljni opis izuma
Izum se bazira na otkriću da primjena tvari koje signaliziraju preko gp 130 rezultira značajno smanjenom osjetljivošću na bolne podražaje, te regeneracijom živaca u establiranom životinjskom modelu dijabetičke neuropatije. Zbog toga, izum se odnosi na upotrebu tvari koje iniciraju signaliziranje preko gp130 dijela humanog IL-6 receptora u pripravi lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
''Tvar koja signalizira preko gp130'' je svaka molekula koja aktivira signalizirajuću kaskadu preko gp130, tj. svaki agonist, stimulator ili aktivator gp130 dijela IL-6 receptorskog kompleksa. Stimulacija može biti direktna, tj. aktivacija se može inicirati direktnim vezanjem na gp130. Primjer takvog direktnog aktivatora je IL-6R/IL-6 kimer. Stimulacija također može biti i indirektna, vezanjem na drugi receptor stanične površine koji s gp130 stvara kompleks aktivirajući ga. Primjer takvog indirektnog aktivatora gp130 je IL-6. Slijedeći primjeri tvari koje signaliziraju preko gp130 uključuju IL-11, LIF, onkostatin M (OSM), CNTF (cilijarni neurotrofični faktor) i kardiotrofin-1 (CT-1) koji pripadaju takozvanoj skupini ''citokina IL-6-tipa''. Navedeni citokini iniciraju JAK/STAT put, čiji je prvi dio homo-ili heterodimerizacija receptorske podjedinice za trandukciju signala koju inducira ligand. Svi citokini IL-6-tipa ojačavaju gp130 do svojih receptorskih kompleksa. Oni signaliziraju ili samo preko gp130 ili u kombinaciji s LIFR ili OSMR, koji su sposobni aktivirati Jak i ojačati STAT proteine. IL-6 izaziva homodimerizaciju gp130, pri čemu CNTF, LIF i CT-1 signaliziraju putem heterodimerizacije gp130 i LIFR.
Termini ''liječenje'' i ''sprečavanje'' trebaju se shvatiti kao sprečavanje, inhibiranje, atenuiranje, poboljšavanje ili mijenjanje jednog ili više simpotoma ili uzroka dijabetičke neuropatije, kao i simptoma, bolesti ili komplikacija koje prate istu. Kod ''liječenja'' dijabetičke neuropatije, tvari prema izumu daju se nakon pojave bolesti, ''sprečavanje'' se odnosi na primjenu tvari prije pojave bilo kakvih znakova bolesti kod pacijenta. Preventivna primjena posebno je korisna kod visokorizičnih pacijenata, npr. kod onih koji već duže vrijeme pate od diabetesa mellitusa.
Termin ''dijabetička neuropatija'' odnosi se na svaki oblik dijabetičke neuropatije, ili na jedan ili više simptoma ili poremećaja koji prate ili uzrokuju dijabetičku neuropatiju, ili komplikacije dijabetesa koje zahvaćaju živce na način koji je detaljno opisan ranije u uvodu.
U preferiranom ostvarenju izuma, dijabetička neuropatija je polineuropatija. Kod dijabetičke polineuropatije simultano su zahvaćeni mnogi živci.
U slijedećem preferiranom ostvarenju, dijabetička neuropatija je mononeuropatija. Kod fokusne mononeuropatije, bolest zahvaća jedan živac, npr. okulomotorički ili kranijalni živac. Kada su na odvojenim područjima zahvačena dva ili više živca, poremećaj se naziva multipla mononeuropatija.
Preferirano, tvar je:
a) IL-6;
b) fragment a) koji se veže na gp80 i inicira signaliziranje preko gp130;
c) inačica a) ili b) čijih je barem 70% slijeda identično s a) ili b) i koja inicira signaliziranje preko gp130;
d) inačica a) ili b) koju kodira DNA slijed koji hibridizira do komplementa nativnog DNA slijeda kodirajući a) ili b) pod umjereno strogim uvjetima i koja inicira signaliziranje preko gp130; ili
e) sol, spojeni protein ili funkcionalni derivat a), b) ili c) koji inicira signaliziranje preko gp130.
Upotreba IL-6 se sama po sebi visoko preferira prema izumu. IL-6 može biti nativni, tj. IL-6 izoliran iz prirodnog izvora ili rekombinantno dobiveni IL-6. rekombinantni IL-6 se posebno preferira prema izumu.
U slijedećem preferiranom ostvarenju prema izumu, tvar je:
a) IL-6R/IL-6 kimer;
b) fragment a) koji se veže na gp80 i inicira signaliziranje preko gp130;
c) inačica a) ili b) čijih je barem 70% slijeda identično s a) ili b) i koja inicira signaliziranje preko gp130;
d) inačica a) ili b) koju kodira DNA slijed koji hibridizira do komplementa nativnog DNA slijeda kodirajući a) ili b) pod umjereno strogim uvjetima i koja inicira signaliziranje preko gp130; ili
e) sol, spojeni protein ili funkcionalni derivat a), b) ili c) koji inicira signaliziranje preko gp130.
''IL-6R/IL-6 kimer'' (također nazvan ''IL-6R/IL-6'' ili ''IL-6 kimer'') je kimerna molekula koja sadrži topljivi dio gp130 koji je spojen na sav ili biološki aktivni dio interleukina-6. Dijelovi kimernog proteina mogu se spojiti direktno jedni na druge ili ih može vezati odgovarajuća karika, kao što je disulfidni most ili polipeptid. Kariku može predstavljati kratak peptid koji sadrži samo 1 do 3 aminokiselinska ostatka, ali može biti i duži, na primjer s 13 ili 18 aminokiselinskih ostataka. Navedena karika može biti tripeptid slijeda E-F-M (Glu-Phe-Met), na primjer, ili pak slijed od 13 aminokiselina (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met) umetnut između aminokiselinskog slijeda topljivog IL-6 receptorskog gp130 i IL-6 slijeda. Primjeri IL-6R/IL-6 kimera poznati su u znanosti, te su detaljnije opisani u npr. WO 99/02552 ili WO 97/32891. Primjer za IL-6R/IL-6 kimernu molekulu koja se može upotrijebiti prema izumu shematski je prikazan na slici 2.
Termin ''inačica'' odnosi se na analoge IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka komponenata IL-6R/IL-6 koje se javljaju u prirodi zamijenjeno različitim aminokiselinskim ostacima ili je pak izbrisano, ili je jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodano originalnom slijedu IL-6 ili IL-6R/IL-6, bez znatnih promjena u aktivnosti dobivenih produkata u usporedbi s originalnim IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimerom. Takve se inačice pripravljaju poznatim tehnikama i/ili tehnikama mutageneze usmjerene na određeni položaj, ili bilo kojom drugom poznatom i prikladnom tehnikom.
Inačice prema prisutnom izumu uključuju proteine koje kodira nukleinska kiselina, DNA ili RNA, koja hibridizira do komplementa DNA ili RNA kodirajući IL-6 ili IL-6R/IL-6 pod umjereno strogim ili strogim uvjetima. Termin ''strogi uvjeti'' odnosi se na uvjete hibridizacije i naknadnog ispiranja. Vidi Ausubel i ostali, ''Current Protocols in Molecular Biology'', supra, Interscience, N. Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i ostali (Sambrook, J.C., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989), ''Molecular Cloning: A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Bez ograničenja, primjeri strogih uvjeta obuhvaćaju uvjete ispiranja 12-20 °C ispod izračunate Tm hibrida koji se proučava u npr. 2 x SSC i 0,5% SDS za 5 minuta, 2 x SSC i 0,1% SDS za 15 minuta, 0,1 x SSC i 0,5% SDS pri 37 °C za 30-60 minuta i zatim 0,1 x SSC i 0,5% SDS pri 68 °C za 30-60 minuta. Stručnjacima je jasno da strogost uvjeta također ovisi i o duljini DNA sljedova, oligonukleotidnim probama (kao što je 10-40 baza) ili miješanim oligonukleotidnim probama. Ako se koriste miješane probe, preferirano je upotrijebiti tetrametilamonijev klorid (TMAC) umjesto SSC, vidi Ausubel, supra. ''Umjereno strogi uvjeti'' odnose se na uvjete ispiranja pri nižim temperaturama, nižim koncentracijama soli ili detergenta, npr. 0,2 x SSC/0,1% SDS pri 42 °C (Ausubel i ostali, 1989, supra).
Svaka takva inačica preferiramo ima dovoljno duplikativan slijed aminokiselina od IL-6 ili IL-6R/IL-6, kao što ima znatno sličnu ili čak bolju aktivnost u usporedbi s IL-6 ili IL-6R/IL-6.
Karakteristična aktivnost IL-6 vezana je uz njegovu sposobnost vezanja s gp80 dijelom IL-6 receptora, a karakteristična aktivnost IL-6R/IL-6 kimera vezana je uz njegovu sposobnost vezanja s gp130. Tip ELISA ispitivanja za mjerenje vezanja IL-6R/IL-6 kimera s gp130 detaljnije je opisan u primjeru 7 na stranici 39 WO 99/02552 koja je ovdje inkorporirana referencom. Stručnjacima će biti jasno da se slični tip ELISA ispitivanja može razviti za vezanje IL-6 s gp80. Dok god inačica ima stvarnu veznu aktivnost sa svojom veznom regijom gp80 ili gp130, može se smatrati da ima stvarno sličnu aktivnost s IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimerom. Iz tog razloga, može se odrediti da li neka dana inačica ima najmanje stvarno istu aktivnost kao IL-6 ili IL-6R/IL-6 pomoću rutinskih eksperimenata koji obuhvaćaju podvrgavanje inačice npr. jednostavnom sendvič veznom ispitivanju za određivanje da li se veže ili ne na imobilizirani gp80 ili gp130, kao što je opisano u primjeru 7 WO 99/02552.
U preferiranom ostvarenju svaka takva inačica ima najmanje 40 % istovjetnosti ili homologije sa slijedom zrele IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimerne molekule koja je sadržana u WO 99/02552. Više preferirano, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najviše preferirano, najmanje 90% istovjetnosti ili homologije.
Istovjetnost odražava vezu između dva ili više polipeptidna slijeda, ili dva ili više polinukleotidna slijeda, određenu uspoređivanjem sljedova. Općenito, istovjetnost se odnosi na točno podudaranje nukleotida ili aminokiseline jednog polinukleotidnog, odnosno polipeptidnog slijeda s nukleotidom ili aminokiselinom drugog na dužini uspoređivanog slijeda.
Za sljedove u kojima nema točnog podudaranja, može se određiti % istovjetnosti. Općenito se kod uspoređivanja dva slijeda, oni svrstavaju tako da se između njih postigne maksimalna korelacija. Za postizanje većeg stupnja svrstavanja u jedan ili oba slijeda mogu se umetnuti ''praznine''. Postotak istovjetnosti može se odrediti na cijeloj dužini svakog slijeda koji se uspoređuje (takozvano globalno svrstavanje), što je posebno prikladano za sljedove iste ili vrlo slične dužine ili čak kraće, definirane dužine (takozvano lokalno svrstavanje), a najprikladnije za sljedove nejednakih đužina.
U znanosti su poznate metode za uspoređivanje istovjetnosti ili homologije dva ili više slijeda. Tako se na primjer za određivanje % istovjetnosti između polinukleotida, te % istovjetnosti i % homologije između dva polipeptidna slijeda mogu upotrijebiti programi dostupni u paketu ''Wisconsin Sequence Analysis Package'', verzija 9,1 (Devereux J. i ostali, 1984), na primjer programi BESTFIT i GAP. BESTFIT koristi Smithov i Watermanov (1981) algoritam ''lokalne homologije'' i pronalazi najbolju pojedinačnu regiju sličnosti između dva slijeda. U znanosti su također poznati i ostali programi za određivanje istovjetnosti i/ili sličnosti između sljedova, na primjer BLAST skupina programa (Altschul S F i ostali, 1990, Altschul S F i ostali, 1997, pristupačan preko početne stranice NCBI na www.ncbi.nim.nih.gov) i FASTA (Pearson W.R., 1990; Pearson 1988).
Inačice IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera koje se mogu upotrijebiti u skladu s prisutnim izumom ili kodiranje nukleinskih kiselina, obuhvaćaju ograničen set stvarno podudarajućih sljedova poput supstitucijskih peptida ili polinukleotida koje stručnjaci mogu rutinski dobiti na temelju ovdje predstavljenih tehnika ili uputa, bez korištenja nepotrebnih eksperimentalnih postupaka.
Preferirane promjene inačica u skladu s prisutnim izumom poznate su pod nazivom ''konzervativne'' supstitucije. Konzervativne aminokiselinske supstitucije IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera mogu obuhvaćati sinonimne aminokiseline unutar skupine, koje imaju dovoljno slična fizičko-kemijska svojstva tako da supstitucija između članova skupine održi biološku funkciju molekule (Grantham, 1974). Jasno je da u ranije definiranim sljedovima mogu biti učinjena umetanja i brisanja aminokiselina bez mijenjanja njihove funkcije, posebno ako umetanja i brisanja obuhvaćaju samo nekoliko aminokiselina (npr. trideset, preferirano deset) i ako se ne uklanjaju ili zamjenjuju aminokiseline presudne za funkcionalnu konformaciju (npr. cisteinski ostaci). Proteini ili muteini dobiveni takvim brisanjima i/ili umetanjima ulaze u područje prisutnog izuma.
Preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 1. Više preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 2. Najviše preferirano, sinonimne aminokiselinske skupine su one koje su definirane u tablici 3.
TABLICA 1
Preferirane skupine sinonimnih aminokiselinskih
[image]
TABLICA 2
Više preferirane skupine sinonimnih aminokiselina
[image]
TABLICA 3
Najviše preferirane skupine sinonimnih aminokiselina
[image]
Primjeri dobivanja aminokiselinskih supstitucija u proteinima koji se mogu upotrijebiti za dobivanje muteina IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera, za upotrebu u prisutnom izumu obuhvaćaju bile koje poznate metodološke korake, npr. predstavljene u US patentima Marka i ostalih (4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462), Kothsa i ostalih (5,116,943), Namena i ostalih (4,965,195), Chonga i ostalih (4,879,111), Leea i ostalih (5,017,691), dok su proteini u kojima je supstituiran lizin predstavljeni u US patentu br. 4,904,584 (Shaw i ostali).
Opisane su specifične inačice IL-6 koje su korisne u vezi s prisutnim izumom (WO9403492A1). Nadalje, EP667872B1 opisuje mutantni IL-6 s poboljšanom biološkom aktivnošću nad IL-6 divljeg tipa. Kao dodatak tome, EP656117B1 opisuje metode izolacije superagonista IL-6. Mutanti ili superagonisti mogu se upotrijebiti prema izumu.
Termin ''spojeni protein'' odnosi se na polipeptid koji sadrži IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimer, ili njihovu inačicu ili fragment, spojen s drugim proteinom, koji npr. u tjelesnim tekućinama ima produženo vrijeme zadržavanja. Zato se IL-6 ili IL-6R/IL-6 može spojiti s drugim proteinom, polipeptidom ili sličnom molekulom, npr. imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.
''Funkcionalni derivati'' pokrivaju derivate IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera i njihove inačice i spojene proteine koji se mogu pripraviti iz funkcionalnih skupina koje se javljaju kao ogranci na ostacima ili N- ili C-terminalnim skupinama, a uključeni su u izum dok god ostaju farmaceutski prihvatljivi, tj. ne uništavaju aktivnost proteina koja je značajno slična s aktivnošću IL-6 ili IL-6R/IL-6 i ne prenose toksična svojstva na pripravke u kojima su sadržani.
Takvi derivati mogu, na primjer, obuhvatiti polietilen-glikolske ogranke koji mogu maskirati antigenske položaje i produžiti zadržavanje IL-6R/IL-6 u tjelesnim tekućinama. Drugi derivati obuhvaćaju alifatske estere karboksilnih skupina, amide karboksilnih skupina reakcijom s amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, N-acilne derivate slobodnih amino-skupina aminokiselinskog ostatka formirane s acilnim dijelovima (npr. alkanoilne ili karbocikličke aroilne skupine) ili o-acil derivate slobodnih hidroksilnih skupina (npr. one serinskih ili treoninskih ostataka) formirane s acilnim dijelovima.
''Fragment'' prema izumu može biti npr. aktivna frakcija IL-6 ili IL-6R/IL-6. Termin fragment odnosi se na svaki podskup molekule, kraći peptid koji zadržava željenu biološku aktivnost, tj. koji ima agonističku aktivnost gp130. Fragmenti se mogu lako pripraviti uklanjanjem aminokiselana s oba kraja IL-6 ili IL-6R/IL-6 molekule i ispitivanjem svojstava rezulatnog fragmenta koja su vezana uz vezanje s gp80, odnosno gp130. U znanosti su poznate proteaze za uklanjanje jedne po jedne aminokiseline s N-terminalnog ili C-terminalnog polipeptida, a takvo određivanje fragmenata kojim se zadržava željena biološka aktivnost uključuje čiste rutinske eksperimente.
Kao fragmente IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera, njihovih inačica i spojenih proteina, prisutni izum pokriva svaki fragment ili prekurzor polipeptidnog lanca proteinske molekule same ili zajedno s povezanim molekulama ili vezanim ostacima, npr. šećernim ili fosfatnim ostacima, agregatima proteinske molekule ili šećernim ostacima samim po sebi, koji osiguravaju da navedena frakcija ima agonisičku aktivost prema gp130, a posebno prema gp130.
Termin ''soli'' odnosi se na soli karboksilnih skupina i na kiselinske adicijske soli amino-skupina IL-6 ili IL-6R/IL-6 molekule ili njihovog analoga. Soli karboksilnih skupina mogu se formirati pomoću u znanosti poznatih postupaka i obuhvaćaju anorganske soli, na primjer, natrijeve, kalcijeve, amonijeve, cinkove ili soli željeza i slične, a soli s organskim bazama su formirane, na primjer, s aminima, kao što je trietanolamin, arginin ili lizin, piperidinom, prokainom i slične. Kiselinske adicijske soli uključuju, na primjer, soli s anorganskim kiselinama, kao što su na primjer, kloridna kiselina ili sulfatna kiselina i soli s organskim kiselinama, kao što su na primjer, octena kiselina ili oksalna kiselina. Naravno, bilo koja takva sol mora održati biološku aktivnost IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera, tj. sposobnost aktiviranja signaliziranja preko gp130.
U preferiranom ostvarenju izuma, tvar izuma je glikozilirana na jednom ili više položaja.
Glikozilirani oblik IL-6R/IL-6 kimera opisan je u WO 99/02552 (PCT/IL98/00321), što predstavlja visoko preferirano kimernu molekulu prema izumu. IL-6R/IL-6 kimer koji je tamo opisan predstavlja rekombinantni glikoprotein dobiven spajanjem cijelog kodirajućeg slijeda topljivog IL-6 receptorskog δ-Val koji se javlja u prirodi (Novick i ostali, 1990) s cijelim kodirajućim slijedom zrelog IL-6 koji se javlja u prirodi, oba ljudskog porijekla. Stručnjacima će biti jasno da se glikozililirani IL-6 može dobiti također i na rekombinantan način, tj. ekspresijom u eukariotskim ekspresijskim sustavima.
U skladu s prisutnim izumom, agonist se može dobiti svakim prikladnim eukariotskim ili prokariotskim tipom stanica, kao što su stanice kvasca, stanice insekata, bakterije i slične. Preferirano se dobiva u stanicama sisavaca, najviše preferirano u genetski modificiranim CHO stanicama kao što je za IL-6R/IL-6 opisano u WO 99/02552. Sve dok se preferira protein ljudskog porijekla, stručnjacima će biti jasno da se prema izumu može upotrijebiti sličan protein spajanja bilo kojeg drugog porijekla, sve dok zadržava opisanu biološku aktivnost.
U slijedećem ostvarenju izuma, tvar izuma nije glikozilirana. Kimerna molekula može se dobiti u bakterijskim stanicama koje nisu sposobne sintetizirati glikozilne ostatke, no obično imaju veće iskorištenje od rekombinatno dobivenog proteina. Dobivanje IL-6 koji nije glikoziliran detaljnije je opisano npr. u EP504751B1.
U slijedećem preferiranom ostvarenju, tvar prema izumu obuhvaća imunoglobulinsko spajanje, tj. molekule prema izumu spajaju se na sav ili samo na dio imunoglobulina, pogotovo na Fc fragment imunoglobulina. U znanosti su poznate metode dobivanja proteina imunoglobulinskog spajanja, kao što su one opisane u npr. WO 01/03737. Stručnjaku će biti jasno da dobiveni protein spajanja izuma održava biološku aktivnost IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimera, tj. stimulaciju gp130 signaliziranja. Dobiveni protein spajanja idealno ima poboljšana svojstva kao što su produženo vrijeme zadržavanja u tjelesnim tekućinama (poluraspad), povećana specifična aktivnost, povećana razina ekspresije ili je olakšano pročišćavanje proteina spajanja.
Preferirano, tvar izuma spaja se na konstantu regiju Ig molekule. Može se spojiti na regije teških lanaca, kao što su CH2 i CH3 domene humanog Ig, na primjer. Ostali izoformi Ig molekula također su prikladni za dobivanje proteina spajanja prema prisutnom izumu, kao što su izoformi IgG2 ili IgG4 ili ostale skupine Ig, npr. IgM ili IgA. Proteini spajanja mogu prema tome biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.
Funkcionalni derivati tvari izuma mogu se konjugirati s polimerima da bi se poboljšala svojstva proteina, kao što su stabilnost, poluraspad, bioraspoloživost, tolerancija prema ljudskom tijelu ili imunogenost.
Zbog toga se preferirano ostvarenje izuma odnosi na funkcionalni derivat tvari izuma koji sadrži barem jedan dio koji je vezan s jednom ili više funkcionalnih skupina koje se javljaju u obliku jednog ili više ogranaka na aminokiselinskim ostacima.
Visoko preferirano ostvarenje odnosi se na tvar izuma koja je vezana na polietilen-glikol (PEG). PEGilacija se može provesti pomoću poznatih metoda opisanih npr. u WO 92/13095.
Preferirano, tvar koja signalizira preko gp130 upotrebljava se u količinskim rasponima od oko 0,1 do 1000 μg/kg ili oko 1 do 500 μg/kg ili manjim od oko 100 μg/kg. Također je preferirana upotreba tvari koja signalizira preko gp130 u količini od oko 1 μg/kg, 3 μg/kg, 10 μg/kg ili 30 μg/kg.
U preferiranom ostvarenju izuma se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje dnevno. U slijedećem preferiranom ostvarenju se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje tri puta tjedno. U još jednom preferiranom ostvarenju se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje jednom tjedno.
Tvar izuma može se primjenjivati bilo kojim prikladnim putem. Potkožni put se visoko preferira prema prisutnom izumu.
Tvar izuma može se dostaviti na položaj djelovanja svakom prikladnom formulacijom. Preferirano, može se dostaviti u obliku staničnog eksprimiranja ili izlučivanja IL-6, IL-6R/IL-6 kimera, njihove inačice, spojenog proteina ili aktivne frakcije. Kao što je prikazano u slijedećim primjerima, stanično eksprimiranje i izlučivanje IL-6R/IL-6 kimera u dostatnim količinama može se dobiti transfekcijom u stanice upotrebom prikladnog ekspresijskog vektora.
Izum se tako odnosi i na upotrebu stanice koja eksprimira tvar prema izumu u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije. Stanica se može primijeniti u bilo kojem prikladnom obliku. No, IL-6 ili IL-6R/IL-6 kimer koji je enkapsuliran u polimeru i koji eksprimira, te preferirano izlučuje stanica, predstavlja visoko preferirani način isporuke IL-6R/IL-6 kimera. Postupak enkapsuliranja detaljnije opisuju npr. Emerich i ostali (1994) ili US 5,853,385. Prikladne stanične linije i ekspresijski sustavi dobro su poznati u znanosti.
Isporuka tvari prema izumu može se također provesti upotrebom vektora, kao što je ekspresijski vektor koji sadrži kodirajući slijed IL-6, IL-6R/IL6 kimera, njihove inačice, spojenog proteina ili fragmenta. Vektor sadrži sve regulacijske sljedove potrebne za ekspresiju željenog proteina u ljudskom tijelu, a preferirano u centralnom živčanom sustavu. Regulacijski sljedovi dobro su poznati stručnjacima na tom području. Izum se stoga također odnosi i na upotrebu vektora koji sadrži kodirajući slijed tvari prema izumu u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
Prema izumu, može se upotrijebiti svaki ekspresijski vektor poznat u znanosti. No, visoko je preferirana upotreba vektora genske terapije dobivenog iz virusa.
Tvar izuma se preferirano primjenjuje na ljudsko tijelo u obliku farmaceutskog pripravka. Farmaceutski pripravak može sadržavati polipeptid izuma kao takav ili navedeni polipeptid koji eksprimira stanica, ili ekspresijski vektor, pogotovo vektor genske terapije iz virusa leće koji sadrži kodirajući slijed IL-6, IL-6R/IL6 kimera, njihove inačice, spojenog proteina ili aktivne frakcije, izborno zajedno s jedim ili više farmaceutski prihavatljivih nosača, sredstava za razrijeđenje ili ekscipijenata, za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
Definicija ''farmaceutski prihvatljiv'' označava bilo koji nosač koji ne utječe na učinkovitost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i nije toksičan prema domaćinu na kojem se primjenjuje. Na primjer, kod parenteralne primjene, aktivni sastojak može se formulirati u jedinici oblika doziranja za ubrizgavanje u prenosnike, kao što su fiziološka otopina, otopina dekstroze, serumski albumin i Ringerova otopina.
Aktivni sastojci mogu se primijeniti na pojedincu na različite načine. Putovi primjene uključuju intradermalne, transdermalne (npr. u polako otpuštajućim formulacijama), intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, potkožne, oralne, intrakranijalne, epiduralne, lokalne, rektalne i intranazalne putove. Može se upotrijebiti i bilo koji drugi terapeutski djelotvoran put primjene, na primjer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili genska terapija u kojoj se na pacijentu primjenjuje DNA molekula (npr. putem vektora) što uzrokuje ekspresiju i izlučivanje aktivnog agensa in vivo. Nadalje, aktivna molekula može se primijeniti zajedno s ostalim komponentama biološki aktivnih agensa, kao što su farmaceutski prihvatljivi površinski aktivni agensi, ekscipijenti, nosači, sredstva za razrijeđenje i prenosnici.
Za parenteralnu (npr. intravenoznu, potkožnu, intramuskularnu) primjenu, aktivni sastojak može se formulirati u obliku otopine, suspenzije, emulzije ili liofiliziranog praška, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prenosnikom (npr. vodom, fiziološkom otopinom, otopinom dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (npr. manitolom) ili kemijsku stabilnost (npr. konzervansi i puferi). Formulacija se sterilizira uobičajno upotrebljavanim tehnikama.
Slijedeća svrha prisutnog izuma je osigurati metodu za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije koja obuhvaća primjenu na pacijenu djelotvorne količine tvari koja inicira signaliziranje preko humanog gp130 receptora, izborno zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosačem.
''Djelotvorna količina'' odnosi se na količinu aktivnog sastojka koja je dovoljna da utječe na tok i jačinu prethodno opisane bolesti, što dovodi do smanjenja ili remisije takve patologije. Djelotvorna količina ovisit će o putu primjene i stanju pacijenta.
Primijenjeno doziranje, u obliku jednostruke ili višestrukih doza, ovisit će o raznim faktorima, uključujući farmakokinetička svojstva, put primjene, stanje pacijenta i karakteristike (spol, dob, tjelesna težina, zdravlje, visina), opseg simptoma, trenutna liječenja, učestalost liječenja i željeni učinak. Stručnjacima su dobro poznata podešavanja i manipulacije vezane uz utvrđivanje raspona doziranja.
Metoda za liječenje dijabetičke neuropatije koja obuhvaća primjenu na pacijentu djelotvorne količine IL-6 ili IL-6R/IL6 kimera, njihove inačice, spojenog proteina ili aktivne frakcije koje eksprimira stanica, također je prema prisutnom izumu. Metoda za liječenje dijabetičke neuropatije koja obuhvaća primjenu na pacijentu ekspresijskog vektora koji sadrži kodirajući slijed IL-6 ili IL-6R/IL6 kimera, njihove inačice, spojenog proteina ili aktivne frakcije također predstavlja svrhu izuma.
U preferiranom ostvarenju izuma, ekspresijski vektor je vektor genske terapije. Visoko je preferirana upotreba virusnog vektora, pogotovo virusa leće.
Prisutni izum biti će detaljnije opisan u neogranićujućim primjerima i popratnim prikazima.
Nakon potpunog opisa izuma, stručnjacima će biti jasno da se isti može provesti uz široki raspon ekvivalentnih parametara, koncentracija i uvjeta bez odvajanja od duha i područja izuma, te bez nepotrebne eksperimentacije.
Dok je izum opisan u svezi sa svojim specifičnim ostvarenjima, jasno je da su moguće njegove daljnje modifikacije. Ovom se prijavom namjeravaju obuhvatiti sve varijante, upotrebe ili prilagodbe izuma koje općenito slijede principe izuma i obuhvaćaju takva odvajanja od prisutnog otkrića koja ulaze u poznatu ili uobičajenu praksu znanstvenog područja na koji se izum odnosi i koja se mogu primijeniti na ranije navedene značajne karakteristike kao što slijedi u području pridodanih zahtjeva.
Sve su citirane reference, uključujući revijske članke ili sažetke, objavljene ili neobjavljene U. S. ili strane patentne prijave, izdane U. S ili strane patente ili bilo koje druge reference potpuno inkorporirane navodom, uključujući sve podatke, tablice, slike i tekst koji se nalazi u citiranim referencama. Cjelovit sadržaj citiranih referenca također je potpuno inkorporiran navodom.
Referenca poznatih metodoloških koraka, konvencionalnih metodoloških koraka, poznatih metoda ili konvencionalnih metoda ni na koji način ne predstavlja dopuštanje da se bilo koji aspekt, opis ili ostvarenje prisutnog izuma iznosi, smatra ili sugerira u relevantnoj znanosti.
Prethodni opis specifičnih ostvarenja potpuno prikazuje opće karakteristike izuma tako da će ga ostali moći, primjenom saznanja unutar znanosti (uključujući sadržaje citiranih referenca), lako modificirati i/ili prilagoditi za razne primjene, bez nepotrebne eksperimentacije i bez odvajanja od općeg koncepta prisutnog ituma. Namjera je da takve modifikacije i adaptacije ulaze u raspon ekvivalenata iznesenih ostvarenja, baziranih na ovdje predstavljenom podučavanju i vođenju. Frazeologija ili terminologija koja je upotrebljena u ovoj prijavi svrha je opisa, no ne i ograničenja, terminologija ili frazeologija prisutnog opisa izuma iznesena je u smislu podučavanja i vođenja stručnjaka na tom području.
PRIMJERI
Primjer 1
Dobivanje IL-6 i IL-6R/IL-6 kimera u CHO stanicama
IL-6R/IL-6 kimer
cDNA sljedovi koji kodiraju topljivi IL-receptor (prirodni oblik sIL-6R nađenog u urinu, Oh i ostali, 1997) spojeni su sa onima koji kodiraju zreli IL-6. Također su bili prisutni sljedovi za 3 premoštujuće aminokiseline (EFM). Spojeni gen umetnut je u ekspresijski vektor pod kontrolom CMV promotora, te je uveden u CHO stanice. Razvijen je postupak dobivanja, a nastali je rekombinatni protein pročišćen imunopročišćavanjem upotrebom anti-IL-6R monoklonalnog antitijela. Pročišćeni IL-6 kimer bio je glikoziliran, te pokazuje očitu MW od 85'000.
Slika 10 shematski prikazuje sastav IL-6R/IL-6 kimera. Zreli protein sadrži 524 aminokiseline.
Protein koji je dobiven i pročišćen na prethodno opisani način, prikladan je za primjenu prema izumu.
IL-6
Rekombinantni humani IL-6 (r-hIL-6) dobiven je iz genetički modificiranih jajnih stanica kineskih hrčaka (CHO). Postupak dobivanja započinje rastom i ekspanzijom stanica iz banke stanica (WBC) i nastavlja se pod uvjetima u kojima se r-hIL-6 izlučuje u mediju za kulture. Obrani r-hIL-6 medij za kulture pročisti se imunokromatografijom upotrebom specifičnog anti-IL-6 monoklonalnog antitijela (mAB). Daljnja pročišćavanja koriste se za dobivanje vrlo visoke razine čistoće.
r-hIL-6 se dobavlja u obliku sterilnog preparata osušenog smrzavanjem koji sadrži odgovarajuće ekscipijente. Dostupan je u dvije različite količine, 35 μg i 350 μg, te se za upotrebu rekonstituira vodom za injekcije. Rekonstitucijski volumen vode za jednu bočicu konačno formuliranog produkta obično iznosi 0,5 mL. Obrađeni produkt treba biti pohranjen u svom orginalnom spremniku pri temperaturi ispod 25 °C.
Struktura r-hIL-6 potvrđena je masenom spektroskopijom u kojoj dolazi do bombardiranja brzim atomima (FAB-MS), triptičkim mapiranjem i određivanjem slijeda aminokiselina. Za određivanje sastava upotrijebljene su FAB i elektroraspršujuća masena spektorskopija, kao i za određivanje sastava i strukture ugljikohidratnih dijelova IL-6. Ostatak asparagin-46 identificiran je kao N-glikozilacijski položaj, a preliminarna analiza N-vezanog ugljikohidrata pokazala je da su dominantne vrste monosialilna fukozilna biantenarna i disialilna fukozilna biantenarna struktura. O-glikozilacijski položaj identificiran je kao treonin-138 ili -139.
Primjer 2
Učinak IL-6 u modelu dijabetičke neuropatije koja je izazvana streptozotozinom na intraperitonealnu primjenu
MATERIJALI I METODE
Životinje
Šest tjedana stari mužjaci Sprague Dawely štakora (Janvier, Le Genest-St-Isle, Francuska) podijeljeni su u 9 eksperimentalnih skupina (n = 10) slučajnim odabirom: (a) kontrolna skupina tretirana prenosnikom kojoj je ubrizgana sterilna otopina fiziološka otopina-BSA 0,02% (masa/volumen); (b) kontrolna skupina koja se sastoji od životinja u koje je ubrizgan IL-6 u dozi od 100 μg/kg, otopljen u sterilnoj otopini fiziološka otopina-BSA 0,02%; (c) skupina koja je intoksicirana ubrizgavanjem streptozotocina (STZ) uz sterilnu otopinu fiziološka otopina-BSA 0,02%; (d) 5 tretiranih skupina intoksiciranih sa STZ koje se sastoje od životinja koje su primale injekcije IL-6 spoja u 5 različitih doza: 1, 3, 10, 30 i 100 μg/kg; (e) skupina koja je intoksicirana sa STZ i tretirana referentim spojem: 4-metil-katekolom (4-MC) u dozi od 10 μg/kg.
2 životinje po kavezu smještene su u prostoriju s kontroliranom temperaturom (21-22 °C) uz obrnuti ciklus svijetlo-tama (12h/12h), a hrana i voda im je bila dostupna ad libitum. Svi su eksperimenti provedeni prema propisanim naputcima.
Izazivanje dijabetesa i farmakološko liječenje
Dijabetes je izazvan ubrizgavanjem puferirane otopine streptozotocina (Sigma, L'Isle D'Abeau Chesnes, Francuska) u kirurški otkrivenu lijevu saphenu magnu u dozi od 55 mg po kilogramu tjelesne težine. Streptozotocin je otopljen neposredno prije ubrizgavanja u 0,1 mol/L citratnom puferu ph 4.5. Dan ubrizgavanja STZ smatrao se nultim danom, (D) 0.
Tjedan dana kasnije, D 10, kod svake je pojedine životinje ispitana krv za određivanje glikemije iz repne vene upotrebom glukometra (Glucotrend test, Roche, Mannheim, Njemačka). Životinje koje su pokazivale vrijednost manju od 260 mg/dL isključene su iz istraživanja. Glikemija je ponovno provjerena D 40, na kraju eksperimenta.
IP liječenje (prenosnik, IL-6 i 4-MC) provođeno je dnevno od D 11 do D 40.
Planiranje eksperimenta
Svaki dan su zabilježeni tjelesna težina i stupanj preživljavanja.
Testiranja vezana uz trzaj repom i EMG provodila su se jednom tjedno, po slijedećim danima:
D-7 : osnovna linija (trzaj repom i EMG)
D 0 : izazivanje dijabetesa injekcijom STZ
D 10 : mjerenje glikemije
D 11 : početak liječenja (IL-6 i 4-MC)
D 25 : EMG i testiranje trzaja repom
D 40 : kontrola glikemije, EMG i testovi trzaja repom, uklanjanje bedrenog živca
Test osjetljivosti: trzaj repom
Rep štakora smješten je pod lampu čija je temperatura kontrolirana poklopcem i koja je predstavljala izvor topline (Bioseb, Pariz, Francuska). Zabilježena je latencija prije nego što je štakor trznuo repom od izvora topline. Osjetilna alternacija povećava latenciju trzaja. Izvedena su dva pokusa, te izračunata je srednja vrijednost koja je zadržana kao karakteristična.
Elektromiografija
Elektrofiziološka mjerenja izvedena su upotrebom elektromiografa Neuromatic 200M (EMG) (Dantec, Les Ulis, Francuska). Štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 60 mg/kg ketamin-klorhidrata (Imalgene 500®, Rhône Mérieux, Lyon, Francuska). Normalna tjelesna temperatura održana je na 37 °C grijaćom lampom, a kontrolirana je kontaktnim termometrom (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, Francuska) na površini repa.
Nakon stimulacije bedrenog živca zabilježen je spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) u gastrocnemius mišiću. U stražnju šapu su smještene referentna elektroda i aktivna igla. Uzemljena igla upiknuta je u leđa štakora. Bedreni živac stimuliran je jednim impulsom od 0,2 ms supramaksimalnog inteziteta. Zabilježena je brzina motoričkih valova, te je izražena u ms.
Također je zabilježena brzina kondukcije osjetilnih živaca (CNVS). Elektrode na koži repa postavljene su na slijedeći način: referentna igla prema ekstremitetu repa, a anodna igla 30 mm od referentne igle prema ekstremitetu repa. Uzemljena elektrodna igla umetnuta je između anode i referentne igle. Leđni živac stimuliran je serijama od 20 impulsa (za 0,2 ms) intenziteta od 12,8 mA. Brzina je izražena u m/s.
Morfometrička analiza
Morfometrička analiza provedena je pri kraju istraživanja (D 40). Životinje su anestezirane IP injekcijom od 100 mg/kg sredstva Imalgène 500®. Za histologiju je izrezan 5-mm segment bedrenog živca. Tkivo je fiksirano preko noći 4% glutaraldehidom (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) otopinom u otopini fosfatnog pufera (pH = 7,4), te je smješteno u 30% sukrozi pri + 4 °C do upotrebe. Uzorak živca fiksiran je u 2% otopini osmijevog tetroksida (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) 2 sata, dehidriran u alkoholnoj otopini i položen u Epon. Uzorci tkiva smješteni su na +70 °C tijekom tri dana polimerizacije. Poprečni isječci od 1,5 μm izrezani su mikrotomom, bojani 1% otopinom toluidin plavo (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) 2 minute, dehidrirani i postavljeni u Eukitt. Upotrebom optičkog mikroskopa (Nikon, Tokyo, Japan) ispitano je davadeset isječaka, a 6 od njih je nasumično odabrano i analizirano upotrebom poluautomatskog digitanog softvera za analizu slika (Biocom, Francuska). Ispitivane su dvije nasumično odabrane površine po uzorku. Izračunati su slijedeći parametri: (a) promjer vlakna, (b) promjer aksona, (c) debljina mijelina (vidi ispod).
Za dobivanje ukupnog broja vlakana po isječku živca nasumično su odabrana 3 isječka po uzorku, a analizirana su dvije površine po isječku.
Analiza podataka
Globalna analiza podataka provedena je upotrebom jednofaktorske ili višefaktorske analize varijance (ANOVA) i jednosmjerne ANOVA. Dunnettov test je upotrebljen u slučaju kada je anova test ukazivao na značajnu razliku. Razina značajnosti namještena je na p < 0,05. Rezultati su izaženi kao srednja ± standardna pogreška prosjeka (s.e.m).
REZULTATI
Težina životinja
Kao što je prikazano na slici 1, u ovom istraživanju primjećena je značajna razlika između skupina u tjelesnoj težini [f (8, 296) = 19,47 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA]. Od D 5 do D 40 kod životinja koje su intoksicirane sa STZ/liječene s IL-6 javilo se značajno smanjenje u tijelesnoj težini (p < 0,05, jednosmjerna ANOVA i p < 0,05 kontrola u odnosu na na (vs) STZ; kontrola/IL-6 (100 μg/kg) vs STZ; kontrola vs STZ + IL-6 i kontrola/IL-6 (100 μg/kg) vs STZ + IL-6; Dunnettov test).
Kod dijabetičnih životinja liječenih s IL-6 u dozi od 10 μg/kg uočena je značajno veća tjelesna težina od one koja je uočena kod ostalih doza IL-6 [f (5, 185) = 1,16 i p = 0,08; višefaktorska ANOVA].
Treba napomenuti da se kod životinja koje su intoksicirane sa STZ/liječene s IL-6 u dozi od 100 μg/kg tijekom istraživanja smanjivala tjelesna težina (od početka liječenja).
Glikemija
Slika 2a prikazuje da je kod kontrolnih životinja dana D 10 bila prisutna glikemijska vrijednost od 100 mg/dL. S druge pak strane, kod štakora intoksiciranih sa STZ uočena je koncentracije glukoze u plazmi veća od 260 mg/dL i te su životinje smatrane dijabetičnim.
Slika 2B pokazuje da su štakori intoksicirani sa STZ bili dijabetični i dana D 40.
Test osjetljivosti: trzaj repom
U izvođenju testa trzaja repom postojala je značajna razlika između skupina [F (8, 16) = 2,07 i p = 0,013, višefaktorska ANOVA] (slika 3). Latencija prije nego što su štakori trznuli repom od topline bila je značajno povećana kod dijabetičnih, neliječenih životinja (kontrola/prenosnik vs STZ/prenosnik p < 0,001; Dunnettov test). Dana D 25 i D 40 reakcijsko vrijeme nije se povećalo kod životinja liječenih s IL-6 u dozama od 1, 3, 10 i 100 μg/kg, te onih koje su liječene s 4-MC u dozi od 10 μg/kg. Dapače, između te dvije skupine nije otkrivena značajna razlika (p > 0,05; Dunnettov test).
Elektrofiziološka mjerenja
Latencija spojnog mišićnog aktivnog potencijala
Tijekom istraživanja postojala je značajna razlika između skupina u latenciji CMAP [F (8, 16 = 5,901 i p < 0,001, višefaktorska ANOVA]. Latencija je bila značajno povećana kod dijabetičnih, neliječenih životinja (25. i 40. dana: p < 0,001, jednosmjerna ANOVA). Povećanje je bilo manje izražajno kod skupina liječenih s IL-6, posebno za skupinu liječenu s IL-6 u dozi od 10 μg/kg kod koje nije uočena značajna razlika u vrijednosti latencije skupine kontrola/prenosnik (slika 4).
Nadalje, 25. dana, kod svake je skupine tretirane s IL-6/STZ uočena značajno kraća CMAP latencija od CMAP latencija skupine prenosnik/STZ (p = 0,001, Dunnettov test).
40. dana donesen je isti zaključak.
Između životina tretiranih s IL-6/STZ (10 mg/kg) i 4 ostalih skupina tretiranih s IL-6 (1, 3, 10, 30 i 100 μg/kg) (D 25: p = 0,002, D 40: p = 0,003; jednosmjerni ANOVA test). 25. dana i 40. dana je kod životinja liječenih s 3 μg/kg i 10 μg/kg uočena manje značajna latencija nego kod skupina tretiranih s IL-6/STZ u dozama od 1, 30 i 100 μg/kg (p < 0,05; Dunnettov test).
Brzina kondukcije osjetilnih živaca
Između skupina je tijekom istraživanja uočena značajna razlika u SNCV [F (8, 16) = 5,518 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA] (slika 5). Kod dijabetičnih štakora uočeno je značajno smanjenje SNCV (25. i 40. dana: p < 0,001; jednosmjerna ANOVA) u odnosu na skupinu kontrola/prenosnik. Nadalje, 25. dana nije uočena značajna razlika između skupine kontrola/prenosnik i skupine liječene s 10 μg/kg IL-6 (p = 0,426; Dunnettov test), dok je između svih ostalih skupina uočena značajna razlika. 25. dana je samo kod životinja liječenih s 10 i 30 μg/kg uočena značajna razlika u odnosu na skupinu STZ/prenosnik (10 μg/kg vs skupine prenosnik/STZ: p < 0,001, 30 μg/kg vs skupine STZ, p = 0,004, Dunnettov test). 40. dana životinje liječene s 10 μg/kg nisu pokazale nikakvu značajnu razliku s životinjama tretiranim sa STZ/prenosnik, no SNCV vrijednost ove skupine bila je veća od ostalih životinja tretiranih sa STZ/prenosnik.
Treba napomenuti da je SNCV postepeno rasla tijekom istraživanja kod životinja kontrola/prenosnik zbog normalnog razvoja periferne živčane strukture (Gao i ostali, 1995, Malone i ostali, 1996).
Morfometrička analiza
Promjer aksona
U promjeru aksona nađena je značajna razlika između skupina (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA) (slika 6). U usporedbi s kontrolnim štakorima, kod životinja prenosnik/STZ uočeno je značajno smanjenje u promjeru aksona (p = 0,08, Dunnettov test). Takvo smanjenje u promjeru aksona mijenja se liječenjem s IL-6 u dozi manjoj od 3 μg/kg (štakori liječeni s IL-6 vs STZ/ prenosnik p < 0,001; Dunnettov test). Nadalje, između kontrolne skupine i skupine ntrola/IL-6 (100 μg/kg) uočena je značajna razlika (p < 0,001; Dunnettov test). Između skupine kontrola/prenosnik i skupine liječene s 4-MC nije nađena nikakava značajna razlika (p = 0,657; Dunnettov test).
Promjer vlakna
Slika 7 prikazuje da je postojala značajna razlika u promjeru vlakna između 9 skupina (p < 0.001, jednosmjerna ANOVA). Primjena STZ dovodi do značajnog smanjenja promjera vlakna (kontrola/prenosnik vs STZ/prenosnik p = 0,005; Dunnettov test). Kod štakora liječenih s IL-6 uočen je veći promjer vlakna nego kod štakora prenosnik/kontrola. Nađena je značajna razlika između kontrolne skupine i skupine kontrola/IL-6 (100 μg/kg) (p < 0,001; Dunnettov test). Kod životinja liječenih s 4-MC u dozi od 10 μg/kg nije uočena značajna razlika sa skupinom kontrola/prenosnik (p = 0,628; Dunnettov test).
Debljina mijelina
Uspoređivanjem debljine mijelina uočena je značajna razlika između 9 skupina (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA) (slika 8). Debljina mijelina je kod životinja prenosnik/STZ bila značajno manja nego kod životinja kontrola/prenosnik i kod životinja liječenih s IL-6 (3, 10, 30 i 100 μg/kg) (p < 0,01; Dunnettov test). Treba se napomenuti da je kod svih životinja tretiranih s IL-6/STZ uočena značajno veća debljina mijelina nego kod skupine prenosnik/STZ. Nadalje, uočili smo značajnu razliku između skupina kontrola/prenosnik i konrola/IL-6 (100 μg/kg) (p < 0,001; Dunnettov test).
Ukupni broj mijeliniziranih vlakana
Kao što je prikazano na slici 9, između skupina je postojala značajna razlika u ukupnom broju mijeliniziranih vlakana (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA). Kod životinja prenosnik/STZ uočen je manji broj vlakana nego kod kontrolnih životinja (p < 0,001; Dunnettov test). Nasuprot tome, životinje tretirane s IL-6/STZ imale su veći broj vlakana u usporedbi s životinjama prenosnik/STZ (p < 0,001; Dunnettov test). Životinje intoksicirane sa STZ i liječene s 4-MC imale su ukupan broj vlakana analogan onom kod kontrolnih životinja. Nadalje, nije uočena značajna razlika između skupine kontrola/prenosnik i skupine kontrola/IL-6 (100 μg/kg).
ZAKLJUČAK
U ovom su istraživanju kao model izazvane neuropatije upotrebljene životinje intoksicirane strptozotocinom kod kojih se nekoliko dana kasnije razvio dijabetes. Životinje su postale dijabetične 3-4 dana nakon indukcije.
Dijabetične životinje liječene su različitim dozama IL-6 (1, 3, 10, 30 i 100 μg/kg) 30 dana. Liječenje je primijenjeno intraperitonealno svaki dan, počevši od desetog dana nakon indukcije sve do žrtvovanja životinja 40 dana nakon izazivanja sa STZ. Ovaj način liječenja može se smatrati kurativnim liječenjem zato što je IL-6 primijenjen nakon prvih molekularnih oštećenja koje uzrokuje dugotrajna hiperglikemija.
Prisutni postupak pokazuje da IL-6 liječenje tijekom 30 dana izaziva neuroprotekciju protiv dijabetičke neuropatije. Bihevioralna analiza s trzajem repa i EMG testiranjem (osjetilne i motoričke brzine) pokazuje neuroprotektivan učinak IL-6, posebno u dozama od 3 i 10 μg/kg.
Neuroprotektivan učinak uočen je kod niskih doza, kao i kod visokih koncentracija. Štoviše, povećavanjem doza liječenja, smanjuje se neuroprotektivan učinak. Nadalje, kod najviše doze (100 μg/kg) nije izražen navedeni učinak, te se smatra da ima tokksičan učinak na opće ponašanje STZ-životinja. Kontrolne životinje (koje nisu tretirane sa STZ) liječene s IL-6 u dozi 100 μg/kg bile su osjetljivije u usporedbi s kontrolnim životinjama koje su tretirane samo prenosnikom ili pak sa štakorima koji su tretirani sa STZ i niskim koncentracijama IL-6. Osim toga, takvim je životinjama (IL-6 100 μg/kg) bilo teže manipulirati. Isto je uočeno sa STZ/IL-6 100 μg/kg. Međutim, takve su životinje bile manje osjetljive (vjerovatno zbog slabosti uslijed velikog gubitka na težini).
Neuroprotektivan učinak fokusiran je na osjetilna vlakna, kao i na motorička vlakna (CMAP brzina se nije mijenjala IL-6 liječenjem).
S obziroma na morfološku analizu, neuroprotekcija koju uzrokuje liječenje s IL-6 očita je za sve istraživane doze. Kod vlakana životinja STZ/prenosnik uočeno je smanjenje debljine mijelinske ovojnice i alternacija aksona, što konačno izaziva degeneraciju vlakana (izraženu smanjenjem ukupnog broja vlakana).
U ovom istraživanju dokazano je da liječenje s IL-6 (posebno u dozi od 10 μg/kg) štiti mijelinsku ovojnicu i sprečava degeneraciju aksona.
Treba napomenuti da visoka doza IL-6 (100 μg/kg) ima štetan učinak na vlakna zdravih životinja. Štoviše, vlakna su oštećena, nema gubitka vlakana, no mijenjaju se ovojnica i opći izgled vlakana. Takav učinak nije zabilježen kod dijabetičnih životinja liječenih visokom dozom IL-6 (toksični učinak uglavnom je vezan uz opće ponašanje životinje okarakterizirano velikim gubitkom tjelesne težine).
Kao zaključak, IL-6 izaziva očit neuroprotektivan učinak nakon 30 dana liječenja kako na osjetilna tako i na motorička vlakna, vjerovatno direktim djelovanjem na vlakna i smanjivanjem upalnih procesa neurodegeneracije.
Primjer 3
Učinak IL-6 u modelu dijabetičke neuropatije koja je izazvana streptozotozinom na potkožnu primjenu
Cilj ovog istraživanja bio je odrediti učinak IL-6 preko potkožnog puta primjene u različitom doziranju i vremensko praćenje istog modela neuropatije.
Životinje
Istraživanje A
Šest tjedana stari mužjaci Sprague Dawely štakora (Janvier, Le Genest-St-Isle, Francuska) podijeljeni su u 6 eksperimentalnih skupina slučajnim odabirom: (a) kontrolna skupina tretirana prenosnikom (n = 4) kojoj je ubrizgana sterilna otopina fiziološka otopina-BSA 0,02% (masa/volumen); (b) skupina koja je intoksicirana ubrizgavanjem streptozotocina (STZ) (n = 10) uz sterilnu otopinu fiziološka otopina-BSA 0,02%; (c) 4 tretiranih skupina intoksiciranih sa STZ (n = 10) koje se sastoje od životinja koje su primale dnevne SC injekcije IL-6 spoja u 4 različite doze: 1, 3, 10 i 30 μg/kg.
2 životinje po kavezu smještene su u prostoriju s kontroliranom temperaturom (21-22 °C) uz obrnuti ciklus svijetlo-tama (12h/12h), a hrana i voda im je bila dostupna ad libitum. Svi su eksperimenti provedeni prema propisanim naputcima.
Istraživanje B
Šest tjedana stari mužjaci Sprague Dawely štakora (Janvier, Le Genest-St-Isle, Francuska) podijeljeni su u 7 eksperimentalnih skupina slučajnim odabirom: (a) kontrolna skupina tretirana prenosnikom (n = 4) kojoj je ubrizgana sterilna otopina fiziološka otopina-BSA 0,02% (masa/volumen); (b) skupina koja je intoksicirana ubrizgavanjem streptozotocina (STZ) (n = 10) uz sterilnu otopinu fiziološka otopina-BSA 0,02%; (c) 4 tretiranih skupina intoksiciranih sa STZ (n = 10) koje se sastoje od životinja koje su primale SC injekcije IL-6 spoja tri puta tjedno u 4 različite doze: 1, 3, 10 i 30 μg/kg; (d) skupina tretirana sa STZ (n = 10) koja se sastoji od životinja koje su primale IP injekcije IL-6 spoja u dozi od 10 μg/kg.
2 životinje po kavezu smještene su u prostoriju s kontroliranom temperaturom (21-22 °C) uz obrnuti ciklus svijetlo-tama (12h/12h), a hrana i voda im je bila dostupna ad libitum. Svi su eksperimenti provedeni prema propisanim naputcima.
Istraživanje C
Šest tjedana stari mužjaci Sprague Dawely štakora (Janvier, Le Genest-St-Isle, Francuska) podijeljeni su u 6 eksperimentalnih skupina slučajnim odabirom: (a) kontrolna skupina tretirana prenosnikom (n = 4) kojoj je ubrizgana sterilna otopina fiziološka otopina-BSA 0,02% (masa/volumen); (b) skupina koja je intoksicirana ubrizgavanjem streptozotocina (STZ) (n = 10) uz sterilnu otopinu fiziološka otopina-BSA 0,02%; (c) 4 tretiranih skupina intoksiciranih sa STZ (n = 10) koje se sastoje od životinja koje su primale SC injekcije IL-6 spoja jednom tjedno u 4 različite doze: 1, 3, 10 i 30 μg/kg.
2 životinje po kavezu smještene su u prostoriju s kontroliranom temperaturom (21-22 °C) uz obrnuti ciklus svijetlo-tama (12h/12h), a hrana i voda im je bila dostupna ad libitum. Svi su eksperimenti provedeni prema propisanim naputcima.
Izazivanje dijabetesa i farmakološko liječenje
Dijabetes je izazvan ubrizgavanjem puferirane otopine streptozotocina (Sigma, L'Isle D'Abeau Chesnes, Francuska) u kirurški otkrivenu lijevu saphenu magnu u dozi od 55 mg/kg tjelesne težine. Streptozotocin je otopljen neposredno prije ubrizgavanja u 0,1 mol/L citratnom puferu ph 4.5. Dan ubrizgavanja STZ smatrao se nultim danom, (D) 0.
Tjedan dana kasnije, D 10, kod svake pojedine životinje ispitana je krv za određivanje glikemije iz repne vene upotrebom glukometra (Glucotrend test, Roche, Mannheim, Njemačka). Životinje koje su pokazivale vrijednost manju od 260 mg/dL isključene su iz istraživanja. Glikemija je ponovno provjerena D 40, na kraju eksperimenta.
Liječenje (prenosnik i IL-6) je provođeno na dnevnoj osnovi od D 11 do D 40.
Planiranje eksperimenta
Svaki dan su zabilježeni tjelesna težina i stupanj preživljavanja.
Testiranja vezana uz trzaj repom i EMG provodila su se jednom tjedno, po slijedećim danima:
D-7 : osnovna linija (trzaj repom, lokomotorna aktivnost i EMG)
D 0 : izazivanje dijabetesa injekcijom STZ
D 10 : mjerenje glikemije
D 11 : početak liječenja (IL-6)
D 24 : test trzaja repom
D 25 : lokomotorna aktivnost na OF (otvorenoj površini)
D 26 : EMG testiranje
D 38 : test trzaja repom
D 39 : lokomotorna aktivnost na OF
D 40 : kontrola glikemije, EMG testiranje, uklanjanje bedrenog živca
Test osjetljivosti: trzaj repom
Rep štakora smješten je pod lampu čija je temperatura kontrolirana poklopcem i koja je predstavljala izvor topline (Bioseb, Pariz, Francuska). Zabilježena je latencija prije nego što je štakor trznuo repom od izvora topline. Osjetilna alternacija povećava latenciju trzaja. Izvedena su dva pokusa, te izračunata je srednja vrijednost koja je zadržana kao karakteristična.
Lokomotorna aktivnost na otvorenoj površini
Životinje su smještene na otvorenoj površini (OF) koja je ograđena pleksiglasom (80 x 80 x 40 ) i podijeljena na 16 jednakih kvadrata. Za svaku je životinju tijekom vremenskog perioda od 10 minuta zabilježena spontana lokomotorna aktivnost i broj uzdizanja.
Elektromiografija
Elektrofiziološka mjerenja izvedena su upotrebom elektromiografa Neuromatic 200M (EMG) (Dantec, Les Ulis, Francuska). Štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 60 mg/kg ketamin-klorhidrata (Imalgene 500®, Rhône Mérieux, Lyon, Francuska). Normalna tjelesna temperatura održana je na 37 °C grijaćom lampom, a kontrolirana je kontaktnim termometrom (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, Francuska) na površini repa.
Nakon stimulacije bedrenog živca zabilježen je spojni mišićni aktivni potencijal (CMAP) u gastrocnemius mišiću. U stražnju šapu su smještene referentna elektroda i aktivna igla. Uzemljena igla upiknuta je u leđa štakora. Bedreni živac stimuliran je jednim impulsom od 0,2 ms supramaksimalnog inteziteta. Zabilježena je brzina motoričkih valova, te je izražena u ms.
Također je zabilježena brzina kondukcije osjetilnih živaca (CNVS). Elektrode na koži repa postavljene su na slijedeći način: referentna igla prema ekstremitetu repa, a anodna igla 30 mm od referentne igle prema ekstremitetu repa. Uzemljena elektrodna igla umetnuta je između anode i referentne igle. Leđni živac stimuliran je serijama od 20 impulsa (za 0,2 ms) intenziteta od 12,8 mA. Brzina je izražena u m/s.
Morfometrička analiza
Morfometrička analiza provedena je pri kraju istraživanja (D 40). Životinje su anestezirane IP injekcijom od 100 mg/kg sredstva Imalgène 500®. Za histologiju je izrezan 5-mm segment bedrenog živca. Tkivo je fiksirano preko noći 4% glutaraldehidom (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) otopinom u otopini fosfatnog pufera (pH = 7,4), te je smješteno u 30% sukrozi pri + 4 °C do upotrebe. Uzorak živca fiksiran je u 2% otopini osmijevog tetroksida (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) 2 sata, dehidriran u alkoholnoj otopini i položen u Epon. Uzorci tkiva smješteni su na +70 °C tijekom tri dana polimerizacije. Poprečni isječci od 1,5 μm izrezani su mikrotomom, bojani 1% otopinom toluidin plavo (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francuska) 2 minute, dehidrirani i postavljeni u Eukitt. Upotrebom optičkog mikroskopa (Nikon, Tokyo, Japan) ispitano je davadeset isječaka, a 6 od njih je nasumično odabrano i analizirano upotrebom poluautomatskog digitanog softvera za analizu slika (Biocom, Francuska). Ispitivane su dvije nasumično odabrane površine po uzorku. Izračunati su slijedeći parametri: (a) promjer vlakna, (b) promjer aksona, (c) debljina mijelina.
Za dobivanje ukupnog broja vlakana po isječku živca nasumično su odabrana 3 isječka po uzorku, a analizirana su dvije površine po isječku.
Analiza podataka
Globalna analiza podataka provedena je upotrebom jednofaktorske ili višefaktorske analize varijance (ANOVA) i jednosmjerne ANOVA. Dunnettov test je upotrebljen u slučaju kada je anova test ukazivao na značajnu razliku. Razina značajnosti namještena je na p < 0,05. Rezultati su izaženi kao srednja ± standardna pogreška prosjeka (s.e.m).
REZULTATI
Istraživanje A
Težina životinja
Kao što je prikazano na slici 11, u ovom istraživanju primjećena je značajna razlika između skupina u tjelesnoj težini [F (5, 185) = 9,20 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA]. Od D 5 do D 40 kod životinja koje su intoksicirane sa STZ/liječene s IL-6 javilo se značajno smanjenje u tjelesnoj težini (p < 0,05, jednosmjerna ANOVA i p < 0,05 kontrola u odnosu na (vs) STZ; kontrola vs STZ + IL-6; Dunnettov test).
Kod dijabetičnih životinja liječenih s IL-6 u dozi od 10 μg/kg uočena je značajno veća tjelesna težina nego kod ostalih doza IL-6 [F (4, 148) = 2,93 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA].
Glikemija
Slika 12 prikazuje da je kod kontrolnih životinja dana D 10 bila prisutna glikemijska vrijednost od 120 mg/dL. S druge pak strane, kod štakora intoksiciranih sa STZ uočena je koncentracija glukoze u plazmi veća od 260 mg/dL i te su životinje smatrane dijabetičnim.
Treba napomenuti da su dana D 41 štakori intoksicirani sa STZ i dalje bili dijabetični (štakor br. 2 iz skupine STZ/IL-6 (10 μg/kg) eliminiran je iz istraživanja budući da je kod njega vrijednost glikemije bila manja od 260 mg/dL).
Test osjetljivosti: trzaj repom
U izvođenju testa trzaja repom nije postojala značajna razlika između skupina [F (5, 10) = 1,81 i p = 0,072, višefaktorska ANOVA] (slika 13). Latencija prije nego što su štakori trznuli repom od topline značajno je povećana kod dijabetičnih, neliječenih životinja, te onih koje su liječene s IL-6 u većim dozama. Dana D 38, reakcijsko vrijeme nije se povećalo kod životinja liječenih s IL-6 u dozama od 1 i 3 μg/kg. Dapače, između te dvije skupine nije otkrivena značajna razlika (p > 0,05; Dunnettov test).
Lokomotorna aktivnost na OF
Kao što je prikazano na slikama 14A i 14B, tijekom ispitivanja postojala je značajna razlika u broju pređenih kvadrata i uzdizanja [F (5, 10) = 5,99 s p < 0,001, odnosno F (5, 10) = 4,22 s p < 0,001; višefaktorska ANOVA]. 25. i 40. dan je kod dijabetičnih, liječenih ili neliječenih životinja uočena niža lokomotorna aktivnost okarakterizirana značajnim smanjenjem broja pređenih kvadrata i uzdizanja (kontrola vs STZ/prenosnik i kontrola vs STZ/IL-6 p < 0,01; Dunnettov test).
Treba napomenuti da je kod životinja liječenih s dozama od 1 i 3 μg/kg bila prisutna niža lokomotorna aktivnost nego kod štakora STZ/prenosnik.
Elektrofiziološka mjerenja
Latencija spojnog mišićnog aktivnog potencijala
Tijekom istraživanja postojala je značajna razlika između skupina u latencija CMAP [F (5, 10) = 5,71 i p < 0,001, višefaktorska ANOVA]. Latencija je bila značajno povećana kod dijabetičnih, neliječenih životinja (dana 26. i dana 41.: p < 0,01, jednosmjerna ANOVA). Povećanje je bilo manje izražajno u svakoj skupini koja je liječena s IL-6 (slika 15).
26. dana i 41. dana je kod svake STZ/liječene s IL-6 skupine uočena CMAP latencija značajno kraća od CMAP latencije skupine STZ/prenosnik (p = 0,05; Dunnettov test).
Brzina kondukcije osjetilnih živaca
Između skupina je tijekom istraživanja uočena značajna razlika u SNCV [F (5, 10) = 3,78 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA] (slika 16). Kod dijabetičnih štakora uočeno je značajno smanjenje SNCV (dana 26. i dana 41: p < 0,01; jednosmjerna ANOVA) u odnosu na skupinu kontrola/prenosnik.
26. i 41. dana je kod svih životinja liječenih s IL-6 uočena značajna razlika sa STZ/prenosnik skupinom (p < 0,05; Dunnettov test). Osim toga, 41. dana nije zapažena nikakva značajna razlika (p = 0,054, odnosno p = 0,184); Dunnettov test) između skupine kontrola/prenosnik i skupina liječenih s 3 i 30 μg/kg IL-6, dok je značajna razlika bila vidljiva između svih ostalih skupina
Morfometrička analiza
Promjer vlakna
Kao što je prikazano na slici 17, između skupina je uočena je značajna razlika u promjeru vlakna (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA). Kod dijabetičkih štakora uočeno je smanjenje promjera vlakna u usporedbi sa skupinom kontrola/prenosnik (p < 0,001; Dunnettov test). Nadalje, liječenje s IL-6 u svim ispitanim dozama značajno sprečava smanjenje promjera vlakna (STZ/prenosnik vs STZ/liječene s IL-6: p < 0,05; Dunnettov test).
Promjer aksona
U promjeru aksona nađena je značajna razlika između skupina (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA) (slika 18). U skupini STZ/prenosnik uočeno je značajno smanjenje u promjeru aksona (kontrola/prenosnik vs STZ/prenosnik: p < 0,001: Dunnettov test). Kod životinja liječenih s IL-6 u svim ispitivanim dozama prisutan je značajno veći promjer aksona nego kod dijabetičkih, neliječenih štakora (p < 0,05; Dunnettov test).
Debljina mijelina
Između skupina uočena je značajna razlika u debljini mijelina (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA) (slika 19). Kod dijabetičnih štakora uočena je značajna razlika u usporedbi s životinjama kontrola/prenosnik (p < 0,001; Dunnettov test). Osim toga, takav je porast manje značajan kod skupina liječenih s IL-6 (p < 0,05; Dunnettov test).
Postotak degeneriranih vlakana
Kao što je prikazano na slikama 20 i 21, kod dijabetičnih i neliječenih štakora uočeno je značajno opadanje broja mijeliniziranih vlakana (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA). Svakodnevno liječenje s IL-6 u dozama od 3, 10 i 30 μg/kg značajno smanjuje postotak degeneriranih vlakana u usporedbi sa skupinom STZ/prenosnik (p < 0,001; Dunnettov test).
Istraživanje B
Težina životinja
Između skupina postojala je značajna razlika u razvoju tjelesne težine [F (6, 168) = 9,24 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA] (slika 22). Od D 5 do D 40 kod životinja koje su intoksicirane sa STZ/liječene s IL-6 javilo se značajno smanjenje u tjelesnoj težini (p < 0,05, jednosmjerna ANOVA i p < 0,001 kontrola/prenosnik vs STZ/liječene s IL-6; Dunnettov test).
Od D 5 do D 40 nije uočena značajna razlika u tjelesnoj težini između skupina STZ/liječene s IL-6 [F (5,125) = 1,08 i p = 0,26; višefaktorska ANOVA].
Glikemija
Kao što je prikazano na slici 23, kod štakora intoksiciranih sa STZ uočena je koncentracija glukoze u plazmi veća od 260 mg/dl, dok je kod kontrolnih životinja ona iznosila oko 100 mg/dL.
Dana D 40 su štakori intoksicirani sa STZ i dalje bili dijabetični, vrijednosti glikemije veće od 500 mg/dL.
Test osjetljivosti: trzaj repom
U izvođenju testa trzaja repom postojala je značajna razlika između skupina [F (6, 12) = 2,13 i p = 0,02, višefaktorska ANOVA] (slika 24). 24. i 38. dana je kod dijabetičnih i neliječenih štakora uočen značajan porast reakcijskog vremena u usporedbi s kontrola/prenosnik i skupinama STZ/liječene s IL-6 (p < 0,05; Dunnettov test).
Osim toga reakcijsko vrijeme manje se povećalo kod životinja liječenih s IL-6 u dozama od 10 i 30 μg/kg.
Lokomotorna aktivnost na OF
Kao što je prikazano na slikama 25A i 25B, tijekom ispitivanja postojala je značajna razlika u broju pređenih kvadrata i uzdizanja [F (5, 10) = 5,99 s p < 0,001, odnosno F (5, 10) = 4,22 s p < 0,001; višefaktorska ANOVA]. 25. i 40. dan je kod dijabetičnih, liječenih ili neliječenih životinja uočena niža lokomotorna aktivnost okarakterizirana značajnim smanjenjem broja pređenih kvadrata i uzdizanja (kontrola vs STZ/prenosnik i kontrola vs STZ/IL-6 p < 0,05; Dunnettov test).
Elektrofiziološka mjerenja
Latencija spojnog mišićnog aktivnog potencijala
Kao što je prikazano na slici 26, tijekom istraživanja postojala je značajna razlika između skupina u latenciji CMAP [F (6, 12) = 3,97 i p < 0,001, višefaktorska ANOVA]. 26. i 40. dan uočen je značajni porast latencije kod dijabetičnih neliječenih štakora i životinja liječenih s niskom dozom IL-6 (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA). Zatim, između skupina kontrola/prenosnik i STZ/liječene s IL-6 (10 i 30 μg/kg) nije uočena značajna razlika (p > 0,05; jednosmjerna ANOVA).
Brzina kondukcije osjetilnih živaca
Između skupina je tijekom istraživanja uočena značajna razlika u SNCV [F (6, 12) = 3,38 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA] (slika 27). 26. dana je kod dijabetičnih, te liječenih ili neliječenih štakora uočeno je značajno smanjenje SNCV (D 26: p < 0,001; i D 40: p < 0,001; jednosmjerna ANOVA).
Dana D 26 je kod životinja kontrola/prenosnik i STZ/liječene s IL-6 uočeno značajno veća SNCV vrijednost nego kod štakora STZ/prenosnik (p < 0,05; Dunnettov test).
Dana D 40 je kod štakora liječenih s većim dozama IL-6 bila prisutna značajnija SNCV vrijednost nego kod skupine STZ/prenosnik.
Morfometrička analiza
Promjer vlakna
Kao što je prikazano na slici 28, između skupina je uočena je značajna razlika u promjeru vlakna (p = 0,045, jednosmjerna ANOVA). Kod štakora koji su intoksicirani sa STZ uočeno je značajnao smanjenje promjera vlakna u usporedbi sa štakorima kontrola/prenosnik (p < 0,05; Dunnettov test). Dnevno IP liječenje s IL-6 sprečava takvo smanjenje promjera vlakna (STZ/prenosnik vs STZ/IL-6 IP: p = 0,026; Dunnettov test).
Promjer aksona
U promjeru aksona postojala je značajna razlika između skupina (p = 0,034; jednosmjerna ANOVA) (slika 29). U skupini STZ/prenosnik uočeno je značajno smanjenje u promjeru aksona (p < 0,05: Dunnettov test). Kod štakora liječenih IP putem s IL-6 u dozi od 10 μg/kg uočena je značajna razlika u odnosu na životinje STZ/prenosnik (p = 0,045; Dunnettov test).
Debljina mijelina
Između skupina je uočena značajna razlika u debljini mijelina (p = 0,05, jednosmjerna ANOVA) (slika 30). Kod životinja intoksiciranih sa STZ uočeno je značajno smanjenje u debljini mijelina (p < 0,05; Dunnettov test). Dnevno IP liječenje s IL-6 sprečava takvo smanjenje debljine mijelina (STZ/prenosnik vs STZ/IL-6 IP: p < 0,005; Dunnettov test).
Postotak degeneriranih vlakana
Kao što je prikazano na slikama 31 i 32, nađena je značajna razlika između skupina u postotku degeneriranih vlakana (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA). Taj je postotak bio značajno veći kod skupine STZ/prenosnik nego kod skupine kontrola/prenosnik (p < 0,001; Dunnettov test). Postotak je značajno smanjen kod životinja liječenih s IL-6 (STZ/prenosnik vs STZ/IL-6: p < 0,001; Dunnettov test).
Istraživanje C
Težina životinja
Između skupina je tijekom istraživanja postojala je značajna razlika u razvoju tjelesne težine [F (5, 145) = 15,46 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA] (slika 33). Od D 5 do D 40 se kod životinja koje su intoksicirane sa STZ javilo značajno smanjenje u tjelesnoj težini (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA i p < 0,001 kontrola/prenosnik vs STZ; kontrola/prenosnik vs skupina STZ/liječene s IL-6; Dunnettov test).
Osim toga, kod životinja liječenih s IL-6 u dozi od 30 μg/kg uočeno je manje značajno smanjenje u tjelesnoj težini nego kod ostalih skupina liječenih s IL-6 [F (4, 104 = 2,17 i p < 0,001; višefaktorska ANOVA].
Glikemija
Slika 34 prikazuje da je kod skupine kontrola/prenosnik dana D 10 i D 40 prisutna glikemijska vrijednost manja od 120 mg/dL. S druge pak strane, kod štakora intoksiciranih sa STZ uočena je koncentracija glukoze u plazmi veća od 260 mg/dL, tako da su dana D 10 i D 40 smatrani dijabetičnima.
Test osjetljivosti: trzaj repom
U reakcijskom je vremenu tijekom istraživanja postojala značajna razlika između skupina [F (5, 10) = 2,30 i p = 0,02, višefaktorska ANOVA] (slika 35). Kod životinja STZ/prenosnik je latencija prije nego što su štakori trznuli repom od topline bila značajno povećena (D 24 i D 38: p < 0,005, jednosmjerna ANOVA). Dana D 24 nije bilo značajne razlike u latenciji reakcije između skupina kontrola/prenosnik i STZ/IL-6 (30 μg/kg) (p = 0,31; Dunnettov test). Dana D 38 je kod štakora liječenih s 10 i 30 μg/kg IL-6 uočena reakcija slična onoj kod kontrole (p = 0,3; Dunnettov test).
Lokomotorna aktivnost na OF
25. i 39. dan (slike 36A i 36B) je kod životinja intoksiciranih sa STZ, liječenih ili neliječenih, uočena značajno niža lokomotorna aktivnost nego kod kontrolnih štakora (p < 0,005; Dunnettov test). Ta razlika uočena je u prosječnom broju pređenih kvadrata i broja uzdizanja tijekom zabilježenog perida. Međutim, kod skupine životinja koje su liječene IL-6 u dozi od 30 μg/kg bila je prisutna veća lokomotorna aktivnost nego kod skupine STZ/prenosnik.
Elektrofiziološka mjerenja
Latencija spojnog mišićnog aktivnog potencijala
Tijekom istraživanja nije postojala značajna razlika između skupina u latenciji CMAP [F (5, 10) = 1,33 i p = 0,23, višefaktorska ANOVA] (slika 37). Međutim, ona je uočena dana D 26 i D 40 (p < 0,05; jednosmjerna ANOVA). Kod štakora intoksiciranih sa STZ uočen je značajni porast latencije u usporedbi sa skupinom kontrola/prenosnik. Osim toga, porast je bio manje značajan kod skupina koje su liječene većim dozama IL-6, a između skupina STZ/prenosnik i STZ/IL-6 uočena je značajna razlika (dana D 26: STZ/prenosnik vs STZ/IL-6 u dozama 3, 10, 30 μg/kg: p < 0,005 i dana D 40: STZ/prenosnik vs STZ/IL-6 u dozi 30 μg/kg: p < 0,005; Dunnettov test).
Brzina kondukcije osjetilnih živaca
Kao što je prikazano na slici 38, između skupina je tijekom istraživanja uočena značajna razlika u brzini kondukcije osjetilnih živaca [F (5, 10) = 2,18 i p = 0,025; višefaktorska ANOVA]. Kod životinja intoksiciranih sa STZ uočena je značajna razlika u brzini (kontrola/prenosnik vs STZ/prenosnik i STZ/IL-6 skupine: p < 0,05; Dunnettov test). Osim toga, liječenje s IL-6 u dozi od 10 i 30 μg/kg dovelo je do manje značajnog gubitka brzine kod dijabetičnih životinja (dana D 26, STZ/IL-6 u dozi od 10 i 30 μg/kg vs STZ/prenosnik: p < 0,05; Dunnettov test).
Morfometrička analiza
Promjer vlakna
Kao što je prikazano na slici 39, između skupina je uočena značajna razlika u promjeru vlakna (p < 0,001, jednosmjerna ANOVA). Kod štakora koji su intoksicirani sa STZ uočeno je značajno smanjenje promjera vlakna u usporedbi sa štakorima kontrola/prenosnik (p < 0,005; Dunnettov test). Kod životinja liječenih S IL-6 (u svim dozama) prisutan je značajno veći promjer vlakana nego kod štakora STZ/prenosnik (p <0,05; Dunnettov test)
Promjer aksona
U promjeru aksona postojala je značajna razlika između skupina (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA) (slika 40). Kod životinja koje su intoksicirane sa STZ uočeno je značajno smanjenje u promjeru aksona (p < 0,001: Dunnettov test). Kod štakora liječenih s IL-6 u dozi od 1, 3, 10 i 30 μg/kg uočena je značajna razlika u odnosu na životinje STZ/prenosnik (p < 0,05; Dunnettov test).
Debljina mijelina
Između skupina uočena je značajna razlika u debljini mijelina (p = 0,001, jednosmjerna ANOVA) (slika 41). Kod životinja intoksiciranih sa STZ uočeno je značajno smanjenje u debljini mijelina (p < 0,001; Dunnettov test). Dnevno SC liječenje s IL-6 sprečava takvo smanjenje debljine mijelina (STZ/prenosnik vs STZ/IL-6 1 i 30 μg/kg: p < 0,005; Dunnettov test).
Postotak degeneriranih vlakana
Kao što je prikazano na slikama 42 i 43, nađena je značajna razlika između skupina u postotku funnkcionalno mijeliniziranih vlakana (p < 0,001; jednosmjerna ANOVA). Taj je postotak bio značajno niži kod skupine STZ/prenosnik nego kod skupine kontrola/prenosnik (p < 0,001; Dunnettov test). Postotak je značajno povećan kod životinja liječenih s IL-6 u dozi od 3, 10 i 30 μg/kg (p < 0,001; Dunnettov test).
ZAKLJUČAK
U ovom su istraživanju kao model izazvane neuropatije upotrebljene životinje intoksicirane strptozotocinom kod kojih se nekoliko dana kasnije razvio dijabetes.
Dijabetične životinje liječene su različitim dozama IL-6 (1, 3, 10 i 30 μg/kg) 30 dana. Liječenje je primijenjeno potkožno svaki dan (istraživanje A), 3 puta tjedno (istraživanje B) i jednom tjedno (istraživanje C), počevši od desetog dana nakon indukcije sve do žrtvovanja životinja 40 dana nakon izazivanja sa STZ. Ovaj način liječenja može se smatrati kurativnim liječenjem zato što je IL-6 primijenjen nakon prvih molekularnih oštećenja koje uzrokuje dugotrajna hiperglikemija.
Prisutni postupak pokazuje da IL-6 liječenje tijekom 30 dana bilo kojim programom primjene izaziva neuroprotekciju protiv dijabetičke neuropatije. Bihevioralna analiza s trzajem repa i EMG testiranjem (osjetilne i motoričke brzine) pokazuje neuroprotektivan učinak IL-6 primijenjenog potkožnim putem.
Neuroprotektivan učinak fokusiran je na osjetilna vlakna, kao i na motorička vlakna (CMAP brzina se nije mijenjala kada su životinje liječene s IL-6 spojem). Spoj sprečava gubitak mijelinske ovojnice na vlaknima i degeneraciju.
U usporedbi s dnevnim IP liječenjem (vidi prethodno istraživanje provedeno u Neurofitu, kolovoz 2001.), IL-6 primijenjen potkožno na dnevnoj osnovi jednako je djelotvoran kao i kod intraperitonealnog liječenja (vidi primjer 2) za sve testirane doze. Nadalje, niže doziranje okarakterizirano primjenom IL-6 jednom ili triput tjedno ne dovodi do smanjenja neuroprotektivnog učinka spoja. Čini se da liječenje tri puta tjedno rezultira najboljnim neuroprotektivnim učinkom (pogotovo u dozi od 10 i 30 μg/kg) bez bilo kakve nuspojave na opće ponašanje STZ životinja.
REFERENCE
1. Altschul S F i ostali, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990
2. Altschul S F, Nucleic Acids RES., 25:389-3402, 1997
3. Britland ST, Young RT, Sharma AK i Clarke BF. Diabetes, 39, 898-908. (1990)
4. Breighton, B i Hayden, MR: S Afr Med J. 1981 21. veljača; 59(8): 250
5. Chebath, J., Fischer, D., Kumar A., Oh J.W., Kollet, O., Lapidot, T., Fischer, M., Rose-John, S., Nagler, A., Slavin, S. i Revel, M. Eur. Cytokine Netw. 1997 8,359-365.
6. Devereux J i ostali, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.
7. Emerich DF, Cain CK, Greco C, Saydoff JA, Hu ZY, Liu H, Lindner MD Cell Transplant. 1997 svibanj-lipanj; 6(3):249-66.
8. Emerich, D.F., Lindner, M.D., Winn, S.R., Chen, E.-Y, Frydel, B.R. i Kordower, J.H. (1996). J.Neurosci., 16, 5168-5181.
9. Emerich DF, Winn SR, Hantraye PM, Peschanski M, Chen EY, Chu Y, McDermott P, Baetge EE, Kordower JH Nature. 1997 27. travanj; 386(6623):395-9.
10. Emerich DF, Hammang JP, Baetge EE, Winn SR Exp Neurol. 1994 studeni;130(1):141-50.
11. Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brankenhoff JP, Kallen KJ, Wollmer A, Grotzinger J, Rose-John S. Nat Biotechnol. 1997 veljača; 15(2):142-5
12. Fisher i ostali, J. Neuroimmunology 119 (2001) 1-9
13. Frei i ostali, J. Neuroimmunol., 31:147(1991)
14. Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M i Chebath J. Eur. Cytokine Netw. 1995, 6:135-143
15. Hirano i ostali, 1986 Nature (London) 234-73 (1986)
16. Hirano T, Matsuda T i Nakajima K: Steam cells 1994, 12:2627-277.
17. Hirota H, Kiyama H, Kishimoto T, Taga T J Exp Med. 1996 1. lipanj;183(6):2627-34.
18. Ishikawa i ostali, 1999, Cell Mol Neurobiol. 19, 587-96
19. Lin B, Nasir j, Kalchman MA, McDonald H, Zeisler J, Goldberg YP, Hayden MR Genomics. 1995 10.veljača; 25(3):707-15.
20. May i ostali, Proc Natl Acad Sci USA 83:8957 (1986);
21. Mendel, I., Katz, A., Kozak, N., Ben-Nun, A. i Revel, M. Eur. J. Immunol. 1998 28, 1727-1737.
22. Murakami M, Hibi M, Nakagawa N; Nakagawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T, Kishimoto T Science. 1993 18. lipanj; 260(5115):1808-10.
23. Novick, D., Shulman, L.M., Chen, L. i Ravel, M. Cytokine 1992 4, 6-11.
24. Novick D, Shulman LM, Chen L i Ravel M Cytokine 1992 4, 6-11.
25. Novick D. Engelman H. Wallach D. Leitner O. Revel M. Rubinstein M. Journal of Chromatography 1990. 510:331-7.
26. Paonessa G, Graziani R, Deserio A, Savino R, Ciapponi L, Lahmm A, Salvati AL, Tonniati C i Ciliberto G. EMBO J. 1995: 14: 1942-1951.
27. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990
28. Pearson W R i Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 1988
29. Rakieten, N., Rakieten, M.L. i Nadkami, M.V., Studies on the diabetogenic action of streptozotocin, Cancer Chemother. Rep., 1963, 29, 91.
30. Rudas B. Streptozotocin. Azmeimittel-Forschung, 22, 830-861. (1972)
31. Smith i Waterman J Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.
32. Taga, T., Hibin, M., Hirata, Y., Yamasaki, K., Yasukava, K., Matsuda, T., Hirano, T. i Kishimoto, T. Cell 1989 58, 573-581.
33. Toulmond, S., Vige, X., Fage, D., i Benavides, J. Neurosci Lett 1992, 144, 49-52.
34. Ward LD, Howlett GJ, Discolo G, Yasukawa K, Hammacher A, Moritz RL i Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp130. J. Biol. Chem. 1994, 269: 23286-23289.
35. Yamada, M., i Hatanaka, H.:Brain Res 1994, 643, 173-80.
36. Zilberstein i ostali, EMBO J 5:2529 (1986)

Claims (20)

1. Upotreba tvari koja signalizira preko gp 130, naznačena time, da se koristi u pripravi lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
2. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, da je dijabetička neuropatija polineuropatija.
3. Upotreba prema zahtjevu 1, naznačena time, da je dijabetička neuropatija mononeuropatija
4. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da je navedena tvar: a) IL-6; b) fragment a) koji se veže na gp80 i inicira signaliziranje preko gp130; c) inačica a) ili b) čijih je barem 70% slijeda identično s a) ili b) i koja inicira signaliziranje preko gp130; d) inačica a) ili b) koju kodira DNA slijed koji hibridizira do komplementa nativnog DNA slijeda koji kodira a) ili b) pod umjereno strogim uvjetima i koja inicira signaliziranje preko gp130; ili e) sol, spojeni protein ili funkcionalni derivat a), b) ili c) koji inicira signaliziranje preko gp130.
5. Upotreba prema zahtjevu 4, naznačena time, da je IL-6 rekombinantni IL-6.
6. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1-3, naznačena time, da je navedena tvar: a) IL-6R/IL-6 kimer; b) fragment a) koji se veže na gp80 i inicira signaliziranje preko gp130; c) inačica a) ili b) čijih je barem 70% slijeda identično s a) ili b) i koja inicira signaliziranje preko gp130; d) inačica a) ili b) koju kodira DNA slijed koji hibridizira do komplementa nativnog DNA slijeda koji kodira a) ili b) pod umjereno strogim uvjetima i koja inicira signaliziranje preko gp130; ili e) sol, spojeni protein ili funkcionalni derivat a), b) ili c) koji inicira signaliziranje preko gp130.
7. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da je tvar glikozilirana na jednom ili više položaja.
8. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 1-7, naznačena time, da tvar nije glikozilirana.
9. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 4-8, naznačena time, da spojeni protein obuhvaća imunoglobulinsko (Ig) spajanje.
10. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 4-9, naznačena time, da funkcionalni derivat sadrži najmanje jedan dio koji je vezan na jednu ili više funkcionalnih skupina koje se javljaju u obliku jednog ili više ogranaka na aminokiselinskim ostacima.
11. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time, da je dio polietilenski dio.
12. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se tvar koja signalizira preko gp130 upotrebljava u količinskom rasponu od 0,1 do 1000 μg/kg ili oko 1 do oko 500 μg/kg ili manjem od oko 100 μg/kg.
13. Upotreba prema zahtjevu 12, naznačena time, da se tvar koja signalizira preko gp130 upotrebljava u količini od oko 1 μg/kg, 3 μg/kg, 10 μg/kg ili 30 μg/kg.
14. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje dnevno.
15. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje tri puta tjedno.
16. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da se tvar koja signalizira preko gp130 primjenjuje jednom tjedno.
17. Upotreba vektora za poticanje i pojačavanje endogenog stvaranja IL-6 u stanicama, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
18. Upotreba stanice koja je genetički modificirana za dobivanje tvari prema bilo kojem od zahtjeva 1-9, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
19. Upotreba ekspresijskog vektora koji sadrži kodirajući slijed tvari prema bilom kojem od zahtjeva 1-9, naznačena time, da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije.
20. Metoda za liječenje i/ili sprečavanje dijabetičke neuropatije, naznačena time, da obuhvaća primjenu djelotvorne količine tvari na pacijentu prema bilo kojem od zahtjeva 1-9, izborno zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosačem.
HR20040292A 2001-10-11 2004-03-25 USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY HRP20040292A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01123400 2001-10-11
PCT/EP2002/011364 WO2003033015A1 (en) 2001-10-11 2002-10-10 USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20040292A2 true HRP20040292A2 (en) 2005-06-30

Family

ID=8178778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20040292A HRP20040292A2 (en) 2001-10-11 2004-03-25 USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY

Country Status (20)

Country Link
US (3) US7465441B2 (hr)
EP (1) EP1434597B1 (hr)
JP (1) JP2005505608A (hr)
KR (1) KR20050035151A (hr)
CN (1) CN1602203A (hr)
AT (1) ATE542542T1 (hr)
AU (1) AU2002340547B2 (hr)
BR (1) BR0213183A (hr)
CA (1) CA2463020A1 (hr)
DK (1) DK1434597T3 (hr)
EA (1) EA006881B1 (hr)
ES (1) ES2381341T3 (hr)
HR (1) HRP20040292A2 (hr)
IL (1) IL161310A0 (hr)
MX (1) MXPA04003442A (hr)
NO (1) NO20041908L (hr)
PL (1) PL369296A1 (hr)
WO (1) WO2003033015A1 (hr)
YU (1) YU29804A (hr)
ZA (1) ZA200402351B (hr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003033015A1 (en) * 2001-10-11 2003-04-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY
WO2004101617A1 (en) 2003-05-13 2004-11-25 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof
IL161672A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Yeda Res & Dev Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
AU2011203356B2 (en) * 2004-04-29 2012-03-22 Yeda Research & Development Co., Ltd IL6R/IL6 chimera for therapy of chemotherapy-induced peripheral neuropathy
IL161673A0 (en) * 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
IL163856A0 (en) * 2004-09-01 2005-12-18 Applied Research Systems Use of IL-6 in vascular complications
CA2681935A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Baker Medical Research Institute Treatment of obesity
DE102008057867A1 (de) * 2008-11-18 2010-05-20 B. Braun Melsungen Ag Fettemulsion zur künstlichen Ernährung von schwerkranken Intensivpatienten
CN106924736B (zh) * 2017-05-09 2020-01-03 北京师范大学 gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用
FR3080533A1 (fr) * 2018-04-27 2019-11-01 Enterosys Utilisation de l'il-6 pour le traitement du diabete

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5849571A (en) * 1990-10-10 1998-12-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Latency active herpes virus promoters and their use
US5300292A (en) * 1991-05-03 1994-04-05 The Regents Of The University Of California Composition and method for treating inflammation
IT1261787B (it) * 1993-06-23 1996-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130.
US6479258B1 (en) * 1995-12-07 2002-11-12 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines
US5741772A (en) * 1997-02-03 1998-04-21 Amgen Inc. Neurotrophic factor NNT-1
WO2001003737A1 (en) 1999-07-13 2001-01-18 Bolder Biotechnology Inc. Immunoglobulin fusion proteins
WO2003033015A1 (en) * 2001-10-11 2003-04-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. USE OF gp130 ACTIVATORS IN DIABETIC NEUROPATHY

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003033015A1 (en) 2003-04-24
JP2005505608A (ja) 2005-02-24
DK1434597T3 (da) 2012-02-27
BR0213183A (pt) 2004-08-31
ZA200402351B (en) 2005-03-29
NO20041908L (no) 2004-05-10
US20050058623A1 (en) 2005-03-17
US7465441B2 (en) 2008-12-16
MXPA04003442A (es) 2004-07-08
EA200400520A1 (ru) 2004-08-26
EP1434597A1 (en) 2004-07-07
CA2463020A1 (en) 2003-04-24
ATE542542T1 (de) 2012-02-15
CN1602203A (zh) 2005-03-30
AU2002340547B2 (en) 2008-04-03
US8278286B2 (en) 2012-10-02
PL369296A1 (en) 2005-04-18
YU29804A (sh) 2006-08-17
KR20050035151A (ko) 2005-04-15
IL161310A0 (en) 2004-09-27
US20100189684A1 (en) 2010-07-29
EA006881B1 (ru) 2006-04-28
ES2381341T3 (es) 2012-05-25
EP1434597B1 (en) 2012-01-25
US20090169506A1 (en) 2009-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8278286B2 (en) Use of gp130 activators in diabetic neuropathy
US10786551B2 (en) Use of interleukin-22 in the treatment of fatty liver disease
US8329654B2 (en) Use of IL-6/IL-6 chimera in Huntington&#39;s disease
AU2002340547A1 (en) Use of gp130 activators in diabetic neuropathy
EP1740200B1 (en) Il-6 for therapy or prevention of chemotherapy-induced neuropathy
AU2002361489B2 (en) The use of IL6R/IL6 chimera in nerve cell regeneration
EP1786457B1 (en) Use of il-6 in vascular complications
CA2500189A1 (en) Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-.beta.
EP1740199B1 (en) Il6r/il6 chimera for therapy of chemotherapy-induced peripheral neuropathy
AU2001291849A1 (en) Use of IL-6R/IL-6 chimera in Huntington&#39;s disease
CA2610691C (en) Use of il-18bp isoforms for the treatment and/or prevention of neurological inflammatory diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
PPPP Transfer of rights

Owner name: LABORATOIRES SERONO SA, CH

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20081009

Year of fee payment: 7

OBST Application withdrawn