JP2005505608A - 糖尿病性神経障害でのｇｐ１３０アクチベーターの使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の使用に関する。ＩＬ−６の使用が好ましい。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、真性糖尿病および末梢神経系障害の分野にある。特に、本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の使用に関する。ＩＬ−６、またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが、この特異的な医学的適応症（medical indication）において使用されることが好ましい。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病は、炭化水素代謝の障害、すなわち、インスリン分泌および／またはインスリン作用の絶対的または相対的損傷から生じる高血糖症により特徴付けられる症候群である。
【０００３】
真性糖尿病の分類は、国立糖尿病データグループおよびＷＨＯ（国際保健機構）によって採用されるものに基づく。以前には、それは、その疾患の発症時の年齢、期間および合併症に基づいた。妊娠真性糖尿病は、現在の妊娠中に発症（onset）または最初に認められた可変重度の炭水化物不耐症である。インスリン依存性ＤＭ（ＩＤＤＭ）または若年性発症糖尿病としても知られるＩ型真性糖尿病（ＤＭ）の患者は、糖尿病ケトアシドーシス（ＤＫＡ）を発症する可能性がある。非インスリン依存性ＤＭ（ＮＩＤＤＭ）としても知られるII型ＤＭ（真性糖尿病）の患者は、非ケトン性高血糖性高浸透圧性昏睡（ＮＫＨＨＣ）を発症する可能性がある。代表的な後期細小血管合併症としては、網膜症、ネフロパシー、ならびに末梢および自律神経性神経障害があげられる。大血管合併症としては、アテローム硬化性冠動脈および末梢動脈疾患が挙げられる。
【０００４】
Ｉ型真性糖尿病：あらゆる年齢層で発症し得るが、Ｉ型真性糖尿病は、幼年期または青年期に通常発症し、３０歳前に診断されるＤＭの主要な病型である。この型の糖尿病は、ＤＭの全症例の１０〜１５％を占め、高血糖症および糖尿病性ケトアシドーシス傾向により臨床的に特徴付けられる。その膵臓は、インスリンをほとんどまたはまったく産生しない。
【０００５】
Ｉ型ＤＭ患者の約８０％は、検出可能な血清中の膵島細胞（serum islet cell）の細胞質抗体および膵島細胞表面抗体（グルタミン酸脱炭酸酵素に対する抗体、およびインスリンに対する抗体が、同様の割合で（in a similar proportion of cases）見出される）と関連した特異的ＨＬＡ表現型を有する。
【０００６】
これらの患者では、Ｉ型ＤＭは、遺伝的に影響されやすく、免疫を介した、インスリン分泌細胞の＞９０％の選択的破壊から生じる。彼らの膵島は、膵島炎を示し、該膵島炎は、マクロファージとＢリンパ球を伴うＴリンパ球の浸潤により、ならびにほとんどのベータ細胞の損失により、グルカゴン分泌アルファ細胞の関与なしに特徴付けられる。診断時に存在する抗体は、通常、数年後には検出不可能になる。それらは、主にベータ細胞破壊に対する応答であり得るが、ベータ細胞に対して細胞毒性のものもあり、それらの損失の一因でもあり得る。Ｉ型ＤＭの臨床兆候は、潜在的な自己免疫過程が知らない間に始まってから数年後に起こる患者もいる。これらの抗体のためのスクリーニングは、数多くの進行中の予防的研究に含まれる。
【０００７】
II型真性糖尿病：II型ＤＭは、通常、＞３０歳の患者で診断される糖尿病の型であるが、しかし、子供および青少年でも起こり得る。その臨床的特徴は、高血糖症とインスリン耐性である。糖尿病性ケトアシドーシスはまれである。ほとんどの患者は、食事、運動および経口薬で治療されるが、高血糖症状を制御し、非ケトン性高血糖性高浸透圧性昏睡を予防するためにインスリンを断続的に、または持続的に必要とする患者もいる。一卵性双生児でのII型ＤＭについての一致率は、＞９０％である。II型ＤＭは、一般に、肥満、特に上半身（内臓／腹部）の肥満に関連し、体重増加の期間を経て現われることが多い。加齢に伴う耐糖能障害は、典型的な体重増加と密接な相関関係にある。内臓／腹部の肥満を示すII型ＤＭ患者は、減量後に、正常なグルコース濃度となることがある。
【０００８】
II型ＤＭは、異質な疾患の集団であり、グルコースに対するインスリン分泌応答の障害と骨格筋によるグルコース取り込みの刺激および肝臓グルコース産生の抑制（インスリン抵抗性）におけるインスリンの効果的な作用の減少との両方により、高血糖がもたらされる。しかしながら、インスリン抵抗性は一般的であり、インスリン抵抗性を示すほとんどの患者が、糖尿病を発生しないのは、体が、インスリン分泌を適切に増加させることにより補うためである。II型ＤＭの一般的な種類でのインスリン抵抗性は、インスリン受容体またはグルコーストランスポーターにおける遺伝的改変の結果ではない。しかし、遺伝的に決定されたポスト受容体細胞内欠損は、役割を果たしている可能性はある。生じた高インスリン血症は、他の一般的症状、たとえば肥満（腹部）、高血圧、高脂血症、および冠動脈疾患など（インスリン抵抗性症候群）を導き得る。
【０００９】
遺伝的因子は、II型ＤＭの発症の主要な決定因子に見えるが、まだ、II型ＤＭと特異的ＨＬＡ表現型または膵島細胞の細胞質抗体との関連性は証明されていない。例外は、検出可能な膵島細胞細胞質抗体を有し、ＨＬＡ表現型の内の１つを有し、そして最終的にＩ型ＤＭを発生し得る非肥満成人の小集団である。
【００１０】
糖尿病が発症する以前に、患者は、通常、グルコースに対する初期のインスリン分泌反応を失い、そして比較的多量のプロインスリンを分泌し得る。糖尿病が確立すると、空腹時の血漿中インスリン濃度は、II型ＤＭ患者では正常であり得るか、または増大されさえする可能性があるが、グルコース刺激インスリン分泌は、明らかに減少される。インスリン濃度の減少は、インスリンを介するグルコースの取り込みを減少させ、肝臓のグルコース産生を抑制することができない。
【００１１】
高血糖症は、結果であるばかりでなく、高血糖症が、インスリン感受性を減少させ、そして肝臓のグルコース産生を増大させるので、糖尿病患者のさらなる耐糖能障害（グルコース毒性）の原因でもあり得る。いったん患者の代謝制御が改善すれば、インスリンまたは血糖降下薬の投与量は、通常減量される。
【００１２】
II型ＤＭのある種の症例は、常染色体優性遺伝を示す若い非肥満青少年（若年者の成人発症型糖尿病［ＭＯＤＹ］）に発症する。ＭＯＤＹを有する多くの家族は、グルコキナーゼ遺伝子に突然変異を有する。インスリン分泌および肝臓のグルコース調節における障害が、これらの患者で示された。
【００１３】
インスリン異常症（insulinopathies）は、ＤＭのまれな症例で、II型ＤＭの臨床特徴を示し、欠損遺伝子の異種接合遺伝から生じ、インスリン受容体に正常に結合しないインスリンを分泌するようになる。これらの患者は、外因性インスリンに対する正常な血漿中グルコース反応と関連した血漿免疫反応性インスリン濃度をおおいに上昇させた。
【００１４】
糖尿病は、膵臓疾患に起因し得る：慢性膵炎、特にアルコール中毒では、糖尿病を伴うことが多い。このような患者は、インスリン分泌島およびグルカゴン分泌島の両方を失う。したがって、彼らは、軽度の高血糖をであり、そして低用量のインスリンに対して感受性があり得る。有効な対抗調節（グルカゴンによる抵抗のない外因性インスリン）の欠如を考慮すると、彼らは、頻繁に、低血糖症の急速な発症に悩まされている。アジア、アフリカ、およびカリブ海地域では、ＤＭは、若者において、重度のタンパク質欠乏症および膵臓疾患の重症栄養障害のある患者がよく観察される；これらの患者は、糖尿病ケトアシドーシス傾向はないが、しかしインスリンを必要とし得る。
【００１５】
真性糖尿病の診断：無症状の患者では、空腹時高血糖症についての診断基準に合致する場合に、ＤＭと確立される：成人または子供での２回測定した一晩絶食後の血漿（または血清）中グルコース濃度が、＞＝１４０ｍｇ／ｄｌ（＞＝７．７７ｍｍｏｌ／ｌ）。
【００１６】
経口ブドウ糖負荷試験は、その空腹時ブドウ糖が、１１５ｍｇ／ｄｌと１４０ｍｇ／ｄｌ（６．３８と７．７７ｍｍｏｌ／Ｌ）のあいだにある患者でのII型ＤＭを診断する上で、そして診断未確定ＤＭに関連があり得る臨床症状（たとえば、多発性神経障害、網膜障害）を示す患者に有用であり得る。
【００１７】
真性糖尿病の治療：糖尿病の長期細小血管合併症の多くの原因は高血糖症である。それは、ＨｂＡ_1C（以下参照）の濃度と、合併症の発症率とのあいだの線形関係を証明した。他の研究は、ＨｂＡ_1C＜８％が閾値であり、それ以下で、ほとんどの合併症を防ぐことができることを示唆した。したがって、Ｉ型ＤＭについての療法は、低血糖症の発作を避けながら、ＨｂＡ_1Cを下げるために代謝制御を強化することを試みるべきである。しかしながら、治療は、個人に合わせたものでなければならず、いかなる低血糖の危険も許容されない状況（たとえば、余命の短い患者や、脳血管または心血管疾患の患者）の場合または患者の低血糖のリスクが増大する（たとえば、信頼できない患者や自律神経障害を有する患者）場合には改変されるべきである。
【００１８】
減量を達成するための食事療法は、II型ＤＭの肥満患者に最も重要である。食事療法によって高血糖症の改善が達成されない場合、経口薬の試用を開始すべきである。
【００１９】
患者は、合併症の症状または兆候について定期的に評価してもらうべきで、これには足の検査、足と下肢の脈拍および感覚の検査、ならびにアルブミンについての尿検査が含まれる。定期的な検査評価としては、脂質プロファイル、ＢＵＮ（血中尿素窒素）および血清中クレアチニン濃度、ＥＣＧ、および年一回の全面的な眼科評価が挙げられる。
【００２０】
高コレステロール血症または高血圧症は、特異的後期合併症についての危険を増大させ、特定の注意と適切な治療が必要とされる。プロプラノロールなどのベータアドレナリン作動性受容体遮断剤であるβ遮断薬は、ほとんどの糖尿病で安全に使用され得るが、それらは、インスリン誘発性低血糖症のβ−アドレナリン作動性症状を隠蔽し、正常な拮抗調節反応を害し得る。したがって、ＡＣＥ阻害剤およびカルシウム拮抗剤が、しばしば、最適な薬剤である。
【００２１】
血漿中グルコースの監視は、全ての患者によって行なわれるべきであり、インスリン治療患者は、それに応じて彼らのインスリン投与量を調節することを教えられるべきである。グルコース濃度は、指先の血液１滴を用いて、容易に使用できる家庭用分析器で検査することができる。指先の血液サンプルを得るためには、バネ式のランセット針を推奨する。検査の頻度は、個別に決定される。インスリン治療糖尿病患者は、理想的には、食前に、食後１から２時間までに、そして就寝時に、彼らの血漿中グルコースを毎日検査すべきである。
【００２２】
ほとんどの医師は、経時的に、検査前１〜３ヵ月のあいだの血漿中グルコース制御を評価するためにグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ_1C）を測定する。ＨｂＡ_1Cは、血漿中グルコースによるＨｂの非酵素的グリコシル化の安定な産物であり、そして増大する血漿中グルコース濃度と共に増大する速度で形成される。ほとんどの実験室で、正常なＨｂＡ_1C濃度は、約６％である；ほとんど制御されない糖尿病患者では、濃度は、９〜１２％までの範囲にある。ＨｂＡ_1Cは、糖尿病を診断するための特異的な検査ではない；しかし、上昇したＨｂＡ_1Cは、しばしば、既存の糖尿病を示す。
【００２３】
別の検査は、フルクトサミン濃度を測定する。フルクトサミンは、血漿中タンパク質とのグルコースの化学反応により形成され、そして先の１か〜３週間でのグルコース制御に反映する。したがって、このアッセイは、ＨｂＡ_1Cより前のコントロールでの変化を示し、しばしば、強化治療が行なわれるときや、短期的な臨床試験に有用である。
【００２４】
インスリン治療を考慮すると、インスリン治療を開始では、動物由来の変異体より抗原性が少ないので、ヒトインスリンがしばしば好ましい。しかし、通常には非常に低い、検出可能なインスリン抗体濃度は、ヒトインスリン製剤を投与されている者を含めてほとんどのインスリン治療患者で発生する。
【００２５】
インスリンは、日常的に、１００Ｕ／ｍｌ（Ｕ−１００インスリン）を含む製剤で提供され、そして使い捨てインスリンシリンジで皮下に注射される。１／２ｍｌシリンジは、一般には、それらが、さらに容易に読取ることができ、そして小用量の正確な測定を促進できるので、＜＝５０Ｕの用量を日常的に注射する患者に好ましい。一般にインスリンペンと称される複数回用量インスリン注射デバイス（ノボリンペン（NovolinPen））は、数日の投与量を含むカートリッジを使用するように設計される。インスリンは、冷蔵されるべきであるが、しかし決して凍結させるべきでない。しかし、ほとんどのインスリン製剤は、数ヶ月間、室温で安定であり、仕事中および旅行時に容易に使用できる。
【００２６】
糖尿病は、他の内分泌疾患と関連し得る。II型ＤＭは、クッシング症候群、末端肥大症、褐色細胞腫、グルカゴノーマ、原発性アルドステロン症、またはソマトスタチノーマに続発し得る。これらの障害のほとんどは、末梢または肝臓のインスリン耐性に関連する。いったんインスリン分泌も減少されると、多くの患者は、糖尿病になる。Ｉ型ＤＭの有病率は、ある種の自己免疫性内分泌疾患、たとえば、グレーブス病、ハシモト甲状腺炎、および特発性アジソン病の患者で増大される。
【００２７】
糖尿病は、ベータ細胞トキシンによっても誘導され得る。たとえば、ストレプトゾトシンは、ラットにおいて実験的糖尿病を誘導し得るが、ヒトにおいては糖尿病はまれにしか引き起さない。
【００２８】
糖尿病の後期合併症は、数年間の高血糖症の制御の不良の後に起こる。インスリンを介したグルコースの取り込みがある細胞（主に筋肉）を除き、グルコース濃度は、全ての細胞で増大し、結果としてグリコシル化および他の代謝経路の活性が増大する。これは合併症により引起され得る。ほとんどの細小血管合併症は、厳重な血糖制御、すなわち、ほぼ正常なグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ_1C）により反映される、ほぼ正常な空腹時および食後のグルコース濃度を達成することにより遅延、予防、または逆行さえさせることができる。アテローム硬化症のような巨大血管の疾患は、兆候的な冠動脈疾患、跛行、皮膚崩壊、および感染をもたらすことがある。高血糖症は、アテローム硬化症を促進し得るが、糖尿病（インスリン耐性を示す）の発症に先行する長年の過剰インスリン症が、重要な開始の役割を果たし得る。重篤な末梢血管疾患、断続的な跛行および壊疽についての下肢の切断が、なお多く見られる。バックグランド網膜症（検眼鏡検査試験または網膜写真で見つかる最初の網膜変化）は、視覚を明らかには変化させないが、しかしそれは、網膜剥離または出血と共に筋肉浮腫または増殖性網膜症に進行する可能性があり、そしてそれは、失明を引き起す可能性がある。全ての糖尿病の約８５％は、最終的に、ある程度の網膜症を発症する。糖尿病性神経障害は、最終段階の腎臓疾患を発症するまで、通常無症状であるが、しかしそれは、ネフローゼ症候群を引き起し得る。
【００２９】
糖尿病性神経障害は、糖尿病の別の合併症であるが、他の疾患と関係して共通でもある。
【００３０】
多重単神経障害は、通常、コラーゲン血管障害（たとえば、結節性多発性動脈炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シューグレン症候群、慢性関節リウマチ（ＲＡ））、類肉腫症、代謝疾患（たとえば、糖尿病、アミロイド症）または感染疾患（たとえば、ライム病、ＨＩＶ感染）には二次的である。微生物は、神経への直接浸入により多重単神経障害を引き起し得る（たとえば、ライで）。
【００３１】
急性熱病による多発性神経障害は、トキシン（たとえば、ジフテリアで）または自己免疫反応（たとえば、ギャン−バレー症候群で）に起因し得る。時に免疫化に付随する多発性神経障害も、おそらく自己免疫性である。
【００３２】
毒物は、一般に、多発性神経障害を引き起こすが、単神経障害を引き起こすこともある。それらとしては、エメチン、ヘキソバルビタール、バルビタール、クロロブタノール、スルホンアミド、フェニトイン、ニトロフラントイン、ビンカアルカノイド、重金属、一酸化炭素、トリオルトクレシルホスフェート、オルトジニトロフェノール、多くの溶媒、他の工業用毒、および特定のＡＩＤＳ薬（たとえば、ザルシタビン、ジダノシン）があげられる。
【００３３】
栄養不足および代謝障害は、多発性神経障害を生じ得る。ビタミンＢ欠乏は、しばしば原因である（たとえば、アルコール中毒、脚気、悪性貧血、イソニアジド誘導ピリドキシン欠乏、吸収不全症候群、および妊娠悪阻において）。多発性神経障害は、甲状腺機能低下症、ポルフィリン症、類肉腫症、アミロイド症、および尿毒症でも起こる。
【００３４】
妊娠は、単一クローン性高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄腫、リンパ腫）、アミロイド浸潤、または栄養失調を介して、または腫瘍随伴性症候群として多発性神経障害を引起し得る。
【００３５】
真性糖尿病または腎不全のような、代謝障害による多発性神経障害は、ゆっくりと、しばしば数ヵ月または数年かけて進行する。それは、頻繁には、近傍でよりも遠位でいっそう重篤である下肢における感覚異常を伴って始まる。末梢刺痛、麻痺、灼熱痛、または関節固有感覚および振動感覚における欠陥は、しばしば重要である。痛みは、よく夜に悪化し、そして患部領域に触れることによって、または温度変化によって悪化され得る。重篤な症例では、特に、靴下−手袋型分布で感覚消失の客観的な兆候がある。アキレス腱および他の深部の腱反射は、減少されるか、または消失している。指節間関節またはシャルコー関節での無痛腫瘍は、感覚消失が根深いときに発生し得る。感覚または固有受容欠損は、歩行異常を導き得る。運動関与は、遠位筋肉弱体化および萎縮を生じる。自律神経系は、付加的にまたは選択的に関係し得、そして夜間下痢、尿および便失禁、不能、または体位性低血圧に至る。血管運動症状は変化する。皮膚は、正常より蒼白で乾燥しており、そして薄黒い変色を伴うこともある。発汗は過剰であり得る。栄養変化（平滑でそして輝いた皮膚、陥凸形成または畝状爪、骨粗鬆症）は、重篤で長期化した症例に共通である。
【００３６】
全身性障害（たとえば、真性糖尿病、腎不全、多発性骨髄腫、腫瘍）の治療は、進行するのを阻止し、そして症状を改善し得るが、しかし回復はゆっくりである。エントラップメント神経障害は、コルチコステロイド注射または外科的除圧を必要とする可能性がある。物理的治療および副子は、拘縮の見込みまたは重度を減らす。
【００３７】
真性糖尿病は、感覚運動性遠位多発性神経障害（最も一般的）、多発性単神経障害、および病巣の単神経障害（たとえば、動眼神経または外転脳神経）を引起し得る。多発性神経障害は、一般に、感覚欠損を引起す遠位の対称的な主に感覚の多発性神経障害として起こり、そしてそれは、靴下−手袋型分布で始まり、そしてそれにより通常に印をつけられる。
【００３８】
一般に、末梢神経障害は、感覚消失、筋肉弱体化および萎縮の症状、深部腱反射から減少したこと、および血管運動症状を、単独で、またはあらゆる組合せとして定義される。疾患は、単神経（単神経障害）、別個の領域で2つまたはそれより多くの神経（多重単神経障害）、または同時に多くの神経（多発性神経障害）に影響し得る。軸索は、原発的に影響を受け得るか（真性糖尿病、ライム病、または尿毒症での、または毒物でのような）、またはミエリン鞘またはシュバン細胞（急性または慢性炎症性多発性神経障害、白質萎縮、またはギャン−バレー症候群でのような）であり得る。小さな未ミエリン化およびミエリン化線維に対する損傷は、第一に、温度および痛感覚の消失を生じる。大きなミエリン化線維に対する損傷は、運動または固有感覚の欠損を生じる。ある種の神経障害（たとえば、鉛毒性、ダプソン使用、マダニ刺傷、ポルフィリン症またはギャン−バレー症候群による）は、第一に運動線維に影響を及ぼす；他のもの（たとえば、癌、ライ、ＡＩＤＳ、真性糖尿病、または慢性ピリドキシン中毒による脊髄神経節）は、脊髄神経節または感覚線維に影響を及ぼし、そして感覚症状を生じる。偶然にも、脳神経も、含まれる（たとえば、ギャン−バレー症候群、ライム病、真性糖尿病およびジフテリアに）。
【００３９】
外傷は、単神経に対する局在化損傷の最も一般的な原因である。過激な筋肉活動または強制的な関節の過剰伸長は、小さな外傷（たとえば、小型ツールの密着した拘束、空気ハンマーからの過剰の振動）を繰返し得るとおり、病巣の神経障害を生じ得る。圧力またはエントラップメント麻痺は、通常、骨の隆起（たとえば、正常な睡眠のあいだで、または細身または悪液質のヒトでの、そしてしばしばアルコール中毒での麻酔のあいだで）で、または狭いチャネル（たとえば、手根管症候群での）で浅神経（尺骨、撓骨、腓骨）に影響を及ぼす。圧迫麻痺は、腫瘍、骨の隆起、ギプス包帯、松葉づえ、または長期化した窮屈な姿勢（たとえば、園芸での）からも生じ得る。神経への出血および冷気または照射への接触も、神経障害を引起し得る。単神経障害は、さらに、直接的腫瘍浸潤から生じ得る。
【００４０】
糖尿病性多発性神経障害は、四肢のしびれ、刺痛および感覚異常や、頻度は少ないが、衰弱をもたらす重度で根深い痛みおよび知覚過敏を引き起こし得る。くるぶし反射は、通常には減少されるか、または消失している。多発性神経障害の他の原因は、排除されなければならない。第３、第４または第６の脳神経、並びに大腿のような他の神経に影響する急性の痛みのある単神経障害は、数週から数ヶ月かけて自発的に改善し、高齢の糖尿病患者でいっそう頻繁に起こり、神経の梗塞に起因する。自律神経性神経障害は、多発性神経障害のある糖尿病患者で主に起こり、そして体位性低血圧、発汗障害、男性での不能および逆行性射精、膀胱機能障害、胃内容排泄遅延（時に、ダンピング症候群を伴う）、食道機能不全、便秘または下痢、ならびに夜間下痢を引き起し得る。バルサルバ手技または起立時の心拍反応の減少や、深呼吸時の心拍変動の無変化は、糖尿病患者での自律神経の神経障害の証拠となる。
【００４１】
糖尿病性多発性神経障害は、足の潰瘍および関節障害についての主要な原因であり、それらは、真性糖尿病での病的症状の重要な原因である。糖尿病性多発性神経障害では、感覚の脱神経は、合わない靴や小石（pebble）のような通常の原因による外傷の認知を妨げる。固有感覚における変性は、異常なパターンの体重負荷や、時には、シャルコー関節の発生に至る。
【００４２】
感染性の足の潰瘍を患う患者は、しばしば、神経障害のために痛みを感じず、そして無視された経過の後期まで、全身性症状を示さない。深部潰瘍および特になんらかの検出可能な蜂巣炎と関連した潰瘍は、全身性毒性および永久的な障害が発生し得るので、即時入院を必要とする。早期の外科的な壊死組織の切除は、治療の必須部分であるが、しかし時々切断が必要である。
【００４３】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、数種の異なるタイプの細胞により産生および分泌される多機能性サイトカインである。この多面性サイトカインは、免疫応答、急性期反応および造血などの細胞防御機序で中心的役割を果たす。ＩＬ−６は、先にクローン化された１８５個のアミノ酸を有する２０から２６ｋＤａの糖タンパク質である（May et al., (1986); Zilberstein et al., (1986); Hirano et al., (1986)）。以前、ＩＬ−６は、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）、インターフェロン−ベータ２および肝細胞刺激因子として引用されている。ＩＬ−６は、肝臓、脾臓、および骨髄などの多数の異なる組織により、そして単球、線維芽細胞、内皮細胞、ＢおよびＴ細胞などの多様なタイプの細胞により分泌される。ＩＬ−６は、ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、細菌および細菌性リポ多糖、ならびにＩＬ−１およびＴＮＦのような炎症性サイトカインなどの多様なシグナルにより転写レベルが活性化される。
【００４４】
ＩＬ−６は、ヒト炎症性ＣＮＳ疾患の病因に関係しているとみなされている。ＩＬ−６の血漿中および脳脊髄液中濃度の増加が、たとえば、多発性硬化症の患者において示された（Frei et al., 1991）。
【００４５】
中枢および末梢神経系の細胞でのＩＬ−６の効果に関する最近の実験は、ＩＬ−６が、神経細胞での保護効果、ならびに炎症性神経変性過程に対するある種の影響を有することを示す（Gadient and Otten, 1997, Mendel et al., 1998）。ＩＬ−６は、海馬のニューロン（Yamada et al., 1994）ならびに線条体のニューロン（Toulmond et al., 1992）でのグルタミン酸誘導性細胞死を防ぐことが分かった。高濃度のヒトＩＬ−６とヒト可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）の両方を発現するトランスジェニックマウスでは、加速された神経再生が、脳における舌下の核の逆行標識により示されるように、舌下神経の損傷ののちに観察された（Hirota et al., 1996）。さらに、ＩＬ−６が、神経性疾患、脱ミエリン化障害、多発性硬化症（ＭＳ）において含蓄されるというある種の証拠があった（Mendel et al., 1998）。ＩＬ−６遺伝子欠損マウスは、疾患の実験的誘導に耐性があった。他方では、ＩＬ−６が、神経外傷の後の早期外傷後段階のあいだのニューロンの生存に負の効果を有することを示す報告があった（Fisher et al., 2001）。
【００４６】
ＩＬ−６の生物学的活性は、一方はＩＬ−６受容体またはｇｐ８０と名づけられ、そして他方はｇｐ１３０と名づけられた２つの異なるタンパク質を含む膜受容体系によって仲介される（Hirano et al., 1994により検証された）。ｇｐ１３０は、２７７個のアミノ酸の細胞内ドメインを含む９１８個のアミノ酸の長さを有する膜貫通型糖タンパク質であり、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＣＴ−１などのいくつかのサイトカイン受容体のサブユニット構成成分である。ＩＬ−６が、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカインのプロトタイプであるので、このサイトカインファミリーは、「ＩＬ−６型サイトカイン」とも称される。
【００４７】
ｇｐ１３０は、低親和性受容体鎖に結合することによって、これらのサイトカインに対する高親和性受容体の形成に関与する。したがって、ｇｐ１３０は、「親和性コンバーター」とも呼ばれる。サイトカイン受容体に結合するリガンドは、ｇｐ１３０の二量体化（ＩＬ−６受容体に関して見られる）またはＬＩＦＲベータサブユニットとして知られるｇｐ１３０関連タンパク質との異種二量体化（ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、およびＣＮＴＦ受容体に関して見られる）を導く。それぞれのリガンドの結合は、細胞内シグナル伝達の第一段階として、ジャヌスキナーゼ（ＪＡＫｓ）として知られるチロシンキナーゼのファミリーの活性化／連結に関連する。細胞内シグナル伝達過程は、チロシンリン酸化とＳＴＡＴｓ（転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）と呼ばれる因子の活性化を含む。
【００４８】
ヒトｇｐ１３０遺伝子産物は、染色体５および１７上の２つの別個の染色体遺伝子座と相同であるように見える。２つの別個のｇｐ１３０遺伝子配列の存在は、霊長類に限定され、他の脊椎動物で見られない。
【００４９】
ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭおよびＬＩＦのシグナル伝達活性が、ｇｐ１３０に対する種々のモノクローナル抗体により特異的に遮断され得ることが示された。これに加えて、サイトカインまたはそれらの受容体の存在と独立して、ｇｐ１３０を直接的に活性化するモノクローナル抗体が見出された。
【００５０】
ｇｐ１３０に対する他のモノクローナル抗体は、ＩＬ−６仲介機能を阻害することが示された。９０および１１０Ｋｄａの分子質量を有する可溶性型ｇｐ１３０（ｓｇｐ１３０）が、ヒト血清中に見出された。それらは、構成成分としてｇｐ１３０を有する受容体系を利用するそれらのサイトカインの生物学的機能を阻害し得る。
【００５１】
ｇｐ８０の細胞外ドメインに対応する可溶性型ＩＬ−６Ｒ ｇｐ８０（ｓＩＬ−６Ｒ）は、血中および尿中に、糖タンパク質として見出されるヒトの体の天然産物である（Novick et al., 1990, 1992）。ｓＩＬ−６Ｒ分子の異例な性質は、それらが、ヒト細胞などの多くの細胞型にＩＬ−６の強力なアゴニストとして作用することである（Taga et al., 1989; Novick et al., 1992）。たとえｇｐ８０の細胞質内ドメインがなくても、ｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に応答してｇｐ１３０の二量体化を誘発する能力がなおあり、そして次には、それに続くＩＬ−６特異的シグナル伝達および生物学的効果を仲介する（Murakami et al., 1993）。ｓＩＬ−６Ｒは、ｇｐ１３０と２つのタイプの相互作用を示し、それらは両方とも、ＩＬ−６特異的生物学的活性に必須である（Halimi et al., 1995）。そして活性ＩＬ−６受容体複合体は、２つのｇｐ１３０鎖、２つのＩＬ−６Ｒおよび２つのＩＬ−６リガンドにより形成される六量体構造であることが提唱された（Ward et al., 1994; Paonessa et al., 1995）。
【００５２】
可溶性ＩＬ−６受容体およびＩＬ−６を一緒に連結するキメラ分子は、記載されている（Chebath et al., 1997、Fischer et al., 1997、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットおよび国際公開第９７／３２８９１号パンフレット）。それらは、それぞれ、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラおよびハイパー−ＩＬ−６と称され、以下ではＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と呼ばれる。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）およびＩＬ−６をコードするｃＤＮＡの全コーディング領域を融合することにより産生された（Fischer et al., 1997; Chebath et al., 1997）。組換えＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、ＣＨＯ細胞で産生された（Chebath et al., 1997、国際公開第９９／０２５５２号パンフレット）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、インビトロで、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物が結合するより高い効率でｇｐ１３０鎖に結合する（Kollet et al., 1999）。
【発明の開示】
【００５３】
本発明によって、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の投与が、結果として糖尿病性神経障害の樹立動物モデルで明らかに有益な効果を生じることが見出された。試験された模範的な物質は、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラであった。両物質とも、神経活力に関連する数種の項目の改善により示されるとおり、糖尿病性神経障害で統計的に有意で有益な効果を示した。
【００５４】
したがって、本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の使用に関する。
【００５５】
糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質を発現する細胞の使用は、本発明の別の目的である。さらに、本発明によって、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質についてのコーディング配列を含むベクターは、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の投与が、糖尿病性神経障害の樹立動物モデルにおいて有意な抗侵害受効果および神経再生効果を生じるという知見に基づく。したがって、本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす物質の使用に関連する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質」は、ｇｐ１３０を介するシグナル伝達カスケードを活性化するあらゆる分子、すなわち、ＩＬ−６受容体複合体のｇｐ１３０部分のアゴニスト、刺激剤、またはアクチベーターである。刺激は、直接的でも良い。すなわち、活性化は、ｇｐ１３０に対して直接的に結合することによって誘発しても良い。このような直接的アクチベーターについての例は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラである。刺激は、別の細胞表面受容体に結合することにより間接的であっても良く、該受容体がｇｐ１３０と複合体を形成し、それによりｇｐ１３０を活性化する。ＩＬ−６は、ｇｐ１３０のこのような間接的アクチベーターについての例である。ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の別の例としては、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、およびカルジオトロピン−１（ＣＴ−１）があげられ、それらは、いわゆる「ＩＬ−６型サイトカイン」である。これらのサイトカインは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を誘発する。その第１の事象は、シグナル伝達受容体サブユニットのリガンド誘導ホモ−またはヘテロ二量体化である。全てのＩＬ−６型サイトカインは、それらの受容体複合体にｇｐ１３０を補充する。それらは、ｇｐ１３０単独、またはｇｐ１３０とＬＩＦＲもしくはＯＳＭＲとの組合せのいずれかでシグナル伝達し、全て、Ｊａｋを活性化でき、そしてＳＴＡＴタンパク質を補充できる。ＩＬ−６は、ｇｐ１３０ホモ二量体を誘導するのに対して、ＣＮＴＦ、ＬＩＦおよびＣＴ−１は、ｇｐ１３０とＬＩＦＲとのヘテロ二量体を介してシグナル伝達する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療」および「予防」は、糖尿病性神経障害の1つまたはそれ以上の症状または原因、ならびに糖尿病性神経障害に付随する症状、疾患または合併症を予防、阻害、弱体化（attenuating）、緩和または逆行させることと理解されるべきである。糖尿病性神経障害を「治療する」場合、本発明による物質は、その疾患の発症後に与えられ、「予防」は、疾患のあらゆる兆候が、患者に気付かれる前の物質の投与に関する。予防的投与は、すでに長期間真性糖尿病を患ってきた患者のような危険の高い患者に特に有用である。
【００５９】
用語「糖尿病性神経障害」は、あらゆる形態の糖尿病性神経障害に、または糖尿病性神経障害に付随するか、または起因する１つまたはそれ以上の症状または障害に、または上の導入で詳細に記述したように神経に影響を及ぼす糖尿病の合併症に関する。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様では、糖尿病性神経障害は、多発性神経障害である。糖尿病性多発性神経障害では、多くの神経が、同時に影響を及ぼされる。
【００６１】
別の好ましい実施態様では、糖尿病性神経障害は、単神経障害である。病巣の単神経障害では、疾患は、動眼または外転脳神経のような単一の神経を冒す。その障害は、２つまたはそれ以上の神経が、別個の領域で冒される場合、多重単神経障害と称される。
【００６２】
好ましくは、物質は、
ａ）ＩＬ−６；
ｂ）ｇｐ８０に結合し、そしてｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）の断片；
ｃ）ａ）またはｂ）と少なくとも７０％配列同一性を示し、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；
ｄ）中程度にストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）をコードする天然のＤＮＡ配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；または
ｅ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の塩、融合タンパク質または機能的誘導体
である。
【００６３】
ＩＬ−６それ自身の使用は、本発明により非常に好ましい。ＩＬ−６は、天然のＩＬ−６、すなわち、天然源から単離されたＩＬ−６、または組換えで産生されたＩＬ−６であり得る。組換えＩＬ−６は、本発明により特に好ましい。
【００６４】
本発明のさらに好ましい実施態様では、物質は、
ａ）ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ；
ｂ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）の断片；
ｃ）ａ）またはｂ）と少なくとも７０％配列同一性を示し、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；
ｄ）中程度にストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）をコードするＤＮＡ配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；または
ｅ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の塩、融合タンパク質または機能的誘導体
である。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ」（「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６」または「ＩＬ−６キメラ」とも称される）は、インターロイキン−６の全てまたは生物学的に活性な部分に融合したｇｐ１３０の可溶性部分を包含するキメラ分子である。キメラタンパク質の部分は、互いに直接的に融合され得るか、またはそれらは、ジスルフィド架橋またはポリペプチドリンカーなどのあらゆる適切なリンカーによって連結され得る。リンカーは、長さ１から３個までのアミノ酸残基と同じくらい短いか、またはより長く、たとえば、長さ１３または１８個のアミノ酸残基である短リンカーペプチドであり得る。該リンカーは、たとえば、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチドであっても良く、または可溶性ＩＬ−６受容体ｇｐ１３０とＩＬ−６配列とのアミノ酸配列間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３−アミノ酸リンカー配列であっても良い。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの例は、当技術分野で知られており、そしてたとえば、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットまたは国際公開第９７／３２８９１号パンフレットに詳細に記述されている。本発明により使用され得るＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子についての例は、図２に概略的に表現されている。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、ＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６キメラの類似体であって、本来のＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラと比較して、得られる産物の活性を相当に変化することなく、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の天然に存在する成分のアミノ酸残基の１つまたはそれより多くが、異なるアミノ酸残基に置換されるか、または欠失されるか、または１つまたはそれより多くのアミノ酸残基がＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の本来の配列に付加される、ＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６キメラの類似体を意味する。これらの変異体は、公知の合成により、および／または位置指定突然変異誘発技術により、またはそのために適切な他のあらゆる公知技術によって製造される。
【００６７】
本発明による変異体としては、中程度にストリンジェントな条件またはストリンジェントな条件下で、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によりコードされるタンパク質があげられる。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が、慣習的に、「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience、N.Y., §§6.3 and 6．4 (1987, 1992）、およびSambrook et al. (Sambrook, J.C., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【００６８】
制限なく、ストリンジェントな条件の例は、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを３７℃で３０〜６０分間、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを６８℃で３０〜６０分間で、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍの１２〜２０℃低い洗浄条件を含む。当業者であれば、ストリンジェントな条件がＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（たとえば１０〜４０塩基）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することは理解される。もし混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。Ausebel, supra参照。「中程度にストリンジェントな条件」とは、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでのような、低温、低塩または低洗浄剤濃度での洗浄条件を意味する。（Ausubel et al., 1989, supra）。
【００６９】
あらゆるこのような変異体は、好ましくは、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６に比較して、実質的に類似か、またはより良くさえある活性を有するような、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のものが充分に複製されるアミノ酸の配列を有する。
【００７０】
ＩＬ−６の特徴的活性は、ＩＬ−６受容体のｇｐ８０部分に結合するその能力であり、そしてＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの特徴的活性は、ｇｐ１３０に結合するその能力である。ｇｐ１３０に対するＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの結合を測定するためのＥＬＩＳＡ型アッセイは、ここに参考文献として完全に組み込まれる国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの３９頁の実施例７に詳細に記述されている。当業者は、類似のＥＬＩＳＡ型アッセイが、ｇｐ８０に対するＩＬ−６の結合のために開発され得ることを理解するであろう。変異体が、ｇｐ８０またはｇｐ１３０の個々の結合領域に対して実質的な結合活性を示すかぎり、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラと実質的に類似の活性を示すと考えられ得る。したがって、あらゆる所定の変異体が、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの実施例７で記述されるように、たとえば、このような変異体を、簡易サンドイッチ結合アッセイにかけて、それが、固定化ｇｐ８０またはｇｐ１３０に結合するかどうかを決定することを含む、通常の実験を用いて、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と少なくとも実質的に同じ活性を有するかどうかについて決定され得る。
【００７１】
好ましい実施態様では、あらゆるこのような変異体は、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットに含まれる成熟ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子の配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％同一性または相同性を有する。
【００７２】
同一性は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列間、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の、該配列の比較によって決定された関係を反映する。一般的に、同一性は、比較されている配列の全長に渡って、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチド−ヌクレオチド、またはアミノ酸−アミノ酸間の正確な一致をいう。
【００７３】
正確な一致がない配列に対しては、「％同一性」が決定され得る。一般的に、比較されるべき２つの配列は、該配列間に最大の相関関係が得られるように整列される。これは、整合の程度を高めるために、片方または両方の配列のいずれかにおける「ギャップ（gap）」の挿入を含む。％同一性は、比較される各配列の全長に渡って決定されても良く（いわゆるグローバルアラインメント）、またはより短く定義された長さに渡って決定されても良い（いわゆるローカルアラインメント）。グローバルアラインメントは、同じかまたは非常に類似した長さの配列に特に適しており、ローカルアラインメントは、不同の長さの配列により適している。
【００７４】
２つまたはそれより多くの配列の同一性と相同性を比較する方法は、当該分野においてよく知られている。したがって、たとえば、ウィスコンシン シークエンス アナリシス パッケージ、バージョン９．１（Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1）（Devereux J et al., 1984）で使用可能なプログラム、たとえばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰなどのプログラムが、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペプチド間の％同一性および％相同性を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、スミスとウォーターマン（Smith and Waterman）の「ローカルホモロジー」アルゴリズム（１９８１）を使用し、２つの配列間の相同性の最適な単一領域を見つける。配列間の同一性および／または相同性を決定するための他のプログラムも、当業者に知られており、たとえば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, www.ncbi.nlm.nih.govでＮＣＢＩのホームページから利用可能である。）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, 1990; Pearson 1988）である。
【００７５】
本発明によって使用され得るＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの変異体、またはそれをコードする核酸としては、本明細書中に表わされる教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、通常の当業者により日常的に得られ得る置換ペプチドまたはヌクレオチドとして実質的に対応する有限の配列が包含される。
【００７６】
本発明による変異体についての好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの保存的アミノ酸置換は、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸のみを含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびその変異体は、本発明の範囲内である。
【００７７】
好ましくは、同義のアミノ酸群は、表１に規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表２に規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表３に規定される群である。
【００７８】
【表１】

【００７９】
【表２】

【００８０】
【表３】

【００８１】
本発明に使用するためのＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのムテインを得るために使用され得る、タンパク質でのアミノ酸置換の製造例としては、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shaw et al）に示されたリジン置換タンパク質などがあげられる。
【００８２】
本発明との関連において有用であるＩＬ−６の特異的変異体は、記述されている（国際公開第９４０３４９２Ａ１号パンフレット）。さらに、欧州特許第６６７８７２Ｂ１号は、野生型ＩＬ−６を超える改善された生物学的活性を示す突然変異体ＩＬ−６を記載する。これに加えて、欧州特許第６５６１１７Ｂ１号は、ＩＬ−６のスーパーアゴニストを単離する方法を記載する。突然変異体またはスーパーアゴニストは、本発明により使用され得る。
【００８３】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはその変異体または断片からなるポリペプチドのことをいう。したがって、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、たとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から製造され得るＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの誘導体、ならびにそれらの変異体および融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００８５】
これらの誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含むことができ、該側鎖は、抗原部位を覆い、かつＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の体液中での滞留を拡大し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級アミンもしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル基またはトレオニル基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００８６】
本発明による「断片」は、たとえば、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性部分であり得る。用語、断片は、分子のあらゆる小集合、すなわち、所望の生物学的活性を保持する、すなわち、ｇｐ１３０のアゴニスト活性を示す短ペプチドを意味する。断片は、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、そして結果物断片を、それぞれ、ｇｐ８０またはｇｐ１３０に結合するそれの特性について試験することにより容易に製造され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから一度に、１つのアミノ酸を除去するプロテアーゼは、当技術分野で既知であり、よって、所望の生物学的活性を保持する断片を決定することは、純粋にルーチンな実験による。
【００８７】
ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、それの変異体および融合タンパク質の断片として、本発明は、さらに、該部分が、ｇｐ１３０上で、特にｇｐ１３０上でアゴニスト活性を示すという条件で、タンパク質分子単独の、または関連分子またはそこに連結した残基、たとえば、糖またはリン酸残基と一緒のポリペプチド鎖のあらゆる断片または前駆体、またはタンパク質分子の凝集体、または糖残基それら自身を網羅する。
【００８８】
本明細書中で、用語「塩」は、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子のカルボキシル基の塩、およびＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子のアミノ基の酸付加塩の両方、またはそれらの類似体をいう。カルボキシル基の塩は、当業者に周知である手段によって形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、または亜鉛の塩など）、およびたとえばトリエタノールアミン、アルギニン、またはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと形成される有機塩基の塩などを含む。酸付加塩は、たとえば、塩酸または硫酸などの無機酸の塩、およびたとえば酢酸、シュウ酸などの有機酸の塩を含む。もちろん、それらの塩はいずれも、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの生物学的活性、すなわち、ｇｐ１３０を介するシグナル伝達を活性化する能力を保持していなければならない。
【００８９】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の物質は、１つまたはそれより多くの部位でグリコシル化される。
【００９０】
グリコシル化形態のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、国際公開第９９／０２５５２号（ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３２１）パンフレットに記述されており、それは、本発明により非常に好ましいキメラ分子である。そこに記載されるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、それらは共にヒト起源である、天然に存在する可溶性ＩＬ−６受容体δ−Ｖａｌ（Novick et al., 1990）の全コーディング配列を、成熟な天然に存在するＩＬ−６の全コーディング配列に、融合して得られた組換え糖タンパク質である。当業者は、グリコシル化ＩＬ−６が、同様に組換え手段によって、すなわち、真核生物の発現系での発現により産生され得ることを予測する。
【００９１】
本発明により、アゴニストは、酵母細胞、昆虫細胞、細菌などのようなあらゆる適切な真核生物または原核生物の細胞型で産生され得る。それは、好ましくは哺乳類細胞で、最も好ましくは国際公開第９９／０２５５２号パンフレットでＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６について記述されるとおり遺伝子操作されたＣＨＯ細胞で産生されるのが好ましい。ヒト起源由来のタンパク質が好ましい場合、本明細書中に記載される生物学的活性を保持する限り、あらゆる他の起源の類似の融合タンパク質が、本発明により使用され得ることが当業者により予測される。
【００９２】
本発明の別の実施態様では、本発明の物質は、グリコシル化されない。有利には、キメラ分子は、その後にグリコシル残基を合成する能力はないが、しかし通常、高収量の産生組換えタンパク質を有する細菌細胞で産生され得る。非グリコシル化ＩＬ−６の産生は、たとえば、欧州特許第５０４７５１Ｂ１号で詳細に記載されている。
【００９３】
さらに別の実施態様では、本発明による物質は、免疫グロブリン融合体を包含する。すなわち、本発明による分子は、免疫グロブリンの全部または一部に、そして特に、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される。免疫グロブリン融合タンパク質を作製する方法は、たとえば国際公開第０１／０３７３７号パンフレットに記載されたもののように、当技術分野において公知である。当業者であれば、本発明の得られる融合タンパク質が、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの生物学的活性、すなわち、ｇｐ１３０シグナル伝達の刺激を保持することを理解する。得られた融合タンパク質は、理想的には、体液内での長い滞留時間（半減期）、増大した特異的な活性、上昇した発現レベルまたは融合タンパク質の精製が容易になるなどの改善された性質を有する。
【００９４】
好ましくは、本発明の物質は、Ｉｇ分子の定常領域に融合される。それは、たとえばヒトのＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合され得る。ＩｇＧ₂もしくはＩｇＧ₄、またはたとえばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスのアイソフォームなど、Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明における融合タンパク質の産生に適する。融合タンパク質は、モノマーまたはマルチマー、ヘテロもしくはホモのマルチマーであり得る。
【００９５】
本発明の物質の機能的誘導体は、安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、ヒトの体による寛容性、または免疫原性のようなタンパク質の特性を改善するために、ポリマーに接合され得る。
【００９６】
したがって、本発明の好ましい実施態様は、アミノ酸残基上の１つまたはそれより多くの側鎖として生じる１つまたはそれより多くの官能基に結合した少なくとも１つの部分からなる本発明の物質の機能的誘導体に関する。
【００９７】
非常に好ましい実施態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結した本発明の物質に関する。ポリエチレングリコール化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている周知の方法によって行なわれ得る。
【００９８】
好ましくは、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ、または約１〜５００μｇ／ｋｇ、または約１００μｇ／ｋｇより少ない範囲にある量で使用される。約１μｇ／ｋｇ、または３μｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇ、または３０μｇ／ｋｇの量でｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質を使用することが、さらに好ましい。
【００９９】
本発明の好ましい実施態様では、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質を、毎日投与する。別の好ましい実施態様では、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質は、週に３回投与される。さらに別の好ましい実施態様では、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質は、週に１回投与される。
【０１００】
本発明の物質は、任意の適切な経路によって投与され得る。皮下経路は、本発明により非常に好ましい。
【０１０１】
本発明の物質は、任意の適切な処方で、それの作用部位に送達され得る。好ましくは、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、変異体、融合タンパク質またはそれの活性部分を発現および／または分泌する細胞の形態で送達され得る。以下の実施例で説明するように、充分な量でのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを発現および分泌する細胞は、適切な発現ベクターを使用して細胞にトランスフェクションさせることによって産生された。
【０１０２】
したがって、本発明は、さらに糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、本発明による物質を発現する細胞の使用に関する。細胞を、任意の適切な形態で投与し得る。しかし、重合体封入ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを発現、そして好ましくは分泌する細胞は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの送達の非常に好ましいモデルである。封入手段は、たとえば、Emerichら（1994）または米国特許第５，８５３，３８５号により詳細に記述される。適切な細胞株および適切な発現系は、当技術分野で周知である。
【０１０３】
本発明による物質の送達は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、変異体、融合タンパク質またはそれの断片のコーディング配列を含む発現ベクターのようなベクターを使用して行なっても良い。ベクターは、ヒトの体内における、好ましくは末梢神経性細胞における所望のタンパク質の発現のために必要とされる全ての調節配列を含む。発現ベクター用の調節配列は、当業者により既知である。したがって、本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための本発明による物質のコーディング配列を含むベクターの使用にも関する。
【０１０４】
当技術分野で既知のあらゆる発現ベクターは、本発明により使用され得る。しかし、ウイルス由来の遺伝子治療用ベクターの使用が、非常に好ましい。
【０１０５】
本発明の物質は、医薬組成物としてヒトの体に投与することが好ましい。医薬組成物は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のために、本発明のポリペプチド自体、または該ポリペプチドを発現する細胞または発現ベクター、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラまたは変異体、融合タンパク質またはそれの断片のコーディング配列を含むレンチウイルス性遺伝子療法用ベクターを、任意に、１つまたはそれより多くの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤と共に含み得る。
【０１０６】
「薬学的に許容し得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性がない任意の担体を包含することが意味される。たとえば、非経口投与については、活性成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のようなビヒクル中で注射のための単位投与量形態で処方され得る。
【０１０７】
活性成分は、多様な方法で患者に投与することができる。投与経路としては、皮内、経皮（たとえば、徐放処方で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所、および鼻内経路があげられる。あらゆる他の治療に有効な投与経路を使用することができる。たとえば、上皮または内皮組織を通しての吸着、またはＤＮＡ分子を、患者に（ベクターを介して）投与し、インビボで活性ポリペプチドが発現または分泌される遺伝子療法などが使用できる。さらに、活性分子を、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの生物学的活性剤の他の成分と一緒に投与することができる。
【０１０８】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与については、活性成分は、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）と共同して、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般に使用される技術により無菌化される。
【０１０９】
本発明のさらなる目的は、糖尿病性神経障害を治療および／または予防するための方法であって、治療を必要とする患者に、ヒトｇｐ１３０受容体を介してシグナル伝達を起こす物質の有効量を、任意に、薬学的に許容し得る担体と一緒に投与することを含む方法を提供することである。
【０１１０】
「有効量」は、前記の疾患の経過および重症度に影響を及ぼし、このような病理学の減少または寛解にを誘導するのに充分である活性成分の量を意味する。有効量は、投与の経路および患者の症状に依存する。
【０１１１】
単回または複数回投与として個体に投与される服用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態や特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時治療、治療の頻度ならびに望ましい効果などの多様な因子に依存して変化する。確立される服用量の範囲の調整や操作は、充分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１２】
糖尿病性神経障害を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、IL−6またはIL−6R／IL−6キメラ、または変異体、融合タンパク質、それの活性部分を発現する細胞の有効量を投与することを含む方法も、本発明により考慮される。糖尿病性神経障害を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、IL−6またはIL−6R／IL−6キメラ、変異体、融合タンパク質、それの活性部分のコーディング配列を含む発現ベクターを投与することを包含する方法は、本発明の別の目的である。
【０１１３】
本発明の好ましい実施態様では、発現ベクターは、遺伝子治療ベクターである。ウイルス性ベクター、特にレンチウイルス性ベクターの使用が、非常に好ましい。
【０１１４】
本発明は、ここで、以下の限定されない実施例および添付の図面でさらに詳細に記述される。
【０１１５】
ここまで本発明を充分に説明してきたので、同様のことが等しいパラメーター、濃度および条件の範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、また過度の実験をすることなく行なうことができるということは当業者によって充分理解されるであろう。
【０１１６】
本発明は、その特定の実施態様に関連して説明されているが、さらなる変更が可能であるということは理解されるであろう。この出願は、概して本発明の原理を受けて本発明の任意の変化、用途、適応を保護することを意図しており、本発明の属する技術分野の既知のまたは一般的な手法の範囲内となる本開示からの逸脱および下記の通り添付のクレームの範囲で前記の本質的な特徴にあてはまるような本発明からの逸脱も含む。
【０１１７】
本明細書において引用される、雑誌の論文もしくは要旨、公開もしくは未公開の米国もしくは外国特許出願、公布された米国もしくは外国特許または任意のほかの参考文献などのすべての参考文献は、引用される参考文献に示されたすべてのデータ、表、図および文章を含めて、本明細書において完全に参考のために組み込まれる。さらに、本明細書において引用される参考文献中で引用される参考文献の全内容も、参考のために完全に組み込まれる。
【０１１８】
既知の方法手段、常套的な方法手段、既知の方法または常套的な方法への言及は、本発明のあらゆる局面、記載または実施態様が関連技術において開示、教示または示唆されるものであると認めるものではない。
【０１１９】
特定の実施態様の先行する記載は、第三者が、当業者の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験をすることなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、特定の実施態様などのさまざまな適用のために、容易に修飾および／または適応させることができるほど、本発明の全体的な性質を充分に示すものであろう。したがって、本明細書で紹介された教示および手引きに基づく、そのような適応および修飾は、開示された実施態様と同等の範囲の意味であると意図される。本明細書の表現または専門用語は、本明細書で紹介された教示および手引きによる見地と当業者の知識とを組み合わせて、当業者に理解されるものであるため、本明細書での表現または専門用語は、説明を目的とするものであって限定するためのものではない。
【実施例１】
【０１２０】
ＣＨＯ細胞でのＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの産生
【０１２１】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ
可溶性ＩＬ−６受容体（尿中で見出された天然型ｓＩＬ−６Ｒ、Oh et al., 1997）をコードするｃＤＮＡ配列を、成熟ＩＬ−６をコードする配列と融合した。３架橋アミノ酸（ＥＦＭ）についての配列も存在した。融合遺伝子を、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現ベクターに挿入し、そしてＣＨＯ細胞に導入した。産生プロセスを展開し、得られた組換えタンパク質を、抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体を用いて免疫精製により精製した。精製ＩＬ−６キメラは、グリコシル化され、８５′０００の見かけのＭＷを示すことが示された。
【０１２２】
図１０は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの組成を概略的に示す。成熟タンパク質は、５２４個のアミノ酸を含む。
【０１２３】
上に概説されるように産生および精製されたタンパク質は、本発明により投与されるのに適切である。
【０１２４】
ＩＬ−６
遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で組換えヒトＩＬ−６（ｒ−ｈＩＬ−６）を産生する。産生プロセスは、ワーキング・セル・バンク（ＷＣＢ）からの細胞の増殖および拡張から開始し、ｒ−ｈＩＬ−６が、培養培地に分泌される条件下で継続する。ｒ−ｈＩＬ−６収穫培養培地を、特異的抗−ＩＬ−６モノクローナル抗体（ｍＡＢ）を用いて免疫クロマトグラフィーにより精製する。さらなる精製工程を使用して、非常に高いレベルの純度を示す産物を得る。
【０１２５】
ｒ−ｈｌＬ−６を、適切な賦形剤を含む無菌の凍結乾燥調製品として提供する。それは、２種類の量、３５μｇおよび３５０μｇで利用可能であり、そして注射用水で使用のためにもどされる。最終処方産物の１バイアルに対する戻り容積（reconstitution volume）は、正常には０．５ｍｌの水である。最終産物は、２５℃より低い温度でそれの当初の容器に保存されるべきである。
【０１２６】
ｒ−ｈＩＬ−６の構造を、高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）、トリプシンによるマッピングおよびアミノ酸配列決定によって確認した。ＦＡＢおよびエレクトロスプレー質量分析学を使用して、組成を決定し、そしてＦＡＢおよびエレクトロスプレー質量分析学を使用して、ＩＬ−６の炭水化物部分の組成および構造を決定した。残基アスパラギン−４６を、Ｎグリコシル化部位として同定し、Ｎ連結炭水化物の予備分析により、主要な種が、モノシアリルフコシル二分岐およびジシアリルフコシル二分岐構造であることが示された。Ｏ−グリコシル化部位は、スレオニン−１３８または−１３９のいずれかとして同定された。
【実施例２】
【０１２７】
腹腔内投与によるストレプトゾトシン誘導糖尿病性神経障害モデルでのＩＬ−６の効果
材料および方法
動物
６週齢の雄性スプレーグドーリー（Sprague Dawley）ラット（ジャンビエ（Janvier）、ルジェネサンイル（Le−Genest−St−Isle）、フランス）を、乱数表により９つの実験群（ｎ＝１０）に分配した：（ａ）ビヒクルコントロール群、生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％（重量／体積）の無菌溶液を注射した；（ｂ）生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％の無菌溶液に溶解したＩＬ−６を、１００μｇ／ｋｇの用量で注射した動物から構成されるコントロール群；（ｃ）生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％の無菌溶液を注射したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）中毒群；（ｄ）５つの異なる用量：１、３、１０、３０および１００μｇ／ｋｇでＩＬ−６化合物の注射を受けている動物から構成される５つの治療されたＳＴＺ中毒群；（ｅ）ＳＴＺ中毒群および参照化合物での治療群：１０μｇ／ｋｇの用量で４−メチルカテコール（４−ＭＣ）。
【０１２８】
それらを、群で収容し（ケージ当たり２匹の動物）、そして制御温度（２１−２２℃）および可逆明暗サイクル（１２時間／１２時間）で、そして食物および水は自由に利用できる状態で部屋に維持した。研究所の指針にしたがって全実験を行なった。
【０１２９】
糖尿病の誘導および薬理学的治療
５５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、手術的に露出させた左の伏在静脈マグナ（magna）中へのストレプトゾトシン（シグマ、リルダボーシェネ（L′Isle d′Abeau-Chesnes）、フランス）緩衝溶液の注射により、糖尿病を誘導した。薬物を、０．１モル／ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に注射の直前に溶解させた。ＳＴＺ注射の日を、０日（Ｄ）とした。
【０１３０】
１週間後、Ｄ１０に、尾部静脈血を、糖測定器（グルコトレンド試験、ロッシュ、マンハイム、ドイツ）を用いて各個別の動物で血糖を分析した。２６０ｍｇ／ｄｌより下の値を示す動物を、研究から除外した。実験の終わり、Ｄ４０に血糖を再検査した。
【０１３１】
ＩＰ治療（ビヒクル、ＩＬ−６および４−ＭＣ）を、Ｄ１１からＤ４０まで、毎日行なった。
【０１３２】
実験計画
体重および生存率を毎日記録した。
【０１３３】
尾部の動きおよびＥＭＧ検査を、以下の時機として週に１回行なった：
Ｄ−７：ベースライン（尾部の動きおよびＥＭＧ）
Ｄ０：ＳＴＺ注射による糖尿病の誘導
Ｄ１０：血糖の測定
Ｄ１１：治療の開始（ＩＬ−６および４−ＭＣ）
Ｄ２５：ＥＭＧおよび尾部の動き検査
Ｄ４０：血糖の制御、ＥＭＧおよび尾部の動き検査、坐骨神経の除去
【０１３４】
感受性検査：テイル・フリック
ラットの尾部を、熱源としてのシャッター制御ランプ（バイオセブ（Bioseb）、パリ、フランス）の下に置いた。ラットが、熱源からその尾部を動かすまでの潜伏時間を記録した。感覚変化は、動きの潜時間を増大させる。２回試行し、平均値を計算して固有値として保存した。
【０１３５】
筋電図検査法
ニューロマチック２０００Ｍ筋電計（ＥＭＧ）（ダンテック（Dantec）、レジュリス（Les Ulis）、フランス）を用いて、電気生理学的記録を行なった。ラットを、６０ｍｇ／ｋｇケタミン塩酸塩（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００（登録商標）、ローヌメリックス（Rhone Merieux）、リヨン、フランス）の腹腔内注射により麻酔にかけた。正常な体温を、加熱ランプを用いて３０℃に維持させ、そして尾部表面に置かれた接触温度計（クイック、バイオブロック サイエンティフィック（Bioblock Scientific）、イールキルシェ（Illkirch）、フランス）により制御した。
【０１３６】
坐骨神経の刺激後に、複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を、腓腹筋で記録した。参照電極および活性針を、後足に設置した。接地針を、ラットの下部背中（lower back）に挿入した。坐骨神経を、最大限の強度で、０．２ｍｓ単パルスで刺激した。運動波の速度を記録し、ｍｓで表わした。
【０１３７】
感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）も記録した。尾部皮膚電極を、以下のとおり設置した。参照針を、尾の根元に挿入し、そして陽極（anoe）針を、参照針から尾部の末端に向かって３０ｍｍ離して置いた。接地針電極を、陽極と参照電極のあいだに挿入した。尾の神経を、１２．８ｍＡの強度で、一連の２０パルス（０．２ｍｓとして）で刺激した。速度をｍ／ｓで表した。
【０１３８】
形態測定分析
形態測定分析を、研究の終わり（Ｄ４０）に行った。動物に、１００ｍｇ／ｋｇのＩｍａｌｇｅｎｅ ５００（登録商標）のＩＰ（腹腔内）注射により麻酔をかけた。坐骨神経の５ｍｍセグメントを、組織学用に切除した。組織を、４％グルタルアルデヒド（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）溶液のリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）で一晩固定し、そして使用するまで、＋４℃で、３０％ショ糖中に保持した。神経サンプルを、２％四酸化オスミウム（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）溶液のリン酸緩衝溶液で２時間固定し、順次アルコール溶液で脱水し、そしてエポン（Epon）に埋設した。その後、埋設組織を、３日間の重合のあいだ、＋７０℃に置いた。１．５μｍの横断面を、ミクロトームで切断し、２分間、１％トルイジンブルー溶液（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）で染色し、脱水し、そしてＥｕｋｉｔｔ中に埋め込んだ。サンプル当たり２０個の切片を、光学顕微鏡（ニコン、東京、日本）を用いて調べ、そして６個の無作為に選択したスライスを、半自動化デジタル画像解析ソフトウエア（バイオコム（Biocom）、フランス）を使用して分析した。スライス当たり２つの無作為に選択したフィールドを詳しく調べた。以下の項目を算出した：（ａ）線維の直径、（ｂ）軸索の直径、（ｃ）ミエリンの厚さ（下記参照）。
【０１３９】
神経切片当たりの線維の総数を計数するために、サンプル当たり３つの無作為スライスを選択し、そしてスライス当たり２つのフィールドを分析した。
【０１４０】
データ解析
データの全体的な解析は、１因子または反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）および一元配置（one way）ＡＮＯＶＡを用いて行なった。アノバ検定が、有意差を示した場合に、ダネット検定を用いた。ポストホックテストは行なわなかった。有意差のレベルを、ｐ＜０．０５に設定した。結果は、平均±平均の標準誤差（s.e.m.）として表わす。
【０１４１】
結果
動物の体重
図１に示されるとおり、体重の進展における群間の有意差を、この試験で記録した［ｆ（８，２９６）＝１９．４７およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。５日から４０日までで、ＳＴＺ中毒／ＩＬ−６治療動物は、体重の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡおよびｐ＜０．０５コントロール対（ｖｓ）ＳＴＺ；コントロール／ｉｌ−６（１００μｇ／ｋｇ）対ＳＴＺ；コントロール対ＳＴＺ＋ｉｌ−６およびコントロール／ｉｌ−６（１００μｇ／ｋｇ）対ＳＴＺ＋ＩＬ−６；ダネット検定）。
【０１４２】
１０μｇ／ｋｇの用量でＩＬ−６治療した糖尿病動物は、ｉｌ−６の他の用量のものより有意に高い体重を示した［ｆ（５，１８５）＝１．１６およびｐ＝０．０８；反復測定ＡＮＯＶＡ］。
【０１４３】
１００μｇ／ｋｇの用量でＳＴＺ中毒／ＩＬ−６治療した動物は、研究の間中（治療の開始から始めて）減少した体重を示したことが注目され得る。
【０１４４】
血糖
図２ａは、ｄ１０で、コントロール動物が、１００ｍｇ／ｄｌと同等の血糖値を表わしたことを示す。他方で、ＳＴＺ中毒ラットは、２６０ｍｇ／ｄｌより高い血漿中グルコース濃度を示し、糖尿病と判断された。
【０１４５】
図２ｂは、ＳＴＺ中毒ラットがｄ４０でなお糖尿病であったことを示す。
【０１４６】
感受性試験：テイル・フリック
テイル・フリック試験の遂行の進展で、群間に有意差があった［Ｆ（８，１６）＝２．０７およびｐ＝０．０１３；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図３）。ラットが、熱源からその尾部を動かすまでの潜伏時間は、糖尿病の治療なしの動物で有意に増大した（コントロール対／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ビヒクル ｐ＜０．００１；ダネット検定）。Ｄ２５およびＤ４０で、反応時間は、１、３、１０および１００μｇ／ｋｇの用量で、ＩＬ−６で治療した動物、および１０μｇ／ｋｇの４−ＭＣで治療した動物では増加しなかった。実際に、これらの群間に有意差は見られなかった（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１４７】
電気生理学的測定
複合筋肉活動電位の潜伏時間
研究の間中、ＣＭＡＰの潜伏時間に関して群間に有意差があった［Ｆ（８，１６）＝５．９０１およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。潜伏時間は、糖尿病の未治療ラットで有意に増加した（２５および４０日目に：ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。この増加は、ＩＬ−６治療群ではあまり重要でなく；特に、２５および４０日目に、コントロール／ビヒクル群の潜伏時間の値との間に有意差を示さないＩＬ−６（１０μｇ／ｋｇ）治療群については、あまり重要でなかった（図４）。
【０１４８】
さらに、２５日目に、各ＩＬ−６治療／ＳＴＺ群は、ビヒクル／ＳＴＺ群のＣＭＡＰ潜伏時間より有意に短いＣＭＡＰ潜伏時間を示した（ｐ＝０．００１、ダネット検定）。
【０１４９】
４０日目に、同じ結論が引き出された。
【０１５０】
ＩＬ−６治療／ＳＴＺ動物（１０ｍｇ／ｋｇ）と４つの他のＩＬ−６治療群（１、３、１０、３０および１００μｇ／ｋｇ）とのあいだに、有意差が見られた（Ｄ２５：ｐ＝０．００２、Ｄ４０：ｐ＝０．００３；一元配置ＡＮＯＶＡ検定）。３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇ治療動物は、２５日目並びに４０日目に、１、３０および１００μｇ／ｋｇのＩＬ−６治療／ＳＴＺ群より有意に低い潜伏時間を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１５１】
感覚神経伝導速度
研究の間中、群間でＳＮＶＣに有意差が記録された［Ｆ（８，１６）＝５．５１８およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図５）。糖尿病ラットは、コントロール／ビヒクル群と比較して、ＳＮＣＶの有意な減少を示した（２５および４０日目に：ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。さらに、２５日目に、コントロール／ビヒクル群と１０μｇ／ｋｇのＩＬ−６治療群とのあいだに、有意差は観察されなかった（ｐ＝０．４２６；ダネット検定）。それに対して、全ての他の群間で有意差が見られた。２５日目には、１０および３０μｇ／ｋｇのみが、ＳＴＺ／ビヒクル群と有意差を示した（１０μｇ／ｋｇ 対 ビヒクルＳＴＺ群：ｐ＜０．００１、３０μｇ／ｋｇ 対 ＳＴＺ群、ｐ＝０．００４、ダネット検定）。４０日目には、１０μｇ／ｋｇで治療された動物は、ＳＴＺ／ビヒクル治療動物となんらの有意差も示さなかったが、この群についてのＳＮＣＶ値は、他のＳＴＺ／ＩＬ−６治療動物より高かった。
【０１５２】
ＳＮＣＶは、末梢神経構造の正常な成熟により、コントロール／ビヒクル動物においては研究の間中徐々に増大したことが注目され得る（Gao et al., 1995, Malone et al., 1996）。
【０１５３】
形態測定分析
軸索の直径
軸索の直径では、群間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図６）。ビヒクル／ＳＴＺ動物は、コントロールラットと比較して、軸索の直径に有意な減少を示した（ｐ＝０．０８；ダネット検定）。ＩＬ−６を用いた治療は、３μｇ／ｋｇの用量から、軸索の直径のこの減少を反転した（ＩＬ−６治療ラット 対 ＳＴＺ／ビヒクル ｐ＜０．００１；ダネット検定）。さらに、コントロール群とコントロール／ＩＬ−６（１００μｇ／ｋｇ）群とのあいだで有意差が示された（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。コントロール／ビヒクル群と４−ＭＣ治療群とのあいだに有意差は見られなかった（ｐ＝０．６５７；ダネット検定）。
【０１５４】
線維の直径
図７は、線維の直径において９つの群のあいだで有意差があったことを示す（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＳＴＺ投与は、線維の直径の有意な減少を導く（コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ビヒクル ｐ＝０．００５；ダネット検定）。ビヒクル／ＳＴＺラットとＩＬ−６治療／ＳＴＺラットとのあいだに、有意差が観察された（ｐ＜０．００５；ダネット検定）。ＩＬ−６治療動物は、ビヒクル／ＳＴＺ動物より大きな線維の直径を示した。さらに、コントロール群とコントロール／ＩＬ−６（１００μｇ／ｋｇ）群のあいだで、有意差が見られた（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。１０μｇ／ｋｇの用量で４−ＭＣで治療された動物は、コントロール／ビヒクル群と有意差を表わさなかった（Ｐ＝０．６２８；ダネット検定）。
【０１５５】
ミエリンの厚さ
ミエリンの厚さの比較は、９つの群のあいだの有意差を示した（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図８）。ミエリンの厚さは、コントロール／ビヒクルおよびＩＬ−６治療動物（３、１０、３０および１００μｇ／ｋｇ）よりビヒクル／ＳＴＺ動物で有意に小さかった（ｐ＜０．０１；ダネット検定）。すべてのＩＬ−６治療／ＳＴＺ動物が、ビヒクル／ＳＴＺ群より有意に高いミエリンの厚さを表わすことに注目し得る。さらに、我々は、コントロール／ビヒクルおよびコントロール／ＩＬ−６（１００μｇ／ｋｇ）群のあいだの有意差に気が付いた（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。
【０１５６】
ミエリン化された線維の総数
図９に示されるように、ミエリン化された線維の総数に群間で有意差があった（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。ビヒクル／ＳＴＺ動物は、コントロール動物より少ない数の線維を示した（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。対照的に、ＩＬ−６治療／ＳＴＺ動物は、ビヒクル／ＳＴＺ動物と比較した場合、繊維の数の増加を示した（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。４−ＭＣで治療されたＳＴＺ中毒動物は、コントロール動物のものと類似の線維の総数を示した。さらに、コントロール／ビヒクル群とコントロール／ＩＬ−６（１００μｇ／ｋｇ）群とのあいだで有意差を示さなかった。
【０１５７】
結論
この研究で、ストレプトゾトシンで中毒にされ、そして数日後に糖尿病を発生する動物が、誘導神経障害のモデルとして使用された。動物は、誘導の３〜４日後に糖尿病になる。
【０１５８】
糖尿病動物は、３０日間、慢性的に種々の用量のＩＬ−６（１、３、１０、３０および１００μｇ／ｋｇ）によって治療された。治療は、誘導の１０日後に開始し、ＳＴＺ誘導の４０日後の動物の犠牲死まで、毎日、腹腔内に投与された。この治療は、ＩＬ−６が、長期化した高血糖症によって引起される最初の分子損傷の後に投与された点で、治療用処置と見なされ得る。
【０１５９】
本プロトコールは、３０日間のＩＬ−６治療が、糖尿病性神経障害に対して神経保護を促すことを示す。テイル・フリックおよびＥＭＧ試験（感覚および運動速度）を用いた行動分析は、特に３および１０μｇ／ｋｇの用量に関してＩＬ−６の神経保護効果を示す。
【０１６０】
低い容量並びに高い濃度は、神経保護効果を示した。実際に、治療の用量がより増加するほど、神経保護効果は、目立たなくなる。さらに、最も高い用量（１００μｇ／ｋｇ）は、明白な効果を示さず、そしてＳＴＺ動物の全般的行動に対して毒性効果を示すようである。１００μｇ／ｋｇでＩＬ−６により治療したコントロール動物（ＳＴＺで治療されていない）は、ビヒクルコントロール動物または低濃度のＩＬ−６で治療されたＳＴＺラットよりいっそう刺激された。さらに、これらの動物（ＩＬ−６ １００μｇ／ｋｇ）は、実験者にとって扱い難かった。ＳＴＺ／ＩＬ−６ １００μｇ／ｋｇでも同様のことが観察された。それにもかかわらず、これらの動物は、ほとんど刺激されないようであった（おそらく、それらの体重の大きな損失によるそれらの衰弱により）。
【０１６１】
神経保護的効果は、感覚線維並びに運動線維に焦点が置かれる（ＣＭＡＰ速度は、ＩＬ−６治療で変化しなかった）。
【０１６２】
形態学的分析を考慮して、ＩＬ−６治療により誘導された神経保護は、全ての研究用量について非常に明らかである。ＳＴＺ／ビヒクル動物の線維は、ミエリン鞘の減少および軸索の改変を示し、そしてそれは、最終的に線維の変性を誘導する（線維の総数の減少で示される）。
【０１６３】
ＩＬ−６（特に、１０μｇ／ｋｇ）を用いた治療が、ミエリン鞘および軸索変性を保護することがこの研究で証明された。
【０１６４】
高用量のＩＬ−６（１００μｇ／ｋｇ）が、健全な動物で線維に有害な影響を誘導することに注目すべきである。実際に、線維は、病気になる（to suffer）ようであり、線維の損失はないが、線維の鞘および全般的態様が改変される。ところが、この効果は、高用量のＩＬ−６で治療された糖尿病動物では記録されなかった（毒性効果は、体重の大きな減少によって特徴づけられる動物の全般的行動に主に焦点を当てている）。
【０１６５】
結論として、ＩＬ−６は、３０日間の慢性的治療の後に、ならびに運動線維より感覚線維で、明確な神経保護的効果を誘導し、おそらく線維での直接的効果により作用し、そして神経変性の炎症過程を減少させる。
【実施例３】
【０１６６】
皮下投与によるストレプトゾトシン誘導糖尿病性神経障害モデルでのＩＬ−６の効果
この研究の目的は、同じ神経障害のモデルでの様々な投与量およびタイミングで皮下経路を介してのＩＬ−６の効果を評価することであった。
【０１６７】
動物
研究Ａ
６週齢の雄性スプレーグドーリーラット（ジャンビエ、ルジェネサンイル、フランス）を、乱数表により６つの実験群に分配した：（ａ）ビヒクルコントロール群（ｎ＝４）、生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％（重量／体積）の無菌溶液を注射した；（ｂ）生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％の無菌溶液を注射したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）中毒群（ｎ＝１０）；（ｃ）４つの異なる用量：１、３、１０、３０μｇ／ｋｇでＩＬ−６化合物のＳＣ注射を毎日受けている動物から構成される４つの治療されたＳＴＺ中毒群（ｎ＝１０）。
【０１６８】
それらを、群で収容し（ケージ当たり２匹の動物）、そして制御温度（２１−２２℃）および可逆明暗サイクル（１２時間／１２時間）で、そして食物および水は自由に利用できる状態で部屋に維持した。研究所の指針にしたがって全実験を行なった。
【０１６９】
研究Ｂ
６週齢の雄性スプレーグドーリーラット（ジャンビエ、ルジェネサンイル、フランス）を、乱数表により７つの実験群に分配した：（ａ）ビヒクルコントロール群（ｎ＝４）、生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％（重量／体積）の無菌溶液を注射した；（ｂ）生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％の無菌溶液を注射したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）中毒群（ｎ＝１０）；（ｃ）４つの異なる用量：１、３、１０、３０μｇ／ｋｇでＩＬ−６化合物のＳＣ注射を１週間に３回受けている動物から構成される４つの治療されたＳＴＺ中毒群（ｎ＝１０）；（ｄ）１０μｇ／ｋｇでＩＬ−６化合物のＩＰ注射を受けている動物から構成される治療ＳＴＺ中毒群（ｎ＝１０）。
【０１７０】
それらを、群で収容し（ケージ当たり２匹の動物）、そして制御温度（２１−２２℃）および可逆明暗サイクル（１２時間／１２時間）で、そして食物および水は自由に利用できる状態で部屋に維持した。研究所の指針にしたがって全実験を行なった。
【０１７１】
研究Ｃ
６週齢の雄性スプレーグドーリーラット（ジャンビエ、ルジェネサンイル、フランス）を、乱数表により６つの実験群に分配した：（ａ）ビヒクルコントロール群（ｎ＝４）、生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％（重量／体積）の無菌溶液を注射した；（ｂ）生理食塩水−ＢＳＡ ０．０２％の無菌溶液を注射したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）中毒群（ｎ＝１０）；（ｃ）４つの異なる用量：１、３、１０、３０μｇ／ｋｇでＩＬ−６化合物のＳＣ注射を週に１回受けている動物から構成される４つの治療されたＳＴＺ中毒群（ｎ＝１０）。
【０１７２】
それらを、群で収容し（ケージ当たり２匹の動物）、そして制御温度（２１−２２℃）および可逆明暗サイクル（１２時間／１２時間）で、そして食物および水は自由に利用できる状態で部屋に維持した。研究所の指針にしたがって全実験を行なった。
【０１７３】
糖尿病の誘導および薬理学的治療
５５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、手術的に露出させた左の伏在静脈マグナ中へのストレプトゾトシン（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）緩衝溶液の注射により、糖尿病を誘導した。薬物を、０．１モル／ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に注射の直前に溶解させた。ＳＴＺ注射の日を、０日（Ｄ）とした。
【０１７４】
１週間後、Ｄ１０に、尾部静脈血を、糖測定器（グルコトレンド試験、ロッシュ、マンハイム、ドイツ）を用いて各個別の動物で血糖を分析した。２６０ｍｇ／ｄｌより下の値を示す動物を、研究から除外した。実験の終わり、Ｄ４０に血糖を再検査した。
【０１７５】
治療（ビヒクルおよびＩＬ−６）を、Ｄ１１からＤ４０まで行なった。
【０１７６】
実験計画
体重および生存率を毎日記録した。
【０１７７】
尾部の動きおよびＥＭＧ検査を、以下の時機として週に１回行なった：
Ｄ−７：ベースライン（テイル・フリック、運動活動およびＥＭＧ）
Ｄ０：ＳＴＺ注射による糖尿病の誘導
Ｄ１０：血糖の測定
Ｄ１１：治療の開始（ＩＬ−６）
Ｄ２４：テイル・フリック検査
Ｄ２５：ＯＦ（オープンフィールド）での運動活動
Ｄ２６：ＥＭＧ検査
Ｄ３８：テイル・フリック検査
Ｄ３９：ＯＦでの運動活動
Ｄ４０：血糖の制御、ＥＭＧ検査、坐骨神経の除去
【０１７８】
感受性検査：テイル・フリック
ラットの尾部を、熱源としてのシャッター制御ランプ（バイオセブ、パリ、フランス）の下に置いた。ラットが、熱源からその尾部を動かすまでの潜伏時間を記録した。感覚変化は、動きの潜時間を増大させる。２回試行し、平均値を計算して固有値として保存した。
【０１７９】
オープンフィールドでの運動活動
動物を、プレクシーグラス（Plexiglas）（８０×８０×４０ｃｍ）オープンフィールド（ＯＦ）に置いた。床を、１６個の等しい区画に分割した。各動物について、自発的運動活動および立ち上がりの数を、１０分の期間中記録した。
【０１８０】
筋電図検査法
ニューロマチック２０００Ｍ筋電計（ＥＭＧ）（ダンテック、レジュリス、フランス）を用いて、電気生理学的記録を行なった。ラットを、６０ｍｇ／ｋｇケタミン塩酸塩（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００（登録商標）、ローヌメリックス、リヨン、フランス）の腹腔内注射により麻酔にかけた。正常な体温を、加熱ランプを用いて３０℃に維持させ、そして尾部表面に置かれた接触温度計（クイック、バイオブロック サイエンティフィック、イールキルシェ、フランス）により制御した。
【０１８１】
坐骨神経の刺激後に、複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を、腓腹筋で記録した。参照電極および活性針を、後足に設置した。接地針を、ラットの下部背中に挿入した。坐骨神経を、最大限の強度で、０．２ｍｓ単パルスで刺激した。運動波の速度を記録し、ｍｓで表わした。
【０１８２】
感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）も記録した。尾部皮膚電極を、以下のとおり設置した。参照針を、尾の根元に挿入し、そして陽極（anoe）針を、参照針から尾部の末端に向かって３０ｍｍ離して置いた。接地針電極を、陽極と参照電極のあいだに挿入した。尾の神経を、１２．８ｍＡの強度で、一連の２０パルス（０．２ｍｓとして）で刺激した。速度をｍ／ｓで表した。
【０１８３】
形態測定分析
形態測定分析を、研究の終わり（Ｄ４０）に行った。動物に、１００ｍｇ／ｋｇのＩｍａｌｇｅｎｅ ５００（登録商標）のＩＰ（腹腔内）注射により麻酔をかけた。坐骨神経の５ｍｍセグメントを、組織学用に切除した。組織を、４％グルタルアルデヒド（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）溶液のリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）で一晩固定し、そして使用するまで、＋４℃で、３０％ショ糖中に保持した。神経サンプルを、２％四酸化オスミウム（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）溶液のリン酸緩衝溶液で２時間固定し、順次アルコール溶液で脱水し、そしてエポン（Epon）に埋設した。その後、埋設組織を、３日間の重合のあいだ、＋７０℃に置いた。１．５μｍの横断面を、ミクロトームで切断し、２分間、１％トルイジンブルー溶液（シグマ、リルダボーシェネ、フランス）で染色し、脱水し、そしてＥｕｋｉｔｔ中に埋め込んだ。サンプル当たり２０個の切片を、光学顕微鏡（ニコン、東京、日本）を用いて調べ、そして６個の無作為に選択したスライスを、半自動化デジタル画像解析ソフトウエア（バイオコム（Biocom）、フランス）を使用して分析した。スライス当たり２つの無作為に選択したフィールドを詳しく調べた。以下の項目を算出した：（ａ）線維の直径、（ｂ）軸索の直径、（ｃ）ミエリンの厚さ。
【０１８４】
神経切片当たりの線維の総数を計数するために、サンプル当たり３つの無作為スライスを選択し、そしてスライス当たり２つのフィールドを分析した。
【０１８５】
データ解析
データの全体的な解析は、１因子または反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）および一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行なった。アノバ検定が、有意差を示した場合に、ダネット検定を用いた。ポストホックテストは行なわなかった。有意差のレベルを、ｐ＜０．０５に設定した。結果は、平均±平均の標準誤差（s.e.m.）として表わす。
【０１８６】
結果
研究Ａ
動物の体重
図１１に示されるとおり、体重の進展における群間の有意差を、この試験で記録した［ｆ（５，１８５）＝９．２０およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。５日から４０日までで、ＳＴＺ中毒／ＩＬ−６治療動物は、体重の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡおよびｐ＜０．０５コントロール 対（ｖｓ） ＳＴＺ；コントロール 対 ＳＴＺ＋ｉｌ−６；ダネット検定）。
【０１８７】
１０μｇ／ｋｇの用量でＩＬ−６治療した糖尿病動物は、ｉｌ−６の他の用量のものより有意に高い体重を示した［ｆ（４，１４８）＝２．９３およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。
【０１８８】
血糖
図１２は、１０日目で、コントロール動物が、１２０ｍｇ／ｄｌと同等の血糖値を表わしたことを示す。他方で、ＳＴＺ中毒ラットは、２６０ｍｇ／ｄｌより高い血漿中グルコース濃度を示し、糖尿病と判断された。
【０１８９】
ＳＴＺ中毒ラットは、４１日目になお糖尿病であったことが注目される（ｓｔｚ／ＩＬ−６（１０μｇ／ｋｇ）群のラット（ｎ°２）が、２６０ｍｇ／ｄｌより低い血糖のため、その研究から除外された）。
【０１９０】
感受性検査：テイル・フリック
テイル・フリック検査の遂行の進展で、群間に有意差はなかった［Ｆ（５，１０）＝１．８１およびｐ＝０．０７２；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図１３）。それにもかかわらず、ラットが、熱源からその尾部を動かすまでの潜伏時間は、糖尿病の治療なし、および高用量のＩＬ−６で治療した動物で増大した。Ｄ３８で、反応時間は、１および３μｇ／ｋｇの用量で、ＩＬ−６で治療した動物では増加しなかった。実際に、これらの群間に有意差は見られなかった（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１９１】
ＯＦでの運動活動
図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、研究の間中の、区画横切りおよび立ち上がりの回数で群間に有意差があった［それぞれ、ｐ＜０．００１でＦ（５，１０）＝５．９９およびｐ＜０．００１でＦ（５，１０）＝４．２２；反復測定ＡＮＯＶＡ］。２５日目と４０日目に、治療されたかまたはされていない糖尿病ラットは、区画横切りと立ち上がりの回数の有意な減少により特徴づけられた低い運動活動を示した（コントロール 対 ＳＴＺ／ビヒクルおよびコントロール 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６ ｐ＜０．０１；ダネット検定）。
【０１９２】
１および３μｇ／ｋｇの用量で治療された動物が、ＳＴＺ／ビヒクルラットより高い運動活動を表すことは注目され得る。
【０１９３】
電気生理学的測定
複合筋肉活動電位の潜伏時間
研究の間中、ＣＭＡＰの潜伏時間に関して群間に有意差があった［Ｆ（５，１０）＝５．７１およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。潜伏時間は、糖尿病の未治療ラットで有意に増加した（２６および４１日目に：ｐ＜０．０１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。さらに、この増加は、各ＩＬ−６治療群ではあまり重要でなかった。（図１５）。
【０１９４】
２６日目および４１日目に、各ＳＴＺ／ＩＬ−６治療群は、ＳＴＺ／ビヒクル群のＣＭＡＰ潜伏時間より有意に短い潜伏時間を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１９５】
感覚神経伝導速度
研究の間中、群間でＳＮＶＣに有意差が記録された［Ｆ（５，１０）＝３．７８およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図１６）。糖尿病ラットは、コントロール／ビヒクル群と比較して、ＳＮＣＶの有意な減少を示した（２６および４１日目に：ｐ＜０．０１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０１９６】
２６および４１日目に、すべてのＩＬ−６治療動物はＳＴＸ／ビヒクル群と有意差を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。さらに、他のすべての群間で有意差が見られたのに対して、４１日目には、コントロール／ビヒクル群と３および３０μｇ／ｋｇＩＬ−６治療群との間に有意差は観察されなかった（それぞれ、ｐ＜＝０．０５４およびｐ＝０．１８４；ダネット検定）。
【０１９７】
形態測定分析
線維の直径
図１７に示されるように、線維の直径において群間に有意差がみられた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。コントロール／ビヒクル群と比較すると、糖尿病のラットでは、線維の直径の減少が観察された（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。さらに、ＩＬ−６治療は、すべての試験用量に関して、有意にこの直径の減少を防いだ（ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６治療：ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１９８】
軸索の直径
軸索の直径では、群間に有意差があった（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図１８）。ＳＴＺ／ビヒクル群は、軸索の直径の有意な減少を示した（コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ビヒクル：ｐ＜０．００１；ダネット検定）。ＩＬ−６で治療した動物は、すべての試験用量で、糖尿病の未治療ラットよりも有意に大きい軸索の直径を表わした（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０１９９】
ミエリンの厚さ
ミエリンの厚さでは、群間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図１９）。コントロール／ビヒクル動物と比較して、糖尿病のラットにおいてミエリンの厚さの有意な減少が観察された（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。さらに、この減少は、ＩＬ−６治療群においては顕著に重要ではなかった（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２００】
変性した線維の割合
図２０および２１に示されるように、糖尿病で治療していないラットは、ミエリン化された線維の有意な減少を示した（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。３、１０および３０μｇ／ｋｇの用量での毎日のＩＬ−６による治療は、ＳＴＺ／ビヒクル群と比較して変性した線維の割合を有意に減少させた（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。
【０２０１】
研究Ｂ
動物の体重
体重の進展に群間の有意差があった［Ｆ（６，１６８）＝９．２４およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図２２）。Ｄ５からＤ４０までで、ＳＴＺ中毒動物は、体重の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡおよびｐ＜０．００１ コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ；コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ＋ＩＬ−６治療群；ダネット検定）。
【０２０２】
Ｄ５からＤ４０までで、ＳＴＺ／ＩＬ−６治療群間で体重に有意差は見られなかった［Ｆ（５，１２５）＝１．０８およびｐ＝０．２６；反復測定ＡＮＯＶＡ］。
【０２０３】
血糖
図２３に図示したように、Ｄ１０で、コントロール動物が、約１００ｍｇ／ｄｌの血糖値を表わしたのに対し、ＳＴＺ中毒ラットは、２６０ｍｇ／ｄｌより高い血漿中グルコース濃度を示した。
【０２０４】
さらに、ＳＴＺ中毒ラットは、Ｄ４０でなお糖尿病であり、実際それらの血糖値は５００ｍｇ／ｄｌより高かった。
【０２０５】
感受性検査：テイル・フリック
テイル・フリック検査の遂行の進展では、群間に有意差があった［Ｆ（６，１２）＝２．１３およびｐ＝０．０２；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図２４）。２４日目および３８日目に、糖尿病で治療していないラットは、コントロール／ビヒクルおよびＳＴＺ／ＩＬ−６治療群と比較して、反応時間で有意な増加を示した（ｐ＜０．０５；；ダネット検定）。
【０２０６】
さらに、反応時間は、１０および３０μｇ／ｋｇの用量で、ＩＬ−６により治療した動物ではほとんど増加しなかった。
【０２０７】
ＯＦでの運動活動
図２５Ａおよび２５Ｂに示されるように、研究の間中の、区画横切りおよび立ち上がりの回数で群間に有意差があった［それぞれ、ｐ＜０．００１でＦ（５，１０）＝ およびｐ＜０．００１でＦ（５，１０）＝ ；反復測定ＡＮＯＶＡ］。２５日目と４０日目に、治療されたかまたはされていない糖尿病ラットは、区画横切りと立ち上がりの回数の有意な減少により特徴づけられた低い運動活動を示した（コントロール 対 ＳＴＺ／ビヒクルおよびコントロール 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６ ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２０８】
電気生理学的測定
複合筋肉活動電位の潜伏時間
図２６に示されるように、研究の間中、ＣＭＡＰの潜伏時間に関して群間に有意差があった［Ｆ（６，１２）＝３．９７およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。Ｄ２６およびＤ４０に、糖尿病の未治療ラットと低用量でのＩＬ−６による治療動物とにおいて潜伏時間の有意な増加が観察された（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。さらに、コントロール／ビヒクルおよびＳＴＺ／ＩＬ−６治療（１０および３０μｇ／ｋｇ）群の間に有意差は見られなかった（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０２０９】
感覚神経伝導速度
研究の間中、群間でＳＮＶＣ測定に有意差があった［Ｆ（６，１２）＝３．３８およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図１７）。Ｄ２６から、糖尿病で治療されているまたは治療されていないラットは、ＳＮＣＶの減少を示した（Ｄ２６：ｐ＜０．００１およびＤ４０：ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０２１０】
Ｄ２６に、コントロール／ビヒクルおよびＳＴＺ／ＩＬ−６治療動物は、ＳＴＺ／ビヒクルラットよりも有意に高いＳＮＣＶを示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２１１】
Ｄ４０に、高用量のＩＬ−６により治療されたラットは、ＳＴＺ／ビヒクル群よりもより重要なＳＮＣＶの値を示した。
【０２１２】
形態測定分析
線維の直径
図２８に示されるように、線維の直径における群間の有意差が注目された（ｐ＜０．０４５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。コントロール／ビヒクルラットと比較して、ＳＴＺ中毒動物は線維の直径の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。ＩＬ−６による毎日のＩＰ治療は、この線維の直径の減少を防いだ（ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６ＩＰ：ｐ＝０．０２６；ダネット検定）。
【０２１３】
軸索の直径
軸索の直径では、群間に有意差があった（ｐ＝０．０３４；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図２９）。ＳＴＺ中毒動物では、軸索の直径の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。１０μｇ／ｋｇのＩＬ−６でＩＰ経路により治療したラットは、ＳＴＺ／ビヒクル動物と有意差を示した（ｐ＜０．０４５；ダネット検定）。
【０２１４】
ミエリンの厚さ
ミエリンの厚さでは、群間に有意差が見られた（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図３０）。ＳＴＺ中毒動物は、ミエリンの厚さの有意な減少を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。ＩＬ−６による毎日のＩＰ治療は、このミエリンの厚さの減少を防いだ（ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６ＩＰ：ｐ＝０．００５；ダネット検定）。
【０２１５】
変性した線維の割合
図３１および３２に図示されるように、変性した線維の割合において群間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。この割合は、コントロール／ビヒクル群よりもＳＴＺ／ビヒクル群において有意に高かった（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。割合は、ＩＬ−６治療動物で有意に減少した（ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６：ｐ＜０．００１；ダネット検定）。
【０２１６】
研究Ｃ
動物の体重
図３３に図示されるように、体重の進展における群間の有意差が研究の間中観察された［Ｆ（５，１４５）＝１５．４６およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。Ｄ５からＤ４０までで、ＳＴＺ中毒動物は、体重の有意な減少を示した（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡおよびｐ＜０．００１ コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ；コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ−ＩＬ−６群；ダネット検定）。
【０２１７】
さらに、３０μｇ／ｋｇでＩＬ−６により治療した動物は、他のＩＬ−６治療群よりも有意にほとんど重要でない体重の減少を示した［Ｆ（４，１０４）＝２．１７およびｐ＜０．００１；反復測定ＡＮＯＶＡ］。
【０２１８】
血糖
図３４は、Ｄ１０およびＤ４０に、コントロール／ビヒクル群が、１２０ｍｇ／ｄｌより低い血糖値を表わしたことを示す。他方で、ＳＴＺ中毒ラットは、２６０ｍｇ／ｄｌより高い血漿中グルコース濃度を示し、それでそれらは、Ｄ１０およびＤ４０に糖尿病と判断された。
【０２１９】
感受性検査：テイル・フリック
研究の間中、反応時間について、群間に有意差があった［Ｆ（５，１０）＝２．３０およびｐ＝０．０２；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図３５）。ラットが、熱源からその尾部を動かすまでの潜伏時間は、ＳＴＺ／ビヒクル動物で有意に増大した（Ｄ２４およびＤ３８で、ｐ＜０．００５；反復測定ＡＮＯＶＡ）。Ｄ２４に、コントロール／ビヒクルとＳＴＺ／ＩＬ−６（３０μｇ／ｋｇ）群のあいだの反応の潜伏時間に有意差はなかった（ｐ＝０．３１；ダネット検定）。Ｄ３８に、１０および３０μｇ／ｋｇで、ＩＬ−６で治療したラットは、コントロールと同様の反応時間を示した（ｐ＝０．０３；ダネット検定）。
【０２２０】
ＯＦでの運動活動
研究の間中の、区画横切りおよび立ち上がりの回数で群間に有意差があった（それぞれ、ｐ＜ でＦ（５，１０）＝ およびｐ＝０．０２８でＦ（５，１０）＝２．１５；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図２６Ａおよび２６Ｂ）。
【０２２１】
Ｄ２５とＤ３９に、治療されたかまたはされていないＳＴＺ中毒動物は、コントロールラットよりも有意に低い運動活動を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。この差異は、記録期間中の区画横切り平均回数と、立ち上がりの回数で示された。それでもなお、３０μｇ／ｋｇの用量で、ＩＬ−６で治療された動物の群は、ＳＴＺ／ビヒクル群より大きな運動活動を表わした。
【０２２２】
電気生理学的測定
複合筋肉活動電位の潜伏時間
研究の間中、ＣＭＡＰの潜伏時間に関して群間に有意差はなかった［Ｆ（５，１０）＝１．３３およびｐ＝０．２３；反復測定ＡＮＯＶＡ］（図２７）。それにもかかわらず、群間の有意差がＤ２６およびＤ４０に観察された（ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＳＴＺ中毒ラットは、コントロール／ビヒクル群と比較して増大した潜伏時間を示した。さらに、この増大は、高用量のＩＬ−６で治療された群ではほとんど重要でなく、実際、有意差は、ＳＴＺ／ビヒクルおよびＳＴＺ／ＩＬ−６のあいだで示された（Ｄ２６に：ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６（３、１０、３０μｇ／ｋｇで）：ｐ＜０．００５、およびＤ４０に：ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６（３０μｇ／ｋｇで）：ｐ＜０．００５；ダネット検定）。
【０２２３】
感覚神経伝導速度
図３８に示されるように、研究の間中、群間で感覚神経伝導速度に有意差が示された［Ｆ（５，１０）＝２．１８およびｐ＝０．０２５；反復測定ＡＮＯＶＡ］。ＳＴＺ中毒動物で速度の有意な減少が観察された（コントロール／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ビヒクルおよびＳＴＺ／ＩＬ−６群：ｐ＜０．０５；ダネット検定）。さらに、１０および３０μｇ／ｋｇでのＩＬ−６による治療は、糖尿病動物にほとんど重要でない速度の損失を導く（Ｄ２６に、ＳＴＺ／ＩＬ−６（１０および３０μｇ／ｋｇで） 対 ＳＴＺ／ビヒクル：ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２２４】
形態測定分析
線維の直径
図３９に示されるように、線維の直径における群間の有意差が示された（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。コントロール／ビヒクルラットと比較して、ＳＴＺ中毒動物は、線維の直径の有意な減少を示した（ｐ＜０．００５；ダネット検定）。ＩＬ−６治療動物（すべての用量で）は、ＳＴＺ／ビヒクルラットより有意に大きい直径の線維を示す（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２２５】
軸索の直径
軸索の直径では、群間に有意差があった（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図４０）。ＳＴＺ中毒動物では、軸索の直径の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０１；ダネット検定）。１、３、１０および３０μｇ／ｋｇのＩＬ−６で治療したラットは、ＳＴＺ／ビヒクル動物と有意差を示した（ｐ＜０．０５；ダネット検定）。
【０２２６】
ミエリンの厚さ
ミエリンの厚さでは、群間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）（図４１）。ＳＴＺ中毒動物は、ミエリンの厚さの有意な減少を示した（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。ＩＬ−６による毎日のＳＣ治療は、このミエリンの厚さの減少を防いだ（ＳＴＺ／ビヒクル 対 ＳＴＺ／ＩＬ−６（１および３０μｇ／ｋｇ）：ｐ＝０．００５；ダネット検定）。
【０２２７】
変性した線維の割合
図４２および４３に図示されるように、機能的にミエリン化した線維の割合において群間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。この割合は、コントロール／ビヒクル群よりもＳＴＺ／ビヒクル群において有意に低かった（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。割合は、３、１０および３０μｇ／ｋｇで、ＩＬ−６により治療した動物で有意に増加した（ｐ＜０．００１；ダネット検定）。
【０２２８】
結論
この研究で、ストレプトゾトシンで中毒にされ、そして数日後に糖尿病を発生する動物が、誘導神経障害のモデルとして使用された。
【０２２９】
糖尿病動物は、３０日間、慢性的に種々の用量のＩＬ−６（１、３、１０および３０μｇ／ｋｇ）によって治療された。治療は、誘導の１０日後に開始し、ＳＴＺ誘導の４０日後の動物の犠牲死まで、毎日（研究Ａ）、週に３回（研究Ｂ）および週に１回（研究Ｃ）皮下に投与された。これらの治療は、ＩＬ−６が、長期化した高血糖症によって引起される最初の分子損傷の後に投与された点で、治療用処置と見なされ得る。
【０２３０】
本プロトコールは、どのような投与スケジュールでも、３０日間のＩＬ−６治療が、糖尿病性神経障害に対して神経保護を促すことを示す。テイル・フリックおよびＥＭＧ検査（感覚および運動速度）を用いた行動分析は、皮下経路により投与されるＩＬ−６の神経保護効果を示す。
【０２３１】
神経保護効果は、感覚線維ならびに運動線維に焦点を合せた（ＣＭＡＰ速度は、動物がＩＬ−６化合物で治療される際に変化しなかった）。化合物は、線維の、ミエリン鞘の損失および変性を予防する。
【０２３２】
毎日のＩＰ治療（Ｎｅｕｒｏｆｉｔ、２００１年８月に行われた先の研究を参照）と比較して、皮下経路により毎日投与されたＩＬ−６は、全ての試験用量で、腹腔内治療（実施例２を参照）と同様に有効であるように見える。さらに、週当たり１回または３回のＩＬ−６投与により特徴づけられる低い投与量は、化合物の神経保護効果の減少に至らない。週当たり３回の治療が、ＳＴＺ動物の全般的行動において何の副作用もなしに、最高の神経保護効果（特に、１０および３０μｇ／ｋｇで）を示すようである。
【０２３３】
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37. Zilberstein et al, EMBO J 5:2529 (1986)
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】実験動物における体重の進展を示す。
【図２】腹腔内投与を受けている一連の実験動物における、糖尿病誘導１０日（Ａ）および４０日（Ｂ）後の血糖の程度を示す。
【図３】腹腔内投与を受けている動物が、熱源に置かれた尾部を動かすのにかかった時間を秒で示す。
【図４】秒による潜伏時間で表される、腹腔内投与を受けている動物の複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を示す。
【図５】腹腔内投与を受けている実験動物における感覚神経伝導速度（ＳＮＶＣ）をｍ／ｓｅｃで示す。
【図６】腹腔内投与を受けている実験動物における軸索の直径をマイクロメートルで示す。
【図７】腹腔内投与を受けている実験動物における線維の直径をマイクロメートルで示す。
【図８】腹腔内投与を受けている実験動物におけるミエリンの厚さをマイクロメートルで示す。
【図９】腹腔内投与を受けている実験動物におけるフィールド当たりのミエリン化された線維の数を示す。
【図１０】ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ構造を示す概略図である。
【図１１】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における体重の進展を示す。
【図１２】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における、糖尿病誘導１０日および４１日後の血糖の程度を示す。
【図１３】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における、熱源に置かれた尾部を動かすのにかかった時間を秒で示す。
【図１４】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における、区画横切り（Ａ）および立ち上がり（Ｂ）の回数を示す。
【図１５】秒による潜伏時間で表わされる、皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を示す。
【図１６】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における感覚神経伝導速度（ＳＮＶＣ）をｍ／ｓｅｃで示す。
【図１７】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における線維の直径をマイクロメートルで示す。
【図１８】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における軸索の直径をマイクロメートルで示す。
【図１９】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物におけるミエリンの厚さをマイクロメートルで示す。
【図２０】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物における変性した線維の割合を示す。
【図２１】皮下投与を受けている動物のグループＡの実験動物におけるミエリン化された線維の割合を示す。
【図２２】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における体重の進展を示す。
【図２３】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における、糖尿病誘導１０日および４０日後の血糖の程度を示す。
【図２４】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における、熱源に置かれた尾部を動かすのにかかった時間を秒で示す。
【図２５】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における、区画横切り（Ａ）および立ち上がり（Ｂ）の回数を示す。
【図２６】秒による潜伏時間で表わされる、皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を示す。
【図２７】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における感覚神経伝導速度（ＳＮＶＣ）をｍ／ｓｅｃで示す。
【図２８】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における線維の直径をマイクロメートルで示す。
【図２９】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物にける軸索の直径をマイクロメートルで示す。
【図３０】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物におけるミエリンの厚さをマイクロメートルで示す。
【図３１】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物における変性した線維の割合を示す。
【図３２】皮下投与を受けている動物のグループＢの実験動物でのミエリン化された線維の割合を示す。
【図３３】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における体重の進展を示す。
【図３４】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における、糖尿病誘導１０日および４０日後の血糖の程度を示す。
【図３５】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における、熱源に置かれた尾部を動かすのにかかった時間を秒で示す。
【図３６】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における、区画横切り（Ａ）および立ち上がり（Ｂ）の回数を示す。
【図３７】秒による潜伏時間で表わされる、皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）を示す。
【図３８】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における感覚神経伝導速度（ＳＮＶＣ）をｍ／ｓｅｃで示す。
【図３９】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における線維の直径をマイクロメートルで示す。
【図４０】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物における軸索の直径をマイクロメートルで示す。
【図４１】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物におけるミエリンの厚さをマイクロメートルで示す。
【図４２】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物での変性した線維の割合を示す。
【図４３】皮下投与を受けている動物のグループＣの実験動物でのミエリン化された線維の割合を示す。

Claims (20)

1. 糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のためのｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質の使用。
2. 糖尿病性神経障害が、多発性神経障害である請求項１記載の使用。
3. 糖尿病性神経障害が、単神経障害である請求項１記載の使用。
4. 前記物質が、
   ａ）ＩＬ−６；
   ｂ）ｇｐ８０に結合し、そしてｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）の断片；
   ｃ）ａ）またはｂ）と少なくとも７０％配列同一性を示し、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；
   ｄ）中程度にストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）をコードする天然のＤＮＡ配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；または
   ｅ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の塩、融合タンパク質または機能的誘導体
   である請求項１、２または３記載の使用。
5. ＩＬ−６が、組換えＩＬ−６である請求項４記載の使用。
6. 前記物質が、
   ａ）ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ；
   ｂ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）の断片；
   ｃ）ａ）またはｂ）と少なくとも７０％配列同一性を示し、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；
   ｄ）中程度にストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）をコードするＤＮＡ配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）またはｂ）の変異体；または
   ｅ）ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を起こす、ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の塩、融合タンパク質または機能的誘導体
   である請求項１、２または３記載の使用。
7. 物質が、1つまたはそれより多くの部位でグリコシル化される請求項１、２、３、４、５または６記載の使用。
8. 物質が、グリコシル化されない請求項１、２、３、４、５、６および７記載の使用。
9. 融合タンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合体を含む請求項４、５、６、７または８記載の使用。
10. 機能的誘導体が、アミノ酸残基上の１つまたはそれより多くの側鎖として存在する１つまたはそれより多くの官能基に結合された少なくとも１つの部分を含有する請求項４、５、６、７、８または９記載の使用。
11. 部分が、ポリエチレン部分である請求項１０記載の使用。
12. ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質が、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ、または約１〜５００μｇ／ｋｇ、または約１００μｇ／ｋｇより少ない範囲にある量で使用される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載の使用。
13. ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質が、約１μｇ／ｋｇまたは約３μｇ／ｋｇまたは約１０μｇ／ｋｇまたは約３０μｇ／ｋｇの量で使用される請求項１２記載の使用。
14. ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質が、毎日投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の使用。
15. ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質が、週に３回投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の使用。
16. ｇｐ１３０を介してシグナル伝達する物質が、週に１回投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の使用。
17. 糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、細胞でのＩＬ−６の内因性生産を誘導および／または促進するためのベクターの使用。
18. 糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に定義される物質を産生するために遺伝的に改変された細胞の使用。
19. 糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に定義される物質のコーディング配列を含む発現ベクターの使用。
20. 糖尿病性神経障害を治療および／または予防する方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９に定義される物質を、任意には薬学的に許容し得る担体と一緒に投与することを含む方法。

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