FI120740B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI120740B
FI120740B FI962693A FI962693A FI120740B FI 120740 B FI120740 B FI 120740B FI 962693 A FI962693 A FI 962693A FI 962693 A FI962693 A FI 962693A FI 120740 B FI120740 B FI 120740B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
double
rna
seq
dna
sequences
Prior art date
Application number
FI962693A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI962693A (fi
FI962693A0 (fi
Inventor
Carine Giovannangeli
Claude Helene
Original Assignee
Centre Nat Rech Scient
Inst Nat Sante Rech Med
Museum Nat D Histoire Naturell
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Nat Rech Scient, Inst Nat Sante Rech Med, Museum Nat D Histoire Naturell filed Critical Centre Nat Rech Scient
Publication of FI962693A publication Critical patent/FI962693A/fi
Publication of FI962693A0 publication Critical patent/FI962693A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120740B publication Critical patent/FI120740B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C12N2310/152—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs on a single-stranded target, e.g. fold-back TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/802—Virus-based particle
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
    • Y10S977/916—Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/92—Detection of biochemical

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DMA: n 'valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää terapeutti-5 sesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi. Tarkemmin ottaen keksintö koskee menetelmää, jolla aikaansaadaan uusia vektoreita, joilla on mahdollista vaikuttaa hyvin selektiivisesti ja hyvin tehokkaasti geenien ilmentymiseen .
10 Kohdegeenien ilmentymisen säätely oligonukleoti- deilla muodostaa terapeuttisen lähestymistavan, jonka kehitys on kasvussa. Tämä lähestymistapa nojaa oligonukleotidi-en kykyyn hybridisoitua spesifisesti nukleiinihapon komplementaarisiin alueisiin ja inhiboida täten spesifisesti mää-15 rättyjen geenien ilmentyminen. Tämä inhibitio voi vaikuttaa joko translaation tasolla (antisense-oligonukleotidi) tai transkription tasolla (antigeenioligonukleotidi).
Antisense-oligonukleotidit ovat nukleiinihappose-kvenssejä, jotka kykenevät hybridised tumaan selektiivisesti 20 kohdesolun lähetti-RNA-sekvensseihin näiden translaation proteiiniksi inhiboimiseksi. Nämä oligonukleotidit muodos- • · · : ·* tavat kohde-mRNA:n kanssa paikallisesti kaksisäikeisiä alu- • · · V * eitä, jotka ovat tyyppiä RNA/mRNA tai myös DNA/mRNA, tavan- :,i,: omaisella Watson-Crick-vuorovaikutuksella. Kyseessä voivat 25 olla esimerkiksi pienikokoiset synteettiset oligonukleoti-: :*: dit, jotka ovat komplementaarisia solu-mRNA:n nähden ja • i· j**‘j jotka viedään kohdesoluihin. Tällaisia o 1 igonukleotideja on m kuvattu esimerkiksi EP-patenttijulkaisussa 92 574. Samoin kyseessä voivat olla antisense-geenit, joiden kohdesolussa • # · 30 ilmentyessä muodostuu solu-mRNA:hah nähden kömpi ament aari- • « *1* siä RNA-sekvenssejä. Tällaisia geenejä on kuvattu esimer- kiksi EP-patentti julkaisussa 140 308.
*ϊ**ί Nyttemmin on löydetty uuden tyyppisiä oligonukle- .·*·. otideja, jotka kykenevät säätelemään kohdegeenien ilmenty- • · 35 mistä. Nämä oligonukleotidit eivät hybridisoidu soivin xnRNA- • · sekvensseihin, vaan suoraan kaksisäikeiseen genomi-DNA:han.
2 Tämä uusi lähestyrnistäpä nojaa sen osoittamiseen, että tietyt oligonukleotidit kykenevät olemaan spesifisesti vuorovaikutuksessa kaksoisheeliksi-DNAm suuressa uurteessa, jolloin muodostuu paikallisesti kolmoisheeliksejä, mikä 5 johtaa kohdegeenien transkription inhibitioon, Nämä oligonukleotidit tunnistavat selektiivisesti kaksoisheeliks i-DNA:n oligopuriini-oligopyrimidiinisekvenssien tasolla, eli alueiden tasolla, joilla on oligopuriinisekvenssi yhdessä säikeessä ja oligopyrimidiinisekvenssi komplementaarisessa 10 säikeessä, ja muodostavat tällä tasolla paikallisesti kol-moisheeliksin. Kolmannen säikeen emäkset (oligonukleotidi) muodostavat vetysidoksia (Hoogsteen-sidoksia tai käänteisiä Hoogsteen-sidoksia) Watson-Crick-emäsparien puriinien kanssa. Antigeenioligonukleotidit voivat sisältää seuraavia 15 emäksiä: tymidiini (T) , joka kykenee muodostamaan triplette- jä kaksisäikeisen DNA:n Α-τ-dublettien kanssa [Rajagopal et ai., Biochem. 28 (1989) 7859); adeniini (A), joka kykenee muodostamaan triplettejä 20 kaksisäikeisen DNA:n A-T- dublettien kanssa; .. . guaniini (G), joka kykenee muodostamaan triplettejä • · · *. *’ kaksisäikeisen DNA:n G-C-dublettien kanssa; • · · *· 9 *·* * protonoitu sytosiini (C+) , joka kykenee muodosta- \i.: maan triplettejä kaksisäikeisen DNA:n G-C-dublettien kanssa * · ·.*·: 25 (Rajagopal et ai ,, supra) .
ί#ί": Antigeenioligonukleotidejä on kuvannut etenkin
Helene julkaisussa Anti-Cancer Drug Design 6 (1991) 569.
* ™
Esillä oleva keksintö kuvaa uutta lähestymistapaa kohdegeenien. ilmentymisen kontrolloimiseksi. Keksintö nojaa • · · ,···, 30 tarkemmin ottaen sen osoittamiseen, että on mahdollista • · 7 tuottaa geneettisesti in vivo terapeuttisia RNA-sekvens- • " sejä, jotka kykenevät muodostamaan kolmoisheeliksejä yk- "*“ sisäikeisten kohdenukleiinihappoj en kanssa. Edullisesti .···. keksintö nojaa terapeuttisten sellaisten RNA-s ekvens s ien • · 35 tuotantoon geneettisesti in vivo, jotka kykenevät muodosta-maan kolmoisheeliksejä ribonukleiinihappokohteiden kanssa.
3
Keksintö koskee etenkin menetelmää kaksisäikeisten DNA-sekvenssien valmistamiseksi, jotka koodattavat tällaisia terapeuttisia RNA-sekvenssejä. Se koskee samoin menetelmää ilmentämisvektoreiden, jotka ovat käyttökelpoisia 5 näiden terapeuttisten RNA-sekvenssien tuottamiseksi in vivo, etenkin geeniterapian puitteissa, valmistamiseksi.
Tarkemmin ottaen esillä oleva keksintö koskee siten menetelmää, jolla valmistetaan kaksisäikeistä DNA:ta, joka koodittaa RNA;ta, joka kykenee muodostamaan kolmoisheelik-10 sin IGF-l:tä koodaavan yksisäikeisen kohdenuklei inihapon kanssa, joka on tähteiden 40 ja 60 välillä (sekvenssinumero 16), jolle on tunnusomaista, että DNA syntetisoidaan käyttäen automaattista nukleiinihapposyntetisaattoria.
Kaksisäikeiset DNA:t koodittavat tarkemmin ottaen 15 komposiitti-RNA-sekvenssejä, jotka käsittävät vähintään: ensimmäisen alueen, joka kykenee muodostamaan kak-soisheeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon tai osan tästä kanssa; toisen alueen, joka kykenee muodostamaan kolmois-20 heeliksin näin mudostetun kaksoisheeliksin tai osan tästä kanssa; ja • · · : .* yhden tai kaksi vartta, jotka yhdistävät nämä kaksi • · · : aluetta, jolloin kumpikin alue voi olla jatkuva tai kat- : ϊ ί kaistu.
• · · 25 Keksinnön mukaisesti komposiitti-RNA:n ensimmäinen • · • alue muodostaa yksisäikeisen kohdenukleiinihapon kanssa ··· kaksoisheeliksin tavanomaisella tyypin Watson-Crick-vuoro-vaikutuksella, minkä jälkeen toinen alue muodostaa tämän ... kaksoisheeliksin tai osan siitä kanssa kolmoisheeliksin ve- i · * • · · h, 30 tysidosten välityksellä (Hoogsteen- tai käänteinen Hoogs- · '·"* teen-tyyppi) (katso kuviot 1 - 4) .
*:*·: Keksinnön mukaisesti kaksi komposiitti-RNA-aluetta ·:**: muodostavat keskenään kaksoisheeliksin Watson-Crick-tyypin yhdistymisen pareittain välityksellä, minkä jälkeen kak- • · ***, 35 soisheeliksi on vuorovaikutuksessa yksisäikeisen kohdenuk leiinihapon kanssa vetysidosten välityksellä (Hoogsteen- 4 tai käänteinen Hoogsteen-tyyppi) muodostaen täten kolmois-heeliksin (katso kuvio 5).
Yksi säikeinen kohdenukle i irxihappo voi olla RNA: taskut en esimerkiksi lähetti-RNA:ta (mRNA), siirto-RNA:ta 5 (tRNA), ribosomi-RNA:ta (rRNÄ) tai virus-RNA:ta. Samoin ky seessä voi olla yksisäikeinen DNA, joka ilmaantuu esimerkiksi kaksisäikeisen DNAm tai DNA-alueen, joka on luonnostaan paikallisesti avoin, replikaation aikana.
Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä 10 valmistettava tuote soveltuu erityisesti virusten, etenkin RNA-viruksen tai yksisäikeisen DNA-viruksen, ilmentymisen kontrolliin virussyklin eri vaiheissa. Erilaiset yksisäi-keiset nukleiinihapot voivat itse asiassa muodostaa kohteita terapeuttisille RNA-sekvensseille, joista mainittakoon 15 etenkin virus-RNA (RNA-virusten, kuten esimerkiksi retrovirus ten, polioviruksen, influenssaviruksen jne., kyseessä ollen): terapeut t i s t en RNA-sekvenssien vaikutuksella RNA:hän on mahdollista inhiboida käänteinen transkriptio, 20 eli vaikuttaa virussyklin varhaisessa vaiheessa; viraalinen tai proviraalinen (RNA-virusten kohdal- • · · ! ·’ la) DNA: terapeuttiset RNA-sekvenssit voivat vaikuttaa en- ··· V : nen viraalisen tai proviraalisen DNA:n integraatiota tartu- :.j.: tetun solun genomiin tai tämän jälkeen. Vuorovaikutus ta- 25 pahtuu DNA:n kaksoisheeliksin paikallisen avautumisen jäl- ; ;*; keen, ja näin muodostuneet kolmoisheeliksit ovat paljon ··· stabiilimpia kuin tavanomaiset kolmoisheeliksit (jolloin tähän liittyy antigeenioligonukleotidi); virus-mRNA: terapeuttisten RNA-sekvenssien vaiku- • · · "... 30 tuksella viraaliseen mRNA:han on mahdollista inhiboida vi- • · rusproteiinien translaatio ja ilmentyminen.
*"" Tarkemmin ottaen keksinnön mukaisella menetelmällä ·:**: valmistettavat RNA:t kykenevät muodostamaan kolmoisheelik- sejä yksisäikeisten kohdenukleiinihappojen kanssa alueilla, • · *", 35 jotka koostuvat edullisesti puriiniemäksistä (A ja G: alue • « 5 polyPu) , tai pyrimidiiniemäksistä (T/U ja C: alue polyPy) , tai emäksistä T/U ja G. (alue polyT/U,G) .
Täten kun kohdenukleiinihappo (tai tämän määrätty alue) koostuu oleellisesti puriiniemäksistä (polyPu), kek 5 sinnön mukaisesti valmistettava terapeuttinen RNA voi käsittää ensimmäisen alueen, joka koostuu komplementaarisista pyrimidiiniemäksistä (Watson-Crick-alue), yhdestä tai kahdesta oligonukleotidivarresta ja toisesta alueesta (Hoogs-teen-alue) , joka koostuu emäksistä U, C ja/tai G, jotka 10 ovat vuorovaikutuksessa jäljempänä mainitun parimuodostuk-sen välityksellä muodostuneen kaksoisheeliksin puriiniemäs-ten kanssa: emäkset C ja G kykenevät muodostamaan vety- sidoksia dublettien G-C guaniinin kanssa; emäs U kykenee muodostamaan vetysidoksia dublettien Ä-T tai A-U adeniinin 15 kanssa.
Tässä suoritusmuodossa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava terapeuttinen RNA muodostaa renkaan kohdenukleiinihapon tai osan tästä ympärille konfiguraation mukaan, joka esitetään kuviossa la.
20 Kun kohdenukleiinihapppo (tai tämän määrätty alue) koostuu oleellisesti pyrimidiiniemäksistä (polyPy), keksin-
I · I
• ·* nön mukaisella menetelmällä valmistettava terapeuttinen RNA
• « · : voi käsittää ensimmäisen alueen, joka koostuu kömpiementaa- risista puriiniemäksistä (Watson-Crick-alue) , yhdestä tai :\j .25 kahdesta oligonukleotidivarresta ja toisesta alueesta : (Hoogsteen-alue) , joka koostuu emäksistä U ja G tai A ja G, ··* jotka ovat Vuorovaikutuksessa jäljempänä mainitun parimuo- * dostuksen välityksellä muodostuneen kaksoisheeliks in pu-riiniemästen kanssa: emäs G kykenee muodostamaan vetysidok- • * · 30 siä (käänteinen Hoogsteen) dublettien G-C guaniinin kanssa; * * "** emäkset U ja A kykenevät muodostamaan vetysidoksia dublet- tien A-T tai A-U adeniinin kanssa.
*:**: Tässä suoritusmuodossa keksinnön mukaisesti valmis-· .···, tettava terapeuttinen RNA muodostaa kohdenukleiinihappoon • ***, 35 nähden rinnakkaisen renkaan kuviossa 2 esitetyn konfiguraa- • · tion mukaan.
6
Kun kohdenukieii nihappo (tai tämän määrätty alue) koostuu oleellisesti emäksistä T/U,C tai T/U, G, keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava terapeuttinen RNA voi käsittää ensimmäisen alueen, joka koostuu komp1ementaari-5 sista puriiniemäksistä (Watson-Crick-alue), yhdestä tai kahdesta oligonukleotidivarresta ja toisesta alueesta, joka koostuu puriiniemäksiin nähden komplementaarisista pyramidiini emäksistä {myös Watson-Crick-alue), jolloin terapeuttisen RWA:n kaksi aluetta muodostavat Watson-Crick-kaksois-10 heeliksin, jonka puriinisäie on vuorovaiktuksessa kohdenuk-leiinihapon kanssa Hoogsteen- tai käänteisten Hoogsteen-sidosten muodostumisen välityksellä.
Tässä suoritusmuodossa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava terapeuttinen RNA muodostaa kohde-15 nukleiinihappoon nähden rinnakkaisen renkaan kuviossa 5 esitetyn konfiguraation mukaan.
Huomattakoon, että valitun yksisäikeisen kohdenuk-leiinihapon koostumuksen mukaan alan taitaja voi määritellä muita keksinnön mukaisesti valmistettavia kaksisäikeisiä 20 DNA-sekvenssejä, jotka perustuvat Watson-Crick- ja Hoogs- ,, . teen- tai käänteis-Hoogsteen-dublettien parimuodostukseen.
• t t
Yksi tai useampi varsi, jotka yhdistävät keksinnön *·** mukaisesti valmistettavan terapeuttisen RNA:n kaksi aluet- * ta, ovat oligonukleotidisekvenssejä, jotka voivat käsittää • · ϊ,*** 25 minkä tahansa emäksen, joka sisältyy RNA-sekvenssi en koos- : humukseen (A, U/ G tai C) . Varsisekvenssi ei edullisesti ··« :*·*· saa olla taipuvainen itse muodostamaan paria kohdenukle- iinihapon kanssa, jotta paikallisen kolmoisheeliksin muo-dostuminen ei häiriintyisi. Tämän varren pituuden voi alan • · · .···, 30 ammattilainen sovittaa kohdenukleixnihapon funktiona.
• · *Γ Yleensä se koostuu 3-6 emäksestä, edullisesti 3-5 emäk- Φ ···· , #1 * sesta.
*
Lisäksi erityisessä suoritusmuodossa keksinnön mu- .··*, kaisesti valmistettavat kaksisäikeiset DNA: t voivat koodit- • · .]"· 35 taa komposiittiRNA-sekvenssejä, jotka käsittävät kaksi oli- • · gonukleotidivartta, jotka mahdollistavat kahden renkaan 7 muodostamisen yksisäikeisen kohdenukleiinihapon ympärille ja/tai sen rinnalle. Tällaisilla komposiitti-RNA-sekvens-seillä on erityisen edullisia ominaisuuksia: ensiksi ne tekevät mahdolliseksi muodostuneen kol-5 moisheeliksin stabii1isuuden, sekä sen terapeuttisen tehokkuuden, edelleen nostamisen edelleen merkittävämmän eteerisen kuormituksen johdosta (vrt. kuviot Ib, 1c, 3 ja 4); ne tekevät mahdolliseksi kohdentaa yksisäikeisiä nukleiinihappoja o1igopuriini- tai oligopyrimidiinialueiden 10 tasolla, joita katkaisevat vastaavasti pyrimidiini- tai pu- riiniemäkset, katkaisemalla Hoogsteen- tai käänteisen Hoog- steen-alueen {vrt. kuviot 3a ja 3b). Tällä on siten mahdollista laajentaa näiden terapeuttisten RNA-sekvenssien käyttöaluetta kaikentyyppisiin yksisäikeisiin nukleiinihappo-15 alueisiin; ne tekevät samoin mahdolliseksi kohdentaa yksisäikeisiä nukleiinihappoja, jotka koostuvat oligopuriini- ja oligopyrimidiinialueen, ja päinvastoin, ketjuuntumisesta (kuvio 4). Tämä laajentaa siis edelleen terapeuttisten RNA-20 sekvenssien käyttöaluetta.
Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kaksisäikei- ·1 nen DNA koodit taa siis komposiitti-RNA: ta, joka käsittää: ··♦ V; ensimmäisen alueen, joka kykenee muodostamaan kak- ;.·.ί soisheeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon tai osan 25 tästä kanssa; • ♦ : toisen alueen, joka kykenee muodostamaan kolmois- «·· :1j1. heeliksin näin muodostetun kaksoisheeliksin tai osan siitä m kanssa; ja .··1. kaksi vartta, jotka yhdistävät päistään nämä kaksi I.. 30 aluetta {kuviot Ib, le, 3 ja 4) .
• · • « Tässä suoritusmuodossa toinen kahdesta komposiitti-RNA-alueesta [Watson Crick (kuvio Ib), Hoogsteen (kuviot le *:**: ja 3a) tai käänteinen Hoogsteen (kuvio 3b) ] on katkaistu, ,···ψ sillä se sisältää transkription aloituskohdan.
• · ·· 8
Keksinnön seuraavassa erityisessä suoritusmuodossa kaksisäikeinen DNA koodittaa komposiitti-RNA:ta, joka käsittää; ensimmäisen alueen, joka kykenee muodostamaan kak-5 soisheeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon oligopurii- nialueen kanssa; varren; toisen alueen, joka kykenee muodostamaan kolmois-heeliksin näin muodostetun kaks o i sh ee1 iks in tai osan tästä 10 kanssa; kolmannen, ensimmäiseen liittyvän alueen, joka kykenee muodostamaan kaksoisheeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon oligopyrimidiinialueen kanssa; toisen varren; ja 15 neljännen, kolmanteen liittyvän alueen, joka kyke nee muodostamaan kolmoisheeliksin näin muodostetun kaksoisheeliksin tai osan tästä kanssa (kuviot 4).
Edullisesti keksinnön mukaisesti valmistettava kak-sisäikeisten (ja kooditettujen komposii11i-RNA-sekvenssien) 20 pituus on yli 10 emästä ja edullisemmin yli 15 emästä. Tämän pituuden alan ammattilainen sovittaa yksisäikeisen koh- ! .* denukleiinihapon pituuden funktiona täten varmistaen terä- • · · ·.· * peuttisen RNA: n s tahallisuuden, spesifisyyden ja selektii- vi syyden. Lisäksi kolmoisheeliksin s tahi i 1 isuuden paranta- 25 miseksi voi olla kiinnostavaa pidentää yhtä komposiitti- : RNA-alueista, edullisesti kaksoisheeliksin muodostavaa alu- • · · että.
• · *
Kaksisäikeinen DNA voi olla synteettinen tai puoli-synteettinen DNA. Se voidaan saada millä tahansa alan am- • · i 30 mattilaiselle tutulla tekniikalla, ja etenkin nukleiinihap *!* posyntetisaattorien avulla. Tämän DNA:n sekvenssi määrite- tään valitun solukohteen funktiona kuten edellä on mainit-:··: tu.
,···. Edullisesti keksinnön mukaisesti valmistettava kak- • · 35 sisäikeinen DNA käsittää myös signaaleja, jotka mahdollis- • · tavat keksinnön mukaisten terapeuttisten RNA-sekvenssien 9 transkription (tuotannon) kohdesoluissa. Nämä signaalit käsittävät sekvenssejä, jotka -mahdollistavat transkription aloituksen (promoottorit), ja mahdollisesti signaaleja, jotka mahdollistavat transkription päättämisen (päättäjät), 5 sekä signaaleja, jotka mahdollistavat RNA-sekvenssien sta-bilisoinnin (esimerkiksi polyA-jatke). Nämä eri signaalit voivat olla konstitutiivisia tai säädeltyjä. Etenkin kyseessä voivat olla eukaryoottisten, viraalisten geenien promoottorisekvenssit tai synteettiset promoottorit. Esi-10 merkiksi kyseessä voivat olla promoottorisekvenssit, jotka ovat peräisin tartutettavaksi halutun solun genomista. Samoin kyseessä voivat olla virusgenomista peräisin olevat promoottorisekvenssit. Tässä suhteessa voidaan mainita esimerkiksi promoottorit ElA, MLP, CMV, RSV, HIV jne. Voi olla 15 erityisen kiinnostavaa kontrolloida virusta vastaan kohdistetun terapeuttisen RNA:n tuotantoa itse tartunnalla (esimerkiksi käyttäen Hl-viruksen LTR-promoottoria, joka indusoituu spesifisesti HIV:n TAT-proteiinin läsnä ollessa). Lisäksi näitä ilmentämissekvenssejä voidaan modifioida li-20 säämällä aktivaatio-, säätely- jne. sekvenssejä. Sitä paitsi silloin, kun kaksisäikeinen DNA ei käsitä, ilmentämisse- • · · : ·* kvenssejä, se voidaan insertoida vektoriin, alavirtaan täi- ··· V : laisesta sekvenssistä. Erityisen kiinnostava ilmentämissys- teemi käsittää spesifisesti RNA-polymer aasi-III :n kontrol- :/.{ 25 loimien transkriptiopromoottorien käytön. RNA-polymeraasi- : :*; III on itse asiassa vastuussa pienten sytoplasma- tai tuma- • ·· RNA-sekvenssi en synteesistä, jotka osoittavat kohonnutta t stabiilisuutta ja jotka eivät tule käännetyiksi proteiinik-si. Näitä pieniä RNA-sekvenssejä ovat etenkin tRNA:t, • · · 30 rRNA: t tai tietyt viraaliset RNA:t, kuten etenkin adenovi- • « *" ruksen VA-RNA:t. Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan *"*i valmistettava kaksisäikeinen DNA käsittää promoottorin, *:**: jonka transkriptio tapahtuu spesifisesti RNA-polymeraasi- .1. 111:11a. Tarkemmin ottaen kaksisäikeinen DNA voidaan inser- • · • * **'. 35 toida geeniin, jonka transkriptiosta huolehtii spesifisesti • · 10 RNÄ-polymeraasi-III (FR 2 687 411) , tai fuusioida alavirtaan tällaisesta geenistä (EP 387 775).
Esillä oleva keksintö tarjoaa lukuisia etuja suhteessa aiempiin tekniikoihin geeni-ilmentymisen kontrolloi-5 miseksi. Erityisesti sellaisten RNA-sekvenssien tuotanto in vivo, jotka kykenevät muodostamaan kolmoisheeliksejä yk-sisäikeisten solunukleiinihappojen kanssa, tekee mahdolliseksi terapeuttisten molekyylien selektiivisyyden niiden solukohteiden suhteen nostamisen. Oligonukleotidien käyttö 10 terapeuttisina aineina tuottaa itse asiassa solukohteen spesifisen ja selektiivisen tunnistuksen. Täten esimerkiksi Ras:in tapauksessa onkogeenin mRNA poikkeaa proto-onko-geenin mRNA;sta vain yhden pistemutaation verran. Tässä tapauksessa on tärkeää, että oligonukleotidi inhiboi mitä te-15 hokkaimmin onkogeenin mahdollisen ilmentymisen vaikuttamatta kuitenkaan proto-onkogeenin ilmentymiseen. On siten ensiarvoisen tärkeätä antaa käyttöön voimakkaasti diskriminoivia terapeuttisia aineita. Tavanomaisten antisense-sekvenssien tapauksessa kunkin kohdesekvenssiemäksen tun-20 nistaa o1igonuk1eot idi sekvenss in yksi ainoa emäs, ja yhdel-, lä ainoalla epäkelvolla parimuodostuksella voi olla ainoas- • ·’ taan heikko vaikutus kaksoissäikeen muodostumiseen ja s ta- ··· *.* * biilisuuteen. Mutta keksinnön mukaisesti valmistettavien « terapeuttisten molekyylien kohdal la kaksois tunnistus on ! 25 välttämätön (kohdesekvenssin kunkin emäksen tunnistaa kaksi : terapeuttisen RNA:n emästä) , mikä kohottaa huomattavasti
• M
erotuskykyä.
Keksinnön puitteissa tuotettujen terapeuttisten t*;*# RNA-sekvenss ien terapeuttinen tehokkuus on niin ikään pa- • · t 30 rempi kuin tavanomaisten antisense-sekvenssien. Itse asias-*“* sa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavien terä- *·**· peuttisten molekyylien muodostama fysikaalinen kuormitus on ·:*·; suurempi kuin tavanomaisilla antisense-sekvensseillä, koska ^.1.^ ne muodostavat kohteen ympärille renkaan, mikä kykenee ai- • · ***. 35 heuttamaan käänteiskopioijaentsyymin tai DNA-pol ymeraasin toiminnan käynnistymisen ja siten mahdollistamaan vuorovai- 11 kutuksen mRNA:n translaation proteiiniksi tasolla pidennys-ribosomin, entsyymien ja/tai muiden liittyvien tekijöiden kanssa.
Lisäksi kolmoisheeliksin muodostumisen (Watson-5 Crick- ja Hoogsteen- tai käänteisiä Hoogsteen-sidoksia) johdosta keksinnön mukaisesti valmistettavat molekyylit muodostavat kohdenukleiinihappoj en kanssa stabiilimpia komplekseja kuin tavanomaiset antisense-sekvenssit. Tämä ominaisuus vahvistaa edelleen keksinnön mukaisesti valmistet·· 10 tavien, täten erityisen tehokkaita terapeuttisia aineita muodostavien molekyylien etuja.
Lopuksi keksinnön mukainen menetelmä antaa mahdollisuuden muodostaa in vivo terapeuttisia molekyylejä korkeina tasoina yhdestä ainoasta kohdesoluun viedystä kak-15 sisäikeisestä DNA:sta (tai sen sisältävästä vektorista).
Lisäksi keksinnön menetelmä mahdollistaa näiden molekyylien muodostamisen suoraan kohdesolun halutuissa soluosastoissa. Keksinnön mukaisesti valmistettavaa kaksisäikeistä DNA:ta voidaan käyttää sellaisenaan, esimerkiksi ruiskutuk-20 sen ihmiseen tai eläimeen jälkeen, tietyn geenin ilmen tyrni- M sen säätelemiseksi. Erityisesti se voidaan ruiskuttaa pal- • · f • ·* jaana DNA:na tekniikan mukaan, jota kuvataan WO-patentti- • *** V: hakemusjulkaisussa 90/11 092. Se voidaan samoin antaa kornp- ♦ leksoidussa muodossa esimerkiksi DEAE-deks traanin kanssa !/.: 25 [Pagano et ai., J. Virol. 1 (1967) 891], tumaproteiinien : kanssa [Kaneda et ai. , Science 243 (1989) 375] tai lipidien M» --- - - :*·'· kanssa [Feigner et ai., PNAS 84 (1987) 7413]. Se voidaan niin ikään sisällyttää vektoriin kuten liposomi [Fraley et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] tai nanohiukkanen.
• » · Τ--Π-- .
t*..# 30 Liposomit ovat fosfolipidirakkuloita, jotka käsittävät si- * * *" säisen vesifaasiin, johon nukleiinihapot voidaan kapseloi- da, Liposomi en synteesi ja niiden käyttö nukleiinihappojen "*" siirtämiseksi kuuluu alan tekniseen tasoon (WO 91/06 309, ,·*·. WO 92/19 752, WO 92/19 730). Nanohiukkaset ovat mitoiltaan • · 35 pieniä hiukkasia, yleensä alle 500 nm, jotka kykenevät kul- • · jettamaan tai vektorisoimaan vaikuttavan aineen (kuten nuk- 12 leiinihappo) soluihin tai verenkiertoon. Nanohiukkaset voivat koostua polymeereistä, jotka käsittävät valtaosin hajoavia rakenteita, kuten polymaitohappo, mahdollisesti ko-polymerisoituna polyetyleeniglykoliin. Muita, nanohiukkas-5 ten valmistuksessa käyttökelpoisia polymeerejä kuvataan alan teknisen tason puitteissa (katso esimerkiksi EP 275 796; EP 520 889).
Edullisesti keksinnön mukaisesti valmistettava kak-sisäikeinen DMA on osa vektoria. Käyttämällä tällaista vek-10 toria on itse asiassa mahdollista parantaa kaksisäikeisen DNA;n siirtymisen kohdesoluihin tehokkuutta, ja samoin lisätä sen stabiilisuutta mainituissa soluissa, jolloin on mahdollista saada pitkäkestoinen terapeuttinen vaikutus. Lisäksi käyttämällä vektoreita on samoin mahdollista koh-15 dentaa tiettyjä solupopulaatioita, joissa terapeuttisia molekyylejä on määrä tuottaa. Lisäksi On mahdollista viedä useampia kaksisäikeisiä DNA-sekvenssejä samaan vektoriin, mikä samoin lisää hoidon tehokkuutta.
Keksinnön seuraava kohde on siten vektorin menetel-20 mä valmistamiseksi, joka käsittää kaksisäikeistä DNA:ta, joka koodittaa RNA:ta, joka kykenee muodostamaan kolmois- * * * I ·* heeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon kanssa.
*·» V · Käytetyn vektorin alkuperä voi olla moninainen, t *.i.: kunhan se kykenee transformoimaan eläinsoluja, edullisesti 25 ihmissoluja. Kyseessä voi yhtä hyvin olla plasmidi- kuin : virusvektori, Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käyte-
»M
tään virusvektoria, joka voidaan valita adenoviruksista, retroviruksista, adenoliitteisistä viruksista (AAV), her-pes-viruksesta, sytomegaloviruksesta, lehmänrokkoviruksesta 30 jne.
• · *" Tässä suhteessa esillä oleva keksinnön mukainen me- φ **'" netelmä koskee myös mitä tahansa yhdistelmä-DNA-virusta, *:*·: joka käsittää genomxinsa insertoituna kaksisäikeistä s'·.' DNA: ta, joka koodit taa RNA: ta, joka kykenee muodostamaan * · ***. 35 kolmoisheeliksin yksisäikeisen kohdenukleiinihapon kanssa.
* · 13
Adenoviruksi s ta, retroviruksista tai AAV-viruksista saatuja vektoreita, jotka sisältävät hetero)ogisia nukle-iinihappos ekvens s e jä, on kuvattu kirjallisuudessa [Akli et ai., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et 5 ai,, Human Gene Therapy 1. (1990) 241; EP 185 573; Levrero et ai., Gene 101 (1991) 195 ; Le Gal la Salle et ai. ( Science 259 (1993) 988; Roemer ja Friedmann, Eyr. J. Biochem, 208 (1992) 211; Dobson et ai., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et ai., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et 10 ai., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18 088) .
Edullisesti keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava yhdxstelmä-DNA-virus on vajavainen virus. Ilmaisulla "vajavainen virus" tarkoitetaan virusta, joka ei kykene replikoitumaan kohdesolussa. yleensä esillä olevan 15 keksinnön piirissä käytettyjen vajavaisten virusten genomi on siten vailla ainakin mainitun viruksen replikaatiolle tartutetussa solussa välttämättömiä sekvenssejä. Nämä alueet on voitu joko eliminoida (kokonaisuudessaan tai osittain) tai niistä on voitu tehdä ei-funktionaalisia tai ne 20 on voitu korvata muilla sekvensseillä ja etenkin keksinnön mukaisen kaks i s ä :i ke i s en nukleiinihapon sekvenssillä, Edul- • · · I ·* lisesti vajavaisella viruksella on kuitenkin tallella geno- ··· V· minsa ne sekvenssit, jotka ovat välttämättömät viruspartik- kelien kapseloinnille.
• · * 1 » t 25 Keksinnössä nukleixnxhapposekvenssejä käytetään erx- : tyisen edullisesti vajavaiseen yhdi s t e Iina - DNA-adenovi ruk- *·· .*·*. seen sisällytetyssä muodossa.
On itse asiassa olemassa adenovi rus t en erilaisia ,·», serotyyppejä, joiden rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat.
• · · 30 jonkin verran, mutta jotka eivät ole ihmiselle patogeeni- * · T siä, eivätkä etenkään kohteille, joiden immuunijärjestelmä ei ole heikentynyt. Sitä paitsi nämä virukset eivät integ- * *ί**ί roxdu tartuttamiensa solujen genomiin, ja ne voivat sxsäl- .···, tää suuria eksogeenisen DNA:n fragmentteja. Eri serotyy • · ***. 35 peistä esillä olevan keksinnön piirissä käytetään edul 1 i- • · sesti tyypin 2 tai 5 adenoviruksia (Ad2 tai Ad5) . Adenovi- 14 ruksen Ad5 kohdalla replikaatiolle välttämättömät sekvenssit ovat alueet E1A ja E1B. Kuten edellä mainittiin, aivan erityisen edullisesti käytetään vajavaista yhdistelmä-DNA-adenovirusta, joka käsittää keksinnön mukaista kaksisäi-5 keistä DNA:ta insertoituna VA-geeniin.
Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistettavien kak-sisäikeisten DNAsekvensslen pieni koko tekee mahdolliseksi edullisesti sisällyttää samanaikaisesti samaan vektoriin useampia näitä DNA-sekvenssejä, jotka ovat identtisiä (koh-10 distuvat vastaan samaa kohdenukleiinihappoa) tai erilaisia (kohdistuvat vastaan eri kohdenukleiinihappoja). Keksinnön erityinen suoritusmuoto koostuu siten vektorista, etenkin viraalisesta, joka käsittää vähintään kaksi kaksisäikeistä edellä määritellyn mukaista DNA:ta.
15 Keksinnön mukaisesti vajavaiset yhdistelmä-DNA- virukset voidaan valmistaa homologisella DNA-yhdistymisellä vajavaisen viruksen ja plasmidin välillä, joka käsittää muun muassa edellä määritellyn mukaisen kaksisäikeisen DNA:n [Levrero et ai., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBQ J. 20 3:12 (1984) 2917]. Homologinen DNA-yhdistyminen tapahtuu „ , mainittujen viruksen ja plasmidin kotransfektoinnin sopi- • · 9 • ·* vaan solulinjaan jälkeen. Käytetyn solulinjan on edullises- V * ti (i) oltava transformoitavissa mainituilla rakenteilla, ja (ii) käsitettävä sekvenssejä, jotka kykenevät täydentä- • · i/.j 25 mään vajavaisen viruksen genomiosan, edullisesti integ- j roidussa muodossa DNA-yhdis tyrni s vaarojen välttämiseksi.
• M
Esimerkkinä solui in j as ta, joka on käyttökelpoinen vajavais- ten yhdistelmä-DNA-adenovirusten tai yhdistelmä-DNA-AAV- ,···, virusten valmistamiseksi, voidaan mainita ihmisalkion munu- • · · 30 aissolulinja 293 [Graham et ai., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59], joka sisältää etenkin genomiinsa integroituneena adenoviruksen Ad5 genomin vasemmanpuoleisen osan (12 %) . ·:*·: Esimerkkinä solulinjasta, joka on käyttökelpoinen vajavais- ten yhdistelmä-DNA-retrovirusten valmistamiseksi, voidaan • · *’*. 35 mainita solulinja CRIP [Danos ja Mulligan, fnaS 85 (1988) t···· “*—- ---- 6460].
.15
Sitten monistuneet virukset otetaan talteen ja puhdistetaan molekyylibiologian tavanomaisilla tekniikoilla.
Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havain-5 npllistaviksi eikä rajoittaviksi.
Yleiset kloonaustekniikat
Molekyylibiologiassa tavanomaisesti käytetyt menetelmät, kuten plasmidi-DNA:n preparatiiviset uutot, plasmi-d.i-DNA:n sentrifugointi seesiumkloridigradienttia käyttäen, 10 elektroforeesi agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä, DNA- fragmenttien puhdistaminen elektroeluutiolla, proteiinien uutot fenolilla tai fenoli-kloroformilla, DNA:n seostaminen suolaympäristössä etanolilla tai isopropano1i11a, transfor-mointi Escherichia coliin jne., ovat alan ammattilaiselle 15 tuttuja ja niitä kuvataan runsaasti kirjallisuudessa [Ma- niatis, T., et ai., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F.M., et al. (toim.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 2D 1987] .
Tyypin pBR322, pUC, pSP65 plasmidit ja sarjan Ml3 • · · ' ·* fagit ovat kaupallista alkuperää (Bethesda Research Labora· ··· V * tories, Promega) .
·.·,· Ligatointeja varten DNA-fragmentit voidaan erottaa 25 kokonsa perusteella elektroforeesilla agaroosi- tai akryy- : :*j liamidigeeleissä, uuttaa fenoliliuoksella tai fenoli/klo- ··· roformi-seoksella ja saastaa etanolilla, minkä jälkeen nii-tä voidaan inkuboida T4-fagin DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan suosituksia noudattaen.
« · · 30 ES iin työntyvien 5'-päiden täyttäminen voidaan suo- • · *" rittaa käyttäen colin DNA-polymeraasi-I:n Klenow-frag- menttia (Biolabs) toimittajan spesifikaatioiden mukaan.
*:**! Esiintyöntyvät; 3 ' -päät tuhotaan T4-fagin DNA -polymer aas in ,···, (Biolabs) läsnä ollessa, jota käytetään valmistajan suosi- * · 35 tuksia noudattaen. Esiintyöntyvät 5'-päät tuhotaan käsitte- 1emällä rajoitetusti Sl-nukleaasilla.
16
Kohdennettu mutagenisointi in vitro synteettisillä oiigodeoksinukleotidei1lä voidaan suorittaa Taylorin et ai. kehittämän menetelmän mukaan [Nucl. Acids Res, 13 (1985) 8749 - 8764] käyttäen Amershamin markkinoimaa pakkausta.
5 DNA-fragmenttien entsymaattinen monistaminen PCRrksi kutsutulla tekniikalla [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R.K., et ai., Science 230 (1985) 1350 - 1354; Mull is, K.B., ja Faloona, F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350] voidaan suorittaa käyttämällä DNA Thermal 10 Cycler -laitetta (Perkin Elmer Cetus) valmistajan spesifikaatioita noudattaen.
Nukleotidisekvensseistä varmistuminen voidaan suorittaa Sangerin et ai. kehittämällä menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467] käyttäen 15 Amershamin markkinoimaa pakkausta.
Esimerkit Esimerkki 1
Kaksisäikeisen DNA:n synteesi, joka koodittaa koi- moisheeliksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan HI- 20 viruksen polypuri inidomeenin sekvenssiä ,, , Tässä esimerkissä kuvataan erilaisten kaksisäikeis- • · « • ·* ten DNA-sekvenssien synteesiä, jotka koodittavat kolmois- ^•·· *.* * heeliksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan sek- venssiä, joka esiintyy kahteen kertaan Hl-viruksen genomis- • · 25 sa (BRUCG). Tämä sekvenssi sijaitsee tähdeväleissä 4369 -; 4382 ja 8662 - 8677. Tämä sekvenssi, jota kutsutaan polypu-
• M
riinidomeeniksi tai PPT:ksi, esittää oleellista osaa DNA:n +-säikeen synteesin käynnistyksessä. Kolmoisheeliksin rauo-dostumisen tämän alueen tasolla tulisi tuottaa polyme- • · · 30 raasiaktiivisuuden erityisen tehokas inhibitio, ja siten • * T estää proviraalisen DNA:n tuotanto,
Hl-viruksen polypuriinidomeenialue käsittää 16 pu- *:··: riiniemästä, joiden sekvenssi esitetään sekvenssinä tunnus- .···. nro 1 (SEQ ID n° 1) .
• * 35 Syntetisoitiin erilaisia kaksisäikeisiä DNA-sek- • · venssejä, jotka koodittavat keksinnön mukaisia kolmoishee- 17 liksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan tätä kohdetta. Synteesi suoritettiin automaattisen nukleotidisyrite tisaattorin avulla käyttäen fosforamidiittikemiaa tekniikan mukaan, jota kuvaavat Giovannangeli et ai, [J. Am, Chem.
5 Soc. 113 (1991) 7775], Nämä DNA-sekvenssit esitetään seu naavalla sivulla.
Kohde-ίΦΤ *>1 -ΓΌλΟΤΤΤΤΤ AAAARAAAAGGSGSGA CTGG-3 ' SEOIDn°l__8662_8677_ ks-DNA 2. alue Varsi 1. alue __3'
SEQ ID n- 2 TTTTCTTTTCCCCCCT ttttt TCCCCCCTTTTCTTTTAA
SEQ ID n° 3 TTTTCTTTTCCCCCCT TTTT tccccccxtttcttttaa
SEQ ID n° A TTTTCTTTTCCCCCCT TTT GTCCCCCCTTTTCTTTTAA
SEQ ID n° 5 TTTCCCCCCT TCT GTCCCCCCTTTT
SEQ ID n® 6 TTTGGGGGGT TCT GTCCCCCCTTTT
SEQ ID n" 7 TTTTCTTTTCCCCCCT TCT GTCCCCCCTTTTCTTTT
SEQ ID nc 8 TTTTCTTTTGGGGGGT TCT GTCCCCCCTTTTCTTTT
Esimerkki 2 10 Kaksisäikeisen DNA:n synteesi, joka koodittaa kol- moisheeliksi-RNA-Sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan Hl-viruksen gag-geenlä *· « * Tässä esimerkissä kuvataan erilaisten kaksisäikeis-··· : ten DNA* sekvenssi en synteesiä, jotka koocäittavat kolxnois- : 15 heeliksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan Hl-vi- *·· ruksen gag-geeniä alueiden tasolla, jotka ovat yhtäältä • · . .·, tähdevälissä 324 - 336 (sekvenssi tunnusnro 9) ja toisaalta » « · ,···, tähdevälissä 404 - 419 (sekvenssi tunnusnro 12) . Gag-geeni • · « koodittaa Hl-viruksen rakenneproteiineja (MApl7, CAp24 ja ... 20 NCpl5) , ja on siten oleellinen viruspartikkelien kapseloin- • · ♦ *·* * nalle ja tuotannolle.
• · *·.·' Tässä identifioidut HI-viruksen gag-geenin kaksi • ' ·;··· aluetta käsittävät vastaavasti 13 ja 16 puriiniemästä.
Syntetisoitiin erilaisia kaksisäikeisiä DNA-sek-25 venssejä, jotka koodattavat keksinnön mukaisia kolmoishee- • · *···* liksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat vastaan näitä koh- ·*·· * * teitä. Synteesi suoritettiin automaattisen nukleotidisynte- tisaattorin avulla käyttäen fosforamidiittikemiaa tekniikan 18 mukaan, jota kuvaavat Giovannangeli et ai. [J. Am. Chem,
Soc. 113 (1991) 7775] . Nämä dna-sekvenssit esitetään seu-rasvassa taulukossa.
Kohde-GAG S'-GCT ÄGMGfiMASAGA TGGO-3* SEP IP n° 9__ 324_336 _ ks-DNA 2. alue Varsi 1. alue 5’_____3*
SEQ ID n"10 TCTTCCTCTCTCT TATT TCTCTCTCCTTCTTTT
SEQ ID n° il TGTTGGTGTGTGT TATT TCTCTCTCCTTCTTTT_
Kohde-GAG 5' -GCC AGGGGGAAAGAAAAAA TAT-3’ SEQ ID n° 12__40i_4J9_ 5EQ ID fl*13 tccccctttctttttt ctgc ttttttctttccccctttt
SEQ ID n°14 TCCCCCTTTCTTT CTCC TTTCTTTCCCCCTTTT
SEQ ID n°15 1TGGGGGTTTGTTT CTCC TTTCTTTCCCCCTTTT_ 5
Esimerkki 3 HIVin tartutussyklxn inhibitio keksinnön mukaisilla käiksisäikeisi 1 lä DNA-sekvensseillä
Esimerkeissä 1 ja 2 kuvattujen keksinnön mukaisten 10 kaksisäikeisten DNA-sekvenssien funktionaalisuus osoitet - tiin eri tyyppisillä kokeilla, ja etenkin fysikokemiai1i-silla tutkimuksilla, transkriptio-, käänteistranskriptio- • · · j *.* tai translaatiokokeilla in vitro ja mittaamalla vaikutus • · · ϊ,ϊ : viruksen replikaatioon.
: 15 3.1. Kohdenukleiinihapon ja keksinnön mukaisen te- • t* ·'·.· rapeuttisen RNA:n vuorovaikutuksen fysikokemiallisella tut- • · . .*. kimuksella on mahdollista saada muodostuneen kompleksin • · · * • ·· termodynaamiset ja kineettiset ominaispiirteet. Tässä tar- « · * koituksessa edellä syntetisoituja kaksisäikeisiä DNA- ... 20 sekvenssejä tai terapeuttisia RNA- sekvens s e j ä inkuboidaan • * * kohdenukleiinihapon läsnä ollesa, minkä jälkeen tässä reak- • · **"* tiossa muodostunutta kompleksia analysoidaan absorptio- ·:*·; spektroskopisesti sekä geeliretardaatiokokeilla. Nämä eri ·;··: tutkimukset osoittavat, miten kukin terapeuttinen RNA kyke- 25 nee olemaan vuorovaikutuksessa vastaavan kohteensa kanssa.
» · **\ 3.2. Mitataan terapeuttisen RNA:n vaikutus kohdese- kvenssin sisältävän, promoottorin (SP6, T7 tai T3) kontrolliin sijoitetun geenin transkriptioon, translaatioon ja 19 käänteiseen transkriptioon. Näillä kokeilla in vitro on mahdollista mitata suoraan keksinnön mukaisten RNA-sekvenssien vaikutus virussyklin kuhunkin vaiheeseen. Tarkemmin ottaen edellä kuvattuja kaksisäikeisiä DNA-sekvenssejä 5 tai niiden koodittamia kompos i i 11 i - RNA-s ekvens s e j ä. inkuboi-daan reaktioympäristössä, joka käsittää eri aineosat ja entsyymit, jotka ovat välttämättömät transkriptiolle ja/ tai translaatiolle, joko plasmidin läsnä ollessa, joka käsittää HI-viruksen integraasigeenin (joka sisältää sekvens-10 s in tunnusnro 1) SP6-promoottorin kontrollissa (DNA-sekvensseille tunnusnrot 2-8) tai plasmidin läsnä ollessa, joka käsittää osan HI-viruksen gag-geenistä (joka sisältää sekvenssit tunnusnrot 9 ja 12) T7-promoottorin kontrollissa (DNA-sekvensseille tunnusnrot 10 - 11 ja 13 ~ 15). Nämä ko-15 keet mahdollistavat keksinnön mukaisten terapeuttisten RNA-sekvenssien vaikutuksen geenien int ja gag transkription seuraamisen vastaavasti RNA-polymeraaseilla SP6 ja T7, sekä vaikutuksen vastaavien proteiinien tuotantoon (eli RNA:n translaatioon) seuraamisen.
20 3.3« Mitataan in vivo HI-viruksen replikaatiotaso ·. . keksinnön mukaisten kaksisäikeisten DNA-sekvenssien läsnä • · · .......
• · *..* ollessa tai puuttuessa. Tätä varten esimerkiksi keksinnön • * · **/ mukaisia kaksisäikeisiä DNA-sekvenssejä viedään T-lymfo- • · *·:·| syyttiviljelmään, ja ilmennetään koodit etu t RNA: t (stabii- *. *: 25 listi tai tilapäisesti) . Sitten lymfosyytteihin tartutetaan HI-virus, ja viruksen replikaatiotaso arvioidaan p24-anti- ··· V: geenin määrityksellä.
Esimerkki 4
Kaksi säikeisen DNA: n synteesi, joka koodittaa koi- • .···. 30 moi sheel iksi-RN&- sekvensse j ä, jotka kohdistuvat vastaan **( IGF-X (insuliinin kaltainen kasvutekijä I) -geeniä * * Tässä esimerkissä kuvataan erilaisten kaksisäikeis- ·*" ten DNA-sekvenssien synteesiä, jotka koodittavat kolmois- .1. heeliksi-RNA-sekvenssejä, jotka kohdistuvat IGF-1-geeniä ·*· 35 vastaan alueen tasolla, joka käsittää tähteet 40 - 62 (sek- • · venssi tunnusnro 16) .
20 Tämä edellä identifioitu IGF-I-qeenialue käsittää 23 puriinieemästä, ja sijaitsee geenin 5'-osassa, jonka transkriptio suoritetaan mutta translaatiota ei.
Syntetisoitiin erilaisia kaksisäikeisiä DNA-sek-5 venssejä, jotka koodattavat keksinnön mukaisia, tätä kohdetta vastaan kohdistuvia kolmoisheeliksi RNA-sekvenssejä. Synteesi suoritettiin automaattisen nukleotidisyntetisaat-torin avulla käyttäen fosforamidiittikemiaa tekniikan mukaan, jota kuvaavat Giovannangeli et ai. [J, Am, Chem, Soc. 10 113 (1991) 7775]. Nämä DNA-sekvenssit esitetään seuraavassa taulukossa.
Kohde IGF-l 5'- AQMGASggftGftgAS&SRG&ftSS ..--3* SEQ ID n” 16 40_ 62__ ks-DNA 2, alue Varsi 2. alue _5* _ 3'
SEQ ID n" 1? iTCTTCTCCC (TC) uTTCG TCCG CCTT(CT) «;CCCTCTTCT
·· · • · ·
• I
• · ··· • · · • · · • · e • · · ··· « · • · · * · · • · * * · • · · ·«· *·· • · · • · * ··· • · · • * · 1 • · • · • * « * · • ·#· • ♦ • t «e· 21
Sekvenssiluettelo Π) INFORMATION GENERALE:
Ci) DEPDSAWT:
(A) MOM: CNRS
(B) HUE: 3, rue Michel Ange
(C) VILLE; PARIS
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75016 (i) DEPOSANT:
(A) MOM: INSERM
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(E) pays: France (F) CODE POSTAL: 75S54 (1) DEPOSANT:
(A) MOM: MNHN
(B) RUE: 57, rue Cuvier (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: France <P) CODE POSTAL: 75005 fi±) TITRE DE L’ INVENTION: Cent role de 1'expression de genes.
(ill) NOMBRE DE SEQUENCES: 17 ilv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR; (A) TYPE DE BUPPQRT: Tape (85 ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEHE D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
CD) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB) I·.1, (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 : • · • · (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: *.1 1 (A) LONGUEUR: 29 paires de bases . ,·, (B) TYPE: acide nuclSique M.1 (G) NOMBRE DE BRINS: simple : (D) CONFIGURATION: llnfiaire . /. (H> TXPB OB MOLECOIiE; AWc * · · • t1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 ; * · · CCACTTTTTA AAAGAAAAGG GGGGACTGG 29 ,.;.t (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: * · (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR; 39 paires da bases • (B) TYPE: acide nuclSigus CO NOMBRE DE BRINS: double * 1 (D) CONFIGURATION; Unfair® (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc :1“· (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: #·· « 22 1TTTCTTTTC CCCCCTTTTT TTCCCCCCTT TTCTTTT&A 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 38 paires de bases (B) ΤΥΡΕ: acide nucleigue (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linSaire (li) ΤΥΡΕ DE MOLECULE: ADNc (1i) DESCRIPTION DB LA SEQUENCE: SEQ ID NO; 3: TTTTCTTTTC CCCCCTTTTT TCCCCCCTTT TCTTTTAA 38 (3) INFORMATION POUR LA SBQ ID MO: 4: U) CARACTERISTIQUBS DE LA SEQUENCE; (A) LONGUEUR: 38 paires de bases (B) TYPE: acide nuclSique (O NOMBRE DE BRINS: double (DJ CONFIGURATION: llnöaire (Uj TYPE DE MOLECULE: ADNc (xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TTTTCTTTTC CCCCCTTTTG TCCCCCCTTT TCTTTTAA 38 (21 INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTBRISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nuclöique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linSaire ·· · • · ·
Ui) TYPE DB MOLECULE: ADNc • · t *** ' (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TTTCCCCCCT TCTGTCCCCC CTTTT 25 * 1 • · · • 1 · (21 INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: • · · • · · “1 (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: I ! (A) LONGUEUR: 25 paires de bases * (BJ TYPE: acide nuclSique (C> NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linSaire « · ·
Ui) TYPE DE MOLECULE: ADNc • · *'"1 (xi). DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: ·:·1: TTTGGGGGGT TCTGTCCCCC CTTTT 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: ·♦· • · • · ·1· ! 23 (i) CARACTERJBTIQUE5 DE 1A SEQUENCE; (A) LONGUEUR: 36 paires de bases (B) TYPE: aeide nucleique (C) WOHBRE DE BRINS: double (D) configuration: lingsire
Mi) TYPE DE MOLECULE: ADNc
Mi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TTTTcriTTC cccccttctc tccccccttt TCTTTT 36 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: fi) CARACTER3STIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3fi paires de bases (B) TYPE: aeide ntfölSigue (C) NOMBRE DE BRINS: double (DJ CONFIGURATION: lingaire (II) TYPE DE MOLECULE: ADNe (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: TTTTCTTTTG GGGGGTTCfC TCCCCCCTTT TCTTTT 36 <2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: M) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: acide nuclgigue (C) NOMBRE DE BRINS: double It» CONFIGURATION: lineal re
Mi) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: • · * • · · Ϊ .* GCTAGAAC.GA GAGAGATGGG 20 *·« • · · • · t (2) information pour la seq id no: 10: • · · • Φ * !*'. Ml CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: • *·! (A) LONGUEUR: 33 palres de bases .* (B) TYPE: acide'nucliigue ::: tc) sombre de srins: double !!! (D) CONFIGURATION: lingaire • · * • * * * (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ... Mi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: • · · *.* * TCTTCCTCTC TCTTATTTCT CTCTCCTTCT TTT 33 ··· ... ....
• · • · ··· * . (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID MO: II: ] U) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: ·;··· (A) LONGUEUR: 33 paires de bases {S) TYPE: acids nucliigue .I. {O NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: Unia ire • • · 24 (ϋ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (3(i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: t T: TGTTGGTGTG TGTTATTTCT CTCTCCTTCT TTT 33 {2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTER2STIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: abide nuclAique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linesIre (ii) TVPE DE MOLECULE: ADNc (X.l) DESCRIPTION DB LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: GCCAGGGGGA ΛΛΟΛΛΛΛΑΛΤ AT 22 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (S) TYPE: acids nucl4ique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linealre (ii) TVPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE Lft SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TCCCCCTTTC TTTTTTCTCC TTTTTTCTTT CCCCCTTTT 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO; 14: IV. (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: ί .* (A) LONGUEUR: 33 paires de bases ,*ϊ*. (B) TYPE: acide nucleigue *.* * (C) NOMBRE DE BRINS: double . .*. (D) CONFIGURATION: linealre *·· * (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc • >· <xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID MO: 14: • · · ;·· TCCCCCTTTC TTTCTCCTTT CTTTCCCCCT TTT 33 ft * * • · · * (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: V * (A) LONGUEUR: 33 paired de bases .**·. (0) TYPE: acide nuclfiique (C) NOMBRE DE BRINS: double • , (D) CONFIGURATION: liniaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (Ki) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ IP NO: 15; ··· • · · • « 2 5 TGGGGGTTTG tttctccttt CTTTCCCCCT TTT 33 (,2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 palres de bases |B) TYPE: acide nuclSAque (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: AlnSalre (AA) type de Molecule: adnc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: AGAAGAGGGA GAGAGAGAGA AGG 23 (2> INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17: (A) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE; (A) LONGUEUR: 50 paires de bases (B) TYPE: acide rmclSigue CC) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (AA) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xA) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: TCTTCTCCCT CTCTCTCTCT TCCTCCGCCT TCTCTCTCTC TCCCTCTTCT 50 M · • · · * · • * »·· • · · • · » * • · · • · * ··· • · • · * * *· « * 9 • · · • · · ··« ··· • t * • · · ·#«
• * I
• · « 9 • · · * · • · »•9 * · *···· • * ·♦* • · * · »·· *···» • 4

Claims (6)

26
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksi-säikeisen DNA:n valmistamiseksi, joka DNA koodittaa RNArta, 5 joka kykenee muodostamaan kolmoisheeliksin IGF-1:tä koodaa-van yksisäikeisen kohdenukleiinihapon alueen, joka on tähteiden 40 ja 62 välillä (sekvenssinumero 16} kanssa, tunnettu siitä, että DNA syntetisoidaan käyttäen automaattista nukleiinihapposyntetisaattoria. 10
2, Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kaksisaikeinen DNA koodittaa koirtpo-siitti-RNA:ta, joka käsittää sekvenssin nro 17.
3. Menetelmä ilmentämisvektorin valmistamiseksi, jossa vektoriin insertoidaan jommankumman edeltävän patentti- 15 vaatimuksen mukaisella menetelmällä valmistettavaa kaksi- säikeistä DNA:ta.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseessä on yhdistelmä-DNA-virus.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun- 20 nettu siitä, että virus valitaan adenoviruksista, retro- .. . viruksista, adenoliitteisistä viruksista, herpes-viruksesta, • · · \t·' sytomegaloviruksesta ja lehmänrokkoviruksesta.
• « · *·* * 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, t tunnettu siitä, että kyseessä on vajavainen virus. * * • · * • M • * • · · • · · Ml ··· * · · « « « • M * · « • It *·* • · • * ··· • I • · ··· : : ··» i • · 27
FI962693A 1993-12-29 1996-06-28 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi FI120740B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9315798 1993-12-29
FR9315798A FR2714383B1 (fr) 1993-12-29 1993-12-29 Contrôle de l'expression de gènes.
FR9401536 1994-12-27
PCT/FR1994/001536 WO1995018223A1 (fr) 1993-12-29 1994-12-27 Controle de l'expression de genes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI962693A FI962693A (fi) 1996-06-28
FI962693A0 FI962693A0 (fi) 1996-06-28
FI120740B true FI120740B (fi) 2010-02-15

Family

ID=9454520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI962693A FI120740B (fi) 1993-12-29 1996-06-28 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6133024A (fi)
EP (2) EP0737248B1 (fi)
JP (1) JPH09507387A (fi)
AT (1) ATE378405T1 (fi)
AU (1) AU1388495A (fi)
CA (1) CA2180032C (fi)
DE (1) DE69435043T2 (fi)
DK (1) DK0737248T3 (fi)
ES (1) ES2297830T3 (fi)
FI (1) FI120740B (fi)
FR (1) FR2714383B1 (fi)
IL (1) IL112195A (fi)
NO (1) NO962707L (fi)
PT (1) PT737248E (fi)
WO (1) WO1995018223A1 (fi)
ZA (1) ZA9410367B (fi)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
NZ547283A (en) 1998-03-20 2008-06-30 Commw Scient Ind Res Org Control of gene expression
US6525185B1 (en) 1998-05-07 2003-02-25 Affymetrix, Inc. Polymorphisms associated with hypertension
JPH11335269A (ja) 1998-05-19 1999-12-07 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc 遺伝子関連医薬の経口投与固形製剤
EP1147204A1 (en) * 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1229134A3 (en) * 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
FR2822476B1 (fr) 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
US20050075298A1 (en) * 2002-01-31 2005-04-07 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa
US20040043003A1 (en) * 2002-01-31 2004-03-04 Wei Chen Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions
US20040009937A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
EP1572902B1 (en) 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20040014956A1 (en) 2002-02-01 2004-01-22 Sequitur, Inc. Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
CA2825894C (en) 2011-02-02 2021-11-30 Amgen Inc. Prognosis of cancer using a circulating biomarker
AU2012335541B2 (en) 2011-11-11 2017-07-06 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
WO2017129763A1 (en) 2016-01-28 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of signet ring cell gastric cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
WO1993012230A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 Sri International Triple-helix formation at (punpyn).(punpyn) tracts
FR2687411A1 (fr) * 1992-02-13 1993-08-20 Nice Sophia Antipolis Universi Vecteur comportant un gene viral transcrit par l'arn polymerase iii, et procede de production intracellulaire d'arn.
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09507387A (ja) 1997-07-29
FI962693A (fi) 1996-06-28
FI962693A0 (fi) 1996-06-28
IL112195A (en) 2004-08-31
US6133024A (en) 2000-10-17
FR2714383B1 (fr) 1996-02-09
NO962707D0 (no) 1996-06-26
EP0737248A1 (fr) 1996-10-16
EP0737248B1 (fr) 2007-11-14
DK0737248T3 (da) 2008-03-25
ZA9410367B (en) 1995-09-20
DE69435043T2 (de) 2008-09-04
ES2297830T3 (es) 2008-05-01
AU1388495A (en) 1995-07-17
NO962707L (no) 1996-06-26
FR2714383A1 (fr) 1995-06-30
EP1939290A3 (fr) 2011-07-06
CA2180032A1 (fr) 1995-07-06
PT737248E (pt) 2008-02-25
WO1995018223A1 (fr) 1995-07-06
EP1939290A2 (fr) 2008-07-02
IL112195A0 (en) 1995-03-15
CA2180032C (fr) 2010-08-10
DE69435043D1 (de) 2007-12-27
ATE378405T1 (de) 2007-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120740B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi
US5567604A (en) Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
US5168053A (en) Cleavage of targeted RNA by RNAase P
EP0638121B1 (en) Targeted cleavage of rna using eukaryotic ribonuclease p and external guide sequence
US5426180A (en) Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
US5629413A (en) Oligonucleotides with activity against human immunodeficiency virus
Tounekti et al. Effect of dimerization on the conformation of the encapsidation Psi domain of Moloney murine leukemia virus RNA
US5176996A (en) Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5869248A (en) Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences
JP4330797B2 (ja) Ｃｃｒ５受容体の発現を阻害することが可能なリボザイム
JP2001518292A (ja) エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸触媒
JP2009100782A (ja) 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物
WO2003091432A1 (en) Circular dumbbell decoy oligodeoxynucleotides (cdodn) containing dna bindings sites of transcription
Wagner et al. Dimerization of the 3′ UTR of bicoid mRNA involves a two-step mechanism
Sakuragi et al. Human immunodeficiency virus type 1 RNA outside the primary encapsidation and dimer linkage region affects RNA dimer stability in vivo
CN116615546A (zh) 自靶向性表达载体
WO2022018269A1 (en) Combinatorial inhibition of mirnas for treatment of heart failure
US6015676A (en) Method for knocking out gene transcripts by covalently binding of an anti-sense probe
WO1996029097A1 (en) Stem-loop and circular oligonucleotides
JP6506270B2 (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物
US7148044B1 (en) Nucleic acid enzyme for RNA cleavage
EP4185693A1 (en) Combinatorial inhibition of transcription factors for treatment of heart failure
Stankov Antisense antiviral agents: about the optimal approach
Kessler A block of transcription elongation; a mechanism that regulated gene expression in animal viruses
Ly Retroviral genomic RNA dimerization: Structural and functional characterizations

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120740

Country of ref document: FI

MA Patent expired