JPH09507387A

JPH09507387A - 遺伝子発現の制御

Info

Publication number: JPH09507387A
Application number: JP7517818A
Authority: JP
Inventors: ジオバナンジエリ，カリーヌ; エレーヌ，クロード
Original assignee: サントル・ナシヨナル・ド・ラ・ルシエルシユ・シヤンテイフイク; アンステイテユ・ナシヨナル・ド・ラ・サンテ・エ・ド・ラ・ルシエルシユ・メデイカル; ミユゼオム・ナシヨナル・デイストワール・ナテユレル
Priority date: 1993-12-29
Filing date: 1994-12-27
Publication date: 1997-07-29
Also published as: CA2180032C; IL112195A; WO1995018223A1; NO962707D0; DE69435043T2; PT737248E; EP1939290A2; ATE378405T1; FI962693A0; AU1388495A; EP1939290A3; CA2180032A1; ES2297830T3; IL112195A0; DE69435043D1; ZA9410367B; DK0737248T3; US6133024A; FI120740B; FI962693A

Abstract

(57)【要約】本発明は新規ベクター、それを含む医薬組成物およびその治療における使用に関する。より詳細には本発明は、一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成するＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ分子に関する。該分子は遺伝子の発現に大変選択的かつ効率的に作用する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子発現の制御本発明は新規ベクター、それを含む医薬組成物および治療におけるその使用に関する。より詳細には本発明は、遺伝子の発現に高度に選択的かつ大変効率的に作用することができる新規ベクターに関する。オリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の制御は、益々発展している治療的方法を構成する。この方法は、オリゴヌクレオチドが核酸の相補的領域に特異的にハイブリダイズすることで、所定の遺伝子の発現を特異的に阻害する能力に基づく。この阻害は翻訳レベル（アンチ−方向のオリゴヌクレオチド）または転写レベル（アンチ−遺伝子オリゴヌクレオチド）のいずれかで妨害することができる。アンチ−方向のオリゴヌクレオチドは、標的細胞メッセンジャーＲＮＡと選択的にハイブリダイズして、それらがタンパク質に翻訳されることを阻害できる核酸配列である。標的ｍＲＮＡとこれらのオリゴヌクレオチドは、従来のワトソン −クリック型の相互作用により、ＲＮＡ／ｍＲＮＡ、またはＤＮＡ／ｍＲＮＡ型でさえも局所的に二本鎖領域を形成する。これは例えば、細胞ｍＲＮＡに相補的な標的細胞に導入された小−サイズの合成オリゴヌクレオチドが関与しうる。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば欧州特許出願公開第92 574号明細書に記載された。これにはまた、標的細胞中の発現が細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡを生成するアンチ−方向の遺伝子が関与することもできる。そのような遺伝子は例えば、欧州特許出願公開第140 308号明細書に記載された。さらに最近では、標的遺伝子の発現を制御できる新しい種類のオリゴヌクレオチドが示された。これらのオリゴヌクレオチドは細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズしないが、二本鎖としてゲノムＤＮＡと直接ハイブリダイズする。この新たな方法は、ＤＮＡダブルヘリックスの主溝中で特異的に相互反応してトリプルヘリックスを局所的に形成し、標的遺伝子の転写阻害をもたらすことのできる一定のオリゴヌクレオチドがある、という実証に基づく。これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡダブルヘリックスをオリゴプリン．オリゴピリミジン配列で選択的に認識し、すなわち１つの鎖上にオリゴプリン配列および相補的鎖上にオリゴピリミジンを有する領域を認識し、そしてそこで局所的にトリプルヘリックスを形成する。第３鎖の塩基（オリゴヌクレオチド）は、ワトソン−クリック塩基対のプリンと水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合）を形成する。抗−遺伝子オリゴヌクレオチドは以下の塩基を含むことができる：−チミジン（Ｔ）、これは二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットとトリプレットを形成できる(Rajagopalら、Biochem.28(1989)7859)； −アデニン（Ａ）、これは二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットとトリプレットを形成できる； −グアニン（Ｇ）、これは二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットとトリプレットを形成できる； −プロトン化シトシン（Ｃ+）、これは二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットとトリプレットを形成できる(Rajagopalら、同上)。アンチ−遺伝子オリゴヌクレオチドは特にHeleneにより、Anti-Cancer drugde sign 6（1991）569に記載された。本発明は標的遺伝子の発現を制御するための新たな方法を記載する。これはより詳細には、一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できる治療用ＲＮＡをインビボで遺伝的に生成することができる、ということが示されたことにある。好ましくはリボ核酸標的とトリプルヘリックスを形成できる治療用ＲＮＡのインビボにおける遺伝産物による。特に本発明は、そのような治療用ＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ配列に関する。また、遺伝子治療との関係で、このような治療用ＲＮＡのインビボ生成のために有用なベクターに関する。また、これらの二本鎖ＤＮＡまたはこれらのベクターを含む医薬組成物に関する。本発明の別の観点は、上記のようなベクターによる標的細胞の形質転換により、細胞遺伝子の発現を制御する方法にある。したがってさらに詳細には、本発明は一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡに関する。本発明の二本鎖ＤＮＡは、より詳細には少なくとも −標的一本鎖核酸またはその部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックス、またはその部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム、これは各領域を連続的、または断続的にすることができる、を含む混成ＲＮＡをコードする。本発明の第一の特定の態様では、複合ＲＮＡの第一領域は、ワトソン−クリック型の従来の相互作用により標的一本鎖核酸とダブルヘリックスを形成し、そして次に第二領域が水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）によりこのダブルヘリックスと、またはその部分とトリプルヘリックスを形成する（図１−４を参照にされたい）。本発明の別の特定の態様では、本発明の複合ＲＮＡの２つの領域が、ワトソン −クリック型のカップリングにより、それらの間でダブルヘリックスを形成し、そしてこのダブルヘリックスが水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）により標的一本鎖核酸と相互作用し、このようにトリプルヘリックスを形成する（図５を参照にされたい）。一本鎖標的化核酸は、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはウイルスＲＮＡのようなＲＮＡであることができる。同等に、一本鎖ＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡの複製中に、または自然に開いている局所的なＤＮＡ領域に現れるものであってもよい。本発明は、ウイルス、特にＲＮＡまたはＤＮＡを一本鎖として含むウイルスの発現を、ウイルス周期の様々な段階で制御することに適する。様々な一本鎖核酸が、実際、本発明の治療用ＲＮＡの標的、具体的には、−ウイルスＲＮＡ（例えばレトロウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス等のような、ＲＮＡを含むウイルスの場合）を構成することができる。本発明の治療用ＲＮＡの前記ＲＮＡに対する作用は、逆転写を阻害することを可能とし、すなわちウイルス周期の初期段階で作用し； −プロウイルス（ＲＮＡを含むウイルスの場合）またはウイルスＤＮＡに対して作用する。本発明の治療用ＲＮＡは、ウイルスまたはプロウイルスＤＮＡが感染細胞のゲノムに取り込まれる前、または後に作用できる。この相互作用は、ＤＮＡダブルヘリックスが部分的に開いた後起こり、そして形成されたトリプルヘリックスは従来のトリプルヘリックスよりもさらに一層安定である（アンチ−遺伝子オリゴヌクレオチドが関与する）； −ウイルスｍＲＮＡ。本発明の治療用ＲＮＡのウイルスｍＲＮＡに対する作用は、ウイルスタンパク質の翻訳および発現を阻害できるようにする。さらに詳細には、本発明のＲＮＡは、好ましくはプリン塩基(ＡおよびＧ：pol yPu領域)またはピリミジン塩基(Ｔ／ＵおよびＣ：polyPy領域)あるいはＴ／ＵおよびＧ塩基(polyT/U、G領域)から成る、領域中の標的とする一本鎖核酸とトリプルヘリックスを形成することができる。したがって、標的とされた核酸（またはその特定の領域）は、実質的にプリン塩基(polyPu)から成り、本発明の治療用ＲＮＡは相補的なピリミジン塩基（ワトソン−クリック領域）、１つまたは２つのオリゴヌクレオチドアーム、ならびに塩基Ｕ、Ｃおよび／またはＧから成る第二領域（フーグスティーン領域）を含むことができ、これは以下に述べる対合に従い形成されたダブルヘリックスのプリン塩基と相互作用する；塩基ＣおよびＧはＧ．Ｃダブレットのグアニジンと水素結合を形成でき；塩基ＵはＡ．ＴまたはＡ．Ｕダブレットのアデニンと水素結合を形成できる。この態様では、本発明の治療用ＲＮＡは、標的核酸またはその一部分の周囲に、第１ａ図に表す配置に従いループを形成する。標的核酸（またはその特定の領域）が、本質的にピリミジン塩基(polyPy)から成る時、本発明の治療用ＲＮＡは相補的プリン塩基（ワトソン−クリック領域）、１つまたは２つのオリゴヌクレオチドアーム、および塩基ＵおよびＧまたはＡおよびＧから成る第二領域（フーグスティーン領域）を含むことができ、これは以下に述べる対合に従い形成されたダブルヘリックスのプリン塩基と相互作用する；塩基ＧはＧ．Ｃダブレットのグアニンと水素結合（逆フーグスティーン）と形成することができ；塩基ＵおよびＡはＡ．ＴまたはＡ．Ｕダブレットのアデニンと水素結合を形成できる。この態様では、本発明の治療用ＲＮＡは第２図に表す配置に従い、標的核酸に平行するループを形成する。標的核酸（またはその特定の領域）が実質的に塩基Ｔ／Ｕ、ＣまたはＴ／Ｕ、Ｇから成るとき、本発明の治療用ＲＮＡは相補的なプリン塩基から成る第一領域（ワトソン−クリック領域）、１つまたは２つのオリゴヌクレオチドアーム、およびプリン塩基の相補的なピリミジン塩基から成る第二領域（ワトソン−クリック領域も）を含むことができ、治療用ＲＮＡの第二領域は、プリン鎖が標的核酸とフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合を形成することにより相互作用するワトソン−クリックダブルヘリックスを形成する。この態様では、本発明の治療用ＲＮＡは第５図に表す配置に従い、標的核酸に平行するループを形成する。選択した一本鎖標的核酸組成に依存して、当業者は本発明の他の二本鎖ＤＮＡ配列を定めることができ、これはワトソン−クリックダブレットおよびフーグスティーンまたは逆フーグスティーンの対合に基づくと考えられる。本発明の治療用ＲＮＡの２つの領域を連結するアーム（１つまたは複数）は、ＲＮＡを構成する任意の塩基（Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）を含むことができるオリゴヌクレオチド配列である。このアームの配列は、好ましくは局所的なトリプルヘリックスの形成を不安定化にしないように、それ自体では標的核酸と対合できてはならない。このアームの長さは、標的とする核酸の関数として、当業者により調整されることができる。これは一般的に、３から６塩基の間、好ましくは３から５塩基の間を含んで成る。さらに特定の態様では、本発明の二本鎖ＤＮＡは、一本鎖標的核酸の周囲に、および／または平行して２つのループの形成を可能にする、２つのオリゴヌクレオチドアームを含む複合ＲＮＡをコードすることができる。そのような複合ＲＮＡは特に有利な特性を有する： −まず最初に、複合ＲＮＡは一層大きな立体障害により、形成したトリプルヘリックスの安定性、ならびにその治療効果をさらに増加させることができる（図１ｂ、１ｃ、３および４を参照にされたい）； −複合ＲＮＡは、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン領域を中断することにより、ピリミジンまたはプリン塩基でそれぞれ中断されたオリゴプリンまたはオリゴピリミジン中の一本鎖核酸を標的化できるようにする（図３ａおよび３ｂを参照にされたい）。したがってこれは、任意の種類の一本鎖核酸の領域に対するこれら治療用ＲＮＡの応用範囲を広くすることができる； −また複合ＲＮＡは、オリゴプリン領域およびオリゴピリミジン領域を連結する鎖から成る一本鎖核酸を標的とすることを可能とし、そしてその逆も可能である（第４図）。したがってこのことはまた、本発明の治療用ＲＮＡの応用範囲を広くする。本発明の特定の態様では、二本鎖ＤＮＡはしたがって、 −標的とする一本鎖核酸またはその部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその部分と、トリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域をその末端で連結するアーム（図１ｂ、１ｃ、３および４）を含む複合ＲＮＡをコードする。この態様では、複合ＲＮＡ（ワトソン−クリック（図１ｂ）、フーグスティーン（図１ｃおよび３ａ）または逆フーグスティーン（図３ｂ）の２つの領域の１つが、転写の開始部位を含むために中断されている。本発明の別の特別な態様では、二本鎖ＤＮＡは −標的一本鎖核酸のオリゴプリン領域とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −アーム、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、 −標的とする一本鎖核酸のオリゴピリミジン領域とダブルヘリックスを形成できる、第一に連結された第三領域、 −第二アーム、および −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる、第三に連結した第四領域、を含む複合ＲＮＡをコードする（図４）。本発明の二本鎖ＤＮＡ（およびコードする混成ＲＮＡ）は、好ましくは１０塩基より大きい、より好ましくは１５塩基より大きい長さを有する。この長さは治療用ＲＮＡの安定性、特異性および選択性を確実とするために、一本鎖標的核酸の長さの関数として当業者により調整される。さらにトリプルヘリックスの安定性を向上するために、複合ＲＮＡをの領域の１つ、好ましくはダブルヘリックスを形成する領域を長くすることが有利かもしれない。二本鎖ＤＮＡは、合成または半合成ＤＮＡであってよい。これは当業者により周知な任意の技術により得ることができ、そして特に核酸合成機により得ることができる。このＤＮＡの配列は、上記のように選択した細胞標的の関数として定める。有利なことには、本発明の二本鎖ＤＮＡは、標的細胞中で本発明の治療用ＲＮＡの転写（生産）を可能にするシグナルも含む。これらのシグナルはＲＮＡの転写を開始する(プロモーター)ことを可能にする、そして場合によっては転写の停止(ターミネーター)を可能にする、ならびにＲＮＡの安定化を可能にする（例えばpolyA 尾）配列を含む。これらの様々なシグナルは、構成されたものであるか、または制御されることができる。特に、これらのシグナルは真核またはウイルス遺伝子のプロモーターの(promotive)配列あるいは合成プロモーターであってよい。例えば、それらは感染させようとする細胞のゲノムから派生するプロモーターの配列を含むことができる。同様に、それらはウイルスのゲノムから派生するプロモーターの配列を含むことができる。これとの関連で、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＨＩＶプロモーター等を挙げることができる。感染自体で、ウイルスに対する治療用ＲＮＡの生産を制御することが特に有利でありうる（例えば、ＨＩＶウイルスのＬＴＲプロモーターを使用することにより、ＨＩＶＴＡＴタンパク質の存在下で特異的に誘導する）。さらに、これらの発現配列は、活性化または調節配列等を付加することによりモディファイされることができる。さらに、二本鎖ＤＮＡがいかなる発現配列も含まないとき、そのＤＮＡをベクター中に、発現配列の下流で挿入できる。特に有利な発現系は、ＲＮＡポリメラーゼ IIIにより特異的に制御される転写プロモーターの使用から成る。ＲＮＡポリメラーゼIIIは、実際、高い安定性を示し、そしてタンパク質に翻訳されない小細胞質または核ＲＮＡの合成の原因である。これらの小さいＲＮＡは特にｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはとくにアデノウイルスのＶＡＲＮＡのような幾つかのウイルスＲＮＡである。本発明の有利な態様によれば、二本鎖ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼIIIにより特異的に転写されるプロモーターを含む。より詳細には、二本鎖ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼIIIにより特異的に転写される遺伝子（仏国特許出願公開第2,687,411号明細書）に挿入されるか、またはそのような遺伝子の下流に融合される(欧州特許出願公開第387 775号明細書)。本発明はこれまでの遺伝子発現の制御法と比較して、多くの利点を提供する。特に、一本鎖細胞核酸とトリプルヘリックスを形成できる本発明のＲＮＡのインビボ生成は、治療用分子の細胞標的に関する選択性を増大させることができる。治療用薬剤としてのオリゴヌクレオチドの使用には、実際、細胞標的の特異的かつ選択的認識が必要である。したがって、クローズ−クロッピング(close-cropp ing)の場合には、発癌遺伝子のｍＲＮＡは癌原遺伝子のｍＲＮＡとは点突然変異だけが異なる。この場合には、オリゴヌクレオチドは発癌遺伝子の発現を出来る限り効率的に、しかし癌原遺伝子の発現には影響を与えずに阻害すべきである、ことが重要である。それゆえに、自由に使用できる高度に識別可能な治療薬を有することが重大である。従来のアンチ方向の場合には、標的配列の各塩基はオリゴヌクレオチド配列の１塩基により認識され、そして１つの誤対合は二重鎖の形成および安定性にわずかな影響を与えることができるだけである。しかし、本発明の治療用分子の場合には、二重の認識が必要であり（標的配列中の各塩基が治療用ＲＮＡの２塩基により認識される）、そしてこれは識別力を大きく増大させる。本発明の範囲で生成される治療用ＲＮＡは、従来のアンチ−方向よりもより良い治療効果も有する。従来の場合は標的の周りにループを形成し、これが逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼをカップリングできないようにするものであるが、実際、本発明の治療用分子により生成される物理的障害は、従来のアンチ−方向の場合よりは大きく、したがってｍＲＮＡのタンパク質への翻訳、伸長におけるリボソームに関与する酵素および／または他の因子に相互作用することができる。さらに、トリプルヘリックスの形成により（ワトソン−クリックおよびフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合）、本発明の分子は従来のアンチ−方向のものよりも、標的とした核酸とのより安定な複合体を形成する。この性質は本発明の分子の利点をさらに強化し、それゆえに特に強力な治療薬を構成する。最後に、本発明の治療用分子をインビボで生じる可能性により、これらの治療用分子を標的細胞中に導入された単一の二本鎖ＤＮＡ（またはそれを含むベクター）から開始して、高レベルで生成することが可能となる。さらに、これらの分子を標的細胞の所望の細胞区画で、直接生成することを可能にする。本発明の二本鎖ＤＮＡは、例えばヒトまたは動物に注射された後、所定の遺伝子の発現を制御するように使用できる。特に、国際公開第90/11092号明細書に記載されている技術を使用して、裸のＤＮＡの状態で注射することができる。また例えば、DEAE-デキストラン(Paganoら、J.Virol.1(19 67)891)と、核タンパク質(Kanedaら、Science 243（1989）375)と、または脂質( Felgnerら、PNAS 84（1987）7413)との複合状態で投与されてもよい。またリポソーム(Fraleyら、J.Biol.Chem.255（1980）10431)またはナノパーティクルのような媒介物中に包含されることもできる。リポソームは、中に核酸をカプセル化することができる内部水性相を含むリン脂質液胞である。核酸を移転させるためのリポソームの合成およびその使用は、従来技術で公知である（国際公開第91/0 6309号、第91/19752号、第92/19730号明細書）。ナノパーティクルは小さなサイズの粒子であり、一般的に500nmよりも小さく、有効成分（核酸のような）を細胞中または血液循環中に運搬または移動させることができる。ナノパーティクルは、場合によってはポリエチレングリコールと共重合したポリ乳酸のような分解性単位の部分を含むポリマーから成ることができる。ナノパーティクルの生成に有用な他のポリマーは、従来技術に記載されている(例えば、欧州特許出願公開第275 796号;同520 889号明細書を参照にされたい)。本発明の二本鎖ＤＮＡは、好ましくはベクターの一部を形成する。そのようなベクターの使用は、実際、二本鎖ＤＮＡの標的細胞への転移効率を向上させ、そしてまた該細胞中でのその安定性を増大させることを可能とし、ならびに持続性の治療効果を得ることを可能にする。さらに、ベクターの使用は中で治療用分子が生成されるべき幾つかの細胞群を標的とすることを可能にする。さらに、多数の二本鎖ＤＮＡを同じベクター中に導入することが可能であり、そしてこれは治療効果を増大させる。したがって本発明の別の主題は、標的とする一本鎖核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡを含むベクターに関する。使用するベクターは、動物細胞を形質転換することができる限り様々な起源であってよく、好ましくはヒトの細胞である。同等にプラスミドまたはウイルスベクターを含むこともできる。本発明の好適な態様では、ウイルスベクターが使用され、これはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス等から選択できる。これと関連して、本発明の別の主題は、標的とする一本鎖核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡをゲノム中に挿入されたものを含む、任意の組換えウイルスである。ヘテロロガスな核酸配列を取り込んだアデノウイルス、レトロウイルスまたはＡＡＶから派生したベクターは、文献に記載されている[Akliら、Nature Geneti cs 3(1993)224;Sreatford-Perricaudetら、Human Gene Therapy１（1990）241; 欧州特許出願公開第185 573号明細書、Levreroら、Gene 101(1991)195;Le Gal l a Salleら、Science 259（1993）988;RoemerおよびFriedmann,Eur.J.Biochem.20 8(1992)211;Dobsonら、Neuron５（1990）353;Chioccaら、New Biol.2(1990)739; ミヤノハラら、New Biol.4(1992)238;国際公開91/18088]。有利には、本発明の組換えウイルスは欠陥ウイルスである。“欠陥ウイルス” という用語は、標的細胞中で複製できないウイルスを言う。したがって一般的に、本発明の範囲中で使用される欠陥ウイルスのゲノムは、感染細胞中で少なくとも該ウイルスの複製に必要な配列が欠けている。これらの領域は除去される（完全に、または部分的に）か、あるいは非機能的にされるか、あるいは他の配列、そして本発明の二本鎖核酸配列により特異的に置き換えられることができる。これにもかかわらず欠陥ウイルスは好ましくはそのゲノム中にウイルス粒子の包膜化に必要な配列を保存している。本発明の核酸配列を欠陥組換えアデノウイルスに組込んだ状態で使用することが特に有利である。実際、構造および特性がかなり変化した様々なアデノウイルス血清型が存在するが、これらはヒト、そして特に非免疫抑制個体に対して病原性ではない。さらに、これらのウイルスは感染した細胞のゲノムに組み込まれるようにはならず、そして外因ＤＮＡの巨大な断片を組み込むことができる。様々な血清型の中でも、２または５型アデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）が、本発明の範囲に好ましい。Ａｄ５アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域である。上記に示したように、ＶＡ遺伝子に挿入された本発明の二本鎖ＤＮＡを含む欠陥組換えアデノウイルスを使用することが特に有利である。さらに、本発明の小さなサイズの二本鎖ＤＮＡは、有利なことには同時に同じベクター中に多くのこれらＤＮＡ（これらは同一（同じ標的核酸に対する）または異なる（異なる標的核酸に対する））を取り込むことを可能にする。したがって本発明の特定の態様では、ベクター、特に少なくとも２つの上記二本鎖ＤＮＡを含むウイルスのベクターから成る。本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスととりわけ上記に定義したような二本鎖ＤＮＡを持つプラスミドとの間の相同組換えにより調製できる（Levrer oら、Gene 101(1991)195;Graham EMBO J.3(12)(1984) 2917)。相同組換えは、該ウイルスおよびプラスミドを適当な細胞株中に同時−トランスフェクションした後に起こる。使用する細胞株は組換えの危険性を回避するように、好ましくは組換え状態で（ｉ）該要素により形質転換されるべきであり、そして（ii）欠陥ウイルスのゲノムの部分を相補できる配列を含むべきである。欠陥組換えアデノウイルスまたは組換えＡＡＶの調製に使用できる株の例として、特にそのゲノム中にAd5アデノウイルスのゲノムの左部を組み込んだ(12％)ヒト胚腎臓系293（Grahamら、J.Gen.Virol.36(1977)59）を挙げることができる。欠陥組換えレトロウイルスの調製に使用できる株の例として、ＣＲＩＰ株を挙げることができる（DanosおよびMulligan,PNAS 85(1988)6460）。次に再生したウイルスを従来の分子生物学的技術により回収し、そして精製する。本発明のもう一つの主題は、上記に定義したような少なくとも１つのベクターまたは二本鎖ＤＮＡを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、目内またはたの経路による投与を行うために配合できる。好ましくは医薬組成物は、注射することができる配合物のために医薬的に許容できるキャリアーを含む。これらは特に滅菌された、および／または等張の塩溶液（リン酸１ナトリウムまたは２ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等、あるいはそのような塩の混合物）、あるいは乾燥、特に凍結乾燥した組成物であってよく、これらは状況に応じて滅菌水または生理塩溶液の添加に際して、注射溶液を構成できる。投与に使用されるＤＮＡ（またはベクター）の投与量は、様々なパラメーター、そして特に使用する投与様式、関連する病因、発現する核酸、あるいは所望する治療期間に従い調整できる。一般的に本発明の組換えウイルスに関して、これらは10⁴−10¹⁴pfu/ml、好ましくは10⁶−10¹⁰pfu/mlの投与量の状態で配合され、そして投与される。pfuという用語（“plaque forming unit:プラーク形成単位”)は、ウイルス溶液の感染力に相当し、そして適当な細胞カルチャーを感染させ、そして一般的に48時間後に感染細胞の面積を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu含量を決定するための技術は文献に詳細に記載されている。そのような医薬組成物は遺伝子の異常な発現（細胞遺伝子の過剰発現、突然変異した遺伝子の発現等）、またはウイルス性疾患（ＨＩＶ）ヘルペス、肝炎等）から生じる疾患を治療および／または予防するために、ヒトに使用することができる。本発明の別の主題は、特定の細胞中での遺伝子発現を制御する方法であり、該細胞中への上記に定義したような二本鎖ＤＮＡを導入することを含む。このＤＮＡはそれ自体で、あるいは上記のようにベクター中に取り込まれた後、投与されることができる。本発明のこの方法は細胞療法との関連で、生物から取り出され、そして再投与される前に特定の細胞群中での遺伝子のex vivo発現をモディファイするために特に使用できる。これには発現レベルが問題の病因においてモディファイされる遺伝子（例えば発癌遺伝子、ウイルス遺伝子）、あるいは発現レベルは影響を受けないが、該病因の発生に参加する遺伝子（レギュレーター遺伝子、ＧＡＰまたはＧＲＦ遺伝子等）を含むことができる。本発明の別の主題は、遺伝子発現をインビボで制御する方法であり、上記定義の医薬組成物を投与することを含む。さらに本発明の主題は、異常な遺伝子発現から生じる疾患の治療法であり、それは該遺伝子の発現をモディファイできるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡを含む上記に定義したような医薬組成物の投与を含む。本発明は以下の説明をするものであって制限するものではない実施例により、より完全に説明されている。一般的なクローニング技法プラスミドＤＮＡの調製的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール−クロロホルム抽出、塩媒質中でのＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌の形質転換等の分子生物学で従来から使用されている方法は、当業者は周知であり、文献に豊富に記載されている［Maniatisら、“モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル:Molecular Cloning,a Laboratory Manual”コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハーバー、N.Y.,1982;Ausubel F.M.ら、（編集）、“分子生物学の最新の方法：Curren t Protocols in Molecular Biology”、ジョンウィリーアンドサン(John Wil ey & Sons)、ニューヨーク、1987］。 pBR322、pUCおよびpSP65型のプラスミドならびにM13シリーズのファージは、市販されているものである（ベセスダリサーチラボラトリーズ：Bethesda Resea rch Laboratories、プロメガ）。ライゲーションのために、ＤＮＡ断片をその大きさに従いアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファージT4のDNAリガーゼ(バイオラボズ:Biolabs)の存在下で、供給元の推薦に従いインキューベーションすることができる。 5'突出末端のファィリングは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片( バイオラボズ)で、供給元の仕様に従い行うことができる。3'突出末端の破壊は、ファージT4 DNAポリメラーゼ(バイオラボズ)の存在下で、製造元の推薦に従い行う。5'突出末端の破壊は、S1ヌクレアーゼで制御された処理により行う。合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロ部位特異的突然変異誘発法は、Taylorらにより開発された方法[Nucleic Acids Res.13(1985)8749-8764]に従い、アマシャム(Amersham)により販売されているキットを使用して行うことができる。ＤＮＡ断片の酵素的増幅、いわゆるＰＣＲ法[Polymerase-catalysed Chain Re action：ポリメラーゼ−触媒連鎖反応、Saiki R.K.ら、Science 230(1985)1350- 1354；Mullis K.B.およびFaloona F.A.，Meth.Enzym.155(1987)335-350]法は、 “ＤＮＡサーマルサイクラー”(パーキンエルマーシータス：Perkin Elmer Cetu s)を使用して、製造元の仕様に従い行うことができる。ヌクレオチド配列の確認はSangerらにより開発された方法[Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,74(1977)5463-5467]により、アマシャムが市販しているキットを使用して行うことができる。実施例実施例１：ＨＩＶウイルスのポリプリントラクト(Tract)配列に対するトリプル- ヘリックスＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡの合成。この実施例では、ＨＩＶウイルスのゲノム中に２回存在する配列に対するトリプル−ヘリックスＲＮＡをコードする様々な二本鎖ＤＮＡの合成を記載する（ＢＲＵＣＧ）。この配列は残基４３６９−４３８２および８６６２−８６７７の間に位置する。ポリプリン域またはＰＰＴとして知られるこの配列は、ＤＮＡの＋鎖の合成の開始に必須な役割を果たす。この領域中のトリプルヘリックスの形成は、ポリメラーゼ活性の特に効率的な阻害を生じ、したがってプロウイルスＤＮＡの生成を妨害するはずである。ＨＩＶウイルスのポリプリントラクト領域は、１６個のプリン塩基を含み、その配列を配列番号１に表す。この標的に対する本発明のトリプル−ヘリックスＲＮＡをコードする様々な二本鎖ＤＮＡが合成された。合成は全自動核酸合成機により行い、Giovannangeli ら、(J.Am.Chem.Soc.113(1991)7775)により記載された方法に従い、ホスホルアミダイト化学を採用した。これらＤＮＡの配列を以下の表に示す。実施例２：ＨＩＶウイスルのｇａｇ遺伝子に対するトリプル−ヘリックスＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡの合成。この実施例は、ＨＩＶウイスルのｇａｇ遺伝子（この領域中に１つを残基３２４と３３６との間（配列番号９）に、そしてもう１つを残基４０４と４１９との間（配列番号１２）に含む）に対するトリプル−ヘリックスＲＮＡをコードする、様々な二本鎖ＤＮＡの合成を記載する。ｇａｇ遺伝子はＨＩＶウイスルの構造タンパク質をコードし（MAp17、CAp24およびNCp15）、したがってウイルス粒子の包膜化および生産に必須である。上記のように同定されるＨＩＶウイルスのｇａｇ遺伝子の２つの領域は、それぞれ１３個および１６個のプリン塩基を含む。これら標的に対するトリプル−ヘリックスＲＮＡをコードする、本発明の様々な二本鎖ＤＮＡが合成された。合成は全自動核酸合成機により、Giovannangeli ら、(J.Am.Chem.Soc.113(1991)7775)により記載された方法に従い、ホスホルアミダイト化学を採用した。これらのＤＮＡ配列を以下の表に表す。実施例３：本発明の二本鎖ＤＮＡによるＨＩＶの感染周期の阻害実施例１および２に記載した、本発明の二本鎖ＤＮＡの機能性を、様々な実験により、そして特に物理化学的研究により、転写、逆転写または翻訳のインビトロ実験により、ならびにウイルスの複製に対する効果を測定することにより実証する。３．１．標的核酸と本発明の治療用ＲＮＡとの間の相互作用の物理化学的実験は、形成された複合体の熱力学的および動力学的特徴を得ることを可能とする。このために、上記のように合成された二本鎖ＤＮＡまたは治療用ＲＮＡを、標的核酸の存在下でインキューベーションし、そして次にこの反応で生じる複合体を吸光度分析により、およびゲルでの減速度実験により分析する。これらの様々な研究は、各治療用ＲＮＡがどのようにそれぞれの標的と相互作用できるかを表す。３．２．標的配列を含む遺伝子の転写、翻訳、および逆転写に対する、プロモーター（ＳＰ６、Ｔ７またはＴ３）の制御下におかれた治療用ＲＮＡの効果の測定。これらのイン−ビトロ実験では、ウイルス周期の各段階に対する本発明のＲＮＡの効果を直接測定することを可能にする。より正確には、上記の二本鎖ＤＮＡまたはそれらがコードする複合ＲＮＡは、転写および／または翻訳に必要な成分および酵素を、プロモーターＳＰ６（配列番号２−８のＤＮＡ用に）の制御下にＨＩＶウイルス（これは配列番号１の配列を含む）のインテグラーゼの遺伝子を含むプラスミドの存在下で、あるいはプロモーターＴ７（配列番号１０−１１および１３−１５のＤＮＡ用に）の制御下にＨＩＶウイルス（これは配列番号９および１２の配列を含む）のｇａｇ遺伝子の一部を含むプラスミドの存在下のいずれかで含む反応培地中でインキューベーションされる。これらの実験は、ポリメラーゼＲＮＡＳＰ６およびＴ７による、ｉｎｔおよびｇａｇ遺伝子それぞれの転写に対する、ならびに対応するタンパク質生産（すなわち、ＲＮＡの翻訳）に対する本発明の治療用ＲＮＡの効果を追跡することを可能にする。３．３．本発明の二本鎖ＤＮＡの存在または不在下での、ＨＩＶウイルスの複製速度のイン−ビボ測定。これを目的として、例えば本発明の二本鎖ＤＮＡを成長しているＴリンパ球に導入し、そしてコードされたＲＮＡを発現させる（安定な、または一時的な様式で）。リンパ球を次にＨＩＶウイルスで感染させ、そしてウイルスの複製速度を、抗原ｐ２４を測定することにより評価する。実施例４：ＩＧＦ−Ｉ（インスリン−様増殖因子Ｉ）遺伝子に対するトリプルヘリックスＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡの合成。この実施例は、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子（残基４０と６２の間に含まれる領域中：配列番号１６）に対するトリプルヘリックスＲＮＡをコードする様々な二本鎖ＤＮＡの合成を記載する。上記のように同定された、このＩＧＦ−Ｉ遺伝子の領域は２３個のプリン塩基を含み、遺伝子の転写された、しかし翻訳されていない５’部に位置する。標的に対する、本発明のトリプルヘリックスＲＮＡをコードする様々な二本鎖ＤＮＡを合成した。合成は全自動核酸合成機により行われ、Giovannangeliら、( J.Am.Chem.Soc.113(1991)7775)により記載された方法に従い、ホスホルアミダイト化学を採用した。これらＤＮＡの配列は以下の表に表す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月５日【補正内容】請求の範囲１．一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ。２．少なくとも −標的一本鎖核酸またはその部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックス、またはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム（このアームは各領域を連続的、または断続的にすることができる）、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。３．複合ＲＮＡの第一領域がワトソン−クリック型の相互作用により標的一本鎖核酸とダブルヘリックスを形成し、そして次に第二領域がこのように形成したダブルヘリックスと水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）によりトリプルヘリックスを形成することを特徴とする、請求の範囲第１または第２項に記載の二本鎖ＤＮＡ。４．複合ＲＮＡの２つの領域がその間にワトソン−クリック型の対合によりダブルヘリックスを形成し、そしてこのダブルヘリックスが標的一本鎖核酸と水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）により相互反応し、このようにしてトリプルヘリックスを形成することを特徴とする、請求の範囲第１または第２項に記載の二本鎖ＤＮＡ。５．一標的一本鎖核酸またはその一部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックス、またはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域をその末端で連結する２つのアーム、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。６．−標的一本鎖核酸のオリゴプリン領域とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −アーム、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、 −標的とする一本鎖核酸のオリゴピリミジン領域とダブルヘリックスを形成できる、第一に連結された第三領域、 −第二アーム、および −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる、第三に連結した第四領域、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。７．アームが３−６個の塩基を含むことを特徴とする、請求の範囲第１ないし第６項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。８．ＲＮＡが１０塩基よりも長い長さ、そして好ましくは１５塩基よりも長い長さを有することをを特徴とする、請求の範囲第１ないし第７項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。９．さらに複合ＲＮＡの転写を可能にするシグナルを含むことを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１０．転写シグナルが構成されたものであるか、または制御されることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１１．ＲＮＡポリメラーゼIIIにより特異的に制御される転写プロモーターを含んで成ることを特徴とする、請求の範囲第１０項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１２．一本鎖標的核酸が、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡから選択され、そして一本鎖または部分的に開いた二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１３．配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１３、１４、１５および１７の配列から選択されることを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１４．前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡを含む発現ベクター。１５．組換えウイルスであることを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載のベクター。１６．ウイルスが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびワクシニアウイルスから選択されることを特徴とする、請求の範囲第１５項に記載のベクター。１７．欠陥ウイルスであることを特徴とする、請求の範囲第１５または第１６項のいずれかに記載のベクター。１８．同一または異なる、請求の範囲第１ないし第１３項のいずれかに記載の多数の二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする、請求の範囲第１４ないし第１７項のいずれか１項に記載のベクター。１９．前記請求の範囲のいずれか１項に記載の少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡまたはベクターを含む医薬組成物。２０．一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡを、ＤＥＡＥ−デキストランと、核タンパク質と、または脂質との複合体の状態で、裸の状態で、あるいはリポソームまたはナノパーティクル中に取り込まれた状態で含む医薬組成物。２１．遺伝子的にインサイチューで生成され、そして一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できることを特徴とするＲＮＡ。２２．少なくとも： −標的一本鎖核酸またはその一部とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム（このアームは各領域を連続的、または断続的にすることができる）、を含む、請求の範囲第２１項に記載の複合ＲＮＡ。２３．−標的一本鎖核酸またはその一部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域をその末端で連結する２つのアーム、を含む、請求の範囲第２１項に記載の混成ＲＮＡ。２４．−標的一本鎖核酸のオリゴプリン領域とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −アーム、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、 −標的とする一本鎖核酸のオリゴピリミジン領域とダブルヘリックスを形成できる、第一に連結された第三領域、 −第二アーム、および −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部分とトリプルヘリックスを形成できる、第三に連結した第四領域、を含む複合ＲＮＡ。２５．請求の範囲第１ないし第１８項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡまたはベクターを特別な細胞中へ導入することを含む、特別な細胞中で遺伝子発現を制御るす方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/02 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/02 21/04 8615−4Ｃ 21/04 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ミユゼオム・ナシヨナル・デイストワール・ナテユレルフランス・エフ−75005パリ・リユキユビエ57 (72)発明者ジオバナンジエリ，カリーヌフランス・エフ−75005パリ・リユラレイ 16 (72)発明者エレーヌ，クロードフランス・エフ−75004パリ・ケドルレアン14 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ。２．少なくとも −標的一本鎖核酸またはその一部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックス、またはその部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム（このアームは各領域を連続的、または断続的にすることができる）、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。３．複合ＲＮＡの第一領域がワトソン−クリック型の相互作用により標的一本鎖核酸とダブルヘリックスを形成し、そして次に第二領域がこのように形成したダブルヘリックスと水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）によりトリプルヘリックスを形成することを特徴とする、請求の範囲第１または第２項に記載の二本鎖ＤＮＡ。４．複合ＲＮＡの２つの領域がその間にワトソン−クリック型の対合によりダブルヘリックスを形成し、そしてこのダブルヘリックスが標的一本鎖核酸と水素結合（フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型）により相互反応し、このようにしてトリプルヘリックスを形成することを特徴とする、請求の範囲第１または第２項に記載の二本鎖ＤＮＡ。５．−標的一本鎖核酸またはその部分とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックス、またはその部分とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域をその末端で連結する２つのアーム、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。６．−標的一本鎖核酸のオリゴプリン領域とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −アーム、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、 −標的とする一本鎖核酸のオリゴピリミジン領域とダブルヘリックスを形成できる、第一に連結された第三領域、 −第二アーム、および −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる、第三に連結した第四領域、を含む複合ＲＮＡをコードすることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。７．アームが３−６個の塩基を含むことを特徴とする、請求の範囲第１ないし第６項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。８．ＲＮＡが１０塩基よりも長い長さ、そして好ましくは１５塩基よりも長い長さを有することをを特徴とする、請求の範囲第１ないし第７項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。９．さらに混成ＲＮＡの転写を可能にするシグナルを含むことを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１０．転写シグナルが構成されたものであるか、または制御されることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１１．ＲＮＡポリメラーゼIIIにより特異的に制御される転写プロモーターを含んで成ることを特徴とする、請求の範囲第１０項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１２．一本鎖標的核酸が、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡから選択され、そして一本鎖または部分的に開いた二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１３．配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１３、１４、１５および１７の配列から選択されることを特徴とする、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ。１４．前記請求の範囲のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡを含む発現ベクター。１５．組換えウイルスであることを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載のベクター。１６．ウイルスが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびワクシニアウイルスから選択されることを特徴とする、請求の範囲第１５項に記載のベクター。１７．欠陥ウイルスであることを特徴とする、請求の範囲第１５または第１６項のいずれかに記載のベクター。１８．同一または異なる、請求の範囲第１ないし第１３項のいずれかに記載の多数の二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする、請求の範囲第１４ないし第１７項のいずれか１項に記載のベクター。１９．前記請求の範囲のいずれか１項に記載の少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡまたはベクターを含む医薬組成物。２０．一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できるＲＮＡをコードする少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡを、ＤＥＡＥ−デキストランと、核タンパク質と、または脂質との複合体の状態で、裸の状態で、あるいはリポソームまたはナノパーティクル中に取り込まれた状態で含む医薬組成物。２１．一本鎖標的核酸とトリプルヘリックスを形成できることを特徴とするＲＮＡ。２２．少なくとも： −標的一本鎖核酸またはその一部とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域を連結する１つまたは２つのアーム（このアームは各領域を連続的、または断続的にすることができる）、を含む複合ＲＮＡ。２３．−標的一本鎖核酸またはその一部とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、および −２つの領域をその末端で連結する２つのアーム、を含む複合ＲＮＡ。２４．−標的一本鎖核酸のオリゴプリン領域とダブルヘリックスを形成できる第一領域、 −アーム、 −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる第二領域、 −標的とする一本鎖核酸のオリゴピリミジン領域とダブルヘリックスを形成できる、第一に連結された第三領域、 −第二アーム、および −このように形成したダブルヘリックスまたはその一部とトリプルヘリックスを形成できる、第三に連結した第四領域、を含む複合ＲＮＡ。２５．請求の範囲第１ないし第１８項のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡまたはベクターを特別な細胞中へ導入することを含む、特定の細胞中で遺伝子発現を制御るす方法。