JP6506270B2 - アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物 - Google Patents

アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物 Download PDF

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Description

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）組成物に関し、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の細胞質送達のための組成物および方法に関する。ハイブリダイズすると核酸結合タンパク質領域と非共有結合的に結合可能な二本鎖領域を形成する、部分的に一本鎖であり、且つ部分的に二本鎖であるハイブリッドＡＳＯが提供される。これにより、標的細胞中へのアンチセンスＤＮＡの送達を容易にするＡＳＯ：：タンパク質複合体が作製され得る。そのような複合体は、細胞における遺伝子発現を下方制御するために用いることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗ウイルス薬としての使用、サイトメガロウイルスに媒介される網膜炎および慢性潰瘍性大腸炎の治療についてＦＤＡによって認可されている（Roehr, 1998; Yacychyn et al., 1998）。ＡＳＯは、特定の遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物にハイブリダイズするようにデザインされている一本鎖ＤＮＡまたはその類似体の断片からなる。このようにして形成されたｍＲＮＡ：：ＡＳＯハイブリッドは、ＲＮＡｓｅ Ｈによって分解され得る。ウイルスに感染した生物において、ウイルスの遺伝子材料は、ウイルス特異的ｍＲＮＡの翻訳を必要とするプロセスである複製のため、特異的細胞に侵入する。ウイルスｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで感染細胞を処理することにより、標的ウイルス遺伝子の発現を阻止し、ウイルスのライフサイクルをブロックすることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の有効性における重要な要因は、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能（bioavailability）である（Biroccio et al., 2003）。生物学的利用能は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞の細胞膜または内膜系を透過できないことにより限定されることがある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的（例えば、ｍＲＮＡ）は細胞の細胞質内に存在するので、オリゴヌクレオチドは、細胞質にアクセスできるようになる前に、細胞膜を横切可能である必要がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞質へのアクセスに関するこの問題に取り組む方法の１つは、全身にではなく局所的に治療を行うこと、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを別個の薬物動態学的コンパートメントに投与して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所的濃度を上げることである。例えば、サイトメガロウイルス媒介性網膜炎のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理には、硝子体内注射によって別個の薬物動態学的コンパートメントにホミビルセン（Fomivirsen）（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標））を投与することが含まれる。しかし、細胞質へのアクセス、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的ｍＲＮＡへのアクセスは、硝子体内投与後でも、かなり制限されたままである（Lysik and Wu-Pong, 2003）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内送達のためのその他の方法には、細胞膜への機械的および電気的細胞ダメージ、（膜を非特異的に不安定化することが知られている）高分子キャリアおよび脂質キャリア、またはウイルスベクターが含まれ得る。しかし、これらの方法および同様の方法は、臨床において安全性または信頼性が証明されておらず、（今日まで）市場においてアンチセンス製品用に認可された送達技術は得られていない。
本発明は、タンパク質性の核酸結合ドメインに結合可能な結合部位を形成する部分的に重複する第２のオリゴヌクレオチド鎖に隣接する活性アンチセンス配列（例えば、一本鎖ＤＮＡ）の新規配置を用いて、細胞内で１または複数の遺伝子発現を下方制御するためのシステムにおいて使用するための、組成物および方法を提供することを目的とする。本発明者らは、これらの部分的に一本鎖であり、且つ部分的に二本鎖であるヌクレオチドを「ＡＳＯハイブリッド」と名付ける。予想されなかったことに、本発明者らは、以下を発見し、実験的に示した（未発表データ）。
（１）ＡＳＯハイブリッドは、無細胞アッセイにおいて、例えば３０ｐＭｏｌのＡＳＯ濃度で、対照一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同等のアンチセンス活性プロファイルを示し得る。
（２）ＡＳＯハイブリッドは、ポリカチオン性親和性ハンドル（affinity handle）（以前（Gaur et al., 2002；国際公開第９７／２３２３６号）に用いられたポリ（Ｌ−リジン）など）、または他の共有結合性の化学的複合体化法を必要とせずに、核酸結合ドメイン（例えば、出芽酵母（S.cerevisiae）のＧＡＬ４）に結合して複合体を形成する。
（３）ＡＳＯハイブリッド複合体（例えば、ＧＡＬ４：：ＡＳＯ）において、核酸結合ドメインが弱毒化された（attenuated）致死因子ドメイン１（炭疽菌（Bacillus anthracis）由来、すなわち、ＬＦｎ）と融合している場合、この超分子集合体は、細菌病原性因子（炭疽菌ＰＡ６３）に由来するポア（pore）を通過することができる。このことは、ＰＡポアの通過にはカーゴ（cargo）の構造的分解（モルテングロビュール状態への転移（molten globular transition））が必要であると報告されているので（Zornetta et al., 2010）、予想外である。超分子複合体がＰＡポアを通って細胞質中へと通過するためには、カーゴのモルテングロビュール状態への転移、すなわち、規則的な構造からランダムコイルへの転移が起こってはいけない。さらに、この転移は、ポリカチオン性親和性ハンドル（ポリ（Ｌ−リジン）など）（Gaur et al., 2002：国際公開第９７／２３２３６号）を使用せずに確認されている。
特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物の細胞膜横断を可能にする複合体化戦略を提供することが本発明の目的である。このようにして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質に送達することができ、記載されるアンチセンスとタンパク質の複合体化戦略により、細胞質内のＲＮＡ標的またはＤＮＡ標的（ウイルスｍＲＮＡ転写産物など）への直接的なアクセスを実現することができる。
ある態様では、本発明は、一対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物であって、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると少なくとも１つの一本鎖アンチセンス配列および少なくとも１つの二本鎖タンパク質結合配列を生じる組成物を提供する。好ましくは、組成物は、シャトルタンパク質（例えば、組換えＬＦｎ−ＧＡＬ４）をさらに含み、シャトルタンパク質は、二本鎖タンパク質結合配列を認識する核酸結合ドメイン（例えば、ＧＡＬ４）を含み、且つ、前記一対のアンチセンスオリゴヌクレオチドと非共有結合的に結合する。
別の態様では、本発明は、細胞膜を通してアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するためのシステムを提供する。このシステムには、（ｉ）二本鎖タンパク質結合配列（例えば、ＧＡＬ４）および少なくとも１つの一本鎖アンチセンス配列を含む、（例えば、図１に示されるような）一対のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）二本鎖タンパク質結合核酸配列内に組み込まれた特異的配列（例えば、ＣＧＧ−Ｎ１１−ＣＣＧ）を認識してシャトルタンパク質を前記一対のアンチセンスオリゴヌクレオチドに非共有結合的に結合させることが可能な核酸結合ドメインを有するシャトルタンパク質が含まれる。
別の態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをシャトルタンパク質（例えば、ＬＦｎ−ＧＡＬ４）と非共有結合的に複合体化させる方法を提供する。この方法には、（ｉ）２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用意すること、（ｉｉ）２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、少なくとも１つの一本鎖アンチセンス配列および少なくとも１つの二本鎖タンパク質結合配列を含むアンチセンスハイブリッドを形成すること、（ｉｉｉ）二本鎖タンパク質結合標的配列を認識する核酸結合ドメインを含むシャトルタンパク質を用意する工程、および（ｉｖ）前記タンパク質の核酸結合ドメインおよび前記アンチセンスハイブリッドのタンパク質結合配列により、前記シャトルタンパク質を前記アンチセンスハイブリッドと非共有結合的に複合体化する工程が含まれる。
一対の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドから二本鎖タンパク質結合部位を作成するための異なるトポロジーを示す、本発明に係る５つの異なる組成物を示す図１のａ〜ｅを含む図である。 本発明に係る組成物の阻害活性を無細胞アッセイにおいて他のアンチセンス組成物と比較した図である。 中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）を用いて、本発明のアンチセンス組成物の存在下で、ＬＦｎ−ＧＡＬ４が二量体化してより大きな分子量の組成物を形成することを示す図である。 記載のシステムが２つの異なる遺伝子の発現をどのように下方制御するかを示す図であり、シンタキシン５の発現の下方制御が示される。 記載のシステムが２つの異なる遺伝子の発現をどのように下方制御するかを示す図であり、ＨＰＶ（血清型１８）Ｅａｒｌｙ（Ｅ）７の発現の下方制御が示される。 ＬＦｎ−ＧＡＬ４ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。 ＬＦｎ（ＬＦドメインＩ）タンパク質配列（配列番号２）を示す図である。 ＧＡＬ４（アミノ酸１〜１４７）タンパク質配列（配列番号３）を示す図である。 Ｖ５−ＬＦｎ−ＧＡＬ４−６ＨｉｓＤＮＡ配列（配列番号４）を示す図である。 Ｖ５−ＬＦｎ−ＧＡＬ４−６Ｈｉｓタンパク質配列（配列番号５）を示す図である。 ＭＲＧＳ−６Ｈｉｓ−ＰＡ８３ＤＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。 ＭＲＧＳ−６Ｈｉｓ−ＰＡ８３タンパク質配列（配列番号７）を示す図である。
複合体化および膜移行（membrane translocation）の方法では、（ポリカチオン性またはイオン性の）ＤＮＡ縮合剤（condensing agent）（ポリ（エチレンイミン）またはポリ（Ｌ−リジン）など）の使用は、これらの材料は多くの場合毒性であり、この毒性は、少なくとも一部は、細胞膜を不安定化する性質によるものであると考えられているので（Richardson et al., 1999）（および以下の表１参照）、必要とされない。本発明において、シャトルタンパク質とは、細胞膜中のポアを通して遺伝子材料を運搬することができるタンパク質として定義される。ポアは、炭疽菌のＰＡ８３またはＰＡ６３などのポア形成タンパク質を含んでいてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＤＮＡの類似体を含み、これは例えば特定の酸素原子が硫黄によって置換されているスルホン化類似体であってもよい。好適であることが見出され得るその他のＤＮＡ類似体としては、Leumann（2002）に開示されているものが挙げられる。配列は、直接互いに隣り合ってもよく、好ましくは少なくとも部分的に二本鎖である、介在ＤＮＡ配列によって連結されていてもよい。
好ましい実施形態では、シャトルタンパク質は、弱毒化された毒素タンパク質である。具体的には、シャトルタンパク質は、炭疽菌の致死因子ドメインＩ（ＬＦｎ）であってもよい。
好ましくは、弱毒化された毒素において、少なくとも１つの毒素ドメイン、例えば、炭疽菌の致死因子タンパク質毒素の毒性ドメインＩＩ〜ＩＶの１または複数が、核酸結合ドメインによって置換されている。例えば、核酸結合ドメインは、（ＬＦｎと融合した）出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ４であってもよい。
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ポア形成タンパク質をさらに含む。好ましくは、ポア形成タンパク質は非毒性タンパク質である。好ましいポア形成タンパク質の１つは、炭疽菌病原性因子である防御抗原（ＰＡ）である。具体的には、ポア形成タンパク質は、炭疽菌のＰＡ８３またはＰＡ６３であってもよい。
ある実施形態では、（シンタキシン５（Ｓｙｎ５）を発現の下方制御の標的とする場合）オリゴヌクレオチドの１つはアンチセンス配列５′ＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡ３′（配列番号１８）を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド対の各メンバーは、ハイブリダイズするとタンパク質結合配列を形成する２つの相補鎖のうちのいずれかを含む（図１参照）。アンチセンス配列は、タンパク質結合配列の下流（３′）または上流（５′）（または、生じるハイブリッド中に２つ以上のアンチセンス配列がある場合、その両方）にあってもよい（図１のａ参照）。
ある実施形態では、タンパク質結合配列は、ＣＧＧ−Ｎ１１−ＣＣＧであり、Ｎは、プリン塩基またはピリミジン塩基を含む任意のヌクレオチドである。好ましくは、タンパク質結合配列は、５′ＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧ３′（配列番号１９）である。
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ハイブリダイズすると、配列５′ＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧ３′（配列番号２０）を含むタンパク質結合配列を形成するオリゴヌクレオチド対を含む。そのような配列の例は、以下に示される配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３である（実施例４）。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質結合配列とアンチセンス配列との間に、隣接配列（flanking sequence）をさらに含む（図１のａ参照）。
好ましくは、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドはスルホン化されていてもよく、これによりその安定性が向上する。スルホン化オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチド鎖中の１または複数の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されていてもよい。スルホン化は、種々の公知の方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１，−ジオキシド）の使用（Cieslak et al., 2005）によって行ってもよい。オリゴヌクレオチドの安定性を増大させる他の方法、例えばLeumann（2002）に開示の方法を本発明で使用してもよい。
本発明はまた、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を用いて、細胞膜を通してアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達することにより、細胞の細胞質において標的遺伝子の発現を下方制御するインビトロの方法を提供する。
本発明の別の態様は、ヒト子宮頸部上皮細胞（cervical epithelial cell）においてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の遺伝子の発現を下方制御する方法で使用するための、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物である（図５および実施例７参照）。
別の態様では、本発明は、癌、特に子宮頸癌（cervical cancer）および口腔癌を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって生じる癌の潜在的な治療または予防として、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を提供する。
多くの植物毒素および細菌毒素（病原性因子）が、高分子の触媒活性タンパク質ドメインの形態で毒素を細胞の細胞質に送達するように進化してきた。例としては、コレラ毒素（Sandvig et al., 2005）、リシン毒素（Sandvig et al., 2010）、および炭疽毒素（Gaur et al., 2002）が挙げられる。これらの病原体は、インビボで機能して、ヒトの罹患原因および死亡原因となることが知られている。
本発明者らは、組換えＰＣＲを用いて（触媒毒性活性に関与する）野生型ドメインＩＩ〜ＩＶが除去された、既知の弱毒化型の炭疽菌致死因子（ＬＦｎ）を作製した。続いて、これらのドメイン（ＩＩ〜ＩＶ）を、出芽酵母のＧＡＬ４などの核酸結合ドメインで置換した。これは全て当該技術分野で公知である（Gaur et al., 2002）。本発明者らは、ＧＡＬ４が間接的に、好適な条件下で、すなわち２つの好適なオリゴヌクレオチド同士がハイブリダイズすると一本鎖アンチセンス配列および二本鎖（ＤＳ）タンパク質結合配列を含むハイブリッドを形成する場合に、活性アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合可能であることを示した。本発明者らはさらに、完全な複合体（ＬＦｎ−ＧＡＬ４：：ＡＳＯ）を用いて、別のタンパク質であるＰＡ８３との相互作用を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に移動させることができることを示した。意義深いことに、完全なアンチセンスオリゴヌクレオチド−タンパク質複合体を作製するために本発明者らが使用したプロセスおよび材料は、当該技術分野でＤＮＡ複合体形成に必要であると従来見なされていた、縮合剤またはポリカチオン性親和性ハンドル（例えば、毒性であり且つ膜を不安定化することが知られている（Richardson et al., 1999）、ポリ（Ｌ−リジン）（Gaur et al., 2002；国際公開第９７／２３２３６号））が必要ないことを意味する。
本発明に係るシステムの好ましい実施形態は、二本鎖（ＤＳ）タンパク質結合配列の３′側および／または５′側の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を提供する。ＬＦｎなどのタンパク質をポア形成タンパク質、例えばＰＡ８３と組み合わせて用いてもよい。ＰＡ８３は、ＬＦｎの膜移行を促進する能力を有する。ＬＦｎとＰＡ８３との相互作用は他で説明されている（Krantz et al., 2005）が、ポア移行中にはカーゴのモルテングロビュール状態への転移が必要であると報告されている。本発明者らは今回、カーゴとして超分子集合体を用いることが可能であること、およびこの超分子集合体と結合したアンチセンス配列が細胞質中に移行できることを示した。このことは、予測されていなかった。
本発明者らはさらに、二本鎖ＬＦｎ−ＧＡＬ４結合配列ならびに３′および／または５′オーバーハング一本鎖アンチセンス配列を含むハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを使用するためのシステムを開発し、このハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、３０ｐＭｏｌ超のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）濃度で、隣接配列のないアンチセンス（一本鎖ヌクレオチド）配列に劣らず効果的であることが示された。本発明者らが開発した複合体は、オリゴヌクレオチドとＬＦｎ−ＧＡＬ４タンパク質が共有結合することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞質送達を容易にするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体化システムとして用いることができる。本発明は、インビトロ研究のための有用なツール、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド医薬組成物の基礎、および任意の好適なアンチセンス療法の送達方法の重要な部分の基礎を提供する。特に、本発明は、ＨＰＶ感染子宮頸部上皮細胞を治療するためのアンチセンス抗ウイルス組成物の基礎を形成し得る。
アンチセンス配列に隣接する二本鎖タンパク質認識核酸配列の存在に応答したＬＦｎ−ＧＡＬ４タンパク質の二量体化は、中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）を用いて示された（実施例５参照）。実施例５は、本発明のハイブリッドオリゴヌクレオチド組成物の添加後に、ＬＦｎ−ＧＡＬ４タンパク質が高分子量複合体（タンパク質の回転半径（Ｒｇ）が約５ｎｍ〜２５ｎｍの範囲）を形成することを示す。
本発明に係る三成分システムを試験するために、本発明者らは最初にプロトタイプを作製した。システムが遺伝子を下方制御する能力をヒト上皮細胞（Ｈｅｌａ）において調べた。ＬＦｎ−ＧＡＬ４：：オリゴヌクレオチド複合体は、ＰＡ８３と混合した場合、アンチセンス配列に対応する、特異的で選択的な遺伝子の下方制御を促進した（実施例６参照）。実施例６は、ウエスタンブロット法および免疫検出による、シンタキシン５タンパク質の下方制御を示す（Suga et al., 2005）。標的遺伝子発現のレベルをＤｅｒｌｉｎ１などの「ハウスキーパー」遺伝子の発現レベルに対して標準化し、「非センス」対照を含めることにより、遺伝子特異性（および細胞数の調整）がさらに強調される（図４参照）。「非センス」対照とは、発現している遺伝子中の標的ＲＮＡに相補的ではなく、したがってその発現を阻害しないと思われる、一本鎖ＤＮＡを含む対照である。
さらに、ＨＰＶのＥ７遺伝子の発現に対するアンチセンス活性も示される（実施例７参照）。ＨＰＶ Ｅ７は、ＨＰＶウイルスのライフサイクルの伝播に重要であり、治療的介入の標的である（Jonson et al., 2008）。
アンチセンス活性を有する配列である遊離状態の一本鎖領域を残したまま二本鎖タンパク質結合領域または二本鎖タンパク質結合配列を提供するための２つのオリゴヌクレオチド鎖の配置により、当該技術分野で既に報告されている薬剤（ＬＦｎ−ＧＡＬ４およびＰＡ８３など）にアンチセンスドメインを結合させるために用いることができる簡便な複合体化方法が提供される。これにより、潜在的な薬物標的をコードする遺伝子、例えばＨＰＶ Ｅ７の発現の下方制御を媒介し得るアンチセンス剤の細胞質送達が容易になる。
添付の図面を参照して本発明の具体的な実施形態を以下にさらに具体的に説明する。
実施例１：シャトルタンパク質の形成
ＬＦｎ−ＧＡＬ４を大腸菌培養物から約５ｍｇ／Ｌの収率で濃縮した。ＬＦｎ−ＧＡＬ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号４（図９）である。この配列は、大腸菌発現カセットであるプラスミドｐＥＴ１５１／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にある。
ＬＦｎ（ＬＦドメイン１）およびＧＡＬ４（アミノ酸１〜１４７）（当該技術分野で公知、Gaur et al., 2002）のＤＮＡ配列をｐＥＴ１５１／Ｄ細菌発現カセットにサブクローニングした。Ｎ末端のＶ５エピトープタグおよびＣ末端の６×ヒスチジンアフィニティータグの付加により、それぞれ、溶菌液からの融合タンパク質の迅速な免疫検出およびアフィニティー精製が可能になった。
組換えタンパク質の産生
化学的にコンピテントな細菌（大腸菌ＢＬ２１＊ＤＥ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を精製プラスミド（前述）で形質転換し、アンピシリン（２００μｇ／ｍＬ）培地を含む２×ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（２×ＹＴ）細菌培養液中で一晩培養（１０ｍＬ）した後、同様な濃度のアンピシリンを含む大容積（１Ｌ）の２×ＹＴ中で継代培養した。次に、１８０ｒｐｍ（３７℃）に設定したオービタルシェーカー中で、細菌培養物を３時間インキュベートした。続いて、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５００μＭの最終濃度で加え、さらに３時間インキュベートした。細菌ペレットを遠心分離（６０００×ｇ、１０分、４℃）により調製し、１５００ＰＳＩに設定したフレンチプレスを用いて溶菌した。溶菌液をさらに遠心分離した（２００００×ｇ、２０分）。得られた上清を６×Ｈｉｓ（Ｃｏ２＋ Ｔａｌｌｏｎ（登録商標）樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））アフィニティークロマトグラフィーカラムに通した。１５０ｍＭイミダゾールを用いて１ｍＬずつの画分にＬＦｎ−ＧＡＬ４を溶出させた。画分をタンパク質の純度および濃度について分析し、プールし、リン酸緩衝食塩水で透析した。最終タンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、（タンパク質純度を決定するため）クーマシー染色および（Ｖ５および６×Ｈｉｓに特異的な抗体を使用した）ウエスタンブロット解析を行った。
実施例２：ポア形成タンパク質の産生
ＰＡ８３を大腸菌ＢＬ２１＊ＤＥ３の培養物から約５ｍｇ／Ｌの収率で濃縮した。ＰＡ８３をコードする既知のＤＮＡ配列を含むプラスミドはＬｅｓ Ｂａｉｌｌｉｅ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｆｆ）からの寄贈として入手した。これは、Ｎ末端６×ヒスチジンアフィニティータグを付与する細菌発現ベクターｐＱＥ３０中にサブクローニングされたＰＡ８３コード配列を含んでいた（Baillie et al., 2010）。化学的にコンピテントな細菌を精製プラスミドで形質転換し、上記と同様に一晩培養した。増殖相の間、１Ｌの細菌培養物を、１８０ｒｐｍ（３７℃）に設定したオービタルシェーカー中で３時間インキュベートした。続いて、ＩＰＴＧを５００μＭの最終濃度で加え、さらに２時間インキュベートした。細菌ペレットを遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により調製し、上記と同様にフレンチプレスを用いて溶菌した。溶菌液をさらに遠心分離した（２００００×ｇ、２０分）。得られた上清を６×ヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーカラムに通した。１５０ｍＭイミダゾールを用いて１ｍＬずつの画分中にＰＡを溶出させた。タンパク質画分を純度および濃度について分析し、プールし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で透析した。最終タンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、（純度を決定するため）クーマシー染色および（ＰＡに特異的な抗体を使用した）ウエスタンブロット解析を行った。
ＰＡ８３のアミノ酸配列を配列番号７に示す（図１２、ＭＲＧＳ−６Ｈｉｓ−ＰＡ８３タンパク質）。
実施例３：二本鎖タンパク質結合領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形成
ＧＡＬ４認識配列の１つの鎖をそれぞれコードする２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて、一本鎖アンチセンス配列が隣接した二本鎖（ＧＡＬ４）タンパク質結合配列を形成した。この例では、記載のＡＳＯ組成物（配列番号８および配列番号９；実施例４参照）を用いた。得られた組成物を図１のａに示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、２つの部分的に重複するオリゴヌクレオチドを融解（９４℃、１分）および再アニーリング（５５℃、１分）する反復（×１０）熱サイクルにより行い、配列特異的にｍＲＮＡと相互作用する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は遊離したままであった。
図１のａ〜ｅは、本明細書に開示されるタンパク質：：オリゴヌクレオチド複合体化戦略を用いた、アンチセンス核酸配列に関連するＤＮＡ（またはＤＮＡ類似体）のタンパク質結合（ＤＳ）配列の複数の可能なトポロジーを示す。図１のａは、反対のセンス方向を向き、相補的部分で互いに結合した２つの配列である、配列番号８および配列番号９を示しており、配列番号８の塩基２３〜４８が配列番号９の塩基４８〜２３（配列番号９は図１のａにおいて３′側から５′側に向かって示される）と結合している。本発明のＡＳＯハイブリッドは、アンチセンス配列に隣接する付加的なＤＮＡ配列を含んでもよく、含まなくてもよい。図１のａ〜ｅに示されるように、ＡＳＯハイブリッドの二本鎖（タンパク質結合）領域は、複数の異なる方法で形成され得る。例えば、二本鎖領域は、図１のａのように、（同じであっても異なってもよい）２つのアンチセンス配列の間に位置していてもよい。あるいは、二本鎖領域は、図１のｂ〜ｅのように、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの片側に位置していてもよい。
実施例４：特異的タンパク質の発現阻害に有用なＤＮＡ配列の作製
隣接配列およびＧＡＬ４結合配列を有する、シンタキシン５特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
フォワードオリゴヌクレオチド（配列番号８）
５′ＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴ３′
リバースオリゴヌクレオチド（配列番号９）
５′ＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＴ３′
隣接配列およびＧＡＬ４結合配列を有する、ＨＰＶ（血清型１８）Ｅａｒｌｙ（Ｅ）７ ｍＲＮＡ転写産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
フォワードオリゴヌクレオチド（配列番号１０）
５′ＧＧＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴ３′
リバースオリゴヌクレオチド（配列番号１１）
５′ＧＧＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＴ３′
隣接配列およびＧＡＬ４結合配列を有する、ＴｕｒｂｏＧＦＰ ｍＲＮＡ転写産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
フォワードオリゴヌクレオチド（配列番号１２）
５′ＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴ３′
リバースオリゴヌクレオチド（配列番号１３）
５′ＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴ３′
前述のオリゴヌクレオチド（配列番号８〜配列番号１３）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの寿命を向上するためのホスホロチオエート修飾を用いて合成した。
９４℃まで１分間加熱、５５℃まで１分間冷却、×１０の条件でＰＣＲサイクラーを用いて、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのペア（配列番号８および配列番号９；配列番号１０および配列番号１１；配列番号１２および配列番号１３）をハイブリダイズさせた。このアニーリングプロセスにより、本発明に係るハイブリッド一本鎖且つ二本鎖のＤＮＡ配列が産生される。
実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチド−シャトル（ＬＦｎ−ＧＡＬ４）複合体の形成
アニーリングしたＡＳＯハイブリッドを産生した（実施例４同様）。これらのＡＳＯハイブリッドを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＬＦｎ−ＧＡＬ４と共に、室温で３０分間、適切な化学量論量（すなわち、タンパク質とオリゴヌクレオチドのモル比が約３：１）でインキュベートした。
このようにして得られた生成物の１つを中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）で調べた。図３において、得られたプロファイルをアンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で得られたプロファイルと比較する。図３は、ＳＡＮＳによって測定される、図１のａに示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物の添加に応答したＬＦｎ−ＧＡＬ４の二量体化、すなわち、ＰＢＳ中のＬＦｎ−ＧＡＬ４およびＬＦｎ−ＧＡＬ４：：ＤＳ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（各例で、約０．５ｍｇ／ｍｌのＬＦｎ−ＧＡＬ４）による中性子小角散乱を示す。図３のｘ軸の単位はｑ／ｌ／オングストロームであり、ｙ軸の単位はｌ／ｃｍである。上側の太い黒色の線は、ＡＳＯが存在しない下側の細い線と比較した、ＡＳＯ存在下での結果を示す。０．０１（ｑ／ｌ／Å）と０．０４（ｑ／ｌ／Å）の散乱プロファイルの差は、オリゴヌクレオチド（図１のａ）の二本鎖タンパク質結合配列形成部分との結合により生じたＬＦｎ−ＧＡＬ４の二量体化に起因する。この例では、２ｍｍキュベット（Ｈｅｌｌｍａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社；英国、エセックス）にＬＦｎ−ＧＡＬ４およびＬＦｎ−ＧＡＬ４：：オリゴヌクレオチドをそれぞれ３：１の化学量論量（モル比）でロードした。
そのような散乱放射線の強度は、散乱体のサイズおよび形状ならびに組成（すなわち、ＬＦｎ−ＧＡＬ４）を反映する。個々のタンパク質およびそれらの混合物の両方を試験した。個々の成分について、全般的に散乱は観察されず、それらが比較的小さいサイズであることが示された。ＬＦｎ−ＧＡＬ４およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの混合物において散乱が観察され、相互作用により大きな構造（すなわち、ＬＦｎ−ＧＡＬ４：：ＡＳＯ複合体）が形成されることが確認された。
実施例６：標的遺伝子発現（シンタキシン５）の下方制御
実施例５で生成した複合体の１つを用いて、Ｈｅｌａ細胞におけるシンタキシン５遺伝子の発現を標的化した。ポア形成タンパク質ＰＡ８３を用いて、ＬＦｎ−ＧＡＬ４との相互作用を介したアンチセンスオリゴヌクレオチドの膜移行の媒介を促進した。複合体のＡＳＯ部分は、２つのアニーリングした（実施例４同様）ＡＳＯ配列（配列番号８および配列番号９）からなっていた。Ｈｅｌａ細胞は、通常条件下で培養した場合にシンタキシン５を産生する。Ｈｅｌａ細胞を、１リットルあたり、０ｐＭｏｌ（対照）、１ｐＭｏｌ、１０ｐＭｏｌ、５０ｐＭｏｌ、１００ｐＭｏｌ、および２００ｐＭｏｌの種々のＡＳＯ複合体濃度範囲で様々な方法で処理した。
図４中、黒く塗りつぶされたバーは、ＰＡ８３、ＬＦｎ−ＧＡＬ４、および「非シンタキシン５」（ＧＦＰ特異的）ＡＳＯ（ハイブリダイズした配列番号１２および配列番号１３から形成）で処理したＨｅｌａ細胞を表す。塗りつぶされていないバーは、ＰＢＳのみで処理したＨｅｌａ細胞を表す。これら２つの処理により、（ここでは、抗ＧＦＰ ＡＳＯ配列はシンタキシン５に対して不活性であるため）シンタキシン５の下方制御に対する配列特異性が示され、これらが陰性対照となる。水平に網掛けされたバーは、（配列番号８および配列番号９から形成された）シンタキシン５特異的ハイブリッドＡＳＯを用いてエレクトロポレーションしたＨｅｌａ細胞を表す。垂直に網掛けされたバーは、ＰＡ８３、ＬＦｎ−ＧＡＬ４、および（配列番号８および配列番号９から形成された）シンタキシン５特異的ハイブリッドＡＳＯで処理したＨｅｌａ細胞を表す。斜めに網掛けされたバーは、製造業者の推奨に従ってＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合したシンタキシン５特異的ハイブリッドＡＳＯ（配列番号８および配列番号９から形成される）で処理したＨｅｌａ細胞を表す。
２４時間後に、イムノブロット法を用いて細胞におけるシンタキシン５の発現レベルを測定した。結果は対照（ＰＢＳのみで処理されたＨｅｌａ細胞）に対する発現割合で示される（ｙ軸）。データは、本発明に係る組成物がシンタキシン５の発現を遺伝子特異的に下方制御することを示す。これは、ウエスタンブロット法および免疫検出により集団レベルで示される。図４のグラフは、シンタキシン５の発現レベルを示しており、（細胞数のばらつきを調整するための）ハウスキーピング遺伝子であるＤｅｒｌｉｎ１の発現と比べた、Ｈｅｌａ細胞上でＰＡ（５０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートしたＬＦｎ−ＧＡＬ４（５０μｇ／ｍＬ）にアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド（３．２μｇ／ｍＬ）（配列番号８および配列番号９）をロードした効果を示す。示されているデータは、３つの別個の実験に由来し、記載した組成物の添加が、アンチセンス配列（すなわち、シンタキシン５）をコードする特定の遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドのノックダウンを媒介し得ることを示す。データは各実験の３回の反復を表し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
実施例７：標的遺伝子発現（ＨＰＶ１８ Ｅ７）の下方制御
Ｈｅｌａ細胞におけるヒトパピローマウイルス（血清型１８）Ｅａｒｌｙ ７の発現に対する抗ＨＰＶ Ｅ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を調べるための実験を、異なるオリゴヌクレオチド配列を用いたこと以外は前述の実施例６と同様に行った。本例では、実施例６の（配列番号８および配列番号９から形成された）シンタキシン５特異的ＡＳＯハイブリッドの代わりに、（配列番号１０および配列番号１１から形成された）ハイブリッドタンパク質結合領域および小さな隣接領域を含むＨＰＶ−Ｅ７特異的ＡＳＯハイブリッドを用いた。本実施例では、ＬＦｎ−ＧＡＬ４およびＰＡ８３と結合した２００ｐＭのオリゴヌクレオチドを用いた（これは図５のグラフの黒色のバーである）。結果は図５に示されており、遺伝子発現の割合がｙ軸に示されている。対照処理（ＰＢＳ）を１００％とし、これは図５のグラフで白色のバーである。データは各実験の３回の反復を表し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。２つの処理間には統計的な差があった（片側独立ｔ検定による測定でｐ＝０．０１０４）。
実施例８：ポリ（エチレンイミン）と比較した本発明の組成物のインビトロ毒性
実施例５と同様に作製したＡＳＯハイブリッド−シャトル複合体を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）との関連で毒性について調べた（表１）。これらのデータは、トランスフェクションを媒介可能であるとして文献中でよく特徴付けられている種々の濃度のカチオン性ポリマーＰＥＩ、および５０μｇ／ｍＬのＰＡの存在下でＡＳＯハイブリッドと７２時間のハイブリダイゼーションした後のＬＦｎ−ＧＡＬ４タンパク質のいずれかに曝露した細胞に関連する毒性の差を示す。細胞生存率を非処理細胞に対して標準化し、ＭＴＴを添加することにより測定した（Richardson et al., 1999）。
実施例９：種々のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を用いたインビトロ翻訳アッセイのアンチセンス阻害
図２は、（膜移行が律速でない）無細胞アッセイにおいてＡＳＯ成分と比較した本発明の組成物の効果を示す。
ｔｕｒｂｏＧＦＰタンパク質（緑色蛍光タンパク質、Ｅｖｒｏｇｅｎ社）をコードする対照プラスミドと共に、「Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｍｉｎｉ−ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて対照反応を行った。反応は、４．５μｌの容積で行い（３０℃で３時間インキュベート）、抗６Ｈｉｓ一次抗体（１：１０００希釈）および抗マウスＨＲＰ標識二次抗体（１：１０００）を用いたウエスタン免疫ブロット法によりｔｕｒｂｏＧＦＰの発現をモニタリングした。Ｐｉｃｏｓｔａｂｌｅ ＥＣＬキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて検出を行った。前述の３時間のインキュベーションの開始時に、３つの抗ｔｕｒｂｏ ＧＦＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）組成物を種々の濃度で反応に加えた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない対照と比べた結果を図２に示す（ｎ＝３±ＳＥＭ）。図２中、ｙ軸は非処理対照と比べたｔｕｒｂｏＧＰＦの発現（％）を表し、ｘ軸は反応に加えられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度（ｐＭｏｌ）を表す。四角で表されたデータポイントは、ｔｕｒｂｏＧＰＦアンチセンス配列およびタンパク質結合配列（の一方の鎖）からなる一本鎖ＡＳＯオリゴヌクレオチド（配列番号１２）に由来する。三角で表されたデータポイントは、配列番号１２に組み込まれたアンチセンス配列（すなわち、２１塩基長のＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡ、配列番号２１）のみから生成したデータを表す。丸で表されたデータポイントは、配列番号１２を配列番号１３と共にアニーリングさせて形成した本発明のＡＳＯハイブリッドから生成された。図２に示される結果は、（インビトロで）ＡＳＯハイブリッド中のタンパク質結合配列の存在が、３０ｐＭｏｌを超えるＡＳＯ濃度で、アンチセンス配列の活性を阻害しないことを示す。
本発明は、３０ｐＭｏｌまたはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）濃度で、タンパク質結合配列または隣接配列を欠くアンチセンス対照と比べて（無細胞アッセイで測定される）アンチセンス活性が実質的に有意に低下していないアンチセンス組成物の作製に用いることができる。前述の実施例９（図２）がこのことを説明している。
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Claims (15)

  1. 部分的に相補的な一対の一本鎖オリゴヌクレオチド−ここで前記一対の一本鎖オリゴヌクレオチドはハイブリダイズすると少なくとも１つの一本鎖アンチセンス配列および少なくとも１つの二本鎖タンパク質結合配列を生じる；
    細胞膜中のポアを通して遺伝子材料を運搬することができ、前記二本鎖タンパク質結合
    配列を認識して前記二本鎖タンパク質結合配列に非共有結合的に結合する核酸結合ドメイ
    ンを含むシャトルタンパク質−ここで、前記シャトルタンパク質は、炭疽菌致死因子（ＬＦ）ドメインＩ（ＬＦｎ）を含む；および
    炭疽菌の病原性因子である防御抗原ＰＡ８３であるポア形成タンパク質
    を含む、細胞の細胞質中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  2. スルホン化により安定性が向上するように修飾されているオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  3. 前記タンパク質結合配列が、ＣＧＧ−Ｎ１１−ＣＣＧであり、Ｎは、任意のプリン塩基
    またはピリミジン塩基である、請求項１または請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  4. 前記タンパク質結合配列が、
    ５′−ＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧ−３′、または
    ５′−ＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧ−３′
    である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  5. 炭疽菌致死因子ＬＦのドメイン（ＩＩ〜ＩＶ）の少なくとも１つが、前記核酸結合ドメインによって置換されている、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  6. 前記シャトルタンパク質の前記核酸結合ドメインが、出芽酵母のＧＡＬ４である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  7. 前記アンチセンス配列が、標的遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズするようにデザインされた一本鎖ＤＮＡである、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  8. 前記標的遺伝子が、ウイルスによって発現される、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  9. 前記標的遺伝子が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって発現される、請求項７または請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  10. 任意に薬学的に許容される賦形剤およびキャリアからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む、治療において使用するための、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  11. ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した対象を治療するための、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  12. 癌を治療するための、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  13. 子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）または口腔癌を治療するための、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物。
  14. 請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物を用意すること、および
    前記アンチセンスオリゴヌクレオチド含有組成物を前記細胞に適用すること
    を含む、細胞の膜を通してアンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロで輸送する方法。
  15. （ｉ）部分的に相補的な２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを用意すること；
    （ｉｉ）前記２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、少なくとも１つの一本鎖アンチセンス配列および少なくとも１つの二本鎖タンパク質結合配列を含むオリゴヌクレオチドハイブリッドを形成すること；
    （ｉｉｉ）細胞膜のポアを通して遺伝子材料を運搬することができ、前記二本鎖タンパク質結合配列を認識する核酸結合ドメインを有するシャトルタンパク質を用意し、さらにポア形成タンパク質を用意すること−ここで、前記シャトルタンパク質は炭疽菌致死因子（ＬＦ）ドメインＩ（ＬＦｎ）を含み、前記ポア形成タンパク質は炭疽菌の病原性因子である防御抗原ＰＡ８３である；ならびに
    （ｉｖ）前記シャトルタンパク質の前記核酸結合ドメインおよび前記オリゴヌクレオチドハイブリッドの前記タンパク質結合配列により、前記シャトルタンパク質を前記オリゴヌクレオチドハイブリッドと非共有結合的に複合体化すること
    を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドをシャトルタンパク質と非共有結合的に複合体化する方法。
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