JP3937446B2 - 特に神経変性疾患の治療のための医薬組成物およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、特に神経変性疾患の治療における医薬組成物およびその使用に関する。より詳細には、神経変性疾患の治療を目的とする医薬組成物の調製のための、ｐ５３タンパク質またはその遺伝子に作用する化合物の使用に関する。
ｐ５３遺伝子は53kDaの核タンパク質をコードする。天然のｐ５３をコードする野生型遺伝子は、抗癌活性を有する［総説として例えば、Oren、FASEB J.6（1992）3169を参照にされたい］。特に、野生型ｐ５３タンパク質は様々な発癌遺伝子の組み合わせで感染させた囓歯動物の繊維芽細胞中に、形質転換座の形成を阻害することができる。この遺伝子の欠失および／または突然変異誘発により変異させた状態は、これに反してほとんどのヒトの癌を発生させることに関与している［Bakerら、Science 244（1989）217］。この突然変異した状態はｒａｓ発癌遺伝子と一緒に作用して、ネズミ繊維芽細胞を形質転換させることができる。この理由から、ｐ５３タンパク質またはその遺伝子が癌の治療のための標的として広く研究されてきた。さらにChoppら（Biochem.Biophys.Res.Com 182（1992）1201）は、虚血性マウスの脳にｐ５３発現を記載した。しかし、この発現が神経変性またはそれに平行する症状の症例を構成しているかどうかを示すこれらの結果はない。さらに、この文献中に考察、または示唆された治療的取り組みは無い。
本発明の一部は、ｐ５３タンパク質が神経変性のメディエーターを構成するという実証から生まれる。また、ｐ５３タンパク質の活性を少なくとも部分的に阻害できる化合物を使用すると、ニューロンの死の過程を遮断することができる、という証明から生まれる。
神経変性の分子機構を研究するために、出願人はモデルとしてｐ５３遺伝子の発現を不活性化したマウスを使用した［Donehowerら、Nature 356（1992）215］。これらのマウスに不可逆的な病巣虚血性実験を行い、そして梗塞の容量を対照の野生型マウスで観察される容量と比較した（同じ系統、同じ性別、同じ年齢、同じ供給元）。得られた結果は、ｐ５３遺伝子を発現しないマウスの虚血後の梗塞の容量は、統計的に有意に減少することを示した（20％）（実施例を参照にされたい）。出願人は、抗−ｐ５３アンチセンスの使用により、皮質細胞培養物に対するグルタミン酸−誘導死を減少させることができることも実証した。これらの結果は、ｐ５３タンパク質が神経変性においてメディエーター的役割を果たすことを示しており、これは従来技術で報告されていない観察であり、そしてこのタンパク質のこの活性を制御することにより、ニューロンの死を撃退することが可能になる。したがってこのｐ５３タンパク質、その遺伝子およびそれに相互作用できるすべての因子は、神経変性過程の治療において、新規の薬理学上の標的を構成する。したがって本発明は部分的には、神経変性疾患の治療のために、ｐ５３活性を少なくとも部分的に遮断することができる化合物の使用から成る。
本発明の第一の主題は神経変性疾患の治療および／または予防を目的とする医薬組成物の調製用に、ｐ５３タンパク質の活性を少なくとも部分的に阻害する化合物の使用から成る。
本発明の目的のために、ｐ５３タンパク質の活性を少なくとも部分的に阻害することができる化合物は、（ｉ）転写、翻訳または翻訳後のレベルでｐ５３の合成に、あるいは（ii）ｐ５３のＤＮＡに対する結合に作用する化合物であることができる。
ｐ５３タンパク質の合成に対して作用する化合物の中で、転写または翻訳レベルでｐ５３の発現を減少または抑制することができる、アンチセンスヌクレオチド配列を挙げることができる。
そのような配列は、まさにｐ５３ｍＲＮＡに対するものであり、そしてそのタンパク質への翻訳に作用するものであり：それらはオリゴヌクレオチド（例えば欧州特許出願公開第092 574号、同231 495号、国際公開第92/03568号、同91/13080号明細書に記載されたような、合成、化学修飾等）、あるいは例えば欧州特許出願公開第140 308号明細書に記載された技術に従い、ｐ５３ｍＲＮＡと選択的に相互反応することができるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であってよい。
そのような配列はｐ５３をコードする遺伝子にも対するものであり、そしてそのＲＮＡへの転写に作用する。より詳細には、これらの配列は遺伝子のコーディング領域（ｐ５３構造遺伝子）に対し、または非コーディング領域（転写を調節する領域、エキソン等）に対するものであってよい。そのような配列は例えば、欧州特許出願公開第558 634号、国際公開第91/06626号、同92/10590号、同93/10820号明細書等に記載されたような条件下で調製できる。
ｐ５３のＤＮＡへの結合に作用する化合物の中で、特にｐ５３拮抗物質、またはｐ５３と相互作用でき、かつこのようにｐ５３のＤＮＡ結合活性をモジュレートすることができるタンパク質を挙げることができる。これに関して、本質的に不活性な突然変異した状態から成るｐ５３の陰性優性突然変異体を挙げることができ、これはＤＮＡと相互作用するために野生型タンパク質と競合することができる。例えばそのような突然変異体はp53Va1135突然変異体であり、またはMichalovitzら［J.Cell.Bioch.45（1991）22］に記載されている他の形態のものである。これらは好ましくは、本発明の枠内でこれらの突然変異体をインビボで発現できる遺伝的構築物の状態で使用するようにできる。ｐ５３のＤＮＡへの結合を少なくとも部分的に阻害することができる他の化合物は、ｐ５３がＤＮＡへ結合するための部位を再生する二本鎖核酸から成る［El-Deiryら、Nature 1（1992）45；Kernら、Science 252,1708；Friedmanら、PNAS 90（1993）3319］。出願人は、そのような核酸が細胞中に存在する転写因子を複合体化でき、それらが内因性の部位に結合することを防ぐことができ、したがってその転写活性を遮断することができることをまさに示した。
好適な態様では、本発明の枠内で使用される化合物は、ｐ５３のＤＮＡへの結合のための部位の全部または一部を含んで成る二本鎖核酸である。より詳細には、この核酸は配列番号２の全部または一部、あるいはその活性変異体を含んで成る。活性変異体という用語は、本発明の目的に関して、ｐ５３タンパク質への結合特性が保存された配列番号２の任意の変異体を言う。そのような変異体は配列番号２の配列の突然変異、欠失、置換および／または塩基の付加、続いてこの結合活性をインビトロで確認することにより得ることができる。
他の好適な態様では、本発明の枠内で使用する化合物は、ｐ５３タンパク質の活性と拮抗できるｐ５３タンパク質の突然変異した状態をコードする核酸である。
さらに好適な態様では、本発明の枠内で使用される化合物は、転写または翻訳レベルで、ｐ５３タンパク質の発現レベルを減少させることがてきるアンチセンス核酸である。より好ましくはこれはｐ５３細胞性ｍＲＮＡの翻訳を阻害できるアンチセンスリボ核酸をコードするＤＮＡである。そのようなアンチセンスは配列番号１の配列に表されている。
この核酸は、例えばヒトまたは動物に注射された後に、神経変性の予防を誘導する、または治療するために使用することができる。特に、これは国際公開第90/11092号明細書に記載された手法に従い、裸のＤＮＡ状態で注射することができる。また、例えばＤＥＡＥ−デキストラン［Paganoら、J.Virol.1（1967）891］と、核タンパク質［カネダら、Science 243（1989）375］と、脂質［Felgnerら、PNAS 84（1987）7413］との複合体の状態で、リポソーム［Fraleyら、J.Biol.Chem.255（1980）10431］等の状態で投与することができる。
好ましくは、本発明の枠内で使用される核酸はベクターの一部を形成する。そのようなベクターの使用は、まさに処理する細胞中への核酸の投与を増大することができ、そしてまた該細胞中でのベクターの安定性を上昇させ、持続性の阻害効果を得ることを可能にする。さらに、同じベクター中に数種の核酸配列を導入することも可能であり、これはまたは治療の効力を増大させる。
使用するベクターは、動物細胞、好ましくはヒト神経細胞を形質転換することができるかぎり、様々な起源であってよい。本発明の好適な態様では、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス等から選択できるウイルスが使用される。
これに関して、本発明の主題はそのゲノム中に挿入される、ｐ５３タンパク質の活性と拮抗することができるｐ５３タンパク質の突然変異した状態をコードする核酸、ならびに／またはｐ５３のＤＮＡへの結合部位の全部または一部を含んで成る核酸、ならびに／またはｐ５３タンパク質の発現レベルを転写または翻訳レベルで減少させることができるアンチセンス核酸を含んで成る任意の組換えウイルスである。
本発明の組換えウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス等から選択できる。好ましくは組換えウイルスは、特にアデノウイルスのような神経細胞を感染できるウイルスである。ヘテロロガスな核酸配列を組込んだアデノウイルス、レトロウイルスまたはＡＡＶに由来するベクターは、文献に記載されている［Akliら、Nature Genetics 3（1993）224；Stratford-Perricaudetら、Human Gene Therapy 1（1990）241；欧州特許出願公開第185 573号明細書、Levereoら、Gene 101（1991）195；Le Gal la Salleら、Science 259（1993）988；RoemerおよびFriedmann,Eur.J.Biochem.208（1992）211；Dobsonら、Neuron 5（1990）353；Chioccaら、New Biol.2（1990）739；ミヤノハラら、New Biol.4（1992）238；国際特許出願公開第91/18088号明細書］。
有利には、本発明の組換えウイルスは欠陥ウイルスである。“欠陥ウイルス”という用語は、標的細胞中で複製できないウイルスを言う。したがって一般的に、本発明の枠組み中で使用される欠陥ウイルスのゲノムは、感染細胞中で少なくとも該ウイルスの複製に必要な配列が欠けている。これらの領域は除去される（完全に、または部分的に）か、あるいは非機能的にされるか、あるいは他の配列、特に核酸に置き換えられることができる。これにもかかわらず欠陥ウイルスは好ましくはそのゲノム中にウイルス粒子の被包化に必要な配列を保存している。
本発明の核酸配列を欠陥組換えアデノウイルスに組込んだ状態で使用することが特に有利である。
実際、構造および特性がかなり変化した様々な血清型が存在するが、これらはヒト、そして特に免疫抑制個体に対して病原性ではない。さらに、これらのウイルスは感染した細胞のゲノムに組み込まれず、そして外因性ＤＮＡの巨大な断片を組み込むことができる。様々な血清型の中でも、２または５型アデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）が、本発明の枠組み内で好ましい。Ａｄ５アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域である。
本発明の特別な態様は、少なくとも上記の２つの核酸を含んで成るベクター、特にウイルスベクターから成る。
本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスととりわけ上記定義の核酸配列を持つプラスミドとの間の相同組換えにより調製できる［Levreroら、Gene 101（1991）195；Graham EMBO J.3（12）（1984）2917）。相同組換えは、該ウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系中に同時−トランスフェクションした後に生成される。使用する細胞系は組換えの危険性を回避するように、好ましくは組換え状態で（ｉ）該要素により形質転換できるべきであり、そして（ii）欠陥ウイルスのゲノムの部分を相補できる配列を含むべきである。欠陥組換えアデノウイルスの調製に使用できる系の例として、特にそのゲノム中にAd5アデノウイルスのゲノムの左部を組み込んだ（12％）ヒト胚腎臓系293［Grahamら、J.Gen.Virol.36（1977）59］を挙げることができる。欠陥組換えレトロウイルスの調製に使用できる系の例として、ＣＲＩＰ系を挙げることができる［DanosおよびMulligan,PNAS 85（1988）6460］。
次に操作したウイルスを従来の分子生物学的技術により回収し、そして精製する。
また本発明の主題は、少なくとも１つの上記定義の組換えウイルスを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下または目内投与等のために配合できる。
好ましくは医薬組成物は、注射することができる配合物のために医薬的に許容できる賦形剤を含む。これらは特に塩溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等、あるいはそのような塩の混合物）、滅菌水、等張液または乾燥組成物、特に凍結乾燥した組成物であってよく、これらは場合に応じて滅菌水または生理塩溶液の添加により、注射溶液が構成されてもよい。
投与に使用される核酸（配列またはベクター）の用量は、様々なパラメーター、そして特に使用する投与様式、関連する病因、発現する核酸、あるいは所望する治療期間に従い調整できる。一般的に本発明の組換えウイルスに関して、これらは10⁴−10¹⁴pfu/ml、好ましくは10⁶−10¹⁰pfu/mlの用量の状態で配合され、そして投与される。pfuという用語は（“plaque forming unit：プラーク形成単位”）は、ウイルス溶液の感染力に相当し、そして適当な細胞培養物を感染させ、そして一般的に48時間後に感染細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための技術は文献に詳細に記載されている。
そのような医薬組成物は神経変性疾患の治療および／または予防のために、そして特に虚血症、低酸素症、無酸素症、低血糖症、てんかん性の発作あるいは大脳および脊髄外傷に合併する神経変性の治療および／または予防のために、またはハンチングトン舞踏病、アルツハイマー疾患、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症の治療および／または予防にのために、ヒトに使用することができる。
本発明は以下の説明をするものであって制限するものではない実施例によりより完全に記載されている。
図の説明
図１：皮質ニューロンの初期培養物に対する、抗−ｐ５３アンチセンス核酸による、グルタミン酸塩により誘導された細胞死の阻害。
一般的なクローニング技法
プラスミドＤＮＡの調製的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースおよびアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール−クロロホルム抽出、生理的媒質中でのＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌の形質転換等の分子生物学で従来から使用されている方法は、当業者に周知であり、文献に豊富に記載されている［Maniatisら、“モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル：Molecular Cloning,a Laboratory Manual”コールドスプリングハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー、N.Y.,1982；Ausubel F.M.ら、（編集）、“分子生物学の最新の方法：Current Protocols in Molecular Biology”、ジョン ウィリー アンド サン（John Wiley & Sons)、ニューヨーク、1987］。
pBR322型およびpUC型のプラスミドならびにM13シリーズのファージは、市販されているものである（ベセスダリサーチラボラトリーズ：Bethesda Research Laboratories）。
ライゲーションのために、ＤＮＡ断片をその大きさに従いアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファージT4 DNAリガーゼ（バイオラボズ：Biolabs）の存在下で、供給元の推奨に従いインキューベーションすることができる。
5'粘着末端のフィリングは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（バイオラボズ）のクレノー断片で、供給元の仕様に従い行うことができる。3'粘着末端の破壊は、ファージT4 DNAポリメラーゼ（バイオラボズ）の存在下で、製造元の推奨に従い行う。5'粘着末端の破壊は、S1ヌクレアーゼで制御された処理により行う。
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロ部位特異的突然変異誘発法は、Taylorらにより開発された方法［Nucleic Acids Res.13（1985）8749-8764］に従い、アマルシャム（Amersham）により販売されているキットを使用して行うことができる。
ＤＮＡ断片の酵素的増幅、いわゆるＰＣＲ［Polymerase-catalysed Chain Reaction：ポリメラーゼ−触媒連鎖反応、Saiki R.K.ら、Science 230（1985）1350-1354；Mullis K.B.およびFaloona F.A.,Meth.Enzym.155（1987）335-350］法は、“ＤＮＡサーマルサイクラー”（パーキンエルマーシータス：Perkin Elmer Cetus）を使用して、製造元の仕様に従い行うことができる。
ヌクレオチド配列の確認はSangerらにより開発された方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74（1977）5463-5467］により、アマルシャムが市販しているキットを使用して行うことができる。
実施例
実施例１：ｐ５３遺伝子抑制による、虚血性にされたマウス中の梗塞容量の減少。
この実施例は、ｐ５３遺伝子の抑制が虚血性となったマウス中の梗塞の容量に対して及ぼす効果を記載する。そのために、中大動脈を閉鎖することによりマウスに虚血を誘発し、そして梗塞の容量を測定し、そして次に比較した。
手順：動物（C57/Blc 9から12週齢のオスマウス、ゲンファーム、デンマーク；野生型 ホモ接合体またはΔｐ５３）を、酸素、亜酸化窒素および1.8％ハロタンの混合物で麻酔をかけ、全手術工程中、この条件下に維持した。直腸の温度を37℃＋／−0.5に、加熱カバーで維持した。左中大脳動脈を、二極性クリップで電気凝固法により麻痺させた。傷を縫い合わせ、そして動物を30℃の部屋に24時間置き、餌と水は自由に摂取させた。24時間後、動物を頸部切断により屠殺した。脳を取り出し、-30℃のイソペンタン浴に浸し、そして次に-80℃に保存した。40μmの組織片を-20℃の低温保持装置中で、500μm毎の割合で、梗塞が現れたところからそれが消失するように作成した。これらの切片を次にCresylバイオレットで染色した。梗塞の容量は画像分析により測定する。統計的分析は、様々な値の同質性を確認した後、独立した群についてステューデントｔ試験により行う。様々な値が同質ではなかった場合、Wilcoxonの非パラメーター試験を使用した。
結果：得られた結果を以下の表に示す。

これらの結果は、ｐ５３遺伝子を発現していないマウス中の虚血後の梗塞容量が、20％のオーダーで減少したことを示す。したがってこれらの結果は、ｐ５３活性の抑制が神経変性を減少させることができることを示している。
実施例２：皮質ニューロンの初期培養物のグルタミン酸塩により誘導される細胞死の、抗−ｐ５３アンチセンス核酸による抑制
この実施例は、初期培養物中の胚性ラット皮質ニューロンについて、グルタミン酸塩により誘導される細胞死に対する、抗−ｐ５３アンチセンス核酸の効果を記載する。
グルタミン酸塩は中枢神経系を刺激する主要な神経伝達物質である。しかし、異常に長時間、または生理的濃度よりも高濃度のグルタミン酸塩にさらされると、エキシサイトトキシティー（excitotxity）と呼ばれる神経毒性を起こすことがある［Olney Adv.Exp.Med.Biol.203（1986）631］。多くの実験に関する論争は、この種の毒性が虚血、低酸素症、低血糖症、てんかん性発作、あるいは大脳外傷に伴う神経変性の原因であることを示唆している［Choi,J.Neurobiol.23（1992）1261］。このエキシサイトトキシティーは、ハンチングトン舞踏病［Youngら、Science 241（1988）981］、およびアルツハイマー疾患［Kohら、Brain Res.533（1990）315；Mattsonら；J.Neurosci.12（1992）376］のような疾患の病因にも関与していると考えられている。この実施例は、グルタミン酸塩の毒性作用が、ｐ５３タンパク質の発現レベルを減少できるアンチセンス核酸の存在により部分的に抑制されることを示す。
アンチセンス核酸の調製および配列：アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全自動ヌクレオチド合成器により合成した（Maniatis）。オリゴヌクレオチドの配列は次のとおりである：５’−ＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１）。
抑制の研究：胎児性のウイスター ラット皮質細胞（E17）を、Dichterの方法に従い単離し［Brain Res.149（1978）279］、6-ウェル Costarプレートで、10μg/mlのインスリン、10μg/mlのトランスフェリン、10ng/mlの亜セレン酸ナトリウム、10nMのプロゲステロン、1nMのトリヨードサイロニンを含むDMEM培地中（ダルベッコの改良イーグル培地）で培養し（35分間、6×10⁵細胞／プレート）、そしてオーブン中（37℃、5％CO2）で保存した。2μMの上記抗-ｐ５３アンチセンス核酸を、接種中、および次に１日および２日目に培養物へ加えた。グルタミン酸塩（5mM）を２日目に投与し、同時に抗−ｐ５３アンチセンス核酸を投与した。グルタミン酸塩により誘導された毒性を培養24時間後に、Manthorpeらにより記載された方法［Dev Brain.res 25（1986）191］に従い、ミトコンドリア活性を測定することにより決定した。
得られた結果を図１に表す。これらは、抗−ｐ５３アンチセンス核酸がグルタミン酸塩に誘導された毒性を約25％まで減少できることを明らかに示している。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名前：ローヌ プーラン ローラー エス．エー．
（Ｂ）通り：レイモンド アロン通り、２０
（Ｃ）市：アントニー
（Ｄ）国：仏国
（Ｅ）郵便番号：９２１６５
（ii）発明の名称：特に神経変性疾患の治療のための医薬組成物およびその使用
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター読み取り先：
（Ａ）媒体：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換型
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃１．０
バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：有り
（xi）配列の記載：配列番号１：

（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列番号２：

Claims (8)

1. ｐ５３タンパク質の活性を少なくとも部分的に阻害する化合物を有効成分とする神経変性疾患の治療および／または予防用の医薬製剤。
2. 化合物が転写、翻訳または翻訳後のレベルでｐ５３タンパク質の合成に、および／またはｐ５３のＤＮＡへの結合に作用することを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
3. 化合物が、ｐ５３のＤＮＡへの結合のための部位の全部または一部を含んで成る二本鎖核酸であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬製剤。
4. 化合物がｐ５３の活性と拮抗することができるｐ５３タンパク質の突然変異状態をコードする核酸であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬製剤。
5. 化合物が、転写または翻訳レベルでｐ５３タンパク質の発現レベルを減少させることができる、アンチセンス核酸であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬製剤。
6. アンチセンス核酸が、ｐ５３細胞性ｍＲＮＡの翻訳を阻害できるアンチセンスリボ核酸をコードするＤＮＡであることを特徴とする、請求項５に記載の医薬製剤。
7. 核酸がベクターの一部を形成することを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
8. 核酸がウイルスベクターの一部を形成することを特徴とする、請求項７に記載の医薬製剤。

Images