ES2234730T3 - Agente antivirus. - Google Patents

Agente antivirus.

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Abstract

Agente antivirus de hepatitis, que comprende los siguientes componentes (A), (B), (A) una secuencia de nucleótido que dirige la síntesis de una cadena complementaria del virus de la hepatitis; (B) una secuencia de nucleótido que contiene, como mínimo, una zona reguladora enlazada operativamente a un gen estructural que codifica una toxina que muestra un LD50 para vertebrados no superiores a 100ng/kg de peso corporal; en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina está dispuesta en dirección antisentido.

Description

Agente antivirus.
La presente invención se refiere a un agente antivirus que actúa contra virus RNA (+) de una sola cadena. En particular, la presente invención se refiere a un agente antivirus que contiene un constructo que comprende una secuencia de nucleótido capaz de dirigir la síntesis de la cadena complementaria y un gen que codifica una toxina operativamente enlazada a un regulón, de manera que el gen que codifica la toxina está orientado de manera invertida en el constructo. La presente invención se refiere también a la utilización de dicho agente antivirus para la preparación de un medicamento para tratar enfermedades víricas.
Los virus de cadena única RNA (+) son virus de cadena positiva sin etapa de DNA durante la propagación en una célula huésped. Los virus de este grupo multiplican su RNA genómico por medio de enzimas codificadas por el propio virus, designadas de manera genérica RNA polimerasa, RNA dependiente (RdRp). En la mayor parte de casos, dicho RdRp es un complejo de las llamadas proteínas no estructurales (NS), que no forman parte del virión.
Este complejo de enzimas de proteínas NS reconoce secuencias/regiones no traducidas del RNA vírico (designado UTR), que están situadas de manera general en el extremo 5' y/o 3' del genoma vírico, cada uno de ellos, y efectúan la síntesis de la cadena complementaria, es decir, la cadena (-) del RNA (+) de una sola cadena (Ekland y otros, Nature 382 (1986), 373-376). Además, este complejo se relaciona también con la síntesis de múltiples copias del RNA vírico genómico en respuesta al RNA de doble cadena, el dúplex de la cadena de RNA formada de sentido (+) y antisentido (-) (Bartenschlager y otros, J. Gen. Vir. 71 (2000), 1497-1505).
Uno de los elementos más importantes de dichos virus ss(+)RNA son varios subgrupos del virus de la hepatitis del cual han sido descubiertos hasta el momento. El virus de la hepatitis C (HCV), el tipo más habitual, es un virus con envoltura, con cadena positiva que está relacionado desde el punto de vista de evolución con los flavivirus y pestivirus. El genoma de HCV consiste en una región no traducida 5' (5'-UTR), un armazón largo de apertura abierta (ORF) con un número de nucleótidos comprendido entre 9030 y 9099, y un 3'-UTR. Se ha indicado que el extremo 3' del genoma contiene un tramo corto de poli(A) en cepas de tipo I, no obstante, dicho descubrimiento no ha sido confirmado en cepas de tipo II, III o IV. Las secuencias en el 5'-UTR se ha indicado que muestran control translacional negativo con respecto a la expresión del gen vírico.
El complejo RdRp de HCV se ha observado que interacciona con una región que tiene entre 27 y 45 nucleótidos en el 3'-UTR que funciona como indicador estructural de la iniciación de la cadena complementaria (la cadena (-)) y eventualmente la replicación genómica vírica.
El grupo de virus de la hepatitis C es responsable para la mayor parte de casos de hepatitis no-A, no-B. Si bien la hepatitis no-A, no-B puede ser provocada por muchos virus distintos, la causa principal es HCV. La infección se transmite a través de las transfusiones de sangre, infusión percutánea por la utilización ilícita de drogas, trasplante de órganos renales y transferencia maternal-neonatal. Hasta 20% de las infecciones esporádicas de hepatitis son provocadas por HCV.
La asociación de virus de hepatitis C en hepatitis post-transfusión (>95% de los casos) y la observación subsiguiente de que la infección con este virus, más que con el virus de la hepatitis B, se correlaciona fuertemente con el desarrollo de carcinoma hepatocelular, y cirrosis de hígado ha conducido a intensos estudios de la biología molecular de los genes víricos.
Hasta el momento, no existe medicación potente disponible para el tratamiento de las enfermedades víricas producidas por virus ss(+) RNA, tal como por ejemplo, las enfermedades del pie y de la boca o fiebre Dengue. Para la hepatitis producida por HCV una terapia conocida comporta la administración de medicamentos que contienen
IFN-\alpha y/o IFN-\gamma. No obstante, la administración de los medicamentos por sí solos no demostró ser muy eficaz y tampoco una aplicación combinada de ambas sustancias produjo los efectos deseados (Samuel y otros, Virology 130 (1983), 474-484).
Por lo tanto, existe una marcada necesidad en esta técnica de conseguir un medicamento substantivo para tratar enfermedades víricas producidas por virus ss(+)RNA, tales como HCV.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar dichos medios para el tratamiento de enfermedades víricas producidas por virus ss(+)RNA.
Este problema ha sido solucionado dando a conocer un agente antivirus dirigido contra virus (+) RNA de una sola cadena, comprendiendo los componentes (A) y (B), de manera que el componente (A) es una secuencia de nucleótido que dirige la síntesis de la cadena complementaria del virus (+) RNA de cadena única, y en el que el componente (B) es una secuencia de nucleótido que contiene, como mínimo, una región reguladora asociada de forma operativa a un gen estructural que codifica una toxina, de manera que la secuencia de nucleótido que codifica la toxina está orientada en dirección inversa con respecto a la cadena (+) (cadena con sentido).
De acuerdo con otra realización preferente, el componente (A) se deriva de la región no traducida 5' o 3' de un virus ss(+)RNA, tal como el virus de la hepatitis de tipo B, C, D o E, el virus de Dengue, flaviviridae no clasificadas, virus de Rubella, virus de la fiebre amarilla, virus de diarrea vírica bovina, virus de la fiebre del cerdo, virus de enfermedades de boca y pie. De acuerdo con otra realización preferente, dicho componente (A) se deriva de 3'-UTR del HCV o de una parte del mismo.
De acuerdo con otra realización preferente, la zona reguladora comprende una secuencia Shine-Dalgarno o el sitio de unión ribosomal interna (IRBS) del RNA genómico de la cepa de la vacuna de poliovirus Sabin 2.
La toxina puede ser cualquier toxina que muestre un LD50 para vertebrados no superior a 100 ng/kg de peso corporal y que es aceptada para su utilización en individuos tales como humanos o animales o incluso plantas (ver CDC Final Rules). De acuerdo con una realización preferente, la toxina es seleccionada del grupo que comprende la exotoxina de la difteria, la subunidad A de la exotoxina de la difteria, la toxina Shigella o la neurotoxina Disenteria.
El agente antivirus según la presente invención puede ser utilizado para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad vírica, la cual puede ser provocada por un virus de la hepatitis de tipo A, B, C, D y/o E, el virus de Dengue, flaviviridae no clasificada, virus de Rubella, virus de la fiebre amarilla, virus de Dengue, virus de diarrea vírica bovina, virus de fiebre del cerdo, virus de enfermedad de pie y boca.
En las figuras,
la figura 1 muestra de manera esquemática el principio de la construcción de un antivirus genético; y
la figura 2 muestra esquemáticamente la estructura de un GAPr.
Durante los extensos estudios que han llevado a la invención, el inventor ha diseñado un nuevo concepto para tratar enfermedades víricas producidas por virus ss(+)RNA, que ha sido designado Programa Antivírico Genético
(GAPr).
A este respecto, la presente invención da a conocer un constructo que comprende dos componentes principales (A) y (B). El componente (A) es una secuencia de nucleótido que produce una síntesis de una segunda cadena, que es complementaria a la cadena co-sentido del constructo. Dado que en la mayor parte de los virus ss(+)RNA conocidos hasta el momento estas secuencias están situadas en las regiones no traducidas 5' y/o 3' del virus, estas secuencias o partes funcionales de las mismas son las secuencias preferentes a incorporar en el constructo. Se observará que las secuencias de nucleótido se pueden derivar del virus a tratar, pero que también se pueden aplicar otras secuencias de nucleótido siempre que posibiliten la síntesis de la cadena (-) por el complejo de polimerasa del virus a tratar. Esta secuencia de nucleótido es derivada de modo más preferente del virus ss(+)RNA a tratar, dado que dicho constructo garantiza de manera segura una síntesis de la cadena (-) solamente en presencia del propio virus.
En el caso del HCV, este componente (A) es preferentemente el 3'-UTR del tramo de nucleótido con un número de nucleótidos entre 27 y 45 en el 3'-UTR que es sabido que funciona como indicador estructural de la iniciación de la cadena complementaria (-).
El componente (B) contiene dos constituyentes, una región reguladora y una secuencia de nucleótido que codifica una toxina.
La región reguladora está diseñada para iniciar la translación del gen que codifica la toxina y, por lo tanto, está operativamente relacionada con el mismo. Este regulón puede ser una secuencia de nucleótido que se sabe que efectúa dicha iniciación de translación y que es preferentemente un regulón derivado del individuo a tratar, tal como la secuencia Shine Dalgarno o la toxina utilizada. En este último caso, el regulón constituye una parte integral del nucleótido que codifica la toxina. No obstante, la translación puede ser también efectuada por medio de sitios de unión ribosómica vírica, tal como el lugar de unión ribosómico interno (IRBS) del RNA genómico de la cepa de la vacuna de poliovirus Sabin 2. De acuerdo con una realización preferente, el regulón contiene una secuencia de iniciación de translación utilizada por el virus a tratar en sí mismo, a efectos de proteger una translación no deseada del polipéptido en células que no están infectadas por el virus.
El segundo constituyente del componente (B) es una secuencia de nucleótido que codifica una toxina. No obstante, en el constructo, esta secuencia de nucleótido está orientada de forma invertida, es decir, inversa con respecto a la dirección 5' \rightarrow 3' de la cadena (+) (cadena con sentido) del constructo, de manera que después de la formación no deseada de una molécula de RNA a partir del constructo en una célula huésped, nuevamente se forma la cadena con sentido del constructo (con la toxina dispuesta en dirección inversa), lo que no da lugar a un producto de gen, es decir, un polipéptido de toxina.
No obstante, cuando el constructo entra en una célula, que contiene el virus ss(+)RNA, que entra en una célula infectada, el componente (A) del constructo asegurará, junto con el complejo RdRp proporcionado por el virus de la célula, que la cadena (+) del constructo será transcrita a la cadena (-)RNA, que también se multiplicará dentro de la célula. En esta cadena (-)RNA del constructo formado de esta manera, el nucleótido que codifica una toxina se encuentra en una dirección que posibilita su translación dentro de un polipéptido, con el efecto de que la toxina formada en la célula eventualmente exterminará la célula. Dado que la formación de la cadena (-)RNA del constructo tendrá lugar solamente en células infectadas por un virus, es decir, en células que contienen el complejo RdRp, el agente antivirus de la presente invención proporciona una exterminación selectiva de células infectadas.
A efectos de proporcionar la formación apropiada de la cadena (-)RNA del constructo, dicho componente (A) necesita estar dispuesto de manera tal, que la cadena (-) y, de manera similar, las múltiples copias de la misma sintetizadas en la célula, contengan tanto el regulón como la secuencia de nucleótido que codifica la toxina. Por ejemplo, el componente (A) puede estar situado más arriba del componente (B), pero más abajo del regulón. De manera similar, el componente (A) puede estar situado más abajo del componente (B), pero en una distancia que la molécula de RNA formada por medio de dicho componente (A) será todavía una parte del mismo. Esto se puede conseguir, por ejemplo, situando el componente (A) adyacente al componente (B) o modificando la secuencia de nucleótido más abajo del componente (B) de manera que se forme un largo transcrito que incluya el componente (A).
La toxina puede ser cualquier toxina capaz de exterminar la célula, en la que se produce. De acuerdo con normas habituales, estas toxinas mostrarán un LD50 para vertebrados no superior a 100 ng/kg de peso corporal y serán aceptadas para su utilización en individuos, tales como humanos o animales o incluso plantas (ver CDC Final Rules). Son ejemplos de toxinas preferentes la exotoxina de la difteria, la subunidad A de la exotoxina de la difteria, la toxina de Shigella o la neurotoxina de disentería.
El constructo como tal puede ser una secuencia de DNA o RNA, tal como vectores plásmidos o vectores víricos. Son ejemplos de esos vectores pCI (Promega), pMCV-\beta, pCDM8, pcDNA 1.1 (Invitrogene), etc.
Para llevar el constructo dentro de una célula huésped, el constructo es llevado a una forma galénica adecuada y administrado al paciente. Estas formas galénicas incluyen soluciones para inyecciones o aplicaciones subcutáneas, instilación nasal, formas de medicamentos perorales, encapsulado en liposomas, preparados microencapsulados direccionados, o inclusión en un genoma vírico.
A efectos de conseguir una mayor estabilidad en el constructo con respecto a la degradación enzimática o química, los nucleótidos pueden encontrarse presentes también en forma modificada, que puede aportar el experto en la materia basado en sus propios conocimientos técnicos. Son ejemplos de dichos medios de estabilización la formación de casquete ("capping"), metilación o utilización de análogos de los nucleótidos habituales.
Tal como se ha mencionado anteriormente, cuando el constructo entra en una célula del cuerpo del individuo a tratar, la secuencia de nucleótido de más abajo del promotor puede ser transcrita por medio de enzimas celulares en una molécula de RNA que aloja la toxina en dirección antisentido (componente (B) y componente (A)). No obstante, dado que dicha molécula de RNA está sometida a un proceso de degradación normal en la célula, desaparecerá a lo largo del tiempo. No obstante, en el caso en que se encuentre presente en dicha célula un virus (a tratar), este virus proporcionará el complejo RdRp capaz de llevar a cabo la síntesis de la cadena (-) de la cadena (+) del constructo, o de cualquier molécula de RNA que comprenda dicho componente (A).
Por lo tanto, en este último caso, se formará una molécula de RNA que contiene ahora la secuencia de nucleótido que codifica la toxina en una dirección de lectura correcta y, por consiguiente, la toxina será sintetizada en la célula, exterminando eventualmente la célula.
Como consecuencia, la presente invención da a conocer la exterminación selectiva de células infectadas por un virus (a tratar), dado que solamente en dichas células la "toxina antisentido" será transcrita en la dirección de sentido para su translación en un polipéptido. En células libres de virus, no existe formación de la cadena (-) que comprende el gen que codifica la toxina en dirección de sentido, de manera que no se producirán daños en las células no infec-
tadas.
Sin desear limitación por ninguna teoría, se cree además que en el proceso de muerte, partes de la célula infectada pueden pasar a ser parte de los viriones, lo que comprende la incorporación de una o varias copias del constructo multiplicado en el virión y su transferencia a otras células a infectar. Por lo tanto, el constructo presente puede no solamente exterminar selectivamente células infectadas por los virus sino que proporciona asimismo transferencia a células adicionales infectadas.
Por lo tanto, la presente invención proporciona las siguientes ventajas. En primer lugar, se produce una exterminación selectiva de células infectadas con virus que contienen ss(+)RNA. En segundo lugar, el constructo puede ser insertado en la célula como DNA, cuando forma parte de un plásmido vector, o como RNA, cuando se introduce después de su transcripción, y asimismo como resultado de una multiplicación anterior. En tercer lugar, el constructo no es capaz de formar la toxina sin el aparato enzimático vírico que hace seguro el presente sistema. En cuarto lugar, el constructo es capaz de multiplicación dentro de la célula huésped, de manera que se pueden administrar al individuo dosis mínimas.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitación de la misma.
Ejemplo 1 Construcción del vector
La estructura GAPr, que se ha mostrado en la figura 2 y que está limitada por los sitios para restricción de endonucleasas Not I y Sif I, está formada por 2 partes. La parte reguladora estará presentada por la secuencia IRES del RNA genómico de la cepa de vacuna Sabin 2 del virus de polio (PV), su parte estructural, por el ORF de la subunidad A de la exotoxina de la difteria con un codón de interrupción insertado.
La estructura GAPr fue insertada después del subclonado de los dos cDNA obtenidos por RT-PCR (con polimerasa resistente al calor Pfu II que tiene actividad de lectura de prueba) sobre la matriz genómica de RNA tomada de un virus que contiene (+)ssRNA (en el caso de HCV, la sangre de un paciente fue la fuente del RNA genómico). Uno de los cDNA fue obtenido a partir de los primeros 2,8 kb del RNA genómico, incluyendo el 5'-UTR y las proteínas estructurales que codifican el marco. El otro se tomó del 3'-UTR. El tratamiento de los productos de amplificación y GAPr con las endonucleasas de restricción anteriormente indicadas conduce a la posibilidad de su enlace en una reacción con ligasa T4-bacteriófago. La GAPr® fue clonada en orientación inversa con respecto a las proteínas estructurales ORF. Los constructos resultantes pueden ser incorporados en cualquiera del polienlazador de plásmidos: pCl® (Proega), pCMVB® (Invitrogene), y pcDNA3,1® (Clonetech).
Los plásmidos de DNA pCl::RNA_{HCV}::GAPr fueron introducidos en las células de la línea HepG2 con ayuda de la transformación con el método Transfectin® (frecuencia 2.550-1.200 clones por 10^{5} células). Las células transformadas fueron seleccionadas en el medio RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino y geneticina (0,5 mg/ml). Los clones resistentes a geneticina (G418^{R}) fueron utilizados para determinar antígenos específicos de HCV, RNA SRNA_{HCV} y GAPr.
24-72 horas después de la electroporación se empezaron a detectar en las células G418^{R} los antígenos específicos de HCV y RNA, así como la toxina de difteria. Se demostró que no se observaron signos morfológicos de muerte de las células G418^{R} por la acción de la toxina de la difteria después de 72 horas o más tarde (hasta 14 días). En 14 días, se detectaron partículas parecidas a HCV conteniendo SRNA_{HCV} en el medio de cultivo de las células G418^{R}. Las células HepG2 de hepatocarcinoma humano que expresan proteínas NS (línea HepG2ns) se demostraron altamente sensibles al medio en el que se cultivaron las células G418^{R}, disueltas hasta una concentración de 1:1.600.
Ejemplo 2
Se utilizó HCV-"antivirus" como RNA antivírico. La amplificación fue conseguida con intermedio de PCR con termopolimerasa Pwo II, 2 cebadores oligonucleótidos
5'-TAATACGATTCACTATAGGGAATTCCACAGCTGGGCGG-A-3'
5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTA-3'
y la matriz de plásmido pCl:: DNA (SRNA^{HCV}::GAPr). El amplicón fue utilizado para su transcripción por el bacteriófago T7 RNA-polimerasa. El RNA obtenido fue insertado en las células de la línea HepG2NS por electroporación. 24 horas después de la electroporación la toxina de la difteria pudo ser detectada en las células. La primera toxina de difteria fue detectada en el curso de 48-52 horas después de la electroporación y continuó siendo detectada durante 120 horas.
En 6 horas, se pudieron detectar antígenos específicos de HCV y SRNA_{HCV} y la toxina de la difteria en las células. La toxina en sí misma pudo ser detectada por el método ELISA. Se detectaron signos morfológicos evidentes de destrucción celular 28 horas después de electroporación. Se detectaron partículas parecidas a HCV conteniendo SRN_{HCV} en el medio de cultivo celular porado con línea HepG2NS en 14 días. Las células no tratadas de línea HepG2Ns se mostraron altamente sensibles al medio en el que se habían cultivado células poradas, con disolución hasta una concentración de 1:100.
<110> Technologie Intègrale (Tecnología Integral)
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anti-RNA Virus Composition (Composición de virus anti-RNA)
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<130> 50553
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2,1
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<210> 1
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<211> 39
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis C Virus (Virus de Hepatitis C)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
taatacgatt cactataggg aattccacag ctgggcgga 
\hfill
39 
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<210> 2
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Hepatitis C Virus (Virus de Hepatitis C)
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<400>
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcacgcaga aagcgtcta 
\hfill
19

Claims (8)

1. Agente antivirus de hepatitis, que comprende los siguientes componentes (A), (B),
(A)
una secuencia de nucleótido que dirige la síntesis de una cadena complementaria del virus de la hepatitis;
(B)
una secuencia de nucleótido que contiene, como mínimo, una zona reguladora enlazada operativamente a un gen estructural que codifica una toxina que muestra un LD50 para vertebrados no superiores a 100 ng/kg de peso corporal;
en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina está dispuesta en dirección antisentido.
2. Agente antivirus, según la reivindicación 1, en el que el componente (A) se deriva de las regiones 5' y/o 3' no traducidas de virus de hepatitis tipo B, C, D y/o E.
3. Agente antivirus, según la reivindicación 2, en el que el componente (A) se deriva de la zona 3' no traducida del virus de HCV.
4. Agente antivirus, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región reguladora comprende la secuencia Shine-Dalgarno o el sitio de unión ribosómica interna (IRBS) del RNA genómico de la cepa de vacuna poliovirus Sabin 2.
5. Agente antivirus, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la toxina es seleccionada entre el grupo que comprende exotoxina de difteria, subunidad A de la exotoxina de difteria, toxina de Shigella, toxina de Disenteria.
6. Agente antivirus, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que comprende un vector DNA o RNA.
7. Utilización del agente antivirus, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hepatitis.
8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que la enfermedad vírica es provocada por un virus de hepatitis tipo B, C, D y/o E.
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