HUT69956A - Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides - Google Patents

Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides Download PDF

Info

Publication number
HUT69956A
HUT69956A HU9300364A HU36493A HUT69956A HU T69956 A HUT69956 A HU T69956A HU 9300364 A HU9300364 A HU 9300364A HU 36493 A HU36493 A HU 36493A HU T69956 A HUT69956 A HU T69956A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
analog
rna
ucucccucuc
oligonucleotide analog
Prior art date
Application number
HU9300364A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9300364D0 (en
Inventor
Lex M Cowsert
David J Ecker
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9300364D0 publication Critical patent/HU9300364D0/hu
Publication of HUT69956A publication Critical patent/HUT69956A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

KIVONAT
A találmány tárgya kompozíció és eljárás influenza A, B és C vírus fertőzések kezelésére és diagnosztizálására. A találmány értelmében oliognukleotidokat és oligonukleotid analógokat készítenek, amelyek specifikusan komplementerek a H2N2 virális RNS-sel, illetve a transzkripció indítóhelyekkel, transzláció indítóhelyekkel, 5*-nemtranszlatált szekvenciákkal, 3’-nemtranszlatált szekvenciákkal, infulenzavírus mRNS intron/exon kapcsolódásokkal, továbbá olyan RNS szekvenciákkal, amelyek a virális RNS hasításában vagy víruspakolásban vesznek részt. A kapott oligonukelotidok és oligonukleotid analógok influenza A, B vagy C fertőzésben szenvedő emberek és állatok kezelésére alkalmazhatók.
J
6 Közzétételi
PÉLDÁNY
Képviselő:
DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA KFT.
woG
ELJÁRÁS INFLUENZAVÍRUS GÁTLÁSÁRA ANTISZENSZ OLIGONUKLEOTIDOKKAL
ISIS PHARMACEUTICALS, INC., Carlsbad, Kalifornia,
Amerikai Egyesült Államok
Feltalálók:
COWSERT Lex M., Carlsbad
ECKER Dávid J., Carlsbad
Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok
A bejelentés napja: 1991. 08. 13.
Elsőbbsége: 1990. 08. 14. (567 287)
Amerikai Egyesült Államok
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US91/05742
A nemzetközi közzététel száma: WO 92/03454
76829-7418-GI
A találmány tárgyát influenzavírus diagnosztizálása, kutatási reagensei és gyógyítása képezi. Pontosabban, a találmány a sejtek influenzavírusok által való megfertőzésében szerepet játszó bizonyos virális ribonukleinsavak és hírvivő ribonukleinsavak közötti antiszensz oligonukleotidok kölcsönhatásaival foglalkozik. Olyan oligonukleotidokat állítunk elő, amelyek az influenzavírusok virális RNS szegmenseihez, illetve bizonyos hírvivő RNS-ekhez hibridizálódnak, amelyek az influenzavírus NP, Ml, M2, NS1, NS2 vagy egyéb kulcsfehérjéit kódolják, beleértve az RNS polimerázt, a hemagglutinint, nukleoproteint vagy a neuraminidázt. Olyan oligonukleotidokat állítunk elő továbbá, amelyek az RNS illesztéséhez vagy a vírus pakolásához szükséges virális RNS szekvenciákhoz hibridizálódnak. Ezen oligonukleotidokról kiderült, hogy módosítják az RNS aktivitását; ennek eredménye a fertőzés, diagnózis, tünetenyhítés, terápiás hatás módosítása.
A történeti feljegyzések azt mutatják, hogy az influenzavírusok az emberek mortalitási és morbiditási fő okainak egyikét képezik. Szabályos időközönként jelentkeznek járványok, amelyeknek a súlyossága változó, de mindig jelentős számú megbetegedést és halálesetet okoznak, főleg az idősebb emberek körében. Az influenzajárványok okaként először R.E. Shope jelölte meg a vírusokat, aki kimutatta, hogy megszűrt nyállal az influenzafertőzés terjeszthető. Az influenzavírusokat jelenleg három csoportba osztják; A, B és C típusokra, belső antigén fehérjéik különbsége alapján.
Az influenzafertőzés akut tünetegyüttest okoz: fej3 • · 4 ·· · • •4 44··* • ··· ···· fájást, köhögést, lázat és általános gyengeséget. Súlyos esetekben, illetve korábbi eredetű tüdő- vagy keringési betegség megléte esetén kórházi kezelésre van szükség. A leggyakoribb szövődmény a közvetlen vírusfertőzés, illetve másodlagos bakteriális vagy virális fertőzés következtében fellépő tüdőgyulladás. Az influenzavírus-fertőzés klinikai jellemzőinek összefoglalása Douglas, R.G., New England Journal of Medicine, 322. 443-450 (1990) irodalmi helyen található .
Az antigén-sodródás következtében szabályos időközönként, általában évente új influenzavírus törzsek jelentkeznek, és beindítanak egy fertőzési ciklust, amely bejárja a világot. Nagyon keveset tudunk arról, hogy az egyes járványok hogyan indukálódnak. Nagyobb új influenzavírus altípusok ritkábban jelentkeznek, de egész világrészekre kiterjedő járványokat okozhatnak.
A súlyos komplikációknak kitett populációk esetén az influenzavírus elleni leghatékonyabb módszer a megelőzés. Hozzáférhető influenzavakcina használatával hatékony módon csökkenthetjük egy adott populációban a halálesetek számát, azonban a vírus állandóan változó természete miatt egy olyan vakcinának a kifejlesztése, amelynek megfelelő az összetétele ahhoz, hogy az adott pillanatban aktív összes vírustörzszsel szemben védelmet biztosítson, bonyolult és drága. Emellett a betegek együttműködési készsége a vakcinázásban általában nagyon csekély. Ezért nagyszámú, súlyos komplikációknak kitett beteg marad hatékony védelem nélkül.
Van néhány gyógyszer, amelyeknek van némi profilak4 • ·«· · · • · Λ · « ·· • ··· ···· tikus aktivitásuk az influenzavírus ellen. Egyik sem aktív azonban a B típusú vírussal szemben. Emellett általában nagyon korlátozott a terápiás felhasználásuk és nem használják széles körben a betegség kezelésére a tünetek fellépése után. Ezért világszerte igény van jobb terápiás hatóanyagokra az influenzavírus-fertőzés kezelésére.
Már ismertettek az influenzavírus gátlására antiszensz oligonukleotidok felhasználásával tett kísérleteket. Leiter és munkatársai foszfodiészter és foszforotioát oligonukleotidokat készítettek az influenza A és C vírusokkal szemben [Leiter, J., Agrawal, S., Palese, P. and Zamecnik, P.C., Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3430-3434 (1990)]. Ezek a kutatók csak a PB1 polimeráz gént, illetve a vRNS 3' régiójában az mRNS-t, valamint az mRNS 5' régióját célozták meg. Az influenza A vírus szekvencia-specifikus gátlását nem, jóllehet az influenza C vírusnak valamelyes specifikus gátlását megfigyelték. Más influenzavírus szegmenseket, illetve mRNS-eket nem céloztak meg.
Zerial és munkatársai leírták az influenza A vírus egy interkalálódó ágenshez kötött oligonukleotidokkal történő gátlását [Zerial, A., Thuong, N.T. and Helene, C., Nucleic Acids Research, 57, 9909-9919 (1987)]. Zerial és munkatársai nyolc vRNS szegmens 3' terminális szekvenciáját célozták meg. Oligonukleotid analógjukról leírták, hogy gátolja a vírus citopátiás hatását sejttenyészetben. A 169 787 számú európai szabadalmi leírás (Helene és munkatársai) interkalálódó csoporthoz kovalensen kötődő oligonukleotid vegyületeket közöl, amelyeknek nukleinsav-szekvenciája sze······· ·· • · · · · · ·· · • · · · · · ··· ·· ··· ·· ···
- 5 repet játszik egy nukleinsav replikációjában, illetve egy vagy több gén transzkripciójában/transzlációjában; továbbá olyan, interkalálódó csoporthoz kovalensen kötött oligonukleotidokat közöl, amelyek egy vírus vagy baktérium vagy parazita replikációjához, illetve fejlődéséhez szükséges szekvenciával komplementerek, valamint olyan, interkalálódó csoporthoz kovalensen kötött oligonukleotidokat ismertet, amelyek az influenza vagy herpesz vírus replikációjához vagy fejlődéséhez szükséges szekvenciával komplementerek vagy egy onkogénnel komplementerek.
A 82 110 494.0 számú európai szabadalmi bejelentésben (Krug és munkatársai) olyan oligonukleotidokat közölnek, amelyek egy 5'-metilezett lezáró struktúrát tartalmaznak, amely növeli az oligonukleotid affinitását az influenzavírus endonukleázhoz és transzkriptázhoz. Emellett a lezáró struktúrával rendelkező oligonukleotidokat módosítják, hogy megakadályozzák indító molekulaként való működésüket, például hosszuk 10 nukleotidnál kisebb; vagy meg vannak hoszszabbítva oly módon, hogy egy 3' terminális dezoximononukleotidot vagy egy 3' terminális 3’-O-metilezett ribonukleotidot tartalmaznak, vagy legalább 14, a cukor és/vagy bázisrészben és/vagy a nukleotid-kötésben módosított nukleotidot tartalmaznak.
Kabanov és munkatársai egy olyan oligonukleotidot szintetizáltak, amely komplementer az RNS polimeráz 3-at kódoló RNS hurokképző részével [Kabanov, A.V., Vinogradov, S.V., Ovcharenko, A.V., Krivonos, A.V., Melik-Nubarov, N.S., Kiselev, V.I. and Severin, E.S., FEBS, 259. 327-330 (1990)].
··· · ·· · ·· *·« * ··· · • · · · · · «·· ·· ·«· ♦♦ ·♦·
Oligonukleotidjukat egy undecil csoporthoz kötötték az 5' terminális foszfátcsoportnál. Azt találták, hogy oligonukleotid juk gátolta az influenza A vírus fertőzést MDCK sejtekben .
Jóllehet mindegyik említett kutató közölte, hogy elért némi sikert egy influenzavírus néhány funkciójának gátlásában, az influenzavírus megcélzására általános terápiás sémát még nem találtak. Emellett, jobb hatékonyságra is szükség van az influenzavírus elleni szerek esetén. Fennáll tehát az igény olyan antiszensz oligonukleotid analógok tervezésére, amelyek alkalmasak hatékony terápiás felhasználásra. Ezt a rég fennálló igényt nem elégítették ki az influenza antiszensz oligonukleotid terápiája területén végzett korábbi tevékenységek. Mások nem találták meg azokat a célpontokat, ahol az antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok ésszerű alkalmazási mennyiség mellett terápiásán hatásosak.
A találmány célja olyan készítmények kidolgozása, amelyek influenzavírus-fertőzések kezeléséra alkalmazhatók állatoknál, különösen pedig embernél.
A találmány célja továbbá olyan antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok előállítása, amelyek képesek az RNS vagy influenzavírusok funkcióit gátolni.
A találmány célja ezenkívül az influenzavírus-típusok diagnosztizálására szolgáló eszközök kidolgozása.
A találmány tárgyát tehát olyan oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok képezik, amelyek specifikusan hibridizálódnak az influenzavírusok RNS-ével. Az oligonuk7 • · ··· • · ♦ · · • · · · • · ·· • · · ··· ·« · leotidot vagy oligonukleotid analógot úgy tervezzük, hogy közvetlenül kötődjön az influenza RNS-hez antiszensz típusú kapcsolódás révén. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képesek az RNS működését gátolni: vagy a fehérjévé való transzlációját, a citoplazmába való átjutását, vagy bármely más olyan aktivitását, amely az általános biológiai funkciójához szükséges. Ha az RNS nem képes végrehajtani funkcióit, illetve azok egy részét, ennek eredménye az, hogy a vírus normális életciklusát szabályozó genomrész nem működik.
Előnyös, ha specifikus virális RNS részeket veszünk célba az antiszensz támadásra. Úgy találtuk, hogy az NP, Ml, M2, NS1 és NS2 gének különösen alkalmasak e megközelítéshez. Az NP, Ml, M2, NS1 és NS2 expresszió gátlásáról feltételezhető, hogy különösen alkalmasak az influenzavírus-fertőzések kezelésére. Ez a gátlás diagnosztikai módszerek és kitek alapját is képezheti. Az influenzavírus RNS polimerázát, hemagglutininjét vagy neuraminidázát kódoló gének gátlása szintén nagyon hasznos az ilyen fertőzések kezelésében, emellett még az influenzavírus RNS illesztési vagy pakolási funkcióinak gátlása és a virális nukleoprotein gátlása is hasznos lehet. Az ilyen gátlások vagy interferenciák szintén képezhetik diagnosztikumok alapjait.
A vírusfertőzés befolyásolására szolgáló eljárás abban áll, hogy a kezelendő embert vagy állatot érintkezésbe hozzuk a vírus nukleinsavaival hibridizálódni képes oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal. Előnyösek azok az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, amelyek • ·· · ···
4444444·4 • ··· * »44· • 4 4 4 44 • 44 44 ··· ····· képesek hibridizálódni bármely vRNS szegmensről származó RNS-sel, illetve az NP, Ml, M2, NS1 vagy NS2 fehérjéket kódol mRNS-sel.
A mellékelt 1. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (+)RNS-e (mRNS), az 5-ös szegmensről szintetizálva.
A 2. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (-)RNS-e (mRNS), az 5-ös szegmensről szintetizálva.
A 3. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (+)RNS-e (mRNS), a 7-es szegmensről szintetizálva.
A 4. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (-)RNS-e (mRNS), a 7-es szegmensről szintetizálva.
Az 5. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (+)RNS-e (mRNS), a 8-as szegmensről szintetizálva.
A 6. ábrán látható az influenza A vírus (Ann Arbor H2N2) (-)RNS-e (mRNS), a 8-as szegmensről szintetizálva.
A 7. ábrán sematikusan ábrázoljuk egy 2'-helyettesített oligonukleotid kötődését, amely utánozza a celluláris RNS indító molekulát és gátolja az influenzavírust a 2. példában leírtak alapján.
Az antiszensz oligonukleotidok számos emberi betegség kezelésében nagyon ígéretes gyógyászati hatóanyagok. Az oligonukleotidok specifikus kötődnek a pre-mRNS vagy érett mRNS komplementer szekvenciáihoz, a Watson-Crick féle bázispárosodás törvényei szerint, gátolva ezzel a DNS-től a fehérje felé irányuló genetikai információáramlást. Az influenza vírusok esetében a fehérjék kódolásához szükséges információ nem a DNS-en található, hanem egy RNS genomban, ami
lehetővé teszi a genomiális anyag antiszensz típusú megcélzását. Számos újabb vizsgálat igazolta az antiszensz oligonukleotidok alkalmazhatóságát biokémiai eszközként célfehérjék tanulmányozásában [Rothenberg et al., J. NAtl. Cancer Inst., 81, 1539-1544 (1989); Zon, G., Pharmaceutical Research, 5, 539-549 (1988)]. Az oligonukleotid-kémiában elért legfrissebb eredmények következtében a nukleáz-rezisztens oligonukleotidok és javított sejtbehatolási képességgel rendelkező oligonukleotid analógok szintézise lehetővé vált, ezért megfontolható az antiszensz oligonukleotidok alkalmazása újtípusú gyógyászati hatóanyagokként.
Az influenzavírusok negatív szálú RNS vírusok. Genomjuk diszkrét (-)vRNS szegmensekből áll, ezeket vRNS-nek is nevezik. Például az influenza A vírus 8 (-)RNS szegmensből áll. Az 1. táblázat az ismert szegmensek részleges listája.
1. táblázat
INFLUENZA SZEGMENSEK
Szegmens Kódolt fehérje Helye a virionban
1 PB2 RNS polimeráz Nukleokapszid
2 PB1 RNS polimeráz Nukleokapsz id
3 PA RNS polimeráz Nukleokapszid
4 HA Hemagglutinin Burok
5 NP Nukleoprotein Nukleokapszid
6 NA Neuraminidáz Burok
7 Ml Membránf ehérje Burok
M2 Nem-szerkezeti Nincs jelen
8 NS1 Nem szerkezeti Nincs jelen
NS2 Nem szerkezeti Nincs jelen
A vRNS szegmensek tárolják azokat a genetikai infor10 • ·♦ ·«· ·· · ··· t • ··· ·*·· • · · · · ·«· ·· ···*♦ mációkat, amelyek a virális mRNS [(+)RNS] szintéziséhez templátként szolgálnak. Tehát az influenzavírusokban a transzkripció templátja DNS helyett RNS.
Egy sejtet megfertőző influenzavírus életciklusát az alábbiakban lehet összefoglalni. A vírus a sejt felszínén egy receptorhoz kapcsolódik és bejut a sejtbe (internalizálódik). A vRNS genomiális szegmensei a sejtmagba kerülnek. A vírus számos fehérjét juttat az RNS-sel együtt az újonnan megfertőzött sejtekbe, beleértve azt a három fehérjét is, amelyek az RNS-dependens RNS polimerázt képezik (PB1, PB2, PA) , valamint egy nukleoproteint (NP) amely a három RNS polimerázzal együtt résztvesz az új RNS szintézisében. A vírus expresszálja a génjeit, hogy a fertőzött sejtben az RNS polimeráz és a nukleoprotein akciója hatására a létező sejtmechanizmusokkal kooperálva új fehérjéket állítson elő. A vírus polimeráz nem tartalmaz olyan aktivitást, amely iniciálná a mRNS szintézist, illetve a mRNS lezáró struktúrájának szintézisét vagy metilezését. Ezek a folyamatok általában szükségesek a gének expressziójához. Ehelyett a vírus egy celluláris mRNS-t használ, lehasítja az 5' lezáró struktúrát, valamint a lezáró struktúrától a mRNS 10-15 nukleotidját, és ezt használja indító molekulaként a saját mRNS-e szintézisének iniciálására. Ezt az egyedüláló mechanizmust használjuk ki a találmányban arra, hogy az influenzavírus specifikus gátlását elérjük.
Gyógyászati céllal egy feltételezetten influenzavírussal fertőzött állatot oly módon kezelünk, hogy a találmány szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot ·««
- 11 adagoljuk neki. A szakterületen jártas szakember számára nem probléma az optimális dózisnak, a dozírozás módszereinek és az ismétlés gyakoriságának meghatározása. Az ilyen kezelést általában addig folytatjuk, ameddig a gyógyulást vagy a betegség enyhülését el nem érjük.
Ismeretes, hogy a különböző influenzavírusok között a variánsra jellemző eltérések vannak. Míg egyes régiók nagyon hasonlóak az egyes fajoknál, némi különbség mégis fellép. Az ezeket a variációkat okozó változásokat az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok esetén speciálisan figyelembe vesszük ebben a találmányban.
A találmány szerinti megoldásban oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat alkalmazunk az influenzavírus RNS működésének gátlására. Leírásunkban az oligonukleotid kifejezés olyan polinukleotidokra vonatkozik, amelyek a természetben előforduló bázisokból és furanozil csoportokból állnak, amelyeket természetes foszfodiészter kötések kapcsolnak össze. Ez a kifejezés vonatkozik a természetben előforduló fajtákra, valamint azokra a szintetikus fajtákra, amelyek a természetben alőforduló alegységekből vagy azok közeli homológjaiból állnak.
Az oligonukleotid analóg kifejezés olyan egységekre vonatkozik, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de amelyek a természetben elő nem forduló részeket is tartalmaznak. Az oligonukleotid analógokban lehetnek megváltoztatott cukoregységek vagy cukrok közötti kötések. Ilyenek például a foszfor-tioát és más kéntartalmú kötések, amelyek használata ismert a szakterületen. Néhány előnyös •44* ve
4 4 44 ·4 • ··« 4♦ <*
4 44 4
444 44 444 444 megvalósítási mód szerint az oligonukleotidnak legalább néhány foszfodiészter kötését olyan struktúrával helyettesítjük, amely úgy működik, hogy fokozza a készítményeknek a sejtek azon régióiba való behatoló képességét, amelyekben a módosítandó RNS vagy DNS aktivitása található. Ezek a helyettesítések előnyösen foszfor-tioát kötéseket, metil-foszfonát kötéseket, illetve rövid szénláncú alkil- vagy cikloalkil-struktúrákat tartalmaznak. Más előnyös megvalósítási módok szerint a foszfodiészter kötéseket más struktúrákkal helyettesítjük, amelyek egyszerre lényegében nem-ionosak és akirálisak, illetve egyéb megvalósítási módok szerint olyan struktúrákkal helyettesíthetjük, amelyek királisak és enantiomer-specifikusak. A szakterületen jártas szakember ki tud választani más kötéseket is a találmány szerinti eljárásban való alkalmazás céljára.
Az oligonukleotid analógok lehetnek olyanok, amelyek legalább néhány módosított bázisformát tartalmaznak. Tehát a természetben általában található purin- és pirimidinszármazékok mellett más purin- és pirimidinszármazékok is használhatók. Hasonlóképpen, a nukleotid alegységek pentofuranozilrészein végzett módosítások is előfordulhatnak, mindaddig, amíg a találmány elvei érvényesülnek.
Az ilyen analógokat legjobban úgy írhatjuk le, hogy funkcionálisan felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (illetve a természetes oligonukleotidok alapján szintetizált oligonukleotidokkal), de amelyekben egy vagy több, a természetes struktúráktól való eltérés található. Minden ilyen analógot a találmány oltalmi körébe tartozónak tar····«·« • ··· · «·« • · · « · ··· ·« 4·· ··
- 13 tünk, mindaddig, amíg hatékonyan hibridizálódnak az influenzavírus RNS-ével. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok előnyösen 3-50 alegységet tartalmaznak. Előnyösebb, ha az ilyen oligonukleotidok és analógok 8-25 alegységből, még előnyösebb, ha 10-20 alegységből állnak. Egy alegység egy bázis-cukor kombinációt jelent, amely megfelelő módon kötődik a szomszédos alegységekhez foszfodiészter vagy egyéb kötéseken keresztül.
A találmány szerinti oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat egyszerűen és rutinszerűen készíthetjük a szilárd fázisú szintézis jól ismert módszerével. E szintézishez számos berendezés van forgalomban, beleértve az Applied Biosystems cég berendezését is. A szintézishez azonban bármely egyéb módszer is felhasználható. Az oligonukleotidok aktuális szintézise általában a szintetizáló személy gyakorlatától függ. Az is jól ismert, hogy hasonló technikák használhatók más oligonukleotid analógok szintéziséhez, például a foszfor-tioátok és az alkilezett származékok szintéziséhez .
A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a hírvivő RNS nem csak a fehérjék kódolásához szükséges információt tartalmazza a hárombetűs kódok formájában, hanem tartalmaz egyéb ribonukleotidokat is, amelyek a szakemberek számára ismertek, például az 5' nemtranszIálódő régiót, a 3'nemtranszlálódó régiót, valamint intron/exon kapcsolódási ribonukleotidokat. Tehát az oligonukleotidok és az oligonukleotid analógok a találmány szerint úgy formálhatók, hogy teljes egészében vagy részben ezekre a kapcsolódó ··· ribonukleotidokra, valamint az információhordozó ribonukleotidokra irányuljanak. Az előnyös megvalósítási módok szerint az oligonukleotid vagy az oligonukleotid analóg specifikusan hibridizálódik egy transzkripciós iniciációs helyhez, egy transzlációs iniciációs helyhez vagy egy intron/exon kapcsolódási ponthoz és a 3' nemtranszlálódó régióban található szekvenciához.
A találmány szerinti oligonukleotid specifikusan hibridizálódik az influenzavírus nukleinsavaihoz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az említett nukleinsav lehet az influenza A vagy az influenza B vírus 8 genomiális vRNS-e közül bármelyik, illetve az influenza C vírus 7 genomiális RNS szegmense közül bármelyik, illetve bármelyik említett génből származó (-I-)RNS (mRNS). A megfelelő szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazó oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok jól használhatók a találmány szerinti eljárásban. Az 1. ábrán látható az influenza A vírus 5. szegmensének (+)RNS (mRNS) szekvenciája, a 2. ábrán pedig a (-)RNS (vRNS) szekvenciája. A 3. ábrán az influenzavírus 7. szegmensének (+)RNS (mRNS) szekvenciája látható, a 4. ábrán a (-)RNS (vRNS) szekvenciája látható. Az 5. ábrán az influenzavírus 8. szegmensének (+)RNS (mRNS) szekvenciája látható, a 6. ábrán pedig a (-)RNS (vRNS) szekvenciája látható.
A találmány szerinti eljárásban használható oligonukleotidok és oligonukleotid analógok az RNS valamelyik formájával komplementerek, jóllehet valamelyest eltérő mechanizmus szerint, és ezeket úgy terveztük, hogy az egyik RNS szekvenciával vagy annak egy részével szemben antiszen15 szék legyenek, különösen az 5., 7. vagy 8. szegmens szekvenciájával, amelyek az NP, Ml, M2, NS1 és NS2 fehérjékre vonatkozó információkat tartalmazzák. A használható oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat úgy is meg lehet tervezni, hogy komplementerek (azaz antiszenszek) legyenek az 1., 2., 3., 4. vagy 6. szegmenssel, amelyek az RNS polimerázra, a neuraminidázra vagy a hemagglutinin fehérjékre vonatkozó információkat tartalmazzák, illetve az RNS illesztésben vagy a víruspakolásban szerepet játszó RNS szekvenciákkal legyenek komplementerek. Tehát ezek közül az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok közül előnyösen bármelyik használható a fentiek szerint, illetve bármely hasonló nukleotid, amelyet a szakterületen jártas szakember elő tud állítani az előnyös antiszensz célpontokról szerzett ismeretek alapján, azzal a céllal, hogy befolyásolja az influenzavírus-fertőzést. A találmány számos előnyös megvalósítási módját mutatjuk be az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban. Az előnyösen módosítandó genomiális vagy mRNS fajták közé tartozik a vírus NP, Ml, M2, NS1 és NS2 fehérjéje. Más, előnyös cél-RNS-ek közé tartozik az 1., 2., 3., 4. vagy 6. szegmens, amelyek a polimeráz 3, polimeráz 1, polimeráz 2, hemagglutinin vagy neuraminidáz géneket vagy az illesztési, illetve pakoláshoz szükséges szekvenciákat tartalmazzák. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás általánosan használható. Ezen influenza RNS-ek gátlásától várható, hogy a betegség kezelésében jelentős terápiás előnyökkel rendelkeznek.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
Influenza A vírus (Ann Arbor H2N2 törzs) gátlása
Egy sorozat antiszensz oligonukleotid szekvenciát választottunk ki, amelyek komplementerek az influenza A vírus Ann Arbor H2N2 törzzsel. A kiválasztott oligonukleotid-szekvenciák komplementerek az 5., 7. és 8. szegmens vRNSével, valamint az ezekről a szegmensekről keletkező mRNSsel, amelyek az NP fehérjét (5. szegmens) , az Ml, M2 fehérjét (7. szegmens) és az NS1, NS2 fehérjéket (8. szegmens) kódolják. A kiválasztott szekvenciák és a pontos megcélzott régió a 2. táblázatban látható.
2. táblázat Influenza A, Ann Arbor H2N2 törzs elleni antiszensz oligonukleotidok
Szekv. I sz. Szekvencia (5'-3') Megcélzott RNS régió
1250 TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT 5. szegmens (+)RNS távoli 5' vég
1251 TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT 5. szegmens (+)RNS transzláció iniciációja
1252 TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA 5. szegmens (+)RNS transzláció iniciációja
1253 GGA TCC TTC CCG GCG CTG GG 5. szegmens (+)RNS 292-es pozíció
1254 AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT 5. szegmens (+)RNS távoli 3' vég
1255 AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT 5. szegmens (-)RNS távoli 5' vég
1256 TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG 5. szegmens (-)RNS közeli 3' vég
1257 AGC AAA AGC AG GTA GAT AA 5. szegmens (-)RNS távoli 3' vég
1258 AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT 7. szegmens (+)RNS távoli 5' vég
1259 TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT 7. szegmens (+)RNS transzláció iniciációja
1260 GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC 7. szegmens (+)RNS 5' illeszkedési pont
1261 TCG GCT TTG AG GGG CCT GA 7. szegmens (+)RNS 74-es pozíció
1262 CTG ATA CGC CTG CAA ATT TT 7. szegmens (+)RNS 3' illesztési pont
1263 AGT AGA AAC AAG TGA GTT TT 7. szegmens (+)RNS távoli 3' vég
1264 AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT 7. szegmens (-)RNS távoli 5' vég
1265 TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA 7. szegmens (-)RNS közeli 3' vég
1266 AGC AAA AGC AGG TAG ATA TT 7. szegmens (-)RNS távoli 3· vég
1267 TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT 8. szegmens (+)RNS távoli 5· vég
1268 GTG TTA TTA TCC ATT ATG TC 8. szegmens (+)RNS transzláció iniciációja
1269 AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT 8. szegmens (+)RNS 5· illeszkedési pont
1270 TAG TAT GTC CTG GAA GAG AA 8. szegmens (+)RNS 3· illeszkedési pont
1271 AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT 8. szegmens (+)RNS távoli 3’ vég
1272 AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT 8. szegmens (-)RNS távoli 5’ vég
1273 GCC TCC GCA CCT GCT TCG CG 8. szegmens (-)RNS közeli 3' vég
1274 AGC AAA AGC AGG GTC ACA AA 8. szegmens (-)RNS távoli 3' vég
Az influenzavírusok gátlását a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel vizsgáltuk. Például az olyan sejtek, mint a humán embrionális tüdő sejtvonal (MRC5) vagy a Madin-Darby kutyavese (MDCK) sejtvonal könnyen fertőzhetők az influenzavírussal sejttenyészetben. A sejteket tenyésztettük, öblítettük és 0,001-0,01 fertőzési multiplicitással (M.O.I.) kezeltük a vírussal. Miután hagytuk, hogy a fertőzés lejátszódjon, a fölöslegben levő vírust lemostuk, és antiszensz oligonukleotid analógokat adtunk hozzá 25-50 μπιοί/ΐ koncentrációban, illetve a megfelelő hígításokban. Az egyes hígításokhoz három-három mélyedést használtunk. Az 5-7 napig tartó kezelés végén a vírussal fertőzött sejteket eltávolítottuk, homogenizáltuk, és az influenzavírus fertőzőképességét meghatároztuk oly módon, hogy mértük a keletkező tarfoltok számát, amelyek akkor keletkeztek, amikor a kivonat hígításait MRC5 sejtek rétegére szélesztettük. A pozitív hatóanyag hatásként határoztuk meg, ha a hatóanyaggal való kezelés következtében csökkent az influenzavírus fertőzőképessége. A kezeletlen kontrolihoz viszonyítva legalább tízszeres csökkenés várható.
2. példa
RNS indító molekula utánzók
Ismeretes, hogy az influenza által fertőzött sejtekben a vírus által kódolt mRNS transzkripciójához a sejtben levő RNS polimeráz és a virális RNS polimeráz között együttműködésre van szükség, mert a virális RNS polimerázból hiányzik az a képesség, hogy közvetlenül iniciálja a transz19
kripciót vagy helyesen zárja le, illetve metilezze az mRNS 5' végét. A virális polimeráz egy sejt eredetű RNS polimerázt hív segítségül, lehasítja a sejt eredetű mRNS első 10-15 nukleotidját, és arra használja, hogy beindítsa a saját mRNS-ének a transzkripcióját. A sejt eredetű mRNS alkotja az indító molekulát. A vizsgál metabolizmus egyedi volta lehetőséget nyújt arra, hogy olyan antiszensz oligonukleotidokkal gátoljuk a folyamatot, amelyek a (-)RNS (vRNS) szegmensek 3' végével komplementerek, és amelyek 10-15 nukleotid hosszan kinyúlnak az antiszensz oligonukleotid 5' oldalán, amint azt a 7. ábrán jelöljük.
Az említett megvalósítási módokban előnyösen használható antiszensz oligonukleotidok 2'-helyettesített oligonukleotidok, amelyek utánozzák az RNS szerkezetét és fokozzák a virális polimerázhoz való kötődést. A találmány néhány megvalósítási módjában általában előnyös, ha a kapcsoló cukoregységeknek a 2' pozíciója az oligonukleotidoknak vagy az oligonukleotid analógoknak legalább egy részében helyettesítve van. A következő szubsztituensek lehetnek előnyösek: OH, SH, F, 0CH3, OCN, O(CH2)nCH3, ahol n értéke 1 és 10 közötti, valamint egyéb, hasonló tulajdonságokkal rendelkező szubsztituensek. Az antiszensz oligonukleotid 5' végét adott esetben egy tipikus celluláris mRNS-hez vagy egy lezáró struktúra analóghoz hasonló szerkezetű véggel látjuk el. A szakterületen jártas szakember számára ismert néhány módszer lezáró struktúrával rendelkező oligonukleotidok előállítására. A lezáró struktúrával rendelkező oligonukleotidok előállítására szolgáló módszerek ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Néhány, lezáró struktúrával rendelkező oligonukleotid előállítására vonatkozó eljárást ismertet a szakirodalom [Yisraeli and Méltón, Methods in Enzymology, 180, 42-50 (1989), valamint az ott idézett publikációk]. Adott esetben az antiszensz oligonukleotid egy 3' dezoxinukleotidot vagy más nukleotid analógot tartalmaz, amely nem hosszabbítható az RNS polimerázzal, mivel hiányzik róla a 3' hidroxil csoport, amelyet az enzim az RNS lánc hosszabbítására használ. Az ilyen láncterminációs inhibitorok használata számos biokémiai folyamatban általános. Láncterminációs oligonukleotidokat használnak például a DNS szekvencia meghatározásánál a Sanger-féle módszer esetében [Sanger, F., Nicklen, S., and A.R. Coulson, Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 74., 5463-5467 (1977)]. Ennek a módszernek az alkalmazásával az alábbi oligonukleotidokról véltük úgy, hogy jó célpontjai az antiszensz terápiának (szintetizáltuk, majd vizsgáltuk az antivirális aktivitásukat az 1. példában leírtak alapján):
UCUCCCUCUCAGAGCGAAAGCAGGTCAAUUAU
UCUCCCUCUCAGAGCGAAAGCAGGCAAACCAU UCUCCCUCUCAGAGCGAAAGCAGGTACTGATT UCUCCCUCUCAGCAAAACCUUCCCGGAAAUGA UCUCCCUCUCAGAGCAAAAGCAGGGUAGAUAA UCUCCCUCUCAGAGCAAAAGCAGGAGUGAAAA UCUCCCUCUCAGAGCAAAAGCAGGUAGAUAUU UCUCCCUCUCAGAGCAAAAGCAGGGUGACAAA • ··
3. példa
Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok szintézise és jellemzése
A módosítatlan oligonukleotidokat automatizált DNS szintatizátorral (Applied Biosystems model 380B) állítottuk elő, az ismert foszforamidit módszerrel, valamint jódos oxidációval. A β-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditeket az Applied Biosystems-től vásároltuk (Foster City, CA). A foszfor-tioát oligonukleotidok esetében a standard oxidációs palackot egy olyannal helyettesítettük, amely 3H-1,2-benzoditiazol-3-on-l,1-dioxid 0,2 mol/l-es acetonitriles oldatát tartalmazta, azzal a céllal, hogy a foszfit kötéseket lépésenként alakítsuk át ként tartalmazó kötésekké. A kénbeviteli ciklus várakozási lépését 68 másodpercre növeltük, majd ezt követte a lezáró struktúrát bevivő lépés. A 2'-O-metil-foszfor-tioát oligonukleotidokat 2'-O-metil-B-cianoetil-diizopropil-foszforamiditek alkalmazásával szintetizáltuk (Chemgenes, Needham, MA), és a módosítatlan oligonukleotidok standard ciklusát, a tetrazol impulzus-bejuttatása utáni várakozási lépés kivételével 360 másodpercre növeltük. A 2'-dezoxiribonukleotidot használtuk a szintézis kezdő 3'-bázisaként. A kontrollált pórusméretű üvegoszlopról (Applied Biosystem) való lehasítás után, valamint a tömény ammónium-hidroxiddal 18 óra hosszat 55 °C-on végzett védőcsoport-eltávolítás után az oligonukleotidokat tisztítottuk, kétszer kicsapva 0,5 mol/1 NaCl-ból 2,5 térfogat etanollal. Az analitikai gélelektroforézist 20 % akrilamid, 8 mol/1 karbamid, 45 mmol/1 TRIS-borát puffer (pH=7,0) összetételű gélben vé····
- 22 geztük. Az oligonukleotidokat és foszfor-tioát analógjaikat azon az alapon ítéltük meg, hogy több mint 80 %-ban a teljes hosszúságú anyagot tartalmazzák-e.
Az ezen szintézissel kapott foszfor-tioát és foszfodiészter kötések arányát periodikusan ellenőriztük 31P-NMR spektroszkópiával. A spektrumot szobahőmérsékleten vettük fel, oldószerként deutérium-oxidot vagy szulfoxid-dg-ot használva. A foszfor-tioát minták általában egy százaléknál kevesebb foszfodiészter kötést tartalmaztak.
4. példa
Az oligonukleotid analógok azon képességükre nézve történő átvizsgálása, hogy mennyire gátolják a virálisan indukált citopatikus hatást (CPE)
Az antiszensz vegyületek antivirális hatását gyorsan meg lehet határozni oly módon, hogy ellenőrizzük az influenzavírus által indukált citopatikus hatás gátlását. Mivel ehhez a vizsgálathoz az egysejtréteg mikroszkópos vizsgálata szükséges, ezért végrehajtható mikrotitráló lemez mélyedéseiben, ezzel csökkentve a kezdeti vizsgálatokhoz szükséges oligonukleotid mennyiségét. Ezt a vizsgálati módszert az antivirális hatás gyors primer szűrővizsgálataként alkalmaztuk.
Az A/PR/8/34 típusú influenzavírust MDCK egysejtréteges kultúrákban, Eagles féle MÉM + 2 % borjúembrió-szérum összetételű táptalajba oltottuk át és előnövesztettük. Az antivirális vizsgálatokhoz a vírust táptalajban hígítot tuk 32 CCID5Q (50 %-os sejttenyészet fertőző dózis) értékre, ·· ·· · ··· ··
mélyedésenként 0,1 ml tenyészetben.
Összesen 32 oligonukleotid foszfor-tioát analógot készítettünk a 3. példában leírtak alapján és -20 °C-on tároltuk. Közvetlenül a felhasználás előtt a vegyületeket megolvasztottuk, és táptalajban sorozathigítást készítettünk belőlük 0,5 logio koncentrációkban, azaz 20, 6,4, 2,0, 0,6, 0,2 és 0,06 Mmol/l koncentrációban.
Az ismert Ribavirin nevű aktív vegyületetet az oligonukleotidokkal együtt értékeltük ki, ez volt a pozitív kontroll.
Az MDCK sejteket egysejtréteg formájában előnövesztettük COSTAR 96-mélyedéses szövettenyésztő lemezeken, alkalmas szövettenyésztő táptalaj alkalmazásával. Az antivirális vizsgálatokat úgy terveztük, hogy az egyes vegyületek hat koncentrációját értékeltük a kihívó vírussal szemben három párhuzamosban. A csak táptalajt tartalmazó sejtkontrollokat, a csak táptalajjal kezelt vírussal fertőzött sejtkontrollokat, és a nem fertőzött hatóanyag toxicitási kontrollokat (sejt és a hatóanyag) is felvittük az egyes lemezekre.
A gazdasejt tenyészeteket (a vizsgálati mélyedéseket és a hatóanyag toxicitási kontrollt) 18 óra hosszat 37 °C-on, 2 % CO2~t tartalmazó nedvesített atmoszférában előkezeltük mélyedésenként az egyes hatóanyag koncentrációkból vett 0,2 ml oldattal. Azokat a sejttenyésztő mélyedéseket, amelyek vírus kontrollok voltak, valamint a sejt kontrollokat ál-kezelésnek vetettük alá 18 óra hosszat a kísérleti táptalajjal (MEM+2% borjúembrió-szérum).
• ··· ·; · .· - ··· ·.·. · • ···
A 18 órás előkezelés után a folyadékokat eltávolítottuk a lemez mélyedéseiből és az egysejtrétegeket a táptalajjal öblítettük. Ezután mindegyik vizsgálati és vírus kontroll tenyészet mélyedést 0,1 ml vírusszuszpenzióval hoztuk érintkezésbe 1 óra hosszat 37 °C-on. A hatóanyag toxicitási és a sejt-kontroli tenyészeteket ál-kezelésnek vetettük alá mélyedésenként 0,1 ml táptalajjal.
A vírus adszorpciós periódus után a folyadékokat leszívtuk a mélyedésekről és az egysejtrétegeket táptalajjal mostuk, hogy minden nem adszorbeálódott vírust eltávolítsunk. A három párhuzamosban levő vírus-fertőzött tenyészetekhez és a két citotoxicitási kontrolihoz az egyes hatóanyag koncentrációkból 0,2 ml alikvot részeket adtunk. A kezeletlen vírus kontroll és sejt kontroll tenyészeteket 0,2 ml kísérleti táptalajjal tápláltuk. A lemezeket 37 °C-on inkubáltuk CO2 inkubátorban, ameddig maximális CPE (citopatogén hatás) nem volt észlelhető a vírus kontroll tenyészetekben (3 nap).
A sejttenyészet mélyedéseket mikroszkóposán vizsgáltuk a CPE és a hatóanyag toxicitás szempontjából. Az antivirális aktivitást úgy határoztuk meg, hogy kiszámítottuk a vírussal indukált, vírussal kezelt sejttenyészetekben a vírus-indukálta CPE gátlásának százalékát, a vírus-érték (VR) alapján. A VR az antivirális aktivitás standard súlyozott mérése, figyelembe véve mind a CPE gátlás, mind a hatóanyag toxicitás mértékét, és Ehrlich és munkatársai módszerének [Ann. N.Y. Acad. Sci., 130. 5-16 (1965)] módosításával határoztuk meg, az alábbiak szerint. A CPE mértékét az egyes
mikrotiter lemez mélyedésekben levő tenyészetekre az alábbi skála szerint határoztuk meg:
= a sejtek 100 %-át érinti a vírus;
3 = a sejtek 75 %-át érinti a vírus;
2 = a sejtek 50 %-át érinti a vírus;
1 = a sejtek 25 %-át érinti a vírus;
= nincs CPE; normális egysejtréteg;
u = nem kielégítő teszt (fertőzés, gyenge válasz) t = a hatóanyag toxikus a sejtekre;
CPE nem figyelhető meg;
p = a hatóanyag részlegesen toxikus a sejtekre; az egysejtréteg érintetlen, ezért a CPE megf igyelhet ő.
A VR-t úgy számítottuk ki, hogy a tenyésztő lemezen az egyes teszt-mélyedések és az azoknak megfelelő víruskontroli feljegyzett CPE értéke közötti számbeli különbség összegét 0,1-gyel szoroztuk. A részlegesen citotoxikus (p) hatóanyag koncentrációt tartalmazó teszt mélyedések, és az ezeknek megfelelő vírus kontrollok közötti numerikus különbséget feleztük.
Tapasztalataink szerint az 1,0 vagy nagyobb VR azt jelenti, hogy jelentős az antivirális aktivitás, és jól reprodukálható az ellenőrző in vitro tesztekben. Ezért minden olyan vegyületet, amely 1,0 vagy annál nagyobb VR értéket mutatott, aktívnak tekintettünk (+). Minden olyan hatóanyagot, amelynek a VR értéke 0,5-0,9 közötti, lehetséges vagy marginális aktivitásúnak tekintettünk (±), és minden olyan
- 26 ~ anyagot, amelynek a VR értéke 0,5 vagy annál kisebb, a mi vizsgálati rendszerünkben inaktívnak tekintettünk.
A CPE-t 50 %-kal csökkentő minimális gátló hatóanyag koncentrációt (MIC50 vagy ID50) úgy határoztuk meg, hogy egy regressziós elemző programot használtunk a féllogaritmikus görbeillesztéshez. Az érzékeny vírusokra nézve aktív hatóanyagok terápiás indexét úgy határoztuk meg, hogy a vizsgált vegyületek minimális citotoxikus koncentrációját a MICsq értékkel osztottuk.
Először nyolc kiválasztott influenza RNS célpont elleni foszfor-tioát analógot vizsgáltunk, két nonszensz kontrollal. Ezeknek az oligonukleotid analógoknak a szekvenciáját és célpontjait a 3. táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat Antivirális aktivitásra vizsgált oligonukleotid analógok (foszfor-tioát)
Szekv. ISIS sz. sz. Szekvencia Célpont
1 2792 AGC AAA AGC AGG GTG ACA AA vRNS, gátolja a 8. szegmens transzkripciój át
2 2793 AGC GAA AGC AGG TAG ΑΤΑ TT vRNS, gátolja a 7. szegmens transzkripcióját
3 2794 GTG TTT GGA TCC ATT ATG TC mRNS, nem-szerkezeti fehérjék AUG-je, 8. szegmens
4 2795 TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT mRNS, mátrix fehérjék AUG-je, 7. szegmens
5 2796 GCA ATC TAC CTG AAA GCT TG mRNS, az NS-2 illeszkedési pontja, 8. szegmens
6 2797 AGA GAA CGT ACG TTT CTA CC mRNS, az M2 illeszkedési pontja, 7. szegmens
7 2798 AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT vRNS, 5' vég pakolási szekvencia, 8. szegmens
8 2799 AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT vRNS, 5’ vég pakolás! szekvencia, 7. szegmens
9 2800 GGG AAA CCA ACG GAA ATA AG Nonszens kontroll oligo
10 2801 CAA CCA AAA AGA TAA TCT CA Nonszensz kontroll
oligo
A CPE-gátlási vizsgálatok eredményeinek összefoglalása a
4. táblázatban látható.
·
- 28 4. táblázat
Az ISIS vegyületek influenzavírus A/PR/8/34 típusa elleni antivirális aktivitása eredményeinek összefoglalása MDCK sejttenyészetben, CPE-gátlási vizsgálat alkalmazásával
ISIS sz. VR1 ID25q(Mmol/1) MTC3(Mmol/l) TI4
2792 1,0 13,92 >20 >1,43
2793 0 - >20 -
2794 1,1 12,58 >20 >1,59
2795 0,5 - >20 -
2796 0,5 - >20 -
2797 0,7 16,99 >20 >1,18
2798 0,7 19,98 >20 >1,0
2799 0,8 - >20 -
2800 3,5 1,11 >20 17,95
2801 0,4 - >20 -
Ribavirin 1 3,6 5,65 ~g/ml 100 gg/ml 17,69
1VR = Vírus Érték: A szelektív antivirális aktivitás mérése, amely figyelembe veszi a vírus által indukált citopatogén hatásokat (CPE) és a teszt vegyület által okozott citotoxicitás mértékét, Ehrlich és munkatársai módszerének módosításával meghatározva [Ann. N.Y. Acad. Sci., 130, 5-16 (1965)]. Tapasztalataink szerint az 1,0 vagy annál nagyobb VR érték határozott (+) antivirális aktivitást jelez, a 0,5-0,9-es VR érték gyenge vagy közepes (±) antivirális aktivitást jelent, és a <0,5 VR érték általában azt jelenti, hogy nincs (-) jelentős antivirális aktivitás.
2ID5q (MIC50) = Az a minimális hatóanyag koncentráció, amely a CPE-t 50 %-kal gátolja, féllogaritmikus görbeillesztéses regressziós elemzési program alkalmazásával számítva.
··
- 29 3MTC = Az a minimális hatóanyag koncentráció, amely egyáltalán citotoxicitást okoz (mikroszkópos megfigyelés). Az MTT-vel megfigyelt hatóanyag citotoxicitást a 7. táblázatban mutatjuk be.
4TI = Terápiás index, úgy számítjuk ki, hogy a minimális citotoxikus hatóanyag koncentrációt az IDsQ-nel osztjuk.
Három vegyület, az ISIS 2792 (1. szekvencia) , az ISIS 2794 (3. szekvencia) és az ISIS 2800 (9. szekvencia) rendelkezett 1,0 vagy annál nagyobb vírus értékkel; de a legnagyobb értékkel rendelkező vegyiilet (ISIS 2800, 9. szekvencia) az egyik nonszensz kontroll volt.
Egy 22 analógból álló második sorozatot is készítettünk és vizsgáltunk. Ezeknek az oligonukleotidoknak a szekvenciáját és a célpontjait az 5. táblázatban mutatjuk be.
··
1
- 30 5. táblázat Antivirális aktivitásra vizsgált oligonukleotid analógok (foszfor-tioát)
Szekv. ISIS sz. sz. Szekvencia Célpont
11 3302 GGG AAA CCA ACG GAA ATA AG nonszensz kontroll
12 3303 CTT TCC ATA TTG AAT ATA AT AUG 1. szegmens polimeráz 3
13 3304 ACA TCC ATT CAA ATG GTT TG AUG 2. szegmens, polimeráz 1
14 3305 TCT TCC ATT TTG GAT CAG TA AUG 3. szegmens, polimeráz 2
15 3306 GCC TTC ATT TTG GTT GTT TT AUG 4. szegmens, hemagglutinin
16 3307 GAC GCC ATG ATT TTG ATG TC AUG 5. szegmens, nukleoprotein
17 3308 GGA TTC ATT TTA AAC CCC TG AUG 6. szegmens, neuraminidáz
18 3309 AGA CTC ATC TTT CAA TAT CT AUG 7. szegmens, mátrix fehérje
19 3310 GAT AGA GAG AAC GTA CGT TT baloldali illesztési pont, 7. szegmens
20 3311 TCT GAT AGG CCT GCA AAT TT jobboldali illesztési pont, 7. szegmens
21 3312 GGA TCC ATT ATG TCT TTG TC AUG 8. szegmens, nemszerkezeti fehérje
22 3313 CAT GTC GGT TAG GTA ACG CG illesztési ág, 8. szegmens
23 3314 GCA ATC TAC CTG AAA GCT TG jobboldali illesztési pont, 8. szegmens
24 3315 AGC AGT ATC TCC TGG AAG AG baloldali illesztési pont, 8. szegmens
25 3316 AAA ACG ACC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 1. szegmens
26 3317 AAA AAT GCC TTT TTC CTA CT pakoló szekvencia, 2. szegmens
27 3318 AAA AGT ACC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 3. szegmens
28 3319 AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 4. szegmens
29 3320 AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 5. szegmens
30 3321 AAA AAC TCC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 6. szegmens
31 3322 AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia, 7. szegmens
32 3323 AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT pakoló szekvencia,
8. szegmens
- 31 ί··.
•·
A CPE-gátlási vizsgálatok eredményeinek összefoglalása a 6. táblázatban látható.
6. táblázat
Az ISIS vegyületek influenzavírus A/PR/8/34 típusa elleni antivirális aktivitása eredményeinek összefoglalása MDCK sejttenyészetben, CPE-gátlási vizsgálat alkalmazásával
ISIS VR1
ID2 50(Aímol/l) MTC3(Mmol/l) TI4
3302 1/1 12,7 >20 >1,6
3303 0,8 14,7 >20 >1,4
3304 0,8 17,4 >20 >1,2
3305 2,0 3,9 >20 >5,2
3306 2,6 2,0 >20 >9,8
3307 3,2 1,8 >20 >11,4
3308 2,6 3,1 >20 >6,6
3309 2,1 4,5 >20 >1,6
3310 1/1 12,7 >20 >1,6
3311 2,8 1,0 >20 >19,8
3312 1,6 7,0 >20 >2,8
3313 2,3 3,7 >20 >5,5
3314 1,2 12,8 >20 >1,6
3315 2,6 2,1 >20 >9,6
3316 1,3 8,1 >20 >2,5
3317 1,3 12,4 >20 >1,6
3318 1,2 12,7 >20 >1,6
3319 3,6 0,9 >20 >23,5
3320 1,1 11,3 >20 >1,8
3321 2,7 2,4 >20 >8,3
3322 2,1 2,9 >20 >1,4
3323 1,0 14,2 >20 >1,4
Ribavirin 4,1 2,3 Mg/ml 32 Mg/ml 13,9
(+ kontroll) Ribavirin 3,9 2,6 gg/ml 32 Mg/ml 12,2
1 VR = Vírus érték: A szelektív antivirális aktivitás mér-
téke, amely figyelembe veszi az vírus által indukált citopatogén hatások (CPE) gátlásának mértékét, valamint a vizsgált vegyület által mutatott citotoxicitás fokát, Ehrlich és munkatársai módszerének módo-
sításával meghatározva [Ann. N.Y. Acad. Sci., 130,
5-16 (1965)]. Tapasztalataink szerint az 1,0 vagy annál nagyobb VR érték határozott (+) antivirális aktivitást jelez, a 0,5-0,9-es VR érték gyenge vagy közepes (±) antivirális aktivitást jelent, és a <0,5 VR érték általában azt jelenti, hogy nincs (-) jelentős antivirális aktivitás.
2ID5q (MIC5Q) = Az a minimális hatóanyag koncentráció, amely a CPE-t 50%-kal gátolja, féllogaritmikus görbeillesztéses regressziós elemzési program alkalmazásával számítva.
3MTC = Az a minimális hatóanyag koncentráció, amely egyáltalán citotoxicitást okoz (mikroszkópos megfigyelés) . Az MTT-vel megfigyelthatóanyag citotoxicitást a 7. táblázatban mutatjuk be.
4TI = Terápiás index, úgy számítjuk ki, hogy a minimális citotoxikus hatóanyag koncentrációt az ID5Q-nel osztjuk.
Az összes vizsgált hatóanyag aktív volt az influenza A vírussal szemben. Csak két vegyületnek, az ISIS 3303-nak (12. szekvencia) és az ISIS 3304-nek (13. szekvencia) volt 1-nél kisebb a vírus értéke. A leghatékonyabb vegyületek közé tartozott az ISIS 3307 (16. szekvencia; VR 3,2) és az ISIS 3319 (28. szekvencia; VR 3,6). A legnagyobb hatékonyságot és szelektivitást az ISIS 3311, (20. szekvencia; VR 2,8, ID50 1,0 Mmol/l és TI>19,8), valamint az ISIS 3319 mutatta (28. szekvencia, ID50 0,9 és TI>23,5). Az ID50 és TI értékeket az első tizedesjegyre kerekítettük a számítás
- 33 ·· *
•·· *· »·β után. Jóllehet a pozitív kontroll, a Ribavirin aktívabb volt, mint a vizsgált vegyületek a VR alapján, az ISIS 3311 (20. szekvencia) és az ISIS 3319 (28. szekvencia) sokkal hatékonyabb volt a kihívó vírussal szemben, mint a pozitív kontroll hatóanyag, amit a magasabb terápiás index is mutat.
4. példa
Oligonukleotidok citotoxicitásának MTT vizsgálata
Amellett, hogy a hatóanyag citotoxicitását kontroll sejttenyészeteken vizsgáltuk oly módon, hogy mikroszkóposán ellenőriztük a nagy morfológiai változásokat, a hatóanyag citotoxicitásának a mértékét mennyiségileg is meghatároztuk, MTT alkalmazásával. Ezzel a módszerrel a sejtek életképességét mérjük. A módszer a 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid) (MTT) redukcióján alapszik, amit az életképes gazdasejtek mitokondriuma végez, ekkor MTT-formazán keletkezik [T. Mossman, J. Immunoi. Methods, 65. 55 (1983)]. A hatóanyag citotoxicitási kontrollokat és a sejt kontrollokat MTT-vel, majd SDS-sel kezeltük az MTTformazán kristályok feloldása céljából. Az MTT-formazán kék színét spektrofotometriásán mértük 570 nm-en, egy automata lemezleolvasóval. A hatóanyag toxicitását (életképesség) úgy határoztuk meg, hogy az egyes hatóanyag citotoxicitási kontrollok abszorbanciáját (optikai sűrűség, O.D.) a sejt-kontroli átlagos O.D.-jával hasonlítottuk össze, és a kontroll százalékában fejeztük ki.
A vizsgált 32 vegyület közül egyik sem volt toxikus 20 μιηοΐ/ΐ koncentrációban, amely a vizsgált legmagasabb dó
A • · ·
- 34 zis volt, mikroszkópos kiértékelés alapján (4. és 5. táblázat), illetve az MTT vizsgálat alapján (7. és 8. táblázat).
7. táblázat
Hatóanyaggal kezelt MDCK sejt kontroll tenyészetek eletképessége1 az MTT vizsgálat alapján
Kontroll százaléka
Vegyület
sz. 20 6,4 2,0 0,64 0,2 0,06[μπΐο1/1]
2792 99 99 97 96 93 91
2793 98 100 96 96 92 91
2794 >100 >100 >100 >100 96 93
2795 >100 99 >100 98 91 90
2796 97 >100 99 94 91 91
2797 98 99 98 94 90 91
2798 94 98 97 96 89 89
2799 96 99 >100 98 93 93
2800 >100 99 100 93 94 92
2801 98 >100 100 98 92 93
320 100 32 10 3,2 1,0 [gg/ml]
Ribavirin 56 58 63 78 86 94
^Életképesség (hatóanyag citotoxicitás) meghatározása oly módon, hogy összehasonlítjuk az egyes hatóanyagok citotoxicitási kontroll abszorbanciáját (optikai sűrűség, OD) a kezeletlen sejt kontroll tenyészetek átlagos OD-jával, majd a kontroll százalékában fejezzük ki.
8. táblázat Hatóanyaggal kezelt MDCK sejttenyészetek életképességének1 összehasonlítása az MTT vizsgálattal
A kontroll százaléka Vegyület
sz. 20 6,4 2,0 0,64 0,2 0,06[gmol/l]
3302 100 100 100 99 91 94
3303 100 100 100 96 93 89
3304 100 100 100 100 95 91
3305 97 100 100 99 96 92
3306 100 100 100 100 98 97
3307 95 100 100 100 100 100
3308 98 97 95 96 93 93
3309 96 93 97 94 93 96
3310 96 95 92 93 88 91
3311 90 88 89 92 92 93
3312 95 93 93 93 90 94
3313 96 97 96 96 94 92
3314 89 95 98 97 94 93
3315 89 95 95 96 97 93
3316 90 95 93 92 91 89
3317 94 92 93 91 91 89
3318 93 97 93 93 90 91
3319 94 99 97 99 97 97
3320 95 100 100 100 96 93
3321 98 98 99 97 99 92
3322 98 99 100 99 96 91
3323 100 100 100 100 99 100
320 100 32 10 3,2 1,0 [Mg/ml]
Ribavirin 35 52 52 80 98 96
Ribavirin 37 55 57 83 97 96
^•Életképesség (hatóanyag citotoxicitás) meghatározása oly módon, hogy összehasonlítjuk az egyes hatóanyagok citotoxicitási kontroll abszorbanciáját (optikai sűrűség, OD) a kezeletlen sejt kontroll tenyészetek átlagos OD-jával, majd a kontroll százalékában fejezzük ki.
Ezen aktív anyagoknak a szelektivitása ennélfogva • <·
- 36 ~
nagyobb lehet, mint amit ezekkel a vizsgálatokai igazoltunk.
5. példa
RNS minikri a virion kialakulás gátlására
Az influenzavírus ciklusának egyik fontos része a virion kialakulása, összeszerelődése. Ebben a folyamatban a vírusnak választania kell a nyolc egyedi virális RNS szekvencia (vRNS) közül egyet, hogy azt egy komplett (fertőzőképes) virionba beépítse. Ennek a folyamatnak egy fontos része a vRNS szegmensek felismerése a virális fehérjék segítségével. A vRNS szegmensek 5’ végét úgy azonosították, mint a virális fehérjék kötődési helyét. A vRNS szegmensek 5’ végénél található ribonukleotid szekvencia megőrződött a nyolc szegmensben, és a 9. táblázatban látható.
9. táblázat (A bemutatott szekvencia az A/PR/8/34 influenzavírusból származik, az első 30 nukleotidot mutatjuk be)
SEG1 AGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATG
SEG2 AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT
SEG3 AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAA
SEG4 AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCA
SEG5 AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTG
SEG6 AGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAA
SEG7 AGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAG
SEG8 AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGG • · «
Emellett ezek a szekvenciák a különböző influenzavírus törzsekben nagymértékben konzervatív módon megmaradnak.
Amint a szekvenciákból látható, az első 12 bázis nagymértékben konzervatív mind a 8 szegmensben. így egy ezt a konzervatív régiót célzó oligonukleotid (pl. a 33. szekvencia) hatékony lesz.
Az influenza vRNS-k 5' vége potenciális RNS másodlagos struktúrájának elemzése arra utal, hogy minden szegmens végénél van egy erős másodlagos struktúra, amely fontos szerepet játszhat a proteinfelismerésben. Amint a 497 090 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a PCT/US91/01822 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti, bizonyos RNS-k és a proteinek közötti kölcsönhatás gátolható olyan oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok alkalmazásával, amelyek az RNS-nek legalább egy részét utánozzák. Ez feltételezhetően különösen hatékony, ha az illető RNS erős másodlagos struktúrával rendelkezik, ami az RNSutánzással kihasználható. A génexpresszió és a betegség állapota megbolygatható az ilyen RNS—protein kölcsönhatások megszakításával. Nem szükséges ismerni az aktuális RNSstruktúrát ahhoz, hogy a találmány szerinti megoldást gyakorlatba vegyük, csupán arra van szükség, hogy az illető RNS-szekvenciát egy RNS-kötő protein felismeri, és hogy ennek a kölcsönhatásnak fontos biológiai következményei vannak.
Az RNS-t utánzó oligonukleotidokat, amelyeket a 10. táblázatban mutatunk be, egységes 2'-0-metil- vagy 2’-0-me
- 38 til-foszfor-tioát analógok formájában szintetizálhatjuk, a
3. példa szerinti módon, és antivirális aktivitásukra nézve a 4. példa szerinti módon vizsgálhatók át.
10. táblázat
Szekv.
sz.
AGCGAAACCAGGTCAATTATATTCAATATG
AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT
AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAA
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCA
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTG
AGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAA
AGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAG
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGG
SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:
(i) Bejelentő:
(ii) Bejelentés címe: Influenzavírusok gátlása (iii) Szekvenciák száma: 41 (iv) Levelezési cím:
(A) Címzett:
(B) Utca:
(C) Város:
(D) Állam:
(E) Ország:
(F) Irányítószám:
(v) Komputerrel olvasható forma:
(A) Hordozó típusa:
(B) Komputer:
(C) Operátor rendszer:
(D) Software:
(vi) A jelen bejelentés adatai:
(A) A bejelentés száma:
(B) A bejelentés napja:
(C) Osztály:
(vii) Az elsőbbségi bejelentés adatai:
(A) A bejelentés száma:
(B) A bejelentés napja:
(viii) A képviselő adatai:
(A) Név:
(B) Regisztrálási szám:
• «
(C) Aktaszám:
(ix) Telekommunkikációs információk:
(A) Telefon:
(B) Telefax:
(2) Információk az 1. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia:
AGCAAAAGCA GGGTGACAAA (2) Információk az 2. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 2. szekvencia:
AGCGAAAGCA GGTAGATATT (2) Információk az 3. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 3. szekvencia:
GTGTTTGGAT CCATTATGTC (2) Információk az 4. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 4. szekvencia:
TAGAAGACTC ATCTTTCAAT (2) Információk az 5. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav • 1 (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 5. szekvencia:
GCAATCTACC TGAAAGCTTG (2) Információk az 6. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 6. szekvencia:
AGAGAACGTA CGTTTCTACC (2) Információk az 7. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem
(
Μ ··· (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 7. szekvencia:
AAAACACCCT TGTTTCTACT (2) Információk az 8. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 8. szekvencia:
AAAACTACCT TGTTTCTACT (2) Információk az 9. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 9. szekvencia:
GGGAAACCAA CGGAAATAAG (2) Információk az 10. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 10. szekvencia:
CAACCAAAAA GATAATCTCA (2) Információk az 11. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 11. szekvencia:
GGGAAACCAA CGGAAATAAG (2) Információk az 12. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav
(C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 12. szekvencia:
CTTTCCATAT TGAATATAAT (2) Információk az 13. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 13. szekvencia:
ACATCCATTC AAATGGTTTG (2) Információk az 14. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem
(iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 14. szekvencia:
TCTTCCATTT TGGATCAGTA (2) Információk az 15. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 15. szekvencia:
GCCTTCATTT TGGTTGTTTT (2) Információk az 16. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 16. szekvencia:
GACGCCATGA TTTTGATGTC • -:
·· ..
- 47 (2) Információk az 17. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 17. szekvencia:
GGATTCATTT TAAACCCCTG (2) Információk az 18. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 18. szekvencia:
AGACTCATCT TTCAATATCT (2) Információk az 19. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav • 4 « ·« (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 19. szekvencia:
GATAGAGAGA ACGTACGTTT (2) Információk az 20. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 20. szekvencia:
TCTGATAGGC CTGCAAATTT (2) Információk az 21. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem ι
·· ♦ a*
(iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 21. szekvencia:
GGATCCATTA TGTCTTTGTC (2) Információk az 22. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 22. szekvencia:
CATGTCGGTT AGGTAACGCG (2) Információk az 23. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 23. szekvencia:
GCAATCTACC TGAAAGCTTG • 44
- 50 V··
(2) Információk az 24. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 24. szekvencia:
AGCAGTATGT CCTGGAAGAG (2) Információk az 25. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 25. szekvencia:
AAAACGACCT TGTTTCTACT (2) Információk az 26. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav
··· (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 26. szekvencia:
AAAAATGCCT TGTTCCTACT (2) Információk az 27. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 27. szekvencia:
AAAAGTACCT TGTTTCTACT (2) Információk az 28. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem : ’··ί ” ·: ··· ·· .· · · s
..... ...
(iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 28. szekvencia:
AAAACACCCT TGTTTCTACT (2) Információk az 29. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 29. szekvencia:
AAAATACCCT TGTTTCTACT (2) Információk az 30. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 30. szekvencia:
AAAAACTCCT TGTTTCTACT (2) Információk az 31. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 31. szekvencia:
AAAACTACCT TGTTTCTACT (2) Információk az 32. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása: 32. szekvencia:
AAAACACCCT TGTTTCTACT (2) Információk az 33. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 12 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla
J) * .
• · (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 33. szekvencia:
AGCTAAAGCA GG (2) Információk az 34. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv> Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 34. szekvencia:
AGCGAAACCA GGTCAATTAT ATTCAATATG (2) Információk az 35. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem • ·
(xi) Szekvencia leírása: 35. szekvencia:
AGCGAAAGCA GGCAAACCAT TTGAATGGAT (2) Információk az 36. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 36. szekvencia:
AGCGAAAGCA GGTACTGATC CAAAATGGAA (2) Információk az 37. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 37. szekvencia:
AGCAAAAGCA GGGGAAAATA AAAACAACCA (2) Információk az 38. szekvenciához:
(D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 40. szekvencia:
AGCGAAAGCA GGTAGATATT GAAAGATGAG (2) Információk az 41. szekvenciához:
(i) Szekvencia-jellemzők:
(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: szimpla (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: más nukleinsav (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) Szekvencia leírása: 41. szekvencia:
AGCAAAAGCA GGGTGACAAA GACATAATGG • ·

Claims (34)

  1. Sazbadalmi igénypontok
    1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál influenzavírus ribonukleinsav (vRNS) 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. szegmens legalább egy részével vagy a megfelelő (+) ribonukleinsavval.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál (-)RNS-sel.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál (+)RNS-sel.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál kettősszálú RNS-sel és háromszálű szerkezetet képez.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál az említett szegmensek transzkripciós indítóhelyének, transzlációs indítóhelyének, 5' nemtranszIálódó szekvenciájának, 3' nemtranszlálódó szekvenciájának, illetve intron/exon kapcsolódási helyének legalább egy részével.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizál egy primer indítóhely legalább egy részével.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 3-50 alegységet tartalmaz.
    • Η *
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 8-25 alegységet tartalmaz.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 10-20 alegységet tartalmaz.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag elfogadható hordozóban van jelen.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciák valamelyikének legalább egy részét tartalmazza:
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTCAAUU AU; UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGCAAACC AU; UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTACTGA TT; UCUCCCUCUC AGCAAAACCU UCCCGGAAAU GA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUAGAU AA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGAGUGAA AA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGUAGAUA UU vagy
    UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUGACA AA.
    • ·· • τ·'
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciák valamelyikének legalább egy részét tartalmazza:
    5' 3'
    TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT; TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT; TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA; GGA TCC TTC CCC GCG CTG GG; AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT; AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT; TGA GTG ACA TAC AAA TCA TG; AGC AAA AGC AG GTA GAT AA; AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT; TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT; GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC; TCG GCT TTG AG GGG CCT GA; CTG ATA GGC CTG CAA ATT TT; AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT; AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT; TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA; AGC AAA AGC AGG TAG ATA TT; TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT; GTG TTA GGA TCC ATT ATG TC; AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT; TAG TAT GTC CTG GAA GAG AA; AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT; AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT; GCC TCC GCA CCT GCT TCG CG vagy
    ·····
    AGC AAA AGC AGG GTC ACA AA.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag elfogadható hordozóban van jelen.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag elfogadható hordozóban van jelen.
  17. 17. A 13. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
  19. 19. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
  21. 21. Eljárás vélhetően influenzavírussal fertőzött ember és állatok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő személynek vagy állatnak olyan oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg hatásos mennyiségét adagoljuk, amely specifikusan hibridizál influenzavírus ribonukleinsav (vRNS) 1., <
    - 62 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. szegmens legalább egy részével vagy a megfelelő (+) ribonukleinsavval.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizál (-)RNS-sel.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizál (+)RNS-sel.
  24. 24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizál kettősszálú RNS-sel és háromszálú szerkezetet képez.
  25. 25. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizál az említett szegmensek transzkripciós indítóhelyének, transzlációs indítóhelyének, 5' nemtranszlálódó szekvenciájának, 3’ nemtranszlálódó szekvenciájának, illetve intron/exon kapcsolódási helyének legalább egy részével.
  26. 26. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizál egy primer indítóhely legalább egy részével.
  27. 27. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely mintegy 3-50 alegységet tartalmaz.
  28. 28. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alt kalmazunk, amely mintegy 8-25 alegységet tartalmaz.
  29. 29. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely mintegy 10-20 alegységet tartalmaz.
  30. 30. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot farmakológiailag elfogadható hordozóban alkalmazzuk.
  31. 31. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
  32. 32. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
  33. 33. Eljárás vélhetően influenzavírussal fertőzött ember és állatok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő személynek vagy állatnak olyan oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg hatásos mennyiségét adagoljuk, amely a következő szekvenciák valamelyikének legalább egy részét tartalmazza:
    UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTCAAUU AU; UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGCAAACC AU; UCUCCCUCUC AGAGCGAAAG CAGGTACTGA TT; UCUCCCUCUC AGCAAAACCU UCCCGGAAAU GA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUAGAU AA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGAGUGAA AA; UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGUAGAUA UU vagy
    4'
    - 64 UCUCCCUCUC AGAGCAAAAG CAGGGUGACA AA.
  34. 34. Eljárás vélhetően influenzavírussal fertőzött ember és állatok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő személynek vagy állatnak olyan oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg hatásos mennyiségét adagoljuk, amely a következő szekvenciák valamelyikének legalább egy részét tartalmazza:
    5’ 3 ’
    TTA TCT ACC CTG CTT TTG CT; TGG GAC GCC ATG ATT TTG AT; TTT GGT GCC TTG GGA CGC CA; GGA TCC TTC CCC GCG CTG GG; AGT AGA AAC AAG GGT ATT TT; AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT; TGA GTG ACA TAC AAA TCA TG; AGC AAA AGC AG GTA GAT AA; r AAT ATC TAC CTG CTT TTG CT; L- TAG AAG ACT CAT CTT TCA AT; GAG AGA ACG TAC GTT TCG AC; t. TCG GCT TTG AG GGG CCT GA; 9 CTG ATA GGC CTG CAA ATT TT; 1- AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT; AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT; TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA; 9 AGC AAA AGC AGG TAG ATA TT; 1- TTT GTC ACC CTG CTT TTG CT; GTG TTA GGA TCC ATT ATG TC; t. AGC AAT CTA CCT GAA AGC TT;
    *4·
    - 66 jellemezve, hogy a 3., 5. vagy 10. táblázat szerinti szekvencia legalább egy részét tartalmazza.
    42. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a 33. szekvencia legalább egy részét tartalmazza.
    43. A 41. vagy 42. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy farmakológiailag elfogadható hordozóban van jelen.
    44. A 41. vagy 42. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
    45. A 41. vagy 42. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid nukleotidegységei közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
    46. Eljárás vélhetően influenzavírussal fertőzött ember és állatok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő személynek vagy állatnak olyan oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg hatásos mennyiségét adagoljuk, amely a 3., 5. vagy 10. táblázat szerinti szekvencia legalább egy részét tartalmazza.
    47. Eljárás vélhetően influenzavírussal fertőzött ember és állatok kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő személynek vagy állatnak olyan oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg hatásos mennyiségét adagoljuk, amely a 33. szekvencia legalább egy részét tartalmazza.
    48. A 46. vagy 47. igénypont szerinti eljárás, azzal
    - 67 jellemezve, hogy az oligonukleotidőt vagy oligonukleotid analógot farmakológiailag elfogadható hordozóban alkalmazzuk.
    49. A 46. vagy 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike kéntartalmú csoport.
    50. A 46. vagy 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti kapcsoló csoportok legalább némelyike foszfor-tioát-tartalmú csoport.
    51. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot a gyógyszergyártásban szokásos hígító-, vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
    A meghatalmazott:
    Λίί··
    GY oldoJL ^G oldoJL
    KÖZZÉTÉTELI
    -63 0036^
    PÉLDÁNX. ÍBRi '9/4
    Influenza A vírus Ann Arbor H2N2 törzsből származó (+)RNS (mRNS) a 6. szegmensről szintetizálva/ nukleoprotein
    Szekvencia 5' - 3· irányban
HU9300364A 1990-08-14 1991-08-13 Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides HUT69956A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56728790A 1990-08-14 1990-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9300364D0 HU9300364D0 (en) 1993-05-28
HUT69956A true HUT69956A (en) 1995-09-28

Family

ID=24266540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300364A HUT69956A (en) 1990-08-14 1991-08-13 Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5580767A (hu)
EP (1) EP0543938A4 (hu)
JP (1) JPH06501843A (hu)
KR (1) KR970005274B1 (hu)
AU (1) AU652577B2 (hu)
BR (1) BR9106747A (hu)
CA (1) CA2089562A1 (hu)
FI (1) FI930628A (hu)
HU (1) HUT69956A (hu)
NO (1) NO930514L (hu)
WO (1) WO1992003454A1 (hu)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US7119184B2 (en) * 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
GB2273932A (en) * 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
CN1124980A (zh) * 1993-03-31 1996-06-19 海布里顿公司 具有改良抗流感活性的经修饰寡核苷酸
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6127533A (en) * 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
KR20010022452A (ko) 1997-07-31 2001-03-15 추후제출 플라비바이러스 감염에 대한 재조합 다이머형 엔벨롭 백신
CA2487328A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd. Sirna for control of gene expression
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6841539B1 (en) 1998-05-21 2005-01-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
TR200604211T1 (tr) * 1999-02-12 2007-02-21 Daiichi Sankyo Company Limiteddaiichi Sankyo Company Limited Yeni nükleosid ve oligonükleotid analoglarıYeni nükleosid ve oligonükleotid analogları
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6544958B2 (en) * 2001-03-26 2003-04-08 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence Of Her Majesty's Canadian Government Therapy of respiratory influenza virus infection using free and liposome-encapsulated ribonucleotides
US7452963B2 (en) * 2001-03-27 2008-11-18 Samuel Bogoch Replikin peptides and antibodies therefore
US7420028B2 (en) * 2001-03-27 2008-09-02 Samuel Bogoch Replikins and methods of identifying replikin-containing sequences
KR100906102B1 (ko) 2001-03-27 2009-07-07 사무엘 보고치 레플리킨 펩타이드 및 그의 이용
US7189800B2 (en) * 2001-03-27 2007-03-13 Samuel Bogoch Replikin peptides in rapid replication of glioma cells and in influenza epidemics
US20060160759A1 (en) * 2002-09-28 2006-07-20 Jianzhu Chen Influenza therapeutic
US20040242518A1 (en) * 2002-09-28 2004-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
WO2005030800A2 (en) * 2003-08-05 2005-04-07 Avi Biopharma, Inc. Oligonucleotide analog and method for treating flavivirus infections
WO2005013905A2 (en) * 2003-08-07 2005-02-17 Avi Biopharma, Inc. SENSE ANTIVIRAL COMPOUND AND METHOD FOR TREATING ssRNA VIRAL INFECTION
US20050222068A1 (en) * 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
US20050234002A1 (en) * 2004-01-23 2005-10-20 Mourich Dan V Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
CA2571593C (en) 2004-07-02 2015-04-21 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) * 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) * 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
US7923207B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing pools
US7935811B2 (en) 2004-11-22 2011-05-03 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing compositions
US20060166234A1 (en) 2004-11-22 2006-07-27 Barbara Robertson Apparatus and system having dry control gene silencing compositions
US20060240032A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-26 Hinrichs David J Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases
WO2006113743A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for rna interference with sialidase expression and uses thereof
US20060293268A1 (en) * 2005-05-05 2006-12-28 Rieder Aida E Antisense antiviral compounds and methods for treating foot and mouth disease
US7790694B2 (en) * 2005-07-13 2010-09-07 Avi Biopharma Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
WO2007030691A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
WO2007030576A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
KR20080086440A (ko) * 2005-11-01 2008-09-25 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 인플루엔자 바이러스 복제의 ＲＮＡｉ 억제
US8501704B2 (en) * 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
US7582615B2 (en) * 2006-03-07 2009-09-01 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
US8785407B2 (en) * 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
DK2024499T3 (da) * 2006-05-10 2018-01-29 Sarepta Therapeutics Inc Oligonukleotidanaloger med kationiske intersubunit-koblinger
ES2911034T3 (es) 2006-08-08 2022-05-17 Univ Bonn Rheinische Friedrich Wilhelms Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
EP2081949B1 (en) 2006-09-22 2014-12-10 GE Healthcare Dharmacon, Inc. Tripartite oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
CN101553252A (zh) * 2006-12-06 2009-10-07 诺华有限公司 包含来自于四株流感病毒的抗原的疫苗
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
EP2185196B1 (en) 2007-08-27 2014-06-11 Longhorn Vaccines & Diagnostics, LLC Immunogenic compositions and methods
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
WO2009085355A2 (en) 2007-10-01 2009-07-09 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection and transport system and methods of use
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
EP2297323A1 (en) 2008-05-21 2011-03-23 Hartmann, Gunther 5' triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
US8034922B2 (en) * 2008-08-22 2011-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for modulating activity of capped small RNAs
AU2009335740B2 (en) * 2008-12-17 2016-04-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
DK2396032T3 (en) 2009-02-10 2016-12-19 Seqirus Uk Ltd Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
AU2010319314C1 (en) * 2009-11-13 2016-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
KR102095478B1 (ko) 2010-05-28 2020-04-01 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
US8198429B2 (en) 2010-08-09 2012-06-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
US10017763B2 (en) 2010-09-03 2018-07-10 Sarepta Therapeutics, Inc. dsRNA molecules comprising oligonucleotide analogs having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
WO2013067873A1 (zh) * 2011-11-09 2013-05-16 南京森楠生物技术研究有限公司 抗流行性感冒病毒的核酸、肽核酸及其制剂
KR20210081448A (ko) 2011-11-18 2021-07-01 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 기능적으로-변형된 올리고뉴클레오티드 및 이의 서브유니트
WO2013112916A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
WO2015084846A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Brandeis University High temperature selection of nucleotide-supported carbohydrate vaccines and resulting glycosylated oligonucleotides
US9976136B2 (en) 2015-05-14 2018-05-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
EP3423107A4 (en) * 2016-03-02 2020-01-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University PAN-GENOTYPIC AGENTS AGAINST INFLUENZA VIRUS AND METHODS OF USE THEREOF
US11339392B2 (en) 2016-03-02 2022-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same
WO2018140354A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisense oligonucleotides that inhibit influenza virus replication and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0081099A3 (en) * 1981-12-04 1983-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Capped oligonucleotide anti-viral agents
NZ209840A (en) * 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
US5190931A (en) * 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
FR2568254B1 (fr) * 1984-07-25 1988-04-29 Centre Nat Rech Scient Application d'oligonucleotides lies a un agent intercalant, notamment a titre de medicament
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
DE3929144A1 (de) * 1989-09-02 1991-03-07 Behringwerke Ag Nachweis von influenza-a-virus durch polymerase-kettenreaktion (pcr) nach reverser transkription eines bereichs des viralen haemagglutinin-gens
US5166195A (en) * 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
FI930628A (fi) 1993-03-24
EP0543938A1 (en) 1993-06-02
EP0543938A4 (en) 1993-11-10
NO930514D0 (no) 1993-02-12
AU8536091A (en) 1992-03-17
HU9300364D0 (en) 1993-05-28
US5580767A (en) 1996-12-03
CA2089562A1 (en) 1992-02-15
FI930628A0 (fi) 1993-02-12
WO1992003454A1 (en) 1992-03-05
KR930701466A (ko) 1993-06-11
BR9106747A (pt) 1993-07-20
NO930514L (no) 1993-04-02
KR970005274B1 (ko) 1997-04-15
JPH06501843A (ja) 1994-03-03
AU652577B2 (en) 1994-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT69956A (en) Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides
EP0527906B1 (en) Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotides
JP4118348B2 (ja) Ｇキャプ安定化したオリゴヌクレオチド
US6034233A (en) 2&#39;-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
Zerial et al. Selective inhibition of the cytopathic effect of type A influenza viruses by oligodeoxynucleotides covalently linked to an intercalating agent
EP0664833B1 (en) Therapeutic anti-hiv oligonucleotide and pharmaceutical
Shu et al. Evidence for interspecies transmission and reassortment of influenza A viruses in pigs in southern China
AU697234B2 (en) Antisense oligonucleotides and therapeutic use thereof in human immunodeficiency virus infection
CA2646026C (en) Nucleic acid primers and probes for detecting human and avian influenza viruses
NZ263985A (en) Oligonucleotide complementary to an essential amino acid sequence of influenza virus
US5442049A (en) Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections
CA2308852A1 (en) Rnase l activators and antisense oligonucleotides effective to treat rsv infections
NZ255087A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates and their use
HUT63430A (en) Process for producing oligonucleotides influencing the effect of cytomegalovirus infection
US20160281089A1 (en) Prevention of viral infectivity
US20030087851A1 (en) Pharmaceutical composition for treating or preventing influenza, and novel oligonucleotide
CA2211877A1 (en) Human immunodeficiency virus transcription inhibitors and methods of their use
US11046958B2 (en) Antisense oligonucleotides that inhibit influenza virus replication and uses thereof
JPH10313872A (ja) 抗インフルエンザウイルス剤
AU736470C (en) RNase L activators and antisense oligonucleotides effective to treat RSV infections
WO1999000147A1 (en) Antigenomic oligodeoxynucleotides for treatment of infection by negative-stranded nonsegmented rna viruses
CA2396240A1 (en) Methods for inhibiting/treating hiv infections and aids related symptoms
JPWO2021201996A5 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee