JP2001500530A - キメラ及び交互のオリゴヌクレオチドを用いたｒａｓ遺伝子のアンチセンス阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 正常と活性型、両方のヒトｒａｓ遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法が提供される。ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互のメチレン（メチルイミノ）結合を有するオリゴヌクレオチドが提供される。ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互のメチレン（メチルイミノ）結合を有する第一領域及びホスホロチオエート結合を有する第二領域を有するオリゴヌクレオチドがさらに提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の活性化より生じる病態の診断、検出及び治療の方法を含む、診断並びに研究目的のために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラ及び交互のオリゴヌクレオチドを用いたｒａｓ遺伝子のアンチセンス阻害 関連出願 本出願は、１９９５年４月１３日に出願された米国特許出願第４１１，７３４ 号、１９９３年１０月１日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９３４ ６号、１９９１年６月１４日に出願され、現在放棄された米国特許出願第７１５ ，１９６号、１９９２年１０月５日に出願され、現在放棄された米国特許出願第 ９５８，１３４号、１９９４年７月１９日に出願され、米国特許第５，５８２， ９８６号として発行された米国特許出願第２９２，０８６号、１９９３年１月２ １日に出願され、現在放棄された米国特許出願第０８／００７，９９６号、１９ ９４年７月２６日に出願され、米国特許第５，５７６，２０８号として発行され た米国特許出願第２９７，２４８号、１９９１年５月２１日に出願され、米国特 許第５，３７８，８２５号として発行された米国特許出願第７０３，６１９号、 １９９３年３月３１日に出願され、米国特許第５，３８６，０２３号として発行 された米国特許出願第０４０，９０３号、１９９３年３月３１日に出願され、米 国特許第５，４８９，６７７号として発行された米国特許出願第０４０，５２６ 号、１９９３年１２月２８日に出願され、米国特許第５，５４１，３０７号とし て発行された米国特許出願第１７４，３７９号、１９９３年３月３１日に出願さ れ、現在放棄された米国特許出願第０４０，９３３号、１９９４年９月２日に出 願され、米国特許第５，６１８，７０４号として発行された米国特許出願第３０ ０，０７２号、１９９３年３月３０日に出願され、現在放棄された米国特許出願 第０３９，９７９号、１９９５年２月２７日に出願され、米国特許第５，６２３ ，０７０号として発行された米国特許出願第３９５，１６８号、１９９１年１２ 月２４日に出願され、現在放棄された米国特許出願第８１４，９６１号、１９９ ２年１２月２３日に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号 、及び１９９４年６月２１日に出願され、米国特許第５，６２３，０６５号とし て発行された米国特許出願第２４４，９９３号及び１９９５年６月６日に出願さ れた 米国特許出願第４６８，０３７号の部分継続出願であり、上記のいずれもそのま ま本明細書に参考文献として援用する。 発明の技術分野 本発明は、腫瘍形成との関連が示唆されてきた活性化型へ時々変換する天然に 存在する遺伝子、ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法に関する 。本発明はまた活性化型ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に阻害することに向けられ ている。本発明はさらに細胞及び組織内ｒａｓ遺伝子の正常及び活性化型を検出 することにも向けられていて、研究及び診断用の研究試薬及びキットの基礎を形 成し得る。さらに、本発明はｒａｓ遺伝子の活性化より生じるような病態の治療 に向けられている。本発明はまた、ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するための安定化 オリゴヌクレオチド、ｒａｓのＲＮＡターゲットに対する親和性を高めるように さらに修飾されたオリゴヌクレオチド、及びｒａｓのＲＮＡターゲットを配列特 異的に消滅させ得るようにさらに修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。 発明の背景 細胞の成長及び分化を直接的又は間接的に制御する細胞遺伝子に変化が起こる ことが癌の主因であると考えられている。ヒトの腫瘍形成との関連が示唆されて いる、癌遺伝子と呼ばれる約３０の遺伝子ファミリーがある。そのようなファミ リーのメンバーであるｒａｓ遺伝子ファミリーは、ヒト腫瘍において突然変異し ていることがしばしば見出されている。その正常な状態では、ｒａｓ遺伝子によ って産生されるタンパク質は正常な細胞成長及び成熟化に関わっていると考えら れている。ｒａｓ遺伝子の突然変異は、このタンパク産物における３つの重要部 位の１つでアミノ酸を変化させ、腫瘍形成に関連すると考えられる形態への変化 をもたらす。このような突然変異部分を有する遺伝子は「活性化された」と言わ れる。ｒａｓ活性化につながるこのような点突然変異は、発癌物質又は他の環境 因子によって誘発され得ると考えられている。膵臓性腺癌の９０％以上、結腸の アデノーマ及び腺癌の約５０％、肺の腺癌及び甲状腺癌の約５０％、及び急性骨 髄性白血病及び骨髄形成異常症候群のような血液の悪性腫瘍の大部分に、活性化 されたｒａｓ癌遺伝子を含むことが見出されている。全体的に見て、ヒト腫瘍の 約１０〜２０％は、３つのｒａｓ遺伝子（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ又はＮ−ｒａ ｓ）の１つに突然変異を有している。 ある特定の腫瘍細胞において活性化癌遺伝子の発現を阻害すると、その細胞を より正常な成長の習性へ戻すことが可能になる。例えば、Feramiscoら、Nature 1985，314，639‐642は、活性化ｒａｓ遺伝子によって悪性腫瘍の状態へ転換さ れた細胞にｒａｓ遺伝子のタンパク産物に結合する抗体をマイクロインジェクシ ョンすると、細胞が増殖速度を緩め、より正常な外観を呈するようになることを 実証した。このことは、活性化ｒａｓ遺伝子産物が癌細胞特有の無制御な成長に 関与していることの傍証として解釈されている。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、ＱＴ延長症候群と呼ばれる重篤な心臓性不整脈との関連 が最近示唆されている。これは直ぐに治療を施さないとしばしば突然死を引き起 こす遺伝性疾患である。不規則な心拍が発現する前には症状が無いことが多い。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子がＱＴ延長症候群のまさに原因であるかどうかは不明である。 しかしながら、この疾患の遺伝とＨ−ｒａｓ遺伝子の周囲にある染色体１１領域 の特殊な変異体の存在との間には非常に高い相関性がある。従って、Ｈ−ｒａｓ 遺伝子は、ＱＴ延長症候群による突然心臓死の高リスク性の有用な指標になる。 ｒａｓ遺伝子の発現を調節し得る物質の組成物を提供すること、及び特にｒａ ｓ遺伝子の活性化型の発現を特異的に調節する物質の組成物を提供することが大 いに所望されている。動物のｒａｓ遺伝子の診断及び検出の方法を提供すること が大いに所望されている。ｒａｓ遺伝子の活性化より生じる病態の診断及び治療 の方法を提供することも所望されている。さらに、ｒａｓ遺伝子の検出及び研究 のための改良された研究キット及び試薬が所望されている。 癌遺伝子発現の阻害は、２キロベースのＫｉ−ｒａｓ癌原遺伝子ＲＮＡセグメ ントを発現するレトロウイルスベクター又はプラスミドベクターをアンチセンス 配向で用いることによって達成されている(Mukhopadhyay,T.ら(1991)Cancer Res earch 51，1744‐1748；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１８５２（ＷＯ９ ２／１５６８０）；Georges，R．N．ら（1993）Cancer Research，53，1743‐1 746）。 癌遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、様々な癌遺伝子ファミリ ーの役割を理解する上で有用なツールであることがわかっている。アンチセンス オリゴヌクレオチドはある遺伝子の「センス」又はコーディング鎖に相補的であ り、このためこの遺伝子のｍＲＮＡ転写物に相補的であり、安定かつ特異的にハ イブリダイズし得る。Holtら、Mol．Cell Biol．1988，8，963‐973は、癌遺伝 子ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリ ゴヌクレオチドが、培養ＨＬ６０白血病細胞に加えられると、その増殖を阻害し 、分化を誘導することを示した。Anfossiら、Proc．Natl．Acad．Sci．1989，86 ，3379‐3383は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子のｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイ ズするアンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト骨髄性白血病細胞系の増殖を阻害 することを示している。Wickstromら、Proc．Natl．Acad．Sci．1988，85，1028 ‐1032は、ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオ リゴヌクレオチドによって、ＨＬ６０培養白血病細胞の増殖だけでなく、ｃ−ｍ ｙｃ癌遺伝子のタンパク産物の発現も阻害されることを示した。米国特許第４， ８７１，８３８号（Bosら）は、Ｎ−ｒａｓのコドン１３の突然変異部分に相補 的で、前記突然変異を検出するオリゴヌクレオチドを開示している。米国特許第 ４，８７１，８３８号（Bosら）は、ｒａｓタンパク質をコードするＤＮＡの突 然変異を検出するためのプローブとして有用な分子を開示している。 上記のすべてにおいて、非修飾オリゴヌクレオチドの不安定性が主要な問題に なっているのは、それが細胞の酵素による分解を受けやすいからである。ＰＣＴ ／ＵＳ８８／０１０２４（Zonら）は、増幅されたｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の翻訳開 始領域にハイブリダイズし得て、ＨＬ−６０白血球細胞の成長及びこれらの細胞 内のＤＮＡ合成を阻害するホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを開示して いる。Tiddら、Anti‐Cancer Drug Design 1988，3，117‐127は、活性化さ れたＮ−ｒａｓ癌遺伝子に特異的にハイブリダイズするメチルホスホネートのア ンチセンスオリゴヌクレオチドを評価し、それが生化学的な分解に抵抗し、培養 ヒトＨＴ２９細胞には無毒である一方、Ｎ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害せず、こ れらの細胞に対して何の効果も無いことを見出した。Changらは、マウスのＢａ ｌｂ−ｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズするメチル ホスホネート及びホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドがいずれもインビト ロでこの遺伝子のタンパク産物の翻訳を阻害し得ることを示した（Changら、、A nti‐Cancer Drug Design 1989，4，221‐232；Brownら、Oncogene Research 19 89，4，243‐252）。ｒａｓのｐ２１タンパク産物のインビトロ翻訳に抗するこ れらオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性とＴ_mがさして相関しないことが認 められた。Changらによって使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｒ ａｓ遺伝子の翻訳開始領域と特異的にハイブリダイズするので、それらが活性化 されたｒａｓに対して何らかの選択性を示すことは期待されていないし、これら オリゴヌクレオチドの正常（野生型）対突然変異（活性化型）ｒａｓ遺伝子に対 する結合能力は比較されなかった。 Heleneと共同研究者は、アクリジン挿入剤及び／又は疎水性テールに結合した ９−ｍｅｒのホスホジエステルを用いて、活性化された（コドン１２のＧ→Ｔ転 移）Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡの発現が選択的に阻害されることを示した。この化合 物は、低いマイクロモル濃度でのＲＮアーゼアッセイ及び細胞増殖アッセイのい ずれでも突然変異体のｒａｓメッセージの選択的ターゲティングを示した（Sais on‐Behmoaras，T．ら、EMBO J．1991，10，1111‐1118）。Changと共同研究者 は、突然変異体のＨ−ｒａｓメッセージの選択的ターゲティングを開示している が、ここでのターゲットは、Ａ→Ｔ変換を含むＨ−ｒａｓコドン６１であり、利 用されたオリゴヌクレオチドは、１１−ｍｅｒのメチルホスホネート又はそのソ ラレン誘導体のいずれかであった。活性のために７．５〜１５０μＭの濃度を必 要とするこれらの化合物は、正常のｐ２１に比較して突然変異体Ｈ−ｒａｓのｐ ２１の発現を選択的に阻害することが、免疫沈降法によって示された（Changら 、Biochemistry 1991，30，8283‐8266）。 塩基ミスマッチに対する△△Ｇ°₃₇を増加させる修飾されたヌクレオチドは、 選択性を向上させるために使用され得る。△△Ｇ°₃₇は、最も安定なミスマッチ に対する１〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌから最も不安定なミスマッチに対する５〜６ｋ ｃａｌ／ｍｏｌの範囲に及ぶことが見出されている。従って、突然変異体ターゲ ットに対する選択性を最大化することが可能であるとき、安定なミスマッチ（例 、Ｇ→Ａ）をもたらす突然変異は、不安定なミスマッチ（例、Ｃ→Ｇ、Ｕ→Ｇ、 Ａ →Ｃ）をもたらす突然変異より好ましくない。この例は、家族性アルツハイマー 病に関連した常染色体の優性突然変異に見出され得る。β−アミロイド前駆体遺 伝子の３つの異なる点突然変異は、この疾患と共分離することが示された。これ らの突然変異は、Ｇ→Ａ（△△Ｇ°₃₇＝＋１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｇ→Ｔ（ △△Ｇ°₃₇＝＋３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びＴ→Ｇ（△△Ｇ°₃₇＝＋６．３ｋ ｃａｌ／ｍｏｌ）を含む（Goateら、Nature 1991，349，704‐706；Murrelら、 Science 1991，254，97‐99；Chartier‐Harlinら、Nature 1991，353，844‐ 846）。この場合、Ｔ→Ｇ突然変異をターゲットにすることが、アンチセンスオ リゴヌクレオチドによるβ−アミロイド突然変異体に対する最大の選択性をもた らすと考えられている。 非修飾ホスホジエステルのヌクレオシド間結合又は修飾されたホスホロチオエ ートのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞性ＲＮア ーゼＨの基質となる、つまり、それらはＲＮアーゼＨによるターゲットＲＮＡの 開裂を活性化する（Dagle，J．M．，Walder，J．A．及びWeeks，D．L．，Nuclei c Acids Research 1990，18，4751；Dagle，J．M．，Weeks，D．L．及びWald er，J．A．，Antisense Research And Development 1991，1，11；及びDagl e，J．M．，Andracki，M．E．，DeVine，R．J．及びWalder，J．A．，Nucleic Acids Research 1991，19，1805）。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖 のＲＮＡ鎖を開裂するエンドヌクレアーゼであり、従ってこの酵素が活性化され ると、ＲＮＡターゲットが開裂され、ターゲットＲＮＡの発現を阻害するアンチ センスヌクレオチドの能力を増強し得る。Walderらは、ツメガエルの胚において 、ホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合がいずれもエクソヌクレアー ゼによる分解を受けやすいことを認めている。このようなヌクレアーゼ分解が好 ましくないのは、それによってＲＮアーゼＨの活性化に供されるオリゴヌクレオ チドが急激に枯渇されるからである。ＰＣＴ公開ＷＯ／０５３５８，Walderらは 、ＲＮアーゼＨの基質でありながらヌクレアーゼ抵抗性にするために３’末端の ヌクレオシド間結合を修飾したＤＮＡオリゴヌクレオチドを開示している。 ＲＮアーゼＨに対する基質要求性を維持しながらオリゴヌクレオチド修飾の有 益な特質を利用しようとする試みが、キメラオリゴヌクレオチドの利用につなが った（Giles，R．V．ら、Anti‐Cancer Drug Design 1992，7，37；Hayase， Y．ら、Biochemistry 1990,29,8793;Dagle,J.M.ら、Nucleic Acids Research 19 90，18，4751；Dagle，J．M．ら、Nucleic Acids Research 1991，19，1805 ）。キメラオリゴヌクレオチドは、２つ又はそれ以上の化学的に異なった領域を 含み、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドを含む。これらオリゴヌクレオ チドは、１つ又はそれ以上の有益な性質（例えば、増加されたヌクレアーゼ抵抗 性、増加された細胞内取込み、ＲＮＡターゲットに対する増加された結合親和性 、等）をもたらす修飾されたヌクレオチドの領域、及びＲＮアーゼＨ開裂を指令 する能力を保持している非修飾領域を通常含む。このアプローチは多種多様な骨 格修飾に対して利用されているが、そのほとんどは、単独ではＲＮアーゼＨの基 質にはならないメチルホスホネートである。ＲＮアーゼＨ感受性のホスホジエス テル結合を含むメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、インビトロでＲＮア ーゼＨによるターゲットＲＮＡ開裂を指令し得ることが見出された。大腸菌のＲ ＮアーゼＨを使用して、ターゲットＲＮＡ鎖のＲＮアーゼＨによる効率的な開裂 を指令するために必要とされる最少のホスホジエステルの長さは、３又は４つの 結合のいずれかであると報告されている（Quartin，R．S．ら、Nucleic Acids R esearch 1989，17，7253；Furdon，P．J．ら、Nucleic Acids Research 1989，1 7，9193）。インビトロの哺乳類ＲＮアーゼＨ開裂アッセイを使用した同様の研 究が報告された（Agrawal，S．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1990，87，140 1）。ここでは、様々な長さのホスホジエステルのメチルホスホネートを含む骨 格修飾の系列が開裂効率を指標にして試験された。この性質のオリゴヌクレオチ ドによって指令される効率的なＲＮアーゼＨ開裂に必要とされる最少のホスホジ エステルの長さは５つの結合である。さらに最近、メチルホスホネート／ホスホ ジエステルキメラが、大腸菌ＲＮアーゼＨを使用したインビトロのターゲットＲ ＮＡ開裂に対する特異性及び効率性を上昇させることが示された。Giles，R．V ．ら、Anti‐Cancer Drug Design 1992，7，37。これらの化合物はまた、ツ メガエルの卵母細胞及び培養哺乳類細胞において有効なアンチセンス阻害剤にな ると報告された。Dagle，J．M．ら、Nucleic Acids Res．1990，18，4751； Potts，J．D．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1991，88，1516。 ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０９５，Froehlerらは、ＲＮアーゼＨ活性化を可能 にしつつエクソヌクレアーゼに対する安定性を与えるために、ホスホロアミダイ ト、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートの結合によって３’及び／又 は５’末端が「キャップされた」キメラオリゴヌクレオチドを開示している。Ｐ ＣＴ公開ＷＯ９１／１２３２３，Pedersonらは、ＲＮアーゼＨの開裂を活性化す る中央のデオキシヌクレオチド領域の隣に、ＲＮアーゼＨを活性化しない修飾さ れた骨格（メチルホスホネート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデ ート又はホスホロアミデート）の付いた２つの領域が存在するキメラオリゴヌク レオチドを開示している。２’−デオキシオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ 分解に対して安定化されている一方で、ホスホロアミデート、アルキルホスホネ ート又はホスホトリエステル結合を有する骨格修飾オリゴヌクレオチド部分の間 に短い部分のホスホジエステル結合ヌクレオチドを配置することによって、ＲＮ アーゼＨ活性化を可能にする（Dagle，J．M．，Walder，J．A．及びWeeks，D．L ．，Nucleic Acids Research 1990，18，4751；Dagle，J．M．，Weeks，D．L． 及びWalder，J．A．，Antisense Research And Development 1991，1，11； 及びDagle，J．M．，Andracki，M．E．，DeVine，R．J．及びWalder，J．A，Nuc leic Acids Research 1991，19，1805）。ホスホロアミデート含有オリゴヌ クレオチドはエクソヌクレアーゼに対して安定化されたが、各ホスホロアミデー ト結合は、ホスホロアミデート含有オリゴヌクレオチドの測定Ｔ_m値で１．６℃ の損失をもたらした（Dagle，J．M．，Andracki，M．E．，DeVine，R．J．及びW alder，J．A，Nucleic Acids Research 1991，19，1805）。 このようなＴ_m値の損失は、オリゴヌクレオチドとそのターゲット鎖間のハイブ リダイゼーションが減少することを示している。 Saison-Behmoaras，T．，Tocque，B．，Rey，I．，Chassignol，M．，Thuong ，N．T．及びHelene，C．，EMBO Journal 1991，10，1111は、オリゴヌクレオ チドがＲＮアーゼＨの基質であってもＲＮアーゼＨによる開裂の効率が低いのは ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションが弱いためであると述べている。 キメラオリゴヌクレオチドは骨格修飾に限定されないが、ＲＮアーゼＨ感受性 のデオキシ残基のついた２’−リボース修飾を有するキメラオリゴヌクレオチド は、この骨格キメラほどは特徴付けられていない。ＥＰ公開２６０，０３２（In oueら）及びOhtsukaら、FEBS Lett，1987，215，327-330は、非修飾デオキシギ ャップを含む２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（これだけではＲＮアーゼＨ の基質にならない）を利用して、相補的なＲＮＡ鎖内の特定部位に対する大腸菌 ＲＮアーゼＨのインビトロ開裂を指向した。これらの化合物は、効率的なターゲ ットＲＮＡ開裂のためには最少で４塩基のデオキシギャップを必要とした。しか しながら、この性質のオリゴヌクレオチドは、哺乳類のＲＮアーゼＨを用いて開 裂効率を試験されなかったし、細胞内のアンチセンス活性も試験されなかった。 上記のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して安定化されなかった。 Ｏ−メチル以外の２’−リボース修飾の、ＲＮアーゼＨ開裂及びアンチセンス 活性を指向する能力に関する研究はきわめて限られている（Schmidt，S．ら、Bi ochim．Biophys．Acta 1992，1130，41）。 アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＲＮアーゼＨを用いてターゲットＲＮＡ 鎖を開裂することは有用であろうと認識されているものの、オリゴヌクレオチド のヌクレアーゼ抵抗性及びハイブリダイゼーションの適合度もきわめて重要であ る。ハイブリダイゼーション特性を維持又は向上させると同時にＲＮアーゼＨを 活性化し、ヌクレアーゼ抵抗性を提供し得る方法又は材料が切実に求められてい る。アンチセンス活性を増強するための方法及び材料に対する切実なニーズも存 在している。 発明の目的 ｒａｓ遺伝子の発現を阻害する、ｒａｓ・ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌタレオ チドを提供することが本発明の目的である。 活性型（突然変異体）ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に阻害する、ｒａｓ・ｍＲ ＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを提供することが本発明のもうひとつの目的 である。 本発明のさらにもうひとつの目的は、ｒａｓ遺伝子の発現を阻害する安定化オ リゴヌクレオチドを提供することである。 本発明のさらにもうひとつの目的は、ｒａｓ遺伝子の発現を阻害する、ｒａｓ ・ｍＲＮＡに相補的で、ｒａｓ・ｍＲＮＡターゲットに対する親和性を増すよう に修飾された、安定化オリゴヌクレオチドを提供することである。 さらに別の目的は、ｒａｓ・ｍＲＮＡに相補的でＲＮアーゼＨの基質になるオ リゴヌクレオチドを提供することである。 本発明の追加的な目的は、癌細胞の増殖を阻害するオリゴヌクレオチドを提供 することである。癌細胞の増殖を阻害する方法も本発明の目的である。 ｒａｓ遺伝子の正常（野生型）から活性化型への突然変異を検出することも、 本発明のもうひとつの目的である。 形態学的に類似した腫瘍の鑑別診断及び活性化ｒａｓ遺伝子の存在に基づいた ハイリスクな病態の同定も本発明のもうひとつの目的である。 本発明の更なる目的は、遺伝子の突然変異による、ｒａｓ遺伝子の野生型から 突然変異体の活性化型への変化から生じる病態の診断及び治療の方法を提供する ことである。 発明の要約 本発明に拠れば、修飾されたヌクレオシド間結合又は修飾されたヌクレオシド 単位を有する、ＤＮＡ又はＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。 １つの好ましい実施形態では、ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来のＤＮＡ又はＲＮＡに 相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のある好ましいオリゴヌクレ オチドには、交互の結合を有するオリゴヌクレオチド又は交互の結合を有するキ メラオリゴヌクレオチドがある。 上記のオリゴヌクレオチドはこの遺伝子の翻訳開始コドンに相補的であり、好 ましくはオリゴヌクレオチドがＣＡＴ配列を含むことが好ましい。別の好ましい 実施形態に拠れば、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２に相補的であるオリゴ ヌクレオチドが提供され、好ましくはＧＡＣ配列を含む。別のそのような実施形 態では、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子の突然変異コドン１２に相補的で、選択的にハ イブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。この実施形態では、そのよ うなオリゴヌクレオチドは好ましくはＧＡＣ配列を含む。 本発明のオリゴヌクレオチドは、便利にも及び望ましくは、製剤的に許容され る担体に存在する。 本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい１グループは、少なくとも１つのメチ レン（メチルイミノ）結合を有する。本発明のさらに好ましいオリゴヌクレオチ ドのグループは、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の少なく とも１つのメチレン（メチルイミノ）結合を有する。本発明のさらなるオリゴヌ クレオチドのグループは、選択されたＤＮＡ又はＲＮＡと特異的にハイブリダイ ズし得て、少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ）結合を有する第一領域及 び少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する第二領域を含む、８〜３０ のヌクレオチド単位を有するキメラオリゴヌクレオチドである。このキメラオリ ゴヌクレオチドのより好ましいグループでは、この第二領域は、少なくとも１つ のメチレン（メチルイミノ）結合をそれぞれ含む２つの第一領域に隣接されてい る。 本発明のキメラオリゴヌクレオチドのさらに好ましいグループでは、第一領域 は、２’位が修飾された少なくとも１つのヌクレオシド単位を含む。２’修飾に 好ましいのは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキル、２’−フルオロ 修飾である。本発明のキメラオリゴヌクレオチドで、好ましいオリゴヌクレオチ ドは、２’−デオキシヌクレオチドを含む第二領域を含む。この第二領域の最初 の好ましい長さは、少なくとも４ヌクレオチドの長さである。この第二領域のよ り好ましい長さは５〜９ヌクレオチドの長さである。 本発明のある好ましいキメラオリゴヌクレオチドでは、第一領域は、ホスホロ チオエート又はホスホジエステル結合と交互の少なくとも１つのメチレン（メチ ルイミノ）結合を有する。本発明のさらに好ましいオリゴヌクレオチドでは、第 一領域は、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の１つ、２つ又 は３つのメチレン（メチルイミノ）結合を有する。 他の好ましい実施形態に拠れば、ｒａｓの発現を阻害し、同時にヌクレアーゼ 抵抗性を増し、ｒａｓ・ｍＲＮＡターゲットに対する結合親和性を増して、ＲＮ アーゼＨの基質となる、ｒａｓ・ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが提供 される。 結合親和性の増加は、糖の２’位にある少なくとも１つのヌクレオチドの修飾 、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキルアミノ、２’−Ｏ −アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ修飾を含む修飾によってなされる のが現時点では好ましい。 いくつかの好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的な ｒａｓ・ｍＲＮＡに対する結合親和性を高めるように修飾されている少なくとも １つの領域、及びＲＮアーゼＨ開裂の基質になる領域を含むキメラオリゴヌクレ オチドである。１つのこのような実施形態では、ＲＮアーゼＨ基質領域は、ｒａ ｓ・ｍＲＮＡ結合親和性が増した２つの領域に隣接されている。 本発明の他の態様は、細胞又は組織におけるヒトｒａｓ遺伝子の発現を調節す るための方法、及び活性化につながる突然変異を有していることが疑われる活性 化ｒａｓ遺伝子の細胞又は組織における発現を特異的に調節するための方法に向 けられている。 本発明のいくつかの実施形態は、ｒａｓ遺伝子の発現を阻害する、及び活性化 ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に阻害するための方法に向けられている。 本発明の追加的な態様は、細胞又は組織内のｒａｓ遺伝子の検出方法、及び突 然変異した遺伝子を有していることが疑われる活性化ｒａｓ遺伝子を細胞又は組 織内で特異的に検出する方法に向けられている。このような方法は、ヒトｒａｓ 遺伝子を含むことが疑われる細胞又は組織を、前記遺伝子を検出するために、本 発明に拠るオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。 本発明の他の態様は、ｒａｓ遺伝子の活性化につながる突然変異を有すること が疑われる動物の診断及び治療の方法に向けられている。このような方法は、動 物又は動物由来の細胞、組織又は体液を、この遺伝子の発現を阻害する、この遺 伝子の活性化から生じる病態を治療する、又はその診断を実効化するために、本 発明によるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。 図表の簡単な説明 図１は、Ｈ−ｒａｓ翻訳開始コドン（ＡＵＧ）をターゲットにするオリゴヌク レオチドを用いた、ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現の用量応答的 な阻害を示す棒グラフである。ルシフェリン添加時の放出光量によってアッセイ されるルシフェラーゼ活性を定量して発現が測定される。 図２は、活性化Ｈ−ｒａｓ内の突然変異コドン−１２領域をターゲットにする オリゴヌクレオチドを用いた、ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現の 用量応答的な阻害を示す棒グラフである。ルシフェリン添加時の放出光量によっ てアッセイされるルシフェラーゼ活性を定量して発現が測定される。 図３は、アンチセンスホスホロチオエート化合物による、ｒａｓ−ルシフェラ ーゼ融合タンパク質の発現の単回用量阻害を示す棒グラフである。ルシフェリン 添加時の放出光量によってアッセイされるルシフェラーゼ活性を定量して発現が 測定される。 図４は、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズする１３個のアン チセンスオリゴヌクレオチドに対して得られたデータを要約した表及び棒グラフ である。各オリゴヌクレオチドに対して示されているのはその長さ、それが特異 的にハイブリダイズする活性化ｒａｓ遺伝子の領域、及びｒａｓ−ルシフェラー ゼ融合タンパク質の発現を阻害するその活性である。 図５は、ｒａｓ・ｍＲＮＡターゲット配列（５’→３’）、及びＨ−ｒａｓ翻 訳開始コドン（ＡＵＧ）とコドン１２領域をターゲットにするアンチセンスオリ ゴヌクレオチドの存在位置及び配列を示す。図５Ａは、ＡＵＧをターゲットにす る２つの２０−ｍｅｒ（２５０２と２５０３）、及びコドン１２をターゲットに する長さ５〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド系列を示す。図５Ｂは、ｒ ａｓ・ｍＲＮＡターゲット配列に関連したオリゴヌクレオチド２５０２、２５０ ３、６１８６及び２５７０を示す。 図６は、様々な用量のオリゴヌクレオチド２５０２、２５０３、６１８６及び 均一に２’−Ｏ−メチル化されたこれらホスホロチオエート・オリゴヌクレオチ ドによるｒａｓ−ルシフェラーゼの阻害を示す棒グラフである。 図７は、様々な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、突然変異（縞 の棒）及び正常（無地の棒）ｒａｓ−ルシフェラーゼのアンチセンス阻害を示す 棒グラフである。 図８は、用量依存的なｒａｓ阻害を示す連続した８つのパネルである。連続線 は野生型の活性であり、点線は活性化ｒａｓに対する活性を示す。 図９は、４７−ｍｅｒのＨ−ｒａｓＲＮＡへアピンターゲットに結合するアン チセンスオリゴヌクレオチドを示す２部分図である。図９Ａは、均一２’−Ｏ− メチルオリゴヌクレオチド（デオキシ数＝０）の付いたヘアピンターゲット及び ９塩基デオキシギャップ（デオキシ数＝９）を有する２’−Ｏ−メチルキメラオ リゴヌクレオチドの付いたヘアピンターゲットの、オリゴヌクレオチド濃度の関 数としてのゲルシフト分析である。レーン１〜８は、以下のオリゴヌクレオチド 濃度を含む：１）ゼロ；２）１０^-11Ｍ；３）１０^-10Ｍ；４）１０^-9Ｍ；５）１ ０^-8Ｍ；６）１０^-7Ｍ；７）１０^-6Ｍ；８）１０^-5Ｍ。図９Ｂは、シフトしたヘ アピンターゲット分画とアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度との関係を示す グラフである。◇：デオキシ数＝１７；●：デオキシ数＝９；▲：デオキシ数＝ ７；○：デオキシ数＝５；△：デオキシ数＝３；■：デオキシ数＝１；□：デオ キシ数＝０。（挿入図：４７−ｍｅｒＨ−ｒａｓヘアピンターゲットの構造をオ リゴヌクレオチド２５７０の配列とともに示す）。 図１０は、２’−Ｏ−メチルキメラホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド による相補的Ｈ−ｒａｓＲＮＡのＲＮアーゼＨ依存的な開裂を示すゲルである。 レーンの数字は、中央のデオキシギャップの長さを指す。 図１１は、ｒａｓコドン１２のＲＮＡ配列をターゲットにするホスホロチオエ ート２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を示す２部 分図である。図１１Ａは、均一な２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、均一な デオキシオリゴヌクレオチド、及び中央に１−、３−、５−、７−又は９−塩基 デオキシギャップを含むキメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの単回用量 活性（１００ｎＭ）を示す棒グラフである。図１１Ｂは、均一なデオキシ（▼） 又は中央に４−（■、◆）、５−（●）、７−（＋）又は９−塩基（▲）デオキ シギャップを含む２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの用量応答的な活性を示 す折線グラフである。 図１２は、均一なデオキシホスホロチオエート及び短縮したキメラオリゴヌク レオチドのｒａｓ−ルシフェラーゼに対するアンチセンス活性を示す棒グラフで ある。 図１３は、ｒａｓをターゲットにするホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオ リゴヌクレオチドを用いた、アンチセンス活性とＲＮアーゼＨ活性化能力との相 関性をデオキシギャップの長さの関数として示す折線グラフである。 図１４は、７塩基デオキシギャップを含むホスホロチオエート２’−修飾キメ ラオリゴヌクレオチドの用量応答的なアンチセンス活性を示す折線グラフである 。（▲）、均一なデオキシホスホロチオエート；（■）、２’−Ｏ−ペンチルキ メラ；（●）、２’−Ｏ−プロピルキメラ；（◆）、２’−Ｏ−メチルキメラ； （▼）、２’−Ｏ−フルオロキメラ。 図１５は、ホスホロチオエートとホスホジエステル骨格及び２’−Ｏ−メチル と２’−デオキシヌクレオチドの様々な組み合わせを有するキメラオリゴヌクレ オチドによるｒａｓ−ルシフェラーゼの用量依存的なオリゴヌクレオチド阻害を 示す折線グラフである。 図１６は、ヌードマウスにおけるＡ５４９ヒト細胞腫瘍に対するＩＳＩＳ２５ ０３の抗腫瘍活性を示す折線グラフである。 図１７は、陽イオン性脂質とともに投与されたｒａｓオリゴＩＳＩＳ２５０３ の、ヌードマウスにおけるＡ５４９ヒト細胞腫瘍に対する抗腫瘍活性を示す折線 グラフである。 図１８は、様々な２’糖修飾及びホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）骨格を有するオ リゴヌクレオチドとホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）骨格の２’−デオキシリボヌ クレオチドとの抗Ｈａ−ｒａｓ活性の比較を示す棒グラフである。 図１９は、３種のヒト結腸癌細胞系、Ｃａｌｕヒト、ＳＷ４８０及びＳＷ６２ ０におけるＫｉ−ｒａｓ・ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害を示す棒グラフであ る。 図２０は、Ｋｉ−ｒａｓ特異的なオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ６９５７及び ＩＳＩＳ６９５８によるＳＷ４８０ヒト癌細胞系の増殖阻害を示す棒グラフであ る。 図２１は、突然変異体Ｋｉ−ｒａｓのコドン−１２をターゲットにしたオリゴ ヌクレオチドで処置されたときに、野生型Ｋｉ−ｒａｓを発現するヒーラ細胞に 比較して、突然変異Ｋｉ−ｒａｓを発現するヒト癌ＳＷ４８０細胞におけるＫｉ −ｒａｓ・ｍＲＮＡ発現が選択的に阻害されることを示す棒グラフである。 図２２は、本発明のあるヌクレオチドの好ましい化学構造を図示する。 図２３及び２４は、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子又はスクランブル対照と特異的に ハイブリダイズするある好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの特質及び阻 害反応性をそれぞれ要約した表及び棒グラフを示す。この表は、オリゴヌクレオ チドの長さに沿った各位置における核酸塩基の組成及び化学を示す。棒グラフは 、オリゴヌクレオチドの各試験用量に対する、Ｔ−２４細胞における用量応答的 なＨ−ｒａｓ・ｍＲＮＡ阻害を要約する。 発明の詳細な説明 悪性腫瘍は、一連の段階的かつ進行性の変化を経て、癌細胞に特徴的な成長制 御の消失、即ち、不断の非調節増殖、周囲組織を侵襲する能力、他の臓器部位へ 転移する能力を獲得する。慎重に制御されたインビトロ研究により、正常及び新 生物細胞の成長を特徴づける因子が明らかにされ、細胞の成長及び分化を制御す る特定のタンパク質が同定されてきた。さらに、慎重に制御された定量的インビ トロアッセイにおける細胞の形質転換に関する研究により、形質転換された細胞 の表現型を誘導し得る特定の遺伝子が同定された。このような癌を引き起こす遺 伝子、又は癌遺伝子は、そのタンパク産物の発現調節の変化につながる突然変異 を介して形質転換誘導性を獲得すると考えられている。ある場合には、このよう な変化は、プロモーター及びエンハンサーのような非コードＤＮＡ調節ドメイン で起こり、癌遺伝子の転写活性を変化させ、その遺伝子産物の過剰又は過少発現 をもたらす。他の場合には、遺伝子の突然変異が癌遺伝子のコード領域内で起こ り、不活性である、過剰活性である、又は正常（野生型）遺伝子産物とは異なる 活性を示す、変化した遺伝子産物の産生につながる。 今日までに、３０種以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定されている。これ らの遺伝子は、そのタンパク産物の細胞内所在と推定される作用機序の両方に基 づいて分類され得る。ｒａｓ癌遺伝子は、形質膜の内表面に局在化している関連 タンパク質をコードする遺伝子ファミリーのメンバーである。ｒａｓタンパク質 については、アミノ酸レベルで高度に保存されていること、高い親和性及び特異 性でＧＴＰと結合すること、及びＧＴＰアーゼ活性を有することが示されている 。ｒａｓ遺伝子産物の細胞機能は不明であるが、その生化学的性質、並びにＧＴ Ｐ結合タンパク質、又はＧタンパク質として知られているシグナル伝達タンパク 質のクラスと著しくその配列が似ていることからも、形質膜を通した細胞外シグ ナルの伝達に関連した基本的な細胞調節機能において、ｒａｓ遺伝子産物は根源 的な役割を担っていることが示唆されている。 Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓと呼ばれる３種のｒａｓ遺伝子が哺乳 類ゲノムに同定されている。哺乳類のｒａｓ遺伝子は、そのコード配列内の単一 の点突然変異によって、形質転換誘導能を獲得する。天然に存在するｒａｓ癌遺 伝子内の突然変異は、コドン１２、１３及び１６に局在化している。Ｈ−ｒａｓ 、Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓの配列は知られている（Caponら、Nature 302 1983 ，33-37；Kahnら、Anticancer Res.1987 7，639-652；HallとBrown、Nucleic Acids Res．1985，13，5255-5268）。ヒトの腫瘍に見出されている活性化ｒ ａｓ突然変異のなかで最も一般的に検出されているのは、ＧＧＣからＧＴＣへの 塩基変化によってｒａｓタンパク産物のＧＴＰアーゼ調節ドメイン内でグリシン からバリンへの置換が起きているＨ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２である（Tabin ，C．J．ら、Nature 1982，300，143-149；Reddy，P．E．ら、Nature 1982，3 00，149-152；Taparowsky，E．ら、Nature 1982，300，762-765）。この単一の アミノ酸変化がｒａｓタンパク質の機能の正常な制御を破棄させ、正常に調節さ れる細胞タンパク質を不断に活性なものへ変換する。正常ｒａｓタンパク質のこ のような調節解除が正常な成長から悪性の成長への形質変換の原因であると考え られている。 本発明は、ヒトｒａｓ遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを提供する 。このようなオリゴヌクレオチドは、ヒトｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ 又はＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。本発明はまたｒａｓの突然変異型の 発現を選択的に阻害するオリゴヌクレオチドを提供する。 本発明の文脈では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸又はデオ キシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する 塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるオリゴマー、及び同様に機能する天然に は存在しない部分を有するオリゴマーを含む。このような修飾された又は置換さ れたオリゴヌクレオチドがしばしば自然の形態よりも好ましいのは、例えば、増 強された細胞内取り込み及びヌクレアーゼ存在下での増加された安定性のような 特質のためである。 本発明の好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例は、ホスホジエステル、ホス ホロチオエート又はヘテロ原子の糖間結合又はこれら結合のキメラ及び／又は交 互の混合物を含む。好ましいヘテロ原子の糖間結合は、ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂ 、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂− Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂及びＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂骨格（ホ スホジエステルはＯ−Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ₂）である。最も好ましいのは、Ｃ Ｈ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂結合である。このＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂ 結合は、例えば３’−デ（オキシホスフィニコ）−３’−［メチレン（メチルイ ミノ）］結合、それを短縮したメチレン（メチルイミノ）結合、さらに頭字語で 「ＭＭＩ」結合というように、様々に命名され得る。本発明のあるキメラ混在性 の骨格では、ホスホロチオエートヌクレオチドの領域の隣に、ヘテロ原子結合の 領域又は交互のヘテロ原子の領域及びホスホジエステル又はホスホロチオエート 結合の１つが存在する。 他の好ましいオリゴヌクレオチドは、アルキル及びハロゲンで置換された糖成 分を含み得る。好ましい置換される糖成分は、その２’位に以下の１つを含む： Ｆ、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃又はＯ（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_n ＣＨ₃；ここでｎは、０〜約１０である。 本発明のオリゴヌクレオチドは、限定しないが、アデニン、グアニン、チミン 、ウラシル及びシトシンを含む、プリン−９−イル及びピリミド−１−イルのヘ テロ環を含む標準的なヌクレオシド塩基を含む。他の好ましい実施形態は、少な くとも１つの修飾された塩基の形態を含み得る。このような修飾塩基のいくつか の特別な例は、２−（アミノ）アデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２− （イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、 ７−デアザ−プロピニルアデニン又はグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン 又はグアニン、５−メチルシトシン、５−プロピニルウラシル、２−チオウラシ ル、 ２−アミノウラシル及びシュードウラシルを含む。 本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、同時に、そのヌクレアーゼ抵抗性を 増すために修飾されたヌクレオチドを含み、そのｒａｓ・ｍＲＮＡに対する親和 性を高めるために修飾されたヌクレオチドを含み、ＲＮアーゼＨの基質になるヌ クレオチドを含み得る。１つの好ましい実施形態では、キメラオリゴヌクレオチ ドは、ｒａｓ・ｍＲＮＡ結合親和性を高めるために修飾された少なくとも１つの 領域、及びＲＮアーゼＨの基質になる領域を含む。オリゴヌクレオチドはまたヌ クレアーゼ抵抗性を高めるために修飾される。より好ましい実施形態では、ＲＮ アーゼＨの基質になる領域には、ｒａｓ・ｍＲＮＡ結合親和性を高めるために修 飾された２つの領域が隣接している。このような修飾の効果は、ｒａｓ遺伝子発 現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を大いに増強することである。 本発明に拠るオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約５０の核酸塩基単 位を含む。より好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは約８〜３０の核酸 塩基単位を含み、さらにより好ましくは、約１３〜２５の核酸塩基単位を有する 。理解されるように、核酸塩基単位とは、ホスホジエステル又は他の結合を介し て隣の核酸塩基単位に適切に結合している塩基−糖の組み合わせである。 本発明の文脈における「ハイブリダイゼーション」とは、通常は反対の核酸鎖 間で又は１つの核酸鎖の２領域での、ワトソン−クリック塩基対合としても知ら れる相補的な塩基間の水素結合を意味する。グアニンとシトシンは、３つの水素 結合を形成することが知られている相補的な塩基の例である。 「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドが非ターゲット配 列と非特異的に結合することを回避するほど十分な程度の相補性を示す。理解さ れているように、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、 そのターゲット核酸配列に対して１００％相補的である必要はない。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害： Ｈ−ｒａｓの翻訳開始コドン又は活性化Ｈ−ｒａｓのコドン１２点突然変異のい ずれかをターゲットにしたアンチセンスホスホロチオエート・オリゴヌクレオチ ド系列を実施例２〜５に記載されるｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター系を用い てスクリーニングした。この最初の系列のなかで、ｒａｓ−ルシフェラーゼ 活性を著しくかつ再現性よく阻害する６つのオリゴヌクレオチドが同定された。 これらオリゴヌクレオチド（いずれもホスホロチオエートである）の塩基配列、 配列参照番号及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯを表１に示す。 表１ 図１は、正常なｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子又は突然変異体のｒ ａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子のいずれかを発現している細胞を、増加 する濃度のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド２５０３(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２)で処置した用量応答実験を示す。この化合物は、Ｈ−ｒａｓＲＮＡ転 写産物の翻訳開始コドンをターゲットにしている。図１に示すように、このオリ ゴヌクレオチドで細胞を処置すると、ｒａｓ−ルシフェラーゼ活性が用量依存的 に阻害された。ＩＣ５０値は、正常及び突然変異ｒａｓターゲットの両方で約５ ０ｎＭを示した。対照オリゴヌクレオチドは、長さ２０塩基のランダムなホスホ ロチオエート・オリゴヌクレオチドである。結果は、オリゴヌクレオチドで処置 されていない形質転換細胞内のルシフェラーゼ活性に対する比率で表される。ｒ ａｓ翻訳開始コドンをターゲットにしたオリゴヌクレオチドが、突然変異と正常 のｒａｓの発現を抑制するのに同等に有効であるという観察事実が期待されるの は２つのターゲットがＡＵＧ翻訳開始部位を囲む領域で同一の配列組成を有して いるからである。 図２は、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド２５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で細胞を処置した用量応答実験を示す。この化合物は、突然変異体（ 活 性化）Ｈ−ｒａｓＲＮＡのコドン１２点突然変異をターゲットにしている。対照 オリゴヌクレオチドは、２０塩基の長さのランダムなホスホロチオエート・オリ ゴヌクレオチドである。結果は、オリゴヌクレオチドで処置されていない形質転 換細胞内のルシフェラーゼ活性に対する比率で表される。この図が示すように、 このオリゴヌクレオチドの増加する濃度で細胞を処置すると、ｒａｓ−ルシフェ ラーゼの突然変異型又は正常型のいずれかを発現している細胞において、ｒａｓ −ルシフェラーゼ活性が用量依存的に阻害された。しかしながら、このデータを 精査すると、オリゴヌクレオチド２５７０は、低濃度では、正常型に比較してｒ ａｓ−ルシフェラーゼの突然変異型に対して約３倍の選択性を示したことがわか る。実際、２５７０の示したＩＣ５０値は、ｒａｓ−ルシフェラーゼの非突然変 異型に対しては約２５０ｎＭであったのに対し、突然変異型に対しては約１００ ｎＭであった。 図３は、ｒａｓ−ルシフェラーゼの正常型又は突然変異型のいずれかを発現し ている細胞を、Ｈ−ｒａｓの翻訳開始コドン又はコドン１２点突然変異のいずれ かをターゲットにしたオリゴヌクレオチドの単回用量（０．５μＭ）で処置した 典型的な実験の結果を示す。試験されたアンチセンスホスホロチオエート・オリ ゴヌクレオチドは表１に示される。対照オリゴヌクレオチド（２５０４）は、長 さ２０塩基のランダムなホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドである。結果 は、オリゴヌクレオチドで処置されていない形質転換細胞内のルシフェラーゼ活 性に対する比率で表される。図３に示すように、ｒａｓ翻訳開始コドンをターゲ ットにした化合物２５０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、ｒａｓ−ルシフェラ ーゼ活性の阻害において最も有効であった。活性化Ｈ−ｒａｓのコドン１２点突 然変異をターゲットにした３つの化合物の中で、１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチ ド２５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）だけが正常型に比較してｒａｓ−ルシフ ェラーゼの突然変異型に対して選択性を示した。活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子に相補 的な全１３種のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びスクランブル対照オリゴ ヌクレオチド（１９６６）及び野生型ｒａｓのコドン１２領域に相補的な対照オ リゴヌクレオチド（２９０７）に関して得られたデータをまとめた図４にも、こ のことが示されている。この図に示すのは、各オリゴヌクレオチドの長さ、相補 的である領域、及びｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現を抑制する活 性である。コドン１２点突然変異をターゲットにするより長いホスホロチオエー トは、ｒａｓ−ルシフェラーゼの発現に対して実質的なアンチセンス活性を示す 一方で、ｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異型の発現を選択的に阻害しなかった 。コドン１２点突然変異をターゲットにした、１７ヌクレオチド長より短いホス ホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、ｒａｓ−ルシフェラーゼのいずれの型 に対しても活性を示さなかった。以上の結果は、ｒａｓ配列をターゲットにした ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの有効なアンチセンス活性を実証して いる。 Ｈ−ｒａｓ・ＡＵＧと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレ オチド：実施例２〜５に記載されるような一過性トランスフェクションアッセイ において、Ｈ−ｒａｓ・ＡＵＧコドンをターゲットにした３種の２０塩基ホスホ ロチオエート・オリゴヌクレオチドのｒａｓ−ルシフェラーゼ発現を阻害する能 力を比較した。結果を図５Ａ及び５Ｂに示す。表２に示すこれらのオリゴヌクレ オチド、ＩＳＩＳ２５０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、２５０３（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２）、６１８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の単回用量（１００ｎＭ ）でのｒａｓ−ルシフェラーゼ発現阻害をヒーラ細胞で試験した。３つのＡＵＧ −ターゲットオリゴヌクレオチドはいずれもｒａｓ−ルシフェラーゼ発現を有効 に阻害した。これら３つのホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドはまた各糖 の２’−Ｏ−メチル修飾で製造された。ＩＳＩＳ２５０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２）の２’−Ｏ−メチル化物もｒａｓ−ルシフェラーゼの発現を阻害した。こ のことは図６に示されている。 表２ 突然変異Ｈ−ｒａｓをターゲットにしたアンチセンスオリゴヌクレオチド （オリゴヌクレオチド配列は５’→３’で示す） （野生型） オリゴヌクレオチドの長さはアンチセンス活性及び特異性に影響する：Ｈ−ｒ ａｓのコドン１２点突然変異をターゲットにしたオリゴヌクレオチドもｒａｓ− ルシフェラーゼの発現を阻害することに有効であった。５〜２５塩基の長さに及 ぶ１１種のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成し、実施例２〜５に 記載されるような一過性トランスフェクションアッセイにおいて、突然変異及び 野生型ｒａｓ−ルシフェラーゼを阻害する能力を試験した。オリゴヌクレオチド は表２に示されている。１００ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度で、１５塩基又は それ以上の長さのオリゴヌクレオチドは、突然変異Ｈ−ｒａｓターゲットの発現 を阻害することが見出された。野生型に対する突然変異ｒａｓ−ルシフェラーゼ 発現の選択的な阻害が、長さ１５〜１９塩基のオリゴヌクレオチドに観察された 。野生型に比較した突然変異ｒａｓ−ルシフェラーゼ阻害の選択性が最も大きく 観察されたのは、１７−ｍｅｒの２５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で、約４ 倍であった。２５７０が配列特異的に作用していることを示すために、この化合 物の変異体（２９０７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を試験した。このオリゴヌ クレオチドでは、中央のアデノシン残基がシトシンに置換され、そのために野生 型 Ｈ−ｒａｓターゲットに対して完全に相補的になっている。従って、このオリゴ ヌクレオチドは、突然変異体のＨ−ｒａｓ配列と完全にハイブリダイズしたとき 、オリゴヌクレオチド／ＲＮＡ二本鎖の中央で単一ミスマッチを含むことになる 。図７に示すように、オリゴヌクレオチド２９０７は、突然変異ｒａｓ−ルシフ ェラーゼに比較して野生型ｒａｓ−ルシフェラーゼの発現を選択的に阻害したが 、その差は１００ｎＭのオリゴヌクレオチド用量で約５倍であった。 突然変異体のコドン１２領域に相補的な２つの１６−ｍｅｒおよび１８−ｍｅ ｒ（図５及び表２）を実施例２〜５に記載されているようにして試験した。図８ は、長さ１３、１５、１６、１７、１８及び１９塩基のオリゴヌクレオチドに対 するアンチセンス活性及び突然変異体選択性を用量依存的に決定した実験の結果 を示す。これらオリゴヌクレオチドに関して得られた結果は、突然変異体のＨ− ｒａｓ配列に対して活性であるこれらの化合物に選択性があることを示した。つ まり、長さ１６のオリゴヌクレオチド(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５)と１７塩基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が最大の選択性を示 したのである(それぞれ、４倍及び５倍)。１３塩基化合物の２５６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）はいずれの試験濃度でもアンチセンス活性を示さなかった。 デオキシギャップを有するキメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド：突然 変異体選択的１７−ｍｅｒ（２５７０）の配列に基づいて、末端領域が２’−Ｏ −メチルヌクレオシドから構成され、中央残基が「デオキシギャップ」を形成す るキメラホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの系列が合成 された。デオキシ残基の数は、ゼロ（すべて２’−Ｏ−メチル）〜１７（すべて デオキシ）に及んだ。これらのオリゴヌクレオチドを表３に示す。 表３ ２’−Ｏ−メチル末端（太字）及び中央デオキシギャップを有するキメラホスホ ロチオエート・オリゴヌクレオチド （突然変異コドン１２：ターゲット） 上記ヌクレオチドは、実施例６に記載されたようにしてハイブリダイゼーショ ン効率を、実施例８に記載されたようにして哺乳類ＲＮアーゼＨを用いたインビ トロＲＮアーゼＨ開裂を指令する能力を、及びアンチセンス活性を、特徴付けた 。完全な長さのＨ−ｒａｓ・ｍＲＮＡに対するアンチセンス活性は、実施例９に 記載されるように、レポーター遺伝子ルシフェラーゼに結合したｒａｓ応答性エ ンハンサーエレメントを用いて、Ｈ−ｒａｓ遺伝子発現がモニターされる一過性 の同時トランスフェクションレポーター遺伝子系を使用して決定された。 一本鎖２５−ｍｅｒＲＮＡターゲットに対するホスホロチオエートアンチセン スオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション：図５及び表２は、コドン１２ Ｇ→Ｕ点突然変異を含む活性化Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡをターゲットにする１５種 のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの配列を示す。これらオリゴヌクレ オチドの長さは５〜２５塩基に及び、その点突然変異付近が中央になる。突然変 異及び野生型２５−ｍｅｒＲＮＡターゲットに対する、４μＭオリゴヌクレオチ ド濃度でのこれらアンチセンスホスホロチオエートの融解温度（Ｔ_m）を測定し た。Ｔ_mは鎖長の増加とともに増加し、いかなる鎖長でも、突然変異体ターゲッ トに対するハィブリダイゼーションのＴ_mは、野生型ターゲットに対するものよ り高かった。オリゴヌクレオチド２９０７は、中央のアデノシン残基がシトシン に置換され、野生型Ｈ−ｒａｓターゲットに対して完全に相補的になっている、 ２５７０のホスホロチオエート１７−ｍｅｒ変異体である。予想されるように、 このオリゴヌクレオチドの野生型ターゲットに対するハイブリダイゼーションの 融解温度は、突然変異体ターゲットに対するそれよりも高かった。これは、オリ ゴヌクレオチド／ＲＮＡ二本鎖の点突然変異の部位に単一ミスマッチを含むため である。突然変異体Ｈ−ｒａｓターゲットに対して完全に相補的な１７−ｍｅｒ ホスホロチオエート（２５７０）に対しては、オリゴヌクレオチド濃度に対する Ｔ_mの依存性をもとに、熱力学的パラメーターが得られた。これらのデータを用 いて、オリゴヌクレオチドの突然変異体ターゲットに対するハイブリダイゼーシ ョンと野生型ターゲットに対するハイブリダイゼーションとの自由エネルギー較 差（△△Ｇ°₃₇）を決定した。ある一定のオリゴヌクレオチドに対しては、オリ ゴヌクレオチド濃度に対するＴ_m依存性から△△Ｇ°₃₇が得られる（Borer，P．N ．，ら、J．Mol．Biol．1974，86，843‐853）。２５７０に対する△△Ｇ°₃₇は 、＋１．８ｋｃａｌ／モルと算出された。 △△Ｇ°₃₇が増加するにつれて、野生型より突然変異体をターゲットにするた めに達成され得る選択性の最大値も著しく増加する。従って、△△Ｇ°₃₇を増加 させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの化学修飾は選択性を増強する。１つの このような修飾は、２，６−ジアミノプリンであり、これは、ｄＡよりも強くＵ 対する△△Ｇ°₃₇を増加すると考えられている。本発明の教示による選択性を得 るためには、ＲＮアーゼＨの基質要求性も利用され得る。この酵素がミスマッチ に結合又はミスマッチを開裂することができなければ、ミスマッチにＲＮアーゼ Ｈ認識部位を配置するキメラオリゴヌクレオチドを利用することによって、△△ Ｇ°３７によって与えられる以上の追加的な選択性が得られるだろう。このこと は実際に問題になることが判明している。なぜなら、ＲＮアーゼＨは、完全にマ ッチした二本鎖と単一ミスマッチを含む二本鎖とを判別し得るからである。 短いオリゴヌクレオチドターゲットに対する「デオキシギャップ」オリゴヌク レオチドのハイブリダイゼーション：実施例６に記載されるような２５−ｍｅｒ 合成オリゴリボヌクレオチド相補体に対する２’−Ｏ−メチルデオキシギャップ 系列のハイブリダイゼーション分析から、所定のオリゴヌクレオチドのＴ_m値は ２’−Ｏ−メチル含量に直接関連していることが示された。２’−Ｏ−メチル修 飾をデオキシ置換基で置き換えるにつれて、１つの修飾につき約１．５℃の割合 でＴ_m値は減少した。これらの実験において、２’−Ｏ−メチル修飾を含むオリ ゴヌクレオチドのＴ_m値は、同一配列の完全なデオキシ化合物のＴ_m値よりも高か った。 構造ＲＮＡターゲットに対する「デオキシギャップ」オリゴヌクレオチドのハ イブリダイゼーション：さらに別の実験では、コドン１２領域に安定なステムル ープ構造を含むより大きなＨ−ｒａｓターゲットに対してオリゴヌクレオチドを ハイブリダイズした。この構造Ｈ−ｒａｓターゲットへのアンチセンスハイブリ ダイゼーションに対する２’−Ｏ−メチル修飾の効果を、実施例７に記載される ようなゲルシフト分析によって決定した。 図９に示すように、全デオキシ１７−ｍｅｒがこのヘアピンターゲットと最も 安定でない二本鎖を形成したのに対し、全２’−Ｏ−メチル１７−ｍｅｒは最も 安定な二本鎖を形成した。これらオリゴヌクレオチドににおけるデオキシギャッ プのサイズが少なくなるにつれ、２’−Ｏ−メチル残基の数が増え、二本鎖の安 定性が増加した。 ＲＮＡターゲットの二次及び三次構造はアンチセンスオリゴヌクレオチドのハ イブリダイゼーションに影響を及ぼす。ｒａｓヘアピンターゲットの種々の領域 にハイブリダイズする１１−ｍｅｒキメラオリゴヌクレオチド系列を合成した。 ＩＳＩＳ５０５５はステム領域の左側にハイブリダイズする（ヘアピンを図９に 示す）。ＩＳＩＳ５０５６はループの左側にハイブリダイズする。ＩＳＩＳ５０ ９１はループの右側にハイブリダイズし、ＩＳＩＳ５１４７はステムの右側にハ イブリダイズする。いずれも２’−Ｏ−メチル領域が隣接した中央５−デオキシ ギャップを有する均一ホスホロチオエートである。ループの左側をターゲットに した１１−ｍｅｒだけが測定可能なほどにターゲットと結合したが、他の１１− ｍｅｒは測定可能なほどに結合しなかった。これらオリゴヌクレオチドのより長 いバージョンを合成したところ、これらの１３−ｍｅｒオリゴリボヌクレオチド はいずれもヘアピンターゲットと測定可能な結合を示したが、ゲルシフトアッセ イでは、ループの左側をターゲットにしたオリゴヌクレオチドが最も強い結合を 示した。 デオキシギャップオリゴヌクレオチドに指令されるＲＮアーゼＨ開裂：相補的 ＲＮＡのＲＮアーゼＨ開裂を指令する２’−Ｏ−メチルデオキシギャップオリゴ ヌクレオチドの能力を、実施例８に記載されるように、ＲＮアーゼＨの供給源と してヒーラ細胞の各抽出物を利用してインビトロで決定した。図１０に示すよう に、全修飾された２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド又は単一のデオキシ残基 を含むオリゴヌクレオチドでは開裂が観察されなかった。ＲＮアーゼＨ開裂を指 令できたのは、３、４、５、７又は９のデオキシ長を有するオリゴヌクレオチド である。５、７又は９のデオキシギャップが好ましく、７又は９のギャップが最 も好ましい。 完全長のｒａｓ・ｍＲＮＡに対するデオキシギャップオリゴヌクレオチドのア ンチセンス活性：２’−Ｏ−メチル修飾によってもたらされる増強されたターゲ ット親和性という有益な特質は、適切な長さのＲＮアーゼH感受性デオキシギャ ップをこれらの化合物に付けるという条件で、アンチセンス阻害に利用され得る 。実施例９に記載されるＨ−ｒａｓトランス活性化レポーター遺伝子系を用いて 、２’−Ｏ−メチルデオキシギャップオリゴヌクレオチドの、完全長のＨ−ｒａ ｓ・ｍＲＮＡに対するアンチセンス活性を試験した。アンチセンス実験は、単一 オリゴヌクレオチド濃度（１００ｎＭ）で最初実施された。図１１に示すように 、５又はそれ以上の残基のデオキシギャップを含むキメラ２’−Ｏ−メチルオリ ゴヌクレオチドがＨ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害した。これらの化合物は、全デ オキシの親化合物よりも強い活性を示した。 これらの活性化合物と、４つのデオキシ残基を含む２’−Ｏ−メチルキメラを 用いて、用量応答実験を実施した。図１１Ｂに示すように、これらオリゴヌクレ オチドによる完全長Ｈ−ｒａｓのオリゴヌクレオチド介在性阻害は、用量依存的 であった。最も活性な化合物は、７残基デオキシのキメラであり、全デオキシオ リゴヌクレオチドの約５倍の活性を示した。 短縮したキメラオリゴヌクレオチド：２’−Ｏ−メチル修飾によってもたらさ れる増強されたターゲット親和性は、短いキメラオリゴヌクレオチドに活性を与 えることが見出された。実施例９に記載されるようにして短い２’−Ｏ−メチル キメラオリゴヌクレオチド系列のＴ_m及び完全長のｒａｓに対するアンチセンス 活性が試験された。表４は、５塩基長又は７塩基長のデオキシギャップを有する 、１１、１３、１５及び１７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのＴ_mを示す 。全デオキシ１３−ｍｅｒとはきわめて対照的に、いずれの２’−Ｏ−メチルキ メラ１３−ｍｅｒもｒａｓ発現を阻害し、１１−ｍｅｒのひとつも活性であった 。 このことは表１２に示されている。 表４ キメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドによるインビトロの相対アンチセ ンス活性及びＲＮアーゼＨ開裂活性化能は、デオキシの長さとよく相関している （図１３）。 非対称デオキシギャップ：デオキシギャップは必ずしもキメラ分子の中央に位 置する必要はない。結合を増強するために１つの末端の２’位が修飾された領域 を有するヌクレオチドと残りの非修飾（２’デオキシ）分子部分を有するキメラ 分子もやはりｒａｓ発現を阻害し得ることが見出された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のオリゴヌクレオチド（突然変異コドン１２に相補的な１７−ｍｅｒ）では、 ７−デオキシギャップが１７−ｍｅｒの５’又は３’末端、又は分子内の様々な 部位に位置しているが、いずれもＲＮアーゼＨ活性化及びアンチセンス活性を示 した。しかしながら、５−塩基ギャップのほうが配置の影響をより受けやすいこ とが判明した。ギャップの位置によっては二本鎖のＲＮアーゼH活性化能及びア ンチセンス阻害性が弱くなったからである。従って、７−塩基デオキシギャップ のほうが好ましい。 他の糖修飾：２’−Ｏ−メチル以外の２’糖修飾がキメラオリゴヌクレオチド のアンチセンス活性に及ぼす効果を試験した。これらの修飾は、７−塩基デオキ シギャップが隣接する２’修飾ヌクレオチドを有する１７−ｍｅｒのオリゴヌク レオチドが、実施例６に記載されているようにして、２５−ｍｅｒのオリゴリボ ヌクレオチド相補体とハイブリダイズしたときに得られたＴ_m値と並べて、表５ に掲げられている。これらのオリゴヌクレオチドに対しては、２’位のアルキル の長さとＴ_m値との間に相関性が観察された。アルキルの長さが増加するにつれ て、Ｔ_m値が減少したのである。この系列で最大のＴ_m値を示したのは、２’−フ ルオロキメラオリゴヌクレオチドである。 表５ ７−デオキシギャップを有する２’−修飾１７−ｍｅｒ、ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣ ＧＧＣＧＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のとアンチセンス活性の相関性 実施例９に記載されるトランス活性化レポーター遺伝子アッセイを用いて、こ れら２’修飾オリゴヌクレオチドのＨ−ｒａｓに対するアンチセンス活性を試験 した。図１４及び表５に示すように、これら２’修飾キメラ化合物はいずれもｒ ａｓ発現を阻害し、２’−フルオロ７−デオキシギャップ化合物がその中で最も 活性であった。中央に５−デオキシギャップを有する２’−フルオロキメラオリ ゴヌクレオチドも活性であった。 ５塩基又は７塩基デオキシギャップを囲む２’−Ｏ−プロピル領域を有するＳ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のキメラホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドと２’ −Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドを比較した。Ｔ２４細胞におけるｒａｓ 発現は、７−デオキシギャップ及び均一なホスホロチオエート骨格を有する２’ −Ｏ−メチルと２’−Ｏ−プロピルいずれのキメラオリゴヌクレオチドでも阻害 された。デオキシギャップを５ヌクレオチドまで減少させると、ｒａｓ発現を阻 害したのは，２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドだけであった。 癌細胞におけるＨ−ｒａｓ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 ：ｒａｓのＡＵＧ領域に相補的な２つのホスホロチオエート・オリゴヌクレオ チド（２５０２、２５０３）、並びに、同一の配列と２’−Ｏ−メチル領域が隣 接した７塩基デオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチド（４９９８、 ５１２２）を、実施例１０に記載されるようにして試験した。上記のキメラオリ ゴヌクレオチドを表６に示す。 表６ ２’−Ｏ−メチル末端（太字）及び中央デオキシギャップ(ターゲット：ＡＵＧ) を有するキメラホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド 化合物２５０３がＴ２４細胞においてｒａｓ発現を７１％阻害したのに対し、 キメラ化合物（４９９８）は、ｒａｓ・ｍＲＮＡをさらに強く阻害した(８４％ 阻害)。ＡＵＧ領域にも相補的な化合物２５０３は、ｒａｓＲＮＡレベルを２６ ％減少させたのに対し、このオリゴヌクレオチドのキメラバージョン（５１２２ ）は、１５％の阻害を示した。このアッセイにはまた突然変異コドン１２をター ゲットにした２つのオリゴヌクレオチドも含まれていた。化合物２５７０（ＳＥ ＱＩＤ ＮＯ：３）はｒａｓＲＮＡを８２％減少させ、７−デオキシギャップを 有するこのオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルキメラバージョン（３９８５ ）は、ｒａｓＲＮＡを９５％減少させた。 オリゴヌクレオチド２５７０及び２５０３も、野生型（即ち、活性化されてい ない）Ｈ−ｒａｓコドン１２を有するヒーラ細胞において、ｒａｓ発現に対する その効果を決定するために試験された。これらのオリゴヌクレオチドはいずれも Ｔ２４細胞(活性化されたコドン１２を有する)ではｒａｓの発現を阻害したが、 ヒーラ細胞でのｒａｓ発現を阻害したのは、ｒａｓＡＵＧと特異的に阻害するオ リゴヌクレオチド（２５０３）だけである。活性化コドン１２と特異的にハイブ リダイズするオリゴヌクレオチド２５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ヒー ラ細胞ではｒａｓの発現を阻害しなかったが、これはこの細胞に活性化コドン１ ２ターゲットが無いためである。 活性化Ｈ−ｒａｓのコドン１２領域に相補的な１７−ｍｅｒのホスホロチオエ ート・オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド２５７０、並びに、２５７ ０と同一の配列を有し、それぞれ５、７及び９塩基のデオキシギャップを有する キメラホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、３９８０、３ ９８５及び３９８４（表３に示す）の、Ｔ２４細胞におけるｒａｓ発現阻害を（ 実施例１０に記載されるようにして）試験した。全２’−デオキシのオリゴヌク レオチド２５７０及びこの３つのキメラオリゴヌクレオチドは、Ｔ２４細胞にお いてｒａｓ・ｍＲＮＡレベルを減少させた。化合物３９８５（７−デオキシギャ ップ）及び３９８４（９−デオキシギャップ）がｒａｓ・ｍＲＮＡを８１％減少 させたのに対し、化合物３９８０（５−デオキシギャップ）はｒａｓ・ｍＲＮＡ を６１％減少させた。この配列を有しているが、５−デオキシ（４６８９）又は ７−デオキシ（４６９０）ギャップに隣接した２’−フルオロ修飾ヌクレオチド を有するキメラオリゴヌクレオチドもＴ２４細胞においてｒａｓ−免疫アッセイ の発現を阻害したが、７−デオキシギャップのほうが好ましかった（８２％阻害 ；５−デオキシギャップの２’−フルオロキメラは６３％阻害）。 癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：活性化ｒａｓのコドン１ ２領域に相補的な同一の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有する３種の１７− ｍｅｒオリゴヌクレオチドの、Ｔ２４癌細胞の増殖に対する効果を実施例１１に 記載されるようにして試験した。３９８５は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが隣 接した７−デオキシギャップを有し、４６９０は２’−Ｆ−ヌクレオチドが隣接 した７−デオキシギャップを有する（いずれもホスホロチオエートである）。癌 細胞の増殖に対するこれらオリゴヌクレオチドの効果は、ノーザンブロット分析 によって示されるｒａｓ・ｍＲＮＡ発現に対するそれらの効果とよく相関してい た：オリゴヌクレオチド２５７０は細胞増殖を６１％阻害し、２’−Ｏ−メチル キメラオリゴヌクレオチド３９８５は細胞増殖を８２％阻害し、２’−フルオロ キメラ類似体は細胞増殖を９３％阻害した。 細胞増殖に対するこれらオリゴヌクレオチドの用量応答試験では、２５ｎＭ〜 １００ｎＭの範囲において用量依存的な阻害が示された。オリゴヌクレオチド４ ６９０、３９８５及び２５７０のＩＣ５０値は、それぞれ４４ｎＭ、６１ｎＭ及 び９８ｎＭとされた。ランダムオリゴヌクレオチド対照は、試験した用量では無 効であった。 細胞増殖に対するＩＳＩＳ２５７０の効果は細胞タイプ特異的であった。この オリゴヌクレオチドによるＴ２４細胞増殖の阻害は、同じオリゴヌクレオチド（ １００ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度）によるヒーラ細胞の阻害に比べて４倍強 かった。ＩＳＩＳ２５７０はＴ２４に存在する活性化（突然変異体）ｒａｓコド ンをターゲットにしているが、野生型コドン１２を有するヒーラ細胞にはこれが 無いためである。 骨格が修飾されたキメラオリゴヌクレオチド：これまでの例で論じたオリゴヌ クレオチドは、均一なホスホロチオエート骨格を有していた。上記で論じた２’ 修飾キメラオリゴヌクレオチドは、均一なホスホジエステル骨格では、活性でな い。５−ヌクレオチドデオキシギャップに隣接する２’−Ｏ−メチル領域を有し 、Ｐ＝Ｓ骨格のギャップ領域及びＰ＝Ｏ骨格のフランキング領域を有するキメラ オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４２２６）が合成された。ギャップにＰ＝Ｏ骨格 を、フランキング領域にＰ＝Ｓを有するもうひとつのキメラオリゴヌクレオチド （ＩＳＩＳ４２２３）も合成された。これらのオリゴヌクレオチドを表７に示す 。 完全に２’−デオキシで、１つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４２４８）、２ つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５４６）、３つのホスホジエステル（ＩＳＩ Ｓ４５５１）、４つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５９３）、５つのホスホジ エステル（ＩＳＩＳ４６０６）又は１０のホスホジエステル結合（ＩＳＩＳ−４ ２４１）を分予の中央部分に含むホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレ オチドがさらに合成された。これらのオリゴヌクレオチドも表７に示されている 。 表７ 突然変異コドン１２をターゲットにする、２’−Ｏ−メチル末端（太字）及び、 ｓ（Ｐ＝Ｓ）又はｏ（Ｐ＝Ｏ）で示される中央デオキシギャップ骨格結合を有す るキメラ骨格（Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチド Didnamら、Nucleic Acids Res．1983，11，1475-1489に記載されるようにし て、オリゴヌクレオチドをヒーラ細胞粗抽出物において37℃でインキュベートし 、ヌクレアーゼ分解に対するその感受性を決定した。両端のホスホロチオエート ／２’−Ｏ−メチルの間に５つのジエステルギャップを有するオリゴヌクレオチ ド（４２３３）のＴ_1/2は７時間であった。ホスホロチオエート／２’−Ｏ−メ チル分予のなかに５つのホスホロチオエートギャップを有するオリゴヌクレオチ ドのＴ_1/2は３０時間であった。１〜１０のジエステル結合を有するオリゴヌク レオチドのセットにおいて、単一のホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレ オチド（４２４８）は、完全なホスホロチオエート分子であるＩＳＩＳ２５７０ と同じくらいヌクレアーゼに対して安定であり、ヒーラ細胞抽出物において５時 間経過しても分解されなかった。２−、３−及び４−ジエステルギャップを有す るオリゴヌクレオチドのＴ_1/2は、それぞれ、約５．５時間、３．７５時間及び ３．２時間であり、５又は１０デオキシ結合を有するオリゴヌクレオチドのＴ_{1/ 2} は、それぞれ、１．７５時間及び０．９時間であった。 骨格修飾キメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性：アンチセンス活性に は均一なホスホロチオエート骨格は必要とされない。実施例２〜５に記載される ようにして、ＩＳＩＳ４２２６及びＩＳＩＳ４２３３、並びにＩＳＩＳ２５７０ （全ホスホロチオエート／すべてデオキシ）、ＩＳＩＳ３９８０（全ホスホロチ オエート、２’−Ｏ−メチル両端の間にデオキシギャップ）及びＩＳＩＳ３９６ １（完全にホスホジエステル、２’−Ｏ−メチル両端の間にデオキシギャップ） のｒａｓ発現に対する効果を、ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター系で試験した 。 Ｐ＝Ｓ（即ち、ヌクレアーゼ抵抗性）ギャップ領域を有するオリゴヌクレオチド は、すべてｒａｓ発現を阻害した。このことは図１５に示されている。単一のホ スホジエステル（ＩＳＩＳ４２４８）又は１０個のホスホジエステル結合（ＩＳ ＩＳ４２４１）のいずれかを分子中央に含むホスホロチオエート骨格を有する２ つの完全な２’デオキシオリゴヌクレオチドについてもその活性をアッセイした 。単一のＰ＝Ｏを含む化合物が全Ｐ＝Ｓ分子とまさに同じくらい活性であったの に対し、１０個のＰ＝Ｏを含む同じ化合物は全く不活性であった。 ７塩基デオキシギャップ領域にのみホスホロチオエート骨格を有し、２’−Ｏ −メチルか２’−Ｏ−プロピルのいずれかであるフランキング領域にホスホジエ ステル骨格を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のキメラホスホロチオエート・オ リゴヌクレオチドを合成した。２’−Ｏ−プロピルジエステルのフランキング領 域を有するオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ発現を阻害し得た。 修飾された塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｒａｓ−ルシフ ェラーゼ遺伝子発現の阻害：突然変異したコドン１２のウラシルに相補的な部位 に２−（アミノ）アデニンを有する、活性化ｒａｓのコドン１２点突然変異に相 補的なアンチセンスホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド系列が記載された ように合成された。アデニンの２位にあるアミノ基がウラシルの２位の酸素と水 素結合し得るので、通常の２本ではなく３本の水素結合が形成される。このこと は、活性化ｒａｓ遺伝子に対する２−（アミノ）アデニン修飾アンチセンスオリ ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを強く安定化させるのに役立つ一方で 、野生型コドンに対するこのオリゴヌクレオチドの安定性に対しては、この部位 で修飾されたＡとＧのミスマッチがあるために、不安定化又は全体に何の影響も もたらさない。このことによって、所望のターゲットに対する修飾されたオリゴ ヌクレオチドの特異性が増加する。 この部位に単一の２，６−（ジアミノ）アデノシンを有し、他の点では修飾さ れていない均一のホスホロチオエート１７−ｍｅｒ(２５７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に同一の配列)は、ＲＮアーゼＨの基質として２５７０配列と少なくと も同じくらい有効であることが見出された。従って、それは有効なアンチセンス 分子となることが期待される。同一配列のデオキシギャップのあるホスホロチオ エ ート・オリゴヌクレオチド内のこの部位に単一の２−（ジアミハアデノシンを有 するオリゴヌクレオチドも、ＲＮアーゼＨ活性化を示す。 インビボの抗腫瘍データ：実施例１３及び１４に記載されるようにして、ＩＳ ＩＳ２５０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のインビボにおけるヒト腫瘍に対する 活性を評価した。これらの試験に利用したのは、ヌードマウスへ皮下移植され、 移植部位で腫瘍が成長する、ヒト肺腺癌細胞系（Ａ５４９）である。この細胞は Ｈａ−ｒａｓ遺伝子に突然変異を含まず、正常のＨａ−ｒａｓを実際に発現する ので、抗腫瘍活性を評価したのはＡＵＧ-指向性オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ ２５０３だけである。 第一の試験では、生理食塩水に溶かしたホスホロチオエート・オリゴヌクレオ チドを２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によって投与した。薬物処置を開始し たのは腫瘍が目に見えるようになったとき（腫瘍細胞接種後２８日目）で、処置 は隔日に実施した。図１６に示すように、無関係な対照ホスホロチオエート・オ リゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０８２で処置した後には腫瘍の成長に対して何の効 果も観察されなかった。しかしながら、Ｈａ−ｒａｓ特異的オリゴヌクレオチド のＩＳＩＳ２５０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）では、腫瘍の成長に対する顕著 な阻害が観察された。Ｈａ−ｒａｓ化合物の抗腫瘍効果が最初に観察されたのは 薬物処置の開始から２０日目であり、その後この試験期間を通して効果が継続し た。 第二の試験では、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドをカチオン性脂質 製剤（ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ）で調製し、実施例１５に記載されるようにして、 皮下注射によって投与した。腫瘍接種後１週間目に薬物処置を開始し、週３回、 ４週間だけ実施した。最初の試験で観察されたように、Ｈａ−ｒａｓ特異的な化 合物、ＩＳＩＳ２５０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の投与が腫瘍成長の際立っ た抑制を引き起こしたのに対し、無関係な対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳＩ ０８２）は有意な効果を示さなかった（図１７）。腫瘍体積の減少は、目に見え る腫瘍の出現後２０日目に初めて観察され、残りの試験期間を通して継続した。 細胞における２’修飾ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドの安定性：オリ ゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼに対する安定性を与えることは、細胞に おけるアンチセンス活性のために必要とされる。糖の２’位のある修飾は、骨格 修飾をしなくても細胞におけるアンチセンス効果を誘発するのに十分なヌクレア ーゼ活性をもたらすことが見出されている。図１８に示されるように、均一に２ ’−プロピル修飾されたホスホジエステル・オリゴヌクレオチド(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３)は、投与後２４時間で、同一の配列を有するホスホロチオエート２ ’−デオキシオリゴヌクレオチドと同等なレベルで、Ｔ２４細胞におけるＨａ− ｒａｓの発現を阻害することが見出された。均一な２’−メトキシホスホジエス テル・オリゴヌクレオチドもいくらかの活性を示した。２’−ペントキシ修飾は 、２’−プロポキシと少なくとも同等の活性であることが見出された。 Ｋｉ−ｒａｓに対して活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド：ヒトＫｉ−ｒ ａｓ癌遺伝子の５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域及びコード領域に相補的な オリゴヌクレオチドが設計され々（McGrath，J．P．ら、（1983）Nature 304， 501-506）。後者のオリゴヌクレオチドがターゲットにしたのは、Ｋｉ−ｒａｓ 介在性の形質転換を導く突然変異の部位であることが知られているコドン１２及 び６ｌ、さらにまた、形質転換に関与することが知られていないコドン３８であ る。これらのオリゴヌクレオチドを表８に示す。 表８ ヒトＫｉ−ｒａｓに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子のコドン１２に突然変異を含む、３種の結腸癌細胞系に 対するアンチセンス活性で１２種のＫｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌクレオチドをス クリーニングし、Ｋｉ−ｒａｓのｍＲＮＡレベルの測定により評価した。図１９ に示すように、試験した化合物の半分がＫｉ−ｒａｓ転写産物に対して有意な活 性（４０％阻害）を示したが、最も活性のある化合物は、５’−及び３’非翻訳 領域をターゲットにしたものであった。しかしながら、野生型コドン１２及び６ １に対して指向された化合物にもＫｉ−ｒａｓ発現の有意な阻害が観察された。 有意な活性を示した化合物は、試験したこれら３種の癌細胞系すべてに対して有 効であった。 これら化合物の用量応答分析は、５’−ＵＴＲをターゲットにするＩＳＩＳ６ ９５８及びＩＳＩＳ６９５７がこのオリゴヌクレオチド系列のなかでは最も強力 なＫｉ−ｒａｓ阻害剤であることを示した。Ｋｉ−ｒａｓ形質転換細胞系の増殖 を阻害する能力について、これら化合物を試験した。結腸癌細胞系ＳＷ４８０を オリゴヌクレオチドの単回用量（２００ｎＭ）で処置し、５日間にわたり細胞数 を測定した。図２０に示されるように、いずれのＫｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌク レオチドもＳＷ４８０細胞の増殖を効果的に阻害したが、ＩＳＩＳ６９５７（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）は、ＩＳＩＳ６９５８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０） よりも高い活性を示した。この活性の違いは、Ｋｉ−ｒａｓのｍＲＮＡ発現の阻 害によく相関している（図１９）。 正常Ｋｉ−ｒａｓに対する突然変異体Ｋｉ−ｒａｓ阻害の選択性：Ｋｉ−ｒａ ｓをターゲットとしたオリゴヌクレオチドが正常のＫｉ−ｒａｓに比較して選択 的に突然変異体のＫｉ−ｒａｓを阻害する能力が試験された。２種の細胞系が利 用された。突然変異体Ｋｉ−ｒａｓ（コドン１２、Ｇ→Ｔ変換）を発現するＳＷ ４８０細胞系及び正常Ｋｉ−ｒａｓを発現する細胞系（ヒーラ）である。２種の オリゴヌクレオチドが試験された。Ｋｉ−ｒａｓの５’−非翻訳領域をターゲッ トにする２０−ｍｅｒホスホロチオエートのＩＳＩＳ６９５７（ＳＥＱ ＩＤＮ Ｏ：２１）及びＫｉ−ｒａｓのコドン１２領域をターゲットにする１５−ｍｅｒ ホスホロチオエートのＩＳＩＳ７４５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）である。 処置後２４時間、Ｋｉ−ｒａｓのｍＲＮＡレベルを測定した。コドン１２指向性 の化合物は突然変異体Ｋｉ−ｒａｓを発現する細胞系において有効であった。し かしながら、図２１に示すように、５’−非翻訳領域をターゲットにしたＫｉ− ｒａｓオリゴヌクレオチドは、いずれの細胞系でもＫｉ−ｒａｓ発現の強力な阻 害剤であった。突然変異体のＫｉ−ｒａｓに対する選択性は、オリゴヌクレオチ ド濃度及びＲＮＡターゲットに対する親和性に依存していることが見出された。 デオキシギャップのついたＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチド：長さ６又は８ヌ クレオチドの中央２’−デオキシギャップ領域に隣接した２’−Ｏ−メチル修飾 を有するようにホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２ＬＫｉ−ｒａｓの５’−非翻訳領域をターゲットにする)を合成した。ノー ザンブロット分析によって決定されるように、ギャップのあるオリゴヌクレオチ ドはいずれもＫｉ−ｒａｓ発現に対して活性であった。均一に２’−Ｏ−メチル 化された化合物（デオキシギャップなし）は不活性であった。別のオリゴヌクレ オチド、ＩＳＩＳ７６７９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、Ｋｉ−ｒａｓの５’− 非翻訳／ＡＵＧ領域に相補的である）も、６−又は８−ヌクレオチドデオキシギ ャップをつけて合成されたとき、活性であることが見出された。 本発明によって使用されるオリゴヌクレオチドは、よく知られた固相合成技術 によって便宜的かつ定常的に合成され得る。このような合成装置は、アプライド バイオシステムを含むいくつかのベンダーによって販売されている。このような 合成に対する他の手段も利用され得るが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は、 定常的に合成する人々の技能の範囲内にある。また、ホスホロチオエート及びア ルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造する類似の技術を使用す ることもよく知られている。 本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｈ−ｒａｓ遺伝子由来のメッセンジャーＲＮ Ａに相補的であり、従ってそれとハイブリダイズするように設計されている。こ のようなハイブリダイゼーションが達成されると、メッスンジャーＲＮＡの正常 の役割に干渉し、細胞内のその機能を喪失させる。干渉されるメッセンジャーＲ ＮＡの機能は、タンパク質の翻訳部位へのＲＮＡの移動、ＲＮＡからタンパク質 の実際の翻訳、１つ又はそれ以上のｍＲＮＡ種を産生するＲＮＡスプライシング 、 及び恐らくは、ＲＮＡが動員され得る独立した触媒活性のようなすべての生きた 機能を含む。ＲＮＡ機能に対するそのような干渉の全体的な効果がＨ−ｒａｓ遺 伝子の発現に干渉することになる。本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドは、 ｒａｓ・ｍＲＮＡのＲＮＡ開裂を活性化するように設計されている。 他の哺乳類のｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓのタンパク産物は、最 初の８５アミノ酸ではＨ−ｒａｓと同一である。必ずしも同一でない、この３つ のｒａｓ遺伝予の核酸配列が知られており、当業者は、Ｎ−ｒａｓ及びＫ−ｒａ ｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを製造するときのガ イドとして本発明を活用することができるだろう。本発明の好ましい実施形態は 、Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡのコドン１２と特異的にハイブリダイズするアンチセン スヌクレオチドに関するが、本発明は、ｒａｓ遺伝子の他の点突然変異、特に配 列が当業者に知られていて明確化されている、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ及びＫ− ｒａｓのコドン１２、コドン１３及びコドン６１における点突然変異と特異的に ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを製造するときのガイドとして使用され 得る。 図２２は、本発明のある好ましいキメラオリゴヌクレオチドの化学構造上の態 様を示す。左側の構造は、それぞれの糖−ヌクレオシド塩基単位を連結する、Ｍ ＭＩ結合と略記されるある種のヘテロ原子結合を有するオリゴヌクレオチドを図 示する。上記のＭＭＩ結合を製造する特定の方法は、１９９５年１月３日発行の 米国特許第５，３７８，８２５号、１９９５年１月３１日発行の第５，３８６， ０２３号、１９９６年２月６日発行の第５，４８９，２４３号、１９９６年７月 ３０日発行の第５，５４１，３０７号、１９９７年４月２２日発行の第５，６１ ８，７０４号及び１９９７年４月８日発行の第５，６２３，０７０号に教示され ており、これらはいずれも参考文献として本明細書に援用する。ＭＭＩとはメチ レン（メチルイミノ）の略であるが、これもより複雑な化学名である、「３’− デ（オキシホスフィニコ）−３’［メチレン（メチルイミノ）］」を短縮した言 い方である。化学名はさておき、この結合は、上記の特許に記載された通りであ る。これら特許の結台はまた、Bhatら、J．Org．Chem．，1996，61，8186-8199 を含む本発明者とその共著者による様々な科学公表物及び本明細書に引用 されている種々の文献に記載されている。 図２２の中央に図示されているのは、互い違いの又は交互の結合を有するある オリゴヌクレオチドである。これらは交互のＭＭＩ及びホスホジエステル又はホ スホロチオエート結合から形成される。図２２の右側に記載されているものは、 中央の「ギャップ」内のホスホロチオエート結合領域、及びそれに隣接した混合 的または交互的、つまり図の中央の互い違いの結合から形成される化学構造を有 するオリゴヌクレオチドである。 図２２のＭＭＩ含有オリゴヌクレオチドでは、左側図の「ギャップ」領域のも のを除けば、様々なオリゴヌクレオチドの「フランキング」領域の残りのヌクレ オシド単位は、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド単位、つまり２’−ＯＭｅヌクレ オシドとして示されている。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる他の２’− 置換ヌクレオシド単位は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル及び２’−Ｏ− 置換アルキルヌクレオシドを含む。好ましい置換基はアルコキシ置換基、つまり エーテルである。最も好ましいのは、２’−Ｏ−メトキシエチルで置換されたヌ クレオシドである。Martin、P．，Helvetica ChimicaActa，1995，78，486-504 を参照のこと。 図２２に図示されているような特定の化学構造を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の様々なオリゴヌクレオチドに対して、Ｔ−２４細胞におけるＨ−ｒａｓ・ｍ ＲＮＡの産生を阻害する能力を試験した。この試験のために、Ｔ−２４細胞を６ 穴プレートで培養した後、カチオン性脂質（リポファクチン、ＧＩＢＣＯ）の存 在下、種々の上昇濃度のオリゴヌクレオチドで処置した。オリゴヌクレオチド１ ００ｎＭにつきリポファクチンは２．５μｇ／ｍｌの配分比である。オリゴヌク レオチド処置は無血清培地中で４時間実施した。処置後１８時間目に全ＲＮＡを 回収し、Ｈ−ｒａｓのｍＲＮＡ及び対照遺伝予のＧ３ＰＤＨに対するノーザンブ ロットによって分析した。このオリゴヌクレオチドの構造及び試験データを図２ ３及び２４に示す。データは、Ｇ３ＰＤＨシグナルに対して標準化した対照との 比として棒グラフで示されている。図２３及び２４に見られるように、本発明の 各オリゴヌクレオチドは、用量の全域で用量応答性を示した。ＭＭＩヌクレオシ ド単位を取り込んだキメラオリゴヌクレオチドは、Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡを最も 減少させ、フランキング領域のそれぞれに１又は２のＭＭＩ結合を有するオリゴ ヌクレオチド（オリゴ１４８９６、１４８９７及び１４８９８）のついた、この 試験の陽性対照として使用されたホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドと同 等又はそれ以上の応答性を示した。ホスホロチオエート結合と交互の３つのＭＭ Ｉ結合を有するオリゴ（オリゴ１４９００）は陽性対照オリゴとほとんど同じく らい強力であったが、ホスホジエステル結合と交互の３つのＭＭＩ結合を有する オリゴ（オリゴ１４８９９）は陽性対照のそれよりも低い効力を示した。陽性対 照と同等の効力であったのは、フランキング領域に２’−Ｏ−メトキシエチル置 換基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ１３９２０）である。 本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬、治療薬及び研究用試薬及びキットにお いて使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドはｒａｓ遺伝子にハイブリダイ ズするので、このことを利用してサンドイッチアッセイ等のアッセイが容易に組 み立てられ得る。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはｒａｓ癌遺伝子の突然 変異（活性化）型に選択的にハイブリダイズするので、野生型から活性化型へｒ ａｓが変換した細胞及び組織をスクリーニングするようなアッセイが考案され得 る。そのようなアッセイは、形態学的に類似した腫瘍の鑑別診断及びｒａｓ遺伝 子活性化に由来する発癌リスクの増加を検出するために利用され得る。オリゴヌ クレオチドのｒａｓ遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出する手段は定常的 に提供され得る。そのような提供は、酵素抱合、放射標識又は他の適切な任意の 検出システムを含み得る。ｒａｓ又は活性化ｒａｓの存在又は不在を検出するキ ットもまた製造され得る。 以下の実施例は本発明を例解するものであって、それを限定することを意図し ない。 実施例 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成 ヨウ素による酸化反応を用いた標準的なホスホロアミダイト化学法を利用して 、自動化ＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシシテムズ、モデル３８０Ｂ ）で置換及び非置換デオキシオリゴヌクレオチドを合成した。ホスホロチオエー ト・オリゴヌクレオチドのためには、亜リン酸結合を段階的にチアン化（ｔｈｉ ａｔｉｏｎ）するために、標準酸化ボトルを３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール− ３−オン１，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えた。チア ン化待ち工程を６８秒にまで上げ、次いでキャッピング工程をした。ＣＰＧカラ ムから外して、濃水酸化アンモニウム、５５℃（１８時間）にて脱保護化しした 後、２．５倍量のエタノールを含む０．５ＭのＮａＣｌ溶液から２度沈殿させる ことによって、オリゴヌクレオチドを精製した。分析用ゲル電気泳動は、２０％ アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５４ｍＭトリスホウ酸緩衝液、ｐＨ＝７．０にて 実施した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動から、オリゴヌクレオチドが完全長 の物質の８０％以上であることが判明した。 オリゴリボヌクレオチドは、自動化シンセサイザー及び５’−ジメトキシート リチル−２’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイ ト（アメリカンバイオネクティクス、ヘイワード、ＣＡ）を用いて合成された。 Ａ、Ｃ及びＧの環外アミン上の保護基はフェノキシアセチル基であった(Wu，T. ，Oglivie，K．K．，及びPon，R．T．，Nucl．Acids Res．1989，17，3501-351 7）。標準合成サイクルに、テトラゾールのパルスデリバリー後の待ち工程を９ ００秒にまで増やすという変更を加えた。メタノール性アンモニアにて室温で一 晩インキュベーションしてオリゴヌクレオチドを脱保護化した。真空乾燥した後 、テトラブチルアンモニウムフルオリド（アルドリッチ、ミルウォーキー、ＷＩ ）のＩＭテトラヒドロフラン溶液にて室温で一晩インキュベーションして、２’ -シリル基を外した。オリゴヌクレオチドはＣ−１８・Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリ ッジ（ウォーターズ、ミルフォード、ＭＡ）を用いて精製した後、エタノール沈 殿させた。分析用変性ポリアクリルアミド電気泳動は、ＲＮＡオリゴヌクレオチ ドが完全長の物質の９０％以上であることを示した。 実施例２ ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子のアセンブリー 本試験に記載されたｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ＰＣＲ技術 を使用して組み立てられた。突然変異体（コドン１２）及び非突然変異体（野生 型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子のエクソン１の５’領域をＰＣＲクローニングするた めのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを合成した。ｃ−Ｈ−ｒａｓ １活性化癌遺伝子（コドン１２、ＧＧＣ→ＧＴＣ）を含むプラスミドｐＴ２４− Ｃ３及びｃ−Ｈ−ｒａｓ癌原遺伝子を含むｐｂｃ−Ｎ１は、アメリカンタイプカ ルチャーコレクション（ベテスダ、ＭＤ）より入手した。１．９ｋｂのホタルル シフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＴ３／Ｔ７は、クローンテクラボラトリ ーズ（パロアルト、ＣＡ）より入手した。オリゴマーＰＣＲプライマーは、突然 変異体及び非突然変異体のＨ−ｒａｓ遺伝子を鋳型として使用する標準的なＰＣ Ｒ反応に用いられた。これらプライマーは、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限 エンドヌクレアーゼ部位が隣接した、正常及び突然変異体Ｈ−ｒａｓの（翻訳開 始部位に比較して）−５３〜＋６５配列に対応する１４５塩基対のＤＮＡ産物を 産生する。ＰＣＲ産物は、通常の方法により、ゲルで精製し、沈殿させ、洗浄し 、水に再懸濁させた。 Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子をクローニングするた めのＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物が完全長のルシフェラーゼタンパク質をコ ードするように設計されたが、ただしそのアミノ末端のメチオニン残基は、アミ ノ末端のリジンにロイシン残基が続く２つのアミノ酸で置換されるようにした。 ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングに使用されるオリゴヌクレオチドＰＣＲプ ライマーは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を鋳型として含む市販のプラスミ ド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（クローンテク）を用いた標準的なＰＣＲ反応に使 用された。これらプライマーは、特定のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｓＨＩＩ制限エ ンドヌクレアーゼ部位が隣接した、ルシフェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋ ｂの産物を生成する。このフラグメントは、通常の方法により、ゲルで精製し、 沈殿させ、洗浄し、水に再懸濁させた。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子のアセンブリーを完了するため に、ｒａｓとルシフェラーゼのＰＣＲ産物を適切な制限エンドヌクレアーゼで消 化し、３部分の連結により、ステロイド誘発性のマウス乳癌ウイルスプロモータ ー、ＭＭＴＶを含む発現ベクターへ、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ及びＢｓｓＨＩＩを用いてクローン化した。得られたクローンには、ホ タルのルシフェラーゼ遺伝子に同調して融合したＨ−ｒａｓの５’配列（−５３ 〜＋６５）が挿入されている。得られた発現ベクターは、ステロイド誘発性のＭ ＭＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合生成物を コードする。上記のプラスミド構築体は、ホタルのルシフェラーゼをコードする 配列に同調フレームで融合した活性化（ＲＡ２）又は正常（ＲＡ４）Ｈ−ｒａｓ タンパク質のアミノ酸１〜２２をコードする配列を含む。ｒａｓ−ルシフェラー ゼ融合ｍＲＮＡの翻訳開始は、天然のＨ−ｒａｓのＡＵＧコドンに依存している 。突然変異体及び正常Ｈ−ｒａｓルシフェラーゼ融合構築体は、いずれも通常の 方法を用いたＤＮＡ配列分析によって確認された。 実施例３ プラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクション 「分子生物学の最新プロトコール」（F．M．Ausubel，R．Brent，R．E．Kings ton，D．D．Moore，J．A．Smith，J．G．Seidman及びK．Strahl編）ジョンウィ リーアンドサンズ、ＮＹ、のGreenberg，M．E．による記載に、以下の変更を加 えてトランスフェクションを実施した。ヒーラ細胞を５ｘ１０⁵細胞／プレート の濃度で６０ｍｍプレートに培養した。全量で１０μｇ又は１２μｇのＤＮＡを 各プレートに加えたが、その１μｇは構成的ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモ ーターの制御下でラットのグルココルチコイド受容体を発現するベクターであり 、その残りはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであった。１６〜２ ０時間後に、３ｍＭ ＥＧＴＡを含むトリス緩衝化生理食塩水[５０ｍＭトリス −Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄してリン酸カルシウム− ＤＮＡ共沈殿物を除去した。次に１０％ウシ胎仔血清を含む新鮮培養液をこの細 胞に加えた。ここで、デキサメタゾンによるレポーター遺伝子発現の活性化に先 立って、アンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を前処置した。 実施例４ 細胞のオリゴヌクレオチド処置 プラスミドによるトランスフェクション後、３７℃まで加温しておいたリン酸 緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬのＮ−［１−（２，３−ジオレイ ルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯ ＴＭＡ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを各プレートに加えた（１．０ｍｌ／プレート ）。 ５０μＭストックからオリゴヌクレオチドを各プレートヘ添加し、３７℃で４時 間インキュベートした。培養液を除去し、１０％ウシ胎仔血清及び指定濃度の適 切なオリゴヌクレオチドで置換し、細胞をさらに２時間３７℃でインキュベート した後、最終濃度０．２μＭのデキサメタゾンで細胞を処置することによって、 レポーター遺伝子の発現を活性化した。デキサメタゾン刺激後１５時間目に細胞 を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。 実施例５ ルシフェラーゼアッセイ 「分子生物学の最新プロトコール」（F．M．Ausubel，R．Brent，R．E．Kings ton，D．D．Moore，J．A．Smith，J．G．Seidman及びK．Strahl編）ジョンウィ リーアンドサンズ、ＮＹ、のGreenberg，M．E．に記載されたようにして、界面 活性剤のトリトンＸ−１００による溶解によって細胞からルシフェラーゼを抽出 した。ダイナテックのＭＬ１０００蛍光計を使用して、ルシフェリン（シグマ） ６２５μＭ添加時のピーク蛍光度を測定した。各抽出物に対してルシフェラーゼ アッセイを数回実施し、様々な量の抽出物を使用してデータがアッセイの直線範 囲で集められるようにした。 実施例６ 融解曲線 ＩＢＭのＰＣコンピュータとインターフェースのあるギルフォード２６０分光 光度計及びギルフォードレスポンスＩＩ分光光度計を使用して、２６０ｎｍにお ける吸光度の温度曲線を測定した。緩衝液は、１００ｍＭ Ｎａ⁺、１０ｍＭリ ン酸及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。オリゴヌクレオチド濃度は、８５ ℃における吸光度及びPuglisiとTinoco，Methods in Enzymol．1989，180，30 4-325によって計算される消衰係数より決定され、各鎖につき４μＭであった。 Ｔ_m値、二本鎖形成の自由エネルギー及び会合定数は、直線傾斜ベースラインの ある２状態モデルへのデータフィットから得られた（Petersheim，M．及びTurne r，D．H．，Biochemistry 1983，22，256-263）。報告されたパラメータは、少 なくとも３回の実験の平均値である。あるオリゴヌクレオチドに対しては、二本 鎖形成の自由エネルギーは、Ｔ_m ^-1対ｌｏｇ₁₀（濃度）のプロットから も得られた（Borer，P．N．，Dengler，B．，Tinoco，I．，Jr．及びUhlenbeck ，O．C．，J．Mol．Biol．，1974，86，843-853）。 実施例７ ゲルシフトアッセイ Limaら、Biochemistry，1991，31，12055-12061に記載されるようにして、構 築されたｒａｓターゲット転写産物である、突然変異したコドン１２を含む４７ ヌクレオチドのヘアピンを製造し、マッピングした。１００ｍＭナトリウム、１ ０ｍＭリン酸、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｃｐｍのＴ７産生ＲＮＡ（約１０ ｐＭ）及び１ｐＭ〜１０μＭ濃度範囲のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む 、ハイブリダイゼーション反応液２０μｌを調製した。反応液を３７℃で２４時 間インキュベートした。ハイブリダイゼーションの後に、この反応液に補充緩衝 液を加え、４５ｍＭトリスホウ酸と１ｍＭ ＭｇＣｌ₂（ＴＢＭ）を用いて調製 した、２０％のネーティブなポリアクリルアミドゲルに反応生成物を展開した。 １０℃で電気泳動を実施し、モレキュラーダイナミクスのホスホロイメージャー （ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して定量化した。 実施例８ ＲＮアーゼＨ分析 活性化（コドン１２、Ｇ→Ｕ）Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡの＋２３〜＋４７の塩基 に相当する化学合成された２５塩基オリゴリボヌクレオチドを用いて、ＲＮアー ゼＨアッセイを実施した。５’末端を標識したＲＮＡを２０ｎＭの濃度で使用し 、１０倍モル過剰のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに、最終容積１０μ ｌに２Ｏ０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、１ｍＭ ジチオトレイトール、１０μｇ・ｔＲＮＡ及び４Ｕ・ＲＮア シン（ａｓｉｎ）を含む反応液でインキュベートした。この反応成分は、３７℃ で１５分間プレアニールした後、ゆっくりと室温まで冷やした。哺乳類のＲＮア ーゼＨの供給源としてはヒーラ細胞の核抽出物を使用した。核抽出物（５μｌ） の２μｇを添加することで反応を開始し、３７℃で１０分間反応を継続させた。 フェノール／クロロホルム抽出によって反応を停止させ、ＲＮＡ成分をエタノー ル沈殿させた。７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲルに同量のＣＰＭを ロー ドし、ＲＮＡ開裂産物を電気泳動で展開し視覚化した後、オートラジオグラフィ ーを実施した。モレキュラーダイナミクスのデンシトメーターを使用して開裂産 物の定量を実施した。 実施例９ ｒａｓトランス活性化レポーター遺伝子システム 構成的ＳＶ４０プロモーターに制御される活性化（コドン１２、ＧＧＣ→ＧＴ Ｃ）Ｈ−ｒａｓ・ｃＤＮＡ挿入物を含む発現プラスミド、ｐＳＶ２−ｏｌｉは、 ブルーノ・トク博士（ローヌ・プーラン＝サンテ、ビトリー、フランス）から寄 贈された。このプラスミドは、ステロイド誘発性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ ）プロモーターの調節下にあるＨ−ｒａｓ発現プラスミドをＰＣＲによって構築 するときの鋳型として使用された。Ｈ−ｒａｓコード配列を得るには、Ｈ−ｒａ ｓ遺伝子の５７０ｂｐコード領域をＰＣＲによって増幅した。その５’領域にク ローニングを促進するための独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するＰＣＲ プライマーが設計された。Ｈ−ｒａｓコドン１２突然変異癌遺伝子のコード領域 を含むＰＣＲ産物をゲルで精製し、消化し、クローニングに先立ってもう一度ゲ ルで精製した。この組み立ては、発現プラスミドｐＭＡＭｎｅｏ（クローンテク ラボラトリーズ、ＣＡ）への挿入物をクローニングすることによって完了した。 ｒａｓ応答性レポーター遺伝子、ｐＲＤＯ５３を使用してｒａｓの発現を検出 した（Owenら、Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．1990，87，3866-3870）。 実施例10 ｒａｓインビボ発現のノーザンブロット分析 ヒト膀胱癌細胞系、Ｔ２４をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロッ クビル、ＭＤ）より入手した。１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清とペニシリン及 びストレプトマイシンをそれぞれ５０Ｕ／ｍｌ補充した、Ｌ−グルタミン含有の マッコイ（ＭａＣｏｙ）５Ａ培地（ギブコＢＲＬ、ゲイサースブルグ ＭＤ）で 細胞を生育した。細胞は１００ｍｍプレートにまいた。それが７０％の集密度に 達したとき、オリゴヌクレオチドで処置した。保温ＰＢＳ１０ｍｌ及び２．５μ ｌのＤＯＴＭＡ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清減少培地５ｍｌでプレートを洗浄した 。次いでオリゴヌクレオチドを所望の濃度になるように加えた。４時間の処置後 、 培地をマッコイ培地に換えた。オリゴヌクレオチド処置後４８時間後に細胞を回 収し、標準的なＣｓＣｌ精製法を用いてＲＮＡを単離した（Kingston，R．E．「 分子生物学の最新プロトコール」(F.M.Ausubel，R.Brent,R.E.Kingston，D．D． Moore，J．A．Smith，J．G．Seidman及びK．Strahl編)ジョンウィリーアンドサ ンズ、ＮＹ）。 ヒト上皮様癌細胞系、ヒーラ２２９は、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン（ベテスダ、ＭＤ）より入手した。ヒーラ細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び １００Ｕ／ｍｌペニシリンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ） にて、６穴プレートで単層として維持した。オリゴヌクレオチドを用いた処置及 びＲＮＡの単離は、ほとんど上記Ｔ２４細胞に記載した通りである。 ノーザンハイブリダイゼーション：各ＲＮＡ１０μｇを１．２％アガロース／ ホルムアルデヒドのゲルで電気泳動した後、常法により、ジーンバインド４５ナ イロン膜（ファルマシアＬＫＢ、ピスカタウェイ、ＮＪ）ヘトランスファーした (Kingston，R．E．「分子生物学の最新プロトコール」（F．M．Ausubel，R．Bre nt，R．E．Kingston，D．D．Moore，J．A．Smith，J．G．Seidman及びK．Strahl 編）ジョンウィリーアンドサンズ、ＮＹ）。ＵＶでＲＮＡを膜に架橋結合させた 。プライム・ア・ジーン（Ｐｒｉｍｅ ａ Ｇｅｎｅ）の標識化キット（プロメ ガ、マジソン ＷＩ）を使用して、二本鎖³²Ｐ−標識プローブを合成した。ｒａ ｓプローブは、コドン１２にＧＧＣ→ＧＴＣ突然変異を有する活性化（突然変異 体）Ｈ−ｒａｓ・ｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンのＳａｌＩ−ＮｈｅＩ断片である 。対照プローブはＧ３ＰＤＨであった。クイックハイブ（ＱｕｉｃｋＨｙｂ）ハ イブリダイゼーション溶液（ストラタジーン、ラジョラ、ＣＡ）を用いてブロッ トを６８℃で１５分間プレハイブリダイズした。１０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮ Ａの１００μＬを混合した熱変性放射活性プローブ（２．５ｘ１０⁶カウント／ ２ｍｌ）を加え、ナイロン膜を６８℃で１時間ハイブリダイズした。ブロットは 、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温、１５分間で二回、０．１ｘＳＳＣ／０． １％ＳＤＳ、６０℃、３０分間で一回、洗浄した。ブロットのオートラジオグラ フィーをとり、イメージクォントホスホロイメージャー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅr）（モレキュラーダイナミクス、サ ニーヴェイル、ＣＡ）を用いてシグナル強度を定量した。ノーザンブロットは、 ｒａｓプローブと最初にハイブリダイズさせた後、０．１ｘＳＳＣ／０．１％Ｓ ＤＳにて１５分間煮沸して剥がした後、正しいサンプルローディングを調べるた めに、対照Ｇ３ＰＤＨプローブと再ハイブリダイズさせた。 実施例１１ 癌細胞の増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 ほとんど実施例１０に記載されたようにして、細胞を培養し、オリゴヌクレオ チドで処置した。６０ｍＭプレートに細胞をまき、７０％の集密度に達したとき 、ＤＯＴＭＡの存在下、オリゴヌクレオチドで処置した。経時変化実験：１日目 、最終濃度１００ｎＭのオリゴヌクレオチドの単回用量で細胞を処置した。増殖 培地は３日に一度交換し、細胞は血球計測板を用いて５日間毎日カウントした。 用量応答試験：細胞に様々な濃度のオリゴヌクレオチド（１０、２５、５０、１ ００又は２５０ｎＭ）を加え、３日後に細胞を採取し、数を数えた。オリゴヌク レオチド２５７０、３９８５及び４６９０のＴ２４癌細胞の増殖に対する効果を 試験した。 実施例１２ ２−（アミノ）アデニン置換オリゴヌクレオチドの合成 以下の例外を設けて、実施例１のようにオリゴヌクレオチドを合成した：２− （アミノ）アデニンが所望される２位では、標準的なホスホロアミダイトを市販 の２−アミノデオキシアデノシンホスホロアミダイト（ケムジーンズ）に換える 。 実施例１３ Ａ５４９細胞の培養 Ａ５４９細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ベテスダ ＭＤよ り入手）を６穴プレート（ファルコンラブウェア、リンカーンパーク、ＮＪ）で 、１ｇグルコース／リットル及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、アーヴィンサイ エンティフィック、サンタアナ、ＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｄ ＭＥＭ）にて、集密状態になるまで生育させた。 実施例１４ ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド処置− 腹腔内注射 ヒト肺癌Ａ５４９細胞を採取し、５ｘ１０⁶個の細胞（２００μｌ）をヌード マウスの内大腿へ皮下注射した。約１ヶ月で触知し得る腫瘍が発達する。ホスホ ロチオエート・オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２５０３及び１０８２（無関係な 対照）を約１０週間、隔日、２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でマウスへ腹腔内投与し た。この期間中マウスの腫瘍成長をモニターした。 実施例１５ ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド処置− カチオン性脂質を含む皮下注射 ヒト肺癌Ａ５４９細胞を採取し、５ｘ１０⁶個の細胞（２００μｌ）をヌード マウスの内大腿へ皮下注射した。約１ヶ月で触知し得る脛瘍が発達する。カチオ ン性脂質製剤（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ、６０ｍｇ／ｋｇ）で調製したホスホロチ オエート・オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２５０３及び無関係な対照オリゴヌク レオチド１０８２（用量：５ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腫瘍部位へ皮下投与した。 薬物処置を開始したのは腫瘍細胞接種後１週目であり、４週間だけ週２回投与し た。全９週間の間、マウスの腫瘍成長をモニターした。 実施例１６ Ｔ２４細胞における修飾オリゴヌクレオチドの安定性 実施例１０に記載されたようにしてＴ２４膀胱癌細胞を生育させた。単回用量 のオリゴヌクレオチド（１μＭ）で細胞を処置し、２４時間後、ノーザンブロッ ト分析によってＨａ−ｒａｓ・ｍＲＮＡの発現をアッセイした。試験したオリゴ ヌクレオチドは、Ｈａ−ｒａｓコドン１２をターゲットにした１７−ｍｅｒであ るＩＳＩＳ２５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の類似体である。 実施例１７ ３種の結腸癌細胞系に対するＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチドの活 性 ヒト結腸癌細胞系、Ｃａｌｕｌ、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０をアメリカンタイ プカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手し、実施例１０のヒーラ細胞に 対して記載されたようにして維持した。単回用量のオリゴヌクレオチド（２００ ｎＭ）で細胞を処置し、２４時間後、ノーザンブロット分析によってＨａ−ｒａ ｓ・ｍＲＮＡの発現を測定した。増殖試験では、０日目に単回用量のオリゴヌク レオチド（２００ｎＭ）で細胞を処置し、５日間にわたって細胞数をモニターし た。 実施例１８ 野生型Ｋｉ−ｒａｓと突然変異体Ｋｉ−ｒａｓに対するオリゴヌク レオチド阻害 先の実施例のようにしてＳＷ４８０細胞を培養した。ヒーラ細胞は実施例１０ のように培養した。単回用量のオリゴヌクレオチド（１００ｎＭ）で細胞を処置 し、２４時間後、ノーザンブロット分析によってｍＲＮＡレベルを定量した。 実施例１９〜３５ 一般情報 特に記さなければ、材料は市販業者より入手し、指定通りに使用した。２’− Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェ ニルメチル）−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−（４，４’ −ジメトキシトリフェニルメチル）−Ｎ−２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル グアノシン及びＮ−６−ベンゾイル-５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフ ェニルメチル）−２’−Ｏ−メチルアデノシンは、ＲＩケミカルズ、ＣＡ（７１ ４−２８８−１５７４）より購入し、２’−Ｏ−メチルグアノシン及び２’−Ｏ −メチルアデノシンはサミットファーマシューティカルズ社、Ｎ．Ｊ．（２０１ −５８５−９６８７）より購入した。 ＮＭＲ分光検査法。全化合物に対する¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ヴァリアン ユニティ（Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ）４００ＮＭＲ分光計で３９９．９４ＭＨ ｚ、又はヴァリアンジェミニ（Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ）２００ＮＭＲ分光 計で１９９．９７５ＭＨｚのいずれかで記録した。すべての多次元及び可変温度 スペクトルは、ユニティ４００ＮＭＲにて収集した。化合物１９ｄは、６００μ ｌのＤＭＳＯ−ｄ₆に溶かし、１．６ｍＭの濃度で試験した。１次元¹Ｈ ＮＭＲ スペクトルは、サンプル温度、２９３、３１０、３３３及び３５３Ｋで記録した 。 １次元測定はすべて同一の条件で実施し、同じように処理した：掃引幅（ｓｗｅ ｅｐ ｗｉｄｔｈ）５２００Ｈｚ、時間領域３２Ｋ、６４Ｋへのゼロフィリング （ｚｅｒｏ−ｆｉｌｌｉｎｇ）。可能ならば、データはアポダイズせずに検討さ れたが、いくつかの例では、標準的なＶａｒｉａｎ ＶｎｍｒＳ解像増強法を利 用して、−１．０１の線広がり及び０．９４５のガウスフィルターを使用した。 全サブスペクトルは１次であると観察された。プロトン共鳴は、３１０及び３５ ３Ｋで実施された２次元スペクトルから帰属させた。ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ スペクトルは、それぞれ、３１０Ｋ、２０ｍｓスピンロック及び６５０ｍｓ混合 タイムで実施され、５１２複合点（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔｓ）による１ｋ が位相感知式に収集された。同様の実験が３５３Ｋで実施され、５１２複合点に よる２ｋが位相感知式に収集された。いずれの場合でも、データは平方コサイン でアポダイズされ、２ｋｘ１ｋ複合点ヘゼロフノリングされてからフーリエ変換 された。¹³Ｃスペクトルは、振動数１００．５７ＭＨｚ、掃引幅３０４４１Ｈｚ 、処理時間０．５０ｓで同一の装置で記録され、２Ｈｚの線広がり及び３２Ｋへ のゼロフィリングでアポダイズして処理した。¹³Ｃスペクトルは、２９３Ｋで¹ Ｈ｛¹³Ｃ｝ＨＭＱＣを用いて帰属させた。この実験のためには、掃引幅３２００ Ｈｚの全域で直接検出される次元にて、１Ｋ複合点が収集された。全部で２４０ の増分（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）が、掃引幅２２ｋＨｚの全域で、直接検出次元 において、位相感知式に収集された。データは、¹Ｈ次元及びｔ₁ガウスフィルタ ーの平方コサインでアポダイズされた。 １２ｈ、１２ｉ、１２ｊ、１８ａ、２０ａ及び２０ｂに対するすべての１次元¹ Ｈスペクトルは、収集及び加工処理に同一のパラメータを使用して、２９３Ｋ で記録された：掃引幅７ｋＨｚで１４３３６の複合点が収集された。データは６ ４Ｋ点ヘゼロフィリングされ、０．３０Ｈｚの線広がりでアポダイズしてからフ ーリエ変換した。２次元スペクトルは、各次元で４ｋＨｚ〜５２００Ｈｚに及ぶ 、各サンプルのスペクトル範囲で解像を最大化するように調整した掃引幅を用い て得られた。１２ｈ及び１２ｊには２５６複合点で１Ｋ、１２ｉ及び２０ｂには ５１２複合点で１Ｋのデータセットが得られた。１８ａ及び２０ｂを十分に解像 するためには、５１２データ点で２Ｋのデータセットが収集された。２０ａ及び ２ ０ｂには、化学シフト分散を増強するために、３１３Ｋでデータが収集された。 全データは位相感知式であり、上記のＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ方式に使用され る方法に他の点では同一な条件で加工処理された。１９ｂの¹Ｈ ＮＭＲデータ は、上記の実験条件の同一系列を使用して、酸化重水素にて３１０Ｋで収集した 。他の一般的な実験手技は、Perbost，M．；Hoshino，T．；Morvan，F．；Swayz e，E．；Griffey，R．H．；Sanghvi，Y．S.，J．Org．Chem.1995，60，5150-515 6に記載されたようにして実施した。 実施例１９ 一般法Ａ：３’−ヨード−２’−Ｏ−メチルヌクレオシド（１１→１２）の合 成 ピリジン（４．３等量）の乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）へ、不活 性ガスの下で、−１０℃でトリフルオロメタンスルホン酸無水物（２当量）のＣ Ｈ₂Ｃｌ₂溶液（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）を０．５時間にわたって滴加した。さらに０ ．２５時間撹拌した後、適切に保護化した３’−ヒドロキシルヌクレオシド（１ 当量、乾燥ピリジンで共沸混合させたもの）の乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（５ｍＬ／ｍ ｍｏｌ）を０．５時間にわたって滴加した後、この溶液をさらに２時間、−１０ ℃で撹拌した。反応混合液を等量の氷冷１０％水性ＮａＨＣＯ₃で激しく撹拌し ながら希釈した後、混合液を室温まで温めた。有機層を除去し、（ＭｇＳＯ₄で ）乾燥し、トルエン（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）で希釈し、濃縮し、乾燥トルエン（３ ｘ５ｍＬ／ｍｍｏｌ）で共沸混合した。得られた泡状物質にＢｕ₄ＮＩ（２当量 ）及び乾燥トルエン（３０ｍＬ／ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合液を激しく撹 拌しながら８０℃の油浴で０．５時間加熱すると、この時点で固形物がすべて溶 解し、暗赤色のオイルが分離した。得られた混合物をＥｔＯＡｃで希釈して溶か し、水（１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）、５％水性ＮａＨＳＯ₃と５％水性Ｎａ₂ＳＯ₃の 等量混台液（２ｘ１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）で洗浄し、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃 縮し、クロマトグラフ処理して、ヨー化物を得た。 実施例２０ ３’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）− ３’−ヨード−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（１２ａ） ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−メチ ルウリジン（５．７５ｇ，１０ｍｍｏｌ）から、一般法Ａにより、クロマトグラ フィー（３０％〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後に、１２ａを４．４１ｇ（ ６４％）得た：Ｒｆ０．３８（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）； 元素分析：Ｃ₃₂Ｈ₃₃Ｎ₂Ｏ₇Ｉ・０．４ＣＨ₂Ｃｌ₂の計算値：Ｃ，５４．１６；Ｈ ，４．７４；Ｎ，３．９０。実測値：Ｃ，５４．２７；Ｈ，４．５８；Ｎ，３． ７３。 実施例２１ ３’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）− ３’−ヨード−２’−Ｎ−イソブチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（１２ｃ） ５ｇ（８．２６ｍｍｏｌ）の１１ｃから、一般法Ａにより、クロマトグラフィ ー（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後に、１２ｂを３．８ｇ（５９％）得た： 元素分析：Ｃ₃₆Ｈ₃₈Ｎ₅Ｏ₇Ｉ・０．２５Ｃ₆Ｈ₁₄の計算値：Ｃ，５６．２５；Ｈ ，５．１６；Ｎ，８．７５。実測値：Ｃ，５６．４８；Ｈ，５．２４；Ｎ，８． ６８。 実施例２２ ６−Ｎ−ベンゾイル−３’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト リフェニルメチル）−３’−ヨード−２’−Ｏ−メチル−５−メチルアデノシン （１２ｋ） Ｎ−６−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリトリチル）−２ −Ｏ−メチルアデノシン（０．６９ｇ，１ｍｍｏｌ）から、一般法Ａにより、ク ロマトグラフィー（５０％〜７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）の後に、１２ｋを０ ．４７ｇ（５８％）得た：Ｒ_f０．３４（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）； 元素分析：Ｃ₃₉Ｈ₃₆Ｎ₆Ｏ₆Ｉ・０．４ＣＨ₂Ｃｌ₂・０．５ＥｔＯＡｃの計算値： Ｃ，５６．７９；Ｈ，４．７０；Ｎ，８．０。実測値：Ｃ，５６．６０；Ｈ，４ ．６４；Ｎ，８．０１。 実施例２３ ５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−３’−デオキシ-３’− ヨード−５−メチル−２’−Ｏ−メチルウリジン（１２ｅ） １１ｅ（７．０ｇ，１３．７ｍｍｏ１）及び乾燥ピリジン（１．９ｇ，２４． ６ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（８０ｍＬ）を不活性気体中で約２０分間激 しく撹拌しながら−１０℃まで冷却した。無水トリフルオロメタンスルホン酸( ５．１ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂溶液（３０ｍＬ）をシリンジでゆっ くりと１５分かけて添加した。この反応は添加後３５分間のうちに終了した。こ の冷溶液にＭｅＯＨ（１ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ₃を加えた後、有機層を 分離し、緘水（２ｘ１５ｍＬ）で洗浄してからＮａ₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減 圧除去し、残渣をトルエン（２ｘ２０ｍＬ）と共沸混合させた。残渣のゴム状物 質を ｐ−キシレン（１００ｍＬ）に溶かし、これにＢｕ₄ＮＩ（５．６ｇ，１５．１ ｍｍｏｌ）を加えた後、加熱しておいた浴で、この反応混合液を１４０℃まで加 熱した。反応は３０分で終了した。室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で 希釈した後、亜硫酸ナトリウム：亜硫酸水素ナトリウム（１：１）の５％水溶液 で洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮した後、６０％ＥｔＯＡｃ／ヘ キサンを用いたシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで処理した。溶媒を 除去し、無色の泡状物質として１２ｅを６．８ｇ（８０％）得た： 元素分析：Ｃ₂₇Ｈ₃₃Ｎ₂Ｏ₅ＳｉＩの計算値：Ｃ，５２．２６；Ｈ，５．３６；Ｎ ，４．５１。実測値：Ｃ，５２．５５；Ｈ，５．４１；Ｎ，４．４８。 実施例２４ ５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−３’−デオキシ−６−Ｎ −（ジメチルアミノ）メチレン−３’−ヨード−２’−Ｏ−メチルアデノシン（ １２ｆ) １１ｈ（５．３ｇ，９．２ｍｍｏｌ）、ピリジン（３．６５ｇ，４６．１ｍｍ ｏｌ）、無水トリフルオロメタンスルホン酸（３．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）及びＢ ｕ₄ＮＩ（５．２ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）から、１２ｅに使用した方法により、 ３〜５％ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ：ヘキサン（８０：１５）溶液を用いたシリカゲ ルのクロマトグラフィーの後、１２ｆを３．８ｇ（６０％）得た： 元素分析：Ｃ₃₀Ｈ₃₇Ｎ₆Ｏ₃ＳｉＩ・０．２５Ｃ₆Ｈ₁₂の計算値：Ｃ，５３．６１ ；Ｈ，５．７１；Ｎ，１１．９１。実測値：Ｃ，５３．２０；Ｈ，５． ５８；Ｎ，１２．２４。 実施例２５ ５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−３’−デオキシ−２−Ｎ −（ジメチルアミノ）メチレン−３’−ヨード−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ １２ｇ） １１ｊ（５．０ｇ，８．４６ｍｍｏｌ）、ピリジン（３．３６ｇ，４６ｍｍｏ ｌ）、無水トリフルオロメタンスルホン酸（３ｇ，１１ｍｍｏｌ）及びＢｕ₄Ｎ Ｉ（５．２ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）から、１２ｅに使用した方法により、３〜５ ％ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ：ヘキサン（８０：１５）溶液を用いたシリカゲルのク ロマトグラフィーの後、１２ｇを２．５ｇ（４３％）得た：元素分析：Ｃ₃₀Ｈ₃₇Ｎ₆Ｏ₄ＳｉＩの計算値：Ｃ，５１．４３；Ｈ，５．３２；Ｎ ，１１．９９。実測値：Ｃ，５１．５６；Ｈ，５．３７；Ｎ，１１．９８。 実施例２６ 一般法Ｂ、ヌクレオシドのミツノブ反応（１０→１３） 適切なヌクレオチド（１当量）、トリフェニルホスフィン（１．１５当量）及 びＮ−ヒドロキシフタルイミド（１．１５等量）の混合物を、使用前１８時間、 Ｐ₂Ｏ₅で真空乾燥した。この混合物に、不活性気体の下で乾燥ＴＨＦ（Ｔ用）又 はＤＭＦ（Ａ及びＧ^dmf用）（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）を加え、次いでジエチルア ゾジカルボキシレート（１．１５当量）を室温で撹拌しながらこの溶液に滴加し た。添加の速度は、得られた深赤の着色が抜けてから次の滴加をするというよう に維持される。添加終了（５〜４５分間、出発ヌクレオシド及びスケールによっ て異なる）後、ＴＬＣによって反応完了が示されるまで、反応液を撹拌する。出 発容積の約１／３になるまで溶媒を真空蒸発させ、もし固形物が得られたら（Ｔ 、 Ｇ^dmfの場合）、回収し、そうでなければ（Ａの場合）、得られた溶液を水とエ ーテルに分離し、得られる固形物を回収し、エーテルでよく洗浄し、乾燥して所 望の生成物を得た。この物質は純品である場合もあったが、通常は微量のトリフ ェニルホスフィン及び／又はジエチルヒドラジンジカルボキシレートを含んでい て、これらはカラムクロマトグラフィーで除去し得た。しかしながら、これらの 不純物は以下の反応（一般法Ｃ）には干渉しなかったので、この粗生成物を直接 次の工程へ続けることができた。 実施例２７ ２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−フタルイミド−５−メチルウリジン（１３ａ） ２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（４．０８ｇ，１５ｍｍｏｌ）を一般 法Ｂによって反応させた。反応終了（ＴＬＣによって確認）後、固形物を回収し 、エーテルでよく洗浄し、乾燥して純粋な生成物を３.０６ｇ（４９％）得た。 濾液を集めて濃縮し、カラムクロマトグラフィー（０〜４％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃ ｌ₂）によって精製し、さらに２．５０ｇ（４０％）を回収し、合わせて１３ａ を５．５６ｇ（８９％）得た： 元素分析：Ｃ₁₉Ｈ₁₉Ｎ₃Ｏ₈・０．５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５３．５２；Ｈ，４． ７３；Ｎ，９．８５。実測値：Ｃ，５３．５１；Ｈ，４．４９；Ｎ，９．８４。 実施例２８ ２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−フタルイミドアデノシン（１３ｂ） ２’−Ｏ−メチル−アデノシン（５０．０ｇ，１７８ｍｍｏｌ）から、一般法 Ｂにより、濃縮した反応混合物を氷水（３Ｌ）とエーテル（３Ｌ）とに分離させ た後に、得られた固形物を回収し、乾燥し、生成物７４．３ｇ（９８％）を得た 。生成物は微量（¹Ｈ ＮＭＲ及び燃焼分析によれば０．１２５当量）のＰｈ₃Ｐ ＝Ｏを含むが、これはシリル化反応には干渉しない： ；Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｎ₆Ｏ₆＋Ｃｓ⁺に対するＨＲＭＳ（ＦＡＢ⁺，ＣｓＩ／ＮＢＡ）計算値 ５５９．０３４２、実測値５５９．０３５５。元素分析：Ｃ₁₉Ｈ₁₈Ｎ₆Ｏ₆・０． １２５Ｐｈ₃Ｐ＝Ｏ（¹Ｈ ＮＭＲで証明）の計算値：Ｃ，５５．３４；Ｈ，４． ３４；Ｎ，１８．２２。実測値：Ｃ，５５．０７；Ｈ，４．４５；Ｎ，１７．９ ８。 実施例２９ ２−Ｎ−（ジメチルアミノ）メチレン−２’−Ｏ−メチル−５’−フタルイミド グアノシン（１３ｃ） ２−Ｎ−（ジメチルアミノ）メチレン−２’−Ｏ−メチルグアノシン（１０ｆ ，６．３９ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）を完全に乾燥した（０．０１ｍｍＨｇ，４５ ℃，Ｐ₂Ｏ₅で数日間）後、一般法Ｂにより反応させた。反応終了（ＴＬＣで確認 ）後、元の容積の１／３にまで減少させ、固形物を回収し、乾燥し、１３ｃの水 和物を８．８５ｇ（９３％）得た： ；Ｃ₂₂Ｈ₂₃Ｎ₇Ｏ₇＋Ｃｓ⁺に対するＨＲＭＳ（ＦＡＢ⁺，ＣｓＩ／ＮＢＡ）計算値 ６３０．０７１３、実測値６３０．０７２５。元素分析：Ｃ₂₂Ｈ₂₃Ｎ₇Ｏ₇・１． ５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５０．３８；Ｈ，５．００；Ｎ，１８．６９。実測値： Ｃ，５０．５７；Ｈ，５．１２；Ｎ，１８．８１。 実施例３０ 一般法Ｃ、ヌクレオシドのシリル化（１３→１４） 必要なヌクレオシド（１当量、真空下Ｐ₂Ｏ₅で乾燥）及びイミダゾール（４． ５当量）を、不活性気体の下で乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶かした後、 ＴＢＤＰＳＣｌ（１．５当量）を加えた。ＴＬＣによって終了が確認されるまで （１６〜４８時間）反応液を室温で撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ／ｍｍｏ ｌ）及び水（１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に注いだ。有機層を水（３ｘ１０ｍＬ／ｍｍ ｏｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮した。大スケールでは、粗反応混 合物を水っぽいシロップになるまで濃縮し、この生成物をエーテルと水に分離し て、得られる固形物を回収するほうがより簡便であることがわかった。この物質 は、カラムクロマトグラフィーで精製し得るが、存在している唯一の不純物はシ リル基のついた副生成物であり、これは一般法Ｄを介した次のオキシムへの変換 には干渉しなかった。 実施例３１ ３’−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−Ｎ−（ジメチルアミノ）メチレ ン−２’−Ｏ−メチルグアノシン（１４ｃ） １３ｃ（８．８５ｇ，１６．９ｍｍｏｌ）から、一般法Ｃにより、粗生成物を シリカプラグで濾過（０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）し、１４ｃを１０．６ ｇ（８４％）を得た： ；Ｃ₃₈Ｈ₄₁Ｎ₇Ｏ₇Ｓｉ＋Ｃｓ⁺に対するＨＲＭＳ（ＦＡＢ⁺，ＣｓＩ／ＮＢＡ）計 算値８６８．１８９１、実測値８６８．１８９９。元素分析：Ｃ₃₈Ｈ₄₁Ｎ₇Ｏ₇Ｓ ｉ・０．５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，６１．２７；Ｈ，５．６８；Ｎ，１３．１６。 実測値：Ｃ，６１．２７；Ｈ，５．８２；Ｎ，１３．３８。 実施例３２ 一般法Ｄ、ヌクレオシド５’−ホルムアルドオキシムの合成（１４→１５） 対応する５’−Ｏ−フタルイミドヌクレオシドをシリル化して得た粗生成物を 、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶かし、メチルヒドラジン（１．２ 当量）を−１０〜０℃で滴加した。１時間後、この混合液を濾過し、濾液をＣＨ₂ Ｃｌ₂で洗浄し、合わせた有機層を水、緘水で洗浄し、乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し、 この溶液を濃縮して５’−Ｏ−アミノヌクレオシドを得た。これをさらに精製し ないですぐに使用した（５’−Ｏ−アミノヌクレオシドはカラムクロマトグラフ ィーによって精製され得るが、放置すると分解しやすいことが観察されたためで ある）。この残渣を１：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶 かし、ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ水溶液、１．１当量）を加え、この混合 液を室温で２時間撹拌した。溶液を濃縮し、クロマトグラフ処理又は再結晶させ て、３’−シリル−５’−ホルムアルドオキシムを得た。 実施例３３ ３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−Ｎ−（ジメチルアミノ）メ チレン−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−（メチレンイミノ）グアノシン（１５ｅ ） １４ｃ（１０．６ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）から、一般法Ｄにより、粗生成物を シリカプラグで濾過（０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）し、ほとんど定量的な 収率で、１５ｅを９．２１ｇ得た： 元素分析：Ｃ₃₁Ｈ₃₉Ｎ₇Ｏ₅Ｓｉ・０．５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５９．４０；Ｈ， ６．４３；Ｎ，１５．６４。実測値：Ｃ，５９．５９；Ｈ，６．３３；Ｎ，１５ ．６１． 実施例３４ 一般法Ｅ、ラジカルカップリング反応 適切な３’−デオキシ−３’−ヨード−ヌクレオシド（１当量）及び５’−ホ ルムアルドオキシム（３当量）を乾燥ベンゼン（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）と共沸混 合し、ビス（トリメチルスタニル）ベンゾピナコレート（２当量）及び乾燥ベン ゼン（５ｍＬ／ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を脱気し（アルゴン、０．５時 間）、油浴で１６〜２４時間８０℃まで加熱し、この時点でヨードがすべて消費 された（ＴＬＣで確認）。この溶液を冷却し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ／ｍｍｏｌ ）及び１０％水性KＦ（２０ｍＬ／ｍｍｏｌ）とともに２時間激しく撹拌した。 有機層を５％水性ＮａＨＣＯ₃で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮し、最少量 のＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、シリカカラムにかけた。３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（ ５カラム容積）で溶出すると、スズの副生成物及びベンゾフェノンが出た。適切 な溶媒系でさらに溶出して、未反応のオキシム（回収された未反応物質の７５〜 ９９％）及びヒドロキシルアミノ基が結合したダイマーを得た。 実施例３５ ３’−デ（オキシホスフィニコ）−３’−（メチレンイミノ）−５’−Ｏ−（ト リフェニルメチル）チミジリル−（３’→５’）−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチ ルジフェニルシリル）−２’−デオキシアデノシン（９ｄ） ６ｂの２９７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）及び７ｂの７７５ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ ）から、一般法Ｆにより、４：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの０％〜５％ＭｅＯＨ勾 配溶液でカラムを溶出した後、出発オキシム５１５ｍｇ（未反応物質の８３％） 及び９ｄの２９１ｍｇ（５９％）が得られた： 元素分析：Ｃ₅₆Ｈ₆₀Ｎ₈Ｏ₇Ｓｉ・０．５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，６７．６５；Ｈ， ６．１８；Ｎ，１１．２７。実測値：Ｃ，６７．７７；Ｈ，６．０６；Ｎ，１１ ．３５。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１１月２日（１９９９．１１．２） 【補正内容】 請求の範囲 １．ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の少なくとも１つの ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（Ｃ Ｈ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）-Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂又はＯ−Ｎ（ＣＨ₃）− ＣＨ₂−ＣＨ₂結合を含む少なくとも１つの部分を有するオリゴヌクレオチド。 ２．前記少なくとも１つのＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ −ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃） −ＣＨ₂又はＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂結合が、メチレン（メチルイミノ） 結合である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハ イブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含む請求項１に記載のオリゴ ヌクレオチド。 ４．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位又はコドン１２と特異的にハイブリ ダイズしうる請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：３を含む請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ６．前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の少なくとも１つが２’位で 修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．前記２’位の修飾が２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル又は２’−Ｏ− 置換アルキルである請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。 ８．前記２’位の修飾が２’−置換アルキルである請求項７に記載のオリゴヌ クレオチド。 ９．前記２’−置換アルキルが２’−Ｏ−メトキシエチルである請求項８に記 載のオリゴヌクレオチド。 １０．前記メチレン（メチルイミノ）結合がホスホロチオエート結合と交互で ある請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。 １１．前記メチレン（メチルイミノ）結合がホスホジエステル結合と交互であ る請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。 １２．ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の１つ、２つ又は ３つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチ ド。 １３．ホスホロチオエート結合と交互の１つ又は２つのメチレン（メチルイミ ノ）結合を含む請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。 １４．選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８〜３ ０のヌクレオチド単位を含み、ＲＮアーゼＨの基質となり、少なくとも１つの末 端メチレン（メチルイミノ）結合を有するオリゴヌクレオチド。 １５．ヒトｒａｓ−遺伝子由来のＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイ ズしうる請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。 １６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。 １７．選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８〜３ ０のヌクレオチド単位を含み、少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ）結合 を有する第一領域及び少なくとも４つの連続するホスホロチオエート結合を有す る第二領域を含むキメラオリゴヌクレオチド。 １８．前記第二領域にそれぞれが少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ） 結合を含む前記第一領域の２つが隣接している請求項１７に記載のキメラオリゴ ヌクレオチド。 １９．前記第一領域が、２’位の修飾された少なくとも１つのヌクレオシド単 位を含む請求項１７に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２０．前記２’位の修飾が２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキル又は ２’−フルオロ修飾である請求項１９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２１．前記第二領域が２’−デオキシヌクレオチドを含む請求項１７に記載の キメラオリゴヌクレオチド。 ２２．前記第二領域が５〜９のヌクレオチドの長さである請求項２１に記載の キメラオリゴヌクレオチド。 ２３．前記第一領域が、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互 の少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項１７に記載のキ メラオリゴヌクレオチド。 ２４．前記第一領域が、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互 の１つ、２つ又は３つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２３に記載 のキメラオリゴヌクレオチド。 ２５．前記第一領域が、ホスホロチオエート結合と交互の１つ、２つ又は３つ のメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２４に記載のキメラオリゴヌクレ オチド。 ２６．前記第一領域が、ホスホジエステル結合と交互の１つ、２つ又は３つの メチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２４に記載のキメラオリゴヌクレオ チド。 ２７．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含み、少なくとも１つのメ チレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド。 ２８．前記オリゴヌクレオチドがヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位又はコ ドン１２と特異的にハイブリダイズしうる請求項２７に記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２９．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含み、２’位が２’−Ｏ− メトキシエチル置換基で修飾された少なくとも１つのヌクレオシド単位を有する 第一領域及び少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する第二領域を含む オリゴヌクレオチド。 ３０．前記第一領域が、２’位が２’−Ｏ−メトキシエチル置換基で修飾され た少なくとも３つのヌクレオシド単位を有する請求項２９に記載のオリゴヌクレ オチド。 ３１．前記第二領域がホスホロチオエート結合で一緒に連結した少なくとも４ つのヌクレオシド単位を有する請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。 ３２．前記第二領域のヌクレオシド単位のそれぞれが２’−デオキシヌクレオ チドである請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。 ３３．前記第二領域に、２’位が２’−Ｏ−メトキシエチル置換基で修飾され た少なくとも１つのヌクレオシド単位をそれぞれ含む前記第一領域の２つが隣接 している請求項３２に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ３４．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位又はコドン１２と特異的にハイブ リダイズしうる請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。 ３５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 モニア，ブレット・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, ラ・コスタ，ヌエバ・カスティージャ・ウ ェイ 7605 (72)発明者 フレイアー，スーザン・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サンディエゴ，レノールト・ストリート 2946 (72)発明者 サングヴィ，ヨーゲッシュ・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, エンシニタス，ワンダリング・ロード 2169

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の少なくとも１つの ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（Ｃ Ｈ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂又はＯ−Ｎ（ＣＨ₃） −ＣＨ₂−ＣＨ₂結合を含む少なくとも１つの部分を有するオリゴヌクレオチド。 ２．前記少なくとも１つのＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ −ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃） −ＣＨ₂又はＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂結合が、メチレン（メチルイミノ） 結合である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハ イブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含む請求項１に記載のオリゴ ヌクレオチド。 ４．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位又はコドン１２と特異的にハイブリ ダイズしうる請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：３を含む請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ６．前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の少なくとも１つが２’位で 修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．前記２’位の修飾が２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル又は２’−Ｏ− 置換アルキルである請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。 ８．前記２’位の修飾が２’−置換アルキルである請求項７に記載のオリゴヌ クレオチド。 ９．前記２’−置換アルキルが２’−Ｏ−メトキシエチルである請求項８に記 載のオリゴヌクレオチド。 １０．前記メチレン（メチルイミノ）結合がホスホロチオエート結合と交互で ある請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。 １１．前記メチレン（メチルイミノ）結合がホスホジエステル結合と交互であ る請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。 １２．ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互の１つ、２つ又は ３つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチ ド。 １３．ホスホロチオエート結合と交互の１つ又は２つのメチレン（メチルイミ ノ）結合を含む請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。 １４．選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８〜３ ０のヌクレオチド単位を含み、ＲＮアーゼＨの基質となり、少なくとも１つのメ チレン（メチルイミノ）結合を有するオリゴヌクレオチド。 １５．ヒトｒａｓ−遺伝子由来のＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイ ズしうる請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。 １６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。 １７．選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８〜３ ０のヌクレオチド単位を含み、少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ）結合 を有する第一領域及び少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する第二領 域を含むキメラオリゴヌクレオチド。 １８．前記第二領域にそれぞれが少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ） 結合を含む前記第一領域の２つが隣接している請求項１７に記載のキメラオリゴ ヌクレオチド。 １９．前記第一領域が、２’位の修飾された少なくとも１つのヌクレオシド単 位を含む請求項１７に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２０．前記２’位の修飾が２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキル又は ２’−フルオロ修飾である請求項１９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２１．前記第二領域が２’−デオキシヌクレオチドを含む請求項１５に記載の キメラオリゴヌクレオチド。 ２２．前記第二領域が少なくとも４つのヌクレオチドの長さである請求項２１ に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２３．前記第二領域が５〜９のヌクレオチドの長さである請求項２１に記載の キメラオリゴヌクレオチド。 ２４．前記第一領域が、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互 の少なくとも１つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項１７に記載のキ メラオリゴヌクレオチド。 ２５．前記第一領域が、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合と交互 の１つ、２つ又は３つのメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２４に記載 のキメラオリゴヌクレオチド。 ２６．前記第一領域が、ホスホロチオエート結合と交互の１つ、２つ又は３つ のメチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２５に記載のキメラオリゴヌクレ オチド。 ２７．前記第一領域が、ホスホジエステル結合と交互の１つ、２つ又は３つの メチレン（メチルイミノ）結合を含む請求項２５に記載のキメラオリゴヌクレオ チド。 ２８．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含み、少なくとも１つのメ チレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド。 ２９．前記オリゴヌクレオチドがヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位又はコ ドン１２と特異的にハイブリダイズしうる請求項２８に記載のオリゴヌクレオチ ド。 ３０．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子由来の選択されたＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる８〜３０のヌクレオチド単位を含み、２’位が２’−Ｏ− メトキシエチル置換基で修飾された少なくとも１つのヌクレオシド単位を有する 第一領域及び少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する第二領域を含む オリゴヌクレオチド。 ３１．前記第一領域が、２’位が２’−Ｏ−メトキシエチル置換基で修飾され た少なくとも３つのヌクレオシド単位を有する請求項３０に記載のオリゴヌクレ オチド。 ３２．前記第二領域がホスホロチオエート結合で一緒に連結した少なくとも４ つのヌクレオシド単位を有する請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。 ３３．前記第二領域のヌクレオシド単位のそれぞれが２’−デオキシヌクレオ チドである請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３４．前記第二領域に、２’位が２’−Ｏ−メトキシエチル置換基で修飾され た少なくとも１つのヌクレオシド単位をそれぞれ含む前記第一領域の２つが隣接 している請求項３３に記載のキメラオリゴヌクレオチド。