CN1674934A - 含有淀粉样β1－6抗原阵列的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供了包含有序和重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物，特别是Aβ1－6肽－VLP组合物。更具体地，本发明提供了包含病毒样颗粒和与其结合的至少一个Aβ1－6肽的组合物。本发明也提供了用于产生此缀合物或有序重复阵列的方法。本发明组合物可以用于生产治疗阿尔茨海默氏病的疫苗，和用作预防或治愈阿尔茨海默氏病及有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答的药物。而且，在所述上下文中，本发明组合物特别可以用于有效地诱导自身特异性免疫应答。

Description

含有淀粉样β1-6抗原阵列的疫苗组合物
技术领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供了包含有序重复抗原或抗原决定簇阵列的组合物，特别是Aβ1-6肽-VLP组合物。更具体地，本发明提供了包含病毒样颗粒和与其结合的至少一个Aβ1-6肽的组合物。本发明也提供了用于产生此缀合物或有序重复阵列的方法。本发明组合物可用于阿尔茨海默氏病的治疗性疫苗的生产和用作预防或治愈阿尔茨海默氏病及有效地诱导免疫应答，特别是抗体免疫应答的药物。而且，本发明组合物特别可用于有效地诱导自身特异性免疫应答。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是(65岁和更年长)老年人中痴呆的最常见原因，并且对于公众健康是一个严重负担。例如，在美国，报道有4百万人患有这种疾病。预期该疾病的发病率将随着人口老龄化而增加。
阿尔茨海默氏病的主要病理学征兆是与年龄有关的行为改变、β淀粉状蛋白沉积为不溶斑块(称为神经炎斑块或AD斑块)、神经元内由τ蛋白质组成的神经原纤维缠结和整个前脑的神经元损失。除了在(65岁或更年长)老年发生的晚发性AD外，还有35和60岁之间发生的早发性AD，家族性AD(FAD)。AD病理学异常在FAD中比在晚发或散发性AD中更普遍、严重和早发生。APP基因、早老素(presenilin)1和早老素2基因中的突变与FAD相关。
如所述，阿尔茨海默氏病(AD)中的一个关键性事件是淀粉样蛋白沉积为不溶性纤维块(淀粉样病变，amyloidogenesis)，产生了细胞外神经炎斑块和脑血管壁周围的沉积物(综述参见Selkoe，D.J.(1999)Nature.399，A23-31)。尽管神经炎斑块和嗜刚果红血管病含有其它蛋白质诸如糖胺聚糖和载脂蛋白，但是这些沉积物的主要组分是淀粉样β肽(Aβ)。Aβ从称为淀粉样前体蛋白质(APP)的大得多糖蛋白蛋白酶解切下，APP包括具有单疏水跨膜区和695-770个氨基酸的多种同种型。Aβ形成了长度不超过43个氨基酸的一组肽，其显示了相当大的氨基和羧基末端异质性(截短)及修饰(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.，& Ball，M.J.(1988)J.CellBiol.107，2703-2716.Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.，& Greenberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。主要的同种型是Aβ1-40和1-42。它具有形成β片层的高度倾向，而后者可聚集为原纤维，这最终导致淀粉样蛋白质。
Aβ肽在阿尔茨海默氏病神经病理学中具有重要作用。Aβ肽的区域特异性细胞外积累伴随着小神经胶质细胞增生(microgliosis)、细胞骨架改变、营养不良性神经炎和突触损失。这些病理学改变被认为与定义该疾病的认知下降有关。
在EP 526’511中描述了在没有任何佐剂且淀粉样β蛋白质或Aβ1-28与载体没有任何连接的情况下，以多达10-2mg/剂量的量施用淀粉样β蛋白质，或者具体地是Aβ1-28，用于治疗阿尔茨海默氏病。
其他人也已经通过Aβ肽联合佐剂进行给药的方式诱导了抗Aβ1-42的细胞或体液免疫应答。在阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中，动物超量表达含有突变APP(717)V-F的人类淀粉样前体蛋白质(PDAPP-小鼠；Johnson-Wood，K.等，Proc.Natl.Acad.USA 94：1550-1555，Games，D.等，Nature 373：523-527(1995a))，引起了Aβ1-42超量产生并出现了斑块、营养不良性神经炎、突触前末端损失、星形胶质细胞增生和小神经胶质细胞增生。在最近研究中，据Schenk，D.等(Nature 400：173-77(1999)和WO99/27944)的报道，在最初4次免疫中向6周龄PDAPP小鼠给药混合有人类中不能使用的强佐剂(CFA/IFA)的聚集Aβ1-42，接着在随后免疫中，给药PBS中聚集的Aβ1-42，基本上防止了斑块形成和有关的营养不良性神经炎。相同作者还报道了利用相同策略免疫年长小鼠(11月龄)也显著地降低了阿尔茨海默氏病(AD)样神经病学的程度和进展。在WO 99/27944的实施例III(抗确立的AD的治疗效力的筛选)中报道了从利用上述策略免疫的小鼠获得的脾细胞的增殖，表明通过接种方法诱导了Aβ1-42特异性T细胞。WO 9927944中报道了Aβ片段与山羊抗小鼠IgG的偶联，以及在佐剂CFA/IFA存在的情况下用所述偶联片段进行的免疫。WO 99/27944中也公开了包含与多肽诸如白喉毒素连接的Aβ片段的组合物在促进抗Aβ免疫应答中的用途。然而，没有提供免疫数据。
已经证明识别Aβ N末端(1-16)内表位的单克隆抗体(抗体6C6)保护PC12细胞免受纤维性β淀粉样蛋白的神经毒性损害，并且体外使β淀粉样蛋白解聚(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997))。也已证明抗Aβ1-28形成的单克隆抗体可以体外抑制β淀粉样蛋白聚集(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996))。Frenkel等(J.Neuroimmunol.88：85-90(1998))后来鉴定了两个抗聚集抗体10D5和6C6的表位，即表位“EFRH”，也即Aβ3-6。相反，对Aβ1-7特异的抗体不能防止β淀粉样蛋白聚集(Frenkel D.等，J.Neuroimmunol.95：136-142(1999))。
Aβ1-42具有形成原纤维的性质，并且实际上WO 99/27944中所述的疫苗组合物利用的是经处理能形成聚集体的Aβ1-42。已经证明这些原纤维对神经元细胞培养物是毒性的(Yankner等.，Science 245：417-420(1989))，并且当将其注射到动物大脑中时也观察到了毒性作用(Sigurdson等，Neurobiol.Aging 17：893-901(1996)；Sigurdson等，Neurobiol.Aging 18：591-608(1997))。Walsh等，(Nature 416：535-539(2002))报道了在细胞内小泡中形成Aβ天然寡聚体。这些寡聚体在大鼠体内抑制了长期的强化作用(potentiation)，并且当以在人类大脑和脑脊髓液中发现的浓度存在时破坏了突触可塑性。
在另一个研究中，Bard，F.等.(Nature Medicine 6：916-19(2000))报道了尽管相对适度的血清水平，但是抗Aβ1-42抗体的外周给药能降低淀粉样蛋白负担。该研究利用了抗Aβ1-42多克隆抗体，或抗来源于Aβ不同区域的合成片段的单克隆抗体。因此，抗Aβ肽抗体的诱导具有作为阿尔茨海默氏病潜在治疗法的希望。
WO99/27949中描述了与β淀粉样斑块有关的抗原(诸如β淀粉样肽和Aβ1-40)的粘膜给药。据说粘膜给药可以抑制与阿尔茨海默氏病有关的一些细胞因子应答，并且增强与炎性应答抑制有关的另一些细胞因子应答，其中该炎性应答与该疾病有关。据认为通过“激发以抗炎性细胞因子模式为特征的T细胞”可以抑制炎性应答。如WO9927949中所述适宜的抗原包括对AD特异并被人类或动物宿主的免疫T细胞识别的抗原。
WO 01/18169中描述了单克隆抗体所识别的Aβ表位与丝状噬菌体外壳蛋白的融合。用在外壳蛋白VIII上显示15mer表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO：89)的丝状噬菌体免疫小鼠，产生了识别Aβ1-16和Aβ1-40的抗体。利用Aβ肽在抑制性ELISA中证明了这点，并且发现用Aβ1-40抑制血清与Aβ1-16的结合具有1μM的IC50。然而，Solomon(WO 01/18169)没有提示由带有表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO：89)的丝状噬菌体引起的抗血清能结合AD淀粉样斑块或神经炎斑块。
利用不同于待激发的免疫应答所要针对的抗原的序列进行免疫有大量的缺点。首先，可以诱导针对抗原或抗原决定簇以外的序列部分的抗体。其次，在外源侧翼序列元件背景中的抗原构象可能不同于全长抗原背景中的抗原构象。因此，尽管可以激发与抗原交叉反应的抗体，但是它们对抗原的结合可能是次最佳的。这样激发的抗体的精确特异性也可能不对应于抗抗原本身引起的抗体的特异性，因为表位中存在不同于全长Aβ上残基的另外侧链。最后，15mer氨基酸序列可以含有T细胞表位。WO 01/18169中也公开了丝状噬菌体外壳蛋白质III上表位YYEFRH(SEQ ID NO：90)的展示，其中每个噬菌体上通常只存在3-5个拷贝。当使用感染性噬菌体作为用于免疫的载体时出现了几个问题。首先，对于大的免疫运动，大规模和足够量生产感染剂是有问题的。其次，疫苗中含有抗生素抗性基因的噬菌体DNA的存在也是有问题的，并且是安全性问题。最后，在使用非感染性噬菌体作为疫苗的情况下，大量噬菌体辐射的可行性和效力尚未解决。
WO 01/62284已经描述了Aβ类似物，其中修饰Aβ以包括T辅助细胞表位。用Aβ类似物免疫具有人类APP转基因的TgRND8+小鼠比在没有佐剂情况下用Aβ1-42免疫产生了高4到7.5倍的抗体效价。
最近的研究证明通过免疫接种诱导大脑淀粉样蛋白沉积物减少有改进认知功能的潜力(Schenk，D.，等Nature 400：173-177(1999)；Janus，C.等，Nature 408：979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408：982-985(2000))。
用佐剂QS21中聚集的Aβ1-42免疫的患者的尸体解剖表明，存在T淋巴细胞脑膜脑炎和巨噬细胞对脑白质的浸润(Nicoll，J.A.等，Nature Med.9：448-452(2003))。
最近，出版物已经报道了在用聚集的Aβ1-42和QS-21佐剂组成的疫苗AN1792免疫的患者中的18例脑膜脑炎(Orgogozo J.-M.等，Neurology61：46-54(2003))。据报道T细胞活化是对该疾病负责的潜在机制，但在疾病和血清抗Aβ1-42效价之间没有明显的关系。
公认单独给药纯化的蛋白质通常不足以激发强免疫应答；分离的抗原一般必需与称为佐剂的辅助物质一起施用。在这些佐剂中，施用的抗原可以免于被快速降解，并且佐剂可以造成抗原的低水平延长释放。在本发明中，Aβ肽通过结合VLP而具有免疫原性，并且不需要佐剂。
因此，改进接种效率的一种方法是增加所施用抗原的重复程度。不同于分离的蛋白质，在有和无T细胞辅助及不存在任何佐剂的情况下，病毒都可以诱导快速和有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol：15：235-270(1991))。尽管病毒常常由少数蛋白质组成，但是它们能触发比它们的分离成分强得多的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个至关重要的因素是表面表位的重复性和有序性。许多病毒显示了准晶体表面，该表面展示出一个有规则的表位阵列，这些表位可以有效地与B细胞上的表位特异性免疫球蛋白交联(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17：553-558(1996))。与B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是直接诱导细胞周期进程和IgM抗体产生的强活化信号。而且，这种触发的B细胞能活化T辅助细胞，接着在B细胞中诱导从IgM到IgG抗体产生的转换和长寿记忆B细胞的产生——任何接种的目的(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol：15：235-270(1997))。病毒结构甚至可以与自身免疫病中抗-抗体的产生相联系，作为针对病原体的天然应答的一部分(参见，Fehr，T.等，J Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，通过高度有组织的病毒表面呈递的抗体能诱导强抗-抗体应答。
然而，如所述的，免疫系统通常不能产生抗来源于自身的结构的抗体。对于低浓度存在的可溶抗原而言，这是由Th细胞水平上的耐受性所致。在这些条件下，将自身抗原与可以递送T辅助的载体偶联可以打破耐受性。对于高浓度存在的可溶蛋白质或低浓度的膜蛋白质，B和Th细胞可以是耐受性的。然而，B细胞的耐受性可能是可逆的(无反应性)，并且可以通过施用偶联外源载体的高度有组织形式的抗原来破坏(Bachmann&Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol：15：235-270(1997))。如2002年1月18日提交的，正在审查的美国申请号10/050,902中所表明的，用包含与VLP结合的Aβ肽(Aβ1-15，Aβ1-27和Aβ33-42，其是小鼠的自身抗原)的组合物可以诱导强免疫应答。具体地，结合RNA噬菌体Qβ VLP的上述人类Aβ肽在人类APP转基因小鼠中诱导了高Aβ特异性效价(实施例中所述)，这证明用结合VLP的Aβ肽免疫可以克服对自身抗原Aβ的耐受性。
因此，为了治疗阿尔茨海默氏病，需要高免疫原性的安全组合物和疫苗，特别是，利用无可以激发副反应的T细胞表位和佐剂但仍能诱导结合淀粉样斑块的高抗体效价的免疫原。
发明概述
我们发现Aβ1-6肽与具有固有重复组织结构的核心颗粒，特别是病毒样颗粒(VLP)或VLP亚单位结合形成的高度有序和重复的缀合物，是用于诱导Aβ1-6特异性抗体的有效免疫原。因此，本发明提供了用于阿尔茨海默氏病治疗的预防和治疗手段，该手段基于有序和重复的Aβ1-6-核心颗粒阵列，特别是基于VLP-Aβ1-6肽缀合物或阵列。这种预防和治疗剂能诱导高效价抗Aβ1-6肽抗体，该抗体与可溶Aβ交叉反应，并且能结合人类APP转基因小鼠模型中的人类淀粉样斑块以及结合AD淀粉样斑块。而且，此激发的抗体不与大脑切片上的APP结合。
此外，本发明提供了用于AD治疗的新的组合物、疫苗和方法。包含Aβ1-6肽的此组合物和疫苗无T细胞表位，并且能诱导结合AD斑块和可溶Aβ的抗体。通过使Aβ1-6肽结合核心颗粒，优选地结合VLP，甚至更优选地结合RNA噬菌体的VLP，Aβ1-6肽以高度重复和有序的方式被呈递给患者的免疫系统。
在优选的实施方式中，抗原或抗原决定簇是人类淀粉样β肽Aβ1-6(DAEFRH；SEQ ID NO：75)，其是Aβ(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO：91)的片段，其中人类淀粉样β肽Aβ1-6与核心颗粒或VLP结合。SEQ ID NO：92中提供了淀粉样β蛋白质。SEQ ID NO：93中提供了淀粉样β前体蛋白。
因此，本发明提供了组合物，该组合物包含：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)至少一个具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附着位点选自：(i)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇中的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能与所述第一附着位点缔合(association)；并且其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。适于本发明中使用的核心颗粒的优选实施方式是病毒、病毒样颗粒、噬菌体、RNA噬菌体的病毒样颗粒，细菌菌毛或鞭毛或具有能形成本发明的有序和重复抗原阵列的固有重复结构的任何其它核心颗粒。
本发明的Aβ片段是可溶的，并且一般地不形成团聚体。而且，它们与核心颗粒或VLP结合，并且优选地共价结合。因此，本发明组合物不具有诱导有毒作用，诸如作为淀粉样沉积物的种子的危险。
用包含结合核心颗粒或VLP的Aβ1-6肽的组合物可以获得与可溶Aβ和AD淀粉样斑块交叉反应的高效价抗体，这是本发明的意外发现。特别地，已经证明VLP可以介导抗自身抗原的抗体诱导，由此破坏自身耐受性(WO 02/056905，这里整体将该文献的公开内容并入为参考文献)。而且，该表位的小尺寸也排除了T细胞表位的存在，因此提供了不诱导Aβ特异性T细胞应答的新组合物。此外，所激发的抗体不结合大脑切片上的APP。因此，本发明提供了用于AD预防和治疗的安全疫苗组合物。
更具体地，本发明提供了包含有序重复抗原或抗原决定簇阵列，特别是Aβ1-6肽-VLP缀合物的组合物。更具体地，本发明提供了包含病毒样颗粒和与其结合的至少一个Aβ1-6肽的组合物。本发明也提供了用于产生此缀合物或有序重复阵列的方法。本发明组合物可以用于生产治疗阿尔茨海默氏病的疫苗，和用做药物以预防或治愈阿尔茨海默氏病和有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答。而且，在本上下文中，本发明组合物尤其可用于有效地诱导自身特异性免疫应答。
在本发明中，Aβ1-6肽典型地以定向方式结合核心颗粒或VLP，从而产生有序和重复的Aβ1-6肽抗原阵列。而且，核心颗粒或VLP的高度重复有组织结构可以介导Aβ肽以高度有序的重复方式进行展示，产生高度有组织的重复抗原阵列。而且，因为核心颗粒和VLP对用核心颗粒-Aβ1-6肽阵列或VLP-Aβ1-6肽阵列免疫的宿主是外源的，所以Aβ1-6肽与核心颗粒或VLP的结合也提供了T辅助细胞表位。这些阵列尤其在它们高度有组织的结构、维度和阵列表面抗原的重复性方面不同于现有技术的缀合物。
在本发明的一个方面，化学合成Aβ1-6肽，而从适于核心颗粒或VLP折叠和装配的表达宿主中表达和纯化核心颗粒或VLP。然后，通过Aβ1-6肽与核心颗粒或VLP的结合，装配Aβ1-6肽阵列。
在另一个方面，本发明提供了组合物，该组合物包含(a)病毒样颗粒，和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含(a)本发明组合物，和(b)可接受的药物学载体。
在另一个方面，本发明提供了包含如下组合物的疫苗组合物，其中所述组合物包含(a)病毒样颗粒；和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
在另一个方面，本发明提供了免疫方法，该方法包括向动物施用本发明组合物、本发明药物组合物或本发明疫苗。
在再一方面，本发明提供了制备本发明组合物的方法，该方法包括(a)提供病毒样颗粒；和(b)提供至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽；(c)混合所述病毒样颗粒和所述至少一个抗原或抗原决定簇，使得所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
相似地，本发明提供了制备权利要求1的组合物的方法，该方法包括(a)提供具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供至少一个具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述第二附着位点选自：(i)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇中的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点；并且其中所述第二附着位点能缔合所述第一附着位点；和(c)混合所述核心颗粒和所述至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。
在另一方面，本发明提供了权利要求1的组合物用于制备治疗阿尔茨海默氏病药物的用途。
在另一方面，本发明提供了权利要求1的组合物用于制备预防或治疗阿尔茨海默氏病的药物的用途。而且，在另一方面，本发明提供了权利要求1的组合物单独或联合其它药剂或者以明确缺少特殊物质诸如佐剂的形式用于制备治疗或预防阿尔茨海默氏病和/或刺激哺乳动物免疫系统的组合物、药物组合物、疫苗、药剂或药物的用途。
因此，特别地，本发明提供了适于预防和/或减轻阿尔茨海默氏病或其相关病症的疫苗组合物。本发明还提供了用于预防和/或减轻人类的阿尔茨海默氏病或其相关病症的免疫或接种方法。可以预防地或治疗地施用本发明组合物。
在具体实施方式中，本发明提供了预防和/或减弱由“自身”基因产物，即这里所用的“自身抗原”引起或加重的阿尔茨海默氏病或其相关病症的方法。在相关实施方式中，本发明提供了在动物或个体中诱导免疫学应答的方法，该方法导致可以预防和/或减弱由“自身”基因产物引起或加重的阿尔茨海默氏病或其相关病症的抗体产生。
如本领域普通技术人员所理解的，当向动物或人类给药本发明组合物时，它们可以是含有盐、缓冲液、佐剂或期望用于改进组合物效力的其它物质的组合物。大量的文献包括Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，编辑，Mack Publishing Co.(1990))中提供了适于在药物组合物制备中使用的物质的例子。
如果受体个体可以耐受本发明组合物的施用，那么称本发明组合物是“药理学可接受的”。而且，将以“治疗有效量”(即，产生期望的生理学作用的量)施用本发明组合物。
可以用本领域已知的各种方法给药本发明组合物，但是正常地，通过注射、输注、吸入、口服或其它适合的物理方法给药。做为可替代方案，可以肌内地、静脉内地、或皮下地给药该组合物。用于给药的组合物成分包括无菌水性(例如，生理盐水)或非水性溶液和悬浮液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。载体或封闭敷料可以用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。
基于本领域已知的现有技术、下面的附图、本发明说明书和权利要求，本发明的其它实施方式对本领域普通技术人员将显而易见。
附图说明
图1描述了还原条件下电泳的SDS-PAGE凝胶，表明Aβ1-6肽(NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO：77)与Qβ外壳蛋白的VLP偶联的结果。
图2表示在用偶联Qβ外壳蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，对Aβ1-6特异性抗体的ELISA分析。
图3表示在用偶联Qβ外壳蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，对Aβ1-40特异性抗体的ELISA分析。
图4A-B表示用偶联Qβ外壳蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清染色的APP23小鼠大脑切片(A)和AD患者entorhinalcortex切片(B)。
图5A-E表示用偶联Qβ外壳蛋白VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清或者用对人或小鼠APP之C末端特异的多克隆兔抗血清染色的APP23小鼠大脑切片。
图6表示用ELISA试验测得的、用偶联Qβ VLP的人类Aβ1-6肽免疫恒河猴的结果。
图7表示通过组织学在人类AD和转基因小鼠斑块上测定到的、斑块与血清的结合结果，其中所述血清来源于用偶联Qβ VLP的人类Aβ1-6肽免疫的猴子。
图8描述了对鼠Aβ1-6与AP205 VLP偶联的SDS-PAGE分析。
图9表示ELISA中测定到的、用偶联AP205的鼠Aβ1-6免疫小鼠的结果。
图10表示在用QβhAβ1-6免疫的9.5至19个月龄的“Swedish/London”转基因小鼠的血清中，抗Aβ40和抗Aβ42效价的ELISA分析。
图11表示用QβhAβ1-6或PBS免疫的“Swedish/London”转基因小鼠的大脑切片的免疫组织化学染色。
图12表示在用QβhAβ1-6、Qβ或PBS免疫的9.5至19个月龄“Swedish/London”转基因小鼠中对斑块沉积物的定量。
图13表示在用QβhAβ1-6或PBS免疫的13.5至19个月龄“Swedish/London”转基因小鼠中对斑块沉积物的定量。
图14表示在用Qβh Aβ1-6免疫的“Swedish”转基因小鼠血清中，针对抗Aβ40和抗Aβ42效价的ELISA分析。
图15表示用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的“Swedish”转基因小鼠的大脑切片的免疫组织化学染色。
图16表示在用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的“Swedish”转基因小鼠中对斑块沉积物的定量。
发明详述
除非另外定义，这里所用的所有科技术语具有和本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的意思相同的意思。尽管在本发明实践或试验中可以使用与这里所述相似或等同的任何方法和材料，但是，此后描述的是优选的方法和材料。
1定义：
Aβ1-6肽：这里所用的Aβ1-6肽指具有与人类Aβ1-6序列相应的序列或与人类Aβ1-6序列同源的序列的肽。与人类Aβ1-6序列同源的序列包括，但不限于其它物种的Aβ1-6序列，因此包括但不限于灵长类、兔子、豚鼠、光滑爪蟾(xenopus Laevis)、青蛙、小鼠和大鼠Aβ1-6序列。尽管来源于爪蟾或青蛙的Aβ1-6序列在两个位置不同于人类Aβ1-6，但是它们具有保守性突变(Ala-Ser，Phe-Tyr)，因此根据该定义认为它们与Aβ1-6同源。然而，根据本发明，通常修饰Aβ1-6肽使得第二附着位点附着于其上。优选地，用包含第二附着位点的接头或氨基酸接头修饰第二附着位点，以便结合核心颗粒或VLP。当这里提到Aβ1-6肽时，应该包括上述修饰的Aβ1-6肽，即具有附着于其上的第二附着位点的Aβ1-6肽。然而，通常地，本申请文件中明确地指出这种修饰。而且，随着本说明书的进行，作为本发明抗原或抗原决定簇的Aβ1-6肽的其它优选实施方式将变得显而易见。
佐剂：这里所用术语“佐剂”指免疫应答的非特异性刺激物或允许在宿主中产生贮库(depot)的物质，当其与本发明疫苗或药物组合物联合时可以提供更强的免疫应答。可以使用各种佐剂。例子包括完全和不完全弗氏佐剂，氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其它佐剂是矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、pluronie polyol、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂诸如BCG(卡介菌)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域已知的。可以与本发明组合物一起给药的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂质免疫调节剂，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，铝盐(Alum)，MF-59，OM-174，OM-197，OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可以包含这些物质的混合物。
来源于南美洲树Quillaja Saponaria Molina树皮的具有佐剂活性的免疫学活性皂苷级分是本领域已知的。例如QS21，也称为QA21，是来源于Quillaja Saponaria Molina树的Hplc纯化级分，并且在美国专利号5,057,540中公开了它的生产方法(做为QA21)。Scott等，Int.Archs.AllergyAppl.Immun.，1985，77，409也公开了Quillaja皂苷作为一种佐剂。单磷酰脂质A和其衍生物是本领域已知的。优选的衍生物是3-脱氧-酰化单磷酰脂质A，见英国专利号2220211。WO00/00462中描述了其它优选的佐剂，这里将这篇文献的公开内容并入为参考文献。
然而，本发明有利的特征是本发明组合物高度的免疫原性。如这里已概述的或者随着本说明书的进行将变得显而易见的，本发明在备选的或优选的实施方案中提供了无佐剂的疫苗和药物组合物，从而产生了用于治疗AD的疫苗和药物组合物，该疫苗和药物组合物无佐剂并且因此具有优良的安全性质，因为佐剂可能引起副作用。在涉及用于治疗AD的疫苗和药物组合物时，这里所用的术语“无”指所使用的疫苗和药物组合物没有佐剂。
氨基酸接头：如这里所使用的，本说明书中  “氨基酸接头”，或也称为“接头”在于连接第二附着位点与抗原或抗原决定簇，或者更优选地，其已经包含或含有第二附着位点，典型地，但不是必需地，所述第二附着位点为一个氨基酸残基，优选地为半胱氨酸残基。然而，即使由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明优选的实施方式，但是这里使用的术语“氨基酸接头”并没有意指这种氨基酸接头专门地由氨基酸残基组成。氨基酸接头的氨基酸残基优选地由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物组成。然而，包含具有巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头也包括在本发明中。这种分子优选地包含C1-C6烷基-、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分。然而，除了氨基酸接头外，优选地包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分并且无任何氨基酸的接头也包括在本发明范围内。抗原或抗原决定簇或可选地第二附着位点和氨基酸接头之间的连接优选地通过至少一个共价键，更优选地通过至少一个肽键进行。
动物：这里使用的术语“动物”意在包括例如人类、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳动物、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。
抗体：这里所用术语“抗体”指能结合表位或抗原决定簇的分子。该术语意在包括整个抗体和其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选地，抗体是人抗原结合抗体片段，并且包括，但不限于Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFV)及含有VL或VH结构域的片段。抗体可以来源于任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。这里所用术语“人”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包括从人类免疫球蛋白文库分离的抗体或者从具有一种或多种人类免疫球蛋白转基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如，参见Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。
抗原：这里所用术语“抗原”指能被抗体结合或者在被MHC分子呈递后能被T细胞受体(TCR)结合的分子。这里所用术语“抗原”也包括T-细胞表位。抗原还能被免疫系统识别和/或能诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而激活B-和/或T-淋巴细胞。然而，这可能要求，至少在一些情况下，抗原含有或连接有Th细胞表位，并且在佐剂中给出。抗原可以有一个或多个表位(B-和T-表位)。上述特异性反应意思是指抗原典型地以高度选择性方式优先地与其相应抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原激发的大量其它抗体或TCR反应。这里所用抗原也可以是几种单独抗原的混合物。
抗原决定簇：这里所用术语“抗原决定簇”意指B或T淋巴细胞特异地识别的抗原部分。B-淋巴细胞应答抗原决定簇产生抗体，而T淋巴细胞通过增殖和建立对细胞和/或体液免疫的介导起决定作用的效应子功能来应答抗原决定簇。
缔合(association)：这里所用术语“缔合”当用于第一和第二附着位点时，指第一和第二附着位点的结合，优选地通过至少一个非肽键结合。缔合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的或它们的任何组合，优选地缔合的性质是共价的。
第一附着位点：这里所用短语“第一附着位点”指非天然或天然来源的元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可以与其缔合。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的联合或者它们的化学反应基团。通常地和优选地，第一附着位点位于核心颗粒诸如，优选地病毒样颗粒的表面。多个第一附着位点通常以重复构型存在于核心或病毒样颗粒的表面。
第二附着位点：这里所用短语“第二附着位点”指与抗原或抗原决定簇连接的元件，位于核心颗粒或病毒样颗粒表面上的第一附着位点可以与其缔合。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的联合或者它们的化学反应基团。至少一个第二附着位点存在于抗原或抗原决定簇上。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”指包含至少该抗原或抗原决定簇和该第二附着位点的抗原或抗原性构建体。然而，特别是对于非天然来源，即，不天然出现在抗原或抗原决定簇中的第二附着位点，这些抗原或抗原性构建体包含“氨基酸接头”。
结合：这里所用术语“结合”指可以是共价的(例如通过化学偶联)或非共价的(例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等)结合或附着。共价键可以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等等。术语“结合”更广义，并且包括术语诸如“偶联”、“融合”和“附着”。
外壳蛋白：这里所用术语“外壳蛋白”指能掺入噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配物中的噬菌体或RNA噬菌体蛋白质。然而，当指RNA噬菌体外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ外壳蛋白基因的具体基因产物称为“Qβ CP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包括“Qβ CP”及A1蛋白质。噬菌体Qβ的衣壳主要由Qβ CP组成，具有少量的A1蛋白质。同样地，VLP Qβ外壳蛋白主要包含Qβ CP，具有少量的A1蛋白质。
核心颗粒：这里所用术语“核心颗粒”指具有固有重复组织的刚性结构。这里所用核心颗粒可以是合成过程的产物或者是生物学过程的产物。
偶联的：这里所用术语“偶联的”指通过共价键或通过强的非共价相互作用的附着，通常和优选地指通过共价键的附着。本发明中可以使用本领域技术人员通常用于生物活性材料偶联的任何方法。
有效量：这里所用术语“有效量”指实现期望的生物学作用所必需的量或足以实现期望的生物学作用的量。组合物的有效量将是达到选定结果的量，并且该量可以由本领域技术人员常规地确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量可以是引起免疫系统活化所必需的量，一旦暴露于抗原，这种量将引起抗原特异性免疫应答形成。该术语也与“足够量”同义。
表位：这里所用术语“表位”指在动物，优选哺乳动物，最优选人中，具有抗原或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。在MHC分子背景中表位可以被T细胞通过其T细胞受体识别，或者表位可以被抗体识别。这里所用术语“免疫原性表位”定义为通过本领域已知的任何方法进行测定，可以在动物中激发抗体应答或诱导T细胞应答的多肽部分(参见，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。如这里所用术语“抗原性表位”定义为通过本领域已知的任何方法进行测定，抗原蛋白质中可以与抗体免疫特异性结合的部分。免疫特异性结合排除了非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不必一定是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，在这种情况下，它们可以在MHC背景下，免疫特异性地结合T细胞受体。
表位可以在表位独特的空间构象中包含3个氨基酸。一般地，表位由至少约5个这种氨基酸组成，更一般地，由至少约8-10个这种氨基酸组成。如果表位是有机分子，那么它可以如硝基苯基一样小。
融合：这里所用术语“融合”指不同来源的氨基酸序列通过它们的编码核苷酸序列的读框内组合而在一个多肽链中组合。术语“融合”明确地包含内部融合，即，不同来源的序列除了融合在多肽链一个末端外，还可以插入到多肽链中。
免疫应答：这里所用术语“免疫应答”指引起B和/或T-淋巴细胞和/或抗原呈递细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在一些情况下，免疫应答可能具有低的强度，并且只有当使用至少一种本发明物质时才可检测。“免疫原性”指用于刺激活生物体免疫系统的试剂，由此免疫系统的一种或多种功能将被增强并且定向于此免疫原性剂。“免疫原性多肽”是在佐剂存在或不存在的情况下，单独地或是以连接载体的形式激发细胞和/或体液免疫应答的多肽。优选地，可以活化抗原呈递细胞。
“增强”免疫应答的物质是这样的一种物质，即当与没有添加该物质时测定的相同免疫应答比较，添加该物质时观察到免疫应答被增强或强化或发生偏离。例如，可以在免疫期间利用或不利用该物质并获取样品，然后可以在样品中利用51Cr释放试验测定细胞毒性T细胞的裂解活性。与没有该物质时的CTL裂解活性比较，该物质增强CTL裂解活性时的量称为足以增强动物对抗原的免疫应答的量。在优选的实施方式中，免疫应答增强至少2倍，更优选地增强至少约3倍或更多。也可以改变所分泌的细胞因子的量和类型。做为可以替代的方案，可以改变诱导的抗体或其亚型的量。
免疫：这里所用术语“免疫“或相关术语指赋予产生抗靶抗原或表位的实质性免疫应答(包括抗体和/或细胞免疫诸如效应CTL)的能力。这些术语不要求产生完全的免疫，而是要求产生实质上比基线大的免疫应答。例如，如果本发明方法应用后，出现了对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，那么就认为哺乳动物被免疫了。
天然来源：这里所用术语“天然来源”意指物质的整体或其部分不是合成的，而是自然界中存在或产生的。
非天然的：这里所用术语“非天然的”一般意指不是来源于自然界的，更具体地，该术语意指来源于人工的。
非天然来源：这里所用术语“非天然来源”一般意指合成的或者不是来源于自然界的；更具体地，该术语意指来源于人工的。
有序和重复的抗原或抗原决定簇阵列：这里所用术语“有序重复的抗原或抗原决定簇阵列”一般地指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇相对于核心颗粒或病毒样颗粒为一种典型地且优选地一致的空间排列。在本发明一个实施方式中，重复模式可以是几何学模式。适宜的有序重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选例子是具有严格重复的抗原或抗原决定簇次晶晶序的阵列，优选地具有0.5到30纳米晶面间距(spacing)，优选地5到15纳米晶面间距。
菌毛：这里所用术语“菌毛”指细菌细胞的细胞外结构，其由组织成有序重复模式的蛋白质单体(例如菌毛蛋白单体)组成。而且，菌毛是参与诸如细菌细胞附着宿主细胞表面受体、细胞间遗传交换和细胞-细胞识别等过程的结构。菌毛的例子包括类型1菌毛、P菌毛、F1C菌毛、S菌毛和987P菌毛。下面列出了菌毛的其它例子。
菌毛样结构：这里所用短语“菌毛样结构”指与菌毛具有相似特征并由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个例子是表达修饰的菌毛蛋白的细菌细胞形成的结构，该修饰的菌毛蛋白不形成与天然菌毛相同的有序重复阵列。
多肽：这里所用术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。它指氨基酸的分子链，并且不指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽定义中。该术语也意指多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生多肽不一定从指定核酸序列翻译而成。其也可以通过任何方法，包括化学合成来产生。
残基：这里所用术语“残基”意指多肽主链或侧链中具体的氨基酸。
自身抗原：这里所用术语“自身抗原”指宿主DNA编码的蛋白质，并且通过宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物也定义为自身的。此外，由2种或几种自身分子联合产生的蛋白质，或者是作为自身分子一部分的蛋白质，及与上述两种自身分子具有高度同源性(＞95％，优选地＞97％，更优选地＞99％)的蛋白质也可以认为是自身的。
治疗：这里所用术语“治疗”或“治疗的”指预防和/或治疗。例如，当在感染性疾病方面使用该术语时，该术语指预防性治疗(该预防性治疗增加个体对病原体感染的抗性，或者换而言之，减少个体被病原体感染或个体显示出由感染引起的病征的可能性)，以及个体感染后的治疗(以战胜感染，例如减少或消除感染或者防止其变得更严重)。
疫苗：这里所用术语“疫苗”指含有本发明组合物并具有能向动物给药的形式的制剂。通常地，疫苗包含常规盐水或缓冲水性溶液介质，而本发明组合物悬浮或溶解于其中。以这种形式，可以方便地使用本发明组合物以预防、改善或治疗病症。一旦将该疫苗引入到宿主中，该疫苗就能激发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的活化和/或其它细胞应答。
可选地，本发明的疫苗还包含佐剂，该佐剂可以相对于本发明化合物以次要或主要比例存在。
病毒样颗粒(VLP)：这里所用术语“病毒样颗粒”指类似病毒颗粒的结构。而且，本发明病毒样颗粒由于缺少所有或部分病毒基因组，特别是病毒基因组中的复制和感染元件，所以它是非复制和非感染性的。本发明病毒样颗粒可以含有不同于其基因组的核酸。本发明病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是病毒衣壳，诸如病毒，噬菌体或RNA噬菌体的病毒衣壳。这里可交换地使用的术语“病毒衣壳”和“衣壳”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配物。典型并优选地，病毒蛋白质亚单位装配成病毒衣壳或衣壳，所述衣壳的结构具有固有的重复组织，其中所述结构通常是球形或管状。例如，RNA噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面对称的球形。这里所用术语“衣壳样结构”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配物，其形态类似上述意义的衣壳，但是偏离典型的对称装配，而是维持了足够程度的有序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒：这里所用术语“噬菌体的病毒样颗粒”指类似噬菌体结构的病毒样颗粒，其是非复制和非感染性的，并且缺少至少一种或多种编码噬菌体复制机器的基因，并且典型地也缺少一种或多种编码负责病毒附着或进入到宿主中的蛋白质的基因。然而，该定义也应该包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中前述一种或多种基因仍旧存在但是已失活，因此也导致非复制和非感染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：从RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配形成的、可选地含有宿主RNA的衣壳结构称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在这种特定情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可以仅由Qβ CP亚单位装配(Qβ CP亚单位通过Qβ CP基因表达产生，该基因含有例如TAA终止密码子，从而通过阻抑作用排除了更长A1蛋白质的任何表达，参见Kozlovska，T.M.，等，Intervirology 39：9-15(1996))，或者还可以在衣壳装配物中含有A1蛋白质亚单位。
病毒颗粒：这里所用术语“病毒颗粒”指病毒的形态学形式。在一些病毒类型中，它包括蛋白质衣壳环绕的基因组；其它病毒还具有另外的结构(例如，包膜，尾等)。
一个/一种：除非另有说明，当在本公开中使用术语“一个/一种”时，它们意指“至少一个/一种”或者“一个/种或多个/种”。
如本领域技术人员所清楚的，本发明一些实施方式涉及到使用重组核酸技术诸如克隆、聚合酶链式反应、DNA和RNA的纯化、原核生物和真核生物细胞中重组蛋白质的表达等。这些方法是本领域技术人员公知的，并且在出版的实验室方法手册中可以方便地找到(例如，Sambrook，J.等，编辑，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等，编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997))。在文献中也充分描述了与组织培养细胞系有关的基本实验技术(Celis，J.，编辑，Cell Biology，Academic Press，第二版，(1998))和抗体技术(Harlow，E.和Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press SanDiego(1990)；Scopes，R.K.，Protein Purification Principles and Practice，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))，这里将这些文献并入为参考文献。
2.增强免疫应答的组合物和方法
本公开的发明提供了用于在动物中诱导抗Aβ1-6肽免疫应答，诱导能结合Aβ淀粉样斑块和可溶Aβ的抗体的组合物和方法。本发明组合物包含，或者可替代地其组成为：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)至少一个具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附着位点选自：(i)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇中的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能与所述第一附着位点缔合；并且其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。更具体地，本发明组合物包含或者可替代地其组成为病毒样颗粒和至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合以形成有序和重复的抗原-VLP阵列。而且，本发明能使实施者方便地构建这种组合物，特别是用于阿尔茨海默氏病治疗和/或预防。本申请范围中的病毒样颗粒指类似于病毒颗粒但是没有致病性的结构。一般地，病毒样颗粒缺少病毒基因组，因此是非感染性的。而且，通过异源表达可以大量产生病毒样颗粒，并且可以容易地进行纯化。
在一个实施方式中，核心颗粒包含或者选自病毒、细菌菌毛、从菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、RNA噬菌体病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。本领域已知的具有有序和重复外壳和/或核心蛋白质结构的任何病毒都可以选作本发明的核心颗粒；适宜病毒的例子包括新培斯病毒和其它甲病毒，弹状病毒(例如，水泡性口膜炎病毒)，细小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒，Aichi病毒)，披膜病毒(例如，风疹病毒)，正粘病毒(例如，Thogoto病毒，Batken病毒，家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，禽多瘤病毒BFDV)，细小病毒，轮状病毒，诺沃克病毒，口蹄疫病毒、逆转录病毒，乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒，FlockHouse Virus，和人乳头瘤病毒，并且优选RNA噬菌体，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11，噬菌体MX1，噬菌体NL95，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体MS2，噬菌体f2，噬菌体PP7(例如，参见Bachmann，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17：553-558(1996)中的表1)。
在另一实施方式中，本发明利用病毒基因工程，在有序和重复的病毒包膜蛋白和第一附着位点之间产生融合，所述第一附着位点包含或者可替代地或优选地其是选定的异源蛋白质、肽、抗原决定簇或反应性氨基酸残基。本发明组合物的构建还可能使用本领域已知的其它基因操作；例如，可能期望通过基因突变限制重组病毒的复制能力。而且，由于化学或物理失活作用，或者如所述，由于缺少能复制的基因组，本发明所用病毒不能复制。选定用于和第一附着位点融合的病毒蛋白质应该具有有组织的重复结构。这种有组织的重复结构包括病毒表面上的准晶体组织，具有5-30nm，优选地5-15nm晶面间距。这种类型融合蛋白质的产生将在病毒表面上导致许多有序重复的第一附着位点，并且反映天然病毒蛋白质的正常组织。如本领域技术人员所理解的，第一附着位点可以是任何适宜的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或它们的联合，或者它们的一部分，它们可以用来特异性附着抗原或抗原决定簇，从而形成有序和重复抗原阵列。
在本发明另一个实施方式中，核心颗粒是重组甲病毒，并且更具体地，是重组新培斯病毒。甲病毒是正链RNA病毒，它们在感染细胞的胞质中完整地复制它们的基因组RNA，并且没有DNA中间体(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58：491-562(1994))。甲病毒科的几个成员，新培斯病毒(Xiong，C.等，Science 243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.11：18-22(1993))，塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)(Liljestrm，P.& Garoff，H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等，Virology 171：189-204(1989))已经接受了相当多的关注，其被用做各种不同蛋白质的病毒基表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8：578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))和用做疫苗研制的候选者。最近，已经授予了涉及甲病毒在异源蛋白质表达和疫苗研制中的用途的大量专利(参见美国专利号5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。如这里并入为参考文献的前述文献所述，通过重组DNA技术领域一般已知的方法，可以构建本发明的甲病毒核心颗粒。
可以使用各种不同的重组宿主细胞来产生用于抗原或抗原决定簇附着的基于病毒的核心颗粒。例如，已知甲病毒具有广泛的宿主范围；新培斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞及一些昆虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51：645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35：335(1977)；Stollar，V.in THE TOGAVIRUSES，R.W.Schlesinger，编辑，Academic Press，(1980)，583-621页)。因此，在本发明实践中可以使用多种重组宿主细胞。BHK，COS，Vero，HeLa和CHO细胞特别适于异源蛋白质的产生，因为它们有潜能以与人类细胞相似的方式糖基化异源蛋白质(Watson，E.等，Glycobiology 4：227，(1994))，并且可以经选择(Zang，M.等，Bio/Technology 13：389(1995))或者基因工程改造(Renner W.等，Biotech.Bioeng.4：476(1995)；Lee K.等.Biotech.Bioeng.50：336(1996))在无血清培养基中及悬浮液中生长。
通过标准实验室手册(参见，例如Sambrook，J.等，编辑，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，9章；Ausubel，F.等，编辑，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.Wiley &Sons，Inc.(1997)，16章)中所述方法，包括诸如电穿孔、DEAE葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、转导、scrape loading、生物弹道引入和感染，可以实现将多核苷酸载体引入到宿主细胞中。在Felgner，P.等，美国专利号5,580,859中讨论了将外源DNA序列引入到宿主细胞中的方法。
包装的RNA序列也可以用于感染宿主细胞。可以通过将这些包装的RNA序列添加到培养基中，以便将其引入宿主细胞中。例如，在大量文献，包括“新培斯病毒表达系统”，C版本(Invitrogen目录号.K750-1)中描述了非感染性甲病毒颗粒的制备。
当哺乳动物细胞用作产生基于病毒的核心颗粒的重组宿主细胞时，一般地，将在组织培养基上培养这些细胞。在培养基中培养细胞的方法是本领域已知的(参见，例如Celis，J.，编辑，CELL BIOLOGY，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等，编辑，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等，编辑，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，CULTURE OF ANIMAL CELLS，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
适于用做本发明核心颗粒的其它RNA病毒例子包括，但不限于下面的病毒：呼肠病毒科成员，包括正呼肠病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型)，环状病毒属(蓝舌病病毒，Eugenangee病毒，Kemerovo病毒，非洲马瘟病毒和科罗拉多蜱传热病毒)，轮状病毒属(人类轮状病毒，内布拉斯加小牛腹泻病毒，鼠轮状病毒，猿猴轮状病毒，牛或绵羊轮状病毒，禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，埃可病毒(ECHO)，甲、丙、丁、戊和已型肝炎病毒，猿猴肠道病毒，鼠科脑脊髓炎(ME)病毒，Poliovirus muris，牛肠道病毒，猪肠道病毒)，心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，Mengovirus)，鼻病毒属(人类鼻病毒，包含至少113种亚型；其它鼻病毒)，Apthovirus属(口蹄疫病毒(FMDV)；Calciviridae科，包括猪水疱疹病毒，San Miguel海狮病毒，猫小RNA病毒和诺沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，Semlikforest病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，，O′Nyong-Nyong病毒，罗斯河病毒，委内端拉马脑炎病毒，西部马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传播的黄热病毒，登革病毒，日本脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒，Murray河谷脑炎病毒，西尼罗病毒，Kunjin病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳跃病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，Border disease病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(Bunyamwera病毒和相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒组)，白蛉病毒属(白蛉热Sicillian病毒，山谷热病毒)，纳伊罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和乌库病毒属(Uukuniemi和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人类亚型)，猪流感病毒，禽和马流感病毒，乙型流感病毒(许多人类亚型)，和丙型流感病毒(可能单独的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化全脑炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，O′Nyong-Nyong病毒，罗斯河病毒，委内端拉马脑炎病毒，西部马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传播的黄热病毒，登革病毒，日本脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒，Murray河谷脑炎病毒，西尼罗病毒，Kunjin病毒，中欧蜱传病毒，远东蜱传病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳跃病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，Boder disease病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(Bunyamwera和相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒组)，白蛉病毒属(白蛉热Sicillian病毒，山谷热病毒)，纳伊罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和乌库病毒属(Uukuniemi和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人类亚型)；猪流感病毒，禽和马流感病毒；乙型流感病毒(许多人类亚型)，和丙型流感病毒(可能单独的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化全脑炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒(VSV)属，Chandipura病毒，Flanders-Hart Park病毒)，狂犬病毒属(狂犬病病毒)，鱼类弹状病毒和线状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒复合物和拉沙病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人类肠冠状病毒和猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。
可以用做核心颗粒的示例性DNA病毒包括，但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(大天花，类天花，猴痘痘苗，牛痘，Buffalopox，野兔痘，Ectromelia)，野兔痘病毒属(粘液瘤，纤维瘤)，禽痘病毒属(禽痘病毒，其它禽类痘病毒)，山羊痘病毒属(绵羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(传染性小脓疱皮炎病毒，假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪热病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1和2型，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)；β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴和啮齿动物的巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马立克氏病病毒，松鼠猴疱疹病毒，Herpesvirus ateles，Herpesvirussylvilagus，豚鼠疱疹病毒，Lucke肿瘤病毒)；腺病毒科，包括Mastadenovirus属(人类亚组A，B，C，D和E及未分组的；猿猴腺病毒(至少23种血清型)，犬传染性肝炎，和牛、猪、绵羊、青蛙和许多其它物种的腺病毒，禽腺病毒属(禽类腺病毒)；和不可培养的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒和其它物种的各种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，野兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，和其它灵长类多瘤病毒诸如嗜淋巴细胞乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺相关病毒属，细小病毒属(猫泛白细胞减少病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申貂病病毒等)。最后，DNA病毒可以包括诸如慢性传染性神经病病毒(CHINA病毒)之类的病毒。
在其它实施方式中，细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白的亚部分，或者含有细菌菌毛蛋白或其亚部分的融合蛋白质被用于制备本发明组合物或疫苗组合物。菌毛蛋白的例子包括由大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的菌毛蛋白。适于本发明使用的菌毛蛋白氨基酸序列包含GenBank报道AJ000636，AJ132364，AF229646，AF051814，AF051815和X00981中所述氨基酸序列，这里将这些文献所有公开的内容并入为参考文献。
在将细菌菌毛蛋白输出到细菌外周质以前，通常加工该蛋白质以移除N末端前导序列。而且，如本领域技术人员将认识到的，用于制备本发明组合物或疫苗组合物的细菌菌毛蛋白通常将没有天然存在的前导序列。
适于本发明使用的菌毛蛋白的一个具体例子是大肠杆菌(E.coli)P菌毛蛋白(GenBank报道AF237482(SEQ ID NO：1))。适于本发明使用的类型1大肠杆菌菌毛蛋白的一个例子是具有GenBank报道P04128(SEQ IDNO：2)中所述氨基酸序列的菌毛蛋白，其由具有GenBank报道M27603(SEQ ID NO：3)中所述核苷酸序列的核酸编码。这里将这些GenBank报道所有公开的内容并入为参考文献。而且，一般地，上述蛋白质的成熟形式将被用于制备本发明的组合物或疫苗组合物。
适于本发明实践中使用的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亚部分一般将能缔合以形成有序和重复的抗原阵列。
体外制备菌毛和菌毛样结构的方法是本领域已知的。例如，Bullitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12890-12895 (1996)描述了大肠杆菌(E.coli)P菌毛亚单位的体外重建。而且，Eshdat等，J.Bacteriol.148：308-314 (1981)描述了适于解离大肠杆菌类型1菌毛和重建菌毛的方法。简而言之，这些方法如下：在饱和盐酸胍中37℃温育以解离菌毛。然后，通过层析纯化菌毛蛋白，随后通过用5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(pH 8.0)透析形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等也发现一旦用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH 8.0)透析后菌毛蛋白二聚体将重新装配形成菌毛。
而且，利用，例如常规的基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋白以含有第一附着位点，其中抗原或抗原决定簇通过第二附着位点连接此第一附着位点。可替代地，抗原或抗原决定簇可以通过第二附着位点直接连接这些蛋白质中天然存在的氨基酸残基。然后，这些修饰的菌毛蛋白可以用在本发明疫苗组合物中。
可以用这里所述用于HBcAg的相似方法修饰用于制备本发明组合物或疫苗组合物的细菌菌毛蛋白。例如，可以缺失或用其它氨基酸残基置换半胱氨酸和赖氨酸残基，并且可以向这些蛋白质添加第一附着位点。而且，可以以修饰形式表达菌毛蛋白或者可以在表达后化学修饰菌毛蛋白。相似地，可以从细菌收集完整的菌毛，然后化学修饰之。
在另一个实施方式中，从细菌(例如大肠杆菌)收集菌毛或菌毛样结构，并且用于形成本发明的组合物或疫苗组合物。适于制备组合物或疫苗组合物的菌毛的一个例子是大肠杆菌类型1菌毛，其是从具有SEQ IDNO：2中所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体形成的。
本领域已知多种方法可用于收集细菌菌毛。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74：623-632(1998))描述了用于从大肠杆菌收集P菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P菌毛质粒的超菌毛化大肠杆菌剪切菌毛，并且通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀循环纯化。
一旦收获后，菌毛或菌毛样结构就可以用各种方法修饰。例如，可以向菌毛添加第一附着位点，其中抗原或抗原决定簇可以通过第二附着位点附着第一附着位点。换而言之，可以收集和修饰细菌菌毛蛋白或菌毛样结构以产生有序和重复的抗原阵列。
抗原或抗原决定簇可以与菌毛或菌毛样结构中存在的天然半胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这种情况下，天然氨基酸残基的高度有序和重复性将引导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶联。例如，可以利用异双官能交联剂使菌毛或菌毛样结构与抗原或抗原决定簇的第二附着位点连接。
当使用生物体天然合成的结构(例如，菌毛蛋白)制备本发明组合物和疫苗组合物时，基因工程改造这些生物体以使它们产生具有期望特征的结构常常是有利的。例如，当使用大肠杆菌类型1菌毛时，可以修饰这些菌毛的来源大肠杆菌使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的例子包括一个或多个赖氨酸残基的插入，一个或多个天然存在的赖氨酸残基的缺失或置换，和一个或多个天然存在的半胱氨酸残基(例如，SEQ IDNO：2中位置44和84的半胱氨酸残基)的缺失或置换。
而且，可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，以产生含有第一附着位点(例如，FOS或JUN结构域)而不是赖氨酸残基的表达产物。当然，适宜的第一附着位点一般将限于那些不会阻止菌毛蛋白形成适于用在本发明疫苗组合物中的菌毛或菌毛样结构的第一附着位点。
可以体内(例如，通过同源重组)修饰细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因，或者可以将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入到这些细胞中。例如，菌毛蛋白基因可以作为可复制克隆载体或插入到细菌染色体中的载体的一个成分被引入到细菌细胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以连接表达调节控制序列(例如lac操纵基因)。
在大多数情况下，本发明组合物或疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构将由单一类型的菌毛蛋白亚单位组成。一般地将使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛样结构，因为预期它们将形成可以呈递高度有序和重复抗原阵列的结构。
然而，本发明组合物也包括这样的组合物和疫苗，该组合物和疫苗包含由异质菌毛蛋白亚单位形成的菌毛或菌毛样结构。可以从细菌细胞中天然存在的基因表达能形成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛亚单位，或者可以将形成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单位引入到细胞中。当在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达天然存在的菌毛蛋白基因和引入的基因时，结果一般是从这些菌毛蛋白混合物形成的结构。而且，当在细菌细胞中表达两种或多种菌毛蛋白基因时，每种菌毛蛋白基因的相对表达量典型地将是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比率的因素。
当期望菌毛或菌毛样结构具有特定的混合菌毛蛋白亚单位组成时，可以通过异源诱导型启动子调节至少一种菌毛蛋白基因的表达。这种启动子及其它遗传元件可以用于调节细菌细胞中产生的不同菌毛蛋白亚单位的相对量，并由此调节菌毛或菌毛样结构的组成。
此外，抗原或抗原决定簇可以通过非肽键的键连接细菌菌毛或菌毛样结构，可以基因工程改造产生本发明组合物中使用的菌毛或菌毛样结构的细菌细胞以产生融合抗原或抗原决定簇的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛样结构的这种融合蛋白质适于本发明疫苗组合物中使用。
在优选的实施方式中，核心颗粒是病毒样颗粒，其中病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。利用重组DNA技术和公众容易得到的病毒编码序列，本领域技术人员可以制备VLP。例如，利用商购杆状病毒载体，同时对序列进行适当修饰以允许编码序列和调节序列功能性连接，可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列使之在杆状病毒表达载体中于病毒启动子调节控制下表达。也可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列使之在例如细菌表达载体中表达。
VLP的例子包括但不限于：乙型肝炎病毒衣壳蛋白(Ulrich，等，VirusRes.50：141-182(1998))，麻疹病毒(Warnes，等，Gene 160：173-178(1995))，新培斯病毒，轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)，口蹄疫病毒(Twomey，等，Vaccine 13：1603-1610，(1995))，诺沃克病毒(Jiang，X.，等，Science 250：1580-1583(1990)Matsui，S.M.，等，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))，逆转录病毒GAG蛋白质(WO 96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白质p1，乙型肝炎病毒表面蛋白质(WO 92/11291)，人类乳头瘤病毒(WO98/15631)，RNA噬菌体，Ty，fr-噬菌体，GA-噬菌体，AP205-噬菌体和Qβ-噬菌体。
对本领域技术人员显而易见，本发明VLP不限于任何特定的形式。可以化学地或通过生物学方法合成该颗粒，该颗粒可以是天然或非天然的。例如，这种类型的实施方式包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更具体的实施方式中，VLP可以包含重组多肽或其片段，或者可替代地基本上由，或者可替代地由重组多肽或其片段组成，所述重组多肽可以选自轮状病毒重组多肽，诺沃克病毒重组多肽，甲病毒重组多肽，口蹄疫病毒重组多肽，麻疹病毒重组多肽，新培斯病毒重组多肽，多瘤病毒重组多肽，逆转录病毒重组多肽，乙型肝炎病毒重组多肽(例如，HBcAg)，烟草花叶病毒重组多肽，兽棚病毒(Flock House Virus)重组多肽，人乳头瘤病毒重组多肽，噬菌体重组多肽，RNA噬菌体重组多肽，Ty重组多肽，fr噬菌体重组多肽，GA噬菌体重组多肽和Qβ噬菌体重组多肽。病毒样颗粒还可以包含这些多肽的一个或多个片段及这些多肽的变体，或者可替代地基本上由或可替代地由这些多肽的一个或多个片段及这些多肽的变体组成。多肽变体与它们的野生型对应物在氨基酸水平上可以共有例如至少80％，85％，90％，95％，97％或99％的同一性。
在优选的实施方式中，病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由重组RNA噬菌体蛋白质或其片段组成。优选地，RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。
在本发明另一个优选实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白质或其片段组成。
在本发明进一步优选的实施方式中，重组蛋白质包含RNA噬菌体外壳蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA噬菌体外壳蛋白，或与自装配为衣壳或VLP相容的噬菌体外壳蛋白片段是本发明的其它优选实施方式。例如，可以在大肠杆菌(E.coli)中重组表达噬菌体Qβ外壳蛋白。而且，一旦进行这种表达后，这些蛋白质将自发地形成衣壳。此外，这些衣壳将形成具有固有重复组织的结构。
可以用于制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选例子包括RNA噬菌体的外壳蛋白诸如噬菌体Qβ的外壳蛋白(SEQ ID NO：4：PIR数据库，记录号VCBPQβ，称为Qβ CP和SEQ ID NO：5：记录号AAA16663，称为Qβ A1蛋白质)，噬菌体R17的外壳蛋白(SEQ ID NO：6：PIR记录号VCBPR7)，噬菌体fr外壳蛋白(SEQ ID NO：7；PIR记录号VCBPFR)，噬菌体GA外壳蛋白(SEQ ID NO：8；GenBank记录号NP-040754)，噬菌体SP外壳蛋白(SEQ ID NO：9；GenBank记录号CAA30374，称为SP CP和SEQ ID NO：10；记录号NP 695026，称为SPA1蛋白质)，噬菌体MS2外壳蛋白(SEQ ID NO：11；PIR记录号VCBPM2)，噬菌体M11外壳蛋白(SEQ ID NO：12；GenBank记录号AAC06250)，噬菌体MX1外壳蛋白(SEQ ID NO：13；GenBank记录号AAC14699)，噬菌体NL95外壳蛋白(SEQ ID NO：14；GenBank记录号AAC14704)，噬菌体f2外壳蛋白(SEQ ID NO：15；GenBank记录号P03611)，噬菌体PP7外壳蛋白(SEQ ID NO：16)，和噬菌体AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：28)。而且，在Qβ外壳蛋白的衣壳装配物中可以掺入噬菌体Qβ的A1蛋白质(SEQ IDNO：5)或从其C末端缺失多达100，150或180个氨基酸的C末端截短形式。一般地，将限制衣壳装配中Qβ A1蛋白质相对于Qβ CP的百分比以确保衣壳形成。
此外，已发现当在大肠杆菌(E.coli)中表达Qβ外壳蛋白时，其自装配为衣壳(Kozlovska TM.等，GENE 137：133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示了具有25nm直径和T＝3准对称的二十面噬菌体样衣壳结构。而且，噬菌体Qβ的晶体结构已经解析。衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键以共价五聚体和六聚体形式连接(Golmohammadi，R.等，Structure 4：543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白形成的衣壳具有显著稳定性。然而，从重组Qβ外壳蛋白制备的衣壳或VLP可以含有不通过或不完全通过二硫键连接衣壳中其它亚单位的亚单位。然而，VLP中，通常约80％以上亚单位通过二硫键互相连接。因此，一旦将重组Qβ衣壳加样到非还原性SDS-PAGE上，就可以观察到对应于单体Qβ外壳蛋白的条带及对应于Qβ外壳蛋白六聚体或五聚体的条带。在非还原性SDS-PAGE中，不完全二硫键连接的亚单位可以表现为二聚体、三聚体或甚至四聚体条带。Qβ衣壳蛋白对有机溶剂和变性剂还显示了异常的抗性。意外地，我们观察到DMSO和乙腈浓度高达30％和胍盐浓度高达1M不影响衣壳稳定性。Qβ外壳蛋白形成的衣壳的高度稳定性特别有利于它们在本发明的哺乳动物和人类免疫和接种中的使用。
如我们通过Stoll，E.等.J.Biol.Chem.252：990-993(1977)中所述的N末端Edaman测序所观察到的，一旦在大肠杆菌(E.coli)中表达后，通常Qβ外壳蛋白的N末端甲硫氨酸将被移除。由没有移除N末端甲硫氨酸的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有存在或不存在N末端甲硫氨酸的Qβ外壳蛋白的混合物的VLP也在本发明范围内。
WO 02/056905中公开了本发明的其它优选的RNA噬菌体(特别是Qβ)的病毒样颗粒，这里将该公开内容整体并入为参考文献。
也已经证明了其它RNA噬菌体外壳蛋白一旦在细菌宿主中表达就可以自装配(Kastelein，RA.等，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等，Virology170：238-242(1989)，Ni，CZ.，等，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了包含外壳蛋白外，还包含通常所说的通读蛋白质A1和成熟蛋白质A2。A1通过在UGA终止密码子处的抑制而产生，并且其具有329个氨基酸的长度。本发明中所用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳无A2裂解蛋白，并且含有来源于宿主的RNA。RNA噬菌体外壳蛋白是RNA结合蛋白，其与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，在病毒生命周期中充当翻译阻遏物。相互作用的序列和结构元件是已知的(Witherell，GW.&Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；Lim F.等，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。一般地，已知茎环和RNA参与病毒装配(Golmohammadi，R.等，Structure 4：543-5554(1 996))。
在本发明进一步优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体重组蛋白质或其片段组成，其中重组蛋白质包含RNA噬菌体突变外壳蛋白，优选地上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体突变外壳蛋白，优选地上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选的实施方式中，通过置换的方法移除至少一个，或者可替代地至少两个赖氨酸残基，或者通过置换的方法添加至少一个赖氨酸残基，修饰了RNA噬菌体突变外壳蛋白；做为可替代的方案，通过至少一个赖氨酸残基，或者可替代地至少两个赖氨酸残基的缺失，或者通过插入的方法添加至少一个赖氨酸残基，修饰了RNA噬菌体突变外壳蛋白。至少一个赖氨酸残基的缺失、置换或添加允许改变偶联的程度，即，  每个RNA噬菌体VLP的每个亚单位上偶联的Aβ1-6肽量，特别地以便满足和适应疫苗的要求。
在另一个优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体Qβ重组蛋白质或其片段组成，其中重组蛋白质包含具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的外壳蛋白，或者具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：5突变体的氨基酸序列的外壳蛋白混合物，或者可替代地基本由或可替代地由具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的外壳蛋白，或者具有SEQ ID NO：4和SEQID NO：5或SEQ ID NO：5突变体的氨基酸序列的外壳蛋白混合物组成，并且其中优选地切割了N末端甲硫氨酸。
在本发明进一步优选的实施方式中，病毒样颗粒包含Qβ重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重组蛋白质或其片段组成，其中重组蛋白质包含突变Qβ外壳蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选的实施方式中，通过置换的方法移除至少一个赖氨酸残基，或者通过置换的方法添加至少一个赖氨酸残基，修饰了这些突变外壳蛋白质。可替代地，通过至少一个赖氨酸残基的缺失，或者通过插入的方法添加至少一个赖氨酸残基，修饰了这些突变外壳蛋白。
4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白衣壳的表面上。用精氨酸置换了暴露的赖氨酸残基的Qβ突变体也可以用于本发明。因此，下面的Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP可以用在本发明实践中：“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)，“Qβ-243”(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：18)，“Qβ-250”(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：19)，“Qβ-251”(SEQ ID NO：20)和“Qβ-259”(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO：21)。因此，在本发明进一步优选的实施方式中，病毒样颗粒包含突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白质，或者基本由或可替代地由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白质组成，该突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白质包含具有选自下面的氨基酸序列的蛋白质：a)SEQ ID NO：17氨基酸序列；b)SEQ ID NO：18氨基酸序列；c)SEQ ID NO：19氨基酸序列；d)SEQ ID NO：20氨基酸序列；和e)SEQ ID NO：21氨基酸序列。在WO 02/056905中描述了上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化。在此，特别提及上述申请的实施例18。
在本发明另一优选的实施方式中，病毒样颗粒包含Qβ重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重组蛋白质或其片段组成，其中该重组蛋白质包含任何一个前述Qβ突变体和相应A1蛋白质的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由任何一个前述Qβ突变体和相应A1蛋白质的混合物组成。
在本发明进一步优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组蛋白质或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体AP205重组蛋白质或其片段组成。
AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的2个开放读框组成；所述两个开放读框是在成熟蛋白基因的翻译中起作用的一个开放读框和裂解基因(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。可以从质粒pAP283-58(SEQ ID NO：27)表达AP205外壳蛋白，所述质粒是pQb10(Kozlovska，T.M..等，Gene 137：133-37(1993))的衍生物，并且其含有AP205核糖体结合位点。AP205外壳蛋白也可以克隆到pQb185中，位于载体中存在的核糖体结合位点下游。如2002年7月17日提交，名称为“分子抗原阵列”(Atty.Docket No.1700.0310000)的同时待审美国临时专利申请中所述，两种方法都导致蛋白质表达和衣壳形成，特此将这篇专利申请的整体并入为参考文献。载体pQb10和pQb185是来源于pGEM载体的载体，并且通过trp启动子控制这些载体中克隆基因的表达(Kozlovska，T.M.等，Gene 137：133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQID NO：27)包含下面序列的推定的AP205核糖体结合位点，该核糖体结合位点位于XbaI位点下游及AP205外壳蛋白ATG起始密码子紧上游：tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT GAG GAAAATCACatg(SEQ ID NO：57)。载体pQb185包含位于XbaI位点下游和起始密码子上游的SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGT AGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO：58)，下划线的是SD序列)。
在本发明另一个优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
因此，本发明的该优选实施方式包含形成衣壳的AP205外壳蛋白。这种蛋白质可以从天然来源制备或重组表达。如电子显微镜术(EM)和免疫扩散所证明的，细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。当在EM下观察时，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：28)形成的衣壳的结构特征和AP205 RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎不能区分。AP205VLP是高度免疫原性的，并且可以连接抗原和/或抗原决定簇以产生疫苗构建体，该疫苗构建体展示了以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇。激发的抗所展示抗原的高效价表明，结合的抗原和/或抗原决定簇易于接近以和抗体分子发生相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明另一优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的能装配的突变体形式，包括在氨基酸位置5具有脯氨酸到苏氨酸置换的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：29)也可以用在本发明实施中，并且产生了本发明另一优选的实施方式。这些VLP、来源于天然来源的VLP或AP205病毒颗粒可以结合抗原以产生本发明的有序重复抗原阵列。
可以从质粒pAP281-32(SEQ ID No.30)表达AP205 P5-T突变外壳蛋白，该质粒直接来源于pQb185，并含有代替Qβ外壳蛋白基因的突变AP205外壳蛋白基因。将用于AP205外壳蛋白表达的载体转染到大肠杆菌(E.coli)中用于AP205外壳蛋白的表达。
实施例1中描述了自装配为VLP的外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达方法。适合的大肠杆菌(E.coli)株系包括但不限于大肠杆菌K802，JM 109，RR1。通过用SDS-PAGE检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达，并且通过可选地首先用凝胶过滤纯化衣壳并随后在免疫扩散试验(Ouchterlony试验)中或电子显微镜下(Kozlovska，T.M..等，Gene 137：133-37(1993)检测衣壳的形成和装配，可以鉴定适宜的载体及株系和它们的联合。
从载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白可以由于大肠杆菌(E.coli)胞质中的加工而无最初的甲硫氨酸氨基酸。切割的、未切割形式的AP205VLP或其混合物是本发明另外优选的实施方式。
在本发明另一优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205重组突变外壳蛋白或其片段的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体AP205重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明另一优选的实施方式中，病毒样颗粒包含RNA噬菌体AP205重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌体AP205重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
能装配为VLP或衣壳的重组AP205外壳蛋白片段也可以用在本发明实践中。可以通过在外壳蛋白或突变外壳蛋白内部或末端缺失，产生这些片段。在外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中的插入，或者抗原序列与外壳蛋白或突变外壳蛋白序列的融合，只要与装配为VLP相容，均是本发明的实施方式，它们将导致嵌合AP205外壳蛋白或颗粒。通过电子显微镜术可以检测插入、缺失及与外壳蛋白序列融合的结果，以及其是否与装配为VLP相容。
通过利用沉淀的分级步骤和利用凝胶过滤(利用例如SepharoseCL-4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-6B柱子或它们的联合)的纯化步骤，可以分离纯化形式的由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒。分离病毒样颗粒的其它方法是本领域已知的，并且可以用于分离噬菌体AP205病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166中描述了超离心用于分离酵母逆转录转座子Ty VLP的用途，这里将这篇文献整体并入为参考文献。
已经测定了几种RNA噬菌体的晶体结构(Golmohammadi，R.等，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，可以鉴定表面暴露的残基，由此可以修饰RNA噬菌体外壳蛋白，以便可以通过插入或置换的方法插入一个或多个反应性氨基酸残基。结果，这些修饰形式的噬菌体外壳蛋白也可以用于本发明。因此，形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质(例如，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体AP205和噬菌体MS2的外壳蛋白)的变体也可以用于制备本发明组合物。
尽管上述变体蛋白质的序列不同于它们的野生型对应物，但是这些变体蛋白质一般地将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括组合物或疫苗组合物，该组合物或疫苗组合物还包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的变体；本发明还包括用于制备这种组合物或疫苗组合物的方法、用于制备这种组合物的单个蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明范围内包括可以形成衣壳或衣壳样结构并且保留了缔合和形成衣壳或衣壳样结构的能力的野生型蛋白质的变体形式。
由此，本发明还包括包含如下蛋白质的组合物或疫苗组合物，该蛋白质包含与野生型蛋白质至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由与野生型蛋白质至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列组成，该蛋白质形成有序阵列并具有固有的重复结构。
本发明范围中还包括核酸分子，该核酸分子编码用于制备本发明组合物的蛋白质。
在其它实施方式中，本发明还包括包含如下蛋白质的组合物，该蛋白质包含与SEQ ID Nos：4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由与SEQ ID Nos：4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的氨基酸序列组成。
适于本发明中使用的蛋白质也包括可以形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质C末端截短突变体。这种截短突变体的具体例子包括具有SEQ IDNos：4-21之任一中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17个氨基酸。通常地，这些C末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适于本发明中使用的其它蛋白质也包括可以形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质N末端截短突变体。这种截短突变体的具体例子包括具有SEQ IDNos：4-21任何一个中所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17个氨基酸。通常地，这些N末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适于本发明中使用的其它蛋白质包括可以形成衣壳或衣壳样结构的N和C末端截短突变体。适合的截短突变体包括具有SEQ ID Nos：4-21任何一个中所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17个氨基酸，并且已经从C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17个氨基酸。通常地，这些N末端和C末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括包含如下蛋白质的组合物，该蛋白质包含与上述截短突变体具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由与上述截短突变体具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列组成。
因此，本发明包括从可以形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组合物和疫苗组合物，从单个蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组合物的方法，制备这些单个的蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，和利用本发明组合物接种个体和/或在个体中激发免疫应答的方法。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。在一个另外优选的实施方式中，本发明组合物中所使用的颗粒由乙型肝炎病毒核心蛋白质(HBcAg)或HBcAg片段组成。在另一实施方式中，本发明组合物中所使用的颗粒由经修饰除去了或减少了自由半胱氨酸残基数量的乙型肝炎病毒核心蛋白质(HBcAg)或HBcAg蛋白质片段组成。Zhou等.(J.Virol.66：5393-5398(1992))证明了经修饰移除了天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg可以保留缔合并形成衣壳的能力。因此，适于本发明组合物中使用的VLP包括含有修饰的HBcAg或其片段的VLP，其中已经缺失或用另一种氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)置换了一个或多个天然存在的半胱氨酸残基。
HBcAg是通过乙型肝炎核心抗原前体蛋白质加工产生的蛋白质。已经鉴定了多种HBcAg同种型，并且本领域技术人员容易获得它们的氨基酸序列。在大多数情况下，将利用加工形式的HBcAg(即，其中已经移除了乙型肝炎核心抗原前体蛋白质的N末端前导序列的HBcAg)制备本发明的组合物或疫苗组合物。
而且，当在不会发生加工的条件下产生HBcAg时，一般地以“加工的”形式表达HBcAg。例如，当将指导蛋白质胞质表达的大肠杆菌表达系统用于产生本发明HBcAg时，一般地将以乙型肝炎核心抗原前体蛋白质的N末端前导序列不存在的方式表达这些蛋白质。
例如，WO 00/32227中，特别是实施例17到19和21到24中，及WO 01/85208中，特别是实施例17到19，21到24，31和41中以及WO02/056905中公开了可以用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备。对于后面的申请，特别地参考实施例23，24，31和51。这里明确地将所有这3篇文献并入为参考文献。
本发明也包括经修饰缺失或置换了一个或多个额外的半胱氨酸残基的HBcAg变体。自由半胱氨酸残基可以参与多种化学侧链反应，这是本领域已知的。这些侧链反应包括二硫化物交换，与化学物质或代谢物(注射的或在和其它物质的联合治疗中形成的)反应，或者直接氧化和与核苷酸在暴露于UV光后反应。特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向这一事实，由此可能产生毒性加成物。这些毒性加成物将以多种形成分布，每种毒性加成物可能单独地以低浓度存在，但是当每种毒性加成物集合在一起时就达到毒性水平。
鉴于上述，疫苗组合物中应用移除了天然半胱氨酸残基的修饰HBcAg的一个优点是，当与抗原或抗原决定簇结合后，将在数量上减少或完全地消除有毒物可以结合的位点。
已经鉴定了适于本发明实践中使用的大量天然HBcAg变体。例如，Yuan等，(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了其中用亮氨酸残基或苯丙氨酸残基置换了位于与SEQ ID NO：22中位置97对应的位置的异亮氨酸残基的变体。在GenBank报道AAF121240，AF121239，X85297，X02496，X85305，X85303，AF151735，X85259，X85286，X85260，X85317，X85298，AF043593，M20706，X85295，X80925，X85284，X85275，X72702，X85291，X65258，X85302，M32138，X85293，X85315，U95551，X85256，X85316，X85296，AB033559，X59795，X85299，X85307，X65257，X85311，X85301(SEQ ID NO：23)，X85314，X85287，X85272，X85319，AB010289，X85285，AB010289，AF121242，M90520(SEQ ID NO：24)，P03153，AF110999，和M95589中公开了大量HBcAg变体及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列，这里将每个GenBank报道公开的内容并入为参考文献。WO01/85208中SEQ ID NOs：89-138中进一步公开了上述乙型肝炎核心抗原前体变体的序列。这些HBcAg变体在氨基酸序列的多个位置存在差异，包括对应于SEQ ID NO：25中12，13，21，22，24，29，32，33，35，38，40，42，44，45，49，51，57，58，59，64，66，67，69，74，77，80，81，87，92，93，97，98，100，103，105，106，109，113，116，121，126，130，133，135，141，147，149，157，176，178，182和183位置氨基酸残基的氨基酸残基。WO 00/198333，WO 00/177158和WO 00/214478中描述了适于本发明组合物中使用并且可以根据本申请公开内容进行进一步修饰的其它HBcAg变体。
如上所述，本发明组合物或疫苗组合物中将使用通常加工的HBcAg(即，缺少前导序列的HBcAg)。本发明包括利用上述变体HBcAg的疫苗组合物及使用这些组合物的方法。
利用已知的计算机程序诸如Bestfit程序可以常规地确定是否多肽的氨基酸序列有与一种上述野生型氨基酸序列或其亚部分至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序以检测是否特定序列与参照氨基酸序列具有例如95％相同性时，设定参数，以便计算和全长参照氨基酸序列相比的同一性百分数，并且允许达到参照序列中氨基酸残基总数5％的同源性空位。
上述HBcAg变体和前体的氨基酸序列相互相对地相似。因此，提到位于对应于SEQ ID NO：25中特定位置的位置的HBcAg变体氨基酸残基时，指在SEQ ID NO：25所示氨基酸序列中在该位置存在此氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒中这些HBcAg变体之间大部分存在足够高的同源性，这样本领域技术人员几乎毫无困难即可检阅SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列和特定HBcAg变体的氨基酸序列，并鉴定出“相应的”氨基酸残基。而且，SEQ ID NO：24中所示HBcAg氨基酸序列(显示来源于感染旱獭的病毒的HBcAg氨基酸序列)与具有SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，因此显而易见在SEQ ID NO：25中，在SEQ ID NO：25的氨基酸残基155和156之间存在3个氨基酸残基插入。
本发明也包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒HBcAg变体的疫苗组合物，及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变体，在将它们包含在本发明疫苗组合物中之前，可以缺失或用另外氨基酸残基置换这些多肽中天然存在的1个、2个、3个或更多个半胱氨酸残基。
如上所述，自由半胱氨酸残基的去除可以减少可能导致有毒成分与HBcAg结合的位点的数量，并且也消除可能导致相同或邻近HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基发生交联的位点。因此，在本发明另一个实施方式中，已缺失或用另外的氨基酸残基置换了乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的一个或多个半胱氨酸残基。
在其它实施方式中，本发明组合物或疫苗组合物将包含其中移除了C末端区域(即，SEQ ID NO：25的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。因此，适于本发明实践中使用的其它修饰的HBcAg包括C末端截短突变体。适宜的截短突变体包括其中已经从C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35个氨基酸的HBcAg。
适于本发明实践中使用的HBcAg也包括N末端截短突变体。适宜的截短突变体包括其中已从N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17个氨基酸的修饰的HBcAg。
适于本发明实践中使用的其它HBcAg包括N和C末端截短突变体。适宜的截短突变体包括已从N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15和17个氨基酸及从C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括包含HBcAg多肽的组合物或疫苗组合物，该HBcAg多肽包含与上述截短突变体具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由与上述截短突变体具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列组成。
在本发明一些实施方式中，将赖氨酸残基引入HBcAg多肽中以介导Aβ1-6肽与HBcAg的VLP的结合。在优选的实施方式中，利用包含SEQID NO：25氨基酸1-144或1-149，1-185，或者可替代地由SEQ ID NO：25氨基酸1-144或1-149，1-185组成的HBcAg制备本发明组合物，其中所述HBcAg被修饰，以致对应于位置79和80的氨基酸由具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)氨基酸序列的肽置换，产生了具有SEQ ID NO：26中所示序列的HBcAg多肽。这些组合物对于抗原决定簇偶联HBcAg VLP的实施方式特别有用。在另外优选的实施方式，将SEQ IDNO：25位置48和107的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明还包括包含如下相应多肽的组合物，该多肽具有任何一个上述乙型肝炎核心抗原前体变体中所示的氨基酸序列并具有上述氨基酸改变。进一步包括在本发明范围中的是能缔合形成衣壳或VLP并且具有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括包含HBcAg多肽或这些蛋白质的适当时被加工以移除N末端前导序列并用上述改变进行修饰的形式的组合物或疫苗组合物，其中所述HBcAg多肽包含与任何一种野生型氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地由与任何一种野生型氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列组成。
本发明组合物或疫苗组合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和修饰的HBcAg的疫苗组合物，在修饰的HBcAg中已改变(例如，缺失、插入或置换)了一个或多个氨基酸残基。而且，本发明优选的疫苗组合物是呈现高度有序和重复抗原阵列的疫苗组合物，其中抗原是Aβ1-6肽。
在本发明另一优选的实施方式中，至少一个Aβ1-6肽通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒或核心颗粒结合。优选地，至少一个Aβ1-6肽通过至少一个非肽键的共价键与所述病毒样颗粒或核心颗粒结合，从而产生Aβ1-6肽阵列或Aβ1-6肽-VLP缀合物。该Aβ1-6肽阵列或缀合物通常并优选地具有重复和有序的结构，因为至少一个Aβ1-6肽以定向方式与VLP或核心颗粒结合。至少一个Aβ1-6肽与VLP或核心颗粒以定向有控制的确定方式结合和附着，确保了重复和有序的Aβ1-6肽-VLP阵列或缀合物的形成，这在下文所述中将显而易见。而且，VLP或和核心颗粒的典型固有高度重复和有组织的结构也有利于促进Aβ1-6肽以高度有序和重复方式展示，形成高度有组织和重复的Aβ1-6肽-VLP阵列或缀合物。
因此，优选的本发明缀合物或阵列在它们高度有组织的结构、维度方面，和阵列表面上抗原的重复性方面不同于现有缀合物。而且，本发明优选的实施方式允许在表达宿主中表达颗粒，从而保证了VLP正确的折叠和装配，然后，抗原，即Aβ1-6肽进一步偶联该VLP。
本发明公开了Aβ1-6肽结合VLP的方法。如所述，在本发明的一个方面，通过化学交联方法，通常和优选地通过利用异双官能交联剂，使Aβ1-6肽结合VLP。几种异双官能交联剂是本领域已知的。在优选的实施方式中，异双官能交联剂含有可以与优选的第一附着位点(即VLP或至少一个VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，和可以与优选的第二附着位点(即与Aβ1-6肽融合的和可选地通过还原反应获得的半胱氨酸残基)反应的另一个官能团。该方法的第一步，通常称为衍生，是VLP和交联剂反应。该反应的产物是活化的VLP，也称为活化的载体。在第二步中，利用通常的方法诸如凝胶过滤或透析移除未反应的交联剂。在第三步中，Aβ1-6肽与活化的VLP反应，并且该步骤通常称为偶联步骤。可选地可以在第四步中，例如通过透析，移除未反应的Aβ1-6肽。几种异双官能交联剂是本领域已知的。这些交联剂包括优选的交联剂SMPH(Pierce)，磺基-MBS，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-SIAB，磺基-SMPB，磺基-SMCC，SVSB，SIA和可从例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)获得的其它交联剂(这些交联剂具有对氨基有活性的一个官能团和对半胱氨酸残基有活性的一个官能团)。所有上述交联剂引起了硫醚键的形成。适于本发明实践的另一类交联剂的特征在于：一旦偶联，就在Aβ1-6肽和VLP之间引入二硫键。属于该类的优选交联剂包括例如SPDP和磺基-LC-SPDP(Pierce)。可以通过改变试验条件诸如每种反应组分的浓度，一种试剂相对于另一种试剂的过量、pH、温度和离子强度来影响交联剂对VLP的衍生程度。可以通过改变上述试验条件调整偶联程度，即每个VLP亚单位的Aβ1-6肽数量，以满足疫苗要求。
Aβ1-6肽结合VLP的一个特别有利的方法是VLP表面上的赖氨酸残基和Aβ1-6肽上的半胱氨酸残基的连接。在一些实施方式中，可能需要将含有半胱氨酸残基的氨基酸接头(半胱氨酸残基作为第二附着位点或作为接头的一部分)融合到Aβ1-6上以便偶联VLP。
一般地，柔性氨基酸接头是有利的。氨基酸接头的例子选自(a)CGG；(b)N-末端γ1接头；(c)N-末端γ3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-末端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO：34)；(g)N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO：35)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接头；(m)C-末端γ 3接头；(n)C-末端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12且k＝0-5(SEQ IDNO：36)；(p)C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO：37)。
氨基酸接头的其它例子是免疫球蛋白铰链区，甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n(SEQ ID NO：38)，和甘氨酸接头(G)n，所有这些接头还都包含做为第二附着位点的半胱氨酸残基和可选地甘氨酸残基。所述氨基酸接头的典型优选例子是N-末端γ1：CGDKTHTSPP(SEQ ID NO：39)；C-末端γ1：DKTHTSPPCG(SEQ ID NO：40)；N-末端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO：41)；C-末端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO：42)；N-末端甘氨酸接头：GCGGGG(SEQ ID NO：43)和C-末端甘氨酸接头：GGGGCG(SEQ IDNO：44)。
当疏水性Aβ肽结合VLP时，特别适于本发明实践中的其它氨基酸接头是N末端接头CGKKGG(SEQ ID NO：46)或CGDEGG(SEQ ID NO：31)，或C末端接头GGKKGC(SEQ ID NO：45)和GGEDGC(SEQ ID NO：32)。对于C末端接头，可选地在C末端酰胺化末端半胱氨酸。
在本发明优选的实施方式中，优选在肽C末端以GGCG(SEQ ID NO：47)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)接头作为氨基酸接头，或在N末端以CGG作为氨基酸接头。一般地，将甘氨酸残基插入到大的氨基酸和将要用做第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免在偶联反应中较大氨基酸可能的空间位阻。在本发明最优选的实施方式中，氨基酸接头GGC-NH2与Aβ1-6的C末端融合。
Aβ1-6肽上存在的半胱氨酸残基必须是还原状态以便与活化的VLP上的异双官能交联剂反应，也就是说必须有可用的自由半胱氨酸或具有自由巯基的半胱氨酸残基。在起结合位点作用的半胱氨酸残基是氧化形式，例如如果它形成二硫键时，需要用例如DTT，TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。WO 02/056905中描述了低浓度还原试剂与偶联相容，而如本领域技术人员所知道的，高浓度将抑制偶联反应，在这种情况下，在偶联前，必须例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC移除还原剂或降低它的浓度。
根据上述优选的方法，通过利用异双官能交联剂使Aβ1-6肽与VLP结合，将允许Aβ1-6肽以定向方式偶联VLP。Aβ1-6肽偶联VLP的其它方法包括利用碳二亚胺EDC和NHS使Aβ1-6肽交联VLP的方法。在另一些方法中，利用同双官能交联剂诸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或者具有对VLP的氨基或羧基有反应性的官能团的其它已知同双官能交联剂，使Aβ1-6肽附着VLP。
VLP结合Aβ1-6肽的其它方法包括生物素酰化VLP并且将Aβ1-6肽作为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白表达的方法，或者例如WO 00/23955中所述，生物素酰化Aβ1-6肽和VLP的方法。在这种情况下，Aβ1-6肽可以首先结合链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，通过调整Aβ1-6肽与链霉抗生物素蛋白的比率，使自由结合位点仍旧可获得用于与下一步添加的VLP结合。做为可替代的方案，可以在“一个容器”反应中混合所有成分。其它配体-受体对也可以用做结合试剂用于结合Aβ1-6肽和VIP，条件是可得到该受体和配体的可溶形式，并且它们能与VLP或Aβ1-6肽交联。做为可替代的方案，配体或受体可以与Aβ1-6肽融合，并由此介导与化学结合或融合了受体或配体的VLP结合。通过插入或置换也可以实现融合。
如所述，在本发明有利的实施方式中，VLP是RNA噬菌体VLP，并且在更优选的实施方式中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
如果空间上允许，优选地通过RNA噬菌体VLP上暴露的赖氨酸残基，一个或几个抗原分子，即Aβ1-6肽可以与RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位结合。因此，RNA噬菌体外壳蛋白，特别是Qβ外壳蛋白的VLP的特定特征是每个亚单位可以偶联几个抗原。这样可以产生密集的抗原阵列。
在本发明优选的实施方式中，至少一个Aβ1-6肽与病毒样颗粒通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点和抗原或抗原决定簇的至少一个第二附着位点之间的相互作用或缔合而实现结合或附着。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在它们的表面展示了确定数量的赖氨酸残基，具有确定的拓扑结构，该拓扑结构具有指向衣壳内部并且与RNA相互作用的3个赖氨酸残基，和暴露于衣壳外部的另外4个赖氨酸残基。这些确定的特性有利于抗原附着到颗粒外部，而不是附着到赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在它们表面也具有确定数量的赖氨酸残基，且这些赖氨酸残基具有确定的拓扑结构。
在本发明其它优选的实施方式中，第一附着位点是赖氨酸残基和/或第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明非常优选的实施方式中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明非常优选的实施方式中，Aβ1-6肽通过半胱氨酸残基结合RNA噬菌体外壳蛋白的VLP(特别是Qβ外壳蛋白的VLP)的赖氨酸残基。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中高的表达产率，该高的表达产率使得可以以可担负得起的花费生产大量物质。
如所述，本发明缀合物或阵列在它们高度有组织的结构、维度方面，和阵列表面上抗原的重复性方面不同于现有缀合物。而且将VLP用作载体使得可以形成具有可变抗原密度的稳固抗原阵列或缀合物。具体地，RNA噬菌体VLP的应用，特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白VLP的应用允许获得非常高的表位密度。特别地，通过偶联人类Aβ1-6肽和Qβ外壳蛋白VLP可以达到每个亚单位1.5个以上表位的密度。利用本申请的教导可以实现具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组合物的制备。在本发明优选的实施方式中，当Aβ1-6肽偶联Qβ外壳蛋白VLP时，优选每个亚单位具有0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或更高的平均Aβ1-6肽数量。
这里所定义的第二附着位点可以天然或非天然存在于抗原或抗原决定簇上。在抗原或抗原决定簇上不存在适宜的天然第二附着位点的情况下，必须进行抗原改造使其具有非天然第二附着位点。
如上所述，4个赖氨酸残基暴露在Qβ外壳蛋白VLP表面上。通常地，这些残基通过与交联剂分子反应而衍生化。在不是所有暴露的赖氨酸残基都偶联抗原的情况下，衍生作用步骤后，留下了与交联剂反应的赖氨酸残基，其中交联剂分子附着ε氨基。这引起了对VLP溶解度和稳定性可能有害的一个或几个正电荷的消失。如在以下公开的Qβ外壳蛋白突变体中，通过用精氨酸置换一些赖氨酸残基，可以阻止正电荷过量的消失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸置换赖氨酸残基可以产生更确定的抗原阵列，因为较少的位点可用于和抗原反应。
因此，在本申请中下面公开的Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP中，用精氨酸置换了暴露的赖氨酸残基：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)，Qβ-250(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：19)和Qβ-259(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO：21)。克隆构建体，表达蛋白质，纯化VLP并且用于偶联肽和蛋白质抗原。也构建了Qβ-251(SEQ ID NO：20)，并且在本申请中可以找到如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白VLP的指导。
在另一实施方式中，我们公开了具有一个额外赖氨酸残基的Qβ突变体外壳蛋白，其适用于获得甚至更高密度的抗原阵列。克隆该突变体Qβ外壳蛋白，Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：18)，表达蛋白质，并且分离和纯化了衣壳或VLP，表明额外赖氨酸残基的引入与亚单位自装配为衣壳或VLP相容。因此，利用Qβ外壳蛋白突变体的VLP可以制备Aβ1-6肽阵列或缀合物。使抗原附着VLP，特别是附着RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的一个特别有利方法是RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面上存在的赖氨酸残基与添加在抗原(即，Aβ1-6肽)上的半胱氨酸残基连接。为了半胱氨酸残基有效地做为第二附着位点，必须有用于偶联的巯基。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有可用的具有自由巯基的半胱氨酸残基或自由半胱氨酸。在起第二附着位点作用的半胱氨酸残基是氧化形式，例如如果它形成二硫键时，需要用例如DTT，TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。必须针对每种抗原调整还原剂浓度和还原剂相对抗原的摩尔过量。如果需要，检测从10μM或更低浓度开始直到10-20mM或更高浓度的还原剂滴定范围，并评价抗原与载体的偶联。尽管如WO 02/056905中所述低浓度还原剂与偶联反应相容，但是高浓度将抑制偶联反应，这是本领域技术人员所知道的，在这种情况下，必须例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC移除还原剂或降低它的浓度。有利地，透析或平衡缓冲液的pH低于7，优选地6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过交联剂和其它反应条件的选择可以调节RNA噬菌体外壳蛋白VLP上的表位密度。例如，交联剂磺基-GMBS和SMPH通常允许达到高表位密度。高浓度反应剂正面影响衍生作用，并且反应条件的操纵可以用于控制偶联RNA噬菌体外壳蛋白VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的抗原数量。
在设计非天然第二附着位点之前，必须选择它应该融合、插入或一般地进行基因工程改造的位置。例如，可以根据抗原晶体结构选择第二附着位点的位置。这种抗原晶体结构可以提供关于分子C或N末端可用性(例如，从它们与溶剂的可接近性来确定)的信息，或者关于适于用做第二附着位点的残基，诸如半胱氨酸残基暴露于溶剂的信息。如Fab片段情况下，暴露的二硫键也可以是第二附着位点的来源，因为一般地通过用例如2-巯基乙胺、TCEP、β-巯基乙醇或DTT温和还原，它们可以转化为单个的半胱氨酸残基。选择不影响抗原免疫原性的温和还原条件。一般地，在用自身抗原免疫旨在抑制该自身抗原和它的天然配体相互作用的情况下，第二附着位点的添加方式将允许抗与天然配体相互作用的位点的抗体产生。因此，将要选择第二附着位点的位置以避免来源于第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方式中，期望定向于不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点的位点的抗体应答。在这种实施方式中，可以选择第二附着位点以使它能够阻止抗自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体产生。
选定第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚化状态，寡聚化位点，辅因子的存在，和是否可以获得抗原结构和序列中如下位点的公开试验证据，其中在所述位点的抗原修饰与自身抗原的功能相容，或者与识别自身抗原的抗体的产生相容。
在最优选的实施方式中，Aβ1-6肽包含能与核心颗粒和VLP或VLP亚单位上第一附着位点缔合的单一第二附着位点或单一活性附着位点。这确保了至少一个，但是通常是一个以上，优选地10，20，40，80，120，150，180，210，240，270，300，360，400，450个以上抗原与核心颗粒或VLP进行确定的一致结合和缔合。因此，在抗原上提供单一第二附着位点或单一活性附着位点将确保可以导致非常高度有序和重复阵列的单一和一致类型的结合或缔合。例如，如果通过赖氨酸(做为第一附着位点)和半胱氨酸(做为第二附着位点)相互作用实现结合或缔合，根据本发明该优选实施方式，不管该半胱氨酸残基是天然的或是非天然存在于抗原上的，都将确保每个抗原仅仅一个半胱氨酸残基能结合或缔合VLP或核心颗粒的第一附着位点。
在一些实施方式中，抗原上第二附着位点的改造需要融合氨基酸接头，该氨基酸接头含有适于做为根据本发明的第二附着位点的氨基酸。因此，在本发明优选的实施方式中，氨基酸接头通过至少一个共价键结合抗原或抗原决定簇。优选地，氨基酸接头包含第二附着位点，或者可替代地基本由第二附着位点组成。在进一步优选的实施方式中，氨基酸接头包含巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选的实施方式中，氨基酸接头是半胱氨酸。上面已经提到了本发明氨基酸接头的一些选择标准及氨基酸接头的其它优选实施方式。
在本发明另一优选的实施方式中，至少一个抗原或抗原决定簇，即Aβ1-6肽与病毒样颗粒融合。如上所述，VLP典型地由至少一种装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明另一个优选的实施方式中，抗原或抗原决定簇，优选地至少一个Aβ1-6肽与病毒样颗粒的至少一种亚单位或能掺入VLP的蛋白质融合，产生嵌合VLP-亚单位-Aβ1-6肽蛋白质融合物。
通过插入到VLP亚单位序列中，或者通过融合到VLP亚单位或能掺入VLP的蛋白质的N或C末端可以实现Aβ1-6肽的融合。此后，当提到肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括与亚单位序列任一末端的融合或亚单位序列中肽的内部插入。
通过将Aβ1-6肽序列插入到VLP亚单位变体中也可以实现融合，该VLP亚单位变体中已经缺失了部分亚单位序列，也称为截短突变体。截短突变体可以具有VLP亚单位序列的部分N或C末端或内部缺失。例如，具有氨基酸残基79到81缺失的具体VLP HBcAg是具有内部缺失的截短突变体。Aβ1-6肽与截短突变体VLP亚单位N或C末端的融合也产生了本发明的实施方式。同样，通过置换也可以在VLP亚单位序列中实现表位的融合，其中例如对于具体的VLP HBcAg，用外源表位置换氨基酸79-81。因此，通过将Aβ1-6肽序列插入到VLP亚单位序列中，通过用Aβ1-6肽置换VLP亚单位的部分序列，或者通过缺失、置换或插入的联合可以实现此后所称的融合。
嵌合的Aβ1-6肽-VLP亚单位一般能自装配为VLP。这里也将展示出与其亚单位融合的表位的VLP称作嵌合VLP。如所述，病毒样颗粒包含至少一种VLP亚单位，或者可替代地由至少一种VLP亚单位组成。在本发明另一实施方式中，病毒样颗粒包含嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位的混合物，或者可替代地由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位的混合物组成，从而产生了所谓的镶嵌颗粒，其中该非嵌合VLP亚单位为没有与抗原融合的VLP亚单位。这对于确保VLP形成和装配可能是有利的。在这些实施方式中，嵌合VLP亚单位的比例可以是1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，95％或更高。
可以向肽或表位序列任一末端添加侧翼氨基酸残基，其中该肽或表位序列将融合到VLP亚单位序列任一末端，或者插入到VLP亚单位序列内部。甘氨酸和丝氨酸残基是在侧翼序列中使用的特别有利的氨基酸，其中向待要融合的肽添加该侧翼序列。甘氨酸残基赋予了额外的柔性，其可以减小外源序列融合到VLP亚单位序列中引起的潜在去稳定作用。
在本发明具体实施方式中，VLP是乙型肝炎核心抗原VLP。已经描述了在HBcAg N末端(Neyrinck，S.等，Nature Med.5：1157-1163(1999))或在所谓的主要免疫优势区(MIR)中插入Aβ1-6肽的融合蛋白(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))，WO 01/98333)，并且它们是本发明优选的实施方式。也已经描述了MIR中有缺失的天然HBcAg变体(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)，明确地将这篇文献整体并入为参考文献)，与N或C末端的融合，及与野生型HBcAg比较在对应于缺失位点的MIR位置的插入是本发明另外的实施方式。也已经描述了与C末端的融合(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员很容易发现关于如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指导(Sambrook，J等，编辑，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)，Ho等，Gene 77：51(1989))。已经描述了编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于HBcAg和HBcAg融合蛋白表达的载体和质粒(Pumpens，P.& Grens，E.Intervirology 44：98-114(2001)，Neyrinck，S.等，Nature Med.5：1157-1163(1999))，这些载体和质粒可以用于本发明实践中。我们也通过实施例的方式(实施例6)描述了在HBcAg MIR中插入表位，产生嵌合的自装配HBcAg。对自装配效率和待要插入到HBcAg MIR中的表位的展示进行优化的一个重要因素是插入位点的选择，及一旦插入，将要从HBcAg的MIR序列中缺失的氨基酸数目(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP 0 421 635；U.S.专利号.6,231,864)，或者换而言之，HBcAg中哪些氨基酸将用新表位置换。例如，已经描述了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80，79-81，79-80，75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP0421635；US 6’231’864)。HBcAg含有长精氨酸尾部(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))，其不是衣壳装配所必需的，并且能结合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。包含或缺少该精氨酸尾部的HBcAg都是本发明的实施方式。
在本发明另一优选的实施方式中，VLP是RNA噬菌体VLP。一旦在细菌中，特别是在大肠杆菌(E.coli)中表达RNA噬菌体主要外壳蛋白，其就自发装配为VLP。可以用于制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括RNA噬菌体诸如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：4；PIR数据库，记录号VCBPQβ，称为Qβ CP和SEQ ID NO：5；记录号AAA16663，称为QβA1蛋白质)和噬菌体fr(SEQ ID NO：7；PIR记录号VCBPFR)的外壳蛋白。
在更优选的实施方式中，至少一个Aβ1-6肽与Qβ外壳蛋白融合。已经描述了将表位融合到截短形式的Qβ A1蛋白质C端，或者插入到A1蛋白质中的融合蛋白构建体(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology，39：9-15(1996))。A1蛋白质通过在UGA终止密码子处的抑制产生，并且其有329个氨基酸或328个(如果考虑N末端甲硫氨酸的切割)氨基酸的长度。通常在大肠杆菌(E.coli)中发生丙氨酸(Qβ CP基因编码的第二个氨基酸)之前的N末端甲硫氨酸的切割，并且这与Qβ外壳蛋白N末端的情况相同。UGA琥珀密码子3’的A1基因部分编码195个氨基酸长度的CP延伸物。(在此CP延伸物的位置72和73之间插入至少一个Aβ1-6肽产生了本发明另一实施方式(Kozlovska，T.M.，等.，Intervirology 39：9-15(1996))。在C末端截短的Qβ A1蛋白质C末端融合Aβ1-6肽产生了本发明另外的优选实施方式。例如，Kozlovska等，(Intervirology，39：9-15(1996))描述了Qβ A1蛋白质融合物，其中在位置19截短的Qβ CP延伸物的C末端融合表位。
如Kozlovska等(Intervirology，39：9-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配通常需要A1蛋白质-Aβ1-6肽融合物和野生型CP同时存在以形成镶嵌颗粒。然而，包含仅由融合了至少一个Aβ1-6肽的VLP亚单位组成的病毒样颗粒，特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方式也包括在本发明范围中。
可以通过多种方法实现镶嵌颗粒的产生。Kozlovska等，Intervirology，39：9-15(1996)描述了3种方法，这3种方法都可以用在本发明实践中。在第一种方法中，在含有编码克隆的UGA抑制型tRNA的质粒(pISM3001质粒(Smiley B.K.，等.，Gene 134：33-40(1993)))的大肠杆菌(E.coli)株系中，表达编码Qβ A1蛋白质融合物的质粒以介导融合表位在VLP上的有效展示，其中所述Qβ A1蛋白质融合物在CP和CP延伸之间具有UGA终止密码子，而所述克隆的UGA抑制型tRNA将导致UGA密码子翻译为Trp。在另一个方法中，将CP基因终止密码子修饰为UAA，并且共转化表达A1蛋白质-Aβ1-6肽融合物的第二质粒。此第二质粒编码不同的抗生素抗性，并且复制起点与第一质粒相容(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology39：9-15(1996))。在第三种方法中，以双顺反子方式编码CP和A1蛋白质-Aβ1-6肽融合物，其可操作地连接启动子诸如Trp启动子，参见Kozlovska等，Intervirology，39：9-15(1996)的图1中所述。
在另一实施方式中，Aβ1-6肽插入到fr CP的氨基酸2和3(切割后的CP，即切除了N末端甲硫氨酸的CP的编号)之间，由此产生了Aβ1-6肽-fr CP融合蛋白。已经描述了可用于本发明实践中自装配为VLP的fr CP融合蛋白质的构建和表达用载体和表达系统(Pushko P.等.，Prot.Eng.6：883-891(1993))。在一个具体实施方式中，Aβ1-6肽序列插入到fr CP缺失突变体中位于氨基酸2后，在所述突变体中已经缺失了fr CP的残基3和4(Pushko P.等，Prot.Eng.6：883-891(1993))。
也已描述了在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白N末端突出的β发夹中融合表位和之后融合表位在RNA噬菌体MS-2自装配的VLP上的呈递(WO92/13081)，并且通过插入或置换将Aβ1-6肽融合到MS-2 RNA噬菌体的外壳蛋白中也落入本发明的范围中。
在本发明另一个实施方式中，Aβ1-6肽融合到乳头瘤病毒衣壳蛋白上。在一个更具体的实施方式中，Aβ1-6肽融合到牛乳头瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1上。已经描述了杆状病毒/昆虫细胞系统中用于BPV-1融合蛋白构建和表达的载体和表达系统(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。用Aβ1-6肽置换BPV-1L1氨基酸130-136产生了BPV-1 L1-Aβ1-6肽融合蛋白，其是本发明优选的实施方式。已经描述了在杆状病毒载体中的克隆和在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达，并且它们可以用在本发明实践中(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。可以用多种方法诸如，凝胶过滤或蔗糖梯度超离心进行展示融合Aβ1-6肽的装配颗粒的纯化(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。
在本发明另一实施方式中，Aβ1-6肽与能掺入到Ty VLP中的Ty蛋白质融合。在一个更具体的实施方式中，Aβ1-6肽与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白(Roth，J.F.，Yeast 16：785-795(2000))融合。已经从酿酒酵母(Saccharomyces Serevisiae)分离了酵母逆转录转座子Ty1，2，3和4，而且已经从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombae)分离了逆转录转座子Tf1(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“Yeast Transposable elements，”《The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces：Genome dynamics，Protein Synthesis，and Energetics》，193页，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与copia类植物和动物元件有关，而Ty3属于gypsy逆转录转座子家族，其与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白质也称为Gag或衣壳蛋白，具有440个氨基酸的长度。在VLP成熟期间，在位置408切割p1产生p2蛋白质，其是VLP的必需成分。
已经描述了p1融合蛋白和用于酵母中所述融合蛋白表达的载体(Adams，S.E.，等，Nature 329：68-70(1987))。因此，例如通过将编码Aβ1-6肽的序列插入到pMA5620质粒的BamHI位点中，Aβ1-6肽可以与p1融合(Adams，S.E.，等，Nature 329：68-70(1987))。编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体中导致融合蛋白表达，该融合蛋白包含以C末端融合在外源表位N末端的Ty1-15 p1的氨基酸1-381。同样，用Aβ1-6肽进行N末端融合，或者内部插入到p1序列中，或者置换部分p1序列也落入本发明范围中。特别地，Aβ1-6肽插入到Ty蛋白质p1氨基酸30-31，67-68，113-114和132-133之间的Ty序列中(EP0677111)产生了本发明优选的实施方式。
适于Aβ1-6肽融合的其它VLP是例如逆转录病毒样颗粒(WO9630523)，HIV2 Gag(Kang，Y.C.，等，Biol.Chem.380：353-364(1999))，豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等.，Bio1.Chem.380：387-392(1999))，细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等，Virology 263：89-99(1999))，HBsAg(US4,722,840，EP0020416B1)。
适于本发明实践的嵌合VLP例子还有在Intervirology 39：1(1996)中描述的嵌合VLP。本发明中可以考虑使用的其它VLP例子是：HPV-1，HPV-6，HPV-1 1，HPV-16，HPV-18，HPV-33，HPV-45，CRPV，COPV，HIV GAG，烟草花叶病毒。已经制备了SV-40，多瘤病毒，腺病毒，单纯疱疹病毒，轮状病毒和诺沃克病毒的病毒样颗粒，并且包含Aβ1-6肽的这些VLP的嵌合VLP也在本发明范围中。
在本发明优选的实施方式中，用氨基酸接头修饰适于产生本发明疫苗的Aβ1-6肽以便与VLP结合。这些Aβ1-6肽包括但不限于在C末端融合到接头GGC上的Aβ1-6肽。适于融合到Aβ1-6片段N末端的氨基酸接头包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。适于融合到Aβ1-6的C末端的接头包括但不限于序列GGC。在优选的实施方式中，当接头融合到Aβ或Aβ片段C末端时，酰胺化C末端半胱氨酸。在优选的实施方式中，Aβ1-6与氨基酸接头融合，并且具有序列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2，其中酰胺化C末端半胱氨酸(这用C末端的“-CONH2”标明)，并且肽N末端是游离的(进一步用“NH2-”标明)。优选地，该氨基酸接头是短的，以避免诱导抗所述接头氨基酸的免疫应答，但是其应该允许诱导与可溶Aβ和AD斑块交叉反应的抗体，并且可以有利于抗体和Aβ1-6肽相互作用。氨基酸接头的其它适宜特性是柔性，优选地缺少大氨基酸，大氨基酸可能干扰偶联和/或引起抗接头本身的免疫应答。在更优选的实施方式中，含有做为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头融合到Aβ1-6肽的C末端。
本发明实践中适宜的其它Aβ片段包括来源于其它动物物种、经上述修饰的对应于前述片段的Aβ片段，其中该Aβ片段激发与人淀粉样斑块和可溶性人Aβ交叉反应的抗体。这种片段的例子是来源于灵长类(DAEFRH；SEQ ID NO：84)，野兔(DAEFRH；SEQ ID NO：85)，豚鼠(DAEFRH；SEQID NO：88)，小鼠(DAEFGH；SEQ ID NO：76)，大鼠(DAEFGH；SEQ IDNO：87)和xaenopus laevis(DSEYRH；SEQ ID NO：86)的Aβ1-6。
已经报道了基于超表达人类APP突变形式的转基因小鼠的大量AD动物模型(Games，D.等，Nature 373：523-527(1995a)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292(1997)；Hsiao，K.，等，Science274：99-102(1996)；Chen，G.等，Nature 408：975-979(2000)；Janus，C.等.，Nature 408：979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408：982-985(2000))。这些小鼠模型在转基因超表达水平、转基因上存在的AD突变和指导转基因超表达的启动子方面互相不同。这些动物模型不能显示AD所有的病理症兆，特别是与年龄相关的行为改变、β淀粉状蛋白沉积为不溶斑块、神经元内的神经原纤维缠结和整个前脑的神经元损失(Chapman，P.F.Nature 408：915-916(2000))。然而，记忆缺陷和鉴定它们的方法可以在这些模型中进行确定，并且它们可以在动物模型中用于检测本发明组合物的作用(Chen，G.等，Nature 408：975-979(2000)；Janus，C.等，Nature 408：979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408：982-985(2000))。而且，可以在还出现星形胶质细胞增生和小神经胶质细胞增生的那些模型中研究与年龄相关的Aβ沉积为淀粉样斑块。
相关领域技术人员将理解，对这里所述方法和应用的其它适应性更改和修改是显而易见的，并且能够进行这样的更改和修改而不背离本发明的范围或其任何实施方式。现在已经详细地描述了本发明，通过参考下面的实施例将更清楚地理解本发明，这里所包括的实施例仅仅是示例的目的，不意在限制本发明。
实施例
实施例1
优选的RNA噬菌体VLP或核心颗粒的克隆、构建、表达和纯化
A.突变Qβ外壳蛋白的构建和表达，及突变Qβ外壳蛋白VLP或衣壳的纯化
突变外壳蛋白的质粒构建和克隆
pQβ-240的构建：
质粒pQβ10(Kozlovska，TM，等，Gene 137：133-137)用做pQβ-240构建的起始质粒。通过反向PCR产生突变Lys13→Arg。以倒转尾对尾方向设计反转引物：
5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′(SEQ ID NO：48)和
5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′(SEQ ID NO：49)。
第一次PCR的产物用做第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物：
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：50)，和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO：51)。用XbaI和Mβh1103I消化第二次PCR的产物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表达载体中。利用PCR试剂盒试剂，根据生产者的方案进行这些PCR反应(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向标记掺入方法进行测序，证实期望的突变。包含pQβ-240的大肠杆菌(E.coli)细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白在SDS-PAGE上共迁移。
所得到氨基酸序列：(SEQ ID NO：17)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-243的构建
质粒pQβ10用做pQβ-243构建的起始质粒。通过反向PCR产生突变Asn10→Lys。以反转尾对尾方向设计反转引物：
5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′(SEQ ID NO：52)和
5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′(SEQ ID NO：53)。
第一次PCR产物用做第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物：
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：50)，和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO：51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR产物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表达载体中。利用PCR试剂盒试剂，根据生产者的方案进行这些PCR反应(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向标记掺入方法测序，证实期望的突变。包含pQβ-243的大肠杆菌(E.coli)细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白在SDS-PAGE上共迁移。
所得到氨基酸序列：(SEQ ID NO：18)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250的构建
质粒pQβ-240用做pQβ-250构建的起始质粒。通过定点诱变产生突变Lys2→Arg。上游引物：
5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO：54)
和下游引物
5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO：55)
用于突变PCR片段的合成，在pQβ-185表达载体中在唯一限制位点NcoI和HindIII引入该突变PCR片段。利用PCR试剂盒试剂，根据生产者的程序进行这些PCR反应(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向标记掺入方法测序，证实期望的突变。包含pQβ-250的大肠杆菌(E.coli)细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白在PAGE上共迁移。
所得到的氨基酸序列：(SEQ ID NO：19)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251的构建：
质粒pQβ10用做pQβ-251构建的起始质粒。通过反向PCR产生突变Lys16→Arg。以反转尾对尾方向设计反转引物：
5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′(SEQ ID NO：56)
和
5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′(SEQ ID NO：57)。
第一次PCR产物用做第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物：
5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO：50)，和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO：51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR产物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表达载体中。利用PCR试剂盒试剂，根据生产者的程序进行这些PCR反应(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向标记掺入方法测序，证实期望的突变。包含pQβ-251的大肠杆菌(E.coli)细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白在SDS-PAGE上共迁移。SEQ ID NO：20中示出了该构建体编码所得的氨基酸序列。
pQβ-259的构建：
质粒pQβ-251用做pQβ-259构建的起始质粒。通过定点诱变产生突变Lys2→Arg。使用上游引物：
5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO：54)
和下游引物
5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO：55)用于突变PCR片段的合成，在pQβ-185表达载体中在唯一限制位点NcoI和HindIII引入该突变PCR片段。利用PCR试剂盒试剂，根据生产者的程序进行这些PCR反应(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向标记掺入方法测序，证实期望的突变。包含pQβ-259的大肠杆菌(E.coli)细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白在SDS-PAGE上共迁移。
所得到的氨基酸序列：(SEQ ID NO：21)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
用于Qβ和Qβ突变体表达和纯化的一般方法表达
用Qβ外壳蛋白表达质粒转化大肠杆菌(E.coli)JM109。使用以Qβ外壳蛋白表达质粒转化的克隆接种含有20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基。在37℃温育该接种培养物16到24小时，不要振荡。随后在含有20μg/ml氨苄青霉素的100-300ml新鲜LB培养基中以1：100稀释制备的接种物，并且不要振荡，在37℃过夜温育。在烧瓶中，在含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培养基中，以1∶50稀释由此得到的第二次接种物，并且在振荡条件下，在37℃过夜温育。
纯化
用于纯化方法的溶液和缓冲液
1.裂解缓冲液 LB
50mM Tris-HClpH8.0，5mM EDTA，0.1％tritonX100和5微克/ml浓度新制备的PMSF。没有溶菌酶和DNAse。
2. SAS
水中饱和的硫酸铵。
3.缓冲液 NET。
20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
4. PEG
NET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
破碎和裂解
以2ml/g细胞，在LB中重悬浮冷冻的细胞。用22kH超声处理混合物5次，15秒，各次间有1分钟间隔以在冰上冷却溶液。然后利用Janecki K60转子，以14000rpm离心裂解液1小时。除非有另外说明，利用相同转子进行所有下述离心步骤。在4℃ 贮藏上清液，用LB冲洗细胞残渣2次。离心后，合并裂解液的上清液和洗涤级分。
分级分离
在对上述合并的裂解液搅拌的条件下，逐滴地添加饱和的硫酸铵溶液。将SAS体积调整到1/5总体积，以获得20％的饱和度。放置溶液过夜，并且第二天以14000rpm离心该溶液20分钟。用少量20％硫酸铵洗沉淀，并且再次离心。合并所获得的上清液，逐滴地添加SAS以获得40％饱和度。放置溶液过夜，并且第二天以14000rpm离心该溶液20分钟。在NET缓冲液中溶解所获得的沉淀。
层析
在Sepharose CL-4B柱子上加样NET缓冲液中重溶解的衣壳或VLP蛋白质。层析期间洗脱了3个峰。第一个峰主要含有膜和膜片段，没有收集该峰。衣壳包含在第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌(E.coli)蛋白质。
合并峰级分，并且调整NaCl浓度到0.65M的终浓度。在搅拌条件下逐滴地添加体积相应于二分之一合并的峰级分的PEG溶液。不要搅拌，放置溶液过夜。通过以14000rpm离心20分钟沉降衣壳蛋白。然后，在最小体积NET中溶解它，并且将它再一次加样到Sepharose CL-4B柱子上。合并峰级分，并且用60％(w/v)饱和度的硫酸铵沉淀。在NET缓冲液中离心和重溶解后，在Sepharose CL-6B柱子上加样衣壳蛋白以再次层析。
透析和干燥
合并上述获得的峰级分，利用大量无菌水进行透析，并且冷干贮藏。
Qβ-240的表达和纯化
在LB中重悬浮细胞(用质粒pQβ-240转化的大肠杆菌(E.coli)JM109)，超声处理5次，15秒(水冰夹套)，并且以13000rpm离心1小时。在进一步处理前，在4℃贮藏上清液，而用9ml LB洗残渣2次，最后用9ml LB中的0.7M尿素洗残渣。合并所有上清液，并且加样到SepharoseCL-4B柱子上。用硫酸铵沉淀合并的峰级分，并且离心。然后，在Sepharose2B柱子上进一步纯化重溶解的蛋白质，并且最后在Sepharose 6B柱子上纯化重溶解的蛋白质。如上所述，最后用大量水透析衣壳峰，并且冻干。通过电子显微镜术证实衣壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-243的表达和纯化
在LB中重悬浮细胞(大肠杆菌RR1)和如一般方法所述处理该细胞。通过在Sepharose CL-4B柱子上和最后在Sepharose CL-2B柱子上的两步连续凝胶过滤纯化蛋白质。如上所述，合并峰级分并冻干。通过电子显微镜术证实衣壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-250的表达和纯化
在LB中重悬浮细胞(用pQβ-250转化的大肠杆菌JM 109)和如上所述处理该细胞。通过在Sepharose CL-4B柱子上和最后在Sepharose CL-2B柱子上凝胶过滤纯化蛋白质，并如上所述冻干该蛋白质。通过电子显微镜术证实衣壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-259的表达和纯化
在LB中重悬浮细胞(用pQβ-259转化的大肠杆菌JM 109)并超声处理。用10ml LB洗残渣1次，并且用10ml LB中的0.7M尿素再次洗残渣。通过在Sepharose CL-4B柱子上的2个凝胶过滤层析步骤纯化该蛋白质。如上所述，透析和冻干该蛋白质。通过电子显微镜术证实衣壳蛋白装配为衣壳。
B.重组AP205 VLP的克隆，表达和纯化
AP205外壳蛋白基因的克隆
通过利用逆转录PCR技术和在用于测序的商购质粒pCR 4-TOPO中克隆，从产生自噬菌体AP205 RNA的两个cDNA片段装配AP205外壳蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO：28)。逆转录技术是相关领域普通技术人员熟知的。质粒p205-246中含有的第一片段包含CP序列上游269个核苷酸和编码CP最开始24个N末端氨基酸的74个核苷酸。质粒p205-262中含有的第二片段包含编码CP氨基酸12-131的364个核苷酸和CP序列下游另外162个核苷酸。p205-246和p205-262都来源于J.Klovins的惠赠。
通过两步PCR设计质粒283.-58以在一个全长CP序列中融合来源于质粒p205-246和p205-262的两个CP片段。
使用含有用于克隆到质粒pQb185中的NcoI位点的上游引物p1.44，或含有用于克隆到质粒pQb10中的XbaI位点的上游引物p1.45，和含有HindIII限制位点的下游引物p1.46(下划线是限制酶的识别序列)：
p1.44  5’-AA CC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3’(SEQID NO：79)
p1.45  5’-AA TCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3’(SEQ ID NO：80)
p1.46  5’-AA AAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3’(SEQ ID NO：81)。
两个另外引物，在p205-262中所含片段的5’末端退火的引物p1.47，和在质粒p205-246中所含片段的3’末端退火的引物p1.48用于扩增第一次PCR中的片段。引物p1.47和p1.48相互互补。
p1.47：5’-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3’(SEQ ID NO：82)
p1.48：5’-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3’(SEQ ID NO：83)。
在开始的两个PCR反应中，产生两个片段。用引物p1.45和p1.48和模板p205-246产生第一片段。用引物p1.47和p1.46和模板p205-262产生第二片段。这两个片段都用做第二次PCR反应的模板，其中用引物联合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46进行拼接重叠延伸。用XbaI或NcoI和HindIII消化两个第二步PCR反应的产物，并且用相同限制位点分别克隆到源于pGEM的表达载体pQb10或pQb185中，位于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子控制下。
获得了两个质粒，pAP283-58(SEQ ID NO：27)--其在pQb10中含有编码野生型AP205 CP(SEQ ID NO：28)的基因，和pAP281-32(SEQ IDNO：30)一一其在pQb185中具有突变Pro5→Thr(SEQ ID NO：29)。通过DNA测序证实外壳蛋白序列。PAP283-58含有位于CP的ATG密码子上游及XbaI位点下游的49个核苷酸，并且含有该外壳蛋白mRNA推定的原始核糖体结合位点。
重组AP205 VLP的表达和纯化
A.重组AP205VLP的表达
用质粒pAP283-58转化大肠杆菌JM109。用单菌落接种具有20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，并且不要振荡，在37℃温育16-24小时。
在含有20μg/ml氨苄青霉素的100-300ml LB培养基中以1∶100稀释制备的接种物，并且不要振荡，在37℃温育过夜。在含有用于缓冲的0.2％葡萄糖和磷酸盐的2TY培养基中以1∶50稀释所得到的第二次接种物，并且在37℃，在振荡器上温育过夜。通过离心收集细胞，并且在-80℃冷冻。B.重组AP205 VLP的纯化
溶液和缓冲液：
裂解缓冲液
50mM Tris-HCl pH 8.0，5mMEDTA，0.1％tritonX100和5微克/mlPMSF。
SAS
水中饱和的硫酸铵。
缓冲液 NET
20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
PEG
NET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
裂解：
以2ml/g细胞，在裂解缓冲液中重悬浮冷冻的细胞。用22kH超声处理混合物5次，15秒，各次间有1分钟间隔以在冰上冷却溶液。然后利用F34-6-38(Ependorf)转子，以12000rpm离心裂解液20分钟。除非有另外说明，利用相同转子进行所有下述离心步骤。在4℃贮藏上清液，用裂解缓冲液洗细胞残渣2次。离心后，合并裂解液的上清液和洗涤级分。
硫酸铵沉淀可以进一步用于纯化AP205 VLP。在第一步中，选择AP205VLP不沉淀的硫酸铵浓度。弃去所得到的沉淀。在下一步中，选择定量沉淀AP205 VLP的硫酸铵浓度，通过离心(14000rpm，20分钟)，从该沉淀步骤的沉淀物分离AP205 VLP。在NET缓冲液中溶解所得到的沉淀。层析：
将来源于合并的上清液的衣壳蛋白加样到Sepharose 4B柱子上(2.8×70cm)，并且以4ml/小时/级分，用NET缓冲液洗脱。收集级分28-40，并且用60％饱和度的硫酸铵沉淀。在沉淀前，通过SDS-PAGE和Western印迹(用对AP205特异的抗血清进行)分析级分。在NET缓冲液中重溶解通过离心分离的沉淀，并且将其加样到Sepharose 2B柱子上(2.3×65cm)，以3ml/小时/级分洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，之后收集级分44-50，合并，并且用60％饱和度的硫酸铵沉淀。在NET缓冲液中重溶解通过离心分离的沉淀，并且在Sepharose 6B柱子上(2.5×47cm)纯化，以3ml/小时/级分洗脱。通过SDS-PAGE分析该级分。收集级分23-27，调整盐浓度到0.5M，并且用PEG6000(其中从水中40％母液添加PEG6000，并且添加到13.3％的终浓度)沉淀。在NET缓冲液中重溶解通过离心分离的沉淀，并且如上所述加样到相同Sepharose 2B柱子上，以相同方式洗脱。收集级分43-53，并且用60％饱和度的硫酸铵沉淀。在水中重溶解通过离心分离的沉淀，并且利用大量水透析所获得的蛋白质溶液。每克细胞可以分离约10mg纯化的蛋白质。
利用电子显微镜术对病毒样颗粒检查，表明它们与噬菌体颗粒相同。
实施例2
含有赖氨酸残基的肽插入到HBcAg(1-149)的c/el表位中
HBcAg的c/el表位(残基72到88)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg)表面的顶部区域。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)遗传地置换该区域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，产生了HBcAg-Lys构建体(SEQID NO：26)。所引入的赖氨酸残基在其侧链含有反应性的氨基，该反应性氨基可以用于HBcAg颗粒与含有自由半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
通过PCRs产生具有SEQ ID NO：78中所示氨基酸序列的HBcAg-LysDNA：通过PCR分别地扩增编码HBcAg片段的两个片段(氨基酸残基1到78和81到149)。用于这些PCRs的引物也引入了编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽(SEQ ID NO：33)的DNA序列。利用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)，从pEco63扩增HBcAg(1到78)片段。利用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，从pEco63扩增HBcAg(81到149)片段。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两个PCR产物末端引入互补DNA序列，从而允许在随后PCR装配中两个PCR产物的融合。利用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，通过PCR扩增装配的片段。
对于PCRs，在具有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用每种寡聚物各100pmol及50ng模板DNAs。对于两个反应，实施温度循环如下：94℃，2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)，30个循环。
引物序列：
EcoRIHBcAg(s)：
(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO：58)；
Lys-HBcAg(as)：
(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAG-TACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO：59)；
Lys-HBcAg(s)：
(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACC-TAGTAGTCAGTTATGTC-3’)(SEQ ID NO：60)；
HBcAg(1-149)Hind(as)：
(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ ID NO：61)。
为了通过PCR融合两个PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng两种纯化的PCR片段。PCR循环条件是：94℃，2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)，30个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分析及纯化装配的PCR产物，并且用EcoRI和HindIII限制酶，在适合的缓冲液中消化19小时。消化的DNA片段连接到EcoRI/HindIII消化的pKK载体中以产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制分析和插入片段的DNA测序，分析PCR产物是否插入到载体中。
实施例3：HBcAg-Lys的表达和纯化
用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌株系K802或JM109。1ml细菌过夜培养物用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基。在37℃，培养该培养物4小时直到在600nm时，OD值达到约0.8。通过添加IPTG达到终浓度1mM进行HBcAg-Lys合成的诱导。诱导后，在37℃，进一步振荡细菌4小时。通过以5000×g离心15分钟收集细菌。在-80℃冷冻沉淀。融解沉淀，并且在补加有200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，pH 7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA)中重悬浮。在室温下温育细胞30分钟，并且通过超声处理破碎。利用含有pKK-HBcAg-Lys表达质粒或对照质粒的大肠杆菌细胞，以IPTG诱导HBcAg-Lys表达。在添加IPTG前，从带有pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养物和从带有对照质粒的培养物取样品。IPTG添加后4小时，再一次从含有pKK-HBcAg-Lys的培养物和从对照培养物取样品。通过SDS-PAGE接着用考马斯亮蓝染色监测蛋白质表达。
然后以12,000×g离心裂解物30分钟以移除不溶细胞残渣。利用抗HBcAg的单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical and ScientificCorp.，Westbury，NY，USA)，通过Western印迹分析上清液和沉淀，表明显著数量的HBcAg-Lys蛋白质是可溶的。简而言之，以14,000×g离心来源于表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和来源于对照细胞的裂解物30分钟。分离上清液(＝可溶级分)和沉淀(＝不溶级分)，并且用SDS样品缓冲液稀释到相同体积。通过SDS-PAGE分析样品，接着用抗HBcAg单克隆抗体YVS1841以Western印迹分析样品。
利用由4ml 65％蔗糖溶液，其上覆盖有3ml 15％蔗糖溶液，之后为4ml细菌裂解物组成的蔗糖分级梯度，分级梯度离心澄清细胞裂解物。在4℃，以100,000×g离心样品3小时。离心后，自梯度顶部收集1ml级分，并且通过SDS-PAGE和随后的考马斯亮蓝染色分析。通过考马斯亮蓝染色检测HBcAg-Lys蛋白质。
HBcAg-Lys蛋白质在15％和65％蔗糖界面富集，表明该蛋白质已经形成了衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质保留在没有蔗糖的梯度上层，因此，HBcAg-Lys颗粒的分级梯度离心导致了颗粒的富集和部分纯化。
如下所述大规模进行HBcAg-Lys的表达和纯化。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB中接种单菌落，在37℃过夜培养该培养物，制备过夜培养物。第二天，在800ml LB氨苄青霉素培养基中稀释25ml预培养物，并且培养培养物到0.6-0.8 OD600的光密度。然后，用1mM IPTG诱导培养物，并且使其生长另外4小时。基本如上所述，收集细胞并且裂解。
然后，通过用硫酸铵(30％饱和度)首先从澄清的细胞裂解物沉淀蛋白质，然后在凝胶过滤柱子(Sephacryl S-400，Pharmacia)上加样重溶解的沉淀，纯化HBcAg-Lys。用硫酸铵再一次沉淀合并的级分，第二次重溶解沉淀并在相同凝胶过滤柱子上加样。最后合并和浓缩级分，并且用Bradford试验(BioRad)估测浓度。
实施例4：
无自由半胱氨酸残基但含有插入的赖氨酸残基的HBcAg的构建利用下面方法，构建这里称为HBcAg-lys-2cys-Mut的肝炎核心抗原(HBcAg)，其在对应于SEQ ID NO：25中48和107的位置没有半胱氨酸残基，但含有插入的赖氨酸残基。
通过用下面的PCR引物联合，首先分别扩增如上述实施例2中所述制备的HBcAg-Lys基因的3个片段，以引入两个突变。利用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。简言之，下列引物用于制备片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO：58)
引物2：48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQID NO：62)
下面引物用于制备片段2：
引物3：48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQID NO：63)
引物4：107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO：64)
下面引物用于制备片段3：
引物5：HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGC-GTTGATAG(SEQ ID NO：65)
引物6：107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO：66)。
然后，用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as联合片段1和2以产生片段4。然后用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg149hind-as联合片段4和片段3以产生全长基因。然后，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全长基因，并且克隆到在相同限制位点切割的pKK载体(Pharmacia)中。如实施例3中所述进行HBcAg-lys-2cys-Mut的表达和纯化。
实施例5
HBcAg1-185-Lys的构建
如实施例2中所述修饰肝炎核心抗原(HBcAg)1-185。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：33)通过遗传方式置换c/e1表位(残基72到88)区域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，产生HBcAg-Lys构建体(SEQID NO：26)。所引入的赖氨酸残基在其侧链含有反应性氨基，该氨基可以用于HBcAg颗粒与含有自由半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。PCR方法和常规克隆技术用于制备HBcAg1-185-Lys基因。
如上述实施例2中所述，从pEco63扩增HBcAg基因的两个单独的片段，并且随后通过PCR融合两个片段以装配全长基因，从而插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列(SEQ ID NO：33)。使用下面PCR引物联合：
片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO：58)(参见实施例2)
引物2：Lys-HBcAg(as)(SEQ ID NO：59)(参见实施例2)
片段2：
引物3：Lys-HBcAg(s)(SEQ ID NO：60)(参见实施例2)
引物4：HBcAgwtHindIIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQID NO：67)
装配：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO：58)(参见实施例2)
引物2：HBcAgwtHindIIII(SEQ ID NO：67)。
然后，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化装配的全长基因，并且克隆到在相同限制位点切割的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例6
HBcAg MIR区域中肽表位的融合
用具有序列VNLTWSRASG(SEQ ID NO：68)的表位CεH3置换HBcAg1-185残基79和80。CεH3序列来源于人IgE重链第三恒定区的序列。利用装配PCR方法，将表位插入到HBcAg1-185序列中。在第一PCR步骤中，来源于ATCC克隆pEco63，并且用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和引物HBcAg-wt Hind III rev扩增的HBcAg1-185基因用做两个单独反应中的模板，以扩增含有编码CεH3序列的序列元件的两个片段。然后在第二PCR步骤中，在装配PCR反应中装配这两个片段。
第一PCR步骤中的引物联合：CεH3 fwd和HBcAg-wt Hind III rev，及HBcAg-wt EcoRI fwd和CεH3 rev。在装配PCR反应中，在没有外部引物的3轮PCR循环中，首先装配第一PCR步骤中分离的两个片段，之后将外部引物添加到反应混合物中进行下面25轮循环。外部引物：HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
利用EcoRI和HindIII位点，将PCR产物克隆到pKK223.3中，以在大肠杆菌(E.coli)中表达(参见实施例2)。如实施例2中所述，在大肠杆菌(E.coli)中表达嵌合VLP和纯化该嵌合VLP。从凝胶过滤洗脱HBcAg1-185-CεH3的洗脱体积表明融合蛋白和嵌合VLP实现装配。
引物序列：
CεH3fwd：
5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3′(SEQ ID NO：69)
    V   N   L   T   W   S   R   A   S   G  A80  S   R   D   L   V  V86(SEQ ID NO：70)
CεH3rev：
5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC  ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′(SEQ ID NO：71)
                                            D78  E   L   N   N   G  V72(SEQ ID NO：72)
HBcAg-wt EcoRI fwd：
5’CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO：73)
HBcAg-wt Hind III rev：
5’CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ ID NO：74)
实施例7
HBcAg MIR区域中Aβ1-6肽的融合
用Aβ1-6肽序列DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQ ID NO：76)置换HBcAg1-185的残基79和80。利用实施例6中所述相同的策略设计两个重叠引物，并且通过装配PCR构建融合蛋白质。将PCR产物克隆到pKK223.3载体中，并且在大肠杆菌(E.coli)K802中表达。如实施例3中所述表达嵌合VLP，并且纯化该嵌合VLP。
实施例8：
Aβ1-6肽与在CP延伸的位置19截短的Qβ A1蛋白质的C末端融合在使用pQβ10做为模板的PCR反应中，使用在Qβ A1基因5’末端退火的引物和在A1基因3’末端退火的引物，并且该引物还包含编码具有序列DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQ ID NO：76)的Aβ1-6肽的序列元件。PCR产物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.等，Gene 137：133-37(1993))中，并且如实施例1中所述表达和纯化嵌合VLP。
实施例9
在fr外壳蛋白的位置2和3之间插入Aβ1-6肽
通过标准分子生物学技术，在pFrd8载体(Pushko，P.et al.，Prot.Eng.6：883-91(1993))的Bsp119I位点中插入互补引物，所述互补引物编码具有DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQ ID NO：76)的Aβ1-6肽序列，并且含有Bsp119I匹配末端及能引起读框内插入的另外核苷酸。做为可替代方案，用Bsp119I消化后，用Klenow补平pFrd8载体的突出端，并且在Klenow处理后，在pFrd8中连接编码Aβ1-6肽序列的寡核苷酸和用于符合读框克隆的另外核苷酸。通过测序分析具有正确方向插入片段的克隆。如Pushko，P.等，Prot.Eng.6：883-91(1993)中所述进行大肠杆菌JM109或大肠杆菌K802中嵌合融合蛋白的表达和纯化，但是用SepharoseCL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)柱子进行层析步骤。与实施例1中所述用于Qβ的方法相似，用硫酸铵沉淀细胞裂解物，并且通过两个连续的凝胶过滤纯化步骤纯化。
实施例10
在载体pOGS8111中于Ty1蛋白质p1的位置67和68之间插入Aβ1-6肽
合成编码序列DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQ ID NO：76)的Aβ1-6肽的两个互补寡核苷酸，该寡核苷酸末端与pOGS8111的NheI位点匹配。根据EP 677’111的描述，添加另外核苷酸以允许编码Aβ1-6肽的序列以符合读框的方式插入。由pOGS8111的TyA(d)基因中寡核苷酸插入造成的改变的NheI位点编码位于插入表位侧翼的氨基酸AS和SS。
如EP0677111和其中参考文献中所述，将pOGS8111转化到酿酒酵母(S.cervisiae)株系MC2中用于嵌合Ty VLP的表达。如EP 677’111中所述，通过蔗糖梯度超离心纯化嵌合Ty VLP。
实施例11
Aβ1-6肽插入到乳头瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1中
如所述(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.USA 96：2373-2378(1999))，用编码具有序列DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQID NO：76)的Aβ1-6肽的序列置换pFastBac1(GIBCO/BRL)载体中克隆的BPV-1 L1基因氨基酸130-136的编码序列。通过核苷酸序列分析证实构建体序列。如制造商所述，利用GIBCO/BRL杆状病毒系统产生重组杆状病毒。如Kirnbauer，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.89：12180-84(1992)和Greenstone，H.L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：1800-05(1998)所述，从杆状病毒感染的Sf9细胞纯化嵌合VLP。
实施例12
用融合VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠
如实施例13和14中所述，使用实施例7-11中产生的展示序列DAEFRH(SEQ ID NO：75)或DAEFGH(SEQ ID NO：76)的Aβ1-6肽的嵌合VLP，免疫人转基因APP小鼠或C57/BL6小鼠。如实施例13中所述，在Aβ1-6肽或Aβ1-40肽或Aβ1-42肽特异的ELISA中分析从免疫小鼠获得的血清。
如实施例14中所述，通过免疫一大组人APP转基因小鼠检查疫苗的保护作用。
实施例13
Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶联(QβAβ1-6)，及用QβAβ1-6免疫小鼠A.Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶联
化学合成Aβ1-6肽(序列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO：77)；开始的NH2基团表示该肽具有自由N末端，并且末端NH2基团表示该肽具有酰胺化的羧基末端。如实施例1中所述，表达和纯化Qβ VLP。在室温(RT)下，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.2(HBS，pH 8.2)中使Qβ VLP以2mg/ml浓度(Bradford测定法中测定的)与1.43mMSMPH(Pierce，Rockford IL)(自DMSO中的母液稀释)反应30分钟。然后，在4℃，用HBS，pH 8.2缓冲液透析该反应混合物，并且与反应混合物中稀释的0.36mM Aβ1-6肽(来自DMSO中的50mM母液)反应。在15℃，使偶联反应进行2小时，并且用pH 8.2的1000倍体积HBS透析反应混合物2×2小时，并且在液氮中等份急骤冷冻，在使用前在-80℃贮藏。
融解等份试样，并且通过SDS-PAGE估测Aβ1-6肽与Qβ VLP亚单位的偶联，并且在Bradford测定法中测定蛋白质浓度。图1中示出了偶联反应的结果。
图1表示Aβ1-6肽与Qβ VLP偶联反应的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝胶上，在还原条件下，对样品进行电泳，用考马斯亮蓝染色。泳道1是蛋白质标记，在凝胶左侧边界标出了相应的分子量；泳道2，衍生的Qβ VLP蛋白质；泳道3，Qβ VLP蛋白质与Aβ1-6肽偶联反应的上清液；泳道4，Qβ VLP蛋白质与Aβ1-6肽偶联反应的沉淀；在图中，用箭头指示对应于每个单体偶联1，2和3个肽的偶联产物。平均每个亚单位偶联1.5以上的个肽；几乎没有亚单位没有被偶联。
B.用偶联Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠和免疫应答分析
在第0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射偶联Aβ1-6肽的Qβ VLP(这里命名为Qb-Ab-1-6)。如上所述，使Aβ1-6肽偶联Qβ VLP蛋白质。用在PBS中稀释到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在21天，从小鼠眼眶后取血，并且在抗Aβ1-6肽的ELISA中测定对Aβ1-6肽特异的抗体效价。利用化学交联剂磺基-SPDP，Aβ1-6肽偶联牛RNAase A。用偶联的RNAase制备物，以10μg/ml浓度包被ELISA板。封闭该板，然后与系列稀释的小鼠血清温育。用酶促标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也检测了相同小鼠的免疫前血清。结果如图2中所示。
图2表示在用偶联Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，针对Aβ1-6肽特异性IgG抗体的ELISA分析。结果表示免疫的3只小鼠(A1-A3)，在图中免疫前血清表示为“Pre”；示出了一个免疫前血清的结果。免疫前血清和用“Qb-Ab-1-6”免疫的小鼠血清的比较表明，在没有佐剂情况下，可以获得抗肽Aβ1-6的强特异性抗体应答。C.抗Aβ1-40肽的ELISA
在DMSO中制备人Aβ1-40或Aβ1-42肽母液，并且使用前，在包被缓冲液中稀释该母液。用0.1μg/孔Aβ1-40肽包被ELISA板。封闭该板，然后与上述获得小鼠血清的系列稀释物温育。用酶学标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也包括接种前获得的血清。计算表现出高于基线平均3个标准偏差的血清稀释度，并且定义为“ELISA效价”。在免疫前血清中没有检测到特异性抗体。针对3只小鼠获得的效价是1∶100000，表明抗Aβ1-40的强特异性免疫应答。因此，用偶联Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫可以激发与Aβ1-40交叉反应的强抗体效价。
图3表示ELISA结果。针对用如上所述偶联Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的3只小鼠(A1-A3)的血清，获得以405nm光密度表示的ELISA信号，针对X轴上表示的每个稀释度对该信号绘图。示出了于21天取血时，来自3只小鼠的结果。也包括免疫前的血清。如上所述检测血清中抗体的效价，所有3只小鼠的效价均是1∶100000。
实施例14
人APP转基因小鼠的免疫
带有人APP转基因的8月龄雌性APP23小鼠(Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292(1997))用于接种。用在无菌PBS中稀释的25μg疫苗皮下注射小鼠，并且14天后，用相同量的疫苗加强免疫。在开始免疫前和加强免疫注射后7天，从小鼠尾静脉取血。如实施例13中所述，通过ELISA，分析血清中对Aβ1-6、Aβ1-40和Aβ1-42特异的抗体的存在。
实施例15
鼠Aβ1-6肽与Qβ VLP的偶联，小鼠中疫苗的注射，和免疫应答的分析化学合成鼠Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFGHGGC-CONH2)(SEQ IDNO：78)，并且用于如实施例13中所述偶联Qβ VLP。在C57BL/6小鼠中注射疫苗，测定激发的抗鼠Aβ1-6、鼠Aβ1-40和鼠Aβ1-42的抗体的效价。如实施例13中所述进行免疫和ELISA测定。
实施例16
激发的抗Aβ1-6的血清与人APP转基因小鼠斑块和AD斑块的结合大脑切片中的免疫组织化学
18月龄杂合APP23小鼠的连续石蜡大脑切片和来源于Braak III期AD患者的entorhinalcortex切片(Institute of Pathology，University Basel)用于染色。通过用浓甲酸处理人大脑切片5分钟，和在90℃用微波加热小鼠大脑切片3分钟，以增强抗原性。在具有3％山羊血清的PBS中以1∶1000稀释抗人Aβ1-6激发的小鼠血清(如实施例13中所述获得)，并且温育过夜。漂洗后，用在PBS中以1∶200稀释的生物素酰化抗小鼠第二抗体温育切片1小时。漂洗后，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术(ABC-Elite Kit PK6100；Vector Laboratories)进一步处理切片。最后，切片与二氨基联苯胺(DAB)金属加强的底物(Boehringer，Code 1718096)反应，用苏木精明矾对染，脱水，在二甲苯中透明并盖上盖玻片。
在图4A和B中示出了组织学染色的结果。用经偶联Qβ VLP的人类Aβ1-6免疫的3只小鼠的血清染色切片。每种血清都阳性染色来源于转基因小鼠和AD的淀粉样斑块。示出了3种血清之一种的结果。抗人类Aβ1-6激发的血清明显地染色了转基因人APP23小鼠的淀粉样斑块，及来源于AD患者的淀粉样斑块。免疫前的血清是阴性的。抗体染色细胞外淀粉样斑块和分离的血管。
实施例1 7
通过小鼠斑块组织学评价抗人类Aβ1-6激发的血清的特异性
脑切片的免疫组织化学
用如实施例13中所述抗人类Aβ1-6激发的代表性小鼠血清，或者用对鼠或人APP的最后20个氨基酸具特异性并且因此不识别Aβ的兔多克隆抗体，如实施例16中所述染色超表达人类APP的3月龄和18月龄杂合APP23小鼠的连续石蜡脑切片。除了使用生物素酰化的抗兔第二抗体(BA1000，Vector Laboratories)外，如实施例16中所述，处理与兔多克隆抗体温育的切片。
在图5A，B，C，D和E上示出了组织学染色的结果。标记在切片左下部的Aβ1-6表示抗Aβ1-6激发的血清已经被用于染色，而“Pab”表示切片已经用对鼠或人类APP最后20个氨基酸(对应于APP695中位置676-695)特异的多克隆抗体染色。
对来源于18月龄小鼠的切片的染色比较(图5A和C)，表明抗Aβ1-6激发的血清不与大脑中表达的APP交叉反应，但是APP被对照多克隆抗体染色。图5B表示来源于3月龄小鼠(在没有观察到淀粉状蛋白沉积的时间点)的大脑切片被对APP特异的多克隆抗体染色。图5D和5E分别表示图5A和图5B中的海马CA1锥体层的放大图。
实施例18
A.Aβ1-6肽和fr衣壳蛋白的偶联
在25℃，在摇摆振荡器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM fr衣壳蛋白溶液与从DMSO中母液稀释的10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)反应30分钟。随后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反应溶液2次2小时。然后，在16℃，在摇摆振荡器上，透析的fr反应混合物与5倍摩尔过量的Aβ1-6肽(序列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO：77)反应2小时。通过SDS-PAGE分析偶联产物。
B.Aβ 1-6肽和HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
在25℃，在摇摆振荡器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的1ml 120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut溶液与从DMSO中母液稀释的10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)反应30分钟。随后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反应溶液2次2小时。然后，在16℃，在摇摆振荡器上，透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合物与5倍摩尔过量的Aβ1-6肽(序列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO：77)反应2小时。通过SDS-PAGE分析偶联产物。
C.Aβ1-6肽和菌毛的偶联
在室温，在摇摆振荡器上，20mM Hepes，pH 7.4中的125μM1型大肠杆菌菌毛溶液与50倍摩尔过量的交联剂SMPH(Pierce)(从DMSO中的母液稀释)反应60分钟。在PD-10柱子(Amersham-Pharmacia Biotech)上使反应混合物脱盐。合并从柱子上洗脱的含有蛋白质的级分，并且在16℃，在摇摆振荡器上，使脱盐并衍生化的菌毛蛋白质与5倍摩尔过量的Aβ1-6肽(序列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO：77)反应2小时。通过SDS-PAGE分析偶联产物。
D.用偶联fr衣壳蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽免疫小鼠
在第0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射上述偶联fr衣壳蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽。用在PBS中稀释到200μ1的10μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在第21天从小鼠眼眶后取血，并且如实施例13中所述通过ELISA测定对Aβ1-6肽或Aβ1-40或Aβ1-42特异的抗体的效价。
实施例19
用Qβh Aβ1-6免疫恒河猴
因为人类和恒河猴之间Aβ序列相同，所以为了检测在Aβ1-6是自身抗原的情况下基于人类Aβ1-6肽的疫苗对于抗人类Aβ抗体的诱导，用Qβh Aβ1-6免疫恒河猴。如实施例13中所述制备Qβh Aβ1-6疫苗。在0天，用50μg疫苗免疫10至15步龄的4只恒河猴，并且在28和56天，用25μg疫苗加强免疫2次。背部皮下免疫猴子。在0天(取血前)、42天和70天从动物取血。从头前臂静脉(V.cephalica antebrachii)收集4ml血液。通过基本如实施例13中所述的ELISA，利用对猴子IgG特异的第二抗体，测定对Aβ1-40特异的抗体的效价。
因为人类和恒河猴共有相同的Aβ序列，所以恒河猴中对Aβ1-40特异的高效价抗体的产生表明用偶联Qβ的hAβ1-6免疫打破了对自身抗原Aβ的耐受性。而且，在灵长类中，用偶联的Aβ1-6片段可以产生识别全长Aβ的抗体。
图6中示出了ELISA结果。图中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的4只猴子(1-4)血清中测定的Aβ1-40特异性抗体的效价和该4只猴子的平均效价。效价表示为OD50效价。OD50是信号达到最大信号值一半时的抗体稀释度。从来源于用QβhAβ1-27免疫的猴子并识别Aβ1-40的参照血清获得最大值(OD最大值)，并且该最大值是在相同ELISA平板上测定的。
在第97，110，117，124，138，143，152，159，166天，从两只猴子(上述)取血，并且在110天，用25μg疫苗进行第三次加强免疫。合并血清(99ml)，并且用于Aβ1-6特异性抗体的亲和纯化。这些抗体以1.5μg/ml浓度用于免疫组织化学染色，并且生物素酰化的第二抗猴子抗体用于检测。18月龄杂合APP23小鼠和Braak III期AD患者的石蜡脑切片用于染色。在APP23小鼠脑切片中和AD患者脑切片中均观察到斑块特异性染色(图7)。
图7A和B中示出了组织学分析的结果。图7A中所示的是用上述对Aβ1-6特异的亲和纯化抗血清染色人APP转基因小鼠斑块(APP23株系)。图7B表示用相同的纯化抗血清染色人类AD斑块。在两种情况下，都使用1.5μg/ml浓度的纯化抗血清。两图上均以箭头指示典型斑块。
实施例20
鼠Aβ1-6与AP205 VLP的偶联，小鼠的免疫和免疫应答的分析
A.鼠Aβ1-6肽与AP205 VLP的偶联
化学合成鼠Aβ1-6肽(mAβ1-6，序列：NH2-DAEFGHGGC-CONH2(SEQ ID NO：78)；开始的NH2基团表示该肽具有自由N末端，并且末端NH2基团表示该肽具有酰胺化的羧基末端)。在室温下，20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.0(HBS，pH 8.0)中(如实施例1中表达和纯化的)AP205VLP以(在Bradford测定法中测定的)2mg/ml浓度与从DMSO中100mM母液稀释的2.86mM SMPH(Pierce，Rockford IL)反应30分钟。然后，在4℃，用pH 7.4的1000倍体积HBS透析反应混合物2次2小时；在液氮中急骤冷冻所得到的经透析和衍生化的AP205 VLP，并且在-20℃过夜贮藏。用1体积pH 7.4，20mM HBS稀释衍生的AP205 VLP，并且在15℃，在振荡条件下与反应混合物中稀释的719μM mAβ1-6肽(来源于DMSO中的50mM母液)反应2小时。用pH 7.4，1000倍体积HBS透析偶联反应物2次2小时，并且过夜。在液氮中急骤冷冻等分的透析的反应混合物，在使用前，在-80℃贮藏。
融解等份试样，并且通过SDS-PAGE估测mAβ1-6肽与AP205 VLP亚单位的偶联，并且在Bradford测定法中测定蛋白质浓度。图8中示出了偶联反应的结果。
图8表示mAβ1-6肽与AP205 VLP偶联反应的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝胶上，在还原条件下，对样品进行电泳，并且用考马斯亮蓝染色。泳道1是蛋白质标记，在凝胶左侧边界标出了相应的分子量；泳道2，AP205 VLP蛋白质；泳道3，衍生的AP205 VLP；泳道4，AP205VLP与mAβ1-6肽偶联反应的上清液；泳道5，AP205 VLP与mAβ1-6肽偶联反应的沉淀。在凝胶上没有检测到未偶联的AP205 VLP亚单位，而观察到了对应于每个亚单位几个肽的条带，证明了非常高的偶联效率。特别地，每个AP205 VLP亚单位具有远多于一个的Aβ1-6肽。
B.用偶联AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫小鼠和免疫应答分析
在0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射偶联mAβ1-6肽的AP205VLP。如上所述，mAβ1-6肽偶联AP205 VLP。用在PBS中稀释到200μl的25μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在21天，从小鼠眼眶后取血，并且在抗mAβ1-6肽的ELISA中测定对mAβ1-6肽特异的抗体的效价。利用化学交联剂磺基-SPDP，mAβ1-6肽偶联牛RNAse A。用RNAse-mAβ1-6制备物，以10μg/ml浓度包被ELISA板。封闭该板，然后与系列稀释的小鼠血清温育。用酶学标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也检测了相同小鼠的免疫前血清。结果如图9中所示。
图9表示在用偶联AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，针对mAβ1-6肽特异性IgG抗体的ELISA分析。结果表示在第21天(A1d21-A3d21)收集的3只免疫小鼠的血清，在图中免疫前血清表示为“Pre imm”；示出了一个免疫前血清的结果。免疫前血清和用偶联AP205VLP的mAβ1-6免疫的小鼠血清比较，表明在没有佐剂情况下，抗自身抗原肽mAβ1-6可以获得强特异性抗体应答。而且，自身肽与AP205VLP偶联可以破坏对该肽的耐受性，并且引起非常高的特异性免疫应答。因此，AP205 VLP适于在没有佐剂的情况下产生抗Aβ肽的高抗体效价。
实施例21：
用QβhAβ1-6免疫减少了超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中的淀粉样斑块
该实施例证明在发展有阿尔茨海默氏病样弥散性(刚果红阴性)淀粉样斑块的小鼠模型中，用QβhAβ1-6免疫在新皮层和皮层下大脑区域中引起了斑块密度的大幅度减少。弥散性淀粉样斑块的组织学出现是AD大脑病理学的显著特征(Selkoe，1994，Annu.Rev.Neurosci.17：489-517)，因此，该实施例证明了用QβhAβ1-6免疫提供了阿尔茨海默氏病治疗的有效方法。
为了评估用Qβ-Aβ1-6免疫的治疗效果，使用在小鼠Thy-1启动子控制下超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠(APP24；K670N/M671 L；V717I，专利号.WO980-36-4423)。该小鼠株系的特征在于：在18月龄时，在新皮质、海马、尾状核及壳核和丘脑中有大量淀粉样斑块。在9月龄时可以首先观察到斑块。组织学上，APP24小鼠中淀粉样斑块主要是弥散型的，即，它们为刚果红染色阴性的。较少地，也可以发现紧密的淀粉样斑块(刚果红阳性)。
如实施例13中所述，制备偶联Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根据下面实验方法(这些方法对于描述和实现本发明不是必须的)，在0天，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的25μg QβhAβ1-6(每只小鼠给药2×100μl)(n＝16)，或者做为阴性对照用PBS(每只小鼠给药2×100μl)(n＝9)，或者用无偶联抗原的Qβ病毒样颗粒(n＝11)，皮下注射9.5月龄APP24转基因小鼠。随后，在第15，49，76，106，140，169，200，230，259和291天，给小鼠注射25μg QβhAβ1-6疫苗、Qβ或PBS。在第一次免疫前(0天)1-2天和在第56，90，118，188，214，246和272天，通过尾静脉从动物取血。在305天也收集血清，在这时也收集大脑用于组织病理学检查(在该时间点，小鼠年龄：19.5个月)。
基本如实施例13中所述，通过ELISA测定对Aβ1-40特异的抗体效价。在图10中示出了ELISA的结果。图中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的小鼠血清中测定的Aβ1-40或Aβ1-42特异性抗体的效价。该效价表示为OD50％效价。OD50％是信号达到其最大值一半时的抗体稀释度。从在相同ELISA平板上测定的识别Aβ1-40和Aβ1-42的参照抗体获得最大值(OD最大值)。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶8000以上的OD50％效价(免疫前血清效价低于1∶100)，证明了甚至在老龄APP24小鼠中也出现对QβhAβ1-6一致的抗体应答(图10)。在整个免疫期间，免疫组中，中值OD50％效价是1∶20’000到1∶50’000。
为了定量淀粉样斑块，在4℃，在0.1M PBS中的4％甲醛中浸没来固定大脑。用乙醇脱水后，大脑被包埋在石蜡中，并且用切片机径向切成4μm厚度的切片。将切片置于超冷冻的载玻片上，并且在37℃干燥。在PBS中洗切片，并且通过在90℃，0.1M柠檬酸缓冲液中微波加热3分钟加强抗原性。在PBS中，用3％山羊血清以1∶1000稀释NT11抗血清(抗Aβ1-40，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：13287-13292)，并且在4℃温育过夜。漂洗后，用在PBS中以1∶200稀释的生物素酰化抗兔IgG第二抗体(BA1000，Vector Laboratories)温育切片1小时。漂洗后，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术(ABC-Elite KitPK6100；Vector Laboratories)进一步处理切片。最后，切片与二氨基联苯胺(DAB)金属加强的底物(Boehringer，Code 1718096)反应，用苏木精明矾复染，脱水，在二甲苯中透明和盖上盖玻片。每个动物3个不同解剖平面的系统-随机系列大脑切片用于分析。利用MCID图像分析仪(ImagingResearch，Brock University，Ontario-Canada，Program Version M5 elite)定量淀粉样斑块。通过利用Xillix黑白CCD TV照相机数字化该显微图像，并且以256灰度，以640480像素分辨率存储。利用物镜测微计(LeicaNeoplan Obiective)，以5×放大倍数校准该像素大小。利用用于邻近物场精确定位的电动机驱动的显微镜载物台，分析每个切片的整个新皮层和嗅核。对于每个物场，用人工轮廓限定解剖面积。对于每个单独的切片，用免疫阳性淀粉样斑块和组织背景之间的人工阈值设定(灰度水平)限定样品面积。通过人工轮廓排除分离的组织假象。原始数据测定为单独的计数(淀粉样沉积物)和成比例的面积值(免疫阳性淀粉样斑/皮层或嗅核)。
每只小鼠的数据被标准化为每mm2的沉积物(斑块)数量，和按整个新皮层的百分数计的总斑块面积。与PBS或Qβ注射的对照组比较，QβhAβ1-6免疫的小鼠显示了在皮层和皮层下区域中显著减少的淀粉样沉积物(图11)。在皮层、尾状核及壳核、海马和丘脑中，与PBS组比较，沉积物的中值数量和总斑块面积均高度显著地减少了80％-98％(p＜0.001，与PBS组比较，Mann-Whitney检测；图12)。
在第二项研究中，在0天，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的25μgQβhAβ1-6(每只小鼠给药2×100μl)(n＝15)，或者做为阴性对照用PBS(每只小鼠给药2×100μl)(n＝15)皮下注射13.5月龄APP24转基因小鼠。随后，在16，46，76，109，140和170天，给小鼠注射25 μg QβhAβ1-6疫苗或PBS。在第一次免疫(0天)前1-2天，和在31，59，128和154天，通过尾静脉从动物取血。在184天，也收集血清，在该时间点也收集大脑用于组织病理学检查(该时间点小鼠的年龄：19.5个月)。如上所述测定和表示对Aβ1-40特异的抗体效价，并且再一次发现所有免疫的小鼠对QβhAβ1-6免疫产生应答，具有至少1∶2000以上的OD50％效价(未示出)。整个免疫期间，中值OD50％效价是1∶10’000到1∶50’000。如上所述进行淀粉样沉积物的定量。与较早(即，在9.5月龄)起始免疫的实验比较，新皮层中斑块沉积物数量(-55％)和面积(-32％)的减少不太剧烈，但是仍旧非常明显(图13)并且有高度的显著性(p＞0.001，与PBS比较，Mann-Whitney检测)。在QβhAβ1-6免疫组中，在皮层下的区域中，斑块沉积物数量和面积减少了60-90％。与皮层比较，这些区域中更显著的效果可能与这些区域中更长的斑块形成时间有关。
总之，这两个实验证明了在超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中，QβhAβ1-6免疫急剧地减少了这些小鼠中淀粉样沉积物的出现。
图10：超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗体效价(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫9.5和19个月龄之间的小鼠。所示的是个体值(黑点)和框图，其中框的两端定义第25个和第75个百分点，并示出中值处的线条和定义第10个和第90个百分点的误差线(框外值以点表示)。
图11：在径向大脑切片中淀粉样斑块的免疫组织化学染色。图中所示是用Qβ(A)或QβhAβ1-6(B)疫苗免疫的超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠的径向大脑切片。
图12：在9.5至19月龄免疫后，超表达“Swedish/London”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中斑块沉积的定量。(A)皮层斑块密度。(B)皮层斑块面积。(C)尾状核壳核中斑块密度。(D)尾状核壳核中斑块面积。(E)海马中斑块密度。(F)海马中斑块面积。(G)丘脑中斑块密度。(H)丘脑中斑块面积。斑块密度表示为斑块/mm2，斑块面积表示为β淀粉状蛋白覆盖的组织面积的百分比。数据以个体值(黑点)及框图表示。框两端定义第25个和第75个百分点，并示出中值处的线条和定义第10个和第90个百分点的误差线。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum检测)。PBS，n＝9，Qβ，n＝11，QβhAβ1-6，n＝16。
实施例22
用QβhAβ1-6免疫减少了超表达“Swedish”突变体淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中的淀粉样斑块
该实施例证明了甚至在非常晚的淀粉样斑块病理学阶段起始免疫，用QβhAβ1-6免疫也提供了阿尔茨海默氏病治疗的有效方法。在该实施例中使用的AD小鼠模型中淀粉样斑块沉积过程在大约6个月龄就已经开始了(Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：13287-13292)。在这里所述研究中，在18个月龄开始用QβhAβ1-6免疫，这时在皮层中已经形成了高数量的紧密斑块。该实施例也证明了在非常年老的动物中，QβhAβ1-6也可以诱导Aβ40/42抗体(在19只免疫小鼠中没有未应答者)。
为了评估QβhAβ1-6免疫的治疗效果，使用超表达“Swedish”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠(APP23；K670N/M671L，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：13287-13292)。在这些小鼠中已充分地表征了阿尔茨海默氏病样病理学(Calhoun等，1998，Nature 395：755-756；Phinney等，1999，J.Neurosci.19：8552-8559；Bondolfi等，2002，J.Neurosci.22：515-522)。
如实施例13中所述制备偶联Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根据下面实验方法(这些方法对描述和实施本发明不是必须的)，在0天，用磷酸缓冲盐水中溶解的25μg QβhAβ1-6(每只小鼠给药2×100μl)(n＝19)，或者做为阴性对照用磷酸缓冲盐水(n＝17)，皮下注射18个月龄APP23转基因小鼠，并且在13，27-34，61-63，90-96和123-130天，用25μg疫苗加强免疫。在第一次免疫(0天)前1-2天和在第41-45天和68天，通过尾静脉从动物取血。也在152-154天收集血清，在该时间点也收集大脑用于组织病理学检查(该时间点的小鼠年龄：23个月)。
基本如实施例13中所述，通过ELISA测定对Aβ1-40特异的抗体效价，并且如实施例21中所述表示结果。在图14中示出了ELISA结果。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶2000以上OD50％效价(免疫前血清效价低于1∶100)，证明了即使在非常年老的小鼠中对Qβ-Aβ1-6仍有一致的抗体应答(图14)。整个免疫期间，中值OD50％效价是1∶9’000到1∶20’000。
如实施例21中所述进行淀粉样斑块的定量。每只小鼠的数据被标准化为每mm2沉积物(斑块)的数量和以整个新皮层的％表示的总斑块面积。QβhAβ1-6免疫的小鼠在皮层中显示了更少数量的沉积物(图15，图16)，这主要由于小体积的斑块的减少所致。与未免疫组比较，QμhAβ1-6免疫组中中值等斑块数量减少33％(p＜0.001，与PBS组比较，Mann-Whitney检测)。因为主要是小体积的斑块受影响，所以总斑块面积的减少是中等的，达到10％(p＜0.01，与PBS组比较，Mann-Whitney检测)。
图14：超表达“Swedish”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗体效价(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫18至23月龄的小鼠。所示的是个体值(黑点)和框图，其中框两端定义了第25个和75个百分点，并示出中值处的线条和定义第10个和第90个百分点的误差线(框外以点表示)。
图15：径向大脑切片中淀粉样斑块的免疫组织化学染色。箭头指向小体积的沉积物。图中所示的是来源于用PBS(A)或Qβ-Aβ1-6(B)免疫的超表达“Swedish”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠的径向大脑切片。
图16：在18至23个月龄免疫后，超表达“Swedish”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠中斑块沉积的定量。(A)皮层斑块密度。(B)皮层斑块面积。斑块密度表示为斑块/mm2，斑块面积表示为β淀粉状蛋白覆盖的组织面积的百分比。数据表示为个体值(黑点)和框图。框两端定义了第25个和75个百分点，并示出中值处的线条和定义第10个和第90个百分点的误差线。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum检测)。PBS，n＝17，QβhAβ1-6，n＝19。
为了清楚地理解本发明的目的，现在已经通过示例和实施例的方式完整地以一定的详细程度描述了本发明，本领域普通技术人员显而易见可以通过在广泛等同的条件、制剂和其它参数范围内修改或改变本发明而实施本发明，而不影响本发明的范围和其任何具体实施方式，并且所附权利要求的范围意欲包括这些修改或改变。
本说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平，并且在这里将它们并入为参考文献，就如同具体和单独地指明每篇单独的公开出版物，专利或专利申请并入为参考文献一样。
                            序列表
<110>希托斯生物技术股份公司(Cytos Biotechnology AG)
     诺瓦提斯医药股份公司(Novartis Pharma AG)
<120>含有淀粉样β1-6抗原阵列的疫苗组合物
<130>PA041WO
<150>US 60/396,639
<151>2002-07-19
<150>US 60/470,432
<151>2003-05-15
<160>93
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>172
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>1
Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln
1               5                   10                  15
Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys
            20                  25                  30
 Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu
         35                  40                  45
Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu
    50                  55                  60
Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn
65                  70                  75                  80
Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser
                85                  90                  95
Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile
            100                 105                 110
Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly
        115                 120                 125
Asp Pro Asn Leu Leu Lys Asp Gly Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Thr
    130                 135                 140
Val Gly Lys Lys Ser Ser Asp Gly Asn Ala Gln Ile Thr Glu Gly Ala
145                 150                 155                 160
Phe Ser Gly Val Ala Thr Phe Asn Leu Ser Tyr Gln
                165                 170
<210>2
<211>182
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr
            20                  25                  30
Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala
        35                  40                  45
Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln
65                  70                  75                  80
Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe
                85                  90                  95
Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln
            100                 105                 110
Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp
            115             120                 125
Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu
    130                 135                 140
Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr
                165                 170                 175
Phe Lys Val Gln Tyr Gln
            180
<210>3
<211>853
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>3
acgtttctgt ggctcgacgc atcttcctca ttcttctctc caaaaaccac ctcatgcaat     60
ataaacatct ataaataaag ataacaaata gaatattaag ccaacaaata aactgaaaaa     120
gtttgtccgc gatgctttac ctctatgagt caaaatggcc ccaatgtttc atcttttggg     180
ggaaactgtg cagtgttggc agtcaaactc gttgacaaac aaagtgtaca gaacgactgc     240
ccatgtcgat ttagaaatag ttttttgaaa ggaaagcagc atgaaaatta aaactctggc     300
aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacgacg gctctggccg ctgccacgac     360
ggttaatggt gggaccgttc actttaaagg ggaagttgtt aacgccgctt gcgcagttga     420
tgcaggctct gttgatcaaa ccgttcagtt aggacaggtt cgtaccgcat cgctggcaca     480
ggaaggagca accagttctg ctgtcggttt taacattcag ctgaatgatt gcgataccaa     540
tgttgcatct aaagccgctg ttgccttttt aggtacggcg attgatgcgg gtcataccaa     600
cgttctggct ctgcagagtt cagctgcggg tagcgcaaca aacgttggtg tgcagatcct     660
ggacagaacg ggtgctgcgc tgacgctgga tggtgcgaca tttagttcag aaacaaccct     720
gaataacgga accaatacca ttccgttcca ggcgcgttat tttgcaaccg gggccgcaac     780
cccgggtgct gctaatgcgg atgcgacctt caaggttcag tatcaataac ctacctaggt     840
tcagggacgt rca                                                                         853
<210>4
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>4
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>5
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>5
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100             105                     110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>6
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>6
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>7
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>7
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>8
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>9
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>9
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
            115             120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>10
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>11
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>11
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>12
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>12
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>13
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MXl
<400>13
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>14
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>14
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>15
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>15
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
 Tyr
 <210>16
 <211>128
 <212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>16
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qbeta 240突变体
<400>17
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 243突变体
<400>18
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 250突变体
<400>19
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 251突变体
<400>20
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>21
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 259突变体
<400>21
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>22
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>22
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>23
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>23
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
            20                  25                  30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65                  70                  75                  80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn
                85                  90                  95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp
            100                 105                 110
Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln
        115                 120                 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
    130                 135                 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
                165                 170                 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
        195                 200                 205
Glu Ser Gln Cys
    210
<210>24
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>24
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys
            180                 185
<210>25
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>25
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>26
<211>152
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>26
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
145                 150
<210>27
<211>3635
<212>DNA
<213>人T序列
<220>
<223>质粒pAP283-58
<400>27
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga     120
ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt     180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt     240
taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg     300
tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca     360
atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg     420
ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt     480
ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata     540
gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc     600
taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc     660
atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg     720
taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc     780
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg     840
gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga     900
gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca     960
tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg     1020
ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta     1080
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat     1140
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc     1200
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc    1260
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta    1320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg    1380
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg    1440
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt    1500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt    1560
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg    1620
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa    1680
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt    1740
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag    1800
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt    1860
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga    1920
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt    1980
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta    2040
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg    2100
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc    2160
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt    2220
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg    2280
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg    2340
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa    2400
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa    2460
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga    2520
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg    2580
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact    2640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac    2700
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg    2760
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg    2820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga    2880
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc    2940
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg    3000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc    3060
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc    3120
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt    3180
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc    3240
gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc    3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca    3360
tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct    3420
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa    3480
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac    3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag    3600
tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt                               3635
<210>28
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>28
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>29
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>AP205外壳蛋白
<400>29
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
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Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
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Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>30
<211>3607
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pAP281-32
<400>30
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga     60
gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag     120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta     180
tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg     240
aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc     300
agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc     360
agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac     420
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gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat     540
acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg     600
tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt     660
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tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc     1500
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taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt     1680
tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg    1740
catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg    1800
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg    1860
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca    1920
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa    1980
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa    2040
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aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat    2160
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc    2220
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata    2280
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt    2340
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga    2400
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag    2460
cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa    2520
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag    2580
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg    2640
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat    2700
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta    2760
ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg    2820
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc    2880
gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa    2940
gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc    3000
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt    3060
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct    3120
ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc    3180
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag    3240
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg    3300
ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc    3360
gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg    3420
tatggccgtg  caggtcgtaa  atcactgcat  aattcgtgtc  gctcaaggcg  cactcccgtt    3480
ctggataatg  ttttttgcgg  cgacatcata  acggttctgg  caaatattct  gaaatgagct    3540
ggtgacaatt  aatcatcgaa  ctagttaact  agtacgcaag  ttcacgtaaa  aagggtatcg    3600
cggaatt                                                                   3607
<210>31
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端接头
<400>31
Cys Gly Asp Glu Gly Gly
1               5
<210>32
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端接头
<400>32
Gly Gly Glu Asp Gly Cys
1               5
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>33
Gly Gly Lys Gly Gly
1               5
<210>34
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端甘氨酸接头
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以重复0至5次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以重复0至12次
<400>34
Gly Cys Gly
1
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以重复0至5次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以重复0至10次
<220>
<221>REPEAT
<222>(4)..(4)
<223>丝氨酸可以重复0至2次
<220>
<221>REPEAT
<222>(5)..(9)
<223>这些残基作为一组可以重复0至3次
<400>35
Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>36
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端甘氨酸接头
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以重复0至12次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>甘氨酸可以重复0至5次
<400>36
Gly Cys Gly
1
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>甘氨酸可以重复0至10次
<220>
<221>REPEAT
<222>(2)..(2)
<223>丝氨酸可以重复0至2次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(7)
<223>这些残基作为一组可以重复0至3次
<220>
<221>REPEAT
<222>(8)..(8)
<223>甘氨酸可以重复0至8次
<220>
<221>REPEAT
<222>(10)..(10)
<223>甘氨酸可以重复0至5次
<400>37
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly
1               5                   10
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(5)
<223>这些残基作为一组可以重复任意次
<400>38
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端γ1
<400>39
Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
1               5                   10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端γ1
<400>40
 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
 1               5                   10
<210>41
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端γ3
<400>41
 Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala
 1               5                   10                  15
Pro
<210>42
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端γ3
<400>42
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端甘氨酸接头
<400>43
Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>44
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端甘氨酸接头
<400>44
Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1               5
<210>45
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-端甘氨酸-赖氨酸接头
<400>45
Gly Gly Lys Lys Gly Cys
1               5
<210>46
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-端甘氨酸-赖氨酸接头
<400>46
Cys Gly Lys Lys Gly Gly
1               5
<210>47
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C.端接头
<400>47
Gly Gly Cys Gly
1
<210>48
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>48
ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc                               37
<210>49
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>49
ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc                               37
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>50
agctcgcccg gggatcctct ag                                               22
<210>51
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>51
cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag                            40
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>52
ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg                                36
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>53
ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc                                36
<210>54
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>54
ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg                                   33
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>55
gatttaggtg acactatag                                                   19
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>56
gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg                               37
<210>57
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>57
ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc                               37
<210>58
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoRIHBcAg(s)引物
<400>58
ccggaattca tggacattga cccttataaa g                                     31
<210>59
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Lys-HBcAg(as)引物
<400>59
cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c               51
<210>60
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Lys-HBcAg(s)引物
<400>60
gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc                   48
<210>61
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg(1-149)Hind(as)引物
<400>61
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag                              38
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>48as引物
<400>62
gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc                               37
<210>63
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>48s引物
<400>63
gagtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac                               37
<210>64
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>107as引物
<400>64
cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac                                   33
<210>65
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg149hind-as
<400>65
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag                    47
<210>66
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>107s引物
<400>66
gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag                                   33
<210>67
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAgwtHindIIII引物
<400>67
cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg                              38
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>表位CeH3
<400>68
 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly
 1               5                   10
<210>69
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3fwd引物
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
<400>69
gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta        48
Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val
1               5                   10                  15
gtc                                                                    51
Val
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3fwd引物
<400>70
ValAsn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val
1              5                   10                  15
Val
<210>71
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3rev引物
<400>71
accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c               51
<210>72
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CeH3rev引物肽
<400>72
Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val
1               5
<210>73
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg-wt EcoRI fwd引物
<400>73
ccggaattca tggacattga cccttataaa g                                     31
<210>74
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBcAg-wt Hind III rev引物
<400>74
cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg                              38
<210>75
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>75
Asp Ala Glu Phe Arg His
1               5
<210>76
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>76
Asp Ala Glu Phe Gly His
1               5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Aβ1-6 GGC
<400>77
Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Gly Cys
1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠Aβ1-6 GGC
<400>78
Asp Ala Glu Phe Gly His Gly Gly Cys
1               5
<210>79
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.4 4
<400>79
aaccatggca aataagccaa tgcaaccg                                         28
<210>80
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.45
<400>80
aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg                                       30
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.46
<400>81
aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac                                       30
<210>82
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.47
<400>82
gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg                        43
<210>83
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物p1.4 8
<400>83
cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc                        43
<210>84
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>84
Asp Ala Glu Phe Arg His
1               5
<210>85
<211>6
<212>PRT
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>85
Asp Ala Glu Phe Arg His
1               5
<210>86
<211>6
<212>PRT
<213>光滑爪蟾(Xenopus laevis)
<400>86
Asp Ser Glu Tyr Arg His
1               5
<210>87
<211>6
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>87
Asp Ala Glu Phe Gly His
1               5
<210>88
<211>6
<212>PRT
<213>豚鼠(Cavia porcellus)
<400>88
Asp Ala Glu Phe Arg His
1               5
<210>89
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>89
Val His Glu Pro His Glu Phe Arg His Val Ala Leu Asn Pro Val
1               5                   10                  15
<210>90
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>90
Tyr Tyr Glu Phe Arg His
1               5
<210>91
<211>42
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>91
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
             20                  25                  30
 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
         35                  40
<210>92
<211>770
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>92
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
            20                  25                  30
Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
        35                  40                  45
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
    50                  55                  60
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
                85                  90                  95
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
            100                 105                 110
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
        115                 120                 125
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
    130                 135                 140
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu
145                 150                 155                 160
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
                165                 170                 175
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
            180                 185                 190
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
        195                 200                 205
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
    210                 215                 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
                245                 250                 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
            260                 265                 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
        275                 280                 285
Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
    290                 295                 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe
305                 310                 315                 320
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
                325                 330                 335
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr
            340                 345                 350
Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
        355                 360                 365
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
    370                 375                 380
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385                 390                 395                 400
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
                405                 410                 415
Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
            420                 425                 430
Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn
        435                 440                 445
Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
    450                 455                 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
465                 470                 475                 480
Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
                485                 490                 495
Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe
            500                 505                 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser
        515                 520                 525
Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser
    530                 535                 540
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp
545                 550                 555                 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val
                565                 570                 575
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
            580                 585                 590
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
        595                 600                 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe
    610                 615                 620
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625                 630                 635                 640
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
                645                 650                 655
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
            660                 665                 670
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
        675                 680                 685
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
     690                695                 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705                 710                 715                 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
                725                 730                 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
            740                     745             750
Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met
        755                 760                 765
Gln Asn
    770
<210>93
<211>82
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>93
Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys
1               5                   10                  15
Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
            20                  25                  30
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
        35                  40                  45
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val
65                  70                  75                  80
Val Glu

Claims (51)

1、一种组合物，其包含：
(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和
(b)至少一个具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附着位点选自：
(i)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇上的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇上天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能与所述第一附着位点缔合；并且其中所述Aβ1-6肽和所述核心颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。
2、如权利要求1所述的组合物，其中所述核心颗粒选自：
(i)病毒；
(ii)病毒样颗粒；
(iii)噬菌体；
(iv)RNA噬菌体的病毒样颗粒；
(v)细菌菌毛；
(vi)病毒衣壳颗粒；和
(vii)(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)或(vi)的重组形式。
3、如权利要求1或2所述的组合物，其中所述核心颗粒包含，优选地是病毒样颗粒，其中优选地所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。
4、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒包含选自如下的重组蛋白质或其片段：
(a)重组乙型肝炎病毒蛋白质；
(b)重组麻疹病毒蛋白质；
(c)重组新培斯病毒蛋白质；
(d)重组轮状病毒蛋白质；
(e)重组口蹄疫病毒蛋白质；
(f)重组逆转录病毒蛋白质；
(g)重组诺沃克病毒蛋白质；
(h)重组甲病毒蛋白质；
(i)重组人乳头瘤病毒蛋白质；
(j)重组多瘤病毒蛋白质；
(k)重组噬菌体蛋白质；
(l)重组RNA噬菌体蛋白质；
(m)重组Ty蛋白质；
(n)重组Qβ噬菌体蛋白质；
(o)重组GA噬菌体蛋白质；
(p)重组fr噬菌体蛋白质；
(q)重组AP205噬菌体蛋白质；和
(r)来源于(a)到(q)的任何重组蛋白质的片段。
5、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
6、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体蛋白质或其片段，或者可替代地由重组RNA噬菌体蛋白质或其片段组成。
7、如权利要求6所述的组合物，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(j)噬菌体f2；
(k)噬菌体PP7；和
(l)噬菌体AP205。
8、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体Qβ蛋白质或其片段，或者可替代地由重组RNA噬菌体Qβ蛋白质或其片段组成。
9、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体fr蛋白质或其片段，或者可替代地由重组RNA噬菌体fr蛋白质或其片段组成。
10、如权利要求2或3所述的组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体AP205蛋白质或其片段，或者可替代地由重组RNA噬菌体AP205蛋白质或其片段组成。
11、如权利要求3至10任一所述的组合物，其中所述重组蛋白质包含RNA噬菌体外壳蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌体外壳蛋白组成。
12、如权利要求11所述的组合物，其中所述RNA噬菌体外壳蛋白具有选自下面的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：4；
(b)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的混合物；
(c)SEQ ID NO：6；
(d)SEQ ID NO：7；
(e)SEQ ID NO：8；
(f)SEQ ID NO：9；
(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的混合物；
(h)SEQ ID NO：11；
(i)SEQ ID NO：12；
(k)SEQ ID NO：13；
(l)SEQ ID NO：14；
(m)SEQ ID NO：15；
(n)SEQ ID NO：16；和
(o)SEQ ID NO：28。
13、如权利要求3至10任一所述的组合物，其中所述重组蛋白质包含RNA噬菌体的突变外壳蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。
14、如权利要求13所述的组合物，其中所述RNA噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(j)噬菌体f2；
(k)噬菌体PP7；和
(l)噬菌体AP205。
15、如权利要求13或14所述的组合物，其中通过置换方式移除至少一个赖氨酸残基已修饰了所述RNA噬菌体的所述突变外壳蛋白。
16、如权利要求13或14所述的组合物，其中通过置换方式添加至少一个赖氨酸残基已修饰了所述RNA噬菌体的所述突变外壳蛋白。
17、如权利要求13或14所述的组合物，其中通过缺失至少一个赖氨酸残基已修饰了所述RNA噬菌体的所述突变外壳蛋白。
18、如权利要求13或14所述的组合物，其中通过插入方式添加至少一个赖氨酸残基已修饰了所述RNA噬菌体的所述突变外壳蛋白。
19、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述第二附着位点能通过至少一个共价键缔合所述第一附着位点。
20、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述第二附着位点能通过至少一个非肽键缔合所述第一附着位点。
21、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述Aβ1-6肽与所述核心颗粒融合。
22、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述Aβ1-6肽选自：
(a)具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的人Aβ1-6肽；
(b)具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；
(c)具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的灵长类Aβ1-6肽；
(d)具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的兔Aβ1-6肽；
(e)具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；
(f)具有SEQ ID NO：87的氨基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和
(g)具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
23、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述Aβ1-6肽具有SEQ IDNO：75的氨基酸序列。
24、如前述任一权利要求所述的组合物，其还包含氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含所述第二附着位点，或者可替代地由所述第二附着位点组成。
25、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述第二附着位点或具有所述第二附着位点的所述氨基酸接头与所述Aβ1-6肽在其C末端结合。
26、如前述任一权利要求所述的组合物，其中所述第二附着位点或具有所述第二附着位点的所述氨基酸接头选自：
(a)GGC；
(b)GGC-CONH2；
(c)GC；
(d)GC-CONH2；
(e)C；和
(f)C-CONH2。
27、如前述任一权利要求所述的组合物，其中具有所述至少一个第二附着位点的所述Aβ1-6肽是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO：77)。
28、如权利要求27所述的组合物，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的病毒样颗粒。
29、一种药物组合物，其包含：
(a)如权利要求1所述的组合物；和
(b)可接受的药物学载体。
30、如权利要求29所述的药物组合物，其还包含佐剂。
31、如权利要求29或30所述的药物组合物，其中所述疫苗组合物无佐剂。
32、一种疫苗组合物，其包含前述任一权利要求所述的组合物。
33、如权利要求32所述的疫苗组合物，其还包含佐剂。
34、如权利要求32或33所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物无佐剂。
35、如权利要求32至34任一所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体蛋白质或其片段。
36、如权利要求32至35任一所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体Qβ蛋白质或其片段。
37、如权利要求32至35任一所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体fr蛋白质或其片段。
38、如权利要求32至35任一所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒包含重组RNA噬菌体AP205蛋白质或其片段。
39、如权利要求32至38任一所述的疫苗组合物，其中所述Aβ1-6肽选自：
(a)具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的人Aβ1-6肽；
(b)具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；
(c)具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的灵长类Aβ1-6肽；
(d)具有SEQ ID NO：85的氨基酸序列的兔Aβ1-6肽；
(e)具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；
(f)具有SEQ ID NO：87的氨基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和
(g)具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
40、如权利要求32至39任一所述的疫苗组合物，其还包含氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含所述第二附着位点，或者可替代地由所述第二附着位点组成。
41、如权利要求40所述的疫苗组合物，其中具有所述第二附着位点的所述氨基酸接头与所述Aβ1-6肽在其C末端结合。
42、如权利要求40或41所述的疫苗组合物，其中具有所述第二附着位点的所述氨基酸接头选自：
(a)GGC；
(b)GGC-CONH2；
(c)GC；
(d)GC-CONH2；
(e)C；和
(f)C-CONH2。
43、如权利要求32至42任一所述的疫苗组合物，其中具有所述至少一个第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO：77)。
44、如权利要求43所述的疫苗组合物，其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的病毒样颗粒。
45、一种制备前述任一权利要求所述的组合物的方法，该方法包括：
(a)提供具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；
(b)提供至少一个具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述第二附着位点选自：
(i)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇上的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇上天然存在的附着位点；
且其中所述第二附着位点能缔合所述第一附着位点；和
(c)混合所述核心颗粒和所述至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。
46、一种免疫的方法，包括向动物或人类施用前述任一权利要求所述的组合物。
47、如权利要求46所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原决定簇是自身抗原。
48、如权利要求46或47所述的免疫方法，其中所述动物是人类。
49、如权利要求46至48任一所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原决定簇是人Aβ1-6肽。
50、权利要求1至44任一所述的组合物，其用作药物。
51、权利要求1至44任一所述的组合物在制备用于治疗阿尔茨海默氏病和相关疾病的药物中的用途。
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