CN112876535A - 生物活性多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，特别涉及生物活性多肽及其应用。本发明提供的生物活性多肽KLQP具有较好的抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复的活性；一方面可以提高细胞的抗氧化能力，抵抗自由基的氧化损伤，增强机体抵抗外源刺激的能力；另一方面，能够促进细胞抵抗环境不利因素的能力，从而增强机体抵抗衰老的能力；最后，能提高组织在发生损伤后的自我修复能力；上述有益效果，对开发具有抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复功能的食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械具有十分重要的意义。

Description

生物活性多肽及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，特别涉及生物活性多肽及其应用。
背景技术
近年来随着经济的发展和生活水平的提高，人们越来越注重自身健康和保养自己的皮肤，一直以来，美容和抗衰老制剂以及相关衍生的美容化妆品、保健品、食品都备受市场青睐。
自从生活活性多肽物质被发现，特别是已经验证与皮肤组织细胞生理活动相关的活性多肽，人们对多肽的研究和应用不断深入，证实了其在美容、护肤保健、抗衰老等领域具有积极的作用和重要的价值。
生活活性多肽的有效性和分子量的大小显著相关，分子量较大的蛋白质和多肽难以渗透皮肤组织或被人体直接吸收，从而无法真正发挥作用。而分子量在100-1000Da之间的寡肽，具备高渗透性、高生物活性、低免疫源性等特点，能渗透角质层、真皮层、粘膜层等人体屏障被人体所吸收，起到美容、抗衰老、促进损伤修复等功效。
衰老是一种自然现象，且与细胞凋亡、抗氧化水平、器官组织自我修复能力等有关。抗衰老多肽作为近年来新兴的抗衰老剂，研究人员利用细胞模型、模式生物等，发现其在抗氧化功能及自由基的清除、抵抗细胞凋亡、加快器官组织修复及屏障结构与功能的重建等方面起显著作用，以延缓衰老。
发明内容
有鉴于此，本发明针对自然界的一些多肽进行筛选和改进，提供一类多肽能显著提升细胞抗衰亡能力和抗氧化功能，同时能促进伤口愈合。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一类多肽，所述多肽具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列至少有95％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列至少有98％同源性的氨基酸序列。
在上述基础上，本发明还提供了编码所述多肽的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
本发明还提供了所述多肽的制备方法，包括化学合成或通过基因工程的方法合成。
更重要的是，本发明还提供了所述多肽在制备抗氧化、抗衰老的食品、药物或化妆品中的应用。
本发明还提供了所述多肽在制备促进组织损伤修复的药品、化妆品或医疗器械中的应用。
基于上述研究，本发明还提供了药品，包括所述多肽以及药学上可接受的辅料。
此外，本发明还提供了食品，包括所述多肽以及食品中可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了化妆品，包括所述多肽以及化妆品中可接受的助剂。
本发明还提供了医疗器械，包括所述多肽以及可接受的载体。
本发明提供的生物活性多肽KLQP具有较好的抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复的活性；一方面可以提高细胞的抗氧化能力，抵抗自由基的氧化损伤，增强机体抵抗外源刺激的能力；另一方面，能够促进细胞抵抗环境不利因素的能力，从而增强机体抵抗衰老的能力；最后，能提高组织在发生损伤后的自我修复能力；上述有益效果，对开发具有抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复功能的食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同多肽浓度对细胞存活率的影响；
图2示不同多肽浓度对相对细胞活性的影响；
图3示小鼠创面损伤愈合效果。
具体实施方式
本发明公开了生物活性多肽及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明第一方面，提供一种生物活性多肽KLQP，其氨基酸序列为Lys-Leu-Gln-Pro。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽KLQP的核苷酸片段，其序列为：AAGCTGCAGCCC。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽KLQP的制备方法，可以直接通过化学合成制备，也可以通过基因工程的方法人工合成。
本发明的第四方面，提供了所述生物活性多天KLQP在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽KLQP在制备同时具有抗衰老功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽KLQP在制备具有促进组织损伤修复功能的药品、化妆品、医疗器械中的应用。
具体而言，本发明的生物活性多肽KLQP可以用于制备减少自由基对皮肤伤害、抗氧化、抗衰老的化妆品，制备具有抗氧化和/或抗衰老的药物，制备具有促进促织损伤修复功能的医疗器械、化妆品、药物；并且本发明的生物活性多肽KLQP通过胃肠道消化或吸收后仍具有生物活性，因此可以用于制备食品、保健品，以及口服的具有抗氧化和/或抗衰老的药物。
本发明第七方面，提供了一种抗氧化、抗衰老、促进促织修复功能的生物活性多肽KLQP或所述的生物活性多肽KLQP的衍生物；所述的抗氧化、抗衰老、促进促织损伤修复功能的产品包括食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械；所述生物活性多肽KLQP的衍生物，是指在生物活性多肽KLQP的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰得到的多肽衍生物。
本发明发现了一种生物活性多肽，能显著提升细胞抗衰亡能力和抗氧化功能，同时能促进组织损伤修复。
本发明提供的生物活性多肽及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1活性多肽的人工合成：
1、称取Wang树脂3g于150mL的反应器中，分别加入三倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)和一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树脂上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
2、称取脯氨酸Pro适量和1-羟基苯并三唑(HOBT)于离心管中，加入20mL的DMF将其溶解，然后加入3mL的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)震荡摇匀1min，30℃反应1h。
3、1小时后用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：DIEA:DIC＝1:1:2，v:v:v)。
4、分别加入三倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)和一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树枝上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
5、称取第二个氨基酸适量和1-羟基苯并三唑(HOBT)于离心管中，加入20mL的DMF将其溶解，然后加入3mL的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)震荡摇匀1min，30℃反应1h。
6、待完全反应后，用DMF洗涤树脂3次并抽干，反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树枝上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
7、按照5-6的步骤依次连接上氨基酸Gln、Leu和Lys。
8、待最后一个氨基酸连接完成后，脱去保护，DMF洗涤三次抽干。然后用切割液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95:2.5:2.5，v：v：v)将多肽从树脂上切割下来。
至此，完成生物活性多肽KLQP的人工合成。
实施例2抗氧化测试：
细胞实验：
1、将Hacat细胞接种到含10％FBS 1640培养基的6cm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％时，进行细胞传代；
2、Hacat细胞采用胰酶消化计数，使用含血清浓度为10％的1640培养基稀释成2×104/ml。在96孔板中，每孔接种90μL。
3.实验分为7组，其中1组空白对照组(不添加挂氧化氢和生物活性肽KLQP)，设置生物活性多肽KLQP浓度梯度组6组，分别为0nM、0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM和2nM与细胞进行孵育，总体积为100μL.
4.18h后，每孔加入10ul浓度为1.5Mm过氧化氢溶液，培养基中继续孵育18h后，显微镜进行拍照和台盼蓝染色后进行细胞活细胞和死细胞计数。
细胞存活率测定：细胞存活率＝存活细胞数量/总细胞数量×100％。计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
结果：如图1、表1所示。
表1不同多肽浓度添加细胞存活率
存活率(％)
空白对照组 96.77±1.78
0nM 2.63±1.52
0.125nM 3.63±1.56
0.25nM 11.13±1.45**
0.5nM 13.03±2.03**
1nM 17.70±2.56***
2nM 27.23±4.59***
注：t检验，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001(与0nM组比较)
由图1、表1可以看出，当生物活性多肽KLQP添加浓度为0.25nM以上时，细胞的存活率与不添加生物活性多肽KLQP的组别相比具有显著差异，2nM添加组较0nM添加组细胞存活率提升24.6％，且随着生物活性多肽KLQP浓度的升高，细胞存活率也随之升高。
实施例3抗衰老测试：
细胞抗凋亡实验：
1、将Hacat细胞接种到含10％FBS 1640培养基的6cm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％时，换成无血清培养基培养。
2、Hacat细胞再无血清培养基培养24h后，胰酶消化计数，使用含0.25％FBS 1640培养基稀释成2×104/ml。在96孔板中，每孔接种90uL。
3.设置多肽浓度梯度分别为0nM、0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM和2nM与细胞进行孵育，总体积为100μL。
4.测试采用CCK-8试剂盒，具体可参见Hao Y(Hao Y，2019)、Cai Y(Cai Y，2019)等方法；48h后，每孔加入10ul CCK-8反应液，培养基中继续孵育3h后，测定波长＝450nm处每孔的吸光度值。
5.以0nM处的吸光度值为标准设定为100％，计算其他各浓度处理条件下吸光度值。计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
表2不同多肽浓度下相对细胞活性
相对细胞活性(％)
0nM 99.99±11.77
0.125nM 107.84±7.46
0.25nM 114.57±6.96
0.5nM 118.86±4.56
1nM 122.01±2.04**
2nM 119.85±0.79**
注：t检验，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001(与0nM组比较)
由图2可以看出，当生物活性多肽KLQP的添加浓度达到1nM以上时，细胞的相对活性为122％，较0nM添加组相对细胞活性提高22.02％，且随着生物活性多肽KLQP浓度的升高，细胞相对活性也随之提高。
实施例4测试对皮肤的修复功能：
创面愈合测试：
动物实验：选择体重为25-30g的健康雌性昆明小鼠90只，分为3组，每组30只，各组之间无统计学差异，直到实验结束没有小鼠死亡。
对照组设置2组，对照组1:空白对照组(不造模)；对照组2：生理盐水-康复新液对照组(造模)；实验组3：采用1nM的多肽修复液(KLQP)。
小鼠创面损伤：小鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠(0.1ml/20g)麻醉小鼠。然后将小鼠背部毛剃除干净，并用碘伏消毒，最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小对称的孔，约8mm×8mm大小。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室正常饲养。
效果测试：全程皮肤切除当天即进行治疗。每天涂抹两次，每孔每次点滴上样约20μL。实验组3小鼠背部左侧涂生理盐水，右侧多肽修复液(1nM)；对照组2小鼠背部左侧涂生理盐水，右侧康复新液。每隔3天给小鼠背部创伤拍照，计算创伤修复率。
创面愈合率测定：每隔一天用游标卡尺测量小鼠创面的大小，计算创面的愈合率，创面愈合率＝(治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小×100％。
计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
结果：涂抹第3天和第7天，与生理盐水对照组相比，治疗组创面面积均有不同程度的缩小。结果如表3所示：
表3各组不同时间创面愈合率
第3天创面愈合率(％) 第7天创面愈合率(％)
对照组1 N.D N.D
对照组2(左侧-生理盐水) 18±1.23 41±1.12
对照组2(右侧-康复新液体) 25±0.77* 68±0.96*
实验组3(左侧-生理盐水) 19±1.12 39±1.07
实验组3(右侧-多肽修复液) 29±0.77* 79±0.96**
注：t检验，*：P＜0.05,**：P＜0.01(与生理盐水处理比较)；N.D：not detect
可见，相比较生理盐水处理组，实验组3多肽修复液对创面愈合具有明显的促进效果，修复效果与康复新液效果相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江华缔药业集团医药开发有限公司
<120> 生物活性多肽及其应用
<130> MP2037232
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Leu Gln Pro
1
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagctgcagc cc 12

Claims (10)

1.多肽，其特征在于，所述多肽具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同源性的氨基酸序列。
2.编码如权利要求1所述多肽的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，包括化学合成或通过基因工程的方法合成。
5.如权利要求1所述多肽在制备抗氧化、抗衰老的食品、药物或化妆品中的应用。
6.如权利要求1所述多肽在制备促进组织损伤修复的药品、化妆品或医疗器械中的应用。
7.药品，其特征在于，包括如权利要求1所述多肽以及药学上可接受的辅料。
8.食品，其特征在于，包括如权利要求1所述多肽以及食品中可接受的辅料或助剂。
9.化妆品，其特征在于，包括如权利要求1所述多肽以及化妆品中可接受的助剂。
10.医疗器械，其特征在于，包括如权利要求1所述多肽以及可接受的载体。
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