CN114317563A

CN114317563A - 提高基因表达的rna复制子及其应用

Info

Publication number: CN114317563A
Application number: CN202111554199.9A
Authority: CN
Inventors: 张元�; 林贵斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: WO2023109975A3; CN114317563B; WO2023109975A2

Abstract

本发明公开了一种提高基因表达的RNA复制子及其应用，所述RNA复制子包括：5’和3’非翻译区；非结构蛋白基因编码区、亚基因组启动子、目的基因编码区。本发明通过PCR定点突变技术引入的非结构蛋白区域突变体可复制型RNA，通过Lipofectamine2000或者纳米粒转染至哺乳动物真核生物细胞，可显著增强其下游亚基因组启动子介导的包括GM‑CSF、IFN‑γ、IL‑2、IL‑12、IL‑15在内的细胞因子、趋化因子表达，可以应用于肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病或心血管疾病的治疗。

Description

提高基因表达的RNA复制子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高基因表达的RNA复制子及其应用。

背景技术

基因物质通常以编码目的基因的DNA或RNA的形式向细胞内递送。但DNA向细胞核内的递送效率低以及用药安全性等问题影响了以DNA为载体的基因治疗在临床中的应用。信使RNA分子(mRNA)提高了基因治疗的安全性。但mRNA表达时间较短，通常需要多次重复给药才能有效调控基因表达和基因治疗的疗效，限制了其在临床上的推广和患者顺应性，且提高了治疗成本。可复制型RNA(repRNA)，又称为RNA复制子或自我扩增RNA，来源于正链或负链RNA病毒。甲病毒复制子包括甲病毒的非翻译区、非结构蛋白基因编码区、亚基因组启动子和目的基因编码区等功能元件(图1)，repRNA导入细胞后，RNA依赖的RNA聚合酶可以将释放到细胞质中的可复制型RNA作为模板复制合成多份转录本，增加了转录模板，进而翻译表达出多份目标蛋白(图2)。由于缺乏结构蛋白，甲病毒复制子对载体本身具有较低的内在免疫原性，同一可复制型RNA可以被多次重复注射。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高基因表达的RNA复制子及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种RNA复制子，所述RNA复制子包括：5’和3’非翻译区；非结构蛋白基因编码区、亚基因组启动子、目的基因编码区；其非结构蛋白基因编码区发生(I)～(III)任意一种突变：

(I)选自非结构蛋白1的G357、G1569、A1572、C1575和非结构蛋白2的T3922位点中的至少一个位点的突变；优选为同时突变；

(II)选自非结构蛋白1的G357、G1569、A1572、C1575和非结构蛋白2的A3821、T3922位点中的至少一个位点的突变；优选为同时突变；

(III)包括但不限于非结构蛋白2的G3892和非结构蛋白3的A4714位点中的至少一个位点的突变；优选为同时突变。

在本发明的一些实施方式中，所述5’和3’非翻译区、非结构蛋白基因编码区和亚基因组启动子来源于甲病毒、黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒或杯状病毒。在本发明的一些优选实施方式中，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒或塞姆利基森林病毒；所述黄病毒为登革热病毒或昆津病毒；所述小RNA病毒为脊髓灰质炎病毒或人鼻病毒；所述副粘病毒为犬痘热病毒；所述杯状病毒为猫杯状病毒。所述甲病毒优选为为委内瑞拉马脑炎病毒。优选地，所述RNA复制子从5’至3’末端为：5’非翻译序列、非结构蛋白序列、目的基因编码序列、3’非翻译序列。优选地，所述RNA复制子还包含亚基因组启动子，所述亚基因组启动子介于非结构蛋白序列、目的基因编码序列之间，调节目的基因翻译。优选地，所述RNA复制子通过噬菌体来源的DNA依赖的RNA聚合酶启动子(T7，T3，SP6)体外转录获得，优选地，所述DNA 依赖的RNA聚合酶启动子为T7启动子。优选地，所述RNA复制子还包含5’帽和3’poly-A尾，其中5’帽结构的添加采用牛痘病毒加帽体系，在5’末端加上7-甲基鸟苷帽结构，甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在RNA 5’末端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O上添加甲基基团；大肠杆菌聚(A)聚合酶在RNA复制子3’末端加上20-500个A碱基。优选地，所述RNA复制子的非结构蛋白区域DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些实施方式中，所述目的基因包括肿瘤特异性或相关抗原、病原体特异性或相关抗原、细胞因子或其受体、趋化因子或其受体、生长因子或其受体、抗体蛋白、细胞因子抗体融合蛋白和免疫检查点相关蛋白中的至少一种；优选地，所述细胞因子或者趋化因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)或白细胞介素-15(IL-15)。细胞因子可以增强免疫反应，趋化因子可以诱导附近的应答细胞(例如白细胞)向感染部位迁移，它们在感染、免疫反应、炎症、创伤、败血症或癌症的发生发展和治疗方面起重要有用。其中repRNA可编码任意的目的基因序列，例如用于疾病治疗的分子或疫苗抗原。

本发明的第二方面，提供一种载体，包含本发明第一方面所述RNA复制子。

本发明的第三方面，提供一种细胞，包含本发明第二方面所述载体。

在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞非植物或动物新品种。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述RNA复制子在(I)～(V)任一项中的应用：

(I)递送目的基因；(II)实现目的基因的长效表达；(III)提高目的基因的表达量；(IV)基因治疗；(V)疫苗研发。

本发明的第五方面，提供一种组合物，包含本发明第一方面所述RNA复制子或本发明第二方面所述载体。优选地，所述组合物还包含药用稀释剂、药用赋形剂、药用载体和药用载剂中的至少一种。优选地，所述组合物可搭配其他药物联合使用，所述药物包括但不限于：单克隆抗体药物、双特异性抗体药物、抗体偶联药物、融合蛋白药物、核酸类药物、化学药物、血液制品药物、脂类药物或中药提取物。优选地，所述药用载体为基于阳离子脂质的市售转染试剂、非病毒载体、高分子膜、仿生膜、生物膜或病毒载体。优选地，所述转染试剂，包括但不限于Lipofectamine2000、Lipofectamine3000、Lipofectamine8000、Lipofectamine LTX、Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine MessengerMAX、Invivofectamine 3.0。优选地，所述非病毒载体包括但不限于阳离子聚合物、阳离子脂质体、阴离子脂质体、胶束、无机纳米颗粒或微球。优选地，所述高分子膜、仿生膜或生物膜，包括但不限于细胞膜、外泌体或细胞外囊泡。优选地，所述病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒或病毒样颗粒。优选地，所述纳米载体包括但不限于多聚阳离子肽、阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、辅助脂质或两亲性化合物。优选地，所述多聚阳离子肽为鱼精蛋白；所述阳离子脂质为1,2-二油酰-3-三甲基铵盐丙烷；所述辅助脂质为胆固醇；所述两亲性化合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。优选地，所述纳米载体的粒径为20～350nm，电荷为-40～50mV。

本发明的第六方面，提供一种用于在生物体表达目的基因的方法，其包含以下步骤：向所述生物体中施用本发明第一方面所述的RNA复制子。优选地，所述生物体为原核生物或真核生物；优选为大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、鼠、猴、猪、牛、犬、兔、斑马鱼模式生物、人、鼠、猴、猪、牛、犬、兔、斑马鱼、哺乳动物细胞、果蝇来源的原代细胞或相关细胞系。优选地，所述哺乳动物细胞，包括但不限于293T、B16F10或4T1。优选地，所述对施用RNA复制子可以通过转染、转化或感染方式转入细胞。优选地，所述对施用RNA复制子可以通过皮下注射、皮内注射、肌内注射、瘤内注射、静脉注射、腹腔注射、口服给药、鼻腔给药、肺部给药或颅内给药导入机体。

本发明还提供一种对非结构蛋白区域进行定点突变的方法，具体在非结构蛋白1的G357、G1569、A1572、C1575和非结构蛋白2的T3922同时突变；非结构蛋白1的G357、G1569、A1572、C1575和非结构蛋白2的A3821T、T3922同时突变；非结构蛋白2的G3892和非结构蛋白3的A4714同时突变。在本发明的一些实施方式中，所述突变的方法为PCR定点突变。

在本发明的一些实施方式中，所述突变引物：

G357C突变引物：

G357C F：5’-GAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCC-3’(SEQ ID NO.14)；

G357C R：5’-GCTCATGACGGCGGCGAGCTCCTTCATTTTCTTGTCC-3’(SEQ ID NO.15)；

G1569A/A1572C/C1575T突变引物：

G1569A/A1572C/C1575T F：

5’-GGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGG-3’(SEQ ID NO.16)；

G1569A/A1572C/C1575T R：

5’-TAACATCAAGTCGACATCGGCTTCCAGAGTGGGCTCCTCAACATC-3’(SEQ ID NO.17)；

A3821T突变引物：

A3821T F:

5’-CATTGGTGCTATAGCGCGGCTGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAAC-3’(SEQ ID NO.10)；

T7VEESmaI R:5’-GCTTAAGTTAGTTGCGGCCGCCCGGGTCGACTCTAG-3’(SEQ ID NO.11)；

T3922C突变引物：

T3922C F：5’-GCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAAC-3’(SEQ ID NO.4)；

T3922C R：5’-TGAAAGCTTGTAAGGATTGTGCGTACGGGCCTTG-3’(SEQ ID NO.5)；

G3892C突变引物：

G3892C F 5’-CTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTAC-3’(SEQ ID NO.6)；

G3892C R 5’-CCTTGCGATCGTACCGAATGAATACAAACAGAACTTC-3’(SEQ ID NO.7)；

A4714G突变引物：

A4714G F 5’-TATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCG-3’(SEQ ID NO.8)；

A4714G R 5’-TAATACTGCTCATGCCTTCTCCGAGGATATACATGC-3’(SEQ ID NO.9)。

本发明的有益效果是：

在可复制型RNA非结构蛋白区域中，非结构蛋白1启动负链RNA合成，参与病毒RNA5’末端加帽，并且是RNA复制酶复合体与细胞质膜结合所必需的；非结构蛋白2不仅调节亚基因组RNA的合成，还作为RNA解旋酶和蛋白酶用于多种蛋白的加工；非结构蛋白3调节病毒与宿主蛋白的相互作用，参与亚基因组转录。非结构蛋白区域位点的突变，可能影响非结构蛋白的功能，进而导致其下游编码的目的基因表达的改变。

为了进一步增强可复制型RNA编码的抗原表达，促进RNA疫苗引起的免疫反应，本发明利用PCR定点突变技术在甲病毒来源的可复制型RNA非结构蛋白区域进行了一些特殊位点的突变，具体为在非结构蛋白区域中引入的非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T与非结构蛋白2T3922C同时突变，或非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T与非结构蛋白2A3821T/T3922C，增强了可复制型RNA亚基因组启动子下游编码的目的基因表达，可能是因为这些突变促进了RNA结构的稳定性或上调了非结构蛋白区域翻译出的RNA依赖的RNA聚合酶的活性。酶联免疫吸附测定结果显示可复制型RNA非结构蛋白区域中非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T与非结构蛋白2T3922C，或非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T与非结构蛋白2A3821T/T3922C同时突变，可显著上调亚基因组启动子下游GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15表达，其中非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T与非结构蛋白2A3821T/T3922C同时突变效果更加明显。

纳米粒已被证实可作为核酸、蛋白、多肽或药物递送载体，应用于多种疾病的临床治疗，但高浓度的药物具有毒性，容易引起机体不良反应。本发明中的非结构蛋白区域突变体(VEE:nsP1GGAC-nsP2T或VEE:nsP1GGAC-nsP2AT)可复制型RNA，使用Lipofectamine2000或者纳米粒转染哺乳动物细胞293T，均可上调亚基因组启动子介导的目的基因表达，表明该发明可在保证治疗效果的同时，降低纳米粒药物剂量，因此该发明具备极大地临床转化潜力与应用价值。GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15是调控机体免疫反应的关键分子，在多种疾病的治疗中发挥重要作用。本发明的实验数据显示，非结构蛋白区域突变体(VEE:nsP1GGAC-nsP2T或VEE:nsP1GGAC-nsP2AT)可复制型RNA编码的GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15表达显著上调，提示了该成果在相关临床疾病治疗中的应用价值。

综上所述，本发明通过PCR定点突变技术引入的非结构蛋白区域突变体可复制型RNA，通过Lipofectamine2000或者纳米粒转染至哺乳动物细胞，可显著增强其下游亚基因组启动子介导的包括GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15在内的细胞因子或趋化因子表达，可以应用于肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、心血管疾病等相关疾病的治疗。

附图说明

图1为RNA复制子结构示意图。

图2为RNA复制子在细胞内复制及基因表达示意图。

图3为T7-VEE质粒图谱。

图4为T7-VEE质粒非结构蛋白区突变位点。

图5为T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒nsP1 G357C位点突变测序结果。

图6为T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒nsP1 G1569A/A1572C/C1575T位点突变测序结果。

图7为T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP质粒nsP2 T3922C位点突变测序结果。

图8为T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2GT-nsP3A)-GFP质粒nsP2 G3892C位点突变测序结果。

图9为T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2GT-nsP3A)-GFP质粒nsP3 A4714G位点突变测序结果。

图10为T7-VEE(nsP2G-nsP3A)-GFP质粒nsP2 G3892C位点突变测序结果。

图11为T7-VEE(nsP2G-nsP3A)-GFP质粒nsP3 A4714G位点突变测序结果。

图12为T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2AT)-GFP质粒nsP2 A3821T位点突变测序结果。

图13为Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-12可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图14为纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-12可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图15为Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-15可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图16为纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-15可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图17为Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码GM-CSF可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图18为纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码GM-CSF可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图19为Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IFN-γ可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图20为纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IFN-γ可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图21为Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-2可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

图22为纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-2可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以非结构蛋白区域为野生型的T7-VEE-GFP(Addgene,58977)(图3)即T7-VEE(WT)-GFP质粒为模板，其中RNA复制子的非结构蛋白区域DNA序列如SEQ ID NO.1所示；野生型质粒T7-VEE(WT)-GFP的序列如SEQ ID NO.25所示；构建含有非结构蛋白区域点突变体的T7-VEE质粒，突变位点如图4所示。

实施例1构建nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T-nsP2 T3922C突变体

即T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP：

1)T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEEBglII F 5’-AAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCC-3’(SEQ IDNO.2)；

T7VEENdeI R 5’-ATCGATGCTGAGGGCGCGCCCATATGCTAGAC-3’(SEQ ID NO.3)；

G357C突变引物：

G357C F 5’-GAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCC-3’(SEQ ID NO.14)；

G357C R 5’-GCTCATGACGGCGGCGAGCTCCTTCATTTTCTTGTCC-3’(SEQ ID NO.15)；

G1569A/A1572C/C1575T突变引物：

G1569A/A1572C/C1575T F

5’-GGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGG-3’(SEQ ID NO.16)；

G1569A/A1572C/C1575T R

5’-TAACATCAAGTCGACATCGGCTTCCAGAGTGGGCTCCTCAACATC-3’(SEQ ID NO.17)；

T3922C突变引物：

T3922C F 5’-GCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAAC-3’(SEQ ID NO.4)；

T3922C R 5’-TGAAAGCTTGTAAGGATTGTGCGTACGGGCCTTG-3’(SEQ ID NO.5)；

PCR扩增体系：超纯水12.3μL、5x HF缓冲液4μL、10mM dNTP 0.4μL、引物F1μL、引物R1μL、T7-VEE(WT)-GFP质粒0.5μL、二甲基亚砜0.6μL、DNA聚合酶0.2μL；扩增程序：98℃30s；98℃10s、55℃10s、72℃30s/kb、30个循环；72℃8min。以T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP为模板，使用T7VEEBglIIF与T3922CR引物PCR扩增含有T3922C突变的上游片段(1748bp)，T3922CF与T7VEENdeIR物PCR扩增含有T3922C突变的下游片段(3646bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)BglII，NdeI与XhoI酶切T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒载体，酶切体系：10x缓冲液3μL、T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒24μL、BglII 1μL、NdeI 1μL、XhoI 1μL；37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收6212bp片段。

3)同源重组过程，具体反应体系：含有T3922C突变的上游片段0.01x 1748bp＝17.48ng、含有T3922C突变的下游片段0.01x 3646bp＝36.46ng、BglII，NdeI与XhoI酶切的T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒载体0.01x6212bp＝62.12ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

4)转化：将重组产物加入大肠杆菌感受态中，冰上静置25min；42℃，45s；迅速置于冰上5min；加入750μL无抗生素的LB培养基，37℃摇床，200rpm，1h；3500rpm，离心5min，弃上清600μL，剩余液体混匀，涂于含氨苄青霉素的LB平板中，37℃培养箱，倒置培养过夜。

5)挑选单克隆，MluI与EcoRI酶切鉴定，酶切反应体系为：超纯水7.8μL、10x缓冲液1μL、T7-VEE(WT)-GFP质粒1μL、MluI 0.1μL、BglII 0.1μL。37℃，1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序，T3922C位点突变测序结果如图7所示。

实施例2构建nsP2 G3892C-nsP3 A4714G突变体

即T7-VEE(nsP2G-nsP3A)-GFP：

1)T7-VEE载体酶切位点引物：如实施例1；

G3892C突变引物：

G3892C F 5’-CTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTAC-3’(SEQ ID NO.6)；

G3892C R 5’-CCTTGCGATCGTACCGAATGAATACAAACAGAACTTC-3’(SEQ ID NO.7)；

A4714G突变引物：

A4714G F 5’-TATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCG-3’(SEQ ID NO.8)；

A4714G R 5’-TAATACTGCTCATGCCTTCTCCGAGGATATACATGC-3’(SEQ ID NO.9)。

PCR扩增体系同实施例1，以T7-VEE(WT)-GFP为模板，使用T7VEEBglIIF与G3892CR引物PCR扩增含有G3892C突变的上游片段(1714bp)，G3892CF与A4714GR物PCR扩增含有G3892C/T3922C突变与A4714G突变的中间片段(853bp)，A4714GF与T7VEENdeIR引物PCR扩增含有A4714G突变的下游片段(2850bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)BglII，NdeI与XhoI酶切T7-VEE(WT)-GFP质粒载体，酶切体系同实施例1。37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收6212bp片段。

3)同源重组，反应体系：含有G3892C突变的上游片段17.14ng、含有G3892C突变与A4714G突变的中间片段8.53ng、含有A4714G突变的下游片段28.5ng、BglII，NdeI与XhoI酶切的T7-VEE(WT)-GFP质粒载体62.12ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

5)挑选单克隆，BglII与XhoI酶切鉴定，酶切反应体系为：超纯水7.8μL、10x缓冲液1μL、质粒1μL、BglII 0.1μL、XhoI 0.1μL。37℃，1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序，G3892C位点突变测序结果如图10所示，A4714G位点突变测序结果如图11所示。

实施例3构建nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T-nsP2 A3821T/T3922C突变体

即T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2AT)-GFP：

A3821T突变引物：

A3821T F 5’-CATTGGTGCTATAGCGCGGCTGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAAC-3’(SEQ IDNO.10)；

T7VEESmaI R 5’-GCTTAAGTTAGTTGCGGCCGCCCGGGTCGACTCTAG-3’(SEQ ID NO.11)。PCR扩增体系同实施例1，以T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP为模板，使用A3821TF与T7VEESmaIR引物PCR扩增含有A3821T突变的DNA片段(4460bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)SmaI酶切T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP质粒载体，酶切体系：10x缓冲液3μL、T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP 26μL、SmaI 1μL；37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收7062bp片段。

3)同源重组，反应体系：含有A3821T突变的PCR扩增片段44.6ng、SmaI酶切的T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)-GFP质粒载体70.62ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

5)挑选单克隆，SmaI酶切鉴定，酶切反应体系：超纯水7.9μL、10x缓冲液1μL、质粒1μL、SmaI0.1μL。37℃，1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序，A3821T位点突变测序结果如图12所示。

对比例1构建nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T突变体

即T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP：

1)T7-VEE载体酶切位点引物：

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEEMluI F

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACG-3’(SEQ IDNO.12)；

T7VEEBglII R 5’-CTTTCTTGGCGCTCACCACTAGATCTTTTTTGGTGACTGCGCTTTTAATG-3’(SEQ ID NO.13)；

G357C突变引物、G1569A/A1572C/C1575T突变引物同实施例1。

PCR扩增体系同实施例1，T7-VEE(WT)-GFP为模板，使用T7VEEMluI F与G357CR引物PCR扩增含有G357C突变的上游片段(2227bp)，G357C F与G1569A/A1572C/C1575T R引物PCR扩增含有G357C突变与G1569A/A1572C/C1575T突变的中间片段(1258bp)，G1569A/A1572C/C1575T F与T7VEEBglII R引物PCR扩增含有G1569A/A1572C/C1575T突变的下游片段(687bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)MluI与BglII酶切T7-VEE(WT)-GFP质粒载体，酶切体系：10x缓冲液3μL、T7-VEE(WT)-GFP质粒25μL、MluI 1μL、BglII 1μL。37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收7438bp片段。

3)同源重组，反应体系：含有G357C突变的上游片段22.27ng、含有G357C突变与G1569A/A1572C/C1575T突变的中间片段12.58ng、含有G1569A/A1572C/C1575T突变的下游片段6.87ng、MluI与BglII酶切的T7-VEE(WT)-GFP质粒载体74.38ng、2x clonExpressionMix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

5)挑选单克隆，MluI与EcoRI酶切鉴定，酶切反应体系：超纯水7.8μL、10x缓冲液1μL、质粒1μL、MluI 0.1μL、EcoRI 0.1μL。37℃1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序，G357C位点突变测序结果如图5所示，G1569A/A1572C/C1575T位点突变测序结果如图6所示。

对比例2构建nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T-nsP2 G3892C/T3922C-nsP3A4714G突变体

即T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2GT-nsP3A)-GFP：

1)T7-VEE载体酶切位点引物：如实施例1；

G3892C/T3922C突变引物：

G3892C/T3922C F 5’-GTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAAC-3’(SEQ ID NO.18)；

G3892C/T3922C R 5’-TTGATGAAAGCTTGTAAGGATTGTGCGTACGGGCCTTGCGATCGTACCGAATGAATACAAACAGAAC-3’(SEQ ID NO.19)；

A4714G突变引物：同实施例2。

PCR扩增体系同实施例1，以T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP为模板，使用T7VEEBglIIF与G3892C/T3922CR引物PCR扩增含有G3892C/T3922C突变的上游片段(1747bp)，G3892C/T3922CF与A4714GR物PCR扩增含有G3892C/T3922C突变与A4714G突变的中间片段(856bp)，A4714GF与T7VEENdeIR引物PCR扩增含有A4714G突变的下游片段(2850bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)BglII，NdeI与XhoI酶切T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒载体，酶切体系为：10x缓冲液3μL、T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒24μL、BglII 1μL、NdeI 1μL、XhoI 1μL。37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收6212bp片段。

3)同源重组，反应体系：含有G3892C/T3922C突变的上游片段17.47ng、含有G3892C/T3922C突变与A4714G突变的中间片段8.56ng、含有A4714G突变的下游片段28.5ng、BglII，NdeI与XhoI酶切的T7-VEE(nsP1GGAC)-GFP质粒载体62.12ng、2x clonExpressionMix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

5)挑选单克隆，BglII与XhoI酶切鉴定，酶切反应体系：超纯水7.8μL、10x缓冲液1μL、质粒1μL、BglII 0.1μL、XhoI 0.1μL。37℃，1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序，G3892C位点突变测序结果如图8所示，A4714G位点突变测序结果如图9所示。

效果例

检测方法：将不同的目的基因(包括细胞因子和趋化因子)克隆至结构蛋白区。

1)PCR扩增目的基因

(i)GM-CSF

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEEGMCSFF 5’-GTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACCATGTGGCTGCAG-3’(SEQ IDNO.20)；

3'UTRR 5’-AAAATAAAAATTTTAAGGCGGCATGCCAATCGCCGCGAGTTCTATGTAAGCAG-3’(SEQ ID NO.21)；

PCR扩增体系同实施例1，使用T7VEEGMCSFF与3'UTRR引物PCR扩增GM-CSF cDNA(423bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

(ii)IFN-γ

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEEIFNγF 5’-GTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACCATGAACGCTACACACTGC-3’(SEQ ID NO.22)；

3'UTRR：如SEQ ID NO.21所示；

PCR扩增体系同实施例1，使用T7VEEIFNγF与3'UTRR引物PCR扩增IFN-γcDNA(465bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

(iii)IL-2

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEED265AF：5’-GTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACCATGGAGACAGACACAC-3’(SEQ ID NO.23)；

3'UTRR：如SEQ ID NO.21所示。

PCR扩增体系同实施例1，使用T7VEEIFNγF与3'UTRR引物PCR扩增IFN-γcDNA(561bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

(iv)IL-12

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEEIL12F：5’-GTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACC-3’(SEQ ID NO.24)；

3'UTRR：如SEQ ID NO.21所示。

PCR扩增体系同实施例1，使用T7VEEIL12F与3'UTRR引物PCR扩增IL-12cDNA(1645bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

(v)IL-15

T7-VEE载体酶切位点引物：

T7VEED265AF：如SEQ ID NO.23所示；

3'UTRR：如SEQ ID NO.21所示。

PCR扩增体系同实施例1，使用T7VEED265AF与3'UTRR引物PCR扩增IL-15cDNA(753bp)，琼脂糖凝胶电泳，胶回收。

2)NdeI与SphI酶切上述T7-VEE-GFP质粒，反应体系：超纯水1μL、10x缓冲液3μL、质粒24μL、NdeI 1μL、SphI 1μL；37℃，2h后琼脂糖凝胶电泳，胶回收9486bp片段。

3)同源重组

(i)GM-CSF，反应体系：GM-CSF cDNA 8.46ng、NdeI与SphI酶切的上述T7-VEE-GFP质粒94.86ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。

(ii)IFN-γ，反应体系：IFN-γcDNA 9.3ng、NdeI与SphI酶切的上述T7-VEE-GFP质粒94.86ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。

(iii)IL-2，反应体系：IL-2cDNA 11.22ng、NdeI与SphI酶切的上述T7-VEE-GFP质粒94.86ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。

(iv)IL-12，反应体系：IL-12cDNA 32.9ng、NdeI与SphI酶切的上述T7-VEE-GFP质粒94.86ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。

(v)IL-15，反应体系：IL-15cDNA 15.06ng、NdeI与SphI酶切的上述T7-VEE-GFP质粒94.86ng、2x clonExpression Mix上述DNA片段和质粒载体的体积之和。

50℃，15min后，立即置于冰上，静置5min。

5)挑选单克隆，MluI与EcoRI酶切鉴定，反应体系：超纯水7.8μL、10x缓冲液1μL、质粒1μL、MluI 0.1μL、EcoRI 0.1μL。

37℃，1h后琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确的质粒测序。

6)MluI单酶切线性化T7-VEE质粒，并去除DNA模板RNase，反应体系：10x缓冲液8μL、质粒70μL、MluI 2μL。

7)纯化后的T7-VEE质粒，使用T7启动子体外转录：室温条件下，向1.5mL无RNA酶离心管中，按照顺序加入：5x T7转录缓冲液2μL、rNTPs(25mM ATP,CTP,GTP,UTP)3μL、线性化DNA模板3.8μL(1μg)、体外转录酶(T7)1μL、RNA酶抑制剂0.2μL。37℃反应3-6h。

8)无RNA酶的DNA酶消化T7启动子体外转录体系的T7-VEE质粒模板，氯化锂纯化可复制型RNA。

9)可复制型RNA 5’端加甲基化鸟嘌呤核苷帽子，氯化锂纯化可复制型RNA，反应体系为：未加帽的可复制型RNA 13.5μL(10μg)、10x加帽反应缓冲液2μL、GTP(10mM)1.0μL、S-腺苷甲硫氨酸(4mM)1.0μL、牛痘病毒加帽酶1.0μL、mRNA Cap2氧甲基转移酶1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL。加帽反应前，可复制型RNA需在25-70℃加热5-25min。

10)5’端加帽的可复制型RNA 3’端加多聚A尾巴(20-500个A碱基)，RNA纯化试剂盒纯化可复制型RNA，反应体系为：5’端加帽的可复制型RNA 15.5μL(10μg)、10x加多聚A尾巴缓冲液2μL、ATP(10mM)1μL、大肠杆菌聚(A)聚合酶1μL、RNA酶抑制剂0.5μL。37℃，1h。RNA纯化试剂盒纯化5’端加甲基化鸟嘌呤核苷帽子，3’端加多聚A尾巴的可复制型RNA。

11)Lipofectamine2000或纳米粒转染可复制型RNA至293T细胞，酶联免疫吸附测定检测亚基因组启动子下游编码目的基因表达。

11.1 Lipofectamine2000转染可复制型RNA至293T细胞。293T细胞中48孔板，约60％满。1.5mL离心管A：12.5μL opti-MEM培养基，加入500ng可复制型RNA。1.5mL离心管B：12.5μL opti-MEM培养基，加入1μL Lipofectamine2000。将管A加入管B混匀，室温，5min，加入293T细胞培养基中。细胞培养36h，收集细胞培养基，并裂解细胞。

11.2纳米粒包载可复制型RNA处理293T细胞。无核酸酶水10μL、可复制型RNA500ng、鱼精蛋白375ng室温10-15min后添加48.475nmol 1,2-二油酰-3-三甲基铵盐丙烷/胆固醇，室温10-15min后添加2.776μg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，50℃12-15min。

11.3酶联免疫吸附测定检测亚基因组启动子下游编码目的基因表达。

实验结果

使用PCR定点突变技术首先在可复制型RNA体外转录模板质粒非结构蛋白区域中引入非结构蛋白1G357C/G1569A/A1572C/C1575T突变，非结构蛋白2A3821T/G3892C/T3922C突变和非结构蛋白3A4714G突变，并进行了不同的突变组合，如T7-VEE(nsP1GGAC)；T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2T)；T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2AT)；T7-VEE(nsP1GGAC-nsP2GT-nsP3A)；T7-VEE(nsP2G-nsP3A)。并在将不同的目的基因克隆至结构蛋白区，其中主要包括IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、IL-2看其表达情况，主要通过Lipofectamine2000和纳米粒转染的方式。

其中Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-12可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图13，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-12在细胞内表达与细胞外分泌；与VEEnsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-12在细胞内表达与细胞外分泌。

纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-12可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图14，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEEnsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-12在细胞内表达与细胞外分泌；而且与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-12在细胞内表达与细胞外分泌。

Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-15可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图15、结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-15在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-15在细胞内表达与细胞外分泌。

纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-15可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图16，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEEnsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-15在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-15在细胞内表达与细胞外分泌。

Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码GM-CSF可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图17，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变均上调GM-CSF在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强GM-CSF在细胞内表达与细胞外分泌。

纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码GM-CSF可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图18，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEEnsP1GGAC-nsP2AT突变均上调GM-CSF在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强GM-CSF在细胞内表达与细胞外分泌。

Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IFN-γ可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图19，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2AT上调IFN-γ细胞外分泌；VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IFN-γ在细胞内表达。

纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IFN-γ可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图20，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEEnsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IFN-γ在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IFN-γ在细胞内表达与细胞外分泌。

Lipofectamine2000转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-2可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图21，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEEnsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-2在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-2在细胞内表达(VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变的IL-2细胞内表达量是VEE nsP1GGAC-nsP2T突变的IL-2细胞内表达量的～20倍)与细胞外分泌(VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变的IL-2细胞外分泌量是VEE nsP1GGAC-nsP2T突变的IL-2细胞外分泌量的～12倍)。其中VEE nsP2G-nsP3A突变上调IL-2在细胞内表达与细胞外分泌，其表达水平介于VEE nsP1GGAC-nsP2T突变与VEE nsP1GGAC-nsP2AT之间。

纳米粒转染非结构蛋白区域野生型或相关突变的编码IL-2可复制型RNA至293T细胞的酶联免疫吸附测定检测结果见图22，结果显示VEE nsP1GGAC-nsP2T与VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变均上调IL-2在细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步增强IL-2在细胞内表达(VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变的IL-2细胞内表达量是VEE nsP1GGAC-nsP2T突变的IL-2细胞内表达量的～30倍)与细胞外分泌(VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变的IL-2细胞外分泌量是VEE nsP1GGAC-nsP2T突变的IL-2细胞外分泌量的～30倍)。其中VEE nsP2G-nsP3A突变上调IL-2在细胞内表达与细胞外分泌，其表达水平介于VEE nsP1GGAC-nsP2T突变与VEE nsP1GGAC-nsP2AT之间。

综上所述，可以看出使用Lipofectamine2000或纳米粒载体将体外转录的非结构蛋白区域野生型或突变体的可复制型RNA转染至哺乳动物细胞293T，酶联免疫吸附测定结果显示可复制型RNA非结构蛋白区域nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T-nsP2 T3922C同时突变，即VEE(nsP1GGAC-nsP2T)，与nsP1 G357C/G1569A/A1572C/C1575T-nsP2 A3821T/T3922C突变体，即VEE(nsP1GGAC-nsP2AT)均可显著增强其下游亚基因组启动子介导的趋化因子或细胞因子，如GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12或IL-15的细胞内表达与细胞外分泌；与VEE nsP1GGAC-nsP2T突变相比较，VEE nsP1GGAC-nsP2AT突变进一步上调上述趋化因子或细胞因子在细胞内表达与细胞外分泌；此外，可复制型RNA非结构蛋白区域nsP2 G3892C-nsP3 A4714G同时突变，即VEE nsP2G-nsP3A突变上调IL-2在细胞内表达与细胞外分泌，其上调IL-2表达能力介于VEE nsP1GGAC-nsP2T突变与VEE nsP1GGAC-nsP2AT之间。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 提高基因表达的RNA复制子及其应用

<130>

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7482

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaaag ttcacgttga catcgaggaa gacagcccat tcctcagagc tttgcagcgg 60

agcttcccgc agtttgaggt agaagccaag caggtcactg ataatgacca tgctaatgcc 120

agagcgtttt cgcatctggc ttcaaaactg atcgaaacgg aggtggaccc atccgacacg 180

atccttgaca ttggaagtgc gcccgcccgc agaatgtatt ctaagcacaa gtatcattgt 240

atctgtccga tgagatgtgc ggaagatccg gacagattgt ataagtatgc aactaagctg 300

aagaaaaact gtaaggaaat aactgataag gaattggaca agaaaatgaa ggagctggcc 360

gccgtcatga gcgaccctga cctggaaact gagactatgt gcctccacga cgacgagtcg 420

tgtcgctacg aagggcaagt cgctgtttac caggatgtat acgcggttga cggaccgaca 480

agtctctatc accaagccaa taagggagtt agagtcgcct actggatagg ctttgacacc 540

acccctttta tgtttaagaa cttggctgga gcatatccat catactctac caactgggcc 600

gacgaaaccg tgttaacggc tcgtaacata ggcctatgca gctctgacgt tatggagcgg 660

tcacgtagag ggatgtccat tcttagaaag aagtatttga aaccatccaa caatgttcta 720

ttctctgttg gctcgaccat ctaccacgag aagagggact tactgaggag ctggcacctg 780

ccgtctgtat ttcacttacg tggcaagcaa aattacacat gtcggtgtga gactatagtt 840

agttgcgacg ggtacgtcgt taaaagaata gctatcagtc caggcctgta tgggaagcct 900

tcaggctatg ctgctacgat gcaccgcgag ggattcttgt gctgcaaagt gacagacaca 960

ttgaacgggg agagggtctc ttttcccgtg tgcacgtatg tgccagctac attgtgtgac 1020

caaatgactg gcatactggc aacagatgtc agtgcggacg acgcgcaaaa actgctggtt 1080

gggctcaacc agcgtatagt cgtcaacggt cgcacccaga gaaacaccaa taccatgaaa 1140

aattaccttt tgcccgtagt ggcccaggca tttgctaggt gggcaaagga atataaggaa 1200

gatcaagaag atgaaaggcc actaggacta cgagatagac agttagtcat ggggtgttgt 1260

tgggctttta gaaggcacaa gataacatct atttataagc gcccggatac ccaaaccatc 1320

atcaaagtga acagcgattt ccactcattc gtgctgccca ggataggcag taacacattg 1380

gagatcgggc tgagaacaag aatcaggaaa atgttagagg agcacaagga gccgtcacct 1440

ctcattaccg ccgaggacgt acaagaagct aagtgcgcag ccgatgaggc taaggaggtg 1500

cgtgaagccg aggagttgcg cgcagctcta ccacctttgg cagctgatgt tgaggagccc 1560

actctggagg cagacgtcga cttgatgtta caagaggctg gggccggctc agtggagaca 1620

cctcgtggct tgataaaggt taccagctac gatggcgagg acaagatcgg ctcttacgct 1680

gtgctttctc cgcaggctgt actcaagagt gaaaaattat cttgcatcca ccctctcgct 1740

gaacaagtca tagtgataac acactctggc cgaaaagggc gttatgccgt ggaaccatac 1800

catggtaaag tagtggtgcc agagggacat gcaatacccg tccaggactt tcaagctctg 1860

agtgaaagtg ccaccattgt gtacaacgaa cgtgagttcg taaacaggta cctgcaccat 1920

attgccacac atggaggagc gctgaacact gatgaagaat attacaaaac tgtcaagccc 1980

agcgagcacg acggcgaata cctgtacgac atcgacagga aacagtgcgt caagaaagaa 2040

ctagtcactg ggctagggct cacaggcgag ctggtggatc ctcccttcca tgaattcgcc 2100

tacgagagtc tgagaacacg accagccgct ccttaccaag taccaaccat aggggtgtat 2160

ggcgtgccag gatcaggcaa gtctggcatc attaaaagcg cagtcaccaa aaaagatcta 2220

gtggtgagcg ccaagaaaga aaactgtgca gaaattataa gggacgtcaa gaaaatgaaa 2280

gggctggacg tcaatgccag aactgtggac tcagtgctct tgaatggatg caaacacccc 2340

gtagagaccc tgtatattga cgaagctttt gcttgtcatg caggtactct cagagcgctc 2400

atagccatta taagacctaa aaaggcagtg ctctgcgggg atcccaaaca gtgcggtttt 2460

tttaacatga tgtgcctgaa agtgcatttt aaccacgaga tttgcacaca agtcttccac 2520

aaaagcatct ctcgccgttg cactaaatct gtgacttcgg tcgtctcaac cttgttttac 2580

gacaaaaaaa tgagaacgac gaatccgaaa gagactaaga ttgtgattga cactaccggc 2640

agtaccaaac ctaagcagga cgatctcatt ctcacttgtt tcagagggtg ggtgaagcag 2700

ttgcaaatag attacaaagg caacgaaata atgacggcag ctgcctctca agggctgacc 2760

cgtaaaggtg tgtatgccgt tcggtacaag gtgaatgaaa atcctctgta cgcacccacc 2820

tcagaacatg tgaacgtcct actgacccgc acggaggacc gcatcgtgtg gaaaacacta 2880

gccggcgacc catggataaa aacactgact gccaagtacc ctgggaattt cactgccacg 2940

atagaggagt ggcaagcaga gcatgatgcc atcatgaggc acatcttgga gagaccggac 3000

cctaccgacg tcttccagaa taaggcaaac gtgtgttggg ccaaggcttt agtgccggtg 3060

ctgaagaccg ctggcataga catgaccact gaacaatgga acactgtgga ttattttgaa 3120

acggacaaag ctcactcagc agagatagta ttgaaccaac tatgcgtgag gttctttgga 3180

ctcgatctgg actccggtct attttctgca cccactgttc cgttatccat taggaataat 3240

cactgggata actccccgtc gcctaacatg tacgggctga ataaagaagt ggtccgtcag 3300

ctctctcgca ggtacccaca actgcctcgg gcagttgcca ctggaagagt ctatgacatg 3360

aacactggta cactgcgcaa ttatgatccg cgcataaacc tagtacctgt aaacagaaga 3420

ctgcctcatg ctttagtcct ccaccataat gaacacccac agagtgactt ttcttcattc 3480

gtcagcaaat tgaagggcag aactgtcctg gtggtcgggg aaaagttgtc cgtcccaggc 3540

aaaatggttg actggttgtc agaccggcct gaggctacct tcagagctcg gctggattta 3600

ggcatcccag gtgatgtgcc caaatatgac ataatatttg ttaatgtgag gaccccatat 3660

aaataccatc actatcagca gtgtgaagac catgccatta agcttagcat gttgaccaag 3720

aaagcttgtc tgcatctgaa tcccggcgga acctgtgtca gcataggtta tggttacgct 3780

gacagggcca gcgaaagcat cattggtgct atagcgcggc agttcaagtt ttcccgggta 3840

tgcaaaccga aatcctcact tgaagagacg gaagttctgt ttgtattcat tgggtacgat 3900

cgcaaggccc gtacgcacaa ttcttacaag ctttcatcaa ccttgaccaa catttataca 3960

ggttccagac tccacgaagc cggatgtgca ccctcatatc atgtggtgcg aggggatatt 4020

gccacggcca ccgaaggagt gattataaat gctgctaaca gcaaaggaca acctggcgga 4080

ggggtgtgcg gagcgctgta taagaaattc ccggaaagct tcgatttaca gccgatcgaa 4140

gtaggaaaag cgcgactggt caaaggtgca gctaaacata tcattcatgc cgtaggacca 4200

aacttcaaca aagtttcgga ggttgaaggt gacaaacagt tggcagaggc ttatgagtcc 4260

atcgctaaga ttgtcaacga taacaattac aagtcagtag cgattccact gttgtccacc 4320

ggcatctttt ccgggaacaa agatcgacta acccaatcat tgaaccattt gctgacagct 4380

ttagacacca ctgatgcaga tgtagccata tactgcaggg acaagaaatg ggaaatgact 4440

ctcaaggaag cagtggctag gagagaagca gtggaggaga tatgcatatc cgacgactct 4500

tcagtgacag aacctgatgc agagctggtg agggtgcatc cgaagagttc tttggctgga 4560

aggaagggct acagcacaag cgatggcaaa actttctcat atttggaagg gaccaagttt 4620

caccaggcgg ccaaggatat agcagaaatt aatgccatgt ggcccgttgc aacggaggcc 4680

aatgagcagg tatgcatgta tatcctcgga gaaagcatga gcagtattag gtcgaaatgc 4740

cccgtcgaag agtcggaagc ctccacacca cctagcacgc tgccttgctt gtgcatccat 4800

gccatgactc cagaaagagt acagcgccta aaagcctcac gtccagaaca aattactgtg 4860

tgctcatcct ttccattgcc gaagtataga atcactggtg tgcagaagat ccaatgctcc 4920

cagcctatat tgttctcacc gaaagtgcct gcgtatattc atccaaggaa gtatctcgtg 4980

gaaacaccac cggtagacga gactccggag ccatcggcag agaaccaatc cacagagggg 5040

acacctgaac aaccaccact tataaccgag gatgagacca ggactagaac gcctgagccg 5100

atcatcatcg aagaggaaga agaggatagc ataagtttgc tgtcagatgg cccgacccac 5160

caggtgctgc aagtcgaggc agacattcac gggccgccct ctgtatctag ctcatcctgg 5220

tccattcctc atgcatccga ctttgatgtg gacagtttat ccatacttga caccctggag 5280

ggagctagcg tgaccagcgg ggcaacgtca gccgagacta actcttactt cgcaaagagt 5340

atggagtttc tggcgcgacc ggtgcctgcg cctcgaacag tattcaggaa ccctccacat 5400

cccgctccgc gcacaagaac accgtcactt gcacccagca gggcctgctc gagaaccagc 5460

ctagtttcca ccccgccagg cgtgaatagg gtgatcacta gagaggagct cgaggcgctt 5520

accccgtcac gcactcctag caggtcggtc tcgagaacca gcctggtctc caacccgcca 5580

ggcgtaaata gggtgattac aagagaggag tttgaggcgt tcgtagcaca acaacaatga 5640

cggtttgatg cgggtgcata catcttttcc tccgacaccg gtcaagggca tttacaacaa 5700

aaatcagtaa ggcaaacggt gctatccgaa gtggtgttgg agaggaccga attggagatt 5760

tcgtatgccc cgcgcctcga ccaagaaaaa gaagaattac tacgcaagaa attacagtta 5820

aatcccacac ctgctaacag aagcagatac cagtccagga aggtggagaa catgaaagcc 5880

ataacagcta gacgtattct gcaaggccta gggcattatt tgaaggcaga aggaaaagtg 5940

gagtgctacc gaaccctgca tcctgttcct ttgtattcat ctagtgtgaa ccgtgccttt 6000

tcaagcccca aggtcgcagt ggaagcctgt aacgccatgt tgaaagagaa ctttccgact 6060

gtggcttctt actgtattat tccagagtac gatgcctatt tggacatggt tgacggagct 6120

tcatgctgct tagacactgc cagtttttgc cctgcaaagc tgcgcagctt tccaaagaaa 6180

cactcctatt tggaacccac aatacgatcg gcagtgcctt cagcgatcca gaacacgctc 6240

cagaacgtcc tggcagctgc cacaaaaaga aattgcaatg tcacgcaaat gagagaattg 6300

cccgtattgg attcggcggc ctttaatgtg gaatgcttca agaaatatgc gtgtaataat 6360

gaatattggg aaacgtttaa agaaaacccc atcaggctta ctgaagaaaa cgtggtaaat 6420

tacattacca aattaaaagg accaaaagct gctgctcttt ttgcgaagac acataatttg 6480

aatatgttgc aggacatacc aatggacagg tttgtaatgg acttaaagag agacgtgaaa 6540

gtgactccag gaacaaaaca tactgaagaa cggcccaagg tacaggtgat ccaggctgcc 6600

gatccgctag caacagcgta tctgtgcgga atccaccgag agctggttag gagattaaat 6660

gcggtcctgc ttccgaacat tcatacactg tttgatatgt cggctgaaga ctttgacgct 6720

attatagccg agcacttcca gcctggggat tgtgttctgg aaactgacat cgcgtcgttt 6780

gataaaagtg aggacgacgc catggctctg accgcgttaa tgattctgga agacttaggt 6840

gtggacgcag agctgttgac gctgattgag gcggctttcg gcgaaatttc atcaatacat 6900

ttgcccacta aaactaaatt taaattcgga gccatgatga aatctggaat gttcctcaca 6960

ctgtttgtga acacagtcat taacattgta atcgcaagca gagtgttgag agaacggcta 7020

accggatcac catgtgcagc attcattgga gatgacaata tcgtgaaagg agtcaaatcg 7080

gacaaattaa tggcagacag gtgcgccacc tggttgaata tggaagtcaa gattatagat 7140

gctgtggtgg gcgagaaagc gccttatttc tgtggagggt ttattttgtg tgactccgtg 7200

accggcacag cgtgccgtgt ggcagacccc ctaaaaaggc tgtttaagct tggcaaacct 7260

ctggcagcag acgatgaaca tgatgatgac aggagaaggg cattgcatga agagtcaaca 7320

cgctggaacc gagtgggtat tctttcagag ctgtgcaagg cagtagaatc aaggtatgaa 7380

accgtaggaa cttccatcat agttatggcc atgactactc tagctagcag tgttaaatca 7440

ttcagctacc tgagaggggc ccctataact ctctacggct aa 7482

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaagcgcag tcaccaaaaa agatctagtg gtgagcgcc 39

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcgatgctg agggcgcgcc catatgctag ac 32

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcccgtacgc acaatcctta caagctttca tcaac 35

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaaagcttg taaggattgt gcgtacgggc cttg 34

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgtttgtat tcattcggta cgatcgcaag gcccgtac 38

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccttgcgatc gtaccgaatg aatacaaaca gaacttc 37

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tatatcctcg gagaaggcat gagcagtatt aggtcg 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taatactgct catgccttct ccgaggatat acatgc 36

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cattggtgct atagcgcggc tgttcaagtt ttcccgggta tgcaaac 47

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcttaagtta gttgcggccg cccgggtcga ctctag 36

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgcgtcgagg ggaattaatt cttgaagacg 50

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctttcttggc gctcaccact agatcttttt tggtgactgc gcttttaatg 50

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaaatgaag gagctcgccg ccgtcatgag cgaccc 36

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctcatgacg gcggcgagct ccttcatttt cttgtcc 37

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggagcccact ctggaagccg atgtcgactt gatgttacaa gagg 44

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taacatcaag tcgacatcgg cttccagagt gggctcctca acatc 45

<210> 18

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gttctgtttg tattcattcg gtacgatcgc aaggcccgta cgcacaatcc ttacaagctt 60

tcatcaac 68

<210> 19

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgatgaaag cttgtaagga ttgtgcgtac gggccttgcg atcgtaccga atgaatacaa 60

acagaac 67

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtctagtccg ccaagtctag catatggcca ccatgtggct gcag 44

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aaaataaaaa ttttaaggcg gcatgccaat cgccgcgagt tctatgtaag cag 53

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtctagtccg ccaagtctag catatggcca ccatgaacgc tacacactgc 50

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtctagtccg ccaagtctag catatggcca ccatggagac agacacac 48

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtctagtccg ccaagtctag catatggcca cc 32

<210> 25

<211> 11522

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct ggccgccgtc atgagcgacc 420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaggcagacg 1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960

acaattctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740

tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa 7560

gtctagcata tgggcgcgcc ctcagcatcg attcaattcg ccaccatggt gagcaagggc 7620

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 7680

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 7740

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 7800

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 7860

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 7920

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 7980

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 8040

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 8100

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 8160

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 8220

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 8280

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtagtctag agtcgacccg 8340

ggcggccgca actaacttaa gctagcaacg gtttccctct agcgggatca attccgcccc 8400

ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata 8460

tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg 8520

tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt 8580

tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag 8640

cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc 8700

cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga 8760

tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg 8820

cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat 8880

gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc 8940

tttgaaaaac acgataatac catgaccgag tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc 9000

gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg 9060

cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc 9120

ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg 9180

gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg 9240

cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg 9300

gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac 9360

caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc 9420

gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg 9480

ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg 9540

acccgcaagc ccggtgcctg agaattggca agctgcttac atagaactcg cggcgattgg 9600

catgccgcct taaaattttt attttatttt ttcttttctt ttccgaatcg gattttgttt 9660

ttaatatttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgcg tcgaggggaa ttaattcttg 9720

aagacgaaag ggccaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 9780

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 9840

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 9900

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 9960

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 10020

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 10080

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 10140

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 10200

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 10260

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 10320

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 10380

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 10440

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 10500

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 10560

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 10620

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 10680

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 10740

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 10800

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 10860

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 10920

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 10980

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 11040

gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 11100

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 11160

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 11220

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 11280

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 11340

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 11400

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 11460

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcga gctctaatac gactcactat 11520

ag 11522

Claims

1.一种RNA复制子，按5’-3’方向，所述RNA复制子包括：5’和3’非翻译区；非结构蛋白基因编码区、亚基因组启动子、目的基因编码区；其非结构蛋白基因编码区发生(I)～(III)任意一种突变：

2.根据权利要求1所述的RNA复制子，其特征在于，所述5’和3’非翻译区、非结构蛋白基因编码区和亚基因组启动子来源于甲病毒、黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒或杯状病毒；

优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒或塞姆利基森林病毒；所述黄病毒为登革热病毒或昆津病毒；所述小RNA病毒为脊髓灰质炎病毒或人鼻病毒；所述副粘病毒为犬痘热病毒；所述杯状病毒为猫杯状病毒；

更优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒。

3.根据权利要求1所述的RNA复制子，其特征在于，所述目的基因包括肿瘤特异性或相关抗原、病原体特异性或相关抗原、细胞因子或其受体、趋化因子或其受体、生长因子或其受体、抗体蛋白、双特异性抗体蛋白、细胞因子抗体融合蛋白和免疫检查点相关蛋白中的至少一种；优选地，所述细胞因子为GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-12或IL-15。

4.根据权利要求1所述的RNA复制子，其特征在于，所述突变的方法为PCR定点突变；

优选地，所述PCR定点突变的引物包括：

G357C F：5’-GAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCC-3’；

G357C R：5’-GCTCATGACGGCGGCGAGCTCCTTCATTTTCTTGTCC-3’；

G1569A/A1572C/C1575T F：

5’-GGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGG-3’；

G1569A/A1572C/C1575T R：

5’-TAACATCAAGTCGACATCGGCTTCCAGAGTGGGCTCCTCAACATC-3’；

A3821T F:

5’-CATTGGTGCTATAGCGCGGCTGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAAC-3’；

T7VEESmaI R:5’-GCTTAAGTTAGTTGCGGCCGCCCGGGTCGACTCTAG-3’；

T3922C F：5’-GCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAAC-3’；

T3922C R：5’-TGAAAGCTTGTAAGGATTGTGCGTACGGGCCTTG-3’；

G3892C F 5’-CTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTAC-3’；

G3892C R 5’-CCTTGCGATCGTACCGAATGAATACAAACAGAACTTC-3’；

A4714G F 5’-TATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCG-3’；

A4714G R 5’-TAATACTGCTCATGCCTTCTCCGAGGATATACATGC-3’。

5.一种载体，包含权利要求1～4任一项所述RNA复制子。

6.一种细胞，包含权利要求5所述载体。

7.权利要求1～4任一项所述RNA复制子在(I)～(V)任一项中的应用：

(I)递送目的基因；

(II)实现目的基因的长效表达；

(III)提高目的基因的表达量；

(IV)基因治疗；

(V)疫苗研发。

8.一种组合物，包含权利要求1～4任一项所述RNA复制子或权利要求5所述载体。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药用稀释剂、药用赋形剂、药用载体和药用载剂中的至少一种；优选地，所述组合物中还可包含其他药物联合使用，所述药物包括但不限于：单克隆抗体药物、双特异性抗体药物、抗体偶联药物、融合蛋白药物、核酸类药物、化学药物、血液制品药物、脂类药物或中药提取物；

优选地，所述药用载体为基于阳离子脂质的市售转染试剂、非病毒载体、高分子膜、仿生膜、生物膜或病毒载体；

所述转染试剂包括但不限于Lipofectamine2000、Lipofectamine3000、Lipofectamine8000、Lipofectamine LTX、Lipofectamine RNAiMAX、LipofectamineMessengerMAX或Invivofectamine 3.0；

所述非病毒载体包括但不限于阳离子聚合物、阳离子脂质体、阴离子脂质体、胶束、无机纳米颗粒或微球；

所述高分子膜、仿生膜或生物膜，包括但不限于细胞膜、外泌体或细胞外囊泡；所述病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒或病毒样颗粒；

优选地，所述纳米载体包括但不限于多聚阳离子肽、阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、辅助脂质或两亲性化合物；

优选地，所述纳米载体的粒径为20～350nm，电荷为-40～50mV。

10.一种用于在生物体表达目的基因的方法，其包含以下步骤：向所述生物体中施用权利要求1～4任一项所述的RNA复制子或权利要求5所述的载体；优选地，所述生物体为原核生物或真核生物。