CN102061312A - 一种表达icp47基因的腺病毒载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种表达ICP47基因的腺病毒载体及其构建方法，其特征是该载体包含编码单纯疱疹病毒1型ICP47基因的表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。此外在ICP47基因的5’端连有6×His片段，可表达融合基因6His-ICP47，能够在真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白。表达ICP47基因的腺病毒载体，可降低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期表达，用于基因治疗、器官组织移植或细胞移植等方面。

Description

一种表达ICP47基因的腺病毒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术基因治疗领域，特别是一种表达ICP47基因的腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

基因治疗的基本原理在于通过目的基因的转移，目的基因是否准确地定向导人靶细胞，并能有效地表达，将直接影响基因治疗的安全性和治疗效率。但目前，临床基因治疗处于一种保守的阶段，仍存在很多障碍，其中受者对载体及表达基因产物的排斥反应是最为突出的问题，而传统的免疫抑制剂几乎都能抑制人体的免疫系统，增加病人催患感染和肿瘤的危险性。因此，基因治疗的研究越来越重视诱导特异性免疫耐受，而不再过分地关注有效的免疫抑制剂。

诱导特异性免疫耐受只涉及移植排斥的淋巴细胞，而不影响其它淋巴细胞的功能，是解决排斥的最理想方法。迄今已发展出许多诱导耐受的方案，主要包括降低MHCⅠ类分子表达，抑制DC细胞成熟、阻断共刺激因子通路等方法。      

广泛分布于机体组织细胞上主要组织相容性复合体(MHC)不仅与移植排斥有关，而且广泛参与免疫应答的诱导和调节，所以具有很重要的免疫学意义。MHC能与细胞加工处理的抗原肽结合，特异性与TCR结合后成为使相应的T淋巴细胞活化的信号之一。MHC-类分子则与细胞加工处理的内源性抗原肽结合进行抗原的递呈，引起CD8+T细胞的活化。MHC-Ⅱ类分子能与细胞加工处理的外源性抗原肽结合进行抗原的递呈，引起CD4+T细胞的活化。

过去曾一度认为MHC-Ⅰ类分子仅能递呈内源性抗原肽，即引起CD8+T细胞活化的APCs(Antigen Presenting Cells)只是能产生内源性抗原的靶细胞，然而，越来越多的证据表明，MHC-I类分子也能够递呈外源性抗原诱导反应，具有吞噬功能的APC在激活CTL的应答过程中发挥着关键性作用。研究发现许多病毒在其生活周期的不同阶段可以干扰MHC I类抗原呈递，从而产生病毒逃逸，减少机体对病毒的清除。腺病毒E3-gpl9k蛋白能与MHC-I结合，使其固定在内质网膜上，而不是分泌到病毒感染细胞表面，大大降低病毒入侵细胞的MHC-1表达，从而抑制了体内特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对病毒感染细胞的杀伤作用，逃避机体的免疫清除，增加被感染细胞的在体内存活时间，人为的将腺病毒E3-gpl9k蛋白基因导入移植的供体细胞，可以延长供体细胞在受体中存活时间，以利于目的基因的长期表达。而不需要免疫抑制剂。此外，艾伦·P·埃舍尔等构建了可以编码E3-gp19k基因的质粒，用于预防、延迟或治疗包括Ⅰ型糖尿病在内的多种自身免疫性疾病，其研究发现，给NOD小鼠预防接种含有E3-GP19k质粒后，糖尿病的发病延迟，并降低糖尿病的发病率，YinYL等研究发现EBV能翻译一个它复制所需，但不能被MHCI抗原呈递的EBNA-1，从而有效避免针对病毒蛋白CTL的产生和病毒特异性效应CTL识别感染细胞。

目前，临床基因治疗处于一种保守的阶段，仍存在很多障碍，其中受者对载体及表达基因产物的排斥反应是最为突出的问题，而传统的免疫抑制剂几乎都能抑制人体的免疫系统，增加病人催患感染和肿瘤的危险性。因此，基因治疗的研究越来越重视诱导特异性免疫耐受，而不再过分地关注有效的免疫抑制剂。HSV-1立即早期基因产物-ICP47（infected cell protein 47），它所针对的是MHC-1抗原呈递过程中决定抗原呈递效率的重要蛋白之一-TAP。ICP47通过与免疫性肽段竞争结合TAP肽结合位点，抑制病毒抗原肽被有效地转运到ER腔内与新合成的MHC I分子结合，削弱了TAP的肽转运功能，导致不稳定的空载MHCI分子出现，在APC细胞表面MHCI的表达量显著下降，直接干扰了MHCI途径对CTL的激活，使感染的细胞逃脱了宿主的免疫清除。因此，ICP47是HSV 1逃避宿主免疫反应的重要手段。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种表达ICP47基因的腺病毒载体及其构建方法，本发明在腺病毒载体上连接ICP47基因片段，构建可介导免疫耐受的腺病毒载体，期待其能降低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期表达，为基因治疗、器官组织移植或细胞移植等提供一种新的探索方向。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种表达ICP47基因的腺病毒载体，该载体包含编码单纯疱疹病毒1型ICP47基因的表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。

本发明所述的重组腺病毒载体，在ICP47基因的5’端连有6×His片段，可表达融合基因6His-ICP47，能够在真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白，便于蛋白的纯化，用于抗体研制和生产。

本发明的腺病毒载体的构建方法，如下：

单纯疱疹病毒1型ICP47基因双酶切构建于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后，将6×His片段连接于ICP47基因的5’端，PmeI单酶切后与腺病毒包装质粒pAdEasy-1进行同源重组，构建pAdEasy-6His-ICP47，Pac I单酶切后转染293A细胞进行病毒包装，构建重组腺病毒载体r6His-ICP47。

本发明所述的重组腺病毒载体能够在真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白，降低机体对载体及表达基因产物的排斥反应，以利于基因的长期表达，可用于基因治疗、器官组织移植或细胞移植等方面。

附图说明

图1为PCR扩增图像

图2为腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV图谱

图3为腺病毒包装质粒pAdEasy-1图谱

图4重组质粒pTrack-ICP47 Hind Ⅲ和EcoR V双酶切鉴定图像

图5重组质粒pTrack-6His-ICP47 Kpn I和EcoR V双酶切鉴定图像

图6 pAdTrack-6His-ICP47的反向测序结果

图7同源重组结果分析图像

图8重组质粒pAdEasy-6His-ICP47 Pac I酶切鉴定

图9重组腺病毒载体转染293A细胞

图10 Western-blot图像。

具体实施方式

实施例1  扩增ICP47目的基因

NCBI网站查找HSV-1型ICP47的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，设计的引物为：

sense A：5′﹣GGC AAGCTT ATGTCGTGGGCCCTGGAAATG﹣3′

anti-sense B：5′﹣GGCC GATATC TCAACGGGTTACCGGATTACG﹣3′

上游引物和下游引物中加黑斜体序列分别为Hind Ⅲ和EcoR V识别位点。引物由上海赛百盛生物工程公司合成。

临床采集的HSV-1型DNA阳性脑脊液标本进行病毒提取DNA提取，操作依照试剂盒说明书进行，将提取所得HSV-1 DNA置于-20℃保存，以供PCR扩增。

依照说明书要求，依次加入模板HSV-1 DNA，上下游引物，Pfu DNA Polymerase，dNTPs，5×PCR Buffer及适量的ddH₂O，建立50μl PCR反应体系，设置PCR仪反应程序：95℃预变性2min后， 95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 15s，进行35个循环，循环结束后72℃延伸 5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。结果发现标本2号和标本4号在286bp左右处出现一清晰的特异性条带，与预期片段大小相同，见图1。

实施例2  pTrack-ICP47的构建

腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV和包装质粒pAdEasy-1图谱见图2，图3。PCR扩增产物和腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV进行EcoR V和Hind Ⅲ分步双酶切反应，酶切成功后胶回收PCR片段和pAdtrack-CMV载体片段，T4 DNA Ligase酶16℃过夜连接后，转化感受态E.coli DH5α，对生长出的菌落进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，筛选阳性克隆。

限制性核酸内切酶Hind Ⅲ和EcoR V分别对重组质粒pTrack-ICP47和空质粒pTrack-CMV进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线下观察，重组质粒pTrack-ICP47酶切后可见约267bp的插入片段，结果与ICP47预期片段大小相符合，而空质粒pTrack-CMV酶切后没有出现对应的片段，见图4。

实施例3  pAdTrack-6His-ICP47载体的构建

6×His的正、反义链中分别含有限制性核酸内切酶Kpn I和Hind Ⅲ的酶切粘性末端。

Sense H1:  5’-CATGCATCATCATCATCATCATA-3’ 

Anti-sense H2:  5’-AGCTTATGATGATGATGATGATGCATGGTAC-3’

取上海赛百盛生物工程公司合成的6×His tag正，反义链进行退火反应，退火结束后，乙醇沉淀纯化，与KpnI和HindⅢ双酶切后的pAdTrack-CMV-ICP47进行连接反应，转化感受态E.coli DH5α，筛选重组克隆，PCR和酶切鉴定。

限制性核酸内切酶Kpn I和EcoR V分别对重组质粒pTrack-6His-ICP47和空质粒pTrack-CMV进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，重组质粒pTrack-6His-ICP47酶切后可见约290bp的插入片段，结果与6His-ICP47融合基因预期片段大小相符合，而空质粒pTrack-CMV酶切后没有出现对应的片段，见图5。

PCR和酶切鉴定阳性后测序鉴定，测序正确后命名pAdTrack-6His-ICP47。反向测序结果见图6。

实施例4  重组质粒pTrack-6His-ICP47与pAdEasy-1在感受态BJ5183中同源重组

构建成功的重组质粒pAdTrack-6His-ICP47载体和空载体pAdTrack-CMV分别测定OD260，计算DNA浓度后分别进行Pme I酶切，37℃酶切3h后，琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，酶切成功后进行去磷酸化反应，胶回收后进行共转化试验。

(1)将约1μgPme I单酶切线性化的穿梭质粒及约100ng/μl的病毒骨架质粒加入感受态BJ5183细菌中，混匀，冰浴保存30min。42℃水浴中90sec。冰浴5min。加入400μl液体LB培养基，混匀后置于37℃摇床缓慢振摇60min。

(2)5000rpm离心1min，弃上清400μl左右，剩余上清将菌体沉淀吹打混匀，涂于Kana⁺LB培养板，37℃培养过夜。

次日挑取平板上长出的菌落，37℃摇菌，提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，验证质粒的大小，阳性重组质粒大小约40kb，pAdtrak-CMV质粒对照大小约为9220bp。电泳结果中大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定，见图7。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb），及一条小片段（约3.0或4.5kb），基本确定为阳性克隆。结果见图8。构建成功的腺病毒载体命名为pAd Easy-6His-ICP47和pAdEasy-Track。

实施例5  腺病毒载体的包装

Pac I线性化的同源重组质粒4μg采用脂质体转染法转染生长至70％汇合的293A细胞，5% CO₂，37℃培养过夜，次日换液。每日观察细胞是否出现细胞病变效应(cytopathic effects，CPE) 和荧光表达。

转染后第5-6天，各培养瓶开始出现少量CPE细胞，之后CPE细胞数量逐渐增加，约转染后7天，细胞出现片状脱壁漂浮，荧光表达也达到80%以上，10天左右细胞全部漂浮且荧光表达几乎全部阳性，见图9。图9a为正常293A细胞；b为重组腺病毒转染293A细胞48h；c为重组腺病毒转染293A细胞第4d；d为重组腺病毒转染293A细胞第5d；e为重组腺病毒转染293A细胞第6d；f为重组腺病毒转染293A细胞第7d，g为重组腺病毒转染293A细胞第8d，h为重组腺病毒转染293A细胞第10d。

收集细胞。-80℃与37℃反复冻融3个次，4℃12000g离心5分钟，取上清即得到原始病毒液，取5μl病毒上清进行PCR鉴定重组腺病毒产生。鉴定正确的重组病毒命名为r-6His-ICP47，空载病毒命名为r-Track。

重组病毒扩增，经CsCl连续梯度离心纯化，滴度测定后，病毒上清分装成500μl/管，-80℃保存。

实验例6  Western-blot试验

生长至70%汇合的293A细胞，加入病毒上清液感染细胞，当所有细胞变圆漂浮且荧光表达接近100%时，收集细胞，加入预冷的PBS洗涤细胞3次后，每瓶细胞加200μl含PMSF的RIPA裂解液，吹打混匀，冰上裂解30min。12000rpm离心5分钟，离心后80μl上清加入20μl还原型5×SDS上样缓冲液，变性5分钟，30μl样品上样，电泳，浓缩胶时用80-100V，到分离胶以后用150-200V，电泳至溴酚兰刚跑出即终止电泳，进行转膜，丽春红染色，观察到膜上的蛋白条带后，将膜晾干，依次进行奶粉封闭，TBST漂洗，一抗孵育，TBST漂洗，二抗孵育，TBST漂洗，最后进行化学发光反应，显影、定影后，室温下晾干，拍照。结果见图10。

实施例7  CTL杀伤试验

生长至70%汇合的293A细胞，加入病毒上清液感染细胞，当所有细胞变圆漂浮且荧光表达接近100%时，收集细胞，PBS调整细胞浓度为1×10⁶/ml。反复冻融5次，离心后将上清经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。

采集健康人肝素抗凝外周血，生理盐水与抗凝血l:1稀释后，以2：1比例加入淋巴细胞分离液面上，2000rpm离心20min，吸取白色云雾状狭带细胞，PBS洗涤2次后，含10% FBS的RPMI-1640重悬细胞，接种于6孔培养板，37℃，5%C0₂培养3小时。贴壁生长者为单核细胞，未贴壁细胞富含大量的T淋巴细胞。

未贴壁细胞离心后用含10％FBS的RPMI-1640培养液重悬细胞，加入终浓度为5ng/ml的rhIL-2， 37℃，5%CO₂培养。

贴壁细胞每孔中加入含10％FCS的RPMll640培养液，加入终浓度为100ng/mlGM-CSF和IL-4，37℃，5%C0₂培养，第3d，贴壁细胞即为DC细胞。换液后，加入40 μl/孔的抗原肽，第8d收集各组悬浮的DC，1:50的比例与T淋巴细胞混合培养3d。

收集各组靶细胞和DC刺激后的T淋巴细胞，加入96孔板，调节效靶比为20:1，每组设3个复孔，37℃，5%CO₂培养28h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μL，孵育4h，离心弃上清，加入150μl/孔DMSO，振荡10min后，酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔光吸收度，记录结果。

T淋巴细胞杀伤活性=靶细胞对照组OD值-（实验组OD值－效应对照组OD值）/靶细胞对照组OD值×100％

结果显示，致敏T淋巴细胞对293A未转染组的杀伤率为(33.97±6.19)%，明显低于其对r-Track转染293A的杀伤率(57.33±7.77) %和对r-6His-ICP47转染293A的杀伤率(45.15±6.20) %，并且致敏T淋巴细胞对r-6His-ICP47转染293A的杀伤率低于r-Track转染293A的杀伤率(P<0.05)，表达ICP47基因的重组腺病毒载体具有降低CTL杀伤活性的作用，有利于重组基因在体内的长期表达，在基因治疗、器官组织移植或细胞移植等方面具有很大的应用潜力。

Claims (4)

1.一种表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于：该载体包含编码单纯疱疹病毒1型ICP47基因的表达区，能够在真核细胞中表达单纯疱疹病毒1型ICP47蛋白。

2.根据权利要求1所述的表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于：在ICP47基因的5’端连有6×His片段，可表达融合基因6His-ICP47。

3.根据权利要求1所述的表达ICP47基因的腺病毒载体，其特征在于：该载体能够在真核细胞中表达6His-ICP47融合蛋白，便于蛋白的纯化，用于抗体研制和生产。

4.一种权利要求1中所述表达ICP47基因的腺病毒载体的构建方法，其特征在于：单纯疱疹病毒1型ICP47基因双酶切构建于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后，将6×His片段连接于ICP47基因的5’端，PmeI单酶切后与腺病毒包装质粒pAdEasy-1进行同源重组，构建重组腺病毒载体pAdEasy-6His-ICP47，Pac I单酶切后转染293A细胞进行病毒包装，构建重组腺病毒r6His-ICP47。

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