BR122022004041B1 - Proteína de ligação tipo anticorpo e composição farmacêutica - Google Patents

Proteína de ligação tipo anticorpo e composição farmacêutica Download PDF

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Carsten Corvey
Christian Lange
Danxi Li
Vincent Mikol
Anke Steinmetz
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Abstract

A presente invenção fornece proteínas de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, em que cada par de polipeptídeos formando uma proteína de ligação tipo anticorpo possui domínios variáveis duplos tendo uma orientação cruzada. A invenção fornece ainda método de fabricação das referidas proteínas de ligação, bem como molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira e composição farmacêutica.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se a proteínas de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo para formar quatro sítios de ligação ao antígeno, onde cada par de polipeptídeos formando a proteína de ligação tipo anticorpo possui domínios variáveis duplos tendo orientação cruzada. A invenção refere-se também a métodos para produção de tais proteínas de ligação tipo antígeno.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Anticorpos IgG de ocorrência natural são bivalentes e monoespecíficos. Anticorpos biespecíficos tendo especificidades de ligação para dois antígenos diferentes podem ser produzidos usando tecnologias recombinantes e são projetados para terem aplicações clínicas amplas. É bem conhecido que moléculas de anticorpo IgG completas são moléculas de formato em Y compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia leve consiste em dois domínios, o domínio N-terminal sendo conhecido como o domínio (ou região) variável ou VL e o domínio C-terminal sendo conhecido como o domínio constante (ou CL) (domínios constante kappa (CK) ou constante lambda (CÀ)). Cada cadeia pesada consiste em quatro ou cinco domínios, dependendo da classe do anticorpo. O domínio N-terminal é conhecido como o domínio (ou região) variável (ou VH), que é seguido pelo primeiro domínio constante (ou CH1), a região de dobra e então os segundo e terceiro domínios constantes (ou CH2 ou CH3). Em um anticorpo montado, os domínios VL e VH se associam para formar um sítio de ligação ao antígeno. Também, os domínios CL e CH se associam para manter uma cadeia pesada associada com uma cadeia leve. Os dois heterodímeros de cadeia pesada-leve se associam através de interação dos domínios CH2 e CH3 e interação entre as regiões de dobra e as duas cadeias pesadas.
[003] É conhecido que digestão proteolítica de um anticorpo pode levar à produção de fragmentos de anticorpo (Fab ou Fab2). Tais fragmentos do anticorpo integral podem exibir atividade de ligação ao antígeno. Fragmentos de anticorpo podem ser também produzidos recombinantemente. Fragmentos Fv, consistindo apenas nos domínios variáveis das cadeias pesada e leve associadas uns aos outros, podem ser obtidos. Esses fragmentos Fv são monovalentes para ligação ao antígeno. Fragmentos menores tais como domínios variáveis individuais (anticorpos de domínio ou dABs; Ward e outros, 1989, Nature 341(6242): 544-46) e regiões de determinação de complementaridade individuais ou CDRs (Williams e outros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(14): 5537-41) também mostraram reter as características de ligação do anticorpo parental, embora a maioria dos anticorpos de ocorrência natural geralmente precise ambos um VH e um VL para reter potência de ligação integral.
[004] Construtos de fragmento variável de cadeia simples (scFv) (Single Chain Variable Fragment) compreendem um domínio VH e um VL de um anticorpo contidos em uma cadeia de polipeptídeo única onde os domínios são separados por um ligante flexível de comprimento suficiente (mais de 12 resíduos de aminoácido), que força interação intramolecular, permitindo automontagem dos dois domínios em um sítio de ligação de epítopo funcional (Bird e outros, 1988, Science 242(4877):423-26). Essas proteínas pequenas (PM ~25.000 Da) geralmente retêm especificidade e afinidade com seu antígeno em um polipeptídeo único e podem prover um bloco de formação conveniente para moléculas específicas de antígeno, maiores.
[005] Uma vantagem do uso de fragmentos de anticorpo ao invés de anticorpos integrais em diagnóstico e terapia se encontra em seu tamanho menor. Eles são prováveis de ser menos imunogênicos do que anticorpos integrais e mais capazes de penetrar em tecidos. Uma desvantagem associada com o uso de tais fragmentos é que eles têm apenas um sítio de ligação ao antígeno, levando à avidez reduzida. Ainda, devido ao seu tamanho pequeno, eles são eliminados muito rápido do soro, e então mostram uma meia-vida curta.
[006] Tem sido de interesse produzir anticorpos biespecíficos (BsAbs) que combinem os sítios de ligação ao antígeno de dois anticorpos dentro de uma molécula única, e, então, fossem capazes de ligar dois antígenos diferentes simultaneamente. Além de aplicações para propósitos de diagnóstico, tais moléculas abrem caminho para novas aplicações terapêuticas, por exemplo, através do redirecionamento de sistemas efetores potentes a áreas doentes (onde células cancerosas frequentemente desenvolvem mecanismos para suprimir respostas imunes normais disparadas por anticorpos monoclonais, tal como citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) ou citotoxidez dependente de complemento (CDC) (Complement-Dependent Cytotoxicity) ou aumentando atividades de neutralização ou estimulação de anticorpos. Este potencial foi reconhecido cedo, levando a várias abordagens para obtenção de tais anticorpos biespecíficos. Tentativas iniciais em acoplar as especificidades de ligação de dois anticorpos integrais contra antígenos alvo diferentes para propósitos terapêuticos utilizaram moléculas de heteroconjugado quimicamente fundidas (Staerz e outros, 1985, Nature 314(6012): 62831).
[007] Anticorpos biespecíficos foram originalmente feitos fundindo dois hibridomas, cada um capaz de produzir uma imunoglobulina diferente (Milstein e outros, 1983, Nature 305(5934): 537-40), mas a complexidade de espécies (até dez espécies diferentes) produzidas em cultura de célula tornou a purificação difícil e cara (George e outros, 1997, THE ANTIBODIES 4: 99-141 (Capra e outros, Harwood Academic Publishers)). Usando este formato, um anticorpo IgG2a de camundongo e um IgG2b de rato foram produzidos juntos na mesma célula (por exemplo, ou como uma fusão quadroma de dois hibridomas ou em células CHO engenheiradas). Devido ao fato das cadeias leves de cada anticorpo se associarem preferivelmente com as cadeias pesadas de suas espécies cognatas, três espécies de anticorpo principais são montadas: os dois anticorpo parentais e um heterodímero dos dois anticorpos compreendendo um par de cadeia pesada/leve de cada, associando através de suas porções Fc. O heterodímero desejado pode ser purificado a partir desta mistura porque suas propriedades de ligação à Proteína A são diferentes daquelas dos anticorpos parentais: IgG2b de rato não se liga à Proteína A, enquanto o IgG2a de camundongo sim. Consequentemente, o heterodímero camundongo-rato se liga à Proteína A, mas elui em um pH maior do que o homodímero de IgG2a de camundongo, e isso torna purificação seletiva do heterodímero biespecífico possível (Lindhofer e outros, 1995, J. Immunol. 155(1): 219-25). O heterodímero biespecífico resultante é integralmente não humano, desta maneira altamente imunogênico, o que poderia ter efeitos colaterais prejudiciais (por exemplo, reações "HAMA" ou "HARA") e/ou neutralizar o agente terapêutico. Persistiu a necessidade de biespecíficos engenheirados com propriedades superiores que possam ser prontamente produzidos em alto rendimento a partir de cultura de célula de mamífero.
[008] Apesar dos resultados promissores obtidos usando anticorpos heteroconjugados ou biespecíficos produzidos a partir de fusões celulares conforme acima mencionado, vários fatores fazem com que eles sejam impraticáveis para aplicações terapêuticas em larga escala. Tais fatores incluem: eliminação rápida de heteroconjugados in vivo, as técnicas intensivas de laboratório requeridas para geração de qualquer tipo de molécula, a necessidade de purificação extensiva de heteroconjugados longe de anticorpos homoconjugados ou monoespecíficos e os rendimentos geralmente baixos obtidos.
[009] Engenharia genética tem sido usada com grande frequência para projetar, modificar e produzir anticorpos ou derivados de anticorpo com um conjunto desejado de propriedades de ligação e funções efetoras. Uma variedade de métodos recombinantes foi desenvolvida para produção eficiente de BsAbs, ambos como fragmentos de anticorpo (Carter e outros, 1995, J. Hematother. 4(5): 463-70; Pluckthun e outros, 1997, Immunotechnology 3(2): 83-105; Todorovska e outros, 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2); 47-66) e formatos de IgG de comprimento integral (Carter, 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15).
[0010] Combinação de dois scFvs diferentes resulta em formatos de BsAbs com massa molecular mínima, chamados sc-BsAbs ou Ta- scFvs (Mack e outros, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(15): 7021-25; Mallender e outros, 1994, J. Biol. Chem. 269(1): 199-206). BsAbs foram construídos fundindo geneticamente dois scFvs a uma funcionalidade de dimerização tal como um zíper de leucina (Kostelny e outros, 1992, J. Immunol. 148(5): 1547-53; de Kruif e outros, 1996, J. Biol. Chem. 271(13): 7630-34).
[0011] Diacorpos são fragmentos de anticorpo bivalentes e biespecíficos pequenos. Os fragmentos compreendem um VH conectado a um VL na mesma cadeia de polipeptídeo, usando um ligante que é muito curto (menos do que 12 resíduos de aminoácido) para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios são forçados para emparelhar molecularmente com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Os fragmentos de anticorpo dimérico, ou "diacorpos", são bivalentes e biespecíficos (Hollinger e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14): 6444-48). Diacorpos são similares em tamanho a um fragmento Fab. Cadeias de polipeptídeo de domínios VH e VL unidos com um ligante entre 3 e 12 resíduos de aminoácido formam predominantemente dímeros (diacorpos), enquanto com um ligante entre 0 e 2 resíduos de aminoácido, trímeros (triacorpos) e tetrâmeros (tetracorpos) predominam. Em adição ao comprimento do ligante, o padrão exato de oligomerização parece depender da composição, bem como da orientação dos domínios variáveis (Hudson e outros, 1999, J. Immunol. Methods 231(1-2): 177-89). A capacidade de previsão da estrutura final de moléculas de diacorpo é muito pobre.
[0012] Embora construtos à base de sc-BsAb e diacorpo mostrem potencial clínico interessante, foi mostrado que tais moléculas não covalentemente associadas não são suficientemente estáveis sob condições fisiológicas. A estabilidade geral de um fragmento scFv depende da estabilidade intrínseca dos domínios VL e VH, bem como da estabilidade da interface do domínio. Estabilidade insuficiente da interface VH-VL de fragmentos scFv tem frequentemente sido sugerida como uma causa principal de inativação de scFv irreversível, uma vez que abertura transiente da interface, que seria permitida pelo ligante de peptídeo, expõe fragmentos hidrofóbicos que favorecem agregação e então instabilidade e rendimento de produção pobre (Worn e outros, 2001, J. Mol. Biol. 305(5): 989-1010).
[0013] Um método alternativo de fabricação de proteínas de ligação a antígeno bivalente biespecífico a partir de domínios VH e VL é descrito na Patente U.S. No. 5.989.830. Tais configurações de cabeça dupla e Fv duplo são obtidas através da expressão de um vetor biscistrônico, que codifica duas cadeias de polipeptídeo. Na configuração Fv duplo, os domínios variáveis de dois anticorpos diferentes são expressos em uma orientação em tandem em duas cadeias separadas (uma cadeia pesada e uma cadeia leve), onde uma cadeia de polipeptídeo tem duas vezes um VH em série separado por um ligante de peptídeo (VH1-ligante-VH2) e a outra cadeia de polipeptídeo consiste em domínios VL complementares conectados em séries por um ligante de peptídeo (VL1-ligante-VL2). Na configuração de cabeça dupla cruzada, os domínios variáveis de dois anticorpos diferentes são expressos em uma orientação em tandem em duas cadeias de polipeptídeo separadas (uma cadeia pesada e uma cadeia leve), onde uma cadeia de polipeptídeo tem duas vezes um VH em série separado por um ligante de peptídeo (VH1-ligante-VH2) e a outra cadeia do polipeptídeo consiste em domínios VL complementares conectados em série por um ligante de peptídeo na orientação oposta (VL2-ligante-VL1). Modelagem molecular dos construtos sugeriu que o tamanho do ligante fosse longo o suficiente para se estender 30-40 Â (15-20 resíduos de aminoácido).
[0014] Aumento da valência de um anticorpo é de interesse uma vez que ele aumenta a afinidade funcioal deste anticorpo devido ao efeito de avidez. Complexos de proteína polivalente (PPC) (Polyvalent Protein Complexes) com uma valência alta são descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. US 2005/0003403 A1. PCCs compreendem duas cadeias de polipeptídeo geralmente dispostas lateralmente uma com relação à outra. Cada cadeia de polipeptídeo compreende tipicamente três ou quatro "regiões v", que compreendem sequências de aminoácido capazes de formar um sítio de ligação ao antígeno quando combinadas com uma região v correspondente na cadeia de polipeptídeo oposta. Até cerca de seis "regiões v" podem ser usadas em cada cadeia de polipeptídeo. As regiões v de cada cadeia de polipeptídeo são conectadas linearmente umas às outras e podem ser conectadas através de regiões de ligação interespaçadas. Quando dispostas na forma do PPC, as regiões v em cada cadeia de polipeptídeo formam sítios de ligação ao antígeno individuais. O complexo pode conter uma ou várias especificidades de ligação.
[0015] Uma estratégia foi proposta por Carter e outros (Ridgway e outros, 1996, Protein Eng. 9(7): 617-21; Carters, 2011, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15) para produzir um heterodímero de Fc usando um conjunto de mutações "knob-into-hole" no domínio CH3 de Fc. Essas mutações levaram à alteração de complementaridade de empacotamento de resíduo entre a interface de domínio CH3 dentro do núcleo hidrofóbico estruturalmente conservado de maneira que formação do heterodímero é favorecida comparado com homodímeros, o que obtém boa expressão de heterodímero a partir de cultura de célula de mamífero. Embora a estratégia tenha levado a rendimento de heterodímero maior, os homodímeros não foram completamente suprimidos (Merchant e outros, 1998, Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81.
[0016] Gunasekaran e outros exploraram a possibilidade de retenção da integridade do núcleo hidrofóbico enquanto dirigindo a formação de heterodímero de Fc através da mudança da complementaridade de carga na interface de domínio CH3 (Gunasekaran e outros, 2010, J. Biol. Chem. 285(25): 19637-46). Levando vantagem do mecanismo de condução eletrostática, esses construtos mostraram promoção eficiente de formação de heterodímero de Fc com contaminação mínima de homodímeros através da mutação de dois pares de resíduos carregados perifericamente localizados. Em contraste com o projeto knob-into- hole, os homodímeros foram suprimidos uniformemente devido à natureza do mecanismo repulsivo eletrostático, mas não totalmente evitados.
[0017] Davis e outros descrevem uma abordagem de engenharia de anticorpo para converter homodímeros de Fc em heterodímeros através de interdigitação de segmentos de filamento β de domínios CH3 de IgG e IgA humanos, sem a introdução de ligações dissulfeto intercadeia extras (Davis e outros, 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202). Expressão de proteínas de fusão SEEDbody (Sb) por células de mamífero fornece heterodímeros de Sb em alto rendimento que são prontamente purificados para eliminar subprodutos em quantidade menor.
[0018] A Publicação de Pedido de Patente U.S. No. US 2010/331527 A1 descreve um anticorpo específico baseado em heterodimerização do domínio CH3, introduzindo em uma cadeia pesada as mutações H95R e Y96F no domínio CH3. Essas substituições de aminoácido se originam do domínio CH3 do subtipo IgG3 e vão heterodimerizar com uma estrutura principal de IgG1. Uma cadeia leve comum propensa a emparelhar com cada cadeia pesada é um pré-requisito para todos os formatos com base em heterodimerização através do domínio CH3. Um total de três tipos de anticorpos é então produzido: 50% tendo uma estrutura principal de IgG pura, um terço tendo uma estrutura principal mutada H95R e Y96F pura e um terço tendo duas cadeias pesadas diferentes (biespecíficas). O heterodímero desejado pode ser purificado a partir desta mistura porque suas propriedades de ligação com a Proteína A são diferentes daquelas dos anticorpos parentais: domínios CH3 derivados de IgG3 não se ligam à Proteína A, enquanto o de IgG1 sim. Consequentemente, o heterodímero se liga à Proteína A, mas elui em um pH maior do que o homodímero de IgG1 puro, e isso torna purificação seletiva do heterodímero biespecífico possível.
[0019] A Patente U.S. No. 7.612.181 descreve um anticorpo biespecífico de IgG de Domínio-Duplo-Variável (DVD-IgG) (DualVariable-Domain) que é baseado no formato Duplo-Fv descrito na Patente U.S. No. 5.989.830. Um formato biespecífico similar foi também descrito na Publicação de Pedido de patente U.S. No. US 2010/0226923 A1. A adição de domínios constantes às respectivas cadeias do Duplo-Fv (CH1-Fc para a cadeia pesada e domínio constante kappa ou lambda para a cadeia leva) levou a anticorpos biespecíficos funcionais sem qualquer necessidade de modificações adicionais (isto é, adição óbvia de domínios constantes para aumentar estabilidade). Alguns dos anticorpos expressos no formato DVD- Ig/TBTI mostram um efeito de posição na segunda posição de ligação ao antígeno (ou a mais interna) (Fv2). Dependendo da sequência e da natureza do antígeno reconhecido pela posição Fv2, este domínio de anticorpo exibe uma afinidade reduzida com seu antígeno (isto é, perda de associação (on-rate) em comparação com o anticorpo parental). Uma explicação possível para esta observação é que o ligante entre VL1 e VL2 se projeta para a região de CDR de Fv2, tornando o Fv2 um pouco inacessível para antígenos maiores. A segunda configuração de um fragmento de anticorpo biespecífico descrito na Patente U.S. No. 5.989.830 é a cabeça dupla cruzada (CODH) (Cross-over Double Head), tendo a orientação de domínios variáveis expressa em duas cadeias:
[0020] VL1-ligante-VL2, para a cadeia leve, e
[0021] VH2-ligante-VH1, para a cadeia pesada
[0022] A Patente '830 revela que um fragmento de anticorpo de cabeça dupla cruzada biespecífico (construto GOSA.E) retém atividade de ligação maior do que Duplo-Fv (vide página 20, linhas 2050 da patente '830) e revela ainda que este formato é menos impactado pelos ligantes que são usados entre os domínios variáveis (vide páginas 20-21 da patente '830).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0023] A invenção provê uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, onde duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[0024] e duas cadeias de polipeptídeo têm a estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
[0025] onde:
[0026] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0027] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0028] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0029] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0030] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[0031] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0032] Fc é a região de dobra de imunoglobulina e CH2, CH3 domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0033] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0034] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[0035] A invenção também provê uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo duas cadeias de polipeptídeo que formam dois sítios de ligação ao antígeno, onde uma primeira cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[0036] e uma segunda cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[0037] onde:
[0038] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0039] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0040] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0041] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0042] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[0043] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0044] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0045] e onde os primeiro e segundo polipeptídeos formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[0046] A invenção provê ainda um método de fabricação de uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, compreendendo identificação de um primeiro domínio variável de anticorpo que se liga a um primeiro antígeno alvo e um segundo domínio variável de anticorpo que se liga a um segundo antígeno alvo, cada um contendo um VL e um VH; designação ou a cadeia leve ou a cadeia pesada como cadeia modelo; designação do VL do primeiro domínio variável de anticorpo ou do segundo domínio variável de anticorpo como VL1; designação de um VL2, um VH1 e um VH2 de acordo com as fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
[0047] determinação de comprimentos máximo e mínimo para L1, L2, L3 e L4; geração das estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II; seleção de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II que se ligam ao primeiro antígeno alvo e ao segundo antígeno alvo quando combinadas para formar a proteína de ligação tipo anticorpo;
[0048] onde:
[0049] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0050] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0051] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0052] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0053] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[0054] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0055] Fc é a região de dobra de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina CH2, CH3; e
[0056] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0057] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado;
[0058] A invenção provê ainda um método de fabricação de uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, compreendendo identificação de um primeiro domínio variável de anticorpo que se liga a um primeiro antígeno alvo e um segundo domínio variável de anticorpo que se liga a um segundo antígeno alvo, cada um contendo um VLe um VH; designação ou da cadeia leve ou da cadeia pesada como cadeia modelo; designação do VL do primeiro domínio variável de anticorpo ou do segundo domínio variável de anticorpo como VL1; designação de um VL2, um VH1 e um VH2 de acordo com as fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[0059] determinação de comprimentos máximo e mínimo para L1, L2, L3 e L4; geração de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II; seleção de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II que se ligam ao primeiro antígeno alvo e ao segundo antígeno alvo quando combinaas para formar a proteína de ligação tipo anticorpo;
[0060] onde:
[0061] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0062] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0063] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0064] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0065] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[0066] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; e
[0067] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0068] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[0069] Modalidades específicas da invenção se tornarão evidentes a partir da descrição mais detalhada que segue de certas modalidades e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0070] Figura 1. Representação esquemática dos domínios de ligação ao antígeno Fv1 e Fv2 dentro da configuração de região V dupla e disposição de seus respectivos ligantes de peptídeo LL e LH no formato TBTI.
[0071] Figura 2. Diagrama esquemático (2D) dos domínios de ligação ao antígeno Fv1 (anti-IL4) e Fv2 (anti-IL-3) dentro da configuração de variável dupla cruzada (CODV) e a disposição de seus respectivos ligantes de peptídeo.
[0072] Figura 3. Representação esquemática do Fv anti-IL-4 e Fab anti-IL13 mostrando uma possível disposição espacial obtida através de ancoragem proteína-proteína de Fv de anti-IL4 e de Fv de anti-IL13.
[0073] Figura 4. Avaliação de habilidade de ligação tetravalente e biespecífica da proteína CODV em um ensaio BIACORE através de injeção dos dois antígenos sequencialmente ou simultaneamente em um chip revestido com proteína DVD-Ig. O sinal máximo observado pela injeção sequencial pode ser obtido através de co-injeção de ambos os antígenos, demonstrando saturação de todos os sítios de ligação.
[0074] Figura 5. Diagrama esquemático (2D) dos domínios de ligação ao antígeno dentro da configuração CODV e disposição de seu respectivo ligante de peptídeo LL (L1 e L2) e LH (L3 e L4). No painel A, a cadeia leve é mantida em um alinhamento "linear ou de molde", enquanto a cadeia pesada está na configuração "cruzada". No painel B, a cadeia pesada é mantida em um alinhamento "linear ou modelo" e a cadeia leve está na configuração "cruzada".
[0075] Figura 6. Representação esquemática de projeto CODV-Ig com base em se a cadeia leve ou cadeia pesada é usada como "molde".
[0076] Figura 7. Comparação de moléculas de TBTI/DVD-Ig ou CODV-Ig incorporando sequências anti-IL-4 e anti-IL13.
[0077] Figura 8. Comparação de formatos CODV-Fab e B-Fab em um ensaio citotóxico usando células NALM-6.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0078] A invenção provê proteínas de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, onde cada par de polipeptídeos que forma uma proteína de ligação tipo anticorpo possui domínios variáveis duplos tendo uma orientação cruzada. A invenção também provê métodos para produção de tais proteínas de ligação tipo antígeno.
[0079] Modelagem por computador previu que o projeto de cabeça dupla cruzada (CODH) da Patente U.S. No. 5.989.830 renderia um complexo onde ambos os sítios de ligação faceiam na direção oposta, sem as limitações sugeridas para a configuração Duplo-Fv da Patente U.S. No. 7.612.181. Em particular, modelagem por computador indicou que o comprimento dos ligantes de aminoácido entre o domínio variável não era crítico para o projeto de CODH, mas era importante para permitir acesso integral a ambos os sítios de ligação ao antígeno no projeto Duplo-Fv. Como com o formato DVD-Ig/TBTI, construtos de proteína de ligação tipo anticorpo foram preparados, onde domínios constantes foram ligados à configuração de CODH para formar proteínas de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, onde cada par de polipeptídeos formando uma proteína de ligação tipo anticorpo possui domínios variáveis duplos tendo uma orientação cruzada (isto é, CODH-Ig). Moléculas de CODH-Ig são esperadas possuir estabilidade significantemente aperfeiçoada comparado com moléculas de CODH (uma vez que DVD-Ig/TBTI possuía estabilidade aperfeiçoada com relação a moléculas Duplo-Fv).
[0080] A fim de testar a hipótese acima, uma molécula de CODH- Ig foi preparada usando as sequências de anticorpo anti-IL4 e antil- IL13 descritas na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. US 2010/0226923 A1. A molécula de CODH-Ig diferiu da molécula de CODH da US 2010/0226923 com relação aos comprimentos de ligantes de aminoácido separando os domínios variáveis nas respectivas cadeias de polipeptídeo. As moléculas de CODH-Ig foram expressas em células seguindo transfecção transiente e foram então purificadas através de cromatografia da Proteína A. Embora seus perfis de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (Size-Exclusion Chromatography) mostrassem níveis de agregação de 5-10%, nenhuma das moléculas de CODH-Ig era funcional, e então nenhuma das moléculas de CODH-Ig foi capaz de se ligar a todos os seus antígenos alvo. A falta de atividade de ligação ao antígeno pode ter sido devido a uma dimerização perturbada das regiões Fv das cadeias pesada e leve devido a comprimentos de ligante inadequados comprometendo a formação de parátopo correta. Como resultado, um protocolo foi desenvolvido para identificar ligantes de aminoácido adequados para inserção entre os dois domínios variáveis e o segundo domínio variável e domínio constante em ambas as cadeias de polipeptídeo pesada e leve de uma proteína de ligação tipo anticorpo. Este protocolo era baseado em ancoragem de proteína- proteína de modelos de homologia e experimentais das regiões FvIL4 e FvIL13, respectivamente, inclusão do domínio Fc1 no modelo e construção de ligantes apropriados entre as regiões FvIL4 e FvIL13 e entre o Fv e as regiões constantes Fc1.
[0081] Metodologias de DNA recombinante padrão são usadas para construir os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que formam as proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, incorporar esses polinucleotídeos em vetores de expressão recombinantes e introduzir tais vetores em células hospedeiro. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed.). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como geralmente realizado na técnica ou conforme aqui descrito. A menos que definições específicas sejam providas, a nomenclatura utilizada em ligação com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética e químicas médica e farmacêutica descritas aqui são aqueles bem conhecidos e geralmente usados na técnica. Similarmente, técnicas convencionais podem ser usadas para síntese química, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, administração e tratamento de pacientes.
Definições Gerais
[0082] Conforme utilizado de acordo com a presente invenção, os termos que seguem, a menos que de outro modo indicado, devem ser compreendidos ter os significados que seguem. A menos que de outra maneira requerido pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos no plural devem incluir o singular.
[0083] O termo "polinucleotídeo" conforme aqui usado se refere a polímeros de ácido nucleico de filamento simples ou filamento duplo de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Tais modificações incluem modificações de base tal como bromuridina, modificações de ribose tais como arabinosídeo e 2',3'-didesoxirribose e modificações de ligação internucleotídeo tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato. O termo "polinucleotídeo" inclui especificamente formas de filamento simples e filamento duplo de DNA.
[0084] Um "polinucleotídeo isolado" é um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA ou sintética ou alguma combinação das mesmas, que por virtude de sua origem o polinucleotídeo isolado: (1) não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo onde o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) está ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.
[0085] Um "polipeptídeo isolado" é um que: (1) é livre de pelo menos alguns outros polipeptídeos com os quais ele seria normalmente encontrado, (2) é essencialmente livre de outros polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separado de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos ou outros materiais com os quais ele está associado na natureza, (5) não está associado (através de interação covalente ou não covalente) com porções de um polipeptídeo com o qual o "polipeptídeo isolado" está associado na natureza, (6) é operavelmente associado (através de interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual ele não está associado na natureza ou (7) não ocorre na natureza. Tal polipeptídeo isolado pode ser codificado por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação dos mesmos. Preferivelmente, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou outro).
[0086] O termo "anticorpo humano" conforme aqui usado inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes substancialmente correspondendo a sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em algumas modalidades, anticorpos humanos são produzidos em mamíferos não humanos, incluindo, mas não limitado a, roedores, tais como camundongos e ratos, e lagomorfos, tais como coelhos. Em outras modalidades, anticorpos humanos são produzidos em células de hibridoma. Em ainda outras modalidades, anticorpos humanos são produzidos recombinantemente.
[0087] Anticorpos de ocorrência natural tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada tal tetrâmero é tipicamente composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" de comprimento integral (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento integral (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). Os termos "cadeia pesada" e "cadeia leve" conforme aqui usado se referem a qualquer polipeptídeo de imunoglobulina tendo sequência de domínio variável suficiente para conferir especificidade para um antígeno alvo. A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada inclui tipicamente um domínio variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é tipicamente responsável por reconhecimento de antígeno. A porção carboxi-terminal de cada cadeia tipicamente define um domínio constante responsável pera função efetora. Desta maneira, em um anticorpo de ocorrência natural, um polipeptídeo de imunoglobulina de cadeia pesada de comprimento integral inclui um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), onde o domínio VH está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CH3 está no terminal carboxila e um polipeptídeo de imunoglobulina de cadeia leve de comprimento integral inclui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), onde o domínio VL está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CL está no terminal carboxila.
[0088] Cadeias leves humanas são tipicamente classificadas como cadeias leves kappa e lambda, e cadeias pesadas humanas são tipicamente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tem várias subclasses, incluindo, mas não limitado a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tem subclasses incluindo, mas não limitado a, IgM1 e IgM2. IgA é similarmente subdividido em subclasses incluindo, mas não limitado a, IgA1 e IgA2. Dentro das cadeias leve e pesada de comprimento integral, os domínios variáveis e constantes tipicamente são unidos por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Vide, por exemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2a ed., 1989), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada tipicamente formam um sítio de ligação ao antígeno. Os domínios variáveis de anticorpos de ocorrência natural tipicamente exibem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura principal (FR) (Framework Regions) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões de estrutura principal, o que pode permitir ligação a um epítopo específico. A partir do terminal amino para o terminal carboxila, ambos os domínios de cadeia leve e pesada compreendem tipicamente os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0089] O termo "Fc nativa" conforme aqui usado se refere a uma molécula compreendendo a sequência de um fragmento de ligação não antígeno resultante da digestão de um anticorpo ou produzida por outros meios, seja em forma monomérica ou multimérica, e pode estar contida na região de dobra. A fonte de imunoglobulina original da Fc nativa é preferivelmente de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas, embora IgG1 e IgG2 sejam preferidas. Moléculas Fc nativas são formadas de polipeptídeos monoméricos que pode ser ligados a formas diméricas ou multiméricas através de associações covalente (isto é, ligações dissulfeto) e não covalente. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Um exemplo de uma Fc nativa é um dímero ligado por dissulfeto resultante da digestão com papaína de uma IgG. O termo "Fc nativa" conforme aqui usado é genérico para as formas monomérica, dimérica e multimérica.
[0090] O termo "variante de Fc" conforme aqui usado se refere a uma molécula ou sequência que é modificada de uma Fc nativa, mas que ainda compreende um sítio de ligação para o receptor selvagem, FcRn (receptor Fc neonatal). Variantes de Fc exemplares, e sua interação com o receptor selvagem, são conhecidas na técnica. Desta maneira, o termo "variante de Fc" pode compreender uma molécula ou sequência que é humanizada a partir de uma Fc nativa não humana. Ainda, uma Fc nativa compreende regiões que podem ser removidas porque elas proveem características estruturais ou atividade biológica que não são requeridas para as proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção. Desta maneira, o termo "variante de Fc" compreende uma molécula ou sequência que não tem um ou mais sítios ou resíduos de Fc nativa, ou onde um ou mais sítios ou resíduos de Fc foram modificados, que afetam ou estão envolvidos em: (1) formação de ligação dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeiro selecionada, (3) heterogeneidade N-terminal quando da expressão em uma célula hospedeiro selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor de Fc outro que não o receptor selvagem ou (7) citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC).
[0091] O termo "domínio de Fc" conforme aqui usado compreende Fc nativa e variantes de Fc e sequências conforme acima definido. Como com variantes de Fc e moléculas Fc nativas, o termo "domínio de Fc" inclui moléculas em forma monomérica ou multimérica, sejam digeridas de anticorpo integral ou produzidas por outros meios.
[0092] O termo "proteína de ligação tipo anticorpo" conforme aqui usado se refere a uma molécula de ocorrência não natural (ou recombinante) que se liga especificamente a pelo menos um antígeno alvo, e que compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, onde duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[0093] e duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
[0094] onde:
[0095] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0096] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[0097] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0098] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[0099] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00100] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 da imunoglobulina;
[00101] Fc é a região de dobra de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina CH2, CH3;
[00102] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00103] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado. O termo "proteína de ligação tipo anticorpo" conforme aqui usado se refere também a uma molécula de ocorrência não natural (ou recombinante) que se liga especificamente a pelo menos um antígeno alvo, e que compreende duas cadeias de polipeptídeo que formam dois sítios de ligação ao antígeno, onde uma primeira cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[00104] e uma segunda cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[00105] onde:
[00106] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00107] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00108] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00109] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00110] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00111] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00112] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00113] e onde os primeiro e segundo polipeptídeos formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado. Uma molécula "recombinante" é uma que foi preparada, expressa, criada ou isolada através de meios recombinantes.
[00114] Uma modalidade da invenção provê proteínas de ligação tipo anticorpo tendo especificidades biológica e imunológica para entre um e quatro antígeno alvo. Outra modalidade da invenção provê moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeo codificando cadeias de polipeptídeo que formam tais proteínas de ligação tipo anticorpo. Outra modalidade da invenção provê vetores de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeo codificando cadeias de polipeptídeo que formam tais proteínas de ligação tipo anticorpo. Ainda outra modalidade da invenção provê células hospedeiro que expressam tais proteínas de ligação tipo anticorpo (isto é, compreendendo moléculas de ácido nucleico ou vetores codificando cadeias de polipeptídeo que formam tais proteínas de ligação tipo anticorpo).
[00115] O termo "permutabilidade" conforme aqui usado se refere à capacidade de troca de domínios variáveis dentro do formato CODV e com retenção de dobra e afinidade de ligação final. "Permutabilidade integral" se refere à habilidade em trocar a ordem de ambos os domínios VH1 e VH2, e então a ordem de domínios VL1 e VL2, em um CODV-Ig (isto é, reverter a ordem) ou CODV-Fab enquanto mantendo a funcionalidade integral da proteína de ligação tipo anticorpo conforme evidenciado pela retenção de afinidade de ligação. Ainda, deve ser notado que as designações VH e VL dentro de um CODV-Ig ou CODV-Fab particular se referem à localização do domínio em uma cadeia de proteína particular no formato final. Por exemplo, VH1 e VH2 poderiam ser derivados de domínios VL1 e VL2 em anticorpos parentais e posto nas posições VH1 e VH2 na proteína de ligação tipo anticorpo. Da mesma maneira, VL1 e VL2 poderiam ser derivados de domínios VH1 e VH2 em anticorpos parentais e postos nas posições VH1 e VH2 na proteína de ligação tipo anticorpo. Desta maneira, as designações VH e VL se referem à presente localização e não localização original em um anticorpo parental. Domínios VH e VL são então "permutáveis".
[00116] Uma proteína de ligação tipo anticorpo "isolada" é uma que foi identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos de diagnóstico ou terapêuticos para a proteína de ligação tipo anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação tipo anticorpo será purificada: (1) para mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado através do método Lowry, e mais preferivelmente mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N- terminal ou interna através do uso de um sequenciador de copo giratório ou (3) até homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando Coomassie blue ou, preferivelmente, tingimento prata. Proteínas de ligação do tipo anticorpo isoladas incluem a proteína de ligação tipo anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína de ligação tipo anticorpo não estará presente.
[00117] O termo "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" conforme aqui usado se refere a um composto ou espécie que é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar e é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em algumas modalidades, uma fração substancialmente purificada é uma composição onde a espécie compreende pelo menos cerca de 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura vai compreender mais do que cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromolares presentes na composição. Em ainda outras modalidades, a espécie é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectados na composição através de métodos de detecção convencionais) onde a composição consiste essencialmente em uma espécie macromolecular única.
[00118] O termo "antígeno" ou "antígeno alvo" conforme aqui usado se refere a uma molécula ou uma porção de uma molécula que é capaz de ser ligada por uma proteína de ligação tipo anticorpo e ainda é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação a um epítopo deste antígeno. Um antígeno alvo pode ter um ou mais epítopos. Com relação a cada antígeno alvo reconhecido por uma proteína de ligação tipo anticorpo, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de competir com um anticorpo intacto que reconhece o antígeno alvo. Uma proteína de ligação tipo anticorpo "bivalente", que não uma proteína de ligação tipo anticorpo "multiespecífica" ou "multifuncional", é entendida compreender sítios de ligação ao antígeno tendo especificidade antigênica idêntica.
[00119] Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é tipicamente um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/cadeia leve diferentes e dois sítios de ligação ou epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos incluindo, mas não limitado a, fusão de híbridos ou ligação de fragmentos F(ab').
[00120] Um fragmento F(ab) tipicamente inclui uma cadeia leve e os domínios VH e CH1 de uma cadeia pesada, onde a porção de cadeia pesada VH-CH1 do fragmento F(ab) não pode formar uma ligação dissulfeto com outro polipeptídeo de cadeia pesada. Conforme aqui usado, um fragmento F(ab) pode também incluir uma cadeia leve contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e uma cadeia pesada contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e um domínio CH.
[00121] Um fragmento F(ab') tipicamente inclui uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém mais da região constante (entre do domínios CH1 e CH2), de maneira que uma ligação dissulfeto intercadeia pode ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.
[00122] As expressões "propriedades biológica", "característica biológica" e o termo "atividade" em referência a uma proteína de ligação tipo anticorpo da invenção são usadas intercomutavelmente aqui e incluem, mas não estão limitadas a, afinidade e especificidade de epítopo, habilidade em antagonizar a atividade do alvo de antígeno (ou polipeptídeo alvo), a estabilidade in vivo da proteína de ligação tipo anticorpo e as propriedades imunogênicas da proteína de ligação tipo anticorpo. Outras propriedades ou características biológicas identificáveis de uma proteína de ligação tipo anticorpo incluem, por exemplo, reatividade cruzada (isto é, com homólogos não humanos do alvo de antígeno ou com outros alvos de antígeno ou tecidos, em geral), e habilidade em preservar níveis de expressão altos de proteína em células de mamífero. As propriedades ou características mencionadas acima podem ser observadas ou medidas usando técnicas reconhecidas no campo incluindo, mas não limitado à ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo e imunoistoquímica com seções de tecido de fontes diferentes incluindo humano, primata ou qualquer outra fonte conforme necessário.
[00123] O termo "fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional" conforme aqui usado se refere a um fragmento de polipeptídeo que contém pelo menos as CDRs das cadeias pesadas ou leves da imunoglobulina a partir das quais o fragmento de polipeptídeo foi derivado. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional é capaz de se ligar a um antígeno alvo.
[00124] Uma proteína de ligação tipo anticorpo "de neutralização" conforme aqui usado se refere a uma molécula que é capaz de bloquear ou substancialmente reduzir uma função efetora de um antígeno alvo ao qual ela se liga. Conforme aqui usado, "reduz substancialmente" significa pelo menos cerca de 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85%, sobretudo preferivelmente pelo menos cerca de 90%, de redução de uma função efetora do antígeno alvo.
[00125] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante, preferivelmente um determinante de polipeptídeo, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em certas modalidades, determinantes de epítopo incluem agrupamentos quimicamente ativos na superfície de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo ou proteína de ligação tipo anticorpo. Em certas modalidades, uma proteína de ligação tipo anticorpo é dita ligar especificamente um antígeno quando ela reconhece preferivelmente seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em modalidades preferidas, uma proteína de ligação tipo anticorpo é dita ligar especificamente um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio é < 10-8 M, mais preferivelmente quando a constante de dissociação de equilíbrio é < 10-9 M e mais preferivelmente quando a constante de dissociação é < 10-10 M.
[00126] A constante de dissociação (KD) de uma proteína de ligação tipo anticorpo pode ser determinada, por exemplo, através de ressonância de plasmon de superfície. Em geral, análise de ressonância de plasmon de superfície mede as interações de ligação em tempo real entre ligante (um antígeno alvo em uma matriz de biossensor) e analito (uma proteína de ligação tipo anticorpo em solução) através de ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). Análise de plasmon de superfície pode também ser realizada através de imobilização do analito (proteína de ligação tipo anticorpo ou uma matriz de biossensor) e apresentação do ligante (antígeno alvo). O termo "KD" conforme aqui usado se refere à constante de dissociação da interação entre uma proteína de ligação tipo anticorpo particular e um antígeno alvo.
[00127] O termo "se liga especificamente" conforme aqui usado se refere à habilidade de uma proteína do tipo anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma em se ligar a um antígeno contendo um epítopo com uma KD de pelo menos cerca de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M ou mais e/ou se liga a um epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para um antígeno não específico.
[00128] O termo "ligante" conforme aqui usado se refere a um ou mais resíduos de aminoácido inseridos entre domínios de imunoglobulina para prover mobilidade suficiente para os domínios das cadeias leve e pesada para dobra em imunoglobulinas de região variável dupla cruzada. Um ligante é inserido na transição entre domínios variáveis ou entre domínios variáveis e constantes, respectivamente, no nível de sequência. A transição entre domínios pode ser identificada porque o tamanho aproximado dos domínios de imunoglobulina são bem compreendidos. A localização precisa de uma transição de domínio pode ser determinada através da localização de extensões de peptídeo que não formam elementos estruturais secundários tais como folhas beta ou hélices alfa conforme demonstrado através de dados experimentais ou pode ser suposta através de técnicas de modelagem ou previsão de estrutura secundária. Os ligantes descritos aqui são referidos como L1, que está localizado na cadeia leve entre os domínios VL1 e VL2 N-terminais; L2, que está também na cadeia leve está localizado entre os domínios VL2 e CL C-terminais. Os ligantes de cadeia pesada são conhecidos como L3, que está localizado entre os domínios VH2 e VH1 N-terminais; e L4, que está localizado entre os domínios VH1 e CH1-Fc. Os ligantes L1, L2, L3 e L4 são independentes, mas eles em alguns casos têm a mesma sequência e/ou comprimento.
[00129] O termo "vetor" conforme aqui usado se refere a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) que é usada para transferir informação de codificação para uma célula hospedeiro. O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucleico que é capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma molécula de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos. Outro tipo de vetor é um vetor viral, onde segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeiro na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissomais) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeiro quando da introdução na célula hospedeiro e desta maneira são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Ainda, certos vetores são capazes de direcionamento da expressão de gene aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são estão frequentemente na forma de plasmídeos. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercomutavelmente aqui, uma vez que plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, replicação de retrovírus defeituosos, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.
[00130] O termo "operavelmente ligado" é usado aqui para se referir a um disposição de sequências de flanqueamento onde as sequências de flanqueamento então descritas são configuradas ou montadas de maneira a realizar sua função comum. Desta maneira, uma sequência de flanqueamento operavelmente ligada a uma sequência de codificação pode ser capaz de realizar a replicação, transcrição e/ou tradução da sequência de codificação. Por exemplo, uma sequência de codificação é operavelmente ligada a um promotor quando o promotor é capaz de direcionar transcrição desta sequência de codificação. Uma sequência de flanqueamento não precisa ser contígua à sequência de codificação, contanto que ela funcione corretamente. Desta maneira, por exemplo, sequências de interferência não traduzidas ainda que transcritas podem estar presentes entre uma sequência de promotor e a sequência de codificação e a sequência de promotor pode ainda ser considerada "operavelmente ligada" à sequência de codificação.
[00131] A expressão "célula hospedeiro recombinante" (ou "célula hospedeiro") conforme aqui usado se refere a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Uma célula hospedeiro recombinante ou célula hospedeiro pretende se referir não apenas à célula objeto particular, mas também à progênie de tal célula. Devido ao fato que certas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido ou à mutação ou influências ambientais, tal progênie pode, na realidade não, ser idêntica à célula parental, mas tais células estão ainda incluídas no escopo do termo "célula hospedeiro" conforme aqui usado. Uma ampla variedade de sistemas de expressão de célula hospedeiro pode ser usada para expressar as proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção, incluindo sistemas de expressão bacterianos, de levedura, baculovirais e de mamífero (bem como sistemas de expressão de exibição de fago). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano adequado é pUC19. Para expressar uma proteína de ligação tipo anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeiro é transformada ou transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes carregando fragmentos de DNA codificando as cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação tipo anticorpo de maneira que as cadeias de polipeptídeo são expressas na célula hospedeiro e, preferivelmente, secretadas no meio onde as células hospedeiro são culturadas, meio a partir do qual a proteína de ligação tipo anticorpo pode ser recuperada.
[00132] O termo "transformação" conforme aqui usado se refere a uma mudança nas características genéticas de uma célula e uma célula foi transformada quanto ela foi modificada para conter um DNA novo. Por exemplo, uma célula é transformada onde ela é geneticamente modificada de seu estado nativo. Seguindo transformação, o DNA transformante pode recombinar com aquele da célula ao integrar fisicamente em um cromossomo da célula ou pode ser mantido transientemente como um elemento epissomal sem ser replicado ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada ter sido estavelmente transformada quando o DNA é replicado com a divisão da célula. O termo "transfecção" conforme aqui usado se refere à absorção de DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno foi introduzido na membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas no campo. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais moléculas de DNA exógenas em células hospedeiro adequdas.
[00133] O termo "ocorrência natural" conforme aqui usado e aplicado a um objeto se refere ao fato que o objeto pode ser encontrado na natureza e não foi manipulado pelo homem. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser usado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem é de ocorrência natural. Similarmente, de "ocorrência não natural" conforme aqui usado se refere a um objeto que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem.
[00134] Conforme aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem uso convencional. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-, a-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem ser também componentes adequados para as cadeias de polipeptídeo das proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4- hidroxiprolina, Y—carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N- acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metilistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação de polipeptídeo usada aqui, a direção da esquerda é a direção amino terminal e a direção para a direita é a direção carboxila terminal, de acordo com uso e convenção padrão.
[00135] Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades de cadeia lateral:
[00136] hidrofóbico: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
[00137] hidrofílico polar: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
[00138] alifático: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
[00139] hidrofóbico alifático: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
[00140] hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[00141] ácido: Asp, Glu;
[00142] básico: His, Lys, Arg;
[00143] resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
[00144] aromático: His, Trp, Tyr, Phe; e
[00145] hidrofóbico aromático: Phe, Trp, Tyr.
[00146] Substituições de aminoácido conservativas podem envolver troca de um membro de uma dessas classes com outro membro da mesma classe. Substituições de aminoácido conservativas podem compreender resíduos de aminoácido de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados através de síntese de peptídeo química ao invés de através de síntese em sistemas biológicos. Esses incluem peptidomiméticos e outras formas inversas ou invertidas de resíduos de aminoácido. Substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.
[00147] Um versado na técnica será capaz de determinar variantes adequadas das cadeias de polipeptídeo das proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção usando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, um versado na técnica pode identificar áreas adequadas de uma cadeia de polipeptídeo que podem ser mudadas sem destruir a atividade ao se direcionar a regiões não acreditadas ser importantes para atividade. Alternativamente, um versado na técnica pode identificar resíduos e porções das moléculas que são conservados dentre polipeptídeos similares. Ainda, mesmo áreas que podem ser importantes para atividade biológica ou para estrutura podem ser submetidas a substituições de aminoácido conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem afetar de modo adverso a estrutura do polipeptídeo.
[00148] O termo "paciente" conforme aqui usado inclui indivíduos humanos e animais.
[00149] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria de tratamento usando as proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção. "Distúrbio" e "condição" são usados intercomutavelmente aqui e incluem distúrbios ou doenças crônicos e agudos, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem um paciente ao distúrbio em questão.
[00150] O termo "tratamento" ou "tratar" conforme aqui usado se refere a ambos o tratamento terapêutico e a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles tendo o distúrbio, bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles onde o distúrbio deve ser prevenido.
[00151] O termo "composição farmacêutica" ou "composição terapêutica" conforme aqui usado se refere a um composto ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando apropriadamente administrado a um paciente.
[00152] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável " ou "carreador fisiologicamente aceitável" conforme aqui usado se refere a um ou mais materiais de formulação adequados para realizar ou aumentar a administração de uma proteína de ligação tipo anticorpo.
[00153] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" quando usados em referência a uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais proteínas de ligação tipo anticorpo se referem a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado terapêutico desejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de uma proteína de ligação tipo anticorpo suficiente para inibir, por algum período de tempo, um ou mais dos processos patológicos clinicamente definidos associados com a condição sendo tratada. A quantidade eficaz pode variar dependendo da proteína de ligação tipo anticorpo específica que está sendo usada, e também depende de uma variedade de fatores e condições relacionados com o paciente sendo tratado e a severidade do distúrbio. Por exemplo, se uma proteína de ligação do tipo anticorpo tiver que ser administrada in vivo, fatores tais como idade, peso e saúde do paciente bem como curvas de dose-resposta e dados de toxidez obtidos em trabalho com animal pré-clínico estariam dentre os fatores considerados. A determinação de uma quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz de uma dada composição farmacêutica está dentro da habilidade daqueles versados na técnica.
[00154] Uma modalidade da invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação tipo anticorpo. Proteínas de Ligação Tipo Anticorpo
[00155] Em uma modalidade da invenção, as proteínas de ligação tipo anticorpo compreendem quatro cadeias de polipeptídeo para formar quatro sítios de ligação ao antígeno, onde duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[00156] e duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
[00157] onde:
[00158] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00159] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00160] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00161] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00162] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00163] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00164] Fc é a região de dobra de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina CH2, CH3;
[00165] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00166] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[00167] Em outra modalidade da invenção, as proteínas de ligação tipo anticorpo compreendem duas cadeias de polipeptídeo que formam dois sítios de ligação ao antígeno, onde uma primeira cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
[00168] e uma segunda cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[00169] onde:
[00170] VL é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00171] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00172] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00173] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00174] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00175] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00176] L1, L2, L3e L4 são ligantes de aminoácido;
[00177] e onde os primeiro e segundo polipeptídeos formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[00178] As proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção podem ser preparadas usando domínios ou sequências obtidos ou derivados de qualquer anticorpo humano ou não humano incluindo, por exemplo, anticorpos de humano, murino ou humanizados.
[00179] Em algumas proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, o comprimento de L3 é pelo menos duas vezes o comprimento de L1. Em outras proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, o comprimento de L4 é pelo menos duas vezes o comprimento de L2. Em algumas proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção, o comprimento de L1 é pelo menos duas vezes o comprimento de L3. Em outras proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, o comprimento de L2 é pelo menos duas vezes o comprimento de L4.
[00180] Em algumas proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção, L1 é de 3 a 12 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 3 a 14 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de a 1 a 8 resíduos de aminoácido de comprimento e L4 é de 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento. Em outras proteínas de ligação do tipo anticorpo, L1 é de 5 a 10 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 5 a 8 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de 1 a 5 resíduos de aminoácido de comprimento e L4 é de 1 a 2 resíduos de aminoácido de comprimento. Em uma proteína de ligação tipo anticorpo preferida, L1 é de 7 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 5 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de 1 resíduo de aminoácido de comprimento e L4 é de 2 resíduos de aminoácido de comprimento.
[00181] Em algumas proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção, L1 é de 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 1 a 4 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de 2 a 15 resíduos de aminoácido de comprimento e L4 é de 2 a 15 resíduos de aminoácido de comprimento. Em outras proteínas de ligação do tipo anticorpo, L1 é de 1 a 2 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 1 a 2 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de 4 a 12 resíduos de aminoácido de comprimento e L4 é de 2 a 12 resíduos de aminoácido de comprimento. Em uma proteína de ligação tipo anticorpo preferida, L1 é de 1 resíduo de aminoácido de comprimento, L2 é de 2 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de 7 resíduos de aminoácido de comprimento e L4 é de 5 resíduos de aminoácido de comprimento.
[00182] Em algumas proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, L1, L3 ou L4 pode ser igual a zero. No entanto, em proteínas de ligação tipo anticorpo onde L1, L3 ou L4 é igual a zero, o ligante de transição correspondente entre a região variável e a região constante ou entre os domínios variáveis duplos na outra cadeia não pode ser zero. Em algumas modalidades, L1 é igual a zero e L3 é 2 ou mais resíduos de aminoácido, L3 é igual a zero e L1 é igual a 1 ou mais resíduos de aminoácido ou L4 é igual a 0 e L2 é de 3 ou mais resíduos de aminoácido.
[00183] Em algumas proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção, pelo menos um dos ligantes selecionados do grupo consistindo em L1, L2, L3 e L4 contém pelo menos um resíduo cisteína.
[00184] Exemplos de ligantes adequados incluem um resíduo glicina (Gly) único; um peptídeo diglicina (Gly-GLy); um tripeptídeo (Gly-Gly-Gly); um peptídeo com quatro resíduos glicina (Gly-Gly-Gly- Gly; SEQ ID NO: 25); um peptídeo com cinco resíduos glicina (Gly- Gly-Gly-Gly-GLy; SEQ ID NO: 26); um peptídeo com seis resíduos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 27); um peptídeo com sete resíduos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 28); um peptídeo com oito resíduos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 29). Outras combinações de resíduos de aminoácido podem ser usadas tal como o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 30) e o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 31). Outros ligantes adequados incluem um Ser único e resíduo Val; o dipeptídeo Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys e Ser- Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 52), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 53), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 54), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 55); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 48), Arg- Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 49), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 50) e His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 51). Os exemplos listados acima não pretendem limitar o escopo da invenção de modo algum, e ligantes compreendendo aminoácidos aleatoriamente selecionados do grupo consistindo em valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina foram mostrados ser adequados nas proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção (vide Exemplo 12).
[00185] A identidade e a sequência de resíduos de aminoácido no ligante podem variar dependendo do tipo de elemento estrutural secundário necessário para obter o ligante. Por exemplo, glicina, serina e alanina são melhores para ligantes tendo flexibilidade máxima. Algumas combinações de glicina, prolina, treonina e serina são úteis se um ligante mais rígido e prolongado for necessário. Qualquer resíduo de aminoácido pode ser considerado um ligante em combinação com outros resíduos de aminoácido para construir ligantes de peptídeo maiores conforme necessário dependendo das propriedades desejadas.
[00186] Em algumas proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção, VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2; e VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
[00187] Em algumas modalidades da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de ligar especificamente um ou mais alvos de antígeno. Em modalidades preferidas da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de ligar especificamente pelo menos um alvo de antígeno selecionado do grupo consistindo em B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3, C5, CCL11 (eotaxina), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MIP-3A), CCL21 (MIP-2), SCL, CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (E-caderina), Quitinase, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDF1), CXCL13, FCER1A, FCER1, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (b 4 integrina), LEP (leptina), MHC classe II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-a, TNFSF4 (ligante OX40), TNFSF5 (ligante CD40), receptores tipo Toll, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1), DNGR-1 (CLEC91) e HMGB1. Em outras modalidades da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de inibição da função de um ou mais alvos de antígeno.
[00188] Em algumas modalidades da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo é biespecífica e capaz de ligar dois alvos de antígeno ou epítopos diferentes. Em uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo é biespecífica e cada par de cadeia leve-cadeia pesada é capaz de ligação de dois alvos de antígeno ou epítopos diferentes. Em uma modalidade mais preferida, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de ligação de dois alvos de antígeno diferentes que são selecionados do grupo consistindo em IL4 e IL3, IGF1R e HER2, IGF1R e EGFR, EGFR e HER2, BK e IL13, PDL-1 e CTLA-4, CTLA4 e MHC classe II, IL-12 e IL-18, IL-1α e IL-1β, TNFα e IL12/23, TNFα e IL-12p40, TNFα e IL-1β, TNFα e IL-23 e IL17 e IL23. Em uma modalidade ainda mais preferida, a proteína de ligação tipo anticorpo é capaz de se ligar aos alvos de antígeno IL4 e IL13.
[00189] Em algumas modalidades da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo liga especificamente IL4 com uma taxa de associação de 2,97 E+07 e uma taxa de dissociação de 3,30 E-04 e liga especificamente IL13 com uma taxa de associação de 1,39 E+06 e uma taxa de dissociação de 1,63 E-04. Em outras modalidades da invenção, a proteína de ligação tipo anticorpo liga especificamente IL4 com uma taxa de associação de de 3,16 E+07 e uma taxa de dissociação de 2,89 E-04 e liga especificamente IL3 com uma taxa on de 1,20 E+06 e uma taxa off de 1,12 E-04.
[00190] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno é preparada através da identificação de um primeiro domínio variável de anticorpo que liga um primeiro antígeno alvo e um segundo domínio variável de anticorpo que liga um segundo antígeno alvo, cada um contendo um VL e VH; designação ou da cadeia leve ou da cadeia pesada como uma cadeia modelo; designação de VL do primeiro domínio variável de anticorpo ou do segundo domínio variável de anticorpo como VL1; designação de um VL2, um VH1 e um VH2 de acordo com as fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1,Fc [II]
[00191] determinação de comprimentos máximo e mínimo para L1, L2, L3 e L4; geração de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II; seleção de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II que ligam o primeiro antígeno alvo e o segundo antígeno alvo quando combinadas para formar uma proteína de ligação tipo anticorpo;
[00192] onde:
[00193] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00194] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00195] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00196] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00197] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00198] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00199] Fc é a região de dobra da imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina; e
[00200] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00201] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[00202] Em outra modalidade da invenção, uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de libação de antígeno é preparada através da identificação de um primeiro domínio variável de anticorpo que liga um primeiro antígeno alvo e um segundo domínio variável de anticorpo que liga um segundo antígeno alvo, cada um contendo um VL e um VH; designação ou da cadeia leve ou da cadeia pesada como uma cadeia modelo; designação de VL do primeiro domínio variável de anticorpo ou do segundo domínio variável de anticorpo como VL1; designação de um VL2, um VH1 e um VH2 de acordo com as fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[00203] determinação dos comprimentos máximo e mínimo para L1, L2, L3 e L4; geração de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II; seleção de estruturas de polipeptídeo de fórmulas I e II que ligam o primeiro antígeno alvo e o segundo antígeno alvo quando combinadas para formar a proteína de ligação tipo anticorpo;
[00204] onde:
[00205] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00206] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00207] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00208] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00209] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00210] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00211] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00212] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[00213] Em outras modalidades da invenção, uma proteína de ligação tipo anticorpo onde um primeiro domínio variável de anticorpo e o segundo domínio variável de anticorpo são iguais é preparada.
[00214] Uma modalidade da invenção provê um método para fabricação de uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo expressão em uma célula de uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos tendo estruturas representadas pelas fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
[00215] onde:
[00216] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00217] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00218] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00219] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00220] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00221] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[00222] Fc é a região de dobra de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada da imunoglobulina CH2, CH3; e
[00223] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00224] e onde os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.
[00225] Outra modalidade da invenção provê um método para fabricação de uma proteína de ligação tipo anticorpo compreendendo expressão em uma célula de uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos tendo estruturas representadas pelas fórmulas [I] e [II] abaixo: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
[00226] onde:
[00227] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00228] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve da imunoglobulina;
[00229] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00230] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada da imunoglobulina;
[00231] CL é um domínio constante de cadeia leve da imunoglobulina;
[00232] CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; e
[00233] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[00234] e onde os polipeptídeos de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado. Usos para Proteínas de Ligação Tipo Anticorpo
[00235] As proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção podem ser empregadas em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação para detecção e quantificação de um ou mais antígenos alvo. As proteínas de ligação tipo anticorpo ligarão o um ou mais antígenos alvo com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio sendo empregado.
[00236] Para aplicações de diagnóstico, em certas modalidades, proteínas de ligação tipo anticorpo podem ser marcadas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, ou diretamente ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In ou 67Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como fluoresceína, isotiocianato, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre.
[00237] As proteínas de ligação tipo anticorpo da invenção são também úteis para imagem in vivo. Uma proteína de ligação tipo anticorpo marcada com uma porção detectável pode ser administrada a um animal, preferivelmente na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro ensaiada. A proteína de ligação do tipo anticorpo pode ser marcada com qualquer porção que seja detectável em um animal, seja através de ressonância magnética nuclear, radiologia ou outro meio de detecção conhecido na técnica.
[00238] A invenção refere-se também a um estojo compreendendo uma proteína de ligação tipo anticorpo e outros reagentes úteis para detecção de níveis de antígeno alvo em amostras biológicas. Tais reagentes podem incluir um marcador detectável, soro de bloqueio, amostras controle positivas e negativas e reagentes de detecção. Composições Terapêuticas de Proteína de Ligação Tipo Anticorpo e Administração das Mesmas
[00239] Composições terapêuticas ou farmacêuticas compreendendo proteínas de ligação tipo anticorpo estão dentro do escopo da invenção. Tais composições terapêuticas ou farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação tipo anticorpo, ou conjugado proteína de ligação tipo anticorpo-fármaco, em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequabilidade com o modo de administração.
[00240] Materiais de formulação aceitáveis são preferivelmente não tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas.
[00241] A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificação, manutenção ou preservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou eliminação, adsorção ou penetração da composição. Materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfeto de sódio ou hidrogeno-sulfeto de sódio), tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (tal como manitol ou glicina), agentes de quelação (tal como ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA)), agentes de complexação (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrinas), cargas, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrinas), proteínas (tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas), agentes de coloração, saborização e diluentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons de formação de sal (tal como sódio), conservantes (tal como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool de fenetila, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio), solventes (tal como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol), álcoois de açúcar (tal como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, tensoativos ou agentes umectantes (tais como pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbatos tal como polissorbato 20 ou polissorbato 80; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de aumento de estabilidade (tal como sacarose ou sorbitol), agentes de aumento de tonicidade (tais como haletos de metal alcalino - preferivelmente cloreto de sódio ou potássio - ou manitol sorbitol), veículos de administração, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (vide, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990) e edições subsequentes do mesmo, incorporados aqui a título de referência para qualquer propósito).
[00242] A composição farmacêutica ótima será determinada por um versado na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de administração e dosagem desejada. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de eliminação in vivo da proteína de ligação tipo anticorpo.
[00243] O veículo ou carreador primário em uma composição farmacêutica pode ser ou aquoso ou não aquoso em natureza. Por exemplo, um veículo ou carreador adequado para injeção pode ser água, solução salina fisiológica ou fluido cerebroespinhal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro são veículos exemplares adicionais. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris de pH cerca de 7,0-8,5 ou tampão de acetato de pH cerca de 4,0-5,5, que pode incluir ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em uma modalidade da invenção, composições de proteína de ligação tipo anticorpo podem ser preparadas para armazenamento através de mistura da composição selecionada tendo o grau de pureza desejado sem agentes de formulação opcionais na forma de uma torta liofilizada ou uma solução aquosa. Ainda, a proteína de ligação tipo anticorpo pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes adequados tal como sacarose.
[00244] As composições farmacêuticas da invenção podem ser selecionadas para administração parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para administração através do trato digestivo, tal como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da habilidade da técnica.
[00245] Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente menor, tipicamente dentro de uma faixa de pH de a partir de cerca de 5 a cerca de 8.
[00246] Quando administração parenteral é compreendida, as composições terapêuticas para uso na presente invenção podem estar na forma de uma solução aquosa livre de pirógeno, parenteralmente aceitável, compreendendo a proteína de ligação tipo anticorpo desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril onde uma proteína de ligação tipo anticorpo é formulada como uma solução isotônica, estéril, apropriadamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microesferas injetáveis, partículas bioerosíveis, compostos poliméricos (tal como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), contas ou lipossomas, que proveem a liberação controlada ou sustentada do produto que pode então ser administrado através de uma injeção depósito. Ácido hialurônico pode também ser usado, e isso pode ter o efeito de promoção de duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para introdução da molécula desejada incluem dispositivos de administração de fármaco implantáveis.
[00247] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de ligação tipo anticorpo pode ser formulada como um pó seco para inalação. Soluções para inalação de proteína de ligação tipo anticorpo podem ser também formuladas com um propelente para administração aerossol. Em ainda outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas.
[00248] É também compreendido que certas formulações podem ser administradas oralmente. Em uma modalidade da invenção, proteínas de ligação tipo anticorpo que são administradas desta maneira podem ser formuladas com ou sem aqueles carreadores geralmente usados na composição de formas de dosagem sólidas tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para administração da porção ativa da formulação no ponto no trato gastrintestinal quando biodisponibilidade é maximizada e degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar absorção da proteína de ligação tipo anticorpo. Diluentes, saborizantes, ceras de ponto de fusão baixo, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimido e ligantes podem ser também empregados.
[00249] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de proteínas de ligação tipo anticorpo em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Através da dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas em forma de dosagem unitária. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação tal como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
[00250] As composições farmacêuticas adicionais da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo formulações envolvendo proteínas de ligação tipo anticorpo em formulações de administração sustentada ou controlada. Técnicas para formulação de uma variedade de outros meios de administração sustentada ou controlada, tais como carreadores de lipossoma, micropartículas bioerodíveis ou contas porosas e injeções depósito, são também conhecias daqueles versados na técnica. Exemplos adicionais de preparações de liberação sustentada incluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil- metacrilato), etileno acetato de vinila ou ácido poli-D(-)-3- hidroxibutírico. Composições de liberação sustentada podem também incluir lipossomas, que podem também ser preparados através de qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica.
[00251] As composições farmacêuticas da invenção a serem usadas para administração in vivo devem ser tipicamente estéreis. Isso pode ser obtido através de filtragem em membranas de filtragem estéreis. Onde a composição é liofilizada, esterilização usando este método pode ser conduzida ou antes, ou seguindo, liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em uma solução. Ainda, composições parenterais geralmente são postas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00252] Uma vez a composição farmacêutica tendo sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas ou em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) requerendo reconstituição antes da administração.
[00253] A invenção também compreende estojos para produção de uma unidade de administração de dose única. Os estojos podem conter ambos um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Também incluídos no escopo da presente invenção estão estojos contendo seringas pré- cheias de câmara única ou câmara múltipla (por exemplo, seringas líquidas e liosseringas).
[00254] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de proteína de ligação tipo anticorpo a ser empregada terapeuticamente vai depender, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um versado na técnica vai compreender que os níveis de dosagem apropriados para tratamento vão então variar dependendo, em parte, da molécula administrada, da indicação para a qual a proteína de ligação tipo anticorpo está sendo usada, da via de administração e do tamanho (peso do corpo, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde geral) do paciente. Desta maneira, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem típica pode variar de a partir de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de a partir de 0,1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg; ou 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg; ou 5 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 25 μg/kg, 30 μg/kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 50 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg até cerca de 100 mg/kg.
[00255] A frequência de dosagem vai depender dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação tipo anticorpo na formulação sendo usada. Tipicamente, um médico vai administrar a composição até que uma dosagem que obtenha o efeito desejado seja atingida. A composição pode então ser administrada como uma dose única ou duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) com o tempo, ou como uma infusão contínua através de um dispositivo implantável ou cateter. Refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramento feito por aqueles de habilidade na técnica e está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas por eles. Dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados.
[00256] A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; através de sistemas de liberação sustentada; ou através de dispositivos de implante. Onde desejado, as composições podem ser administradas através de injeção por bolo ou continuamente através de infusão ou através de dispositivo de implante.
[00257] A composição pode ser também administrada localmente através de implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e administração da molécula desejada pode ser através de difusão, bolo de liberação cronometrada ou administração contínua.
Exemplos
[00258] Os exemplos que seguem são ilustrativos de modalidades específicas da invenção e vários usos das mesmas. Eles são mostrados para propósitos explicativos apenas, e não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção de modo algum. Exemplo 1. Projeto e Engenharia de Proteínas de Ligação Tipo Anticorpo de Região Variável Dupla Cruzada Biespecífica
[00259] A região variável dupla cruzada em um formato Fv foi descrita na Patente U.S. No. 5.989.830 e foi referida como uma configuração de cabeça dupla cruzada (CODH). Modelagem molecular previu que o projeto de cabeça dupla cruzada (CODH) resulta em um complexo com ambos os sítios de ligação faceando em direções opostas sem as limitações sugeridas pela configuração Fv-Duplo. O formato Fv CODH foi examinado para determinar se ele poderia ser convertido em moléculas tipo anticorpo completas através da adição de um domínio CL à cadeia leve e uma região Fc à cadeia pesada. Uma conversão similar foi bem sucedida para os domínios variáveis duplos correspondentes (DVC-Ig) e TBTI conforme descrito na Patente U.S. No. 7.612.181 e na Publicação Internacional No. WO 2009/052081. A disposição das regiões variáveis no formato CODH é mostrada nas estruturas abaixo, o que indica a orientação amino para carboxila das cadeias de peptídeo:
[00260] cadeia leve: NH2-VL1-Ligante-L2-COOH
[00261] cadeia pesada: NH2-VH2-Ligante-VH1-COOH
[00262] A disposição amino terminal para carboxila das regiões variáveis em (a) e (b) acima pode ser distinguida da disposição na configuração Fv-Duplo mostrada em (c) e (d) abaixo:
[00263] cadeia leve: NH2-VL1-Ligante-VL2-COOH
[00264] cadeia pesada: NH2-VH1-Ligante-VH2-COOH
[00265] A diferença principal a ser notada é a localização distinta das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada correspondentes (VH1/VL2 e VH2/VL2) com relação umas às outras nas duas configurações de região variável dupla. Os domínios VL1 e VH1 correspondentes estavam ambos no terminal N das cadeias leve e pesada em configuração de região variável dupla. Em contraste, na configuração cruzada, uma metade de um par de uma região variável de anticorpo foi separada espacialmente dentro da cadeia de proteína na configuração cruzada. Na configuração cruzada, o domínio VL1 estaria no terminal N da cadeia leve da proteína, mas o domínio VH1 de formação de par está no terminal C da cadeia pesada de configuração cruzada. A relação espacial entre VL1 e VH1 encontrada na configuração de região variável dupla é a disposição encontrada em anticorpos naturais.
[00266] Uma desvantagem potencial da configuração de Fv duplo é que o ligante LL separando as duas regiões variáveis se projeta para o sítio de ligação ao antígeno do domínio Fv2 (vide Figura 1). Esta projeção pode interferir com ligação ao antígeno e resultar em uma acessibilidade perturbada de Antígeno 2 a Fv2. Esta acessibilidade perturbada ou interferência pode prevenir ligação ao antígeno. Ainda, esta interferência seria mais acentuada onde o tamanho do Antígeno 2 é maior. Na verdade, foi documentado na Patente U.S. No. 7.612.181 que a afinidade de ligação e habilidade de neutralização de uma molécula de DVD-Ig dependem de qual especificidade de antígeno é apresentada no terminal N ou terminal C. Vide Patente U.S. No. 7.612.181, Exemplo 2.
[00267] Desta maneira, para criar proteínas de ligação tipo anticorpo mais estáveis que não sejam submetidas à perda de afinidade de antígeno comparado com o anticorpo parental, moléculas de região dupla variável dupla cruzada tendo um domínio CL na cadeia leve e uma região Fc na cadeia pesada foram projetadas e construídas. Os polipeptídeos que formam essas proteínas tipo anticorpo têm as estruturas mostradas abaixo, onde a orientação amino para carboxila das cadeias de polipeptídeo é indicada:
[00268] cadeia leve: NH2-VL1-Ligante-VL2-CL-COOH
[00269] cadeia pesada: NH1-VH2-Ligante-VH1-CH1-Fc-COOH
[00270] Para avaliar se este projeto de proteína tipo anticorpo biespecífica se ligaria a dois antígenos diferentes, duas regiões variáveis anteriormente geradas e humanizadas de anticorpos específicos para IL4 (anti-IL4 humanizado parental) e IL13 (anti-IL13 humanizado parental) foram usadas para construir as moléculas tipo anticorpo biespecíficas mostradas na Tabela 1. Sequenciamento dos anticorpos de camundongo e o processo de humanização foram descritos na Publicação Internacional No. Wo 2009/052081 (TBTI). Em suma, sequências de aminoácido das cadeias pesada e leve variáveis do clone anti-IL13 de murino B-B13 e clone anti-IL4 de murino 8D4-8 foram determinadas através de sequenciamento de aminoácido. As sequências de murino foram humanizadas e então retrotraduzidas em sequências de nucleotídeo conforme descrito no Exemplo 5 da Publicação Internacional No. WO 2009/052081, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. As sequências de VH e VL anti-IL4 humanizadas parentais e VH e VL anti-IL13 humanizadas parentais foram combinadas e dispostas conforme mostrado na Tabela 1. Os códigos de taquigrafia na coluna um da Tabela 1 foram criados para simplificar discussão dessas proteínas de ligação tipo anticorpo. As proteínas de ligação tipo anticorpo diferem em tamanho do ligante inserido entre as duas regiões variáveis conforme mostrado na Tabela 1. Moléculas de DNA codificando os polipeptideos mostrados na Tabela 1 foram geradas a partir dos anticorpos anti-IL4 e anti-IL13 parentais retrotraduzidos. Domínios CH1, CL e Fc foram obtidos de IGHG1 (No. de Acesso GenBank 569F4) e IGKC (No. de Acesso GenBank Q502W4).
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[00271] As combinações de proteína mostradas na Tabela 2 foram expressas através de purificação transiente e purificadas através de cromatografia de Proteína A. Em cada caso, cromatografia de exclusão de tamanho revelou menos do que 12% de agregação, com a maioria tendo menos do que 7% de agregação; mas quaisquer das imunoglobulinas de cabeça dupla cruzada foram verificadas exibir qualquer habilidade em ligar ou IL4 ou IL13. No entanto, nenhuma ligação tipo anticorpo funcional pôde ser detectada e as razões para esta falta de atividade não puderam ser determinadas. Foi anteriormente previsto que esta disposição mostraria estabilidade superior com relação aos anticorpos de domínio de região variável dupla descritos na Patente U.S. No. 7.612.181 e a Publicação Internacional No. WO 2009/052081. Tabela 2. Ligação de CODH-Ig IL4 e IL3
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Exemplo 2. Projeto de Proteínas CODV-Ig através de Modelagem Molecular
[00272] Para obter proteínas tipo anticorpo funcionais utilizando a configuração de cabeça dupla cruzada que são consdescendentes à incorporação dos domínios Fc e CL1, um protocolo de modelagem molecular foi desenvolvido para a inclusão e avaliação de ligantes diferentes entre os domínios constante e variável e entre os domínios variáveis duplos em ambas as cadeias pesada e leve. A questão foi se a adição de ligantes únicos entre cada interface de domínio constante/variável e entre as duas interfaces de domínio variável/variável em ambas das cadeias pesada e leve poderia permitir que dobra de proteína apropriada ocorresse e produzisse moléculas tipo anticorpo funcionais na configuração de região variável dupla cruzada (vide Figura 2). Em outras palavras, um total de quatro ligantes independentes e únicos foi avaliado (vide Figura 2). Este protocolo de modelagem molecular era baseado em ancoragem de proteína-proteína de modelos de homologia e modelos experimentais das regiões FCVIL4 e FVIL13, respectivamente, em combinação com ligantes apropriados entre as regiões FVIL14 e FVIL13 e entre o Fv e as regiões constantes ou Fc.
[00273] Os ligantes independentes receberam nomes únicos como segue: L1 se refere ao ligante entre o VL N-terminal e o VL C-terminal na cadeia leve; L2 se refere ao ligante entre o VL C-terminal e CL na cadeia leve; L3 se refere ao ligante entre VH N-terminal e o VH C- terminal na cadeia pesada; L4 se refere ao ligante entre o VH C- terminal e CH1 (e Fc) na cadeia pesada. Deve ser notado que as designações VH e VL se referem apenas à localização do domínio em uma cadeia de proteína particular no formato final. Por exemplo, VH1 e VH2 poderiam ser derivados de domínios VL1 e VL2 em anticorpos parentais e postos nas posições VH1 e VH2 em um CODV-Ig. Da mesma maneira, VL1 e VL2 poderiam ser derivados de domínios VH1 e VH2 em anticorpos parentais e postos nas posições VH1 e VH2 em um CODV-Ig. Desta maneira, as designações VH e VL se referem à presente localização e não à localização original em um anticorpo parental.
[00274] Em mais detalhes, um modelo de homologia de FVIL4 foi construído em registros PDB 1YLD (cadeia leve) e 1IQW (cadeia pesada). O dímero FVIL4 foi recomposto em uma estrutura de cristal inhouse do complexo IL13/anti-IL13 FabIL13 e otimizado. A fim de obter uma estimativa do volume requerido pelo IL4 quando ligado a FVIL4, a estrutura de cristal de IL4 (1RCB.pdb) foi ancorada ao modelo de homologia de FVIL4. Em seguida, vinte e dois modelos putativos do complexo foram gerados, os quais mereceram consideração adicional.
[00275] Em paralelo, o modelo de homologia de FVIL4 foi ancorado a FVIL13 extraído de uma estrutura de cristal in-house do complexo IL13/FabIL13. Uma solução superior foi encontrada, o que permitiu construção de ligantes relativamente curtos enquanto não mostrando nenhuma interferência estérica para ligação ao antígeno e colocação dos domínios constantes como foi o caso para imunoglobulinas de região variável dupla (vide Figura 3). Nesta disposição, FVIL4 (VL1) foi posto no terminal N da cadeia leve, seguido por FVIL3 (VL12) e Fc (CL1) no terminal C da cadeia leve. Na cadeia pesada, FVIL13 (VH2) foi posto N-terminalmente, seguido por FVIL4 (VH1) e as regiões constantes (CH1 - CH2 - CH3).
[00276] Conforme mostrado na Tabela 3, os modelos da cadeia leve sugeriram que o ligante L1 entre os domínios VL1 e VL2 e o ligante L2 entre os domínios VL2 e CL1 deveriam estar entre um a três e zero a dois resíduos glicina de comprimento, respectivamente. Modelos da cadeia pesada sugeriram que o ligante L3 entre os domínios VH2 e VH1 e o ligante L4 entre os domínios VH e CH1 deveriam estar entre dois a seis e quatro a sete resíduos glicina, respectivamente (vide Tabela 3 e Figura 2). Neste exemplo, glicina foi usada como um aminoácido prototípico para os ligantes, mas outros resíduos de aminoácido podem também servir como ligantes. A estabilidade estrutural dos modelos propostos foi verificada através da otimização das conformações, minimização e cálculos de dinâmica molecular do ligante. Combinação sistemática entre construtos de quatro cadeias leves e seis cadeias pesadas resultou em 24 proteínas de ligação tipo anticorpo anti-IL14 e anti-IL13 biespecíficas de região variável dupla cruzada (vide Tabela 4). Tabela 3. Comprimentos de Ligante Propostos
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[00277] *Um código de taquigrafia foi concebido para representar as estruturas associadas. Códigos começando com HC representam a cadeia pesada adjacente e códigos começando com LC representam as cadeias leves adjacentes.
[00278] Na Tabela 4, o prefixo "anti" não está incluído, mas pretende significar que IL13 se refere a anti-IL13 e IL4 se refere a anti- IL4.
Exemplo 3. Geração de Plasmídeos de Expressão de CODV-Ig
[00279] Moléculas de ácido nucleico codificando as cadeias pesada e leve variáveis das seis cadeias pesadas e quatro cadeias leves descritas na Tabela 4 foram geradas através de síntese de gene na Geneart (Regensburg, Alemanha). Os domínios de cadeia leve variáveis foram fundidos à cadeia leve constante (IGKC, No. de Acesso GenBank No. Q502W4) através de digestão com as endonucleases de restrição ApaLI e BsiWI e subsequentemente ligados aos sítios ApaL1/BsiWI do vetor de expressão epissomal pFF, um análogo do vetor pTT descrito por Durocher e outros (2002, Nucl. Acids Res. 30(2): E9), criando o plasmídeo de expressão de mamífero para expressão das cadeias leves.
[00280] Os domínios de cadeia pesada variáveis foram fundidos à variante "Ted" da cadeia pesada constante humana (IGHG1, No. de Acesso GenBank 569F4) ou, alternativamente, ao domínio CH1 marcado com 6x His da IGHG1 constante humana a fim de criar um Fab específico. Em seguida, o domínio VH foi digerido com as endonucleases de restrição ApaLI e ApaI e então fundido à IGHH1 ou domínio CH1 marcado com His, respectivamente, através de ligação nos sítios ApaLI/ApaI do vetor de expressão epissomal pFF, criando os plasmídeos de expressão de mamífero para expressão das cadeias pesadas (IgG1 ou Fab, respectivamente).
Exemplo 4. Expressão de CODV-Ig
[00281] Os plasmídeos de expressão codificando as cadeias pesada e leve dos construtos correspondentes foram propagados em células DH5a de E. coli. Plasmídeos usados para transfecção foram preparados a partir de E. coli usando o Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit.
[00282] Células HEK 293-FS cultivadas em Freestyle Medium (Invitrogen) foram transfectadas com plasmídeos LC e HC indicados codificando as cadeias pesadas e cadeias leves mostradas na Tabela 4 usando reagente de transfecção 293fectina (Invitrogen) conforme descrito pelo fabricante. Depois de 7 dias, as células foram removidas através de centrifugação e o sobrenadante foi passado por um filtro de 0,22 μm para remover partículas.
[00283] Construtos de CODV-IgG1 foram purificados através de cromatografia de afinidade em colunas de Proteína A (HiTrap Protein A HP Columns, GE Life Sciences). Após eluição a partir da coluna com tampão de acetato 100 mM e NaCl 100 mM, pH 3,5, os construtos CODV-IgG1 foram dessalgados usando Coluna de Dessalinização HiPrep 26/10, formulados em PBS em uma concentração de 1 mg/mL e filtrados usando uma membrana de 0,22 μm.
[00284] Construtos de CODV Fab biespecíficos foram purificados através de IMAC em Colunas HiTrap IMAC HP (GE Life Sciences). Após eluição a partir da coluna com um gradiente linear (tampão de eluição: fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0,5M, imidazol 50-500 mM, pH 7,4), as frações contendo proteína foram agrupadas e dessalinizadas usando Colunas de Dessalinização HiPrep 26/10, formuladas em PBS em uma concentração de 1 mg/mL e filtradas usando uma membrana de 0,22 μm.
[00285] A concentração de proteína foi determinada através da medição de absorbância a 280 nm. Cada batelada foi analisada através de SDS-PAGE sob condições de redução e não redução para determinar a pureza e o peso molecular de cada subunidade e do monômero.
[00286] Uma placa Nunc F96-MaxiSorp-Immuno foi revestida com IgG anti-Humano de cabra (específico de Fc) [NatuTec A80-104A]. O anticorpo foi diluído a 10 μg/ml em tampão de revestimento de carbonato (carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6) e administrado a 50 μL por cavidade. A placa foi vedada com fita adesiva e armazenada de um dia para o outro a 4° C. A placa foi lavada três vezes com Tampão de lavagem (PBS, pH 7,4 e Tween20 0,1%). 150 μL de solução de bloqueio (BSA/PBS 1%) foram administrados em cada cavidade para cobrir a placa. Depois de 1 hora em temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com Tampão de lavagem. 100 μL de amostra ou padrões (em uma faixa de a partir de 1500 nm/ml a 120 ng/m) foram adicionados e deixados assentar por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com Tampão de lavagem. 100 μL de conjugado IgG anti-Humano de cabra-FC - HRP [NatuTec A80-104P- 60] diluídos 1:10.000 foram adicionados usando solução de incubação (BSA 0,1%, PBS, pH 7,4 e Tween20 0,05%). Depois de 1 hora de incubação em temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com Tampão de lavagem. 100 μL de substrato de ABTS (comprimido de ABTS 10 mg (Pierce 34026) em Na2HPO4 0,1M, solução de ácido cítrico 0,05M, pH 5,0). Adição de 10 μL de H2O2 30%/ 10 ml de tampão de Substrato antes do uso) foi administrada a cada cavidade, e a cor foi deixada se desenvolver. Depois da cor desenvolvida (aproximadamente 10 a 15 minutos), 50 μL de solução SDS 1% foram adicionados para parar a reação. A placa foi lida a A405.
Exemplo 5. Caracterização de Variantes de CODV-Ig
[00287] Para determinar se as cadeias pesada e leve de proteína tipo anticorpo CODV-Ig estavam emparelhando e dobrando apropriadamente, o nível de agregação foi medido através de cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC) (Size-Exclusion Chromatography). SEC analítica foi realizada em pares montados usando um ÃKTA explorer 10 (GE HEalthcare) equipado com uma coluna TSKgel G3000SWXL (7,8 mm x 30 cm) e coluna de guarda TSKgel SWXL (Tosoh Bioscience). A análise foi realizada a 1 ml/min usando NaCl 250 mM, Na-fosfato 100 mM, pH 6,7, com detecção a 280 nm. 30 μL de amostra de proteína (a 0,5-1 mg/ml) foram aplicados na coluna. Para estimativa do tamanho molecular, a coluna foi calibrada usando uma mistura padrão de filtragem em gel (MWGF- 1000, SIGMA Aldrich). Avaliação de dados foi realizada usando software UNICORN v5.11.
[00288] A Tabela 5 mostra os resultados do primeiro conjunto de 24 moléculas CODV-Ig diferentes feitas usando as combinações de região variável anti-IL14 e anti-IL13 descritas na Tabela 4. Os códigos fornecidos na Tabela 4 representam as estruturas adjacentes mostradas na Tabela 4. Para os pares de cadeia leve e cadeias pesadas onde proteína foi produzida, níveis de agregação foram medidos usando SEC. Os resultados são mostrados na Tabela 5 onde LC4 (L1 = 1; L2 = 2) foi o mais bem sucedido em emparelhamento com todas as seis cadeias pesadas. LC4 corresponde à estrutura IL4 VL- (Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1 tendo ligante L1 igual a 1, onde um resíduo de aminoácido único separava os dois domínios VL da cadeia leve de região variável dupla. Ainda, LC4 tinha L2 igual a 2, que continha um ligante de dipeptídeo Gly-Gly entre o VL central e o CH1 C-terminal. Tabela 5. Níveis de Agregação Dentre Pares de Cadeias Pesadas e Leves
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[00289] *ND indica que nen huma proteína foi produzida
[00290] Onde moléculas CODV-Ig foram produzidas, um experimento BIACORE de concentração única em concentrações de IL13 e IL14 intermediárias foi realizado para verificar ligação a antígenos alvo. Moléculas tipo anticorpo CODV-Ig correspondendo às combinações LC4:HC4 e LC4:HC6 descritas na Tabela 4 foram escolhidas para avaliação de uma análise cinética integral usando ressonância de plasmon de superfície.
[00291] Conforme mostrado na Tabela 5, a maioria das moléculas CODV-Ig não pôde ser produzida de maneira alguma ou apenas como agregados (até 90%). As combinações de cadeia pesada/cadeia leve dando origem a níveis de agregação aceitáveis (5-10%) após uma etapa de cromatografia foram as combinadas com a cadeia leve IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1. A cadeia leve era a cadeia mais sensível com essas variantes de CODV-Ig e serviu como plataforma para aceitar cadeias pesadas diferentes com composições de ligante diferentes.
Análise Cinética
[00292] Dois pares de cadeias pesada e leve foram selecionados para análise cinética integral. IL13 e IL14 humanos recombinantes foram comprados da Chemicon (USA). Caracterização cinética de anticorpos purificados foi realizada usando tecnologia de ressonância de plasmon de superfície em um BIACORE 3000 (GE Healthcare). Um ensaio de captura usando um anticorpo específico de espécie (por exemplo, MAB 1302 específico de Fc-humano, Chemicon) para captura e orientação dos anticorpos investigados foi usado. O anticorpo de captura foi imobilizado através de grupos amino primários (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. O anticorpo analisado foi capturado em uma taxa de fluxo de 10 μL/min com um valor RU ajustado que resultaria em ligação de analito máxima de 30 RU. Cinéticas de ligação foram medidas contra IL4 e IL3 humanos recombinantes em uma faixa de concentração entre 0 a 25 nM em HBS EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e Tensoativo P20 0,005%) em uma taxa de fluxo de 30 μl/min. As superfícies do chip foram regeneradas com glicina 10 mM, pH 2,5. Os parâmetros cinéticos foram analisados e calculados no pacote de programa BIAevaluation V4.1 usando uma célula de fluxo sem anticorpo capturado como referência.
[00293] A Tabela 6 mostra a comparação de cinética dos anticorpos BB13 (anti-IL13) e 8D4 (anti-IL4) parentais (expressos como IgGs) com os respectivos domínios dentro do formato CODV-Ig (Tabela 4, Códigos LC4:HC4 e LC4:HC6). Conforme mostrado na Tabela 6, os construtos CODV-Ig não exibiram propriedades de ligação menor contra os antígenos correspondentes, quando comparado com os anticorpos anti-IL13 e anti-IL14 parentais. A perda na taxa de associação observada no formato DVD-Ig/TBTI usando as mesmas sequências de Fv não ocorreu com a configuração CODV-Ig. Os sítios de ligação faceando oposto devem permitir ligação ao antígenos grandes ou formação de ponte de células diferentes com uma configuração tipo anticorpo biespecífica, e seriam também adequados para uma seleção mais ampla de anticorpos parentais. Uma vantagem adicional do CODV-Ig foi que quaisquer resíduos de ligante se projetaram para o sítio de ligação ao antígeno e reduziram acessibilidade do antígeno. Tabela 6. Análise Cinética de LC4:HC4 e LC4:HC6
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Co-injeção de IL4 e IL13 para Demonstração de Ligação ao antígeno Aditiva por CODV-Ig
[00294] Para investigar ligação aditiva de ambos os antígenos, um método de co-injeção direcionado por assistente foi aplicado, onde um antígeno foi injetado imediatamente seguido pelo outro antígeno após um tempo de defasagem (IL4, então IL3 e vice versa). O nível de ligação resultante poderia ser comparado com aquele obtido com uma mistura 1:1 de ambos os antígenos na mesma concentração. A fim de mostrar ligação aditiva de ambos os antígenos IL4 e IL13 pelas moléculas CODV-Ig, um experimento BIACORE foi realizado com uma combinação CODV-Ig [HC4:LC4] através de co-injeção de ambos os antígenos em três ciclos de análise separados (vide Figura 4). A co- injeção foi feita com IL4 3,125 nM/IL13 25 nM (e vice versa) e com uma mistura 1:1 de IL4 3,125 nM e IL13 25 nM. Uma co-injeção de tampão HBS-EP foi feita como uma referência. No ponto de tempo de 800 segundos, um nível de ligação idêntico de 63 RU foi obtido após injeção da mistura de antígeno ou co-injeção dos antígenos, sem importar a sequência de co-injeção. Quando a proteína CODV-Ig tinha sido saturada pelo primeiro antígeno (IL4), o segundo antígeno (IL13) foi injetado e um segundo sinal de ligação foi observado. Esta observação foi reproduzida quando a sequência de injeção de antígeno foi revertida. Isso demonstra a ligação aditiva e de não inibição de ambos os antígeno por CODV-Ig. Desta maneira, o construto CODV-Ig foi capaz de se ligar a ambos os antígenos simultaneamente (isto é, exibe biespecificidade) saturando todos os sítios de ligação (isto é, tetravalência exibida).
Exemplo 6. Tolerância de Comprimentos de Ligante para CODV-Ig
[00295] A tolerância para ligantes de vários comprimentos foi avaliada através da construção de moléculas CODV-Ig tendo combinações diferentes de comprimentos de ligante para L1, L2 na cadeia leve e L3 e L4 na cadeia pesada. Construtos de CODV-Ig foram gerados com ligantes de cadeia pesada L3 e L4 variando entre 1 a 8 resíduos para L3 e ou 0 ou 1 resíduo para L4. A cadeia pesada continha anti-IL4 como o domínio de ligação N-terminal e anti-IL13 como o domínio de ligação C-terminal seguido por CH1-Fc. Os ligantes de cadeia leve L1 e L2 foram variados de 3 a 12 resíduos para L1 e de 3 a 14 resíduos para L2. A cadeia leve continha anti-IL13 como o domínio de ligação N-terminal e anti-IL4 como o domínio de ligação C-terminal seguido por CL1.
Caracterização para Variantes de CODV-Ig
[00296] Determinação de nível de agregação foi através de cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC). SEC analítica foi realizada usando um ÃKTA explorer 10 (GE Healthcare) equipado com uma coluna TSKgel G3000SWXL (7,8 mm x 30 cm) e coluna de guarda TSKgel SWXL (Tosoh Bioscience). A análise foi realizada a 1 ml/min usando NaCl 250 mM, Na-fosfato 100 mM, pH 6,7, com detecção a 280 nm. 30 μL de amostra de proteína (a 0,5-1 mg/ml) foram aplicados à coluna. Para estimativa do tamanho molecular, a coluna foi calibrada usando uma mistura de padrão de filtragem em gel (MWGF-1000, SIGMA Aldrich). Avaliação de dados foi realizada usando software UNICORN v5.11.
[00297] IL13 e IL14 humanos recombinantes foram comprados da Chemicon (USA). TNF-α humano recombinante foi comprado da Sigma Aldrich (H8916-10 μg), IL-1β humano recombinante (201- LB/CF), IL-23 humano recombinante (1290-IL/CF), EGFR humano recombinante (344 ER) e HER2 humano recombinante (1129-ER-50) foram comprados da R&D Systems.
[00298] Análise de ligação cinética através de Biacore foi realizada como segue. Tecnologia de ressonância de plasmon de superfície em um Biacore 3000 (GE Healthcare) foi usada para caracterização cinética detalhada de anticorpos purificados. Um ensaio de captura usando um anticorpo específico de espécie (por exemplo, MAB 1302 específico de Fc humano, Chemicon) para captura e orientação dos anticorpos investigados foi usado. Para determinação de cinética de ligação de IL4 e IL13, os Fabs de CODV correspondentes como no Exemplo 10, Tabela 12, foram capturados usando o anti-human Fab capture Kit (GE Healthcare). O anticorpo de captura foi imobilizado através de grupos amina primários (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. O anticorpo analisado foi capturado em uma taxa de fluxo de 10 μL/min com um valor RU ajustado que resultaria em ligação de analito máxima de 30 RU. Cinéticas de ligação foram medidas contra IL4 e IL13 humanos recombinantes em uma faixa de concentração entre 0 a 25 nM em HBS EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 MM, Tensoativo P20 0,005%) em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. As superfícies dos chips foram regeneradas com glicina 10 mM pH 2,5. Parâmetros cinéticos foram analisados e calculados no pacote de programa BIAevaluation v4.1 usando uma célula de fluxo sem anticorpo de captura como uma referência.
[00299] Afinidades de ligação de CODV-Ig, CODV-Fab e TBTI contra EGFR e HER2 foram medidas usado um sistema de disposição de interação de proteína Proteon XPR36 (Biorad). Os antígenos foram imobilizados através de acoplamento reativo de amina em GLC sensor chips (Biorad). Séries de diluição das variantes de anticorpo específicas em tampão PBSET (Biorad) foram analisadas em paralelo em modo de cinética de one-shot com referência dupla. Os dados foram analisados usando Proteon Manager Software v3.0 (Biorad) ou com modelo Langmuir 1:1 com transferência de massa ou modelo de analito bivalente.
[00300] A Tabela 7 sumariza os resultados para rendimento, agregação (conforme medido através de cromatografia de exclusão de tamanho) e afinidade de ligação para CODV-Ig tendo combinações de tamanhos diferentes de ligantes. Os resultados revelaram que moléculas de CODV-Ig onde L2 era zero geralmente não poderiam ser produzidas, ou onde proteína foi produzida, houve um nível alto de agregação (vide ID de Bateladas Nos. 101, 102, 106-111 e 132-137 na Tabela 7). Desta maneira, em contraste com a previsão de modelagem molecular do Exemplo 2, onde L2 igual a zero estava dentro da faixa aceitável, esses resultados indicam que a transição VL2-CL (ou L2) requer um ligante de pelo menos um resíduo (vide Tabela 7). Tabela 7. Otimização de Tamanhos de Ligante para CODV-Ig
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[00301] *Alinhamento na cadeia pesada deve ser IL13VH-L3-IL4VHL4-CH1-Fc
[00302] 1n.p. significa que o construto não foi capaz de ser produzido.
[00303] Ainda, os comprimentos de ligante de CODV-Ig descritos acima foram verificados ser mais sensíveis a aumentos em 1 resíduo de aminoácido do que aumentos em 2 resíduos de aminoácidos. Por exemplo, enquanto Batelada ID Nos. 103 e 104 diferem em 1 resíduo de aminoácido em L2, Batelada ID No. 103 mostra agregação 6 vezes mais e Batelada ID No. 104 exibe menos agregação e duas vezes o rendimento. Em contraste, a Batelada ID Nos. 104 e 105, que diferem por dois resíduos em L2, exibiram perfis similares com relação a rendimento, agregação e ligação.
Exemplo 7. Cadeia Pesada como Cadeia Modelo para CODV-Ig
[00304] Nos exemplos 1 a 5, os tamanhos de ligante curtos ótimos na cadeia leve sugeriram que a cadeia leve estava servindo como um modelo ao permanecer em uma disposição linear e que ligantes maiores eram necessários na cadeia pesada a fim de que a cadeia pesada dobrasse apropriadamente na configuração cruzada para se conformar com a cadeia leve modelo (vide Figura 5, Painel A). Se os ligantes curtos especificamente postos na cadeia pesada para manter uma disposição linear na cadeia pesada tornaram a cadeia pesada a cadeia "modelo", e se o padrão se repetiria e ligantes maiores seria necessários para permitir que a cadeia não modelo dobrasse apropriadamente e acomodasse a cadeia pesada agora modelo foram avaliados em seguida (vide Figura 5, Painel B).
[00305] A Figura 6 ilustra esses princípios de projeto de CODV-Ig com base em ter ou a cadeia leve ou a cadeia pesada como o "modelo". Para avaliar a natureza genérica deste conceito, construtos de CODV-Ig foram gerados com ligantes de cadeia pesada L3 e L4 variando entre 1 a 8 resíduos para L3 e ou 0 ou 1 resíduo para L4. A cadeia pesada continha anti-IL4 como o domínio de ligação N-terminal e anti-IL13 como o domínio de ligação C-terminal seguido por CH1-Fc. Os ligantes de cadeia leve L1 e L2 foram variados de 3 a 12 resíduos para L1 e de 3 a 14 resíduos para L2. A cadeia leve continha anti-IL13 como o domínio de ligação N-terminal e anti-IL4 como o domínio de ligação C-terminal seguido por CL1.
[00306] A Tabela 8 sumariza os resultados para rendimento, agregação (conforme medido através de cromatografia de exclusão de tamanho) e afinidade de ligação para CODV-Ig tendo combinações de tamanho diferentes de ligante e onde a cadeia pesada é mantida em uma disposição linear como a cadeia modelo e a cadeia leve é deixada dobrar em uma configuração cruzada. Os resultados revelaram que moléculas de CODV-Ig onde L4 era zero geralmente não poderiam ser produzidas, ou onde a proteína foi produzida, houve um nível de agregação alto (similar às moléculas onde L2 era igual a zero) (vide Batelada ID Nos. 207-209, 211-212, 219-224, 231-236, 243-252 e 263-266 na Tabela 8). Uma exceção foi a Batelada ID No. 210, onde L1 era 7, L2 era 5, L3 era 2 e L4 era zero. Esta disposição produziu uma quantidade suficiente de proteína e tinha um nível aceitável de agregação e ligação, o que sugeriu que alguma combinação de tamanhos de ligante poderia ser encontrada para compensar um ligante de comprimento zero em L4 em algumas circunstâncias. Tabela 8. Otimização de Tamanhos de Ligante com Cadeia Pesada como Molde Batela-da
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*Alinhamento na cadeia leve deve ser IL13VL-L1-IL4VL-L2-CL1
[00307] Os resultados das Tabelas 7 e 8 mostram claramente que ligantes são necessários entre os domínios variáveis e constantes para permitir dobra ótima. Apenas em disposições raras um ligante igual a zero foi tolerado (vide Batelada ID Nos. 103-105, onde L1 (LC) foi zero e Batelada No. 210, onde L4 era zero). No entanto, em cada caso, o ligante de transição correspondente entre a região variável e a região constante na outra cadeia não poderia ser zero.
[00308] Os resultados acima indicaram que as combinações L1=7, L2=5, L3=1 e L4=2 eram um ponto de partida bom para otimização de um novo CODV-Ig onde a cadeia pesada é o modelo. As faixas na Tabela 9 foram mostradas ser faixas razoáveis para engenharia bem sucedida de um novo CODV-Ig a partir de dois anticorpos parentais. Tabela 9. Faixas de Tamanhos de Ligante para ou LC ou HC como Modelo Ligante LC como Modelo HC como Modelo
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Exemplo 8. Aplicabilidade Universal de Formato CODV-Ig
[00309] Para avaliar a adequabilidade do formato CODV-Ig para engenharia de novas proteínas de ligação tipo anticorpo, as regiões variáveis de vários anticorpos humanos e humanizados existentes tendo especificidade para receptor de fator de crescimento do tipo insulina 1 (IGF1R(1)), um segundo anticorpo para receptor de fator de crescimento do tipo insulina 1 (IGF1R(2)), receptor de fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2), receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR), fator-alfa de necrose de tumor (TNFα), Interleucina 12 e 23 (IL12/23) e interleucina 1-beta (IL-1β) foram incorporadas ao formato CODV-Ig (vide Tabela 10). Tabela 10. Códigos Descritivos para Cadeias Pesada e Leve Usadas em CODV-Ig Biespecífico
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[00310] *Um código de taquigrafia foi concebido para representar as estruturas associadas. Códigos começando com HC representam a cadeia pesada adjacente e códigos começando com LC representam as cadeias leves adjacentes.
[00311] As regiões variáveis de anticorpo de anticorpos humanos e humanizados conhecidos foram usadas para testar a aplicabilidade universal do formato CODV-Ig no projeto de proteínas de ligação tipo anticorpo biespecífica. Ainda, a possibilidade de efeitos posicionais com relação à colocação de certas regiões variáveis de anticorpo ou N-terminal ou C-terminal ou na cadeia pesada ou na cadeia leve foi examinada. Com base no projeto de moléculas de CODV-Ig tendo uma composição de ligante de L1=7, L2=5, L3=1 e L4=2, sequências de anticorpos diferentes foram introduzidas no formato CODV-Ig.
[00312] Atividades de anticorpos biespecíficos ou derivados contra IL1β e TNFα foram determinadas através do uso de células repórteres HEK-Blue TNFα/IL1β comercialmente disponíveis (InvivoGen). Para determinar as atividades de anticorpo contra TNFα e IL1β, as citocinas foram pré-incubadas por 1 hora com concentrações diferentes de anticorpos e adicionadas a 50.000 células HEK-Blue TNFα/IL1β. Indução de SEAP mediada por citocina foi medida após 24 horas no sobrenadante de cultura com o ensaio QUANTI-Blue (InvivoGen).
[00313] Conforme mostrado na Tabela 11, todos os construtos mostraram rendimento de proteína bom a excelente e níveis aceitáveis de agregação (vide, em particular, Batelada ID Nos. 301 e 302 na Tabela 11). A afinidade de medição para cada domínio variável de anticorpo estava dentro da afinidade publicada ou esperada. Em casos onde afinidade foi avaliada, quaisquer efeitos posicionais foram detectados. Em suma, conforme mostrado nas tabelas que seguem, quaisquer efeitos posicionais foram vistos com quaisquer dos domínios variáveis de anticorpo usados ou com o uso desses domínios em qualquer cadeia de anticorpo. Tabela 11. Uso Universal de Formato CODV-Ig para Proteínas de Ligação Tipo Anticorpo Biespecíficas
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00314] *n.m. = não medido por um Biacore
[00314] *n.m. = não medido por um Biacore
[00315] 1 - Cadeia pesada e cadeias leves correspondendo a códigos podem ser encontradas na Tabela 10
Exemplo 9. Retenção de Afinidade de Anticorpo Parental em Formato CODV-Ig
[00316] As sequências de anticorpo idênticas para anti-IL4 e anti- IL13 foram incorporadas aos formatos ou TBTI/DVD-Ig ou CODV-Ig para comparação direta dessas configurações, o posicionamento dos ligantes e afinidades das moléculas resultantes. Conforme mostrado na Figura 7, a afinidade parental de cada um dos anticorpos foi mantida no formato CODV. Conforme mostrado no painel superior da Figura 7, quando as regiões variáveis foram postas no formato TBTI/DVD-Ig, uma queda em afinidade do anticorpo IL4 posicionado na posição de Fv2 interna foi manifestada como uma redução da taxa de associação de ligação de anticorpo para o antígeno. Em contraste não houve nenhuma perda em afinidade para o formato CODV-Ig conforme comparado com os anticorpos parentais (vide Figura 7, painel inferior).
Exemplo 10. Adaptabilidade de CODV-Ig ao Formato Fab
[00317] A habilidade do formato CODV-Ig em prover fragmentos tais como fragmentos Fab foi avaliada em seguida. Duas cadeias pesadas variáveis diferentes foram fundidas umas às outras através do ligante L3 e alongadas C-terminalmente pelo ligante L4. Este complexo VH foi então fundido ao domínio CH1 de IGHGI (No. de Acesso GenBank Q569F4) carregando C-terminalmente a sequência de cinco aminoácidos DKTHT (SEQ ID NO: 60) da região de dobra seguido por seis resíduos histidina. Duas cadeias leves variáveis diferentes foram fundidas umas às outras em uma configuração cruzada para a cadeia pesada correspondente através do ligante L1 e estendidas C-terminalmente pelo ligante L2 e subsequentemente fundidas à cadeia kappa constante (IGKC, No. Acesso GenBank Q502W4).
[00318] Fragmentos Fab foram expressos através de transfecção transiente conforme anteriormente descrito. Sete dias pós-infecção, as células foram removidas através de centrifugação, Tris-HCl 1M 10% vol/vol, pH 8,0, foi adicionado e o sobrenadante foi passado por um filtro de 0,22 μm para remover partículas. As proteínas Fab foram capturadas usando colunas HisTrap High Performance (GE Healthcare) e eluídas através de gradiente imidazol. As frações contendo proteína foram agrupadas e dessalinizadas usando colunas PD-10 ou Sephadex. As soluções de proteína concentradas e filtradas estéreis (0,22 μm) foram ajustadas para 1 mg/ml e mantidas a 4° C até uso.
[00319] Vantagens imediatas foram observadas pelo fato que as moléculas tipo Fab em uma orientação CODV não mostraram nenhuma tendência em agregar e retiveram as afinidades dos anticorpos parentais (vide Tabela 12). Construtos de proteína de ligação da de Batelada ID Nos. 401-421 compararam diretamente proteínas tipo anticorpo onde regiões variáveis de anticorpo foram dispostas como em moléculas CODV-Ig com a cadeia pesada como o molde (401, 402, 406 e 407), fragmentos tipo CODV Fab (402, 408, 413, 418 e 421), moléculas tipo anticorpo de quatro domínios em formato TBTI/DVD-Ig (404, 409, 414 e 419) e CODV-Ig sem quaisquer ligantes (405, 410, 415 e 420). Conforme mostrado na Tabela 12, os resultados desta comparação indicaram que é mais provável haver uma perda em afinidade comparado com os anticorpos parentais quando a região variável é incorporada a um formato TBTI ou DVD-Ig. Em contraste, ambos os formatos tipo CODV-Ig e CODV-Ig Fab foram capazes de manter melhor afinidades parentais . Os resultados confirmaram mais que moléculas CODV-Ig requerem ligantes entre as regiões variáveis e entre as regiões variáveis e os domínios constantes (vide Tabela 12). Tabela 12. Uso do Formato CODV-Ig para Fragmentos Tipo Fab Batela da ID Amostra ID Formato LI L2 Lβ L4 Rendim ento [mg/L] Agreg ação [%] KD (Antígeno 1) [pM] KD
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Exemplo 11. Substituição de Domínios Variáveis Dentro de CODV-Ig e CODV-Fab
[00320] Para caracterizar o formato CODV em uma abordagem envolvente de célula T, proteínas de ligação tipo CODV Fab biespecíficas (CODV-Fab) tendo um sítio de ligação de TCR (CD3epsilon) e um sítio de ligação de CD19 foram geradas e comparadas a um Fab biespecífico derivado do formato TBTI/DVD-Ig (B-Fab). Para investigar a importância da orientação dos sítios de ligação (TCR x CD19 vs. CD19 x TCR), ambas as orientações foram avaliadas para cada uma das proteínas de ligação.
[00321] As proteínas de ligação foram caracterizadas em um ensaio citotóxico usando células NALM-6 (expressando CD19) como células alvo e células T humanas primárias como células efetoras. Células positivas para CD3 foram isoladas de PBMC's humanas recém- preparadas. Células efetoras e alvo foram misturadas em uma razão de 10:1 e incubadas por 20 horas com as concentrações indicadas de proteínas de ligação biespecíficas (vide Figura 8). Células alvo apoptóticas foram determinadas em um ensaio baseado em FACS usando tingimento com 7-Aminoactinomicina.
[00322] O formato B-Fab na configuração CD3-CD19 (1060) foi mostrado ser ativo na indução de citotoxidez mediada por célula T com relação a células NALM-6 com uma EC50 de 3,7 ng/ml. Uma atividade similarmente alta foi observada para o CODV-Fab CD19-CD3 (1109) com uma EC50 de 3,2 ng/ml (vide Figura 8).
[00323] Uma permuta da configuração da molécula B-Fab (Fab do formato TBTI/DVD-Ig) para uma orientação CD19-CD3 resultou em uma perda de atividade significante (vide Figura 8). A molécula B-Fab permutada não mostrou nenhuma atividade nas concentrações que eram máximas para ambas as orientações de CODV-Ig Fab e a outra orientação de B-Fab. Para os CODV-Ig Fabs e uma orientação de B- Fab, uma resposta máxima foi observada (variando entre 1 e 100 ng/ml). Para a orientação CD19-CD3 de B-Fab, mesmo na concentração máxima (30 μg/ml), a resposta de citotoxidez ótima não foi atingida. Em contraste notável, uma mudança na orientação dos domínios no CODV-Fab para CD3-CD19 (1108) resultou em uma molécula com atividade significante neste ensaio (vide Figura 8). Embora permuta de domínio no CODV-Fab também tenha reduzido a indução de citotoxidez mediada por célula T (aumento de EC50 em fator ~100), este efeito era muito menos pronunciado do que foi visto no formato B-Fab e a molécula foi capaz de induzir citotoxidez até o nível máximo. Os dados eram representativos e foram obtidos a partir de três experimentos independentes.
Exemplo 12. Influência de Identidade de Sequência de Aminoácido sobre Ligantes CODV-Ig
[00324] O construto otimizado correspondendo à Batelada ID 204 (vide Exemplo 7 e Tabela 8) foi escolhido para investigar a influência de composição de ligante sobre os ligantes L1 a L4. Os comprimentos do ligante foram ajustados em 7, 5, 1 e 2 resíduos de comprimento para L1, L2, L3 e L4, respectivamente (vide Tabela 13). As sequências foram derivadas de ligantes de ocorrência natural nas transições entre domínios VH e CH1 de anticorpo natural ou entre domínios Fv e CL de anticorpo de cadeias leves kappa ou lambda. As sequências candidatas eram ASTKGPS (SEQ ID NO: 48), que é derivada da transição do domínio VH e CH1, RTVAAPS (SEQ ID NO: 49) e GQPKAAP (SEQ ID NO: 50), que foram derivadas das transições de domínio Fv e CL de cadeias leves kappa e lambda, respectivamente. Ainda, um construto foi gerado com uma composição ligante arbitrária para mostrar que qualquer sequência pode ser potencialmente usada em ligantes L1 a L4. Esta composição ligante foi obtida através de distribuição aleatória dos aminoácidos valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina nas 15 posições de quatro ligantes. Os aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano, bem como os aminoácidos metionina e cisteína, foram delibera- damente excluídos para evitar aumentos potenciais em agregação.
[00325] Um modelo tridimensional do construto para Batelada ID No. 204 foi gerado para assegurar adequabilidade ou refinar as escolhas de composição ligante. Desta maneira, serina foi escolhida para ligante L3 uma vez que resíduos positivamente e negativamente carregados são observados próximo no modelo tridimensional. Os resíduos no ligante L4 foram selecionados para serem compatíveis com exposição a solvente dessas posições conforme sugerido pelo modelo. Similarmente, quaisquer problemas foram antecipados ou previstos para as composições de ligante de L1 e L2. Modelos tridimensionais de propostas selecionadas para composição de ligante foram construídos.
[00326] Conforme mostrado na Tabela 12, composição de ligante pode ter uma influência dramática sobre rendimento. Sequências que foram derivadas de cadeia lambda em L1 (comparando Batelada ID Nos. 505-507 com Batelada ID Nos. 501-503) eram geradoras de proteína mais produtivos (aumento de até 8 vezes). Na verdade, os ligantes com base em geração aleatória também produziram bons rendimentos, conforme mostrado na Tabela 13, Batelada ID No. 508. Desta maneira, composições de ligante devem ser um parâmetro considerado durante otimização de CODV-Ig. Tabela 13. Efeito de Composição de Ligante Sobre CODV-Ig
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[00327] Atividades de anticorpos específicos ou derivados contra citocinas IL4 e IL13 foram determinadas em células repórteres HEK- Blue IL-4/IL-13 (InvivoGen). Células HEK-Blue IL-4/IL-13 são projetadas para monitorar a ativação do curso de STAT6 por IL-4 ou IL-13. Estimulação das células com qualquer citocina resulta em produção da fosfatase alcalina embriônica secretada por gene repórter (SEAP) (Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase), que pode ser medida no sobrenadante de cultura com o ensaio QUANTI-Blue. Para testar atividades de anticorpo contra IL-4 ou IL13, as citocinas foram pré-incubadas por 1 hora com concentrações diferentes dos anticorpos e adicionadas a 50.000 células HEK-Blue IL-4/IL-13. Indução mediada por citocina de SEAP foi medida após 24 horas de incubação no sobrenadante de cultura celular com o ensaio QUANTI-Blue (InvivoGen).
Exemplo 13. Introdução de Cisteínas em Ligantes CODV-Ig
[00328] Os dados publicados sugeriram que a estabilidade de anticorpos e proteínas derivadas de anticorpo pode ser aumentada através da introdução de pontes dissulfeto não naturais (vide Wozniak- Knopp e outros, 2012, "Stabilisation of the Fc Fragmento of Human IgG1 by Engineered Intradomain Disulfide Bonds", PLoS ONE 7(1): e30083). Para examinar se o fragmento Fc equivalente derivado de um anticorpo IgG1 humano e engenheirado em uma molécula CODV- Ig pode ser estabilizado através da introdução de pontes dissulfeto inter- e intra-cadeia, as posições Fc equivalentes do construto CODV- Ig Batelada ID No. 204 (do Exemplo 7) foram mutadas para resíduos cisteína, e as proteínas mutantes foram produzidas em excesso, purificadas e caracterizadas (vide Tabela 14).
[00329] Conforme mostrado na Tabela 14, cada uma das moléculas CODV-Ig mutadas contendo resíduos cisteína adicionais tinha temperaturas de fusão que eram as mesmas que a temperatura de fusão para o construto CODV-Ig Batelada ID No. 204.
[00330] Ainda, duas cisteínas simultâneas foram introduzidas nas posições Kabat 100 para a cadeia leve e 44 para a cadeia pesada em cada um dos domínios variáveis conforme descrito em Brinkmann e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 7538-42. Essas posições foram mostradas ser estruturalmente conservadas dentro de dobras de anticorpo, e então toleráveis de substituição de cisteína sem interferência com a integridade dos domínios individuais.
[00331] Conforme mostrado na Tabela 15, construtos CODV e CODV-Ig onde resíduos cisteína foram introduzidos em posições Kabat 100 para a cadeia leve e 44 para a cadeia pesada em cada um dos domínios variáveis tinham temperaturas de fusão maiores do que os construtos CODV e CODV-Ig onde resíduos cisteína não foram introduzidos nessas posições (vide, por exemplo, Batelada ID Nos. 704 e 706 e Batelada ID Nos. 713 e 714). Medições de Termoestabilidade de Variantes de CODV e TBTI
[00332] Pontos de fusão (Tm) de variantes de CODV e TBTI foram determinados usando fluorimetria de varredura diferencial (DSF) (Differential Scanning Fluorimetry). As amostras foram diluídas em tampão D-PBS (Invitrogen) para uma concentração final de 0,2 μg/ml e adicionadas a 2 μl de uma solução concentrada 40x de corante SYPRO-Laranja (Invitrogen) em D-PBS em placas de 96 cavidades com semi-saia brancas. Todas as medições foram feitas em duplicata usando um instrumento de PCR em tempo real MyiQ2 (Biorad). Valores Tm foram extraídos do primeiro derivado negativo das curvas de fusão usando Software iQ5 v2.1.
[00333] Em seguida, o efeito de introdução de resíduos cisteína diretamente no ligante ou dentro da região variável foi examinado. Neste exemplo, a Batelada ID No. 204 (do Exemplo 7 e Tabela 8) foi usada como a proteína de ligação de CODV-Ig modelo e glicina foi substituída por cisteína em L1, L3, ou a região variável com base no modelo tridimensional. Conforme mostrado na Tabela 16 abaixo, os resultados indicam como a introdução de pares de cisteína afetaria rendimento e agregação. As mutações pretendidas foram todas modeladas para certificar que ligações dissulfeto foram apropriadamente formadas e geometria correta foi mantida para os ligantes e seu ambiente nos modelos. Não obstante, a Batelada ID No. 808 mostrou bom rendimento e pouca agregação, então sugerindo que uma ponte de cisteína apropriada poderia ser formada.
[00334] Embora a invenção tenha sido descrita em termos de várias modalidades, é compreendido que variações e modificações vão ocorrer àqueles versados na técnica. Desta maneira, é pretendido que as reivindicações apensas compreendam todas tais variações equivalentes que se encontram no escopo da invenção conforme reivindicado. Ainda, os cabeçalhos de seção usados aqui são para propósitos de organização apenas e não devem ser considerados limitantes da matéria objeto descrita.
[00335] Cada modalidade aqui descrita pode ser combinada com qualquer outra modalidade ou modalidades a menos que claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica ou modalidade indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características ou modalidade ou modalidades indicadas como sendo preferidas ou vantajosas, a menos que claramente indicado o contrário.
[00336] Todas as referências mencionadas no presente pedido são expressamente incorporadas aqui a título de referência. Tabela 14. Efeito de Estabilização de Ponte Dissulfeto sobre CODV-Ig
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Claims (19)

1. Proteína de ligação tipo anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende duas cadeias polipeptídicas que formam dois sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende a estrutura VL1-L1-VL2-L2-CL e uma segunda cadeia polipeptídica compreende a estrutura VH2-L3-VH1-L4-CH1; em que: (a) (i) VL1 é derivado de um VH de um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e VH1 é derivado de um VL de uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina domínio variável; ou (ii) VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, VL2 é derivado de um VH de um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, VH2 é derivado de VL de um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina e VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; ou (iii) VL1 é derivado de VH de um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, VL2 é derivado de um VH de um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, VH2 é derivado de um VL de um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina e VH1 é derivado de um VL de um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; em que VL1 e VH1 se associam para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno e VL2 e VH2 se associam para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (b) CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; (c) CH1 é o domínio constante da cadeia pesada CH1 da imunoglobulina; (d) L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácidos; (e) pelo menos uma da primeira ou segunda cadeia polipeptídica compreende ainda um domínio Fc; e em que o primeiro e o segundo polipeptídeos formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada.
2. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é capaz de se ligar especificamente a um ou mais alvos de antígeno.
3. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que um ou mais alvos de antígeno são selecionados do grupo que consiste em B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3, C5, CCL11 (eotaxina), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (E-caderina), Quitinase, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (b 4 integrina), LEP (leptina), MHC de classe II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNFα, TNFSF4 (OX40 ligante), TNFSF5 (CD40 ligante), receptores tipo Toll, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91) e HMGB1.
4. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é biespecífica e capaz de se ligar a dois alvos de antígeno diferentes.
5. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os dois alvos de antígeno diferentes são selecionados do grupo que consiste em IL4 e IL13, IGF1R e HER2, IGF1R e EGFR, EGFR e HER2, BK e IL13, PDL- 1 e CTLA-4, CTLA4 e MHC de classe II, IL-12 e IL-18, IL-1α e IL-1β, TNFα e IL12/23, TNFα e IL-12p40, TNFα e IL1β, TNFα e IL-23, e IL17 e IL23.
6. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é capaz de inibir a função de um ou mais dos alvos de antígeno.
7. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ligantes selecionados do grupo que consiste em L1, L2, L3 e L4 contém pelo menos um resíduo de cisteína.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação tipo anticorpo, como definida na reivindicação 1.
9. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 3 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento; L2 tem 3 a 14 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 1 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento; e L4 tem 1 a 3 resíduos de aminoácidos de comprimento.
10. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 1 a 3 resíduos de aminoácidos de comprimento; L2 tem 1 a 4 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 2 a 15 resíduos de aminoácidos de comprimento; e L4 tem 2 a 15 resíduos de aminoácidos de comprimento.
11. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 5 a 10 resíduos de aminoácidos de comprimento; L2 tem 5 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 1 a 5 resíduos de aminoácidos de comprimento; e L4 tem 1 a 2 resíduos de aminoácidos de comprimento.
12. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 7 resíduos de aminoácidos de comprimento; L2 tem 5 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 1 resíduo de aminoácido de comprimento; e L4 tem 2 resíduos de aminoácidos de comprimento.
13. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 1 a 2 resíduos de aminoácidos de comprimento; L2 tem 1 a 2 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 4 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento; e L4 tem 2 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento.
14. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: L1 tem 1 resíduo de aminoácido em comprimento; L2 tem 2 resíduos de aminoácidos de comprimento; L3 tem 7 resíduos de aminoácidos de comprimento; e L4 tem 5 resíduos de aminoácidos de comprimento.
15. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc está ligado à região terminal carboxila da primeira ou segunda cadeia polipeptídica.
16. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc está ligado a CL e/ou CH1.
17. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tanto a primeira como a segunda cadeias polipeptídicas compreendem ainda um domínio Fc.
18. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc do primeiro polipeptídeo está ligado a CL e/ou ao Fc.
19. Proteína de ligação tipo anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc do primeiro polipeptídeo está ligado a CL e/ou o domínio Fc do segundo polipeptídeo está ligado a CH1.
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Families Citing this family (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
PL3235508T3 (pl) 2011-03-16 2021-07-12 Sanofi Kompozycje zawierające białko podobne do przeciwciała z podwójnym regionem v
TWI588156B (zh) 2011-03-28 2017-06-21 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
UA118950C2 (uk) 2011-04-22 2019-04-10 Аптево Рісьорч Енд Девелопмент Ллс Поліпептид, який зв'язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
SG11201404850SA (en) 2012-02-13 2014-09-26 Agency Science Tech & Res IL-1β NEUTRALIZING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
PL3366705T3 (pl) 2012-09-12 2023-09-18 Genzyme Corporation FC zawierające polipeptydy o zmienionej glikozylacji i zmniejszonej funkcji efektorowej
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
US9458244B2 (en) 2012-12-28 2016-10-04 Abbvie Inc. Single chain multivalent binding protein compositions and methods
MX2015008446A (es) 2012-12-28 2016-10-26 Abbvie Inc Composiciones de proteinas de union multivalentes.
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2897987A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
JP2016515093A (ja) * 2013-02-05 2016-05-26 サノフイ 抗体−薬物コンジュゲート療法とともに使用するための免疫イメージング剤
KR102494631B1 (ko) 2013-03-11 2023-02-06 젠자임 코포레이션 당조작을 통한 부위-특이적 항체-약물 접합
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AU2014232416B2 (en) 2013-03-15 2017-09-28 Xencor, Inc. Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014151910A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
TWI679019B (zh) 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
CN103509117B (zh) * 2013-05-06 2016-03-09 江苏匡亚生物医药科技有限公司 抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
US9481729B2 (en) * 2013-09-11 2016-11-01 The University Of Hong Kong Anti-HER2 and anti-IGF-IR BI-specific antibodies and uses thereof
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
KR102480433B1 (ko) * 2014-02-07 2022-12-21 맥마스터 유니버시티 3기능성 t 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도
ES2940903T3 (es) 2014-03-19 2023-05-12 Genzyme Corp Glucomanipulación específica del sitio de restos orientadores
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
CN104974258B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 重组抗hgf/dll4双特异性抗体、其制备方法和应用
US10647777B2 (en) 2014-05-28 2020-05-12 Genzyme Corporation Methods of controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions
RU2016151645A (ru) 2014-07-01 2018-08-03 Пфайзер Инк. Биспецифические гетеродимерные диантитела и их применение
PL3170005T3 (pl) * 2014-07-18 2019-10-31 Sanofi Sa Sposób przewidywania wyniku leczenia afliberceptem u pacjenta podejrzewanego o chorobę nowotworową
CN107108738A (zh) 2014-07-25 2017-08-29 西托姆克斯治疗公司 抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法
TWI711629B (zh) 2014-09-03 2020-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途
EP3204425B1 (en) 2014-10-09 2020-09-16 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
EA037065B1 (ru) 2014-11-26 2021-02-01 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
TN2017000223A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US20160168237A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
US20160175458A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
JP6947639B2 (ja) 2014-12-22 2021-10-13 システィミューン， インク．Ｓｙｓｔｉｍｍｕｎｅ， Ｉｎｃ． 二重特異性四価抗体並びにその製作及び使用方法
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MY191964A (en) 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
TWI733661B (zh) 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
SG11201707383PA (en) 2015-03-13 2017-10-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
ES2936088T3 (es) 2015-03-23 2023-03-14 Alexion Pharma Inc Filtración de virus
AR104368A1 (es) 2015-04-03 2017-07-19 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-cd20- / anti-baff
JP6786526B2 (ja) 2015-06-03 2020-11-18 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． 改変されたｃｃｌ２０ロックド二量体ポリペプチド
US11571462B2 (en) 2015-06-03 2023-02-07 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Engineered CCL20 locked dimer polypeptide
EP4047020A1 (en) 2015-06-15 2022-08-24 Numab Therapeutics AG Hetero-dimeric multi-specific antibody format
TW202144411A (zh) 2015-07-23 2021-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向il-23a與b細胞活化因子(baff)之化合物及其用途
EP3328885A1 (en) 2015-09-11 2018-06-06 Bruce Andrien Recombinant glycosylated eculizumab and eculizumab variants
CA2999138C (en) 2015-09-21 2024-05-21 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
US11203634B2 (en) 2015-10-07 2021-12-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating age-related macular degeneration in a patient comprising administering an anti-C5a antibody
EP3156417A1 (en) * 2015-10-13 2017-04-19 Affimed GmbH Multivalent fv antibodies
EA201891028A1 (ru) * 2015-10-25 2019-02-28 Санофи Триспецифические и/или тривалентные связывающие белки для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой hiv
CN109400709B (zh) * 2015-11-13 2021-03-23 广东医科大学 双功能抗体及其用途
CA3007030A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
RS64771B1 (sr) 2016-04-13 2023-11-30 Sanofi Sa Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini
IL262241B2 (en) * 2016-04-13 2024-05-01 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins with an arm that has a cross-linking dual variable domain and a traditional FAB antibody arm, the pharmaceutical composition that includes said binding proteins and their uses in the prevention and/or treatment of cancer or inflammatory diseases
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
JP2019517473A (ja) 2016-05-27 2019-06-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＡｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 難治性全身型重症筋無力症の処置のための方法
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CA3026393C (en) 2016-06-22 2023-03-14 Alkermes, Inc. Compositions and methods for modulating il-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties
JP7021127B2 (ja) 2016-06-28 2022-02-16 ゼンコア インコーポレイテッド ソマトスタチン受容体２に結合するヘテロ二量体抗体
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
CA3034768A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Sanofi Multispecific antibodies facilitating selective light chain pairing
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
AU2017342560B2 (en) 2016-10-14 2022-03-17 Xencor, Inc. IL15/IL15Ralpha heterodimeric Fc-fusion proteins
US11965884B2 (en) 2016-10-19 2024-04-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of quantitating unbound C5 in a sample
EP3529619B1 (en) 2016-10-19 2021-06-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method of quantitating unbound c5a in a sample
CA3053774A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
US10626169B2 (en) 2017-02-17 2020-04-21 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
US20200385472A1 (en) * 2017-04-28 2020-12-10 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
CA3063051A1 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Optimized nucleic acid antibody constructs
JP2020522486A (ja) 2017-06-01 2020-07-30 サイトメックス セラピューティクス インコーポレイテッド 活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
AR112341A1 (es) 2017-08-02 2019-10-16 Lilly Co Eli ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS ANTI-TNF- / ANTI-IL-23 DE IgG
BR112020007002A2 (pt) * 2017-10-10 2020-11-17 Sanofi anticorpos anti-cd38 e métodos de uso
US11643472B2 (en) 2017-10-12 2023-05-09 Mcmaster University T cell-antigen coupler with Y182T mutation and methods and uses thereof
CN112272563A (zh) 2017-11-08 2021-01-26 Xencor股份有限公司 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
KR20200109333A (ko) 2018-01-12 2020-09-22 젠자임 코포레이션 폴리펩티드의 정량화를 위한 방법
US10738110B2 (en) * 2018-01-12 2020-08-11 Amgen Inc. PAC1 antibodies and uses thereof
WO2019147973A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Genzyme Corporation Fc variants with enhanced binding to fcrn and prolonged half-life
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
JP2022503959A (ja) 2018-10-03 2022-01-12 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
CN113166254A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 赛诺菲 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
US20220002393A1 (en) 2018-11-20 2022-01-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis in pediatric patients
GB2583560A (en) 2018-12-11 2020-11-04 Admirx Inc Fusion protein constructs for complement associated disease
JP2024504880A (ja) 2018-12-24 2024-02-02 サノフイ 疑似ｆａｂベースの多重特異性結合タンパク質
EP3674316A1 (en) 2018-12-24 2020-07-01 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
JP2022515424A (ja) 2018-12-24 2022-02-18 サノフイ 突然変異ｆａｂドメインを有する多重特異性結合タンパク質
WO2020180726A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
KR20210149141A (ko) * 2019-04-09 2021-12-08 사노피 삼중특이적 결합 단백질, 이의 방법 및 용도
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
MX2021014931A (es) * 2019-06-07 2022-01-24 Amgen Inc Construcciones de union biespecificas con enlazadores selectivamente escindibles.
CN114466663A (zh) 2019-07-25 2022-05-10 建新公司 以FcRn拮抗剂治疗抗体介导的障碍的方法
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
US20220259305A1 (en) 2019-08-05 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis with eculizumab
EP4013783A1 (en) * 2019-08-15 2022-06-22 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for improved single chain variable fragments
WO2021080649A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Sanofi Methods for analyzing chain mispairing in multispecific binding proteins
JP2023525423A (ja) 2020-01-15 2023-06-16 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
BR112022016999A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-25 Genzyme Corp Polipeptídeos de ligação modificados para conjugação de fármacos otimizada
MX2022011847A (es) 2020-03-25 2023-01-04 Lilly Co Eli Proteínas de unión multiespecíficas y métodos para desarrollarlas.
WO2021198204A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 Sanofi Split ch2 domains
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
AR123548A1 (es) 2020-09-18 2022-12-14 Ichnos Sciences SA Anticuerpos biespecíficos cd47-cd38
TW202246331A (zh) 2021-01-13 2022-12-01 美商威特拉公司 人源化補體５ａ受體１抗體及其使用方法
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
EP4322937A1 (en) 2021-04-14 2024-02-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) New method to improve the anti-tumoral activity of macrophages
WO2022219080A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to improve nk cells cytotoxicity
EP4334361A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Immatics Biotechnologies GmbH Antigen binding proteins specifically binding prame
MX2023014100A (es) 2021-05-27 2023-12-11 Sanofi Sa Variante de fc con afinidad aumentada para los receptores de fc y estabilidad termica mejorada.
US12016923B2 (en) 2021-06-01 2024-06-25 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 T cell-antigen couplers and uses thereof
TW202330598A (zh) * 2021-06-30 2023-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 特異性結合ｂａｆｆ和ｉｌ－１２／２３的抗原結合分子及用途
IL312475A (en) 2021-11-02 2024-06-01 Visterra Inc FC variants lack linkage to FCGAMMAR and C1Q
EP4198052A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and antigen binding proteins for use in immunotherapy against fibrolamellar hepatocellular carcinoma (fl-hcc) and other cancers
US20240117030A1 (en) * 2022-03-03 2024-04-11 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2023213998A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Ichnos Sciences SA Cd3/bcma/cd38 trispecific antibodies
WO2023222665A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Sanofi Method, system and apparatus for predicting pk values of antibodies
WO2023227790A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Sanofi Natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and bcma variants with fc-engineering
WO2023237690A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Sanofi Methods for purification of multi-specific antibodies
WO2024089609A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function
WO2024121311A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 Ichnos Sciences SA Cd47/cd38 bispecific antibodies and methods of use to treat leukemia
WO2024126833A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Ichnos Sciences SA Cd47-il1rap bispecific antibodies

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
JP3720353B2 (ja) * 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
UA40577C2 (uk) * 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
DE122004000004I1 (de) 1996-02-09 2004-08-12 Abott Biotechnology Ltd Humane Antikörper welche an Humanen TNFalpha binden.
JP2000508892A (ja) 1996-04-04 2000-07-18 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ 多価および多特異的抗原結合タンパク
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
CN100390288C (zh) * 2000-04-11 2008-05-28 杰南技术公司 多价抗体及其应用
CN101684158A (zh) * 2001-01-17 2010-03-31 特鲁比昂药品公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2004232928A1 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
US9963510B2 (en) * 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN101821288A (zh) * 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US9624309B2 (en) * 2007-08-15 2017-04-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Monospecific and multispecific antibodies and method of use
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2376109B1 (en) * 2008-12-19 2019-01-23 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) * 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
PL3235508T3 (pl) * 2011-03-16 2021-07-12 Sanofi Kompozycje zawierające białko podobne do przeciwciała z podwójnym regionem v
TWI588156B (zh) * 2011-03-28 2017-06-21 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
US20140213772A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
MY191964A (en) * 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
IL262241B2 (en) * 2016-04-13 2024-05-01 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins with an arm that has a cross-linking dual variable domain and a traditional FAB antibody arm, the pharmaceutical composition that includes said binding proteins and their uses in the prevention and/or treatment of cancer or inflammatory diseases
BR112020007002A2 (pt) * 2017-10-10 2020-11-17 Sanofi anticorpos anti-cd38 e métodos de uso
CN113166254A (zh) * 2018-10-09 2021-07-23 赛诺菲 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
US11613576B2 (en) * 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL261673B (en) 2020-06-30
JP2023100752A (ja) 2023-07-19
JP6490038B2 (ja) 2019-03-27
US9221917B2 (en) 2015-12-29
EP3199547A1 (en) 2017-08-02
SI3199547T1 (sl) 2021-03-31
PL2691416T3 (pl) 2016-11-30
EP3199547B1 (en) 2020-11-18
MX2013011176A (es) 2013-11-01
JP7003101B2 (ja) 2022-02-04
US20160200811A1 (en) 2016-07-14
AU2012236603B2 (en) 2015-06-18
DK2691416T3 (en) 2016-09-05
JP2022046668A (ja) 2022-03-23
IL261674A (en) 2018-10-31
TW201722988A (zh) 2017-07-01
AU2012236603A1 (en) 2013-04-18
HUE028230T2 (en) 2016-12-28
JP2017038607A (ja) 2017-02-23
CO6781527A2 (es) 2013-10-31
US20140056895A1 (en) 2014-02-27
CN103562221A (zh) 2014-02-05
TW201940510A (zh) 2019-10-16
IL228512B (en) 2018-10-31
DK3199547T3 (da) 2021-02-08
MA35051B1 (fr) 2014-04-03
CA2831603C (en) 2020-07-21
EP3805262A1 (en) 2021-04-14
RU2695880C2 (ru) 2019-07-29
TW202212358A (zh) 2022-04-01
RU2013147821A (ru) 2015-05-20
UY33983A (es) 2012-10-31
KR102607708B1 (ko) 2023-11-30
SI2691416T1 (sl) 2016-10-28
IL261673A (en) 2018-10-31
US20180155450A1 (en) 2018-06-07
PT2691416T (pt) 2016-08-26
TW202317615A (zh) 2023-05-01
CY1118807T1 (el) 2018-01-10
EP3112380A1 (en) 2017-01-04
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