CN114466663A - 以FcRn拮抗剂治疗抗体介导的障碍的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供使用FcRn拮抗剂，例如包含修饰Fc区的结合多肽(例如，抗体和/或免疫黏附素(immunoadhesin))，治疗抗体介导的障碍(例如自体免疫疾病)的方法。本公开还提供使用文中所公开的FcRn拮抗剂提升诊断造影的方法。本公开进一步提供使用文中所公开的FcRn拮抗剂在诊断造影期间降低正常组织暴露于放射性标记抗体的方法。还提供包括向受试者施用治疗有效量的文中所公开的FcRn拮抗剂的方法。

Description

以FcRn拮抗剂治疗抗体介导的障碍的方法

相关申请的交叉引用

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序列表

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先前技术

抗体与新生儿Fc受体(FcRn)的交互作用是维持和延长抗体和Fc-衍生的治疗剂的血清半衰期的决定因素。FcRn是一种第I类MHCα-区和β2-微球蛋白(β2-m)亚基的异二聚体，其辨识抗体Fc区中不同于其他Fcγ受体(FcγRs)的区域。当FcRn在各种组织表达的同时，其被认为主要作用在血管内皮和肾脏及血脑屏障。

抗体与FcRn结合是高pH-依赖性的，此交互作用仅以高亲和力(高纳米摩尔浓度至低微米摩尔浓度)于低pH(pH<6.5)发生，而非生理pH(pH大约7.4)。在胞内体酸化至pH低于6.5之后，IgG和FcRn间的交互作用变得极有利，且直接造成抑制降解并促进FcRn-结合抗体回收至细胞表面。pH增加弱化了此交互作用并促进抗体释放至血流中。

已广泛地追求使用高通量诱变法的Fc工程来鉴别提升FcRn结合亲和力的变体，由于延长血清半衰期的直接结果，推测提升的结合相比于野生型IgG抗体应能导致治疗抗体的疗效增加及降低剂量频率。然而，提升FcRn结合亲和力的变体可能具有无法预见的结果。例如，在pH 6.0显现FcRn亲和力大幅增加的特定IgG变体，例如所述带有N434W或P257I/Q311I取代的变体，其中包括，具有野生型或在转基因人类FcRn(hFcRn)的食蟹猴和小鼠中血清半衰期严重降低(参见，例如Kuo et al.,Mabs.(2011)3(5):422-30；Datta-Mannan etal.,J Biol Chem.(2007)282:1709-17；及Datta-Mannan et al.,Metab Dispos.(2007)35:86-94)者。T250Q/M428L(QL)变体在动物模型中已显示Fv-特异性结果(参见，例如Datta-Mannan,2007,supra；and Hinton et al.,J Immunol.(2006)176:346-56)。M252Y/S254T/T256E(YTE，Eu编号)变体在体外已显现10倍提升，但由于对FcγRIIIa受体的亲和力下降2倍，在体内展现抗体依赖性的细胞介导毒性(ADCC)降低(参见，例如Dall’Acqua etal.,J Immunol.(2002)169(9):5171-80)。

发现以提升的亲和力和降低的pH依赖性性结合FcRn的Fc变体可能用于增加IgG从血液循环的清除。已发现FcRn介导的IgG回收是维持人类IgG血浆浓度的优势过程(Xiao,JBiomed Biotechnol.(2012)2012:282989)。增加IgG从循环的清除应为所希望的，例如在自身免疫疾病，例如其中循环的自体反应性抗体造成病理的系统性红斑性狼疮，及其中IgG-复合毒素、药物或诊断剂需要从身体快速清除的情况。增加不希望的抗体的清除率可通过使用FcRn拮抗剂，例如，以高亲和力与FcRn结合且不会在接近中性pH快速解离的具有工程化Fc的抗体来达成。这些工程化抗体称为Abdeg，为提升IgG降解的抗体(Swiercz et al.,JNucl Med.(2014)55(7):1204-7)。这些FcRn拮抗剂不会从细胞释出，但取而代之仍会预期与FcRn结合并阻断其他较低亲和力IgG的结合。因此，应会阻断FcRn功能且内生性或不希望的IgG应会导入如溶酶体路径进行降解。

对于通过使用具有提升的FcRn结合亲和力及在其结合FcRn时展现失去pH依赖性性的Fc变体来治疗IgG介导的疾病的方法存在需求。

发明内容

本公开提供在有需要的受试者中治疗抗体介导的(例如，IgG介导的)障碍的方法，该方法包括向该受试者施用(例如，人类)治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂。治疗有效量的FcRn拮抗剂将会增加该经治疗的受试者中的血清IgG清除率。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区包含至少四个氨基酸取代的组合，该组合包括：氨基酸位置256的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，及氨基酸位置307的色氨酸(W)或谷氨酰胺(Q)，其中氨基酸位置254不为苏氨酸(T)，及进一步包含：氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；及氨基酸位置252的酪氨酸(Y)。除非另有指出，否则文中所描述的所有Fc残基位置根据EU编号系统。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的氨基酸残基的组合：a)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)和在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；b)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；c)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；d)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)；e)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)；在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；f)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)；g)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；h)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；i)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；或j)在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的氨基酸取代的组合：M252Y/T256D/T307Q/N434Y、M252Y/T256E/T307W/N434Y、M252Y/T256E/T307Q/N434Y、M252Y/T256D/T307Q/N434F、M252Y/T256D/T307W/N434Y、M252Y/T256D/T307W/N434F、M252Y/N434Y、M252Y/T307W/N434Y、M252Y/T256D/N434Y和T256D/307W/N434Y。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区为修饰的人类IgG Fc区，例如修饰的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区，或衍生自一或多个人类Fc区的Fc区。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区对于来自一或多个物种，例如人类、食蟹猴、小鼠和大鼠的FcRnh具有结合亲和力。例如，此修饰的Fc区具有对人类FcRn(hFcRn)和大鼠FcRn(rFcRn)的结合亲和力。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区相比于野生型Fc区，具有提升的FcRn结合亲和力(例如，对hFcRn提升的结合亲和力)。在特定示例性的实施方案中，此修饰的Fc区相比于野生型Fc区，具有在酸性pH下(例如，约6.0)提升的FcRn结合亲和力。在特定示例性的实施方案中，此修饰的Fc区相比于具有五重突变M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(“YTEKF”)的Fc区具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区相比于野生型Fc区具有在非酸性pH下(例如，约7.4)提升的FcRn结合亲和力。在特定示例性的实施方案中，此修饰的Fc区相比于具有YTEKF突变的Fc区具有在非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区相比于野生型Fc区具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，及非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，在特定示例性的实施方案中，此修饰的Fc区相比于具有YTEKF突变的Fc区具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，及非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区相比于野生型Fc区具有降低的FcγRIIIa结合亲和力。

在特定的实施方案中，此FcRn拮抗剂为一结合多肽，例如抗体或包含其抗原结合片段(例如，Fv片段，单链抗体(ScFv)，Fab，Fab-H，Fab'和F(ab')2)。此结合多肽可为一或多个非FcRn的靶标。

在某些实施方案中，通过本发明方法治疗的IgG介导的障碍为自身免疫疾病。在特定示例性的实施方案中，此自身免疫疾病选自由以下组成的群：移植物抗宿主疾病(GVHD)、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力症、系统性硬化症(SSc)/硬皮病、类风湿性关节炎、干癣性关节炎、骨性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、寻常性天疱疮、异位性皮肤炎、干癣、哮喘、过敏、特发性肺纤维化(IPF)、特发性血小板减少紫斑症(ITP)和化脓性汗腺炎。

在特定的方面，本公开提供提升诊断造影的方法，该方法包括将治疗有效量的如文中所述的FcRn拮抗剂向受试者施用。在特定的实施方案中，该方法包括向该受试者施用有效量的放射性标记抗体。在另外的实施方案中，FcRn拮抗剂在放射性标记抗体之后施用，并提升放射性标记抗体的对比。

在特定的方面，本公开提供在诊断造影期间降低非靶标组织暴露于放射性标记抗体的方法，该方法包括将治疗有效量的文中所述的FcRn拮抗剂向受试者施用。

亦提供文中的FcRn拮抗剂用于制造药物供用于本发明治疗和诊断方法的用途，以及用于本发明治疗和诊断方法的FcRn拮抗剂。

本公开亦提供用于制造多肽的编码FcRn拮抗剂多肽的核酸、重组表达载体和宿主细胞，以及包括文中所公开的FcRn拮抗剂的药物组合物。亦提供使用本公开的FcRn拮抗剂治疗疾病的方法。

从以下举例说明的实施方案的详细说明结合附图，将能更完整理解本发明的前述和其他特征及优点。

【附图说明】

图1A和1B描绘了FcRn与IgG1 Fc区相互作用的结构。图1A描绘了hFcRn和IgG1 Fc(pdb：4n0u)间的交互作用，其显示包括如“聚糖”所标示的标语所示的糖基化之一Fc单体(深灰色条带)，与α-区(灰色)和β2-m(淡灰色)hFcRn亚基复合。大部分涉及与FcRn交互作用的抗体残基为位于直接与C_H2-C_H3界面(虚线)毗邻的环中及糖基化位置的对面。图1B描绘了就图1A而言旋转75°的IgG1 Fc晶体结构(pdb:5d4q)的表面呈现。FcRn结合界面由C_H2和C_H3区中的残基所组成。饱和库构建在如标语所示的11个位置，显示为：M252；I253；S254；T256；K288；T307；K322；E380；L432；N434和Y436。所有的这些残基位于极接近或直接接触FcRn处。负责pH依赖性性的重要组氨酸残基的表面(H310、H433、H435)群集在靠近感兴趣的位置且如所示。

图2A-D描绘了Octet筛选分析和结果。图2A示意性地呈现Octet筛选分析。NiNTA生物传感器捕捉组氨酸标签抗体及随后，大鼠FcRn(rFcRn)结合动力学的抗体变体。图2B描绘了对齐rFcRn缔合阶段的起点，野生型(实线)，T307A/E380A/N434A(AAA)变体(短虚线)，LS(穿插一单点的短虚线)，YTE(长虚线)，H435A(穿插一单点的短虚线)和H310A/H435Q(穿插二个点的长虚线)抗体在pH 6.0的rFcRn结合动力学图式。H435A和H310A/H435Q变体显示极少至无FcRn结合。以Octet rFcRn结合分析检测，YTE变体具有最慢的FcRn解离速率。图2C以图式描绘了一组从Octet筛选所得来的突变体在pH6.0时归一化的FcRn结合动力学。大部分的突变体保留与rFcRn显著的结合，但有数种则类似空白对照组(点虚线)，其显示失去所有rFcRn结合(长虚线，位在点虚线(空白组)下方)。二种变体(N434F和N434Y；实线)显示具有低于野生抗体(粗长虚线)的rFcRn解离速率。图2D描绘了所有点突变的rFcRn解离速率的散布图分析，随附由残基位置隔开的可观察的rFcRn结合动力学。饱和变体落在下列四种rFcRn解离速率形式之一：无结合(未显示)，较快结合(黑色)，类野生型结合(白色)，较慢结合(灰色)。18种突变体(E380C、K288D、K288N、M252Y、T256D、T256E、N434F、N434P、N434Y、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、Y436H、Y436N和Y436W)显示比野生型抗体(黑色虚线)明显更慢的rFcRn解离速率。

图3以图式描绘了具有人类和大鼠FcRn的基准和野生型变体在pH 6.0和pH 7.4的Biacore^TM动力学。显示一系列浓度的野生型(左上)，AAA变体(右上)，M428/N434S(LS)变体(左下)和M252Y/S254T/T256E(YTE)变体(右下)，就各人类(第一和第三栏)和大鼠(第二和第四栏)FcRn在pH 6.0(第一和第三列)和pH 7.4(第二和第四列)的所有FcRn结合曲线。AAA、LS和YTE变体显示比野生型抗体更慢的rFcRn解离速率。一般而言相比于野生型，抗体以增加大约10倍亲和力与rFcRn结合。在pH 7.4，LS变体具有最紧密的亲和力以及在pH 7.4对hFcRn最大的残余结合，而rFcRn结合YTE变体则是最紧密的。

图4A以图式描绘了具有人类和大鼠FcRn的先导饱和抗体在pH6.0的Biacore^TM动力学。显示18种先导饱和变体之一系列浓度的FcRn结合动力学追踪。M252Y、T256D、T256E、N434F、N434P、N434Y、T307A、T307E、T307F、T307Q和T307W对人类和大鼠FcRn具有较慢的解离速率。其余的变体仅对大鼠FcRn具特异性。

图4B以图式描绘了WT、基准和具有人类FcRn的先导单一饱和变体在pH 6.0的FcRn结合动力学。一系列浓度的WT、LS、YTE和18种饱和变体与人类FcRn在pH 6.0的FcRn结合传感图。用于组合库的单一饱和变体为加下划线和粗体。

图5A-D描绘了显示在pH 6.0具有较慢的人类和大鼠FcRn的解离速率的多重变体的数据。图5A和5B描绘了各种变体的Biacore^TM传感图。图5A描绘了YTE变体(穿插一单点的长虚线)，LS变体(穿插二个点的长虚线)，野生型(WT；点虚线)和先导饱和变体(先导E380C、K288D、K288N、M252Y、T256D、T256E、N434F、N434P、N434Y、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、Y436H、Y436N和Y436W)；各种阴影实线)在pH 6.0的人类FcRn的解离速率。在图5A中，描绘了归一化的传感图，其显示相比于WT提升的hFcRn解离速率。图5B描绘了AAA变体(点虚线)，LS变体(穿插二个点的长虚线)，YTE变体(穿插一单点的长虚线)，野生型(实线)和18种先导饱和变体(各种不同密度和浓度的虚线)在pH 6.0的大鼠FcRn的解离速率。显示代表性注射各11种先导抗体用以厘清。这些先导单一变体相比于野生型，显现提升的人类和大鼠FcRn的解离速率动力学。图5C和图5D描绘了使用从Biacore^TM动力学测量所得到缔合和解离速率，对18种先导饱和(白色圆圈)和野生型(黑色圆圈)抗体变体对人类(图5C)和大鼠(图5D)FcRn的结合亲和力图。基准变体有：AAA(对角线面对右下方)，LS(点虚线)和YTE(对角线面对左下方)。尽管FcRn解离速率提升，但由于较慢的缔合动力学，大多数的变体对人类或大鼠FcRn并不具有较紧密的亲和力。11种变体对二物种的FcRn具有较慢的解离速率。

图6A-D描绘了显示先导的饱和突变组合进一步提升FcRn解离速率和结合亲和力的数据。图6A和图6B描绘了分别显示人类和大鼠FcRn的FcRn解离速率的代表性Biacore^TM传感图。图6A描绘了与野生型(点虚线)和LS变体(穿插二个点的长虚线)相比较，单一(T256E；虚线)、双重(变体YETN(M252Y/T256E)；淡灰色实线)、三重(变体MDQY(T256D/T307Q/N434Y)；灰色实线)和四重(变体YEQY(M252Y/T256E/T307Q/N434Y)；黑色实线)组合变体的代表性变体的人类FcRn归一化传感图。图6B描绘了与野生型(点虚线)和YTE变体(实线)相比较，单一(穿插二个点的长虚线)、双重(变体METF；穿插一单点的长虚线)、三重(变体MEWY；长虚线)和四重(变体YDWF；短虚线)组合变体的代表性变体的大鼠FcRn归一化传感图。合并多重突变降低对FcRn的解离速率并提升其结合亲和力达到大于基准变体的程度。图6C和图6D描绘了显示就人类(图6C)或大鼠(图6D)FcRn以缔合速率作为解离速率的函数的组合饱和变体图，该图显露当相比于基准变体时，大部分的变体在pH6.0时具有提升的FcRn结合。与人类和大鼠FcRn最紧密结合的变体分别为四重组合(对于hFcRn为变体YDWY、YDQY、YDWF、YEWY和YEQY)及双重组合(对于rFcRn为变体YTTY、YTTF、MDTY、YDTF和MTWY)。

图7A-D描绘了显示在pH 6.0时提升的FcRn结合扰乱了交互作用的pH依赖性的数据。图7A和图7B描绘了相比于野生型(点虚线)和LS变体(图7A，实线)及YTE变体(图7B，实线)，在pH 7.4时单一(穿插二个点的长虚线)、双重(穿插一个单点的长虚线)、三重(长虚线)和四重(短虚线)组合变体的Biacore^TM FcRn结合动力学的代表性传感图。增加促进FcRn结合-突变的数目造成在生理pH时较大的残余结合，其中多数双重、三重和四重变体显现与二物种FcRn的强大结合。图7C和图7D描绘了所有饱和变体对人类(图7C)或大鼠(图7D)FcRn在pH 7.4时的稳态共振单位(RU；

)随着pH 6.0时结合亲和力变化的图。在图7C中，显示在pH 7.4时残余的FcRn结合与在pH 6.0时FcRn结合亲和力的比较。具有提升的FcRn结合性质的先导组合(MDQN、MDWN、YETN、YTWN、YDQN和YEQN)占据以LS基准变体(菱形)所定义的左下象限。在图7D中，LS(菱形)和YTE(三角形)变体分别作为先导验证的截断点。这二种变体分别对于人类和大鼠FcRn具有在pH 6.0时最高的结合亲和力及在pH 7.4时最大的残余结合。在图7C和7D二图中，显示单一(白色圆圈)、双重(淡灰色圆圈)、三重(深灰色圆圈)和四重(黑色圆圈)变体以及YTE变体(三角形)。

图8A-C描绘了从基准变体的FcRn亲和力色谱和差示扫描荧光(DSF)所得来的数据。图8A描绘了WT(黑色实线)、AAA(点虚线)、LS(穿插二个点的长虚线)、YTE(穿插一个单点的长虚线)、H435A(灰色实线)和H310A/H435Q(AQ；深灰色实线)变体的归一化洗脱图。pH标注在图的上方。FcRn零结合变体(H435A、H310A/H435Q)不会与柱结合并洗脱流出(<10mL)。AAA、LS和YTE变体在比WT抗体高的pH洗脱出。图8B描绘了WT(黑色)、LS(灰色)和YTE(深灰色)变体的DSF图。相比于WT和LS，YTE为不稳定的。图8C描绘了用于组合变体的七种先导单一变体与WT和LS变体(垂直点虚线)相比较的FcRn亲和力柱洗脱图。二种变体(N434F/Y)在比LS高的pH洗脱出，其表示就含有这这些突变的变体，对与FcRn交互作用的pH依赖性下降。

图9A-D描绘了显示组合变体显著扰乱pH依赖性和热稳定的数据。图9A描绘了单一(穿插二个点的长虚线)、双重(穿插一个单点的长虚线)、三重(长虚线)和四重变体(短虚线)的代表性FcRn亲和色谱图。促进FcRn结合的突变数目增加洗脱转移到较高的pH值；LS变体(小点垂直虚线)。图9B描绘了先导饱和变体及组合变体，包括单一(白色圆圈)、双重(水平线)、三重(垂直线)和四重(方格的)突变体的洗脱pH的箱形图，其指出随着促进FcRn突变体的数目增加，有趋向较高pH值的趋势。图9C显示FcRn亲和色谱的洗脱pH和使用Biacore^TM的hFcRn解离速率间的高相关性(R²＝0.94)，显露以提升的FcRn解离动力学丧失抗体-FcRn交互作用的pH依赖性。AAA(对角线面对右下)、LS(点虚线)和YTE(对角线面对左下)变体具有与双重变体相类似的hFcRn解离速率和洗脱pH值。图9D描绘了从组合饱和变体的DSF所得来的T_m的箱形图，其揭露相比于WT、单一或基准变体，额外的促进FcRn结合的突变使抗体不稳定。

图10A和10B描绘了从11种变体的FcRn亲和色谱和DSF所得来的数据。图10A描绘了M252Y(实线)、T256D(穿插一个单点的短虚线)、T256E(长虚线)、T307Q(穿插一个单点的长虚线)、T307W(穿插二个点的长虚线)、N434F(点虚线)和N434Y(短虚线)变体的FcRn亲和色谱。色谱图揭露了相比于野生型和LS抗体(垂直点虚线)的洗脱pH的移动。N434F和N434Y具有比LS变体(垂直点虚线)高的洗脱pH(pH大约8.3)。在特定洗脱体积的pH显示高于参照的色谱图。图10B描绘了七种先导变体的DSF图，其显示七种先导单一变体并不会使抗体失去稳定达到等同YTE变体(垂直点虚线)的程度。所有的变体，除了T307Q(穿插一个单点的长虚线)，相比于WT(垂直点虚线)皆是不稳定的。

图11A-C描绘了显示FcγRIIIa结合在含有M252Y-组合变体中下降的数据。图11A显示WT(黑色)、LS(灰色)和YTE(深灰色)变体的FcγRIIIa结合传感图，揭露YTE变体的下降的结合反应。图11B描绘了基准、单一和组合变体的FcγRIIIa结合反应的箱形图，如所指出的。带有M252Y突变的变体含有降低的FcγRIIIa结合反应，包括所有四重变体。带有N434F/Y的组合典型地显示对FcγRIIIay反应增加。图11C描绘了七种先导单一变体相比于WT和YTE变体(水平点虚线)的FcγRIIIa结合反应。M252Y突变相比于WT显示FcγRIIIa结合下降，而有6种显示类似WT或对此受体结合增加。

图12A-D描绘了从七种先导组合变体的FcRn亲和色谱、DSF和FcγRIIIa结合所得来的数据。图12A描绘了七种先导组合变体相比于野生型抗体和LS变体(分别为垂直点虚线和垂直实线)的FcRn亲和色谱图。各先导变体具有接近LS变体的洗脱pH。图12B显示先导组合变体相比于YTE和野生型变体(如所示的垂直点虚线)的DSF图。七种先导变体中有六种具有类似YTE变体或比YTE变体更不稳定的T_m：MDWN(穿插二个点的长虚线)；YTWN(长虚线)；YDTN(实线)；YETN(穿插一个单点的长虚线)；YDQN(点虚线)；YEQN(穿插一个单点的短虚线)。MDQN变体具有类似野生型抗体(短虚线)的T_m。图12C描绘了七种先导变体相比于野生型(较大的点虚线)和YTE变体(粗长虚线)的FcγRIIIa结合动力学的Biacore^TM传感图。含有M252Y的变体，YDTN(实线)、YDQN(穿插一个单点的短虚线)、YTWN(长虚线)、YETN(穿插一个单点的长虚线)和YEQN(较小的点虚线)，各自具有类似YTE5的降低的稳态RU。图12D显示七种先导变体、野生型和YTE变体的稳态RU。仅MDWN和MDQN变体对FcγRIIIa具有与野生型抗体相类似的亲和力。

图12E-H描绘了显示三种先导变体展现关键抗体属性范围的数据。图12E显示DQ(实线)、DW(点虚线)和YD(虚线)变体相比于WT和LS(垂直点虚线)的FcRn亲和色谱洗脱图。各双重变体显现介于WT和LS之间的洗脱pH。图12F描绘了三种变体相比于YTE和WT变体(垂直点虚线)的DSF荧光图，其揭露YD(虚线)和DW(点虚线)相比于YTE为些微不稳定，但DQ(实线)与WT相类似。图12G描绘了与WT和YTE(水平点虚线)相比较的FcγRIIIa结合传感图。YD(虚线)显示与YTE相类似的结合反应，而DQ(实线)和DW(点虚线)相比于WT显示些微下降。图12H描绘了显示同质桥接RF ELISA的数据，其揭露三种先导变体和YTE显现明显下降或类似WT RF结合，与LS不同。**p<0.001，*p<0.01。

图13A-D描绘了显示先导组合变体在pH 6.0和pH 7.4时FcRn结合动力学的比较。图13A和图13B显示先导组合变体相比于野生型(点虚线)和LS(hFcRn，图13A，粗长虚线)或YTE(rFcRn，图13B，粗长虚线)在pH 6.0时对人类FcRn(图13A)或大鼠FcRn(图13B)的Biacore^TM FcRn结合传感图。尽管缔合和解离速率改变，但各组合变体对个别FcRn具有整体较紧密结合。图13C和图13D显示在pH 7.4时的Biacore^TM FcRn传感图。各hFcRn先导变体相比于LS变体具有类似或降低的稳态FcRn结合反应。仅MDQN和MDWN变体在pH 7.4时显示比YTE变体更低的rFcRn结合。

图14为描述根据特定实施方案具有单一突变的饱和库的Octet rFcRn结合解离速率的表格。野生型(WT)和类野生型(类WT)物种以白色长方形标出；WT物种如所示。相比于野生型具有极小至无rFcRn结合的变体以深灰色长方形标出。相比于野生型具有较快速rFcRn解离速率的变体以淡灰色长方形标出，而相比于野生型具有较慢rFcRn解离速率的变体以黑色长方形标出。

图15A-C描绘了使用CM5传感芯片所开发的结合分析。图15A为此分析的示意图。图15B显示直接固定化FcRn。图15C显示链霉亲和素捕捉生物素化FcRn。

图16A和16B描绘了在pH 6.0时mAb2的FcRn结合。图16A描绘了人类FcRn。图16B描绘了小鼠FcRn。

图17A和17B描绘了在pH 7.4时mAb2的FcRn结合。图17A描绘了人类FcRn。图17B描绘了小鼠FcRn。

图18以图式描绘了各种mAb2变体的pH依赖性性。先导变体在pH 6时维持比LS更高的结合亲和力及在pH 7.4时较低的残余结合。

图19描绘了使用mAb1和mAb2骨架的FcRn结合pH依赖性性的比较。mAb1和mAb2是以二个不相关抗原为靶标的人类IgG1抗体。

图20描绘了使用mAb1和mAb2骨架的热稳定性比较。

图21描绘了使用mAb1和mAb2骨架的FcγRIIIa结合的比较。

图22为一组显示DQ、DW和YD变体在IgG1骨架间可转移的图。图a-c描绘了在三个IgG1骨架中具有在低pH显现类似动力学的WT(淡灰色)、LS(深灰色)、DQ(黑色实线)、DW(点虚线)和YD(虚线)变体，于pH 6.0时归一化FcRn结合传感图。这三种变体DQ、DW和YD具有比LS变体稍快的缔合和解离速率，但维持较紧密的FcRn结合亲和力。图d-f描绘了在pH 7.4时的FcRn结合传感图；LS基准变体(黑色实线)。图g-i描绘了对于各抗体骨架与WT(灰色)、LS(深灰色)、DQ(黑色实心)、DW(空心)和YD(空心正方形)变体相比于在pH 6.0时的结合亲和力，在pH 7.4时的FcRn结合反应。DQ、DW和YD显示提升的FcRn特质，其中在pH 6.0时促进结合及在pH 7.4时最小结合。

图23A-C显示三种先导变体在mAb2骨架中类似地提高与食蟹猴FcRn的结合。图23A描绘了显示类似hFcRn的结合动力学和亲和力的WT(灰色)、LS(深灰色)、DQ(黑色实线)、DW(点虚线)和YD(虚线)在pH 6.0时归一化cFcRn结合传感图。图23B描绘了对三种变体的cFcRn结合反应在生理pH时戏剧性下降；但LS(深灰色)以类似hFcRn的方式，显现大于WT(灰色)的结合。图23C描绘了WT(灰色)、LS(深灰色)、DQ(黑色实线)、DW(空心)和YD(空心正方形)在pH 7.4时残余的cFcRn结合反应与pH 6.0时cFcRn结合亲和力的比较，其显露全部三种变体维持在hFcRn所观察到的提升的FcRn结合性质。

图24A和24B显示先导的变体延长抗体血清半衰期。血浆抗体浓度作为时间的函数在食蟹猴(图24A)和hFcRn转基因小鼠(图24B)中WT(带有黑色实线的白色圆圈)、LS(带有黑色虚线的白色圆圈)、DQ(带有灰色实线的淡灰色圆圈)、DW(带有深灰色实线的深淡灰色圆圈)和YD(带有黑色点虚线的黑色圆圈)抗体的药物动力学图式。相比于WT，全部三种先导的变体延长了抗体半衰期。

图25描绘了所有饱和变体对人类FcRn在pH 7.4时的稳态RU作为在pH 6.0时结合亲和力的函数的图。显示在pH 7.4时残余的FcRn结合与在pH6.0时FcRn结合亲和力的比较。在pH 6.0和pH 7.4时具有提升的FcRn结合性质的四重组合显示在图形的右上象限的方框中。显示单一(白色圆圈)、双重(淡灰色圆圈)、三重(深灰色圆圈)和四重(黑色圆圈)变体以及基准AAA、LS和YTE变体(如所示)。

图26描绘了用于捕捉生物素化FcRn的生物素CAPture法的示意图。

图27A-G描绘了显示在pH 6.0、pH 7.4和pH 8.0如所示的YTEKF(ABDEG^TM)基准和FcRn拮抗剂的人类和食蟹猴FcRn结合动力学的图。图27A和图27B显示在pH 6.0时WT、YTEKF和FcRn拮抗剂分别与人类和食蟹猴FcRn的浓度依赖性结合。图27C和图27D显示在pH 7.4时WT、YTEKF和FcRn拮抗剂分别与人类和食蟹猴FcRn的浓度依赖性结合。图27E和图27F显示在pH 8.0时WT、YTEKF和FcRn拮抗剂分别与人类和食蟹猴FcRn的浓度依赖性结合。图27G显示在pH 6.0时YEQF和YEWF变体与人类和大鼠FcRn的浓度依赖性结合。

图28A-H显示示例性的FcRn拮抗剂(YDQY、YEWY、YEQY、YDQF、YDWY、YTWY、YDWF、YDTY、MDWY和YTTY)相比于YTEKF基准在各种pH层级的人类FcRn结合动力学。图28A显示在pH6.0具有显著提升hFcRn解离速率的FcRn拮抗剂(实线)相比于WT(虚线)和YTEKF(点虚线)的归一化的传感图。图28B显示在pH 7.4时hFcRn结合的传感图，其展现相比于YTEKF和WT(无结合)，在升高的pH时FcRn拮抗剂的显著结合。图28C显示在pH 7.4的归一化传感图，其为展现相比于YTEKF，FcRn拮抗剂的显著解离速率。图28D显示在pH 8.0的hFcRn结合的传感图，其展现相比于YTEKF和WT(无结合)，在pH大于生理条件时FcRn的显著结合。图28E显示在pH8.0的归一化传感图，其展现FcRn拮抗剂和YTEKF可测量的解离速率和亲和力。图28F显示pH9.0足以明显影响FcRn拮抗剂变体的hFcRn结合及在此pH时类似的WT结合。图28G显示在pH6.0(黑色)、7.4(灰色)和8.0(淡灰色)时FcRn拮抗剂、YTEKF(开口正方形)和WT(仅pH 6.0)的hFcRn结合亲和力的等亲和力图。多重变体在所有的pH具有大于YTEKF的hFcRn结合亲和力。图28H显示FcRn拮抗剂的结合亲和力作为pH的函数及展现每个pH单位hFcRn结合亲和力的一个数量级的降低。

图29A-H显示相比于YTEKF基准在各种pH等级于图28A-H所试验的FcRn拮抗剂的食蟹猴FcRn(cFcRn)结合动力学。图29A显示FcRn拮抗剂(实线)的归一化传感图，其显现相比于WT(虚线)和YTEKF(点虚线)，在pH 6.0时显著的cFcRn解离速率提升。图29B显示在pH 7.4时cFcRn结合的传感图，其显现相比于YTEKF和WT(无结合)，在升高的pH时FcRn拮抗剂的显著的结合。图29C显示在pH 7.4时归一化的传感图，其展现FcRn拮抗剂相比于YTEKF的显著解离速率。图29D显示在pH8.0时hFcRn结合的传感图，其显现在大于生理条件的pH时，FcRn拮抗剂相比于YTEKF和WT(无结合)的显著结合。图29E显示在8.0pH时归一化的传感图，其显现FcRn拮抗剂和YTEKF的可测量的解离速率和亲和力。图29F显示pH 9.0足以明显影响FcRn拮抗剂变体的cFcRn结合及在此pH时类似的WT结合。图29G显示在pH 6.0(黑色)、7.4(灰色)和8.0(淡灰色)时FcRn拮抗剂、YTEKF(开口正方形)和WT(仅pH 6.0)的cFcRn结合亲和力的等亲和力图。多重变体在所有的pH具有大于YTEKF的cFcRn结合亲和力。图29H显示FcRn拮抗剂的结合亲和力作为pH的函数及展现每个pH单位cFcRn结合亲和力的一个数量级的降低。

图30A-C显示在所示剂量的YDQY或YTEKF hIgG1变体之后，随时间变化的追踪剂(WT)hIgG浓度的图式。图30A显示所有组别的清除图示。图30B显示第2组(对照组)和第6组的图示。图30C显示第2组(对照组)、第4组(YDQY hIgG1)和第7组(YTEKF hIgG1)的图示。

图31A和31B显示在以所示的剂量施用小鼠之后，随时间变化YDQY hIgG1变体(A)或YTEKF hIgG1变体(B)的蛋白浓度。

图32显示来自残基231-447(Eu编号)的人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区的序列比对。文中所述的FcRn致突变位置(M252、T256、T307和N434)在全部四种亚型中是保守的。

图33显示体外在多种pH条件下FcRn-结合Fc变体的人类FcRn结合特性参数。就各变体而言，相对于WT序列(M252/T256/T307/N434；MTTN)的取代突变为加粗黑字体且加下划线(例如，MDWY是指具有T256D、T307W和N434Y突变的变体)。

图34显示体外于多种pH条件下FcRn-结合Fc变体的食蟹猴FcRn结合特性参数。

发明详述

本公开提供具有改变的FcRn结合亲和力的多肽(例如，单克隆抗体或其片段)。这些多肽含有修饰的IgG Fc区，该修饰的IgG Fc区相比于野生型IgG(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区在酸性和非酸性条件下为具有提升的FcRn结合亲和力。因此，不同于野生型IgG Fc区，本发明多肽以较低的pH-依赖性方式与FcRn结合。当FcRn流通于具有不同pH条件的细胞表面和细胞质之间时，这些多肽仍保持与FcRn结合。因此，阻断具有野生型(较低)FcRn结合亲和力的其他IgG分子(例如，血清IgG)与FcRn结合及增加其导向溶酶体路径进行降解的速率，使得IgG分子从身体更快速清除。

由于本发明多肽扰乱了介导IgG回收和维持血清IgG量的FcRn正常功能，因此其称为“FcRn拮抗剂”。本公开的FcRn拮抗剂可为抗体、免疫黏附素或另外的Fc稠合蛋白的形式，或其Fc片段或部分。FcRn拮抗剂可为，例如单体蛋白或二聚体(异质或同质二聚)蛋白。因为FcRn拮抗剂促进身体的血清IgG清除，因此其可用于治疗患有IgG介导的疾病或障碍(例如，自身免疫疾病)的患者，或从身体移除不希望的IgG(例如，已不再需要的或已无利益的治疗或诊断抗体)。

应理解，本公开所描述的方法不限于特定的方法和文中所公开的实验条件，因为这些方法和条件可能改变。亦应理解，文中所用的术语仅用于说明特定实施方案的目的，且不希望受限。

再者，除非另有指出，否则文中所述的实验为本领域中常规分子和细胞生物及免疫学技术。这些技术已为本领域技术人员所熟知，且充分地解释于文献中，参见，例如，Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有的增刊；Green et al.,Eds.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第4版)；Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013年第2版)。

除非另有定义，否则所有文中所用的科学和技术术语具有如本领域普通技术人员所正常理解的相同意义。在任何潜在的含义不明确的情况下中，文中所提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非内容另有要求，否则单数术语应包括复数个，且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”是指“和/或”。使用术语“包括”以及其他的形式“包含”和“含有”并非限制。词语“具有”和“包含”或变化形，应理解为意味纳入所述的整数或一组整数，而不是排除任何其他整数或整数群组。

一般而言，与文中所述的细胞和组织培养、分子生物、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白及核酸化学和杂交有关的所使用的命名法在本领域中是大家所熟知且常用的。除非另有指出，否则文中所提供的方法和技术一般是根据本领域中熟知的常规方法及如整个本说明书所引述和讨论的各种通用和更特定参考文献中所述来进行。酶反应和纯化技术是根据制造商的说明，如通常本领域中所施行的或如文中所述来进行的。所用的相关命名学及文中所述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学的实验室操作和技术为本领域中所熟知及常用的。化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送及治疗患者为使用标准技术。文中提及的所有出版品和其他参考文献以全文引用的方式并入文中。选择的术语定义如下，以便能更容易理解本公开。

除非文中反驳，否则术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合体链且包括天然或人工的蛋白、多肽类似物和蛋白序列的变体，或其片段。多肽可为单体和多聚体；亦即，此术语包括具有一或多个共价偶合，或非共价偶合的多肽链。一多肽片段包含，例如至少约5个连续的氨基酸，至少约10个连续的氨基酸，至少约15个连续的氨基酸或至少约20个连续的氨基酸。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是指凭借其衍生的起源和来源并非与其在天然状态下伴随的天然缔合组份相缔合；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；通过来自不同物种的细胞表达；或不会自然生成的蛋白或多肽。因此，化学合成和以不同于来自其天然来源的细胞的细胞系统所合成的蛋白或多肽应与其天然相缔合的组份“分离”。通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术分离，也可以使蛋白质或多肽基本上不含天然缔合组分。

如文中所用，术语“结合蛋白”或“结合多肽”应指含有至少一个负责与感兴趣靶抗原(例如，人类靶抗原)选择性结合的结合位点的蛋白或多肽(例如，抗体或免疫黏附素)。示例性的结合位点包括抗体可变区，受体的配体结合位点，或配体的受体结合位点。在某些方面，结合蛋白或结合多肽包括多个(例如，二、三、四或更多)结合位点。在某些方面，结合蛋白或结合多肽并非治疗性酶。

术语“配体”是指任何能与另外的物质结合或被结合的物质。同样地，术语“抗原”是指可对其产生抗体的任何物质。虽然“抗原”通常用于有关抗体结合基质，及“配体”通常在指一受体结合基质时使用，但这些些术语彼此并无区别且包括一广泛范围的重叠化学实体。为免生疑义，抗原和配体在整个文中可互换使用。抗原/配体可为肽、蛋白、适配体、多糖、糖分子、脂质、寡核苷酸、聚核苷酸、合成分子、无机分子、有机分子及其任何组合。

术语“特异性结合”如文中所用，是指抗体或免疫黏附素以最大约1x10^-6M，约1x10^-7M，约1x10^-8M，约1x10^-9M，约1x10^-10M，约1x10^-11M，约1x10^-12M或更低的解离常数(Kd)结合抗原的能力，和/或以至少约二倍大于其对非特异性抗原的亲和力与抗原结合的能力。

如文中所用，术语“抗体”是指这些对感兴趣抗原具有显著已知的特异性免疫反应活性的组合体(例如，完整抗体分子、免疫黏附素或其变体)。抗体和免疫球蛋白包括在其间有或无链间共价键联的轻链和重链。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构已有相当充分理解。

如下文更详细论述的，通用术语“抗体”包括五种不同种类的生化上可区别的抗体。全部五种抗体明确地在本公开的范围内，但文中的论述一般为针对IgG类的免疫球蛋白分子。就IgG而言，免疫球蛋白包括二条分子量大约23,000道尔顿的相同轻链分子，及二条分子量53,000-70,000道尔顿的相同重链分子。四条链通过二硫键以“Y”构型键合，其中轻链在“Y”口的起始处撑托重链并持续通过整个可变区。

免疫球蛋白轻链分类为卡帕(κ)或拉姆达(λ)。各重链种类可与κ或λ轻链键合。一般而言，轻链和重链为彼此共价键合，及二条重链的“尾巴”部分为通过共价二硫键联彼此相键合，或当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或基因工程化宿主细胞所产生时，则为非共价键联。在重链中，氨基酸序列由Y构型的叉端的N-端进行至各链底的C-端。本领域技术人员应能理解重链为分类为伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)或伊普西龙(ε)，随附在其中有一些亚型(例如，γl-γ4)。此链的性质分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE的抗体“类型”或同型。免疫球蛋白的同型亚类和亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)已充分理解其特征且已知赋予功能专门化。以本公开观点，各个这些类别和同型的修饰型对本领域技术人员是容易辨别的，且因此在本公开的范围内。

轻链和重链为分成结构区和功能同源区。术语“区(region)”是指免疫球蛋白或抗体链之一部分且包括恒定区或可变区以及所述区的离散部分。例如，轻链可变区包括穿插在如文中所定义的“框架区”或“FR”之间的“互补决定区”或“CDR”。

在“恒定区”的情况下，以各类成员区域内的相对缺乏序列变异为基准，或在“可变区”的情况下，以类成员区域内的显著变异为基准，免疫球蛋白重链或轻链区可定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区。术语“恒定区”和“可变区”亦可以功能性来使用。就此，应理解，免疫球蛋白或抗体的可变区为决定抗原辨识和特异性。反的，免疫球蛋白或抗体的恒定区为赋予重要的效应子功能，例如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合及诸如此类。各类免疫球蛋白的恒定区的次体结构和三维构型为熟知的。

免疫球蛋白重链和轻链的恒定和可变区为折叠成结构域。术语“结构域(domain)”是指包括，例如以β-折板和/或链内二硫键稳定化的肽环(例如，包括3至4个肽环)的重链或轻链的球形区。免疫球蛋白的轻链上的恒定区结构域可交换称为“轻链恒定区结构域”、“CL区”或“CL结构域”。重链上的恒定区(例如，绞链、CH1、CH2或CH3区)可交换称为“重链恒定区结构域”、“CH区结构域”或“CL结构域”。轻链上的可变区可交换称为“轻链可变区结构域”、“轻链可变区”、“VL区结构域”或“VL结构域”。重链上的可变区可交换称为“重链可变区结构域”、“重链可变区”、“VH区结构域”或“VH结构域”。

按照惯例，可变区结构域的氨基酸的编号为越远离抗原结合位点或免疫球蛋白或抗体的氨基端越增加。各重链和轻链免疫球蛋白的N-端为可变区而C-端为恒定区。CH3和CL区为分别包括重链和轻链的羧基端。因此，轻链免疫球蛋白的结构域为以VL-CL方向排列，而重链的结构域为以VH-CH1-绞链-CH2-CH3方向排列。

各可变区结构域的氨基酸分配为依照Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987and1991)的定义。Kabat亦提供广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的对应残基为设定相同的号码。VL结构域的CDR1、2和3在文中分别亦称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或LCDR1、LCDR2和LCDR3。VH结构域的CDR1、2和3在文中分别亦称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或HCDR1、HCDR2和HCDR3。若是如此，请注意，CDR的分配为依照

(Lefranc et al.,Dev Comp Immunol.(2003)27:55-77)替代Kabat。重链恒定区的编号为经由Kabat中所述的Eu索引(Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987and1991)。

如文中所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变区而术语“VL结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基端可变区。

如文中所用，术语“CH1区”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基端)恒定区结构域，其延伸范围例如，从Kabat编号系统大约位置114-223(Eu位置118-215)。CH1结构域与VH结构域和免疫球蛋白重链分子的绞链区的氨基端相邻，且不会形成免疫球蛋白重链Fc区之一部分。

如文中所用，术语“绞链区”包括连接CH1结构域与CH2结构域的重链分子部分。绞链区包括大约25个残基且具弹性，因此能让二个N-端抗原结合区独立地移动。绞链区可再分为三个不同的区：上、中和下绞链区(Roux et al.,J.Immunol.(1998)161:4083)。

如文中所用，术语“CH2区”包括延伸范围，例如从Kabat编号系统大约位置244-360(Eu位置231-340)的重链免疫球蛋白分子的部分。CH2区为独特的，不会与另外的区紧密配对。而是二条N-连接的支链碳水化合物链为插入二个完整天然IgG分子的CH2区之间。在一实施方案中，本公开的结合多肽包括一衍生自一IgG1分子(例如，人类IgG1分子)的CH2区。

如文中所用，术语“CH3区”包括从CH2区的N-端延伸大约110个残基的重链免疫球蛋白分子的部分，例如从Kabat编号系统大约位置361-476(Eu位置341-447)。此CH3区典型地为形成抗体的C-端部分。然而，在某些免疫球蛋白中，另外的区域可从CH3区延伸，形成分子的C-端部分(例如，IgM的μ链中及IgE的ε链中的CH4区)。在一实施方案中，本公开的结合多肽包括一衍生自一IgG1分子(例如，人类IgG1分子)的CH3区。

如文中所用，术语“CL区”包括，例如从约Kabat位置107A延伸至约Kabat位置216的免疫球蛋白轻链的恒定区结构域。CL区与VL区相邻接。在一实施方案中，本公开的结合多肽包括一衍生自κ轻链(例如，人类κ轻链)的CL区。

如文中所用术语“FcRn拮抗剂”是指包括Fc区(例如，文中所公开的变体Fc区)的任何试剂，该试剂为经由Fc区与FcRn特异性结合并抑制免疫球蛋白与FcRn结合。

如文中所用，术语“Fc”、“Fc结构域”、“Fc区”或“Fc片段”可互换使用且为定义为开始于绞链区就在木瓜酶酶裂解位置N-端(亦即，IgG中的残基216，以重链恒定区的第一个残基为114而言)及末端在重链的C-端的重链恒定区的部分。因此，一完整的Fc、Fc结构域、Fc区或Fc片段包含至少一绞链区、一CH2区和一CH3区。示例性的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Fc区的部分序列比对(CH2和CH3区，残基231至447，Eu编号)为如图32中所示。此术语包括天然/野生型Fc和如文中所述的Fc变体并包括无论是从整条抗体消化或是通过例如重组技术所制造的单体或多聚体(例如，二聚体)形式的分子。参见，例如，Ying et al.,JBC(2013)288:25154-164；和Yang et al.,JBC(2019)294:10638-48。在某些实施方案中，本公开的修饰的Fc包含图32中所示的SEQ ID NO:1、2、3或4(或其自然发生的变体)的整体或FcRn-结合部分，其中此序列已经修饰而包括文中所述的氨基酸取代。

天然的Fc的原始免疫球蛋白来源典型地为人类来源且可为任何免疫球蛋白，例如IgG1和IgG2。天然的Fc分子由单体多肽所组成，该单体多肽可通过共价(亦即，二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式。依照类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgA2)，天然Fc分子的单体次体间分子间的二硫键数目范围为从1至4个。天然Fc的实施例由IgG木瓜酶消化所产生的二硫键键合的二聚体。术语“天然Fc”如文中所用，一般为单体、二聚体和多聚体形式。

术语“Fc变体”、“修饰的Fc”或“修饰的Fc区”如文中所用，是指一分子或序列，其为从天然/野生型Fc经修饰但仍包含FcRn结合位点。Fc变体或修饰的Fc区亦可短于或长于天然Fc(例如，短于或长于横跨人类IgG残基216至447(Eu编号)的序列)；例如相比于天然Fc，Fc变体或修饰的Fc可能缺乏某些天然Fc的N-端和/或C-端氨基酸残基，或可能在N-端和/或C-端含有额外的氨基酸残基。修饰的Fc区本身不包括抗体或抗体变体的抗原结合区，或免疫球蛋白的靶结合区，但此修饰的Fc区可与此一区域链接而形成一亦与非-FcRn靶结合的FcRn拮抗剂。此术语包括从非人类天然Fc人源化的分子或序列。再者，天然Fc包括因提供文中所述的FcRn拮抗剂(例如，类抗体结合多肽)不需要的结构特质或生物活性而可移除的区。因此，此术语包括缺乏一或多个天然Fc位置或残基，或其中一或多个Fc位置或残基已经修饰，其为影响或涉及下列的分子或序列：(1)二硫键形成，(2)与选择的宿主细胞不兼容，(3)在选择的宿主细胞中表达后N-端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)与挽救受体(FcγR)以外的Fc受体结合，或(7)抗体-依赖性的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性的细胞毒性(CDC)。

如上所述，抗体的可变区使其能选择性辨识和特异性结合抗原上的表位。亦即，抗体的VL区和VH区组合形成定义三维抗原结合位点的可变区(Fv)。此四元的抗体结构象成存在各Y臂末端的抗原结合位点。更特言之，抗原结合位点为定义在各重链和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)。如文中所用，术语“抗原结合位点”包括与抗原(例如细胞表面或可溶性抗原)特异性结合(免疫反应)的位置。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区且由这些可变区所形成的结合位点决定了抗体的特异性。抗原结合位点由可变区所形成，该可变区在抗体中彼此互不相同。FcRn-拮抗结合多肽例如本公开的抗体，包含至少一个抗原结合位点。

在特定的实施方案中，本公开的结合多肽包含至少二个提供结合多肽与选择的抗原结合的抗原结合区。抗原结合区不需要衍生自相同的免疫球蛋白分子。就此，可变区可能或是衍生自任何种类的动物，其可被引发用以发动体液反应和产生免疫球蛋白对抗所希望的抗原。因此，结合多肽的可变区可为，例如哺乳动物来源，例如可为人类、鼠科；大鼠、山羊、绵羊、非人类灵长类(例如食蟹猴、恒河猴、猕猴等)、狼或骆驼科(例如，来自骆驼、大羊驼和相关物种)。

在天然生成的抗体中，六种存在各抗体中的CDR为特别定位用以形成抗原结合位点的短的、非连续氨基酸序列，因为抗体在水性环境中呈现其三维构型。在氨基酸序列中其余的重链和轻链可变区显现较低的分子间变异性并被称为框架区。此框架区大多采用β-褶板构象且CDR形成环与β-褶板结构相连，且在某些情况下形成部分的β-折叠结构。因此，这些框架区用于形成支架，通过链间非共价相互作用提供此六个CDR在正确方向的定位。通过定位的CDR所形成的抗原结合区为定义与免疫反应抗原上的表位互补的表面。此互补的表面提升了抗体与免疫抗原表位的非共价结合。

示例性的结合多肽包括抗体变体。如文中所用，术语“抗体变体”包括合成的和工程化形式的抗体，其为经改变而并非自然发生的，例如，包括至少二个重链部分但非二条完整重链的抗体(例如，删除抗体或微型抗体)；经改变用以结合二种或更多不同抗原或单一抗原上的不同表位的多特异性形式的抗体(例如，双特异性、三特异性等)；与scFv分子及类似分子连接的重链分子。此外，术语“抗体变体”包括多价形式的抗体(例如三价、四价等，与三、四或更多个相同抗原结合的抗体)。

如文中所用术语“价”是指一多肽中潜在靶结合位点的数目。各靶结合位点特异性结合一靶分子或在靶分子上的一特定位置。当多肽包括一个以上的靶结合位点时，各靶结合位点可特异性结合相同或不同的分子(例如，可与不同的配体或不同的抗原，或相同抗原上的不同表位结合)。主体结合多肽典型地为具有至少一个对人类抗原分子特异性的结合位点。

术语“特异性”是指特异性结合(例如，免疫反应)特定靶抗原(例如，人类靶抗原)的能力。结合多肽可为单特异性并含有一或多个特异性结合一靶标的结合位点，或一多肽可为多特异性并含有二或更多个特异性结合相同或不同靶标的结合位点。在特定的实施方案中，结合多肽对相同靶标的二个不同部分(例如，非重叠)具特异性。在特定的实施方案中，结合多肽为对一个以上的靶标具特异性。包括与抗原结合的抗原结合位点的示例性的结合多肽(例如，抗体)已为本领域所熟知，且一或多个来自这些抗体的CDR可包括在如文中所述的抗体内。

术语“抗原”或“靶抗原”，如文中所用，是指能通过结合多肽的结合位点相结合的分子或分子之一部分。

术语“约”或“大约”是指在一特定值或范围的约20％内，例如在约10％内，在约5％内，或在约1％内多更低。

如文中所用，“施用”或“给药”是指注射或其他身体上递送一物质(当该物质为存在身体以外时)(例如，文中所述的FcRn拮抗剂)至患者中的行为，例如通过，但不限于肺(例如，吸入)，黏膜(例如，鼻内)、皮肤内、静脉内、肌肉内、皮下递送和/或任何其他文中所述或本领域已知的身体递送方法。当管理或治疗一疾病或其症状时，典型地施用此物质在疾病或其症状发作后发生。当预防一疾病或其症状时，典型地施用此物质在疾病或其症状发作之前发生且可能长期性持续用以推迟或降低疾病相关的症状的出现和程度。

如文中所用，术语“组合物”旨在包括一含有特定成份(例如，文中所提供的FcRn拮抗剂)，任选地特定量的产品，以及直接或间接从特定成份，任选地以特定量的组合所产生的产品。

“有效量”是指活性药物剂(例如，本公开的FcRn拮抗剂)的量足以在需要此药剂的个体中实现所希望的生理结果。依照所治疗的个体的健康和身体状况、组合的调配物、个体医疗状况的评估及其他相关因素，有效量在个体间可不相同。

如文中所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如文中所用，一受试者可为哺乳动物，例如非灵长类(例如，小鼠、大鼠、牛、猪、马、猫、狗等)或灵长类(例如，猴子和人类)。在优选的实施方案中，此受试者为人类。

如文中所用，术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或其相关症状的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”可用于调节一受试者中的IgG介导疾病(例如，自体免疫反应)或症状或其相关症状的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”是指本领域技术人员，例如医疗人员已知可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或其相关症状的的生物疗法、支持性疗法和/或其他疗法。在其他的实施方案中，术语“疗法”是指可用于一受试者中调节免疫反应或其相关症状的本领域技术人员，例如医疗人员已知的生物疗法、支持性疗法和/或其他疗法。

如文中所用，术语“治疗”是指由于给予一或多种疗法(包括，但不限于施用一或多种预防性或治疗性药剂，例如文中所提供的FcRn拮抗剂)而降低或改善疾病或其相关症状的进程、严重度和/或持续时间。术语“治疗”如文中所用，亦可指改变所治疗的患者的疾病过程。治疗的治疗性效用包括但不限于防止疾病发生或再复发，减轻症状，减少直接或间接病理后果、降低疾病恶化速率，改善或缓和疾病状态及缓解或改善预后。

FcRn拮抗剂

本发明FcRn拮抗剂包含修饰的Fc区(包括由修饰的Fc区所组成或基本上由修饰的Fc区组成)，且可为，例如抗体、抗体变体或片段，例如Fc片段、免疫黏附素，以及Fc融合蛋白。此FcRn拮抗剂可包括单体或二聚体Fc片段。

来自任何IgG亚型的Fc区可用于产生本公开的FcRn。在某些实施方案中，此修饰的Fc衍生自人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区并包括相对于野生型来源的文中所述的取代。在某些其他实施方案中，此修饰的Fc为一衍生自一种以上IgG亚型的人工Fc。在其他的实施方案中，此Fc区包括一嵌合的绞链(亦即包括衍生自不同同型抗体的绞链区，例如，来自IgG4分子的上绞链区和IgG1中绞链区的绞链部分的绞链)。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区为衍生自人类IgG1 Fc区。在其他的实施方案中，此修饰的Fc区为衍生自人类IgG4 Fc区。在其他亚型的Fc区的情况下，本领域技术人员应理解任何文中所述的氨基酸取代可做相应的调整(参见图32)。除非另有指出，否则文中所指的Fc残基位置为依照Eu Ig编号系统。如图32所见，人类IgG CH2和CH3区在四种不同亚型的中是高度保守的。Eu编号系统应用于所有的亚型。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432、N434或Y436的氨基酸取代，以及其任何组合。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432、N434和Y436的任何二个氨基酸位置的双重氨基酸取代。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432、N434和Y436的任何三个氨基酸位置的三重氨基酸取代。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432、N434和Y436的任何四个氨基酸位置的四重氨基酸取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含在选自M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432或Y436的任何位置的氨基酸取代，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434未经取代(亦即，氨基酸位置N434为野生型)。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自M252Y(亦即，在氨基酸位置252的酪氨酸)、T256D、T256E、K288D、K288N、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、E380C、N434F、N434P、N434Y、Y436H、Y436N或Y436W的氨基酸取代，以及其任何组合。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自下列的双重氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；K288，其中该取代为K288D或K288N；T307，其中该取代为T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q或T307W；E380，其中该取代为E380C；N434，其中该取代为N434F、N434P或N434Y；Y436，其中该取代为Y436H、Y436N或Y436W。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自下列的三重取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；K288，其中该取代为K288D或K288N；T307，其中该取代为T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q或T307W；E380，其中该取代为E380C；N434，其中该取代为N434F、N434P或N434Y；Y436，其中该取代为Y436H、Y436N或Y436W。在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自下列的四重氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；K288，其中该取代为K288D或K288N；T307，其中该取代为T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q或T307W；E380，其中该取代为E380C；N434，其中该取代为N434F、N434P或N434Y；Y436，其中该取代为Y436H、Y436N或Y436W。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自M252Y、T256D、T256E、K288D、K288N、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、E380C、Y436H、Y436N或Y436W的任何氨基酸位置的氨基酸取代，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434不经苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自M252Y、T256D、T256E、K288D、K288N、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、E380C、Y436H、Y436N或Y436W的任何氨基酸位置的氨基酸取代，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434不经酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自M252Y、T256D、T256E、K288D、K288N、T307A、T307E、T307F、T307M、T307Q、T307W、E380C、Y436H、Y436N或Y436W的任何氨基酸位置的氨基酸取代，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434为未经取代(亦即，氨基酸位置N434为野生型)。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自M252、T256、T307或N434的氨基酸取代，以及其任何组合。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自在M252、T256、T307和N434的任何二个氨基酸位置的双重氨基酸取代。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自在M252、T256、T307和N434的任何三个氨基酸位置的三重氨基酸取代。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含在氨基酸位置M252、T256、T307和N434的四重氨基酸取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自M252、T256或T307的氨基酸取代，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434为未经取代(亦即，氨基酸位置N434为野生型)。

在示例性的实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自下列的氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；T307，其中该取代为T307Q,or T307W；或N434，其中该取代为N434F或N434Y，以及其任何组合。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自下列任何二个氨基酸位置的双重氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；T307，其中该取代为T307Q或T307W；或N434，其中该取代为N434F或N434Y。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自下列任何三个氨基酸位置的三重氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；T307，其中该取代为T307Q或T307W；或N434，其中该取代为N434F或N434Y。在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含在选自下列的氨基酸位置的四重氨基酸取代：M252，其中该取代为M252Y；T256，其中该取代为T256D或T256E；T307，其中该取代为T307Q或T307W；或N434，其中该取代为N434F或N434Y。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自下列的氨基酸取代：M252Y、T256D、T256E、T307Q或T307W，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434不经苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自下列的氨基酸取代：M252Y、T256D、T256E、T307Q或T307W，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434不经酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自下列的氨基酸取代：M252Y、T256D、T256E、T307Q或T307W，以及其任何组合，其中氨基酸位置N434为未经取代(亦即，氨基酸位置N434为野生型)。

在特定的实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自T256D或T256E，和/或T307W或T307Q的氨基酸取代，并进一步包含选自N434F或N434Y或M252Y的氨基酸取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含一选自T256D或T256E，和/或T307W或T307Q的氨基酸取代，并进一步包含M252Y的氨基酸取代，其中氨基酸位置N434不经苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自T256D或T256E，和/或T307W或T307Q的氨基酸取代，并进一步包含氨基酸取代M252Y，其中氨基酸位置N434不经酪氨酸(Y)取代。在某些实施方案中，可能希望修饰的Fc区包含选自T256D或T256E，和/或T307W或T307Q的氨基酸取代，并进一步包含氨基酸取代M252Y，其中氨基酸位置N434为未经取代(亦即，氨基酸位置N434为野生型)。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含如图33所示的氨基酸取代。例如，此修饰的Fc区可包含双重氨基酸取代M252Y/N434Y(YY)；或选自M252Y/T307W/N434Y(YWY)、M252Y/T256D/N434Y(YDY)和T256D/307W/N434Y(DWY)的三重氨基酸取代。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区可包含选自下列的四重氨基酸取代：M252Y/T256D/T307Q/N434F(YDQF)、M252Y/T256D/T307W/N434F(YDWF)、M252Y/T256D/T307Q/N434Y(YDQY)、M252Y/T256E/T307Q/N434Y(YEQY)、M252Y/T256D/T307W/N434Y(YDWY)和M252Y/T256E/T307W/N434Y(YEWY)。

在某些实施方案中，此修饰的Fc区具有一或多个，例如，二或更多个，三或更多个，或四或更多个如文中所述的氨基酸取代。

修饰的Fc相比于其野生型对应物，在酸性pH(例如，低于约7.0，或不大于约6.5或不大于约6.0)和非酸性pH(例如，不低于约7.0或不低于约7.4)具有提升的FcRn结合亲和力。

如文中所用，术语“提升”是指特定参数增加10％，并可包括比对照组、基线或先前数值至少增加20％，增加30％，增加40％，增加50％，增加60％，增加70％，增加80％，增加90％，增加95％，增加97％，增加99％或甚至增加100％。术语“提升”可指一特定的参数比对照组、基线或先前数值至少增加1倍，1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍，100倍，1000倍。在特定的实施方案中，术语“提升”是指相对于野生型标准，例如野生型Fc区的增加。在其他的实施方案中，术语“提升”是指相对于FcRn拮抗剂，例如，包括M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F的FcRn拮抗剂(“YTEKF hIgG1”；参见，例如，Swiercz et al.,上文)的增加。

在某些实施方案中，此FcRn拮抗剂可展现物种-特异性的FcRn结合亲和力。在某些实施方案中，此FcRn拮抗剂可展现人类以及食蟹猴FcRn结合亲和力。在一实施方案中，结合多肽可展现大鼠和/或小鼠FcRn结合亲和力。在某些实施方案中，结合多肽可展现跨物种的FcRn结合亲和力。这些结合多肽称为跨一或多种不同物种的交叉反应。在一实施方案中，结合多肽可展现人类和大鼠FcRn结合亲和力。

新生儿Fc受体(FcRn)与抗体的Fc区相互作用通过挽救正常的溶酶体降解来促进循环。此过程是pH-依赖性的过程，其发生在酸性pH(例如，pH低于6.5)的胞内体，而非在血液的生理pH条件下(例如，非酸性pH)。本公开的FcRn拮抗剂在酸性和非酸性条件下相比于包括野生型Fc区的多肽具有提升的FcRn结合亲和力或较缓慢的FcRn解离速率。酸性的pH是低于约7.0的pH，例如，约pH 6.5，约pH 6.0，约pH 5.5，约pH 5.0。升高的、非酸性的pH是约7或更大的pH，例如约pH 7.4，约pH 7.6，约pH 7.8，约pH 8.0，约pH 8.5或约pH 9.0。在特定的实施方案中，该包括文中所述的修饰Fc区的多肽在FcRn结合中展现丧失pH-依赖性；亦即，不同于野生型Fc，该多肽在非酸性条件下相比于酸性条件，不具有极低的FcRn结合亲和力。这些多肽因此可用作FcRn拮抗剂，提升具有野生型FcRn结合性质的IgG从循环中清除，因为此FcRn拮抗剂，通过以高pH-依赖性或低pH-依赖性的方式与FcRn紧密结合，扰乱了具有野生型(亦即，较低)FcRn结合亲和力的IgGFcRn介导的回收。

免疫球蛋白的Fc区涉及非抗原结合功能并具有数个通过与Fc受体结合，例如，结合FcRn所介导的效应子功能。如图1A所示，Fc区由CH2区和CH3区所组成。大多数涉及与FcRn相互作用的Fc残基位于直接与CH2-CH3界面(图1A，点虚线)毗邻及糖基化位置对面的环中。图1B显示IgG1Fc晶体结构(pdb：5d4q)的表面表征并显示包含FcRn结合界面的CH2和CH3区中的残基。

在特定的实施方案中，本发明FcRn拮抗剂可包括包含一或多个氨基酸突变(例如，取代)的修饰Fc区，该突变相比于对应的野生型分子，改变Fc区的效应子功能(例如，ADCC或CDC功能)，例如，具有如同FcRn拮抗剂的相同结构但是却具有野生型Fc区的分子。就抗体FcRn拮抗剂，其对应的野生型分子可为完整、未改变抗体，包括大约相同致免疫性的抗体。例如，具有降低的ADCC和/或CDC效应子功能(例如，所述含有LALA突变者)的FcRn拮抗剂，当施用患者时，可能较不会造成不希望的副作用。

在特定的实施方案中，本发明的FcRn拮抗剂可包括包含一或多个氨基酸突变(例如，取代)的修饰的Fc区，该突变相比于对应的野生型分子改变(例如，增加或降低)FcRn拮抗剂的循环半衰期(例如，血清半衰期)。例如，当不希望FcRn拮抗剂长时间存在患者体内时，降低血清半衰期可能是有利的。

在特定的实施方案中，本发明的FcRn拮抗剂可包括包含一或多个突变(例如，取代)的修饰的Fc区，该突变相比于对应的野生型分子，提供一或多个所希望的生化特质，例如维持单体的能力，非共价二聚化的能力，增加定位在靶位置的能力及糖基化模式。例如，此修饰的Fc区可具有降低的糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)。赋予降低或改变糖基化的示例性的氨基酸取代，公开于国际PCT公开案号WO 2005/018572中。在某些实施方案中，此Fc区经修饰用以消除糖基化(例如，“agly”抗体)。“agly”FcRn拮抗剂可能具有在体内提升的安全性和稳定性样貌。有许多技术-认可的方法可供制造“agly”抗体或具有改变聚糖的抗体。例如，具有修饰的糖基化路径(例如，糖基移转酶删除)的基因工程化宿主细胞(例如，修饰的酵母菌，例如，毕赤酵母(Picchia)或CHO细胞)可用于制造这些抗体。

在特定的实施方案中，可使用本领域中已知的技术使Fc区突变以减低效应子功能。在某些实施方案中，文中此修饰的Fc对于Fc-γ受体(FcγR)亦具有改变的结合亲和力。此FcγR属于一包括数个成员的家族，例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb。在某些实施方案中，文中此修饰的Fc相比于野生型Fc区，在具有提升的FcRn结合亲和力的同时具有降低的FcγRIIIa结合亲和力。

在某些实施方案中，此FcRn拮抗剂为抗体。适合的抗体包括(不限于)人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体，以及可为全长抗体或单链抗体。此抗体可以与疾病状态有关的可溶性靶标为靶标(例如，细胞因子和分泌的循环蛋白)。

具有低热力学安定性的蛋白，包括抗体，具有错误折叠和聚集增加的倾向且可能限制或阻碍蛋白作为有效治疗剂的活性、功效和可能性。在特定的实施方案中，FcRn拮抗剂具有如同包含野生型Fc区或具有三重氨基酸取代M252Y/S254T/T256E(YTE)的修饰Fc区的多肽大约相同或相当的热安定性。

修饰所得的生理特征、生物利用度和其他生物化学效应(如定位、生物分布和血清半衰期)，可以使用熟知的免疫学技术在无需过多的实验的情况下容易地测量和定量。

在特定的实施方案中，本公开的FcRn拮抗剂为分离的结合多肽并包含抗原结合片段，其衍生自与此修饰的Fc区融合的抗体。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其与抗原结合或与完整抗体(亦即，该片段是从该完整抗体所衍生的)竞争和抗原结合(亦即，特异性结合)。

在某些实施方案中，此结合多肽包含与文中修饰的Fc融合的单链可变区序列(ScFv)。单链可变区序列包含具有一或多个抗原结合位点的单一多肽，例如，通过弹性接头与VH区相连接的VL区。ScFv分子可以VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向构建。构成抗原结合位点的连接VL和VH区的弹性绞链包括约10个至约50个氨基酸残基。连接肽已为本领域所知。

在某些实施方案中，本公开的结合多肽为多价(例如，四价)抗体，其通过将编码抗体的DNA序列与ScFv分子(例如，改变的ScFv分子)融合所制造。例如，在一实施方案中，将这些序列组合，使得ScFv分子(例如，改变的ScFv分子)在其N-端或C-端经由弹性接头(例如，甘氨酸/丝氨酸(gly/ser)接头)与抗体的Fc片段相连接。在另外的实施方案中，本公开的四价抗体可通过将ScFv分子与连接肽融合来制造，该连接肽与修饰的Fc区融合，构建ScFv-Fab四价分子。

在另外的实施方案中，本公开的结合多肽为改变的微型抗体(minibody)。本公开的改变的微型抗体由二条多肽链所构成的二聚体分子，所述多肽链各自包含经由连接肽与修饰的Fc区融合的ScFv分子。微型抗体可使用本领域所述的方法通过构建ScFv组件和连接肽组件来制造(参见，例如，美国专利5,837,821或WO 94/09817)。在另外的实施方案中，可构建四价微型抗体。四价微型抗体可以如同微型抗体的方式构建，但是二个ScFv分子使用弹性接头相连接。然后将连接的scFv-scFv结构与修饰的Fc区相连接。

在另外的实施方案中，本公开的结合多肽包括双抗体(diabody)。双抗体为二聚体、四价分子，各自具有类似scFv分子的多肽，但通常具有短的(低于10个，例如约1至5个)氨基酸残基接头连接二个可变区，使得在相同多肽链上的VL和VH区无法相互作用。取而代之的，多肽链上的VL和VH区与第二多肽链上的VH和VL区(个别地)相互作用(参见，例如WO02/02781)。本公开的双抗体包含与修饰的Fc区融合的类scFv分子。

在其他的实施方案中，此结合多肽包括多特异性或多价抗体，该抗体包含在相同多肽链上一连串的一或多个可变区，例如，串联可变区(TVD)多肽。示例性的TVD多肽包括美国专利第5,989,830号中所述的“双头”或“双-Fv”构型。在双-Fv构型中，二个不同抗体的可变区以串联方向表达在二条个别的链上(一条重链和一条轻链)，其中一多肽链具有二个以肽接头分开的串联VH区(VH1-接头-VH2)而另一条多肽链由通过肽接头以串联相连接的互补的VL区所组成(VL1-接头-VL2)。在交叉的双头构型中，二个不同抗体的可变区以串联方向表达在二条个别的多肽链上(一条重链和一条轻链)，其中一多肽链具有二个以肽接头分开的串联VH区(VH1-接头-VH2)而另一条多肽链由通过肽接头以相反方向串联连接的互补VL区所组成(VL2-接头-VL1)。以“双-Fv”模式为基础的另外的抗体变体包括双-可变-区IgG(DVD-IgG)双特异性抗体(参见美国专利7,612,181)和TBTI模式(参见US2010/0226923A1)。在某些实施方案中，结合多肽包含多特异性或多价抗体，该抗体包含与修饰Fc区融合在相同多肽链上的一或多个串联的可变区。

在另外示例性的实施方案中，此结合多肽包括以“双头”构型为基准的交叉双可变区IgG(CODV-IgG)双特异性抗体(参见US20120251541A1)。

在另外示例性的实施方案中，此结合多肽为免疫黏附素。如文中所用，“免疫黏附素”是指包括与免疫球蛋白恒定区(亦即Fc区)相连接的一或多个结合区(例如，来自受体、配体或细胞黏附分子)的结合多肽(参见，例如，Ashkenazi et al.,Methods(1995)8(2):104-15，及Isaacs,Brit J Rheum.(1997)36:305-7，其以全文引用的方式并入本文中)。免疫黏附素的实施例介于受体的配体结合区和IgG Fc区之间的嵌合分子。在某些实施方案中，此FcRn拮抗剂结合并隔离涉及炎症的细胞因子的免疫黏附素。

免疫黏附素以其国际非专利药品名称(INN)，字尾“-cept”来识别。如同抗体，免疫黏附素具有长的循环半衰期，容易通过基于亲和力的方法来纯化，且具有因双价所赋予的亲和力优势。市面可购得的治疗性免疫黏附素的实施例包括依那西普(etanercept)

阿巴西普(abatacept)

利纳西普(rilonacept)

阿柏西普(aflibercept)

和贝拉西普(belatacept)

在特定的实施方案中，此分离的结合多肽与文中所述的修饰Fc区融合的模拟抗体，例如亲合体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz区肽、单抗体(monobody)和nanoCLAMP。

在特定的实施方案中，此结合多肽包括类免疫球蛋白区。适合的类免疫球蛋白区包括但不限于纤连蛋白区(fibronectin domain)(参见，例如，Koide et al.,Methods MolBiol.(2007)352:95–109，其为以全文引用的方式并入本文中)，DARPin(参见，例如，Stumppet al.,Drug Discov Today(2008)13(15–16):695–701，其为以全文引用的方式并入本文中)，A蛋白的Z区(参见Nygren et al.,FEBS J.(2008)275(11):2668–76，其为以全文引用的方式并入本文中)，载脂蛋白(Lipocalins)(参见，例如，Skerra et al.(2008)FEBSJ.275(11):2677–83，其为以全文引用的方式并入本文中)，Affilins(参见，例如，Ebersbach et al.,J Mol Biol.(2007)372(1):172–85，其为以全文引用的方式并入本文中)，Affitins(参见，例如，Krehenbrink et al.,(2008)J Mol Biol.383(5):1058–68，其为以全文引用的方式并入本文中)，Avimers(参见，例如，Silverman et al.,(2005)NatBiotechnol.23(12):1556–61，其为以全文引用的方式并入本文中)，Fynomers(参见，例如，Grabulovski et al.,J Biol Chem.(2007)282(5):3196–3204，其为以全文引用的方式并入本文中)及Kunitz区肽(参见，例如，Nixon et al.,(2006)Curr Opin Drug DiscovDevel 9(2):261–8，其为以全文引用的方式并入本文中)。

包含文中所述的修饰Fc区的本公开的结合多肽，可包括已知的“亲代”抗体的CDR序列或可变区序列。在某些实施方案中，排除文中所述的Fc区的修饰，此亲代抗体和本公开的抗体可享有类似或相同的序列。

核酸和表达载体

典型地，编码文中所公开的多肽的聚核苷酸插入表达载体中，以导入可用于制造所希望数量的所述多肽，例如抗体、其片段或免疫黏附素的宿主细胞中。因此，在某些方面，本发明提供包含文中所公开的聚核苷酸的表达载体和包括这些载体和聚核苷酸的宿主细胞。

术语“载体”或“表达载体”就说明书和权利要求书的目的是用来指用于导入及在细胞中表达所希望基因的载体。这些载体可容易地选自由以下组成的群：质粒、噬菌体和病毒(例如，杆状病毒、牛痘病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和反转录病毒)。一般而言，载体将包含选择标记和适当的限制位点用以帮助克隆所希望的基因和载体进入和/或在真核细胞或原核细胞中复制的能力。

可运用许多表达载体系统。例如，其中一种载体利用衍生自动物病毒，例如牛乳突病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、反转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA组件。其他的涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统(polycistronicsystem)。另外，可通过导入一或多个得以选择转染的宿主细胞的标记来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞。此标记可提供原营养体给营养缺陷的宿主，杀生物剂抗药性(例如，抗生素)或重金属，例如铜的抗性。可选择的标记基因可直接与所要表达的DNA序列相连接或通过共转化导入相同的细胞。亦可能需要另外的组件进行最佳的mRNA合成。这些组件可包括信号序列、剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方案中，所克隆的可变区基因为随着如上所论述合成的重链和轻链恒定区基因(例如人类基因)，插入表达载体。

在其他的实施方案中，文中所述的结合多肽可使用多顺反子构建体来表达。在这些表达系统中，感兴趣的多基因产物，例如抗体的重链和轻链可从单一多顺反子构建体来产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)在真核宿主细胞中提供相当高量的多肽。兼容的IRES序列公开于美国专利第6,193,980号中。

更一般而言，一旦载体或编码本公开的FcRn拮抗剂的DNA序列制备完成，此表达载体则可导入适合的宿主细胞。将质粒导入宿主细胞可通过各种技术，例如转染(包括电泳和电穿孔)、原生质融合、磷酸钙沉淀、以套模DNA细胞融合、显微注射和以完整病毒转染来进行。转化的细胞在适合制造本发明结合多肽的条件下生长，并分析其合成。示例性的分析技术包括酶结合免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或荧光活化细胞分类计(FACS)、免疫组织化学染色及诸如此类。

用于表达本发明多肽的宿主细胞可为真核细胞(例如，哺乳动物、昆虫、酵母菌或植物)或原核细胞来源。在某些实施方案中，用于表达此多肽的宿主细胞株为哺乳动物来源；本领域技术人员可决定最适合用于文中所希望表达的所希望的基因产物的特定宿主细胞株。示例性的宿主细胞包括，但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，DG44和DUXB11，CHO细胞株，DHFR减除)、HELA(人类子宫颈肿瘤)、CVI(猴子肾细胞株)、COS(CVI与SV40 T抗原的衍生物)、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)、BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)、HAK(仓鼠肾细胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴瘤)和293(人类肾脏)。在一实施方案中，此细胞株提供改变的糖基化，例如，从其表达的结合多肽(例如，抗体)的岩藻糖基化(例如，PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8-剔除CHO细胞株(POTELLIGENT^TM细胞)(Biowa,Princeton,NJ))。在一实施方案中，可使用NS0细胞。宿主细胞典型地可从市面上、美国组织培养中心或从公开的文献中取得。用于在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养的技术已为本领域所知并包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中或固定化或包埋细胞培养，例如，在中空纤维、微胶囊，在琼脂糖微珠或陶瓷盒上。若需要和/或为所希望的，多肽的溶液可通过常规的色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-纤维素上的色谱和/或(免疫-)亲和色谱加以纯化。

治疗方法

在一方面，本公开提供治疗有需要的受试者(例如，人类患者)的方法，该方法包括施用有效量的文中所公开的FcRn拮抗剂。在特定的实施方案中，本公开提供用于这些治疗方法的制品(例如，试剂盒)。该患者具有IgG介导的疾病或障碍且可通过以本公开的FcRn拮抗剂治疗而更快速清除血清IgG从而获益。如文中所用，术语“抗体相关的”、“抗体介导的”和“抗体反应的”障碍、症状或疾病是指可通过移除不希望的抗体(例如，特定的自体反应性IgG或外来所提供的治疗性或诊断性IgG，其为不再需要的或对患者不再是有利的)而改善的障碍、症状或疾病。

在特定的实施方案中，IgG介导的障碍可为自身免疫疾病，例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力症、系统性硬化症(SSc)/硬皮病、类风湿性关节炎、干癣性关节炎、骨性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、寻常性天疱疮、异位性皮肤炎、干癣、哮喘、过敏、特发性肺纤维化(IPF)、特发性血小板减少紫斑症(ITP)和化脓性汗腺炎。

在特定的实施方案中，此IgG介导的障碍可为过敏。此过敏可为，例如食物过敏(例如，蛋过敏、鱼类过敏、贝类过敏、水果过敏、大蒜过敏、辣椒过敏、燕麦过敏、肉类过敏、乳类过敏、花生过敏、米过敏、芝麻过敏、大豆过敏、亚硫酸盐过敏、酒石黄(tartrazine)过敏、树坚果过敏、小麦过敏及诸如此类)、药物过敏(例如，四环霉素过敏、苯妥英(Dilantin)过敏、卡马西平(Tegretol)过敏、青霉素过敏、头孢菌素(cephalosporin)过敏、磺胺类过敏、非类固醇消炎药过敏、静脉内显影剂过敏及诸如此类)、环境过敏(例如，青草过敏、花粉过敏、猫过敏、狗过敏、昆虫过敏、霉菌过敏、香水过敏、化妆品过敏、精液过敏、乳胶过敏、水过敏、屋尘螨过敏、镍过敏、黄金过敏、铬过敏、钴过敏、照片显像剂过敏、杀真菌剂过敏及诸如此类)和接触过敏(例如，乳胶过敏、对苯二胺过敏、单硫醇乙酸甘油酯过敏、甲苯磺酰胺甲醛过敏及诸如此类)。

在特定的实施方案中，文中所公开的FcRn拮抗剂可与一或多种另外的治疗剂组合使用。在特定的实施方案中，包括文中所公开的FcRn拮抗剂可针对先天的免疫系统和/或后天免疫系统，例如通过与循环促炎性细胞因子结合并将其移除。在某些实施方案中，FcRn拮抗剂本身可与促炎性细胞因子结合及移除，达到移除自体反应血清IgG以及促炎性细胞因子的组合效用。在特定的实施方案中，包括文中所公开的FcRn拮抗剂的组合疗法可包括TLR-抑制剂，例如，IRAK-4抑制剂。

在特定的实施方案中，此FcRn拮抗剂可用于受试者中降低含Fc-药剂(例如，治疗剂或诊断剂)的血清量。在其中含Fc药剂对于受试者有害(例如有毒)、或其中希望该含Fc药剂仅在该受试者中存在一段特定时间的情况下，清除含Fc药剂可能是所希望的，例如分别当该含Fc药剂为致免疫性或该含Fc药剂为抗体-药物缀合物时。在特定的实施方案中，清除含Fc药剂降低了该受试者暴露于该含Fc药剂的量。血清中任何含Fc药剂的量可通过使用文中所述的FcRn拮抗剂来降低。因此，在特定的实施方案中，文中所公开的FcRn拮抗剂用于已施用含Fc药剂的受试者中减低该含Fc药剂的血清量。

在另外方面，提供提升诊断造影的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的文中所公开的FcRn拮抗剂。文中所公开的FcRn拮抗剂可在诊断造影期间用于降低背景量和放射性标记抗体的系统性暴露。在特定的实施方案中，诊断造影包括但不限于，正电子发射计算机断层扫描(PET)、单光子计算机断层扫描(SPECT)、PET和计算机断层扫描(CT)的组合及诸如此类。

在特定的实施方案中，受试者被施用有效量的放射性标记抗体，及任选地，FcRn拮抗剂在施用该放射性标记抗体之后施用。在特定的实施方案中，使用文中所述的FcRn拮抗剂在受试者中提升了射线标定抗体的对比，例如，通过从循环中清除未结合的射线标定抗体，让对比增加(例如，降低背景信号)并降低暴露于射线标定抗体的有害效应。因此，在特定的实施方案中，提供降低正常组织在诊断造影期间暴露于射线标定抗体的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的文中所公开的FcRn拮抗剂。

在特定的实施方案中，文中所公开的FcRn拮抗剂可用于受试者中清除治疗剂。例如，施用治疗剂的受试者可能产生抗体，例如，抗药物抗体，而降低所施用的治疗剂的可利用性和/或疗效。抗药物抗体的存在可能造成不希望的副作用。因此，文中所公开的FcRn拮抗剂移除了在此受试者中所产生的抗药物抗体。

通过例行的实验，本领域技术人员应能决定如文中所述的FcRn拮抗剂(例如，在pH6.0和pH 7.4具有提升FcRn结合的四价变体)的有效量。在特定的实施方案中，FcRn拮抗剂的有效量是无毒的。FcRn拮抗剂的治疗有效量可能根据各种因素而变。例如，不限于，希望施用FcRn拮抗剂的受试者的年龄、性别、疾病状态和医疗史可影响FcRn拮抗剂的治疗有效量的适当决定。可决定适合的剂量疗法，以便于在受试者中提供有效的治疗反应。剂量可在一段特定的时间内分开给药，例如，每天给药历时1周。

在特定的实施方案中，本公开提供在有需要的哺乳动物受试者中用于诊断和/或治疗障碍，例如，IgG介导的障碍的试剂盒和方法。在示例性的实施方案中，该受试者为人类。

药物组合物及其给药

制备和施用本发明FcRn拮抗剂于受试者中的方法已为本领域技术人员所熟知或可容易地由本领域技术人员决定。施用的路径可为口服、非经肠、局部或吸入。术语“非经肠”如文中所用包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然所有这些施用形式明确地被认为是在本公开的范围内，但用于施用的形式应用于注射，特别适用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的适合药物组合物可包括缓冲剂(例如，乙酸盐、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，任选地安定剂(例如，人类白蛋白)、防腐剂等。在某些实施方案中，FcRn拮抗剂可直接递送至不良的细胞群组的位置，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。

用于非经肠施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实施例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯类，例如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括食盐水和缓冲媒剂。在本公开的组合物和方法中，药学上可接受的载剂包括，但不限于0.01-0.1M，例如，0.05M磷酸缓冲液或0.8％食盐水。其他常见的非经肠媒剂包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或非挥发性油类。静脉内媒剂包括液体和营养素补充物、电解质补充物，例如所述以林格氏右旋糖为基础的媒剂及诸如此类。亦可存有防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及诸如此类。更特言之，适合注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散液及供临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。在这些情况下，组合物必须是无菌的且应是容易注射的程度的流体。其在制造和储存的状况下应是安定的且任选地避免微生物，例如细菌和真菌的污染作用。载剂可为溶剂或含有，例如水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇及诸如此类)的分散媒剂及其适合的混合物。适当的流动性，例如可通过使用涂层，例如卵磷脂来维持，若为分散液则通过维持所需的颗粒大小及通过使用表面活性剂。

防止微生物作用可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫汞撒(thimerosal)及诸如此类来进行。在许多的情况下，组合物中将包括等渗剂，例如糖、多醇类，例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来施行。

在任何情况下，无菌可注射溶液可通过将活性化合物(例如，修饰的结合多肽本身或与其他活性剂组合)以所需的量与一种或组合的文中所列举的成份并入适合的溶剂中，接着过滤杀菌来制备。一般而言，分散液为通过将活性化合物并入无菌媒剂中所制备，该无菌媒剂含有基本的分散媒剂和上文列举的所需的其他成份。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下，示例性的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，产生一活性成份加上任何来自先前其无菌过滤溶液的另外所希望成份的粉末。将用于注射的制备物加工处理，填入容器中，例如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶，并于无菌条件下根据本领域已知的方法密封。再者，制备物可经包装并以试剂盒的形式贩卖。这些制品典型地将具有标签或包装说明书，标示此随附的组合物可用于治疗患有IgG介导的障碍或有其倾向的受试者。

本发明药物组合物的有效剂量依照许多不同因素而变，包括给药方法、靶位置、患者健康状态、医疗史、年龄、性别和体重。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的例行方法来测定以优化安全性和功效。

本发明FcRn拮抗剂可施用多次。单一剂量之间之间隔时间可为每周、每月或每年。间隔时间亦可如在患者中测量血液IgG的量所示为不规律的。在某些方法中，剂量为经调整以达到约1-1000μg/ml的血浆FcRn拮抗剂浓度及在某些方法中为约25-300μg/ml。或者，FcRn拮抗剂可以持续释放的调配物来施用，在该情况下需要较低频率给药。就抗体而言，剂量和频率为依照抗体在患者中的半衰期而定。

文中的药物组合物可包含一或多种的本发明FcRn拮抗剂和药学上可接受的、无毒、无菌载剂，例如生理食盐水、无毒缓冲剂及诸如此类。施用的剂量和频率可依照治疗是预防性或治疗性而变。在预防性施用中，含有FcRn拮抗剂或其混合物(cocktail)的药物组合物在患者尚未处于疾病状态时施用，用以增进患者对发生疾病的抵抗力(例如，遗传上易患病倾向的患者)。此量定义为“预防上有效剂量”。在此用途上，精确的量再次依照患者的健康状态和总免疫力而定，但一般而言范围为从每剂约0.1至约25mg，尤其是每剂约0.5至约2.5mg。或者，于一段长时间内以极低的剂量以相当低频的间隔时间来施用。某些患者在其余生持续接受治疗。在治疗施用上，有时候需要相当短时间间隔的相当高剂量(例如，从约每剂1至400mg/kg体重，例如从约5至25mg的剂量)直到疾病进行降低或终止或直到患者显现部分或完全改善疾障碍状。之后，可给予患者预防性疗法。

示例性的实施方案

本公开的示例性的非限定实施方案提供如下。

1.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，其中该修饰的Fc区包含至少四个下列氨基酸取代的组合：

在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，及在氨基酸位置307的色氨酸(W)或谷氨酰胺(Q)，其中氨基酸位置254不为苏氨酸(T)，及进一步包含：

在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；和

在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，

其中该氨基酸位置是根据EU编号的。

2.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区具有在选自由以下组成的群的在位置的氨基酸取代组合：

a)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

b)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)，及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

c)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)，及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

d)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)，及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)；或

e)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)，及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，

其中该氨基酸取代是根据EU编号的。

3.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含：选自由以下组成的群的四重氨基酸取代：M252Y/T256D/T307Q/N434Y、M252Y/T256E/T307W/N434Y、M252Y/T256E/T307Q/N434Y、M252Y/T256D/T307Q/N434F及M252Y/T256D/T307W/N434Y，其中该氨基酸取代是根据EU编号的。

4.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)。

5.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)。

6.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)。

7.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)。

8.一种在有需要的受试者中治疗抗体介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)。

9.任何前述实施方案的方法，其中该修饰的Fc区为修饰的人类Fc区。

10.任何前述实施方案的方法，其中该修饰的Fc区为修饰的IgG1 Fc区。

11.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂为具有人类FcRn结合亲和力。

12.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂为具有人类和大鼠FcRn结合亲和力。

13.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有提升的FcRn结合亲和力。

14.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

15.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(根据EU编号)的FcRn拮抗剂具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

16.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有在非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

17.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(根据EU编号)的FcRn拮抗剂具有在非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

18.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力及在非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

19.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(根据EU编号)的FcRn拮抗剂具有在酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，及在非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力。

20.任何前述实施方案的方法，其中该酸性pH为约6.0。

21.任何前述实施方案的方法，其中该非酸性pH为约7.4。

22.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有降低的血清半衰期。

23.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(根据EU编号)的FcRn拮抗剂具有降低的血清半衰期。

24.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有降低的FcγRIIIa结合亲和力。

25.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂相比于包含野生型Fc区的FcRn拮抗剂具有降低的热安定性。

26.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂为结合多肽。

27.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂选自由以下组成的群的抗体或其片段：Fv片段、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab-H、Fab'、F(ab')2、Fd，dAb及其多聚合体，单区抗体，大型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、双抗体，叁抗体、四抗体、vNAR及双-scFv。

28.任何前述实施方案的方法，其中该抗体为单克隆抗体。

29.任何前述实施方案的方法，其中该抗体为嵌合、人源化或人类抗体。

30.任何前述实施方案的方法，其中该抗体为全长抗体。

31.实施方案1-25中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂选自由以下组成的群的模拟抗体：亲合体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz区肽、单抗体(monobody)和nanoCLAMP。

32.实施方案31的方法，其中该FcRn拮抗剂为亲和抗体(affibody)。

33.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂进一步包含白蛋白结合区。

34.任何前述实施方案的方法，其中该FcRn拮抗剂特异性结合一或多个靶标。

35.任何前述实施方案的方法，其中该抗体介导的障碍为自身免疫疾病。

36.实施方案35的方法，其中该自身免疫疾病选自由以下组成的群：移植物抗宿主疾病(GVHD)、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力症、系统性硬化症(SSc)/硬皮病、类风湿性关节炎、干癣性关节炎、骨性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、寻常性天疱疮、异位性皮肤炎、干癣、哮喘、过敏、特发性肺纤维化(IPF)、特发性血小板减少紫斑症(ITP)和化脓性汗腺炎。

37.一种提升诊断造影的方法，该方法包括于受试者投中施用治疗有效量的包括修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的四重氨基酸取代：M252Y/T256D/T307Q/N434Y、M252Y/T256E/T307W/N434Y、M252Y/T256E/T307Q/N434Y、M252Y/T256D/T307Q/N434F及M252Y/T256D/T307W/N434Y，其中该氨基酸取代是根据EU编号的。

38.实施方案37的方法，进一步包括向该受试者施用有效量的放射性标记抗体。

39.实施方案38的方法，其中该FcRn拮抗剂在放射性标记抗体之后施用。

40.实施方案37或38的方法，其中该方法为提升放射性标记抗体的对比。

41.一种降低非靶组织在诊断造影期间暴露于放射性标记抗体的方法，该方法包括施用受试者治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号选自由以下组成的群四重氨基酸取代：M252Y/T256D/T307Q/N434Y、M252Y/T256E/T307W/N434Y、M252Y/T256E/T307Q/N434Y、M252Y/T256D/T307Q/N434F及M252Y/T256D/T307W/N434Y，其中该氨基酸取代是根据EU编号的。

文中所提及或叙述的文章、专利和专利申请案及所有其他文书和电子形式可取得的数据以全文引用的方式并入本文中，其引用程度就如同各个别公开案特定及个别地以引用的方式并入。申请人保留了来自任何这些文章、专利和专利申请案或其他实质和电子文书的任何和所有材料及信息实体并入本申请案的权利。

当本发明就有关其特定的实施方案说明的同时，本领域技术人员应理解，在不悖离本发明真实的精神和范围下，可作各种不同的变化及可以同等物取代。本领域技术人员应容易理解，在不悖离文中所公开的实施方案的范围下，可使用适合的同等物就文中所述方法做其他适合的修改和调整。此外，可做许多的修改用以调整特定的情况、物质、组合物、方法、过程步骤或步骤使其适应本发明的靶、精神和范围。所有这些修改希望在所附的权利要求书内。现在已详细描述特定的实施方案，通过参照下列实施例将更能明确理解这些特定实施方案，而下列实施例仅以说明的目的纳入且不希望受限。

实施例

通过下列实施例进一步说明本发明。这些实施例不应被解释为进一步限制。

实施例1：材料和方法

蛋白试剂

表达和分离下列蛋白：带有C-端8x组氨酸标签的抗原(SEQ ID NO：5)；大鼠FcRn(rFcRn,UniProt：P1359,p51亚基：残基23-298；UniProt：P07151,β2-m：残基21-119)；生物素化食蟹猴FcRn(cynoFcRn,UniProt：Q8SPV9,p5亚基：带有C-端Avi-标签的残基24-297；UniProt：Q8SPW0,β2-m：残基21-119)；生物素化人类FcRn(hFcRn,UniProt：P55899,p51亚基：带有C-端Avi-标签的残基24-297；UniProt：P61769,β2-m：残基21-119)；人类CD16a(UniProt：P08637,FcγRIIIa：带有C-端HPC4卷标及位置158缬氨酸(V158)的残基17-208)。从HEK293条件培养基得到H435A和H310A/H435Q重链变体。以Evitria克隆mAb2(IgG1)变体并使用mAbSelect^TM SuRe^TM亲和柱(GE Healthcare)从悬浮液CHO K1条件培养基纯化及缓冲液交换至磷酸缓冲食盐水(PBS)pH 7.4供后续实验。

饱和库构建

使用NcoI和HindIII限制酶位点，将带有前导DNA序列的WT IgG1 mAb1(IgG1)抗体重链和轻链分别并入pBH6414和pBH6368哺乳动物表达质粒。以闪光定点致突变试剂盒(Lightning Site Directed Mutagenesis Kit)(Agilent)和NNK(N＝A/C/G/T,K＝G/T)及WWC(W＝A/T)引子(IDT Technologies)制造饱和库，在下列位置导入所有可能的氨基酸：M252、I253、S254、T256、K288、T307、K322、E380、L432、N434和Y436(Eu编号)。将mAb1骨架中三种对照变体的重链DNA序列，AAA(T307A/E380A/N434A)、LS(M428L/N434S)和YTE(M252Y/S254T/T256E)，通过LakePharma构建至pBH6414载体内。

经由mAb1重链的定点致突变以Q5致突变试剂盒(NEBiolabs)和T256D、T256E、T307Q、T307W、N434F及N434Y引子以WT和M252Y模板以PCR反应，得到组合的饱和库。使用

致突变试剂盒(NEBiolabs)以M252Y、T256D、T307Q和T307W引子进行将突变并入mAb3骨架。所有的Fc变体的反应经由桑格法测序(Sanger Sequencing)(Genewiz,Inc.)来确认。

重组的抗体表达和纯化

对于条件培养基筛选，根据制造商的说明书，将含DNA突变体重链和mAb1的野生型轻链转染至1mL的Expi293哺乳动物细胞(Invitrogen^TM)进行表达。将细胞于2mL 96孔盘(Greiner Bio-One)中在37℃、5％二氧化碳和80％湿度以每分钟900次旋转(RPM)的震荡培养并以曝气薄膜密封。在转染后5天收集条件培养基并储存于-80℃直到使用。将骨架mAb1和mAb3中的先导变体以30mL量级表达在带有0.2μm通气盖的125mL烧瓶(Corning)。在整个表达前间将该125mL培养烧瓶以125RPM震荡。转染后5天收集条件培养基并经由0.22μm,50mL圆锥形过滤器(Corning)过滤及储存于4℃直到纯化。

使用1mL mAbSelect^TM SuRe^TM

柱(GE Healthcare)进行mAb1和mAb3的分离。在PBS pH 7.4的10个柱体积的冲洗步骤后，以5个柱体积的0.1M柠檬酸pH 3.0(Sigma)洗脱抗体并以0.5mL的1M tris碱pH 9.0(Sigma)中和。将洗脱的抗体以PBS pH 7.4缓冲剂交换并使用30kDa MWCO

Concentrators

浓缩至>1mg mL^-1供后续研究。纯化抗体的浓度由其在280nm(UV₂₈₀)的UV吸光度以适当的消光系数测定。

Octet条件培养基筛选和分析

于Octet QK 384上以Ni-NTA生物传感器(PALL Life Sciences)进行含有mAb1变体的条件培养基筛选。于PBS、0.1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和0.01％Tween-20(Sigma)pH 7.4(PBST-BSA7.4)中以15μg mL^-1进行300秒捕捉His-标签抗原，接着以PBST-BSA pH7.4清洗20秒。以1：1经PBST-BSA pH 7.4稀释的条件培养基捕捉抗体200秒。在pH 6.0的缓冲液清洗步骤后，于pH 6.0，使用200nM rFcRn分别进行150和200秒的缔合和解离时间，得到FcRn结合动力学。在Octet筛选期间的所有步骤，以1000RPM的震荡速度，温度为30℃。校正rFcRn结合动力学图至FcRn缔合阶段启动时并使用Octet 7.1分析软件仿造1：1结合模型。

FcRn结合动力学

使用BiacoreTM T200仪器(GE Healthcare)使用生物素CAPture试剂盒(GEHealthcare)测量多个pH条件下(pH 6.0、7.4、8.0和9.0)的FcRn结合动力学(参见，例如，Abdiche et al.,MAbs(2015)7：331-43；Karlsson et al.,Anal.Biochem.(2016)502：53-63)。将CAPture试剂捕捉至CAP芯片达到表面密度>1500RU，接着FcRn于30μL min^-1进行一段变动的捕捉时间以考虑到较高pH值下的结合亲和力降低。各pH的FcRn浓度和捕捉时间为如下：pH 6.0：0.1μg mL^-1FcRn历时24秒，pH 7.4和8.0：1μg mL^-1历时60秒及pH 9.0：10μg mL^-1历时60秒。所有pH条件的操作缓冲液为20mM Bis-Tris丙烷；150mM NaCl，0.05％Tween-20，带有相应调整至pH 6.0、7.4、8.0和9.0的pH。一系列的各抗体变体的浓度从1000nM开始以三倍稀释所建立以涵盖广泛范围的结合亲和力。动力学测量分别进行180秒和360秒结合及解离时间，随后各循环以盐酸胍和氢氧化钠进行CAP表面的再生。以1000nM三重复得到在pH7.4、8.0和9.0的稳态RU测量值。将各pH的传感图使用Biacore T200TM评估软件与1：1或双价结合模型拟合。双价模型解释在高FcRn捕捉量及每个IgG中二个FcRn结合位点所观察到的亲留力(avidity)效应。参见，例如，Suzuki et al.,J Immunol.(2010)184：1968-76。独立地拟合各系列浓度，得到平均的缔合和解离速率以及结合亲和力。在解离相开始之前由稳态结合反应测定残余结合并平均。

FcRn亲和色谱

在一实验中，从Schlothauer et al.,mAbs(2013)5：576-86调整过的方法制造FcRn亲和柱。将1mL链霉亲和素HP

柱(GE Healthcare)以结合缓冲液(20mM磷酸钠(Sigma)pH 7.4、150mM氯化钠(NaCl；Sigma))以1mL min^-1平衡5个柱体积，接着注射4毫克的生物素化cynoFcRn。以结合缓冲液冲洗柱并储存于4℃直到使用。

将FcRn亲和柱以低pH缓冲液(20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES；Sigma)pH 5.5；150mM NaCl)平衡5个柱体积，接着注射300μg的各抗体。以低pH缓冲液调整抗体溶液的pH至pH 5.5。在以10个柱体积的低pH缓冲液冲洗后，通过线性pH梯度以高pH缓冲液(20mM 1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(bis tris丙烷；Sigma)pH 9.5；150mM NaCl)在30个柱体积内以1mL min^-1以1mL洗脱份及监测UV₂₈₀，洗脱抗体。以10个柱体积的低pH缓冲液将FcRn亲和柱再平衡作为后续操作，或以结合缓冲液供储存。所有变体以三重复进行。

各变体的FcRn亲和柱洗脱图使用方程式1以Sigmaplot 11(Systat Software,Inc.)制成单一高斯分布模型，用以测定在UV₂₈₀最大的洗脱体积：

其中x₀为在UV₂₈₀最大峰值的洗脱液体积，y₀为基线UV₂₈₀吸光度且a和b涉及半数最大分布的全宽度。各洗脱份的pH通过Corning Pinnacle 540pH测定计来测量并使用线性回归测定与洗脱液体积的相互关系。

在另外的实验中，FcRn亲和柱由上文Schlothauer et al.所修改，以生物素化hFcRn于1mL链霉亲和素HP

柱(GE Healthcare)上。于AKTA Pure System(AKTA)上，将柱注射300μg溶于低pH缓冲液(20mM 2-(N-吗福啉基)乙磺酸(MES；Sigma)pH 5.5；150mM NaCl)的各抗体。通过以低和高pH缓冲液(20mM 1,3-双(叁(羟甲基)甲基氨基)丙烷(bis tris丙烷；Sigma)pH 9.5；150mM NaCl)所制造的线性pH梯度以0.5mL min^-1于30个柱体积内洗脱抗体并监测吸光度和pH。将柱以低pH缓冲液再平衡供后续运作。所有的变体以三重复进行。将FcRn亲和柱洗脱液图以Sigmaplot 11(Systat Software,Inc.)与单一高斯分布拟合，用以测定最大UV₂₈₀时的洗脱液体积和pH。

差示扫描荧光法

差示扫描荧光法(DSF)实验于BioRad CFX96^TM实时系统热循环仪(BioRad)上以20μL反应来进行。将抗体样本和Sypro^TM橙色染料(Invitrogen^TM)的5000x储液以PBS pH 7.4分别稀释成0.4mg mL^-1及10x。将抗体和Sypro^TM橙色染料以1：1比率混合于96-孔PCR盘中并以黏胶剂

(BioRad)密封，终浓度为每种抗体0.2mg mL^-1和5x Sypro^TM橙色染料。所有的抗体变体为以三重复进行。热循环仪的程序由在20℃的2分钟平衡步骤，接着0.5℃/5秒的固定的温度升降率至100℃最终温度所组成。使用适合Sypro^TM橙色荧光的FAM激发波长(485nm)和ROX发射(625nm)检测器得到各孔槽的荧光测量值(参见，例如，Biggar et al.,Biotechniques(2012)53：231-38)。从BioRad CFX^TM Manager输出DSF荧光强度图和一阶导数(first derivative)并以Sigmaplot 11分析。T_m定义为荧光强度图的第一次转变的中点。

FcγRIIIa结合动力学

使用Biacore^TM T200仪器(GE Healthcare)测量结合动力学和亲和力(Zhou etal.,Biotechnol Bioeng.(2008)99：652-65)。将50μg mL^-1溶于乙酸盐pH 4.5的抗-HPC4抗体(Roche)，以10μl min^-1以胺化学与CM5传感芯片的表面结合600秒达到最终密度>20,000RU。FcγRIIIa结合亲动力学试验的电泳缓冲液含有0.05％表面活性剂P-20(HBS-P+,GEHealthcare)和2mM氯化钙(CaCl₂,Fluka)pH 7.4的HEPES缓冲食盐水。各动力学追踪以5μlmin^-1捕捉1.25μg mL^-1HPC4-标定的FcγRIIIa-V158启动进行30秒。测量各变体在300nM的缔合和解离动力学，就各变体就各个步骤以5μl min^-1进行120-180秒。在动力学测量完成后，以添加10mM EDTA

的HBS-P+缓冲液，让CM5芯片再生。在下个动力学测量之前，以含CaCl₂的HBS-P+冲洗芯片120秒。

在一实验中，以如pH 7.4的FcRn结合所述的类似方式，分析FcγRIIIa动力学实验。就WT、基准、先导单一和组合变体，得到从1000nM开始一系列3倍连续稀释的动力学，用以测定与FcγRIIIa的结合亲和力。测定各浓度和双重复的稳态RU，作为随抗体浓度的变化作图并与方程式2中所示的稳态模型拟合：

其中偏移是0nM抗体时的基线RU，R_max为高抗体浓度时的平稳RU，[抗体]为抗体浓度而K_D,app为变体和FcγRIIIa之间相互作用的表观结合亲和力。

在另外的实验中，以如pH 7.4的FcRn结合所述的类似方式，使用平均稳态结合反应分析FcγRIIIa动力学实验。对于所有的变体，以三重复测定300nM抗体的稳态RU并平均。测定相对于WT的反应变化的倍数变化(反应倍数变化)进行在各骨架中变体间的比较。

等电聚焦

使用毛细管电泳于Maurice C(Protein Simple)上测定先导变体的等电点(pI)。每200μL样本含有0.35％甲基纤维素(Protein Simple)、4％两性电解质(pharmalyte)3–10(GE Healthcare)、10mM精氨酸(Protein Simple)、0.2mg mL^-1抗体和4.05及9.99pI标记(Protein Simple)。将样本于1500V加载至毛细管中历时1min，接着于3000V进行相分离历时6min并使用色氨酸荧光监测。使用Maurice C软件测定各变体的pI并定义为主要物种最大荧光时的pH。

同质桥接类风湿因子(RF)ELISA

使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin和Mix-n-Stain^TM地高辛抗体标定试剂盒(Biotium)根据制造商的说明书将抗体生物素化及地高辛(digoxigen)标定。制备各变体的含有4μg mL^-1生物素化及地高辛标定抗体的储液并以1：1比率与300U/mL RF(Abcam)混合。在室温孵育20小时之后，将100μL的各抗体-RF混合物加到Streptawell^TM盘(Sigma-Aldrich)并于室温孵育2小时。将此盘以含有0.05％Tween-20的PBS pH 7.4清洗三次并将100μL的1：2000稀释比例的HRP-缀合抗-地高辛二级抗体(Abcam)加到各孔槽中。于室温培养2-小时之后，清洗各孔槽并于室温以100μL的TMB基质(Abcam)处理15分钟。以100μL的停止溶液(Abcam)停止反应并以450nm于

读盘器上测量吸光度。提供一不含抗体-RF混合物的孔作为空白背景扣除值并重复此实验三次。使用学生t-检验(student’s t-test)测定P-值。

实施例2：条件培养基中饱和点突变的Octet筛选

FcRn是类第I类MHCα-区和β2-微球蛋白(β2-m)亚基(图1A)的异质二聚体，常见于大部分的Fc受体。FcRn辨识有别于其他FcγR的抗体Fc重链的区域(参见，例如，Oganesyanet al.,J Biol Chem.(2014)289：7812-24；和Shields et al.,J Biol Chem.(2001)276：6591–604)。

为了鉴别出具有比WT抗体更缓慢FcRn解离速率的变体，设计生物膜层干涉技术(BLI)-为基础的分析以高通量方式来筛选条件培养基中的抗体变体(图2A)。此分析是使用数种基准变体来开发的，而所述变体相比于WT抗体，对于FcRn在pH 6.0时亲和力是提升的(AAA、LS和YTE)或降低的(H435A、H310A/H435Q)。NiNTA生物传感器捕捉his-标签抗原及，随后，各抗体变体在pH 7.4模拟条件培养基(图2A)。测量各变体对大鼠FcRn(rFcRn)在pH 6.0的结合动力学，大鼠FcRn具有慢～25倍从人类IgG1解离的解离速率且比人类FcRn(hFcRn)更适合Octet研究(图2B)。H435A(图2B，穿插一个单点的长虚线)和H310A/H435Q(图2B，穿插二个点的长虚线)变体显示极少至无FcRn结合动力学(亦参见，例如，Shields et al.,supra；Medesan et al.,JImmunol.(1997)158：2211-7；和Raghavan et al.,Biochemistry(1995)34(45)：14649-57)。AAA(图2B，短虚线)、LS(图2B，穿插一个单点的短虚线)和YTE(图2B，长虚线)变体相比于WT(图2B，实线)，全部皆展现较低的解离动力学，具有介于2-7.3倍降低的FcRn解离速率。此项验证Octet筛选适合以纷杂的rFcRn解离动力学来区分变体。

以IgG1抗体mAb1作为模型系统，用以制造饱和致突变库，筛选具有降低FcRn解离速率的突变体。以其对FcRn界面的接近或直接贡献为基准，选择11个mAb1的位置(图1A和1B)(参见，例如，Oganesyan et al.,supra；和Shields et al.,上文)。使用定点突变导入在这些位置的所有点突变并转染于Expi293细胞供表达。进行如上述的饱和库突变体的条件培养基筛选。一变体亚组的归一化FcRn结合Octet传感图如图2C(长虚线)所示，野生型(图2C，粗长虚线)和空白-阴性对照组(图2C，点虚线)。空白组显示缺乏可观察的FcRn结合。数种突变体明确扰乱rFcRn的结合，因在动力学图形中观察到极少至无信号变化(图2C,长虚线，位于点虚线(空白组)下方)。具有提升的FcRn解离速率的变体的截断值为定义为低于WT抗体平均的三个标准偏差。在图2C中显示的突变亚组中相比于野生型抗体(图2C，粗长虚线)，二种(图2C，实线)具有明显降低的解离速率，而其余的变体具有类似的(图2C，插入一单点的短虚线)或更快速的(图2C，点虚线(空白组)上方的长虚线)rFcRn解离速率。

所有单点突变的rFcRn解离速率如图2D和图14以位置和突变显示。在图14中，依照相比于野生型的rFcRn解离速率的倍数变化，数据分类为四类中之一类，且野生型物种系以黑色方形指出。

在图14中，在饱和库的11个位置，就所有可能的取代，rFcRn解离速率的倍数变化为归一化至WT抗体的平均并以颜色编码。所有的突变体落在四类中的其中一类：极少至无结合(深灰色)，较快速rFcRn解离(灰色)，类WT的rFcRn解离速率(水平线)和较慢的rFcRn解离速率(网格)。多种变体具有比WT抗体(网格)更低的rFcRn解离速率。

图14中颜色为深灰色的突变体以类似空白组(图2C，点虚线)的方式显示对rFcRn极少至无结合，并局限在M252、I253和S254环。仅在I253的突变为甲硫氨酸和缬氨酸，且二者显著增加的rFcRn解离速率进一步支持I253对FcRn相互作用的重要性。另外120个变体(图2D和图14，淡灰色长方形)与rFcRn的相互作用不稳定，其中大约50％位于各C_H2和C_H3区。25个变体具有类WT的解离速率(图2D和图14，白色长方形)，其中11个位置中有8个具有至少一个类WT突变(图14，白色长方形)。相比于野生型，下列突变具有显著降低的rFcRn解离速率(图2D和图14，黑色长方形)：M252Y、T256D/E、K288D/N、T307A/E/F/M/Q/W、E380C、N434F/P/Y和Y436H/N/W。M252Y、N434F和N434Y比WT抗体具有大二倍的解离速率(图2D)。这些突变为经表达并以蛋白A色谱纯化供进一步体外FcRn动力学定性。

实施例3：在pH 6.0的Biacore^TM FcRn结合动力学

AAA、LS和YTE变体作为人类和大鼠FcRn在pH 6.0使用Biacore^TM的FcRn结合动力学测量中的阳性对照。就所有的变体，包括野生型、基准(图3)及先导(图4A和4B)，观察到浓度依赖性的FcRn结合，且单一注射人类和大鼠FcRn的结合图形分别如图5A和5B中所示。野生型抗体分别具有2380±470nM和207±43nM亲和力的对人类和大鼠FcRn的结合亲和力(表1)。

表1：体外mAb1的纯化先导抗体的特性参数

所有表1所显示的数据是使用显示在各栏上方的实验技术所取得的。

通过Octet使用纯化的蛋白测量rFcRn解离速率，作为从条件培养基筛选中所得到的动力学常数的比较。通过FcRn亲和色谱以三重复(n＝3)和DSF探测热安定性以三重复(n＝3)，测定洗脱液pH。从Biacore^TM以一系列的抗体浓度以双重复(n＝2)和独立拟合，得到对人类和大鼠FcRn的FcRn结合动力学。以1000nM抗体以三重复(n＝3)使用Biacore^TM测量各变体对人类和大鼠FcRn在pH 7.4的稳态结合反应。各测量值的单位如下：Octet pH 6.0rFcRn解离速率(x10^-3 s^-1)；洗脱液pH(无单位)；DSF T_m(℃)；Biacore^TM pH 6.0hFcRn缔合速率(x10⁴ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-1 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；Biacore^TM pH 6.0rFcRn缔合速率(x10⁴ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-3 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；和Biacore^TM pH 7.4稳态结合反应(RU)。

在图5B中，AAA(点虚线)、LS(穿插二个点的虚线)和YTE(穿插一单点的虚线)变体相比于WT具有介于1.6至10.4倍的提升的结合亲和力。具有最紧密FcRn亲和力的基准变体的特性是物种特异性的，如LS具有对hFcRn最紧密的亲和力，而rFcRn对YTE具有较紧密的亲和力(表2A)。

表2A：体外mAb1的纯化的双重组合抗体的特性参数

绝大多数的先导变体对人类和大鼠FcRn(图5A和5B，各种阴影实线)比WT或基准变体具有明显较慢的缔合速率(>2倍)(表1)。N434F和N434Y突变是对二种FcRn展现提升缔合速率的仅有的变体。不受限于理论，因为较慢的hFcRn结合动力学，先导变体的表观结合亲和力通常比WT更弱，与rFcRn不同(图5C和5D，表1)。对rFcRn的亲和力比YTE弱(图5D，对角线面对左下方，表2A)。

不受限于理论，这些结果指出，单一突变并不足以提升亲和力超越LS和YTE变体。FcRn解离速率的排名(由于变体对hFcRn结合亲和力弱)显露对人类和大鼠FcRn具有降低解离速率的亚组：M252Y、N434F/P/Y、T256D/E和T307A/E/F/Q/W(表2A)。这些变体组合上更有利，得以进一步提升Fc区的FcRn结合能力，超越基准变体。

体外先导变体的特性参数如表2B所示。

表2B：体外先导变体的特性参数

在表2B中，所有的数据是使用在各栏上方的实验技术所取得的。FcRn亲和色谱、DSF和FcγRIIIa结合以三重复进行(n＝3)。对人类和大鼠FcRn的FcRn结合动力学以四重复取得并独立拟合。单位：DSF T_m(℃)；FcγRIIIa结合(相对于WT的倍数变化)，Biacore^TM pH6.0hFcRn缔合速率(x10⁴ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-1 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；Biacore^TM pH6.0rFcRn K_D,app(x10⁹M)；Biacore^TM pH 7.4hFcRn和rFcRn稳态RU(RU)。

实施例4：组合变体进一步降低FcRn结合解离速率

多个先导突变位于单一位置(图14，黑色长方形)，例如T307和N434，其中分别鉴别出六个和三个显现较慢FcRn解离动力学的突变。仅使用在这些位置中对hFcRn具有最慢FcRn解离速率的突变来制造组合变体。在本案例中，使用混合引子PCR和定点突变将T307Q、T307W、N434F和N434Y与M252Y、T256D和T256E混合，得到双重、三重和四重变体。总计，组合库由54个变体所组成，包括7个先导单一变体、18个双重变体，20个三重变体，8个四重变体和WT抗体。这些变体的命名如下：野生型背景含有M252、T256、T307和N434并再标记为MTTN。因此，三重变体YTQY含有M252Y、T307Q和N434Y突变，而在位置256维持WT苏氨酸。

对于单一突变，使用Biacore^TM在pH 6.0的FcRn结合动力学来测定哪些组合变体具有提升的亲和力。各单一(穿插二个点的长虚线)、双重(穿插一个单点的长虚线)、三重(长虚线)和四重(短虚线)的代表性的FcRn结合动力学踪迹相比于WT(点虚线)和对于其个别物种的FcRn具有最紧密亲和力的基准变体(hFcRn：LS(穿插二个点的长虚线)；rFcRn：YTE(实线))，如图6A和6B所示。hFcRn缔合和解离速率(图6C)显露，2个单一变体，15个双重变体，18个三重变体和8个四重变体比起LS变体(图6C,点虚线)具有提升的结合亲和力。同样地，所有的组合，但有一个三重变体除外，对于rFcRn比YTE具更紧密地结合(图6D，对角线面对左下方)。对于hFcRn的情况，额外的提升FcRn的突变进一步增加结合亲和力(图6C)。5种对hFcRn具有最紧密亲和力的组合均为四重变体(图6C，方格)，其中结合亲和力大约比野生型大500倍。rFcRn并未发生类似的现象(图6D)，因为具有最高亲和力的变体为双重变体(图6D，水平线)。三重(图6D，垂直线)和四重(图6D，方格)变体典型地解离速率仅显示些微增加(低于2倍)，但亦展现降低的解离速率(图6D)。不受限于任何理论，这些结果显示，有关FcRn表观结合亲和力(大约0.5nM)可能存有较低限制，rFcRn已达到，但hFcRn则无(图6B)。总计，超过40种组合变体具有比基准变体更紧密的亲和力且须要进一步定性用以选择对体内研究具有有利性质的组合。

实施例5：在生理pH时组合变体保持明显的结合

因在pH 6.0时FcRn亲和力显著提升，因此使用pH 7.4时FcRn亲和色谱和Biacore^TM稳态测量，研究pH依赖性的效应。FcRn亲和色谱使用一线性pH梯度直接测量突变的pH依赖性的扰动。H435A和H310A/H435Q，具有弱FcRn结合的变体，不会与柱结合，与pH无关(图8A)。WT洗脱在接近生理pH(pH 7.37±0.05)，而AAA、LS和YTE需要较高的pH(表2B)。所有的组合变体和7种先导变体，从亲和柱洗脱需要比WT更高的pH(图8A和8C)。N434F/Y变体在比LS更高的pH洗脱(表2B)，不希望受限于科学理论，其显示这些变体，单独或组合，扰乱了pH依赖性。代表性色谱图显示随着突变数目变化清楚的转换到较高的洗脱pH(图9A和9B)。洗脱pH和hFcRn解离速率间的强烈相关性(图9C)指出，在pH 6.0时较慢的FcRn解离速率直接造成FcRn变体的洗脱pH增加。

使用Biacore^TM于pH 7.4进行FcRn结合动力学实验，用以测量在生理条件下残余的结合活性。使用稳态RU作为残余FcRn结合亲和力的测量，因在此pH时，某些变体显示不可靠的动力学和极少至无结合。单一(穿插二个点的长虚线)、双重(穿插一个单点的长虚线)、三重(长虚线)和四重(短虚线)变体的代表性动力学踪迹相比于LS(图7A，实线)和YTE(图7B，实线)如图图7A和7B所示。这二种变体分别展现在pH 7.4与人类和大鼠FcRn最大的残余结合。大多数的先导单一变体相比于WT(4.3±1.0RU)具有些微升高的FcRn结合，但低于AAA(13.1±1.7RU)、LS(18.5±2.6RU)和YTE(13.1±1.6RU)，但N434F/Y突变除外(表2A和2B)。组合变体在pH 7.4对于二物种的FcRn亦具有明显的残余结合(图7A和7B)，甚至达到大于N434F/Y的程度。不受限于任何理论，用于活体研究的理想的候选者在低pH具有增加的FcRn结合的变体(例如AAA、LS和YTE变体)，但在升高的pH时仍维持低量结合，以类似WT的方式。在一显示在图7C和7D的图中，这些组合应占据左下象限，其为以LS和YTE变体在各pH分别对人类和大鼠FcRn的亲和力所选定。

实施例6：FcRn亲和色谱

组合变体在pH 6.0表观结合亲和力和pH 7.4稳态RU(图7C和7D)之间展现中等正相关(hFcRn：R²＝0.69,rFcRn：R²＝0.71)。不受限于任何理论，这些结果指出，在pH 6.0明显较高的亲和力典型地转化在pH 7.4较大的残余FcRn结合。这些变体能在血液中保持与FcRn结合且具有短的血清半衰期和/或提升其清除率，与高FcRn亲和力Abdeg突变相类似(YTEKF；参见，例如，Swiercz et al.,J Nucl Med.(2014)55：1204-7；和Vaccaro et al.,Nat Biotechnol.(2005)23：1283-8)。因为IgG-FcRn相互作用是pH-依赖性的且仅在低pH(<pH 6.5)发生，所以饱和突变可能经由亲水或电荷衍生的贡献强化此相互作用，其可能扰乱重要的组氨酸残基的去保护作用(图1B，如所指)及弱化在生理pH的相互作用。结果是，FcRn-结合相互作用因此在环境pH下变成较低敏感性。

FcRn亲和色谱使用线性pH梯度直接测量FcRn相互作用pH依赖性的扰动(参见，例如，Schlothauer et al.,上文)。AAA、LS、YTE、H435A和H310A/H435Q变体的FcRn亲和色谱显露H435A (图8A，灰色实线)和H310A/H435Q(图8A，AQ，深灰色实线)不会与FcRn结合，即使在pH 5.5并洗脱流出。野生型抗体在接近生理pH(pH 7.37±0.05)洗脱出，而AAA、LS和YTE，其通过Octet(图2B-D)和Biacore^TM(图3)具有比野生型更慢的解离速率和更紧密的FcRn结合亲和力，需要相当高的pH从柱解离(AAA：7.94±0.06；LS：8.29±0.03；YTE：8.14±0.03)。洗脱图显示所有组合库中的变体需要比野生型更高的pH从亲和柱洗脱出。就单一(穿插二个点的长虚线)、双重(穿插一个单点的长虚线)、三重(长虚线)和四重(短虚线)变体于平均洗脱pH的代表性色谱图为如图9A所示。七种先导单一变体(M252Y、T256D、T256E、T307Q、T307W、N434F和N434Y)相比于WT，需要较高的pH从柱解离(图10A，表3)，而所述对hFcRn具有类野生型动力学的变体(K288D/N，Y436H/H/W)全部皆在类似野生型的pH洗脱出。

表3：先导抗体变体的体外特性参数

所有的数据是使用在各栏上方的实验技术所取得的。洗脱pH通过FcRn亲和色谱以三重复(n＝3)和DSF探索的热安定性以三重复(n＝3)所测定。对人类和大鼠FcRn的FcRn结合动力学由Biacore^TM以一系列的抗体浓度所获得(n＝4)并独立拟合。各测量单位如下：洗脱pH(无单位)；DSF T_m(℃)；Biacore^TM pH 6.0hFcRn缔合速率(x10⁴ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-1 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；Biacore^TM pH 6.0rFcRn缔合速率(x10⁴ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-3 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)。

N434F/Y变体二者在比LS变体更大pH的洗脱出(N434F：8.30±0.05；N434Y：8.46±0.02)并显示在pH 7.4相当大的FcRn结合(表4)。这些结果显示，这些变体单独可能扰乱pH依赖性性。一般而言，平均洗脱pH随着增进FcRn结合突变的数目增加而增加(图9B)。相比于hFcRn解离速率，显现与洗脱pH强烈相关性(R²＝0.94)(图9C)；不受限于任何理论，其显示：扰乱相互作用的pH依赖性性直接造成组合库在pH 6.0所观察到的较慢FcRn解离速率。

实施例7：热安定性

大部分的蛋白，包括抗体，带有低热力学安定性具有增加的错误折叠和聚集的倾向且可能限制或阻碍其作为治疗剂的活性、功效和可能性。使用DSF测定各变体的热安定性及提报的熔化温度(T_m)为定义为Sypro^TM橙色荧光强度图的第一跃迁区段的中点。相比于具有69.0±0.2℃的T_m的WT，LS变体为类WT(68.5±0.3℃)而AAA和YTE则为热安定性下降约～8℃(AAA：61.3±0.6℃；YTE：61.2±0.3℃)(图8B、9B和10B；及表2B、3和4)。相比于具有69.0±0.2℃的T_m的WT和LS，AAA和YTE变体具有较低的热安定性，就DSF下降～8℃。

表4：体外基准和先导抗体的特性参数

在导入到野生型骨架的突变下面划线标示。所有的数据是使用显示在各栏上方的实验技术所取得的。洗脱pH和T_m为以三重复(n＝3)所测定。对人类和大鼠FcRn在pH 6.0的FcRn结合动力学由Biacore^TM(n＝4)所取得并独立拟合。pH 7.4的稳态FcRn结合反应使用Biacore^TM以单一抗体浓度以三重复所测。FcγRIIIa结合亲和力从一系列的抗体浓度以双重复使用Biacore^TM所测。用于各测量的单位如下：洗脱pH(无单位)；DSF Tm(℃)；Biacore^TMpH6.0hFcRn缔合速率(x10⁵ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-2 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；Biacore^TM pH6.0rFcRn缔合速率(x10⁵ M^-1s^-1)，解离速率(x10^-3 s^-1)和K_D,app(x10⁹ M)；Biacore^TM pH 7.4稳态结合反应(RU)和FcγRIIIa K_D,app(x10⁹ M)。

相比于野生型，18种先导饱和变体中有12种(变体E380C、M252Y、T256D、T256E、K288N、K288D、N434P、T307A、T307W、Y436H、Y436N、Y436W)具有降低的T_m，及数种T307突变体(T307E/F/M/Q)显示些微安定性(表4)。七种用于组合的单一变体(图10B和表4)，相对于YTE(图8B和表5)皆无明显的不稳定。相比于单一突变(图9D，白色圆圈)，于Fc区加入双重(图9D，水平线)、三重(图9D，垂直线)和四重(图9D，方格)突变导致整体热安定性进步下降。多重变体展现低于AAA或YTE(61.2±0.3℃)的T_m，大于这些含T307W变体的60％(>60％)。四重变体(图9D，方格)显示不同的熔化温度的双峰分布，其中含有T307Q的组合比带有T307W的组合具有大约高6℃的热安定性(图9D)。

实施例8：Fc变体改变了与FcγRIIIa的结合相互作用

除了与FcRn相互作用之外，Fc区绞链和C_H2区亦负责与其他的Fc受体相互作用，包括FcγRIIIa。因用于构建组合饱和库的7种单一变体中有5种系位于C_H2区内，与这些受体相互作用的能力，相对于野生型可能折衷，尽管其位置远离相互作用界面。使用Biacore^TM，测量以类似在pH 7.4的FcRn结合方式的FcγRIIIa结合显现：相比于野生型(图11A，黑色)，YTE(图11A，深灰色)变体显示结合反应大约降低50％。不受限于任何理论，YTE的下降的FcγRIIIa结合为M252Y突变的结果(图11B，最下方白色圆圈)，因为此变体单独具有对于此受体显著的下降亲和力。其他的单一突变并未同享此下降的亲和力(图11B，白色圆圈)而单独的N434F/Y变体提升了结合16-40％。这些效应转移到大部分，但并非全部，其对应的组合。例如，含M252Y的组合在FcγRIIIa结合上具有介于17至72％下降(表5)。

表5：条件培养基中的饱和库变体的浓度

一变体，MDQF(图11B，三重变体类别中最高者)，在FcγRIIIa结合上显示急遽140％增加。因此，此组合饱和库提供变体广泛范围的Fc受体功能性，其能发挥重要功用，量身打造具有特定效应子功能的治疗性抗体。

图11C显示7种先导单一变体相比于WT和YTE变体的FcγRIIIa结合反应的箱形图。

实施例9：7种先导组合平衡FcRn相互作用的pH-依赖性性

不受限于理论，用于进一步体内研究的候选变体占据图7C和7D所示的图式的左下象限。有7种变体满足这些用于hFcRn的标准并包括5种双重和2种三重组合(MDQN、MDWN、YDTN、YETN、YTWN、YDQN和YEQN)，且不含有在N434位置的突变(表3)。各个这些组合在介于AAA(pH7.94±0.06)和LS(pH 8.29±0.03)之间从FcRn亲和柱洗脱出，其中YDQN在8.51±0.14的最高pH洗脱出(图12A，表5)，其表示仅些微扰乱pH依赖性性及在pH 7.4时较大的残余结合(表2A)。其中一种变体(MDQN)具有类似野生型的热安定性，而有6种相比于YTE变体具有类似或下降的T_m(图12B，表4)。在一FcγRIIIa结合分析中，5种组合变体显示类似YTE的下降(表4)。以单一突变的进一步研究显露M252Y显著影响FcγRIIIa结合及，不受限于理论，此影响为转向带有这些突变的组合。其余的6种单一突变为类WT或对此受体具有些微提升的结合。

选择三个变体进行以其FcRn结合性质、热安定性和FcγRIIIa结合为基准的进一步研究。DQ(T256D/T307Q)、DW(T256D/T307W)和YD(M252Y/T256D)各自提供了如LS变体(图12E)的最佳FcRn结合性质(表2B)。各变体提供多样范围的热安定性和提供一范围功能性的FcγRIIIa结合性质(图12F和12G，表2B)。图12H为同构型桥联RF的图。

就人类和大鼠FcRn在pH 6.0的表观结合亲和力分别相比于LS(图13A，粗长虚线)和YTE变体(图13B，粗长虚线)的提升为介于缔合和解离速率之间的折衷(图13A和13B，表4)。典型地，具有较快解离速率的组合亦具有较快缔合速率，反的亦然。此观察结果在人类和大鼠FcRn间亦持续(表4)。再者，所有的这些变体具有比pH 7.4时LS变体(图13C，粗长虚线)对hFcRn更低的稳态反应。这些结果与rFcRn并不相符，因为5种含M252Y的变体YDTN、YETN、YTWN、YDQN和YEQN相比于YTE，在pH 7.4为具有升高的FcRn结合(表5)。MDQN和MDWN变体在人类和大鼠FcRn之间具交叉反应的仅有组合。再者，这二种变体不会扰乱与FcγRIIIa的相互作用达到类似含M252Y的变体的程度(图12C和12D及表5；MDQN：600±4nM；MDWN：512±30nM；WT：467±99nM)。因此，在关键FcRn相互作用位置的饱和及组合致突变得以鉴别出平衡相互作用的pH依赖性的先导变体，维持与Fc受体功能性，能提升体内FcRn功能性及能延长治疗抗体的血清半衰期。

实施例10：先导组合变体的类风湿因子结合特性

研究先导变体的等电点和RF结合，因为这些突变可能改变抗体表面电荷和致免疫力。越酸性的抗体已被认为延长抗体药物动力学。相比于WT和LS对照组，全部三种先导变体，因T256D取代的结果，造成pI有～0.2pH单位的下降。由于重叠的交互作用表面，提升FcRn的突变可能同时改变与宿主抗体的结合，例如类风湿因子(RF)。同构型桥接ELISA经调整以适用测量先导变体的RF结合中的电荷。有趣地，在RF结合中相比于WT，LS和YTE显示完全相反的变动(图12H)。LS明显增加RF结合，而YTE则显示明显下降(p<0.001)。YD(p<0.001)及DW(p<0.01)亦明显降低RF结合，而DQ产生类似WT的反应。不受限于任何理论，这些结果表明DQ、DW和YD可提供与LS相比的免疫原性优势。YD、DW和DQ变体代表一系列关键抗体特征，所述特征可以与相对于基准YTE和LS变体改善的FcRn结合特性结合使用。

实施例11：先导组合变体可转移至其他抗体

使用CM5传感芯片开发新的结合分析，如图15A所示。此结合分析包括将链霉亲和素固定化在传感芯片上的步骤，用以捕捉生物素化FcRn至约30RU，若需要则添补。于pH 6.0和7.4测量抗体结合动力学并于pH 8.5进行再生。图15B和15C分别显示使用新的结合分析的FcRn的直接固定化和生物素化FcRn的链霉亲和素捕捉。

MAb2在pH 6.0的FcRn结合：对于小鼠FcRn，先导mAb2变体展现比LS变体(虚线)和野生型(黑色)更慢的解离速率(图16A)。对于人类FcRn，先导变体全部皆具有较快的缔合速率，但解离速率与LS(虚线)相类似(图16B)。

MAb2在pH 7.4的FcRn结合：相比于LS(虚线)，所有先导变体在pH 7.4显示降低的人类FcRn结合(图17A)。对于mAb1mAb1`背景，DW(MDWN)和DQ(MDQN)变体亦显示在pH 7.4对小鼠(大鼠)FcRn较低的残余结合(图17B)。

相比于LS，先导变体在pH 6.0维持较高的结合亲和力及在pH7.4较低的残余结合(图18)。重要地，发现变体在不同的IgG1背景之间是可转移的，对FcRn结合影响极小。如图19中所示，LS具有类似的洗脱pH，与背景无关。WT、DQ和DW在mAb2背景中显现比在mAb1背景中更高的洗脱pH，可能为因在pH 6.0在mAb2背景中结合较紧密。

MAb2背景变体全部皆显示热安定性些微增加，如图20所示。

如图21中所示，与MAb1背景相类似，YD(YDTN)显示FcγRIIIa结合反应(左)和亲和力(右)下降。DQ(淡灰色)和DW(深灰色)显示FcγRIIIa结合性质与MAb2背景中的WT(黑色)相类似。LS对FcγRIIIa结合的效应在MAb1和mAb2之间是一致的。

因此相比于在MAb1背景中的相同先导变体，在mAb2背景中的先导变体不会显著影响FcRn结合、pH依赖性性、热安定性或FcγRIIIa结合。

在一实施方案中，将DQ(T256D/T307Q)、DW(T256D/T307W)和YD(M252Y/T256D)变体并入另一IgG1抗体和重组Fc片段：mAb2辨识出来自mAb1的不同抗原，及mAb3为Fc片段。在各情况下，除了洗脱pH、热安定性和FcγRIIIa结合亲和力之外(表2B和表6)，pH-依赖性的FcRn结合动力学(图22)为高度相似的。不受限于任何理论，这些结果指出，DQ、DW和YD变体赋予由Fc区所组成的蛋白其提升的FcRn结合性质。

表6：条件培养基中饱和库变体的浓度

实施例12：先导变体延长体内血浆抗体消除半衰期

以食蟹猴和hFcRn转基因小鼠(品系Tg32)，就DQ、DW和YD变体对抗体循环半衰期的效应，与WT和LS对照组相比较，检测其药物动力学(PK)(参见，例如，Avery et al.Mabs(2016)8：1064-78)。食蟹猴FcRn的FcRn结合研究揭露了对hFcRn类似的结合亲和力(图23A-23B；表6)。各动物为以静脉内注射WT、LS、DQ、DW或YD变体，经由质谱法测定食蟹猴(图24A)和hFcRn转基因小鼠(图24B)中的清除率和血清半衰期，定量抗体浓度。从抗体浓度作为时间函数的非室模型得到清除率和血清半衰期。在食蟹猴和小鼠中相比于WT，全部三种先导变体和LS显示清除率显著下降(p<0.001)。就食蟹猴和小鼠，WT抗体的血浆半衰期分别为9.9±0.5和11.7天。再者，在二种物种中相比于野生型，LS基准和确定的变体展现显著增加的消除半衰期(在食蟹猴和小鼠中分别增加2.5-和1.7倍)(表7)。相比于LS基准，DQ、DW和YD显示类似的半衰期延长(表7)。经由饱和致突变文中确定的DQ、DW和YD突变比其WT对手，在小鼠和非人类灵长类动物模型中展现显著的延长血浆半衰期。

表7：基准和先导变体的清除率和血清半衰期

在表7中，使用mAb2测定清除率和血浆半衰期。各清除率和血浆半衰期为n＝3食蟹猴的平均及来自n＝6hFcRn转基因小鼠的汇总的单一评估。对比WT的倍数和对比LS的倍数显示分别与WT和LS相比较的相对的清血浆半衰期提升。*n＝2是由于ADA形成，**n＝2是由于部分皮下给药路径。

实施例13：在pH 6.0和pH 7.4具有提升的FcRn结合的组合变体

以如实施例2中所述的Octet筛选(以BLI-为基础的筛选)为基础，产生各种单一、双重、三重和四重变体并评估其在pH 6.0和pH 7.4与FcRn的结合(表8；经取代的残基在下面划线)。

表8：变体的结合亲和力(pH 6.0)和稳态结合(pH 7.4)

在表8中，显示各种单一、双重、三重和四重突变体，以及基准变体(AAA、LS、YTE)在pH 6.0对FcRn的结合亲和力及在pH 7.4与FcRn的稳态结合。

这些数值作图于图25中。图25显示在pH 6.0的结合亲和力和在pH 7.4的RU的比较。如所示，基准变体LS在受试的基准变体(AAA、LS、YTE)中具有在pH 6.0最紧密的结合亲和力及在pH 7.4最大的残余结合。

已确定数种如图25所示的组合变体展现在pH 6.0和pH 7.4提升的FcRn结合亲和力。为了探究任何组合变体在pH 6.0和pH 7.4是否显现比MST-HN变体(文中称在Met252、Ser254、Thr256、His433和Asn434至Tyr252、Thr254、Glu256、Lys433和Phe434含“YTEKF基准”的突变)更紧密的结合，进行下列方法。经由生物素CAPture法进行捕捉生物素化的人类和食蟹猴FcRn(参见图26的图解)。就pH 6.0，以双重复进行从1000nM开始的一系列浓度(5pts)。就pH 7.4和8.0，除了以双重复进行从1000nM开始的一系列浓度之外，为以三重复进行单一浓度(1000nM)注射。以FcRn捕捉量进行pH 7.4和8.0实验，其相比于pH 6.0在此pH所观察到的结合增加10倍。就pH 9.0，以三重复进行单一浓度(1000nM)注射。pH 9.0实验以FcRn捕捉量进行，其相比于pH 6.0在此pH所观察到的结合增加100倍。pH 6.0，以双重复进行从1000nM开始之一系列浓度(5pts)。就pH 7.4，以三重复进行单一浓度(1000nM)注射(在此pH所观察到的各FcRn的捕捉量增加10倍)。结合：180秒；解离：300秒。

在pH 6.0(人类：图27A，食蟹猴：图27B)、pH 7.4(人类：图27C，食蟹猴：图27D)和pH8.0(人类：图27E，食蟹猴：图27F)野生型、YTEKF基准和10种FcRn拮抗剂组合变体的人类和食蟹猴FcRn结合动力学传感图如图27A-G所示。所有受检测的变体相比于WT在pH 6.0显示对人类和食蟹猴FcRn高二个数量级的较紧密亲和力及在较高pH可观察的动力学。受检测的变体为6个四重(YDQF、YDQY、YDWF、YDWY、YEQY和YEWY)、3个三重(MDWY、YDTY、YTWY)和1个双重(YY)组合，由于其提升对FcRn的亲和力(表8)。因为对人类和大鼠FcRn亲和力较弱，并未选择另外二个四重变体YEQF和YEWF(图27G)。

图28A-H和29A-H显示相比于YTEKF基准(点虚线)和WT(虚线)，10种FcRn拮抗剂变体(黑色实线)的人类和食蟹猴FcRn结合动力学。在图28A和29A中，10种变体中有8种展现比YTEKF基准更慢的解离速率且具有类似在pH 6.0对人类和食蟹猴FcRn的缔合速率(表9和10)。所有的变体在pH 7.4和pH 8.0展现对人类(图28B和28D)和食蟹猴(图29C和29D)FcRn显著的FcRn结合(表9和10)。5种四重变体YDQF、YDQY、YDWY、YEQY和YEWY显示比YTEKF基准更高的结合信号，在该pH亲和力提升的指标。pH 7.4(图28C和29C)及pH 8.0(图28E和29E)分别对人类和食蟹猴FcRn的归一化传感图，显示这5种变体展现在这些pH显著FcRn结合，具有比YTEKF基准更慢的解离速率。在图28F和29F中，pH 9.0降低了人类和食蟹猴FcRn结合，达到类似WT和YTEKF变体的程度。图28G和29G显示相比于YTEKF基准(开放方形)和WT(黑色，仅pH 6.0)，在这三个pH(pH 6.0黑色；pH 7.4深灰色；pH 8.0灰色)对人类(图28G)和食蟹猴(图29G)FcRn结合的等亲和力图式。YTEKF基准和先导组合变体比WT在pH 6.0具有大2-3个数量及的人类和食蟹猴FcRn结合亲和力。当pH增加，FcRn结合亲和力减少且基准和组合变体在所有受试的pH展现类似的亲和力。3种变体YDQY、YDWY和YEWY在所有的pH展现对人类和食蟹猴FcRn较大的结合(表9和10)。比较随pH变化的人类(图28H)和食蟹猴(图29H)FcRn的FcRn结合亲和力显示：就所有受检测的组合变体，每个pH单位FcRn亲和力下降10倍。

在图33和34中，显示所选的组合变体、YTEK基准和WT对人类(图33)和食蟹猴(图34)FcRn在pH 6.0、7.4、8.0和9.0的缔合速率、解离速率、结合亲和力和稳态结合。在pH 6.0无稳态结合量报告，因为所有的变体在此pH具有可测量的结合动力学(缔合速率、解离速率和结合亲和力)。由于全部的变体在pH 9.0时FcRn结合亲和力明显下降，因此仅显示稳态结合量作为在此pH的残余结合的测量。插入的突变在WT序列中为加粗黑字体和加下划线(MTTN：M252/T256/T307/N434)。例如：MDWY含有T256D/T307W/N434Y突变及位置252的WT残基。

测定FcRn拮抗剂变体、YETK基准和WT的其他特性参数，例如，与FcγRIIIa结合、热安定性和洗脱pH并显示于表9中。插入的突变在WT序列中为加粗黑字体和加下划线(MTTN：M252/T256/T307/N434)。例如：MDWY含有T256D/T307W/N434Y突变及位置252的WT残基。

表9：体外Fc变体的特性参数

如表9中所示相比于WT，所有的FcRn拮抗剂在明显较高的pH从FcRn柱洗脱时是热不稳定的。相比于WT，FcγRIIIa结合为高可变性具有类似或降低的稳态结合。插入的突变在WT序列中为加粗黑字体和加下划线(MTTN：M252/T256/T307/N434)。例如：MDWY含有T256D/T307W/N434Y突变及位置252的WT残基。

实施例14：FcRn拮抗剂提升IgG降解

将FcRn拮抗剂与人类IgG共施用，用以测定IgG消耗。实验为使用人类FcRn同型合子转基因小鼠(Tg32；例如，Jackson Laboratory stock#014565，M01基因型)来进行，其能缩放用以预测人类动力学。

以Tg32小鼠测定FcRn拮抗剂(例如，图33和34中所描述的任何的四重变体；例如，YDQY、YEWY、YEQY、YDQF和YDWY)对血清IgG量的效应。通过静脉内团注施用Tg32小鼠5mg/kg的非靶标人类IgG1。6小时后，施用小鼠包括FcRn拮抗剂人类IgG1(例如，如图33和34所描述；例如，YDQY、YEWY、YEQY、YDQF和YDWY)或包括FcRn拮抗剂的靶标抗体(例如，如图33和34所描述；例如，YDQY、YEWY、YEQY、YDQF和YDWY)或媒剂对照组。根据表10中所述的给剂时程施用动物。

表10：给剂时程

*假设小鼠体重为25g估算总蛋白

生物措施包括各FcRn拮抗剂IgG1(Antag；人类IgG1和包括四重变体的靶标抗体)，非靶标人类IgG1(hIgG)，内生性小鼠IgG(murIgG)和小鼠血清白蛋白(murAlb)

根据表11中所述的抽血时程表采集血液样本。通过定量的LC-MS/MS和ELISA法测定各FcRn拮抗剂IgG1(FcRn-A；人类IgG1和包括四重变体的靶标抗体)、非靶标人类IgG1(hIgG)、内生性小鼠IgG(murIgG)和小鼠血清白蛋白(murAlb)的量。

表11：采血时程表

*小鼠标示符数值；μl抽血为非终末；CP＝终末心脏穿刺

实施例15：FcRn拮抗剂提升IgG降解

本实施例描述显示示例性的FcRn拮抗剂提升共施用IgG清除率的研究。在本研究中，将mAb1 YDQY(hIgG1变体)与野生型mAb1施用hFcRn同型合子转基因小鼠(Tg32；JacksonLaboratory stock#014565，M01基因型)，其能缩放用以预测人类动力学。作为研究的部分，取得YDQY hIgG1和WT hIgG1的PK测量。白蛋白的测量应进一步确认FcRn抑制不会干扰白蛋白结合位点。

更特言之，将5mg/kg的WT hIgG1(“示踪剂IgG”)通过静脉内团注给予Tg32小鼠。6小时后，根据表12中所述的给剂时程将YTEKF hIgG1(ABDEG^TM)或YDQY hIgG1施用小鼠。所有的剂量为以10mL/kg的给剂量施用。

表12：给剂时程和PK测量

数据显示三种20mg/kg的YDQY hIgG1剂量(在6、24和48hrs)显著降低示踪剂WThIgG1浓度(第6组；图30A和30B；表13)并产生优于YTEKF hIgG1的显著改善结果。单一剂量的YDQY hIgG1或YTEKF hIgG1似乎不会造成示踪剂WT IgG大幅降低(图30C；表13)。

表13：WT hIgG清除

在Tg32小鼠中，YDQY hIgG1的清除(约2.6mL/h/kg)比典型的IgG(～0.1-1.0mL/h/kg)或TEKF hIgG(～1.1mL/h/kg)更快速(图31A和31B)，但在整个研究期间仍持续暴露。结果显示此FcRn拮抗剂可在宿主中停留一段足够的时间，用以降低FcRn介导的WT IgG回收并提高WT IgG清除。

序列表

<110> 建新公司

<120> 以FcRn拮抗剂治疗抗体介导的障碍的方法

<130> 022548.WO062

<150> 62/878,541

<151> 2019-07-25

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 3

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

145 150 155 160

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

165 170 175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 4

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> /note="人工序列说明: 合成多肽, 聚组氨酸标签"

<400> 5

His His His His His His His His

1 5

Claims (35)

1.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号下列四种氨基酸残基的组合：

在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，

在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，

在氨基酸位置307的色氨酸(W)或谷氨酰胺(Q)，和

在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；

其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

2.如权利要求1的方法，其中该修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的氨基酸残基的组合：

a)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

b)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

c)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；

d)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)；

e)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)；及

f)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)。

3.如权利要求1的方法，其中该修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的四重氨基酸取代：

M252Y/T256D/T307Q/N434Y，

M252Y/T256E/T307W/N434Y，

M252Y/T256E/T307Q/N434Y，

M252Y/T256D/T307Q/N434F，

M252Y/T256D/T307W/N434Y，和

M252Y/T256D/T307W/N434F。

4.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

5.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

6.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的谷氨酸(E)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

7.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的谷氨酰胺(Q)及在氨基酸位置434的苯丙氨酸(F)，其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

8.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

9.一种在有需要的受试者中治疗IgG介导的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰Fc区包含根据Eu编号下列氨基酸残基的组合：

a)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)和在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，

b)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，

c)在氨基酸位置252的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，或

d)在氨基酸位置256的天冬氨酸(D)，在氨基酸位置307的色氨酸(W)及在氨基酸位置434的酪氨酸(Y)，

其中该治疗有效量的FcRn拮抗剂增加该受试者中血清IgG的清除。

10.如权利要求9的方法，其中该修饰的Fc区包含选自由以下组成的群的氨基酸取代的组合：

M252Y/N434Y，

M252Y/T307W/N434Y，

M252Y/T256D/N434Y，和

T256D/307W/N434Y。

11.如前述权利要求中任一项的方法，其中该IgG介导的障碍为自身免疫疾病。

12.如权利要求11的方法，其中该自身免疫疾病选自由以下组成的群：移植物抗宿主疾病(GVHD)、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力症、系统性硬化症(SSc)/硬皮病、类风湿性关节炎、牛皮癬性关节炎、骨性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、寻常性天疱疮、异位性皮肤炎、牛皮癬、哮喘、过敏、特发性肺纤维化(IPF)、特发性血小板减少紫斑症(ITP)和化脓性汗腺炎。

13.一种在有需要的受试者中提升诊断造影的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰的人类IgG Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的人类IgG Fc区包含根据Eu编号选自由以下组成的群的氨基酸取代的组合：

M252Y/T256D/T307Q/N434Y，

M252Y/T256E/T307W/N434Y，

M252Y/T256E/T307Q/N434Y，

M252Y/T256D/T307Q/N434F，

M252Y/T256D/T307W/N434Y，

M252Y/T256D/T307W/N434F，

M252Y/N434Y,

M252Y/T307W/N434Y，

M252Y/T256D/N434Y，和

T256D/307W/N434Y。

14.如权利要求13的方法，其进一步包括向该受试者施用放射性标记的抗体。

15.如权利要求14的方法，其中该FcRn拮抗剂在该放射性标记抗体之后施用，由此提升对该放射性标记抗体的对比。

16.一种在有需要的受试者中降低在诊断造影期间非靶组织暴露于放射性标记抗体的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含修饰Fc区的FcRn拮抗剂，该修饰的Fc区包含根据Eu编号选自由以下组成的群的氨基酸取代的组合：

M252Y/T256D/T307Q/N434Y，

M252Y/T256E/T307W/N434Y，

M252Y/T256E/T307Q/N434Y，

M252Y/T256D/T307Q/N434F，

M252Y/T256D/T307W/N434Y，

M252Y/T256D/T307W/N434F，

M252Y/N434Y，

M252Y/T307W/N434Y，

M252Y/T256D/N434Y，和

T256D/307W/N434Y。

17.如前述权利要求中任一项的方法，其中该修饰的Fc区为修饰的人类IgG Fc区。

18.如权利要求17的方法，其中该修饰的Fc区为修饰的人类IgG1 Fc区。

19.如前述权利要求中任一项的方法，其中该修饰的Fc区相比于野生型Fc区具有在酸性pH和非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，任选地其中该酸性pH为约6.0且任选地其中该非酸性pH为约7.4。

20.如前述权利要求中任一项的方法，其中该修饰的Fc区为修饰的人类IgG Fc区且相比于包含氨基酸取代M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F的相同亚型的人类IgG Fc区具有在酸性pH和/或非酸性pH下提升的FcRn结合亲和力，任选地其中该酸性pH为约6.0且任选地其中该非酸性pH为约7.4。

21.如前述权利要求中任一项的方法，其中该修饰的Fc区相比于野生型Fc区具有降低的FcγRIIIa结合亲和力。

22.如前述权利要求中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂包含带有氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、3或4或其FcRn-结合部分。

23.如权利要求1-22中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂为结合一或多个不为FcRn的靶标的结合多肽。

24.如权利要求1-22中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂为抗体或包含其抗原结合片段。

25.如权利要求24的方法，其中该FcRn拮抗剂为单克隆抗体。

26.如权利要求25的方法，其中该抗体为嵌合、人源化或人类抗体。

27.如权利要求1-22中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂为Fc融合蛋白。

28.如权利要求27的方法，其中该Fc融合蛋白为免疫黏附素。

29.如权利要求1-22中任一项的方法，其中该FcRn拮抗剂为Fc片段。

30.FcRn拮抗剂在用于制备供治疗如权利要求1-29中任一项的方法中有需要的受试者的药物中的用途。

31.一种FcRn拮抗剂，其用于如权利要求1-29中任一项的方法中治疗有需要的受试者。

32.一种由修饰的Fc区组成的分离多肽，该修饰的Fc区包含如权利要求1-10中任一项中所述的氨基酸取代的组合。

33.如权利要求32的分离多肽，其中该修饰的Fc区为修饰的人类IgG Fc区。

34.如权利要求33的分离多肽，其中该修饰的Fc区包含具有所述的取代的氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、3或4或其FcRn-结合片段。

35.一种药物组合物，其包含如权利要求32-34中任一项的分离多肽及药学上可接受的载剂。

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