CN111801580A

CN111801580A - 用于定量多肽的方法

Info

Publication number: CN111801580A
Application number: CN201980016834.2A
Authority: CN
Inventors: C·摩根; 张晓葵
Original assignee: New Co
Current assignee: New Co; Genzyme Corp
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-10-20
Also published as: WO2019140320A1; JP2023171846A; US11754573B2; JP7394767B2; JP2021510813A; US20220003780A1; ZA202003701B; CA3088107A1; RU2020124746A3; SG11202006410WA; AU2019206648A1; BR112020013325A2; KR20200109333A; IL275536A; US11067584B2; MX2020007444A; US20190234963A1; EP3737949A1; RU2020124746A

Abstract

提供用于定量存在于样品(例如，血浆或血清样品)中的包含抗体的一部分的多肽的量的方法，其中所述抗体包含含有工程化突变的恒定区(例如，重链或轻链恒定区)。

Description

用于定量多肽的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请序列号62/617,080的优先权权益，其内容通过提述以其整体并入本文。

以ASCII文本文件提交的序列表

如下以ASCII文本文件提交的内容通过提述以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：183952028240SEQLIST.txt，记录日期：2019年1月11日，大小：29KB)。

发明领域

本发明提供用于定量样品中包含具有工程化突变的抗体恒定区(或其部分)的多肽的量的方法。

发明背景

蛋白质，如抗体，代表了一类增长中的治疗剂。在临床前开发过程中，候选治疗性蛋白质在动物模型中进行了广泛的分析，以评估其药代动力学(PK)、药效学(PD)和毒物动力学(TK)特性，评估其安全性概貌，并确定用于第一次人体研究的安全剂量。在临床开发过程中，在人受试者中进一步分析治疗性蛋白质的PK、PD和TK特性。来自人体研究的数据用于评价治疗性蛋白质的安全性和功效，建立给药方案和/或调整患者亚群中的剂量。因此，关键的是，用于在临床前和临床样品中定量治疗性蛋白质的方法必须可靠且灵敏。

由于配体结合测定法(LBA)的高灵敏度，低成本和高通量，因此其已传统上被用于定量治疗性蛋白质。尽管具有这些优点，但LBA的线性动态范围有限，具有跨代谢物/类似物交叉反应的风险，并且难以多重复用。此外，开发用于新的治疗性蛋白质的LBA中的新抗体既昂贵又是劳动密集型的。

液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)已成为一种用于定量治疗性蛋白质的有前途的测定平台。临床前动物研究中用于治疗性蛋白质生物分析的LC-MS/MS测定法通常依赖于“替代肽”(即，其序列对于治疗性蛋白质而言是独特的并在临床前物种的蛋白质组中不存在的肽)的定量作为治疗性蛋白质的替代度量。由于许多治疗性蛋白质衍生自人蛋白质，因此替代肽的序列可能会存在于人蛋白质组中，因此妨碍了从人受试者获得的样品中治疗性蛋白质的准确定量。

因此，在本领域中仍然需要用于定量临床前(非人)和临床(人)样品中的治疗性蛋白质的通用方法。本公开涉及这种需求和其他需求。

本申请中引用的所有参考文献均通过提述而明确地并入本文。

发明概述

提供一种用于定量样品中包含抗体重链恒定区的一部分的多肽的量的方法，该方法包括：(a)消化包含所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽的样品，其中所述抗体重链恒定区的一部分包含工程化突变，并且其中消化产生衍生自所述抗体重链恒定区的肽片段，该肽片段的长度为5至26个氨基酸，并包含所述工程化突变；和(b)通过质谱分析消化的样品以确定所述肽片段的量，由此确定所述样品中所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽的量。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述肽片段不包含甲硫氨酸(M)或半胱氨酸(C)。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述肽片段不包含其后为甘氨酸(G)或丝氨酸(S)的天冬酰胺(N)。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述方法进一步包括在质谱分析之前纯化和浓缩消化的样品。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述消化的样品经由固相提取(SPE)纯化和浓缩。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述消化的样品通过SISCAPA(稳定的同位素标准物和通过抗肽抗体捕获)纯化和浓缩。

在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述样品是全血样品、血清样品、血浆样品或组织样品。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述样品来自小鼠、非人灵长类或人。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述非人灵长类是食蟹猴或恒河猴。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述样品用至少一种酶消化。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述至少一种酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、谷氨酰内肽酶、赖氨酰内肽酶、Asp-N、Arg-C、Glu-C、溴化氰(CnBr)或其组合。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，用于确定样品中多肽的量的质谱是液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS)。

在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述多肽包含CH1域，并且其中CH1域包含工程化突变。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述多肽包含CH2域，并且其中所述CH2域包含工程化突变。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述多肽包含CH3域，并且其中所述CH3域包含工程化突变。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体重链恒定区的CH3域中的工程化突变是T366Y、T366W、T366S、L368A、T394W、T394S、F405A、F405W、Y407T、Y407V或Y407A。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体重链恒定区的CH3域中的工程化突变是Y407V，并且其中CH3域包含SEQ ID NO:6(DGSFFLVS)所示的氨基酸序列。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述消化产生包含以下(如由以下组成的)肽片段：氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述样品用胰蛋白酶消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)组成的肽片段。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述样品用Asp-N消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)组成的肽片段。在根据(或应用于)任何上述实施方式的某些实施方式中，样品用Glu-C消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列GSSFFLSKLTVD(SEQ ID NO:9)组成的肽片段。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体重链恒定区的CH3域中的工程化突变是N434S。在根据(或应用于)任何上述实施方式的某些实施方式中，所述样品用Glu-C和胰蛋白酶消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列ALHSHYTQK(SEQ ID NO:11)组成的肽片段。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体、Fc融合蛋白或免疫粘附素。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述抗体是治疗性抗体。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体是单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述抗体是三特异性抗体。在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述三特异性抗体包含形成三个抗原结合位点的四个多肽链，所述三个抗原结合位点特异性结合一个或多个抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽包含由下式所示的结构：VL2-L1-VL1-L2-CL；第二多肽链包含由下式所示的结构：VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3；第三多肽链包含由下式所示的结构：VH3-CH1-铰链-CH2-CH3；第四多肽链包含由下式所示的结构：VL3-CL，其中VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；CL是免疫球蛋白轻链恒定域；CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；并且L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对；并且其中第二多肽链或第三多肽链包含氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；第二多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；第三多肽包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且第四多肽包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在根据(或应用于)以上任何实施方案的某些实施方案中，所述抗体缀合至药物或标记物。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述药物选自化学治疗剂、细胞毒性剂或生长抑制剂。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述标记物是放射性同位素、荧光染料或酶。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体是人IgG抗体。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG1抗体或人IgG4抗体。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述抗体结合A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4/VTCN1、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1b、CCL5/RANTES、CCL7/MCP-3、CCL8/mcp-2、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、CCL15/MIP-1d、CCL17/TARC、CCL19/MIP-3b、CCL20/MIP-3a、CCL21/MIP-2、CCL24/MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23/FCER2、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD122、CD137/41BB、CD137L、CD152/CTLA4、CD154/CD40L、CD160、CD272、CD273/PDL2、CD274/PDL1、CD275/B7H2、CD276/B7H3、CD278/ICOS、CD279/PD-1、CDH1/E-钙粘蛋白、几丁质酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1/M-CSF、CSF-2/GM-CSF、CSF-3/GCSF、CX3CL1/SCYD1、CXCL12/SDF1、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOLSG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb/IL25、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4/b4整合素、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦蛋白、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2/IL33的受体、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP/IL7Ra、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM或XCR/GPR5/CCXCR1。在根据(或应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述方法用于在小鼠、非人灵长类和人中对所述包含抗体重链恒定区的多肽进行药代动力学研究。

除非明确相反地指示，否则本文描述的每个实施方案可以与一个或多个其他实施方案组合。特别地，除非明确相反地指示，否则指示为优选或有利的任何特征或实施方案可与指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征或实施方案组合。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本发明的这些和其他实施方案。

附图简述

图1显示了几种示例性治疗性抗体的Fc区的序列比对。加下划线的是包含至少一个氨基酸取代的预测的胰蛋白酶肽。胰蛋白酶肽内存在的半胱氨酸用粗箭头表示。SEQ IDNO:2和5包括突起突变(knob mutation)T366W。SEQ ID NO:3和4包含穴突变T366S、L368A和Y407V。

图2A-2C显示了对胰蛋白酶消化的三特异性构建体(TRI-1)进行LC-MS/MS分析的结果，该构建体包含具有SEQ ID NO:2和3所示的氨基酸序列的重链。SEQ ID NO:2包含工程化“突起”突变T366W且SEQ ID NO:3包含工程化“穴”突变T366S、L368A和Y407V。SEQ ID NO:3的胰蛋白酶消化预测以产生具有氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)的肽，即“工程化TTPP肽”。图2A显示了m/z 905.40-907.60的提取离子色谱图。图2B显示了总离子色谱图。图2C显示了工程化TTPP肽的MS/MS光谱。

图3A-3D显示了经胰蛋白酶消化的小鼠血清(图3A)、猴血清(图3B)、人血清(图3C)和PBST中的TRI-1(图3D)的提取离子色谱图。工程化TTPP的运行时间以方框表示。

图4A-4D显示了小鼠血清(图4A)、猴血清(图4B)、人血清(图4C)和PBST(图4D)中经胰蛋白酶消化的TRI-1的提取离子色谱图。工程化TTPP的运行时间以方框表示。

图5A-5C显示了PBST中来自胰蛋白酶消化的TRI-1的工程化TTPP的提取离子色谱图，m/z＝905.36-905.55。TRI-1浓度为20μg/mL(图5A)、2μg/mL(图5B)和0.2μg/mL(图5C)。TTPP肽的峰面积是44064886(图A)、2633166(图5B)和368649(图5C)。

图6A-6C显示了来自PBST中经胰蛋白酶消化的TRI-1的未标记的FNWYVDGVEVHNAK(SEQ ID NO:10)(FNWY)的提取离子色谱图，m/z＝559.90-559.98。TRI-1浓度为20μg/mL(图6A)、2μg/mL(图6B)和0.2μg/mL(图6C)。FNWY肽的峰面积为70091279(图6A)、1078300(图6B)和209110(图6C)。

图7A-7C显示了来自PBST中经胰蛋白酶消化的SILUMAB的同位素标记的FNWY(FNWY(重))的提取离子色谱图，所述胰蛋白酶消化的SILUMAB用作TRI-1消化的内标，m/z＝562.58-562.63。TRI-1浓度为20μg/mL(图7A)、2μg/mL(图7B)和0.2μg/mL(图7C)。FNWY肽的峰面积为1369078(图7A)、343482(图7B)和473743(图7C)。

图8A-8D显示了来自小鼠血清中经胰蛋白酶消化的TRI-1的工程化TTPP的提取离子色谱图，m/z＝905.39-905.55。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图8A)、0.2μg/mL(图8B)2μg/mL(图8C)和20μg/mL(图8D)。TTPP肽的峰面积是ND(未检测到)(图8A)、ND(未检测到)(图8B)、2168471(图8C)和11833127(图8D)。

图9A-9D显示了来自小鼠血清中经胰蛋白酶消化的TRI-1的未标记FNWY的提取离子色谱图，m/z＝559.90-559.98。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图9A)、0.2μg/mL(图9B)、2μg/mL(图9C)和20μg/mL(图9D)。FNWY肽的峰面积是ND(未检测到)(图9A)、410330(图9B)、2500109(图9C)和22039621(图9D)。

图10A-10D显示了来自小鼠血清中经胰蛋白酶消化的SILUMAB的FNWY(重)的提取离子色谱图，所述胰蛋白酶消化的SILUMAB用作TRI-1消化的内标，m/z＝562.58-562.63。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图10A)、0.2μg/mL(图10B)、2μg/mL(图10C)和20μg/mL(图10D)。FNWY肽的峰面积为1184181(图10A)、2310675(图10B)、1199642(图10C)和967309(图10D)。

图11A-11D显示了来自猴血清中经胰蛋白酶消化的TRI-1的工程化TTPP的提取离子色谱图，m/z＝905.39-905.55。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图11A)、0.2μg/mL(图11B)、2μg/mL(图11C)和20μg/mL(图11D)。TTPP肽的峰面积是ND(未检测到)(图11A)、ND(未检测到)(图11B)、1013964(图11C)和3751017(图11D)。

图12A-12D显示了来自猴血清中经胰蛋白酶消化的TRI-1的未标记FNWY的提取离子色谱图，m/z＝559.92-559.95。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图12A)、0.2μg/mL(图12B)、2μg/mL(图12C)和20μg/mL(图12D)。FNWY肽的峰面积是75675(图12A)、97731(图12B)、1298150(图12C)和13378187(图12D)。

图13A-13D显示了来自猴血清中经胰蛋白酶消化的SILUMAB的FNWY(重)的提取离子色谱图，所述胰蛋白酶消化的SILUMAB用作TRI-1消化的内标，m/z＝562.58-562.63。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图13A)、0.2μg/mL(图13B)、2μg/mL(图13C)和20μg/mL(图13D)。FNWY肽的峰面积是1446203(图13A)、1216254(图13B)、1271728(图13C)和1349983(图13D)。

图14A-14D显示了来自人血清中经胰蛋白酶消化的TRI-1的工程化TTPP的提取离子色谱图，m/z＝905.39-905.55。TRI-1浓度为0μg/mL(对照)(图14A)、0.2μg/mL(图14B)、2μg/mL(图14C)和20μg/mL(图14D)。TTPP肽的峰面积是ND(未检测到)(图14A)、ND(未检测到)(图14B)、194065(图14C)和1848332(图14D)。

图15A-15D显示了面积比与抗体浓度的比较。图15A显示了PBST中工程化TTPP:FNWY(重)的面积比相对于TRI-1的抗体浓度的比较。图15B显示了PBST中未标记的FNWY:FNWY(重)的面积比相对于TRI-1的抗体浓度的比较。图15C显示了小鼠血清中工程化TTPP:FNWY(重)的面积比相对于TRI-1抗体浓度的比较。图15D显示了猴血清中工程化TTPP:FNWY(重)的面积比相对于TRI-1的抗体浓度的比较。

图16显示了在实施例2中定量的示例性三特异性抗体的重链和轻链的序列。在LC-MS/MS测定中定量的替代肽的序列加下划线表示。

图17显示了示例性三特异性抗体的示意图，且其中图16中加下划线的替代肽的序列位于所述三特异性抗体中。

图18提供了使用TTPP肽定量三特异性抗体的方法的示例性工作流程图。

图19A显示了TTPP肽在LLOQ处的示例色谱图(定量最下限，2.5μg/ml)。图19B显示了稳定的同位素标记的TTPP肽(标准[¹³C11-¹⁵N2]-LTTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:20))的示例性色谱图，所述TTPP肽在实施例3中用作内标。图19C显示了TTPP肽在2.5μg/mL-10,000μg/mL范围内的校准曲线。

图20A显示了使用线性回归分析以1/x加权分析的血清校准曲线。图20B显示了使用线性回归分析以1/x加权分析的第二血清校准曲线。从实施例3中所述的单独实验中获得用于构建图20A和20B中的曲线的样品。

图21A显示了如通过经由LC-MS/MS测量获自施用了三特异性抗体的小鼠的血清中TTPP肽的水平检测的三特异性抗体的相对水平的比较。图21B显示了如经由ELISA在获自施用了三特异性抗体的小鼠的血清中检测的三特异性抗体的相对水平的比较。

图22A显示了空白大鼠血清样品的LC-MS/MS分析的结果。图22B显示了掺有5μg/ml三特异性抗体的大鼠血清样品的MS/MS谱。图22C显示了空白猴血清样品的LC-MS/MS分析结果。图22D显示了掺有5μg/ml三特异性抗体的猴血清样品的MS/MS谱图。图22E显示了空白猴血清样品的LC-MS/MS分析结果。图22F显示了掺有5μg/ml三特异性抗体的人血清样品的MS/MS谱。

发明详述

定义

如本文所用，“抗体恒定区”是指抗体的更保守的区域，例如在可变域之外。该术语可包括轻链恒定区，即，CL域，铰链区，以及重链恒定域CH1、CH2、CH3和任选的CH4。

如本文所用，术语“工程化突变”是指由人设计产生的突变(即，该突变不是由于自然原因自发发生和/或是人为故意操纵的结果)。

如本文所用，术语“抗体”可指完整抗体，包含重链恒定区的至少一部分的抗体片段(包括而不限于Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv或单重链抗体)，前提是它们表现出所期望的生物学活性；单克隆抗体；多克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体)；和抗体样蛋白。

术语“抗体”通常是指包括两条轻(L)链和两条重(H)链的异四聚体复合物。除链内二硫桥外，可变数目的二硫键连接两条重链，并且一个二硫键将各轻链连接至重链。重链包括可变域(VH)，其后(N末端至C末端)是三个或四个恒定域。轻链包括可变域(VL)，其后是恒定域(CL)。通常，基于氨基酸序列，哺乳动物轻链属于两类之一：κ和λ。

如本文所用，术语“多特异性”当用于提及抗体或抗体片段时包括具有两种或更多种不同结合特异性的抗体或抗体片段(例如，双特异性和三特异性抗体)。例如，每种结合特异性可识别不同的抗原，或者每种结合特异性可识别具有不同亲和力和/或精确表位的相同抗原。在一些实施方案中，每种不同的结合特异性包含一个或多个不同的抗体抗原结合域(例如，可变域)，使得多特异性抗体或抗体片段包含例如具有第一结合特异性的第一抗原结合域，具有第二结合特异性的结合域的第二抗原结合域，等等。多种示例性的多特异性抗体形式(例如，双特异性和三特异性抗体形式)是本领域已知的，并且在本文其他地方进一步详细的描述。

在详细描述所公开的实施方案之前，应当理解，本公开不限于特定的组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不意欲为限制性的。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数指称，除非内容另外明确指出。因此，例如，提及“一个分子”任选地包括两个或更多个所述分子的组合，等等。

如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各自值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。

应当理解，本公开的方面和实施方案包括“包含(comprising)”方面和实施方案、由其“组成”和“基本上由其组成”。

定量样品中多肽的方法

质谱(MS)是配体结合测定(LBA)的可行替代方法，用于定量分析从例如临床前动物研究中获得的样品中的治疗性蛋白质。基于MS的定量的典型程序需要消化每个样品以生成肽片段，并定量衍生自治疗性蛋白质的特定肽的量，作为治疗性蛋白质本身的替代物。当前，衍生自人抗体恒定区的“通用”替代肽被用于在非人动物模型中定量人抗体、人源化抗体或嵌合抗体的通用方法中。此类通用方法基于以下原则：“通用”替代肽的序列在所有人Fc域中均是保守的，但在进行临床前疗效和安全性研究的物种(例如，小鼠、大鼠、狗、猴等)中不存在。然而，不可能在人患者的样品中使用“通用”替代肽来准确定量例如包含人抗体恒定区的治疗性蛋白质，因为“通用”替代肽的序列也存在于内源性人抗体中。

包含人抗体恒定区的许多治疗性蛋白质(例如抗体)还包含工程化突变，该突变已被引入恒定区，以例如调节效应子功能、调节血清半衰期、促进异源二聚化等。申请人发现，衍生自恒定区的含有工程化突变的部分的肽在非人和人蛋白质组背景中都是独特的。因此，本文描述的方法可用于定量临床前样品(即，从动物物种获得)和临床样品(即，从人患者获得)中的治疗性蛋白质。

提供了用于定量样品中多肽的量的方法，其中所述多肽包含抗体重链恒定区的一部分，并且其中所述抗体重链恒定区的一部分包含工程化突变。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)消化被怀疑包含多肽的样品，以产生包括含有工程化突变的肽片段的消化的样品；和(b)经由质谱分析消化的样品，以确定包含工程化突变的肽片段的量，由此确定多肽的量。可使用本文所述方法定量的多肽(例如，融合蛋白、免疫粘附素和抗体)在本文其他地方进一步详细描述。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于药代动力学研究(如在临床前研究或临床试验中)。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：例如在临床前研究期间，在定量之前，向动物施用包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽。下面详细描述可向其施用包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽的示例性非人动物。在一些实施方案中，所述方法包括在临床试验期间，在定量之前，向人(例如人患者)施用包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽。

在一些实施方案中，包含含有具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽的样品是从动物衍生、获得或分离的生物学样品。在一些实施方案中，衍生、获得或分离样品的动物是向其施用包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽的动物。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人(例如人患者)、非人灵长类(NHP)(例如，食蟹猴、恒河猴、狨猴、绢毛猴、蜘蛛猴、枭猴、松鼠猴、长尾猴(vervet money)、狒狒或其他)或啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法进行分析的样品是怀疑含有包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽的任何样品。在一些实施方案中，所述样品为体液或衍生自体液，包括但不限于例如血液、血浆、血清、乳、支气管灌洗液、羊水、唾液、胆汁或泪液。在一些实施方案中，所述样品包含组织或细胞。在一些实施方案中，所述样品包含血清和已知量的肽(即“加标”血清)。在一些实施方案中，所述加标血清还包含缓冲液。在一些实施方案中，所述加标血清用作定量存在于衍生自、获得自或分离自动物的样品中包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽的量的参考。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在消化之前处理所述样品，以例如在样品中富集包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽，或例如从样品消耗丰富的蛋白质(如来自血液、血清或血浆样品的白蛋白)。在一些实施方案中，处理样品包括进行抗体下拉测定。可替代地或另外地，在一些实施方案中，处理样品包括进行凝胶电泳、提取、沉淀、离心、色谱法(例如，亲和捕获色谱法、大小排阻色谱法等)、超滤和/或本领域普通技术人员已知的一个或多个另外的分离步骤。

在一些实施方案中，样品通过化学切割消化。在多肽的特定位点处切割的示例性化学试剂包括但不限于例如甲酸、羟胺、碘代苯甲酸和NTCB(2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸)。在一些实施方案中，样品用酶例如内肽酶消化。在一些实施方案中，所述酶是位点特异性内肽酶。示例性位点特异性蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(高特异性，切割FYW的c末端，不在P之前)、胰凝乳蛋白酶(低特异性，切割FYWML的c末端，不在P之前)、谷氨酰内肽酶、赖氨酰内肽酶、Asp-N蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Lys-N蛋白酶、金黄色葡萄球菌V8(也称为谷氨酰内肽酶或Glu-C蛋白酶)、溴化氰(CnBr)、弹性蛋白酶、胃蛋白酶(pH＝1.3)、胃蛋白酶(pH>2)、脑啡肽酶、BNPS粪臭素、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、梭菌蛋白酶、肠溶酶(enteroinase)、因子Xa、颗粒酶B、嗜热菌素(thermolysin)、脯氨酸内肽酶、葡萄球菌肽酶I、凝血酶和烟草蚀纹病毒蛋白酶。在一些实施方案中，所述样品用非特异性内肽酶例如木瓜蛋白酶或蛋白酶K消化。在一些实施方案中，所述样品用包含两种(或多种)内肽酶(包括位点特异性和/或非位点特异性)的混合物消化。在一些实施方案中，所述两种或更多种内肽酶同时用于消化所述样品。在一些实施方案中，所述两种或更多种内肽酶顺序地用于消化所述样品。在准备通过质谱分析中消化多肽的方法是本领域众所周知的。示例性方法提供于例如Gundry等(2009)Curr Protoc Mol Biol.doi:10.1002/0471142727.mb1025s88；Hedrick等(2015)Curr Protoc Chem Biol.7(3):201-222；Giansanti等(2016)Nature Protocols.11:993-1006；Nordhoff等(Int J Mass Spect.226(1):163-180；和Zhang等(2014)Curr Protoc Mol Biol.doi:10.1002/0471142727.mb1021s108。

样品的消化产生包含工程化突变的肽片段。在一些实施方案中，通过消化产生的肽片段的长度为5至40个氨基酸，例如，长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽片段不包含半胱氨酸(Cys)和/或甲硫氨酸(M)残基。可替换地或另外地，在一些实施方案中，所述肽不包含其后为甘氨酸残基(G)或丝氨酸残基(S)的天冬酰胺残基(N)(即，NG或NS)。在一些实施方案中，所述肽片段不包含相邻的内肽酶切割位点，例如，两个或更多个位点特异性内肽酶切割位点，其被6、5、4、3、2或1个氨基酸分开。已经开发了多种计算机软件工具来预测可通过消化(例如，用一种酶或化学切割试剂进行消化或用酶和/或化学切割试剂的组合进行消化)产生的肽群体。此类工具，包括(而不限于)PChopper、PeptideCutter、MAPPP、IPEP、MS-Digest和Protein Digestion Simulator，在本领域中是众所周知的并且是公众可得到的，例如在万维网上。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在通过质谱分析之前纯化和/或浓缩消化的样品。在一些实施方案中，纯化和/或浓缩消化的样品包括进行亲和捕获色谱或固相提取(SPE)，并洗脱纯化和浓缩的样品。(参见，例如Gudry等(2009)“Preparation ofProteins and Peptides for Mass Spectrometry Analysis in a Bottom-UpProteomics Workflow.”Curr Protoc Mol Biol.CHAPTER:Unit10.25.doi:10.1002/0471142727.mb1025s88)。在一些实施方案中，纯化和/或浓缩消化的样品包括进行稳定的同位素标准和通过抗肽抗体的捕获(SISCAPA)。在一些实施方案中，对样品进行抗体下拉测定，消化(例如，使用本领域已知的一种或多种内肽酶)，并通过SISCAPA纯化和/或浓缩。关于SISCAPA的细节提供于：例如Anderson等(2004)“Mass spectrometric quantitation ofpeptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies(SISCAPA).J Proteome Res.3(2):235-44；美国专利号7,632,686和9,164,089；Whiteaker等(2011)“Evaluation of large scale quantitative proteomicassay development using peptide affinity-based mass spectrometry.”Mol CellProteomics.10(4):M110.005645；和Rasavi等(2016)“Multiplexed longitudinalmeasurement of protein biomarkers in DBS using an automated SISCAPAworkflow.”Bioanalysis.8(15):1597-1609。

在一些实施方案中，通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析消化的样品。LC-MS/MS是一种这样的方法，其中首先通过液相色谱分离样品混合物然后被电离(例如，通过电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)或大气压光电离(APPI))，并使用两个串联的质谱仪通过质荷比和相对丰度表征。关于LC-MS/MS的细节提供于：例如Grebe等(2011)“LC-MS/MS in the Clinical Laboratory–Where to From Here？”Clin.Biochem Review.32(1):5-31；El-Khoury等“Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in theClinical Laboratory.”J.Chrom.&Separation Tech.4:e115.doi:10.4172/2157-7064.1000e115；Shushan等(2010)“A review of clinical diagnostic applications ofliquid chromatography–tandem mass spectrometry.”Mass Spec.Rev.29:930-944,2010。

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于检测样品中的肽，其中样品中肽的浓度为约200、150、100、50、15、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.075、0.05、0.025或0.01ng/ml中的任一者，包括这些值之间的任何范围。

抗体重链恒定区中的工程化突变

在一些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含含有工程化突变的CH1域(或其一部分，例如10-50个氨基酸)。在一些实施方案中，CH1域从抗体重链的约残基114延伸至约残基223，根据Kabat编号系统。在一些实施方案中，CH1域从抗体重链的约残基118延伸至约残基215，根据EU编号系统。参见，例如，在WorldWideWeb.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html的国际免疫遗传学信息系统(IMGT)网络资源(International Immunogenetics Information System(IMGT)Web Resources)。这些氨基酸残基位置基于人IgG；然而，不意欲将本文提供的方法限于与包含人IgG的CH1域(或其部分)的多肽一起使用。来自其他人Ig的相应CH1域序列，以及其他哺乳动物(例如，猕猴、食蟹猴、小鼠、大鼠等)的相应CH1域序列是公众可获得的。

在某些实施方案中，CH1域(或其部分)中的工程化突变包含(例如由以下组成)不影响(或基本上不影响)包含抗体重链恒定区的多肽的所期望的活性的氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代或插入包含非天然氨基酸或缀合的氨基酸的取代或插入。氨基酸取代、插入或缺失可通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变)或通过肽合成而被引入至CH1域(或其部分)，如本文其他地方进一步详细描述的。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含人IgG1 CH1域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG1 CH1域(或其部分)中的工程化突变驱动Fc异二聚化(例如，用于产生双特异性抗体、多特异性抗体或单臂抗体)。在一些实施方案中，人IgG1CH1域(或其部分)中的工程化突变是在K147或K213处的氨基酸取代(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1CH1域中的工程化突变包含氨基酸取代(如由氨基酸取代组成)：K147D、K147E、K213D或K213E(根据EU编号系统)。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含含有工程化突变的CH2域(或其一部分，例如10-50个氨基酸)。在一些实施方案中，人IgG的CH2域从抗体重链的约残基231延伸至约残基340，根据EU编号系统。参见，例如，在WorldWideWeb.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html的国际免疫遗传学信息系统(IMGT)网络资源。这些氨基酸位置基于人IgG；然而，这并不意欲将本文提供的方法限于与包含人IgG的CH2域(或其部分)的多肽一起使用。来自其他人Ig的相应CH2域序列是公众可获得的，其他哺乳动物(例如，猕猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等)的相应CH2域序列也是可公开获得的。在某些实施方案中，CH2域(或其部分)中的工程化突变包含不影响(或基本上不影响)包含抗体重链恒定区的多肽的所期望的活性的氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代或插入包括非天然氨基酸或缀合的氨基酸的取代或插入。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含人IgG1 CH2域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG1CH2域(或其部分)中的工程化突变调节效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1 CH2域(或其部分)中的工程化突变包含在一个(或多个)以下残基处的氨基酸取代：E233、L234、L235、G236、P238、S239、F243、T250、M252、S254、T256、P257、S267、R292、Q295、N297、S298、T299、Y300、Q311、K322、A327、L328、P329、A330、P331、I332和E333(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH2域(或其部分)中的工程化突变包含以下氨基酸取代中的一个(或多个)：E233P、L234V、L234A、L235V、L235A、G236A、P238D、S239D、F243L、T250Q、T250R、M252Y、S254T、T256E、P257I、S267E、R292P、Q295R、N297Q、N297D、N297A、S298G、S298N、S298C、S298A、S28T/S298T、T299A、Y300L、Q311I、K322A、A327G、L328E、L328F、L328W、P329G、P329N、A330S、A330L、A330V、P331S、P331V、I332E、I332Y、E333A和E333S(根据EU编号系统)。可替代地或另外地，人IgG1 CH2域(或其部分)中的工程化突变包含ΔG236(如由ΔG236组成)(根据EU编号系统)。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含人IgG2 CH2域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG2 CH2域(或其部分)中的工程化突变调节效应子功能。在一些实施方案中，人IgG2 CH2域(或其部分)中的工程化突变包含在一个或多个下列残基处的氨基酸取代：K326和E333(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH2域(或其部分)中的工程化突变包含以下氨基酸取代中的一个(或多个)：K326W和E333S(根据EU编号系统)。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法定量的多肽包含人IgG3 CH2域。在一些实施方案中，人IgG3 CH2域中的工程化突变调节效应子功能。在一些实施方案中，人IgG3CH2域中的工程化突变包含在E235处的氨基酸取代(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，氨基酸取代包含E235Y。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法待定量的多肽包含人IgG4CH2域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG4 CH2域(或其部分)中的工程化突变调节效应子功能。在一些实施方案中，人IgG4 CH2域(或其部分)中的工程化突变在一个(或多个)下列残基处包含氨基酸取代：S228、F234、L235、F296、G327和P329(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，氨基酸取代包括以下氨基酸取代中的一个(或多个)：S228P、F234A、F234L、L235A、F296Y、G327A、P329G和P329N。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法待定量的多肽包含含有工程化突变的CH3域(或其部分，例如10-50个氨基酸)。在一些实施方案中，根据EU编号系统，CH3域从约残基341延伸至约残基447。参见，例如，WorldWideWeb.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html上的国际免疫遗传学信息系统(IMGT)网络资源(International Immunogenetics Information System(IMGT)Web Resources)。这些氨基酸位置基于人IgG；然而，不意欲将本文提供的方法限于与包含人IgG的CH3域的多肽一起使用。来自其他人Ig的相应CH3域序列是公众可获得的，来自其他哺乳动物(例如，猕猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等)的其他Ig的相应CH3域序列也是公众可获得的。在某些实施方案中，CH3域(或其部分)中的工程化突变是不影响(或基本上不影响)包含抗体重链恒定区的多肽的所期望的活性的氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代或插入包含非天然氨基酸或缀合的氨基酸的取代或插入。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法待定量的多肽包含人IgG4 CH3域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG1CH4域(或其部分)中的工程化突变调节效应子功能。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含(如由以下组成)残基R409处的氨基酸取代(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含氨基酸取代R409K(如由氨基酸取代R409K组成)。

在某些实施方案中，根据本文提供的方法待定量的多肽包含人IgG1 CH3域(或其部分)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变调节效应子功能和/或改善血清半衰期。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含以下残基的一个或多个氨基酸取代：N343、E380、E382、P396、M428、H433、N434和Y436(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含以下氨基酸取代中的一个(或多个)：N343A、E380A、E382V、P396L、M428I、M428L、H433K、N434S、N434F和Y436H(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变驱动Fc异二聚化(例如，用于产生双特异性抗体、多特异性抗体或单臂抗体)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含以下残基中的一个(或多个)氨基酸取代：Y349、S354、R355、D356、E357、K360、T366、L368、K370、K392、T394、D399、F405、Y407、K409和K439(根据EU编号系统)。在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含以下氨基酸取代中的一个(或多个)：Y349C、S354C、R355D、R355E、D356K、D356R、E357K、E357R、K360D、K360E、T366R、T366K、T366N、T366Q、T366Y、T366W、T366S、T366E、T366G、L368A、L368K、L368Q、L368D、L368E、L368G、L368H、L368I、L368N、L368R、L368S、L368T、L368V、L368W、K370W、K370D、K370E,K392D、K392E、T394W、T394S、D399A、D399G、D399I、D399L、D399M、D399N、D299S、D399T、D399F、D399H、D399K、D399R、D399Y、F405A、F405W、Y407T、Y407V、Y407A、K409R、K409A、K409H、K409D、K409E、K409G、K439D和K439E(根据EU编号系统)。

在一些实施方案中，人IgG1 CH3域(或其部分)中的工程化突变包含Y407V(例如由Y407V组成)。在一些实施方案中，包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的多肽包含SEQID NO:6中所示的氨基酸序列(DGSFFLVS)。在一些实施方案中，消化包含(或疑似包含)包含具有工程化Y407V突变的抗体重链恒定区的多肽的样品产生包含以下(例如由以下组成)的肽片段：氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，用胰蛋白酶消化包含(或疑似包含)包含具有工程化Y407V突变的抗体重链恒定区的多肽的样品，并且消化产生包含以下(如由以下组成)的肽片段：氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)的肽片段。在一些实施方案中，用Asp-N消化包含(或疑似包含)包含具有工程化Y407V突变的抗体重链恒定区的多肽的样品，并且消化产生包含以下(例如由以下组成)的肽片段：氨基酸序列DGSFFLVSKLTV(SEQID NO:8)的肽片段。在一些实施方案中，用Glu-C消化包含(或疑似包含)包含具有工程化Y407V突变的抗体重链恒定区的多肽的样品，并且消化产生包含以下(如由以下组成)的肽片段：氨基酸序列GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)的肽片段。

在一些实施方案中，人IgG1 CH3域中的工程化突变包含N434S(如由N434S组成)。在一些实施方案中，用Glu-C和胰蛋白酶消化包含(或疑似包含)包含具有工程化N434S突变的抗体重链恒定区的多肽的样品，并且消化产生包含以下(例如由以下组成的)的肽片段：氨基酸序列ALHSHYTQK(SEQ ID NO:11)的肽片段。

在某些实施方案中，通过本领域已知的标准分子生物学技术将工程化突变引入抗体重链恒定区(或其部分)。先前已经描述了多种基因工程方法。此类诱变方法包括但不限于例如易错PCR、环改组、寡核苷酸定向诱变、随机核苷酸插入或重组前的其他方法。关于这些方法的进一步细节描述于例如Abou-Nadler等(2010)Bioengineered Bugs.1,337-340；Firth等(2005)Bioinformatics.21,3314-3315；Cirino等(2003)Methods Mol Biol.231,3-9；Pirakitikulr(2010)Protein Sci.19,2336-2346；Steffens等(2007)J.BiomolTech.18,147-149；及其它。

包含抗体重链恒定区的一部分的多肽

可使用包含抗体重链恒定区的一部分的任何多肽来进行本文提供的方法，其中所述抗体重链恒定区的一部分包含工程化突变。在一些实施方案中，所述多肽包含CH1域、CH2域和/或CH3域的全部或部分(例如10至50个氨基酸)，条件是该域(或其部分)包含工程化突变(例如，本文其他各处所述的工程化突变)。在一些实施方案中，重链恒定域的包含工程化突变的一部分来自或衍生自哺乳动物(例如，人、非人灵长类、小鼠、大鼠等)。在一些实施方案中，重链恒定区的包含工程化突变的一部分来自或衍生自人IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、人IgA(如IgA1或IgA2)、人IgM、人IgE或人IgD。在一些实施方案中，重链恒定区的包含工程化突变的一部分来自小鼠或衍生自小鼠(如小鼠IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或IgM抗体重链恒定区)。

在某些实施方案中，包含具有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含恒定区，例如人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgA1、人IgA2、人IgM、人IgE或人IgD的恒定区，其包含至少一个工程化突变。

在某些实施方案中，包含具有工程突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽是融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽是Fc融合多肽，其包含抗体重链恒定区的Fc域(即，CH2和CH3域)。在一些实施方案中，所述融合多肽是免疫粘附素，即其中结合蛋白(例如受体、配体或细胞粘附多肽)的功能域与抗体重链恒定区的一部分(通常是铰链和Fc域)融合的融合多肽。

抗体

在一些实施方案中，包含含有工程化突变抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是包含两条轻(L)链和两条重(H)链的异源四聚体复合物。在一些实施方案中，所述两条轻链和两条重链是相同的。在一些实施方案中，所述两条轻链包含不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两条重链包含不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体(例如，包含两条全长轻链和两条全长重链)。在一些实施方案中，所述抗体是包含含有工程化突变的重链恒定区的一部分的抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、scFv和单个重链抗体。在某些实施方案中，所述抗体是哺乳动物抗体(如人抗体、非人灵长类抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等)。在一些实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。

多特异性抗体

多特异性抗体具有针对一种以上抗原的结合特异性(例如，两种，三种或三种以上的结合特异性)。在一些实施方案中，使用本文提供的方法定量的抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对相同抗原的两种不同结合特异性(例如，具有相同抗原的不同结合亲和力和/或特异性表位)。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对两种不同抗原的结合特异性。在一些实施方案中，双特异性抗体是全长或完整抗体。预期本文提供的方法与本领域已知的双特异性或多特异性抗体形式一起使用。示例性双特异性和多特异性抗体形式包括但不限于以下所述的那些。

例如，“突起入穴”是用于工程化抗体重链同型二聚体以进行异二聚化(例如，用于生产双特异性抗体、多特异性抗体或单臂抗体)的设计策略。通常，此类技术涉及在第一多肽(如第一抗体重链中的第一CH3域)的界面和第二多肽(如第二抗体重链中的第二CH3域)的界面中的相应腔(“穴”)的界面处引入隆突(“突起”)，从而可以将隆突定位在腔中，以促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)替代来自第一多肽(如第一抗体重链中的第一CH3域)的界面的小氨基酸侧链来构建隆突。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二多肽(如第二抗体重链中的第二CH3域)的界面中产生与隆突大小相同或相似的补偿腔。参见，例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；和8,679,785，其中每个均通过提述以其整体并入本文。示例性突起入穴突变组包括但不限于下表1中所示的那些：

表1.示例性突起入穴突变组

WO 2011/131746描述了一种这样的双特异性抗体，该双特异性抗体在每个CH3域中的位置366、368、370、399、405和407(根据EU编号)之一处包含不对称突变。在还原条件下温育后，突变驱动两个单特异性IgG1、IgG4或IgG4样抗体之间定向的“Fab臂”或“半分子”交换。

US 2009/0232811和Schaefer等(2011)PNAS USA.108(27):11187-11192描述了Crossmab技术，即，一种双特异性抗体形式，其涉及在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换一个或多个重链和轻链域。轻链及其同源重链的正确缔合是通过在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)中交换重链和轻链域来实现的。这种“交叉”保留了抗原结合亲和力，但使两个臂如此不同，以致轻链错配不再发生。示例性Crossmab形式包括Crossmab^Fab(即，其中CL和VL域分别与CH1和VH域交换)，Crossmab^VH-VL(即，其中VL和VH域被交换)和Crossmab^CH1-VCL(即，其中CH1和CL域被交换)。还参见WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253和WO 2009/080254，其各自内容通过提述以其整体并入本文。

WO 2007/147901描述了一种工程化抗体重链以异源二聚化(例如，用于生产双特异性抗体、多特异性抗体或单臂抗体)的策略，该策略需要在Fc域中引入不对称突变(即，在第一Fc域中引入K253E、D282K、K322D，且在第二Fc域中引入D239K、E240K和K292D)和在CH/CL域引入不对称突变(即，CH1中引入K96E和CL中引入E15K)。据报道，此类不对称突变既破坏稳定半抗体的同二聚化的离子相互作用，又促进Fc域的异二聚化。

WO 2009/089004描述了异源多聚体蛋白(例如，双特异性、多特异性或单臂抗体)，其包含在CH3-CH3界面中的不对称突变对，其使Fc同源二聚化在静电上不利，但使Fc异源二聚化在静电上有利。参见，例如WO 2009/089004中的表2a和2b)。

Steinmetz等(2016)MABS.8(5):867-878、WO 2012/135345、WO2016/116626和美国专利号9,181,349 9,221,917中描述了几种具有CODV(交叉双重可变)的抗体样蛋白质，其中各内容通过提述以其整体并入本文。CODV构造产生了一个圆形的、自包含的结构，该结构起着自支撑构架的作用，维持两种抗原的亲本抗体亲和力。CODV抗体样蛋白可为(a)双价和/或双特异性的；(b)三价和/或三特异性的；(c)三价和/或双特异性；或(d)四价和/或双特异性的。在一种示例性形式中，所述多肽包含两条具有由下式表示的结构的多肽链：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L，和两条具有由下式表示的结构的多肽链：V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1-Fc，其中V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重链恒定域；Fc包含免疫球蛋白铰链区和C_H2、C_H3免疫球蛋白重链恒定域；L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在另一示例性形式中，所述多肽包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽具有下式表示的结构：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L-Fc，且第二多肽链具有由下式表示的结构：V_H2-L₃-V_HI-L₄-C_H1-Fc，其中：V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重链恒定域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重链恒定域；Fc包含免疫球蛋白铰链区和C_H2、C_H3免疫球蛋白重链恒定域；L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对。在第三示例性形式中，所述多肽包含形成两个抗原结合位点的三个多肽链，其中第一条多肽链具有下式表示的结构：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L，其中第二多肽链具有下式表示的结构：V_H2-L₃-V_HI-L₄-C_H1-Fc，第三多肽链包含抗体Fc区，其中：V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重链恒定结构域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重链恒定域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重链恒定域；Fc包含免疫球蛋白铰链区和C_H2、C_H3免疫球蛋白重链恒定域；且L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对。在第四示例性形式中，所述多肽包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含由下式表示的结构：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L，且该第二多肽链包含由下式表示的结构：V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1，其中：V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重链恒定域；L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。

Wu等(2007)Nat Biotechnol.25:1290-7中首先描述了一种称作四价双特异性串联免疫球蛋白(TBTI)或双可变域免疫球蛋白(DVD-Ig)的双特异性四价免疫球蛋白。像常规IgG一样，TBTI-DVD-Ig包含两条重链和两条轻链。然而，TBTI-DVD-Ig的重链和轻链均包含另外的可变域，其通过柔性的、天然存在的接头序列在现有单克隆抗体的VH和VL的N末端连接。因此，当重链和轻链组合时，所得的TBTI-DVD-Ig包含四个抗原识别位点。还参见美国专利号9,029,508；9,109,026；9,035,027；9,046,513,8,388,965；9,732,162；9,738,728；欧洲专利号2573121B1，以及WO2012/135345，其各内容通过提述以其整体并入本文。

US 2017/00320967和WO 2017/180913(其内容通过提述以其整体而明确地并入本文)描述了包含形成三个抗原结合位点的四个多肽链的结合蛋白(如三价和/或三特异性抗体)。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三价的。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性的。在一个示例性形式中，所述第一多肽链包含由下式表示的结构：V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L；第二多肽链包含由下式表示的结构：V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-铰链-C_H2-C_H3；第三多肽链包含由下式表示的结构：V_H3-C_H1-铰链-C_H2-C_H3；第四多肽链包含由下式表示的结构：V_L3-C_L，其中V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_L3是第三免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；V_H3是第三免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重链恒定域；且L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对；且其中第二多肽链或第三多肽链包含氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ IDNO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，接头L₁、L₂、L₃和L₄的长度范围为无氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸，或小于100、50、40、30、20或15个氨基酸或更少。接头的长度也可为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。一个结合蛋白中的L₁、L₂、L₃和L₄可全部具有相同的氨基酸序列，或者可全部具有不同的氨基酸序列。

合适的接头的实例包括单个甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:21)；具有五个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:22)；具有六个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:23)；具有七个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:24)；具有八个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQID NO:25)。可使用氨基酸残基的其他组合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:26)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:27)和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:28)。其他合适的接头包括单个Ser和Val残基；二肽Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:29)、Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:30)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ IDNO:39)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO:31)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ IDNO:37)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO:32)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:33)和His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO:34)。以上所列举的实例不意欲以任何方式限制本公开的范围，并且已经显示包含随机选择的氨基酸的接头适用于结合蛋白，所述氨基酸选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。

接头中氨基酸残基的同一性和序列可以根据在接头中实现所需的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸最适合具有最大柔韧性的接头。如果需要更刚性和延伸的接头，则甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的某些组合是有用的。取决于合意的性质，任何氨基酸残基都可被认为是接头与其他氨基酸残基组合以根据需要构建更大的肽接头。

在一些实施方案中，L₁的长度是L₃的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L₂的长度是L₄的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L₁的长度是L₃的长度的至少两倍，且L₂的长度是L₄的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L₁的长度为3至12个氨基酸残基，L₂的长度为3至14个氨基酸残基，L₃的长度为1至8个氨基酸残基，且L₄的长度为1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，L₁的长度为5至10个氨基酸残基，L₂的长度为5至8个氨基酸残基，L₃的长度为1至5个氨基酸残基，且L₄的长度为1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L₁的长度为7个氨基酸残基，L₂的长度为5个氨基酸残基，L₃的长度为1个氨基酸残基，且L₄的长度为2个氨基酸残基。

在一些实施方案中，L₁、L₂、L₃和/或L₄包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，L₁包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，L₃包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:35)。

在一些实施方案中，L₁、L₂、L₃和/或L₄包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中，L₁包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ IDNO:33)。在一些实施方案中，L₁包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:33)，L₂包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:36)，L₃包含序列Ser，且L₄包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L₃包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中，L₁包含序列Ser，L₂包含序列Arg-Thr，L₃包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:33)，且L₄包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:36)。

在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列；第二多肽包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列；第三多肽包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列，且第四多肽包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。(SEQ ID NO:12、13、14和15分别对应于WO 2017/074878中公开的SEQ ID NO:3、4、1和2)。另外的示例性三特异性抗体的氨基酸序列描述于WO 2017/074878中，其内容通过提述以其整体并入本文。

经设计用于产生不对称和双特异性抗体样分子的链交换工程化域(SEED)平台基于在保守的CH3域内交换免疫球蛋白的结构相关序列。SEED CH3域中人IgA和IgG的交替序列产生两个不对称但互补的域，称为AG和GA。SEED设计允许高效生成AG/GA异二聚体，并且不利于AG/AG和GA/GA同源二聚体的形成。参见，例如Muda等(2011)Prot Engineering,Design&Selection.24(5):447-454和美国专利号8,871,912，其内容通过提述以其整体并入本文。

其他双特异性和多特异性抗体形式描述于Klein等,(2012)mAbs 4:6,653-663；Spiess等(2015)“Alternative molecular formats and therapeutic applications forbispecific antibodies.”Mol.Immunol.67(2Pt A):95-106；Egan等(2017)mAbs.9(1):68-84；Liu等(2017)Front Immunol.8:38；和Weidle等(2013)Cancer GenomicsProteomics.10(1):1-18中。

靶抗原

在某些实施方案中，待根据本文提供的方法定量的多肽(即，包含含有工程化突变的抗体重链恒定区的一部分的多肽)与靶抗原特异性结合。示例性靶抗原包括但不限于，A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称作VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称作MCP-1)、CCL3(也称作MIP-1a)、CCL4(也称作MIP-1b)、CCL5(也称作RANTES)、CCL7(也称作MCP-3)、CCL8(也称作mcp-2)、CCL11(也称作嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin))、CCL15(也称作MIP-1d)、CCL17(也称作TARC)、CCL19(也称作MIP-3b)、CCL20(也称作MIP-3a)、CCL21(也称作MIP-2)、CCL24(也称作MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称作TECK),CCL26(也称作嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称作FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称作B7-1)、CD86(也称作B7-2)、CD122、CD137(也称作41BB)、CD137L、CD152(也称作CTLA4)、CD154(也称作CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称作PDL2)、CD274(也称作PDL1)、CD275(也称作B7H2)、CD276(也称作B7H3)、CD278(也称作ICOS)、CD279(也称作PD-1)、CDH1(也称作E-钙粘素)、几丁质酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称作M-CSF)、CSF-2(也称作GM-CSF)、CSF-3(也称作GCSF)、CX3CL1(也称作SCYD1)、CXCL12(也称作SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称作IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称作b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦蛋白、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称作IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称作IL7Ra的共受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称作GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人抗原靶标。在其中包含含有工程化突变的抗体重链恒定区的多肽是双特异性或多特异性靶结合蛋白的实施方案中，靶抗原可以是以上列举的示例性抗原中的任何两种(或更多种)。

缀合物

在一些实施方案中，将待根据本文提供的方法定量的多肽(即，包含含有工程化突变的抗体重链恒定区的多肽)与药物例如细胞毒剂、化学治疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)缀合。示例性药物包括但不限于道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶。示例性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素、格尔德霉素、美登素(或其他美登素类化合物)、奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、加利车霉素、相思豆毒素A链、蒴莲素(modeccin)A链、α-八叠球菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)和CC1065。细胞毒剂和使药剂与抗体缀合的接头是本领域已知的；参见，例如Parslow,A.C.等(2016)Biomedicines 4:14和Kalim,M.等(2017)Drug Des.Devel.Ther.11:2265-2276。

在一些实施方案中，将待根据本文提供的方法定量的多肽(即，包括含有工程化突变的抗体重链恒定区的多肽)与能够直接或间接产生可检测的信号的可检测部分缀合。在某些实施方案中，可检测标记物是放射性核素。多种放射性核素可用于生产放射性缀合的多肽，用于临床和研究目的。实例包括¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁹F、³²P、⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³¹In、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、²¹²Bi、²¹²Pb和Lu、Mn、Fe和Gd的放射性同位素。在某些实施方案中，可检测标记物是荧光或化学发光的化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或一种酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

前述书面描述被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。提供以下实施例仅用于说明目的，而不意欲以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中显示和描述的那些之外，根据前述描述，各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：鉴定用于通用的基于质谱的测定中的替代肽，以检测样品中包含抗体重链恒定区的多肽

应用以下选择标准来鉴定替代肽用于经由质谱检测生物样品中治疗性抗体：

·长度为6-26个氨基酸；

·无相邻的内肽酶切割位点；

·肽序列中没有甲硫氨酸(M)或半胱氨酸(C)；

·肽序列中没有其后为甘氨酸或丝氨酸的天冬酰胺(即，NG或NS)；

·衍生自抗体重链的恒定区；和

·含有至少一个工程化取代突变(即，排除自然存在的多态性)。

首先，将三种示例性治疗性抗体的Fc序列进行比对。参见图1。SEQ ID NO:1是抗靶标A抗体重链的一部分。SEQ ID NO:1不包含工程化突变。SEQ ID NO:2是三特异性构建体(即，“TRI-1”)的第一链(即“链1”)的一部分。TRI-1-链1包含抗体重链，该抗体重链包含S354C和T366W突变(即“突起”突变)和M428L/N434S突变(其延长TRI-1的体内半衰期)。SEQID NO:3是TR1的第二链(即“链2”)链的一部分。TRI-1-链2包含含有Y349C/T366S/368A/407V“穴”突变和M428L/N434S突变的抗体重链。SEQ ID NO:4是第二个三特异性构建体(即“TRI-2”)的第一链(即“链1”)的一部分。TRI-2-链1包含含有Y349C/T366S/368A/407V突变(即“穴”突变)和M428L/N434S突变的抗体重链。SEQ ID NO:5是TR2的第二链(即，“链2”)的一部分。TRI-2-链2包含含有S354C/T366W“突起”突变和M428L/N434S突变的重链。上面讨论的所有氨基酸位置均根据EU编号方案进行编号。

含有至少一个工程化取代突变的候选肽用下划线标出，该候选肽被预测为由图1中所示序列的胰蛋白酶消化产生。肽TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)满足以上列出的所有标准。

接下来，使用TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)(即“工程化TTPP肽”)作为针对小鼠、食蟹猴和人蛋白质数据库的查询序列进行BLAST搜索，以确定此类序列是否在这些物种中的任何天然蛋白质中发现。与工程化TTPP肽表现出100％氨基酸同一性的仅有序列是已知的突起入穴抗体。与工程化TTPP肽表现出94％氨基酸同一性的其他序列对应于含有除Y407V以外的Y407取代突变的人Fc域和内源性人Fc域。

进行以下描述的实验以评估三特异性构建体TRI-1的胰蛋白酶消化产生工程化TTPP肽的可行性。简言之，根据制造商的说明书，使用SMART^TM Digest试剂盒(ThermoFisher)消化10μg的TRI-1(其包含图1所示的SEQ ID NO:2和3)。将消化反应液在70℃温育，同时以1400rpm摇动75分钟。然后将消化的样品以1000x g离心2分钟，并收集上清液用于纯化和浓缩。

用200μL乙腈平衡SOLAμHRP固相提取(SPE)板(ThermoFisher)中所需的孔数，然后用200μL的0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液调节。然后将另外的400μL的0.1％TFA水溶液添加到每个孔中。将样品上清液加入孔中，并使其通过。然后用500μL的0.1％TFA水溶液洗涤孔，然后用500μL的0.1％甲酸水溶液洗涤孔。消化的样品用具有0.1％甲酸的2x25μL的80％乙腈水溶液洗脱。用50μL的0.1％甲酸水溶液稀释洗脱液，并以400rpm短暂涡旋。

使用Waters H-Class Acquity UPLC与在典型肽图分析条件下运行的ThermoQExactive质谱仪偶联的液相色谱-串联质谱分析50μL每种消化的样品。

如图2A-2C所示，TRI-1的胰蛋白酶消化可再现地产生工程化TTPP肽，且所述肽易于被检测和片段化。图2A中显示了m/z为905.40-907.60的提取离子色谱图，这是工程化TTPP天然同位素范围的子集。工程化TTPP在约19分钟时被洗脱。在总离子色谱仪中(图2B所示)，工程化TTPP是一个突出的峰。此外，工程化TTPP显示出良好片段化用于MS/MS分析(图2C)。

实施例2：血清中TTPP肽的检测

接下来，进行了一系列实验以确定是否可通过LC-MS/MS在人、猴和小鼠血清中检测到工程化TTPP肽，而没有明显的背景干扰。测试了小鼠和食蟹猴血清，因为这些动物通常用于临床前治疗性抗体研究。

简言之，将100μL涡旋的G蛋白磁珠(Pierce)和100μL PBST添加至96孔微板(Qiagen)的孔中。轻轻摇动板以确保均匀的混合物。将96孔板放置在Alpaqua 96S SuperMagnet 96孔磁体上1分钟，然后放置Qiagen A型96孔磁体1分钟，然后去除溶液。用200μLPBST将该洗涤周期再重复3次。洗涤完成后，将140μL的PBST添加至含有珠的每个孔中。然后，将30μL(1)小鼠血清、(2)猴子血清、(3)人血清或(4)2μg/mL TRI-1添加到孔中。将30μL的校准品、QC和样品添加到含有珠、PBST和血清的单独孔中。然后覆盖96孔板，并以600RPM摇动1小时，并洗涤四次。通过向每个孔中加入90μL的0.1％TFA，并轻轻涡旋板以确保均匀混合物，来洗脱校准品、QC和样品。将板放置在Alpaqua 96S Super Magnet 96孔磁体上1分钟，然后放置在Qiagen Type A 96孔磁体上1分钟。然后，将洗脱液转移到2.0mL 96孔深孔Protein LoBind板(Eppendorf)中。然后重复洗脱程序。用20μL的1M tris-HCl pH 8中和洗脱液的pH，使总体积达到200μL。简单地，将200μL的SMART消化缓冲液添加到每种洗脱液中。将样品在70℃以400rpm摇动温育75分钟，然后以1000x g离心2分钟以沉淀SMART消化树脂。

用200μL的乙腈平衡SOLAμ HRP SPE板中的孔，然后用200μL的0.1％TFA水溶液调节。向每个孔中添加另外400μL的0.1％TFA水溶液。将每种样品上清液添加到单独的孔中，并使其通过。用500μL的0.1％TFA水溶液洗涤孔，然后用500μL的0.1％甲酸水溶液洗涤。消化的样品用具有0.1％甲酸的2x25μL的80％乙腈水溶液洗脱。用50μL的0.1％甲酸水溶液稀释洗脱液，并以400rpm短暂涡旋。

在标准肽图分析条件下，使用Waters H-Class Acquity UPLC和ThermoQExactive质谱仪分析样品的SMART消化物。

空白血清中工程化TTPP肽(m/z 905.47²⁺)的提取离子色谱图如图3A-3C所示，TRI-1消化物(PBST中2μg/mL)中工程化TTPP肽的提取离子色谱图如图3D所示。TRI-1消化物中20.65分钟处的峰在任何测试的血清背景中不存在。

为了确认可在血清背景中检测到工程化TTPP肽，将小鼠、猴和人血清样品掺杂/加标有20μg/mL TRI-1，并如上所述进行抗体下拉、消化和质谱分析。

工程化TTPP肽(m/z 905.47²⁺)的提取离子色谱图如图4A-4C所示，而PBST中的TRI-1消化如图4D所示。将TRI-1掺入每种血清背景后，可清楚地在所有背景中看到工程化TTPP肽。

准备将TRI-1连续稀释至适当的血清背景中，使其最终浓度为0.2、2和20μg/mL，以确定信号是否与样品中分析物的量成正比增加。没有抗体掺入的血清等分试样用作背景对照。如上所述进行下拉、消化、SPE净化和LC-MS/MS。

从PBST中TRI-1的三个测试浓度(20、2和0.2μg/mL)的分析中衍生的工程化TTPP、未标记的FNWY和FNWY(重)的提取离子色谱图分别在图5A-5C、6A-6C和7A-7C中示出。从小鼠血清中TRI-1的四个测试浓度(20、2、0.2和0μg/mL)的分析中衍生的工程化TTPP、未标记的FNWY和FNWY(重)的提取离子色谱图分别在图8A-8C、9A-9C和10A-10C中示出。从猴血清中TRI-1的四个测试浓度(20、2、0.2和0μg/mL)的分析中衍生的工程化TTPP、未标记的FNWY和FNWY(重)的提取离子色谱图分别在图11A-11C、12A-12C和13A-13C中示出。从人血清中TRI-1的四个测试浓度(20、2、0.2和0μg/mL)的分析中衍生的工程化TTPP的提取离子色谱图在图14A-14C中示出。

测定了工程化TTPP肽和重同位素肽FNWYVDGVEVHNAK(SEQ ID NO:10)的峰面积。参加下表2。FNWY(重)是衍生自稳定的同位素标记的通用单克隆抗体(SILU^TMMAB)的消化的内标。

表2.定量测定的结果的总结

PBST、小鼠血清和猴血清背景的工程TTPP与FNWY(重)的面积比也显示在表2中，并在图15A-D中相对于输入TRI-1浓度作图。表2中显示了PBST的工程化FNWY与FNWY(重)的面积比，并在图15A、15C和15D中相对于输入抗体浓度作图。

上面的数据证明，小鼠血清、猴血清或人血清中的TTPP肽几乎没有至没有背景干扰，并且TTPP肽生成的信号与样品中的肽量相关联。

表3.实施例1和2中的氨基酸序列

实施例3：TTPP替代肽在基于质谱的通用测定中用于检测和定量示例性三特异性抗体的用途。

概述

治疗性抗体是用于靶向疾病的有吸引力的工具，其市场正在快速增长。配体结合测定法是测量治疗性抗体的标准方法。然而，为了为它们的发展提供支持，新的生物分析策略是必要的。LC-MS/MS代表一种互补性方法，可提供良好实验室规范(GLP)研究所需的特异性和更高的重现性。而且，LC-MS/MS克服了与配体结合测定(LBA)相关的一些局限性，如基质干扰(例如，样品中可能阻碍治疗性抗体准确定量的组分)和试剂的开发，其可能是昂贵的且耗时的。

IgG代表目前临床上的大多数治疗性蛋白质。为了降低免疫原性，将治疗性抗体工程化以包含人抗体恒定区，如人IgG恒定区。由于难以选择可用于区分样品(例如血浆、血清或血液样品)中内源性人IgG与治疗性IgG抗体而无需免疫亲合步骤的帮助的合适替代肽，因此开发生物分析LC-MS测定法来定量此类治疗性抗体一直是挑战性的。为了克服此问题，将示例性治疗性抗体的恒定区经工程化改造成包含取代突变，例如，在人抗体恒定区或非人灵长类或临床前动物(例如小鼠)的抗体恒定区中非天然发现的取代突变。该策略允许准确定量非人样品和人样品中治疗性抗体，而无基质干扰。

下文描述了一种无需亲和提取的LC-MS/MS测定法，其可快速准确地定量血浆中针对可溶性靶标的三价三特异性抗体。通过避免免疫亲和步骤，该方法会允许准确定量总药物(靶结合药物加游离药物的和)。而且，因为取代突变在抗体恒定区中，所以此方法可用于定量包含抗体恒定区的任何治疗性蛋白质。

分析程序

通过LC-MS/MS选择用于定量示例性三特异性抗体的替代肽示于图16和17以及下表4中。基于它们的线性响应选择这些替代肽。使用其序列未在人蛋白质或非人灵长类的蛋白质中发现的肽(即，SEQ ID NO:7、16和38)。为了进行绝对定量，使用工程化肽TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)(参见图16和17以及下表4)。为了确保分析物的完整性，在通过LC-MS/MS定量的样品中监测TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)和表4中列出的其他肽的峰下面积之间的比率。比率在所有时间点均保持恒定(结果未显示)。

表4.替代肽列表及其检测的MS参数

TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)的稳定的同位素标记的形式用作内标(图19B)。

开发了快速且强大的工作流程以支持临床前研究(参见图18)。该方法基于Ouyang等(2012)Bioanalysis.4(1),17-28中描述的沉淀消化方案。优化了消化方案的每个步骤，以使从样品中回收三特异性抗体和检测替代肽最大化。(来自人受试者的样品的工作流程在变性步骤之前包括蛋白A免疫纯化步骤)。

该方法仅使用10μL的血浆样品。由于少量样品就足够，因此替代肽定量方法适用于测量来自例如啮齿动物的临床前样品。标准消化时间也得到优化。当样品在37℃消化2小时时，观察到最佳信号强度。为了进一步提高定量方法的灵敏度，对样品进行了固相提取(SPE)。使用OASIS MCX盒获得了最佳的回收。

大鼠血浆的验证

在大鼠血浆中进行方法验证，以支持GLP毒理学研究。选择二次回归模型，其在三个独立的校准曲线上的平均回归系数为0.979，其中三个重复运行且具有8个标称浓度(图19A)。通过测量在三种独立制备物的LLOQ(最低定量限)、低、中间和高处的质量控制(QC)样品的准确性和精度来评估分析的变异性。表5总结了运行内/运行间的准确性和精度。通过使用六批不同的血浆进行基质效应(参见下表6)。在-80℃和在37℃储存1-3和6个月的掺杂/加标的人血浆中评价抗体在血浆中的稳定性。在这些时间间隔期间未观察到降解。

表5.三个独立样品在LLOQ、低、中间和高处的运行间和运行内准确性和精度

表6.六个独立批次的大鼠血浆的基质作用

进行了另外的实验，以确定当替代TTPP肽(SEQ ID NO:7)被掺入到猴血浆和人血浆中时，使用替代TTPP肽(SEQ ID NO:7)是否能检测到5μg/ml的三特异性抗体。如图22A-22F所示，在掺杂/加标的大鼠血浆(图22B)、掺杂/加标的猴血浆(图22D)和掺杂/加标的人血浆(图22F)中检测到TTPP肽，但在空白大鼠血浆(图22A)、空白猴血浆(图22C)或空白人血浆(图22E)中未检测到。

如本文其他地方所讨论的，配体结合测定法(LBA)，如ELISA，传统上已用于检测和定量生物样品中的治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)。经由LBA对单克隆抗体的定量通常涉及使用靶抗原作为捕获剂或检测剂。但是，如果将LBA用于检测三特异性抗体和三特异性抗体的可溶性靶标，则可能会产生不准确的结果。对于三特异性抗体，通过LBA定量将需要开发三种不同的测定法(即，每个靶抗原一种测定法)，这会产生三种不同的浓度数据集，这对于临床前物种或人PK暴露评估而言是无法管理的。而且，使用LBA很难区分样品中游离抗体与靶标结合的抗体与总抗体的量。在该实施例中，可用于临床前和临床阶段的通用LC-MS测定法被显示能够以高准确度测量针对可溶性靶标的三特异性抗体。如通过空白血浆样品中不存在干扰信号所证明的，显示该测定法是特异性的(参见图20A-20F)。如表5中所示，也显示此测定法是可再现的，其准确度％差异估计值以及运行间和运行内％精度均在由FDA和EMA关于生物分析方法验证的指南限定的国际监管接受标准之内(即，准确度％不大于±20％，精度％不大于±20％)。

临床前物种的材料和方法

提供的三特异性抗体作为原液，在10mM组氨酸、8％蔗糖、0.04％聚山梨酯80，pH6.0中的标称浓度为25mg/mL。通过在大鼠血浆中稀释原液获得校准标准品和QC。

含有三特异性抗体的大鼠血浆的沉淀消化是根据先前在Ouyang等(2012)Bioanalysis.4(1),17-28中描述的程序优化的。简言之，将10μl每份含三特异性抗体的大鼠血浆样品放入1.5mL Lobind管中，并与等体积的pH 7.4的PBS缓冲液混合。通过向管中加入30μL甲醇而沉淀每份样品中的血浆蛋白和治疗性抗体。涡旋后，将样品在5℃以2000rcf(相对离心力)离心6分钟。弃去上清液，将蛋白质沉淀重悬于40μl的200mM碳酸氢铵缓冲液(ABC)中。将5μl的1M二硫苏糖醇(DTT)添加到每个重悬的沉淀中，并在缓慢搅拌下于56℃温育30分钟。然后将样品在室温冷却10分钟。接下来，将10μl的内标工作溶液(100μg/mL)添加到每个样品中并混合。将样品与10μL的碘乙酰胺(IAA)(100mM)在100mM ABC缓冲液中在室温在轻轻旋转下进一步温育30分钟，同时避光。将30μg/mL的胰蛋白酶和100μL的ABC缓冲液添加至每个样品中，然后在室温在轻轻旋转下将样品温育2小时。

用30μL 10％甲酸(FA)终止消化反应，并在5℃以16000rcf离心10分钟。使用正压处理器歧管，用OASIS MCX洗脱板对上清液进行固相提取(SPE)。简言之，将板用200μL的甲醇平衡，然后用200μL的0.5％FA平衡。将200μL的每个上清液施加到板上，并用200μL的0.5％FA、200μL的0.5％FA的80％MeOH溶液和200μL的0.5％FA的20％MeOH溶液洗涤。最后用2x25μL的氢氧化铵缓冲液5％/甲醇(40:60，v/v)洗脱样品。在200μL的水/甲酸(100:0.5，v/v)中稀释10μL的提取物。将10μL的各洗脱样品用于LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析是使用运行

软件版本1.6.2的SCIEX三重四极子API5500质谱仪进行的。该系统连接到AGILENT 1290INFINITY液相色谱系统。使用X-BridgeProtein BEH C4柱；

(Waters 100x2.1mm ID,3.5μm粒度)在50°及溶剂A(0.1％FA)和B(乙腈中0.1％FA)的梯度进行色谱分析。用溶剂A平衡2.5分钟后，在5分钟后以600μL/分钟的流速将水溶液调至55％。

以正模式采集MS数据，其中离子喷雾电压为5500V，源温度为600℃，去溶剂化温度为60℃。针对每种肽优化了CE能量(参见表4)。

人样品的材料和方法

使用安捷伦的

BRAVO液体处理平台进行亲和纯化，如下所示：在96孔板中，依次添加90μl PBST和10μl人血浆样品。将板涡旋5分钟，并将其放置在BRAVO平台上维持在约20℃的位置4上。在96孔板上装满20μl的1M Tris，并以依次顺序将以下溶液装满储液池：灌注和平衡缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水(PBST))，盒洗涤液1(PBST中的1MNaCl)，盒洗涤液2(PBST)以及洗脱和注射器洗涤缓冲液(1％甲酸)。接下来，运行

BRAVO液体处理平台上的亲和纯化方案。

如下进行变性、还原、烷基化和消化：将位置9中的96孔板离心30秒。依次添加50μl在50mM碳酸氢铵中的0.2％RAPIGEST^TM表面活性剂和20μL在100mM碳酸氢铵中的100mM DL-二硫苏糖醇。接下来，将板离心30秒，并在轻微搅拌下在约56℃温育30分钟。样品在室温冷却。添加20μL在50mM碳酸氢铵中的250mM碘乙酰胺和50μl在200mM碳酸氢铵@0.01％

20中的ISW。将该板离心30秒，然后在避光条件下在约20℃在轻微搅拌下温育30分钟。添加100μL在50mM碳酸氢铵中的1μg/μL新鲜胰蛋白酶，并将样品在约37℃温育过夜。然后添加20μL的10％甲酸水溶液(以终止消化)。

如下进行使用Oasis PRIME MCXμ洗脱板的固相提取：将200μL每种上清液施加到板上，并用200μL 0.5％FA和200μL 0.5％FA的80％MeOH溶液洗涤。最终用50μL的氢氧化铵缓冲液5％/甲醇(40:60，v/v)洗脱样品并将150μL含0.5％甲酸的水添加入洗脱的样品。将板加载入保持在+10℃的自动进样器托盘中，并注入10μL的每种样品。

如上文用于临床前样品所述，对人血浆样品进行LC-MS/MS分析。

表7.实施例3中的氨基酸序列

实施例4：在基于质谱的通用测定中使用TTPP替代肽检测和定量施用至小鼠后的示例性三特异性抗体的概念研究证明

材料/方法

本实施例中使用的材料为：三特异性抗体、血清(小鼠)、蛋白G树脂尖端(安捷伦)、C18树脂尖端(安捷伦)、SILU^TMMAB稳定同位素标记的通用单克隆抗体内标(Sigma)、重标记的工程化肽内标(Thermo)、50mM碳酸氢铵、具有550mM Tris碱pH 8的8M尿素、1M氯化钠的磷酸盐缓冲盐水、125mM二硫苏糖醇、250mM碘乙酰胺、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶(Promega)、LysC(Promega)、水、乙酸、三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙腈

校准曲线准备：

通过在小鼠血清中连续稀释三特异性抗体来准备校准曲线。在此概念研究的证明中测试的浓度为0.012、0.024、0.049、0.098、0.195、0.391、0.781、1.563、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800μg/mL。将无三特异性抗体的血清用作零点。

稳定同位素标记的内标准备：

在使用当天，将500μL 0.1％的甲酸添加到SILU^TMMAB稳定同位素标记的通用单克隆抗体(Sigma Aldrich)的100μg小瓶中，并按照制造商的说明使其在室温放置。抗体浓度为0.2μg/L。

重标记的工程化肽内标准备：

将2.5mL 5％乙腈和0.1％甲酸添加到冻干的TTPP肽(49nmol)中以达到19.6pmol/lL的浓度。在使用当天，将TTPP肽的浓度在含0.1％甲酸的40％乙腈中稀释至0.08pmol/μL。

使用自动液体处理平台(Agilent BRAVO^TM)的高通量测定，用于定量血清中的三特异性抗体

亲和纯化

对于每个校准曲线样品或待检测的血清样品，将10μL的每种样品添加到96孔微板中的单独孔。接下来，向每个孔中添加10μL另外的小鼠血清和30μL的0.2μg/μL稳定同位素标记的通用单克隆抗体内标。将96孔板放在自动液体处理平台(Agilent BRAVO^TM)的台面上，并运行包括以下步骤的亲和纯化方案：

1.初始注射器洗涤

2.灌注(100μL PBS以300μL/分钟)

3.平衡(50μL PBS以10μL/分钟)

4.加载样品(20μL以5μL/分钟)

5.杯洗涤1(25μL去离子水)

6.内部盒洗涤1(50μL PBS中1M NaCl以10μL/分钟)

7.杯洗涤2(25μL去离子水)

8.内部盒洗涤2(50μL PBS以10μL/分钟)

9.严格的注射器洗涤(50μL 5％乙酸)

10.洗脱(10μL 5％乙酸以5μL/分钟)

消化：

将含有洗脱的样品的96孔板放在自动液体处理平台(Agilent BRAVO^TM)的台面上，并进行包括以下步骤的消化方案：

1.将含550mM Tris pH 8的40μL 8M尿素转移到每个孔中。

2.将4.3μL 125mM DTT转移至孔中，然后在40℃温育60分钟。

3.将4.7μL 250mM IAM转移至孔中，然后在25℃温育60分钟。

4.将111μL的50mM碳酸氢铵转移到每个孔中。

5.将20μL的0.5μg/μL胰蛋白酶(1:10酶:底物)和0.2μg/μL rLysC(1:25酶:底物)转移到每个孔中，并在37℃温育120分钟。

6.将20μL的10％TFA转移至每个孔中。

7.将30μL的0.08pmol/μL重标记的工程化肽(肽内标)转移至每个孔中。

C18净化：

将含有消化的样品的板放在安捷伦Bravo系统的台面上，运行包括由以下步骤组成的“肽净化”方案：

1.初始注射器洗涤

2.灌注(具有0.1％TFA的60％乙腈)

3.平衡(50μL 0.1％TFA以25μL/分钟)

4.加载样品(190μL以5μL/分钟)

5.杯洗涤(50μL去离子水)

6.内部盒洗涤(50μL 0.1％TFA以25μL/分钟)

7.严格注射器洗涤(具有0.1％TFA的50μL 60％乙腈)

8.洗脱(具有0.1％TFA的20μL 60％乙腈以5μL/分钟)

LC-MS/MS：

将每个洗脱的样品(20μL于含0.1％TFA的60％乙腈中)立即用35％的乙腈和0.1％甲酸的溶液稀释至100μL，以获得40％乙腈和0.1％甲酸。将每个样品转移到单独的LC-MS小瓶中，并在LC-MS/MS系统上进行分析。保留时间、亲本质量、过渡和优化的片段化条件取决于肽序列和用于分析的仪器而变化。TTPP肽(TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7))在以下条件下在与SCIEX

6500 LC-MS/MS系统偶联的

ACQUITY

I-Class液相色谱系统上进行了分析：

柱：Waters Acquity UPLC肽BEH C18(2.1x150mm,1.7μm)

柱温：30℃

样品注射梯度：开始梯度并在5％B保持1分钟。在17分钟内增加至40％B。流速为0.25mL/分钟。将流速增加到0.4mL/分钟。且90％B用于空白注射。

空白注射梯度：开始梯度并在90％B保持5分钟。流速为0.4mL/分钟。将流速降低至0.25mL/分钟。并在5％B保持3分钟。

流动相：A是含0.1％甲酸的水；B是含0.1％甲酸的乙腈

保留时间：12.9分钟

表8.质谱设置

	Q1质量	Q3质量	分散电位	碰撞能量	入口电压	碰撞池出口电势
							轻肽	905.5	804.4	64	39	10	16
重肽	909.5	808.4	64	40	13	16

对于本实施例，在2个不同日分析校准曲线样品和6份血清样品。通过腹膜内注射三特异性抗体每周两次给药小鼠，共7个剂量。处死时(末次给药后约30小时)收集通过LC-MS/MS分析的研究样品，包括给药盐水的对照动物(即，图21A和21B中的小鼠6)和给药30mg/kg的三特异性抗体的5只小鼠(即，图21A和21B中的小鼠1-5)。

LC-MS/MS后，通过绘制TTPP肽与其重标记肽内标物的比率与理论浓度的图，通过线性回归分析及1/x加权而分析每个血清校准曲线。图20A和20B显示了此分析的结果。两种血清曲线对于0.012μg/mL至800μg/mL的浓度范围均证明了良好的线性度(r平方≥0.99)和偏差(≤25％)。

如图21A所示，血清样品在大多数给药三特异性抗体的小鼠(#1-5)中显示出三特异性肽的较高水平，而在盐水给药的小鼠(#6)中显示出较低水平。在基于LC-MS/MS的测定中检测到的肽水平在这两次测定之间一致(图21A)。还使用ELISA分析这些样品(n＝4个重复)，并且ELISA分析的结果示于图21B中。通过LC-MS/MS或ELISA检测到的三特异性抗体的相对水平对于所有样品均显示出一致的趋势。

尽管本公开包括多种实施方案，但是应当理解，本领域技术人员会想到各种变化和修饰。因此，意欲所附权利要求书覆盖落入本公开范围内的所有此类等同变化。此外，本文中使用的章节标题仅用于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

本申请中引用的所有参考文献均通过在此提述而明确地并入。

序列表

<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)

<120> 用于定量多肽的方法

<130> 18395-20282.40

<140> 尚未指定

<141> 与此同时

<150> US 62/617,080

<151> 2018-01-12

<160> 39

<170> Windows版本4.0的FastSEQ

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

Lys

225

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu

195 200 205

Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

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<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu

195 200 205

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210 215 220

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

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1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

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Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

Lys

225

<210> 5

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

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1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

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Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

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1 5 10 15

Lys

<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

1 5 10

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 11

Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys

1 5

<210> 12

<211> 611

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 12

Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Ala

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Glu Met Asn Asn Val Arg Thr Glu Asp Thr Gly Tyr Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro

100 105 110

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115 120 125

Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gln Val His Leu Thr Gln Ser Gly

130 135 140

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Pro Gly Asn Thr Leu Lys Thr Tyr Asp Leu His Trp Val Arg Ser Val

165 170 175

Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp Ile Ser His Glu Gly Asp

180 185 190

Lys Lys Val Ile Val Glu Arg Phe Lys Ala Lys Val Thr Ile Asp Trp

195 200 205

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210 215 220

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Asp Val Asp Tyr Leu Ser Asn Leu Glu Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala

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275 280 285

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

340 345 350

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

485 490 495

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

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530 535 540

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545 550 555 560

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

580 585 590

Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

595 600 605

Ser Pro Gly

610

<210> 13

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 13

Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser His Ser Leu Ile His Gly

20 25 30

Asp Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Arg Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

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Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp

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Val Leu Asp Lys Thr His Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

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Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

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275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 14

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Met Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ile Asp Cys

20 25 30

Thr Leu Asn Trp Ile Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Met

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65 70 75 80

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115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

420 425 430

His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 15

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ala Ile Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Tyr Gly Ser Leu Ala

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val Ile Tyr Ser

35 40 45

Gly Ser Thr Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg

50 55 60

Trp Gly Pro Asp Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser Gly Asp

65 70 75 80

Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Phe Phe Gly Gln Gly Thr

85 90 95

Lys Val Gln Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

180 185 190

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

195 200 205

Glu Cys

210

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 16

Leu Val Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Arg

1 5

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 17

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<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 18

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 19

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1 5 10 15

Lys

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 20

Leu Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 21

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 29

Thr Lys Gly Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 30

Thr Val Ala Ala Pro

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 31

Gln Arg Ile Glu Gly

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 32

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 33

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro

1 5

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 34

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1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 35

Asp Lys Thr His Thr

1 5

<210> 36

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 36

Thr Lys Gly Pro Ser Arg

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 38

Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 39

Gln Pro Lys Ala Ala

1 5

Claims

1.一种用于定量样品中包含抗体重链恒定区的一部分的多肽的量的方法，所述方法包括：

(a)消化所述包含多肽的样品，所述多肽包含抗体重链恒定区的一部分，其中所述抗体重链恒定区的一部分包含工程化突变，而且其中消化产生衍生自所述抗体重链恒定区的肽片段，所述肽片段长度为5-26个氨基酸并且包含所述工程化突变，

(b)通过质谱分析消化的样品以确定所述肽片段的量，由此确定所述样品中所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽片段不包含甲硫氨酸(M)或半胱氨酸(C)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肽片段不包含天冬酰胺(N)，其随后是甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括在所述质谱分析之前纯化和浓缩所述消化的样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述消化的样品通过固相提取(SPE)纯化和浓缩。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述消化的样品通过SISCAPA(稳定的同位素标准和通过抗肽抗体捕获)纯化和浓缩。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述样品是全血样品、血清样品、血浆样品或组织样品。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品来自小鼠、非人灵长类或人。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述非人灵长类是食蟹猴或恒河猴。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述样品用至少一种酶消化。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、谷氨酰内肽酶、赖氨酰内肽酶、Asp-N、Arg-C、Glu-C、溴化氰(CnBr)或其组合。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述质谱是液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS)。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多肽包含CH1域，并且其中所述CH1域包含所述工程化突变。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多肽包含CH2域，并且其中所述CH2域包含所述工程化突变。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多肽包含CH3域，并且其中所述CH3域包含所述工程化突变。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体重链恒定区的CH3域中的所述工程化突变是T366Y、T366W、T366S、L368A、T394W、T394S、F405A、F405W、Y407T、Y407V或Y407A。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗体重链恒定区的CH3域中的所述工程化突变为Y407V，并且其中所述CH3域包含SEQ ID NO:6(DGSFFLVS)所示的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述消化产生包含氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQ IDNO:9)的肽片段。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品用胰蛋白酶消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)组成的肽片段。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品用Asp-N消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)组成的肽片段。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品用Glu-C消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列GSFFLVSKLTVD(SEQ ID NO:9)组成的肽片段。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示的氨基酸序列。

23.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体重链恒定区的CH3域中的所述工程化突变是N434S。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品用Glu-C和胰蛋白酶消化，并且其中所述消化产生由氨基酸序列ALHSHYTQK(SEQ ID NO:11)组成的肽片段。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体、Fc融合蛋白或免疫粘附素。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述包含抗体重链恒定区的一部分的多肽是抗体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体是治疗性抗体。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述抗体是单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗体是三特异性抗体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述三特异性抗体包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，所述三个抗原结合位点特异性地结合一个或多个抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽包含由下式表示的结构：V_L2-L₁-V_L1-L₂-CL；第二多肽链包含由下式表示的结构：V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-铰链-C_H2-C_H3；第三多肽链包含由下式表示的结构：V_H3-C_H1-铰链-C_H2-C_H3；第四多肽链包含由下式表示的结构：V_L3-CL，其中V_L1是第一免疫球蛋白轻链可变域；V_L2是第二免疫球蛋白轻链可变域；V_L3是第三免疫球蛋白轻链可变域；V_H1是第一免疫球蛋白重链可变域；V_H2是第二免疫球蛋白重链可变域；V_H3是第三免疫球蛋白重链可变域；C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重链恒定域；L₁、L₂、L₃和L₄是氨基酸接头；其中所述第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对；且其中所述第二多肽链或所述第三多肽链包含氨基酸序列TTPPVLDSDGSFFLVSK(SEQ ID NO:7)、DGSFFLVSKLTV(SEQ ID NO:8)或GSFFLVSKLTVD(SEQID NO:9)。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述第二种多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述第三多肽包含SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列，并且所述第四多肽包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述抗体与药物或标记物缀合。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述药物选自化学治疗剂、细胞毒剂或生长抑制剂。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述标记物是放射性同位素、荧光染料或酶。

37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述抗体是人IgG抗体。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述IgG抗体是人IgG1抗体或人IgG4抗体。

39.根据权利要求27-32和34-38中任一项所述的方法，其中所述抗体结合A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4/VTCN1、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1b、CCL5/RANTES、CCL7/MCP-3、CCL8/mcp-2、CCL11/嗜酸细胞活化趋化因子、CCL15/MIP-1d、CCL17/TARC、CCL19/MIP-3b、CCL20/MIP-3a、CCL21/MIP-2、CCL24/MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸细胞活化趋化因子-3、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23/FCER2、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD122、CD137/41BB、CD137L、CD152/CTLA4、CD154/CD40L、CD160、CD272、CD273/PDL2、CD274/PDL1、CD275/B7H2、CD276/B7H3、CD278/ICOS、CD279/PD-1、CDH1/E-钙粘素、几丁质酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1/M-CSF、CSF-2/GM-CSF、CSF-3/GCSF、CX3CL1/SCYD1、CXCL12/SDF1、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb/IL25、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4/b4整合素、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦蛋白、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2/IL33的受体、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP/IL7Ra、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM或XCR/GPR5/CCXCR1。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述方法用于小鼠、非人灵长类和人中所述包含抗体重链恒定区的多肽的药代动力学研究。