JP2008546805A - 最適な凝集および断片化プロフィールを有する抗体製剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、被験体への非経口投与に適した抗体製剤の生成および精製を最適化する方法を提供し、この製剤は長期保存において抗体成分の分解および凝集の低下により安定性の増加を示す。このような方法は、このような製剤の、より厳格さの低いまたはより容易に利用可能な輸送/保存条件、ならびに治療的、予防的および診断的使用におけるより低頻度の投薬またはより少ない用量を含めた、最適化されていない方法によって生成される製剤を超える複数の利点を提供する製剤を提供する。本発明はさらに、本発明の製剤を利用する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本出願は、米国特許法第119条(e)下における、その全体が参考として本明細書中に組み込まれている2005年6月23出願の米国仮特許出願第60/693,603号および2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,614号の利益を請求するものである。
1.序
本発明は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、被験体への非経口投与に適した抗体製剤の生成および精製を最適化する方法を提供し、この製剤は長期保存において抗体成分の分解および凝集の低下により安定性の増加を示す。このような方法は、このような製剤の、より厳格さの低いまたはより容易に利用可能な輸送/保存条件、ならびに治療的、予防的および診断的使用におけるより低頻度の投薬またはより少ない用量を含めた、最適化されていない方法によって生成される製剤を超える複数の利点を提供する製剤を提供する。本発明はさらに、本発明の製剤を利用する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体製剤の生成および精製を最適化する方法を提供し、この製剤は長期保存において抗体成分の分解および凝集の低下により安定性の増加を示す。このような製剤は、RSV感染症の診断的、治療的または予防的治療に用い得る。
2.発明の背景
呼吸器合胞体ウイルス：
呼吸器感染症とは、上気道(たとえば、鼻、耳、洞、および咽頭)ならびに下気道(たとえば、気管、気管支、および肺)の一般的な感染症である。上気道感染症の症状には、鼻水または鼻詰まり、刺激、不穏状態、食欲不振、活動レベルの低下、咳嗽、および発熱が含まれる。ウイルス性の上気道感染症は、咽頭炎、風邪、クループ、およびインフルエンザを引き起こすおよび/またはそれに関連する。下気道感染症の臨床徴候には、肺に痰を生じる浅い咳嗽、発熱、および呼吸困難が含まれる。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、世界中で呼吸系疾患の主要な原因の1つである。米国では、これは毎年何万件もの入院および何千人もの死亡の原因となっている(RSVの生物学および管理の最近の概説には、Black, C.P.、Resp. Care、2003、48(3):209-31を参照)。幼児および小児が、下気道系に転位して肺炎または細気管支炎をもたらす重篤なRSV感染症の危険性が最も高い。実際、小児期細気管支炎の80%の症例および幼児期肺炎の50%がRSVに起因し得る。このウイルスは遍在性が高く、伝染性が高いので、ほぼすべての小児が2歳までに感染している。感染は持続する免疫を生じないが、再感染は重篤性が低い傾向にあるので、より年上の小児および健康な成人では、RSVは、重篤な下気道の併発に進行せずに上気道および/または下気道系を冒す風邪またはインフルエンザ様の病気として現れる。しかし、RSV感染症は高齢者または免疫無防備状態の成人において重篤となる場合がある。(Evans, A.S.編、1989、Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control、第3版、Plenum Medical Book、New York、525-544頁; Falsey, A.R.、1991、Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608;およびGarvie他、1980、Br. Med. J. 281:1253-1254; Hertz他、1989、Medicine 68:269-281)。
現在、RSVに対するワクチンは存在せず、有効な治療も存在しない。最近の臨床データは、RSV感染症の治療に認可されている唯一の薬物である抗ウイルス剤リバビリンの初期の期待を支持することに成功しなかった(Black, C.P.、Resp. Care、2003、48(3):209-31)。その結果、米国小児科学会は、リバビリンの使用を最も重篤な症例のみに限定するという新しい指針を発行した(Committee on Infectious Disease、American Academy of Pediatrics. 1996. Pediatrics 97:137-140; Randolph, A.G.、およびE.E. Wang.、1996、Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 150:942-947)。
ワクチンまたは有効な治療は捕らえどころがないことが証明されたが、重篤な上気道および/または下気道のRSV感染症の危険性が高い幼児の予防の分野では、ある程度の成功が達成されている。具体的には、危険性の高い幼児を重篤な下気道RSV感染症から保護するために認可された免疫グロブリンに基づいた治療が2つ存在し、それらはRSV-IGIV(RSV-免疫グロブリン静脈内、レスピガム(RespiGam)(商標)としても知られる)およびパリビツマブ(palivizumab)(SYNAGIS(登録商標))である。しかし、RSV-IGIVもパリビツマブも、下気道RSV感染症の予防剤として以外の使用が認可されていない。
RSVは、汚染分泌物との物理的接触によって容易に伝播する。ウイルスは、手の上で少なくとも30分間、カウンターおよび使用済みティッシュの上では何時間も生存することができる。RSVの非常に高い伝播性性質は、重篤な感染症の罹患に関連する危険因子から明らかである。最大の危険因子の1つは入院であり、一部の例では、小児科病棟の50%を超えるスタッフが感染していることが判明した(Black, C.P.、Resp. Care、2003、48(3):209-31)。これらの成人感染の20%までが無症候性であるが、それでも相当なウイルスの脱粒が生じる。他の危険因子には、託児所に通うこと、混雑した生活条件、および家庭内の就学年齢の兄弟姉妹の存在が含まれる。重要なことに、上気道および/または下気道からウイルスを取り除くために有効な薬剤は、その伝染の予防に有効である可能性が高い。したがって、重篤なRSV感染症の予防に有望な一手法は、ウイルスを上気道および/または下気道から取り除くまたは遮断する治療の開発である。
RSV-IVIGおよびパリビツマブは下気道RSV感染症の予防における顕著な進歩を表すが、どちらも、許容できる用量で上気道中のウイルスに対する有効性が実証されていない。実際、RSV-IVIGは、治療群のすべての動物において肺のRSVを取り除くために有効であった量で鼻腔スプレーとして投与した場合に、鼻のRSVを取り除くことができなかった(Prince他、米国特許第4,800,078号、1989年1月24日発行)。腹腔内投与経路でも、下気道と同じ有効性で上気道からRSVを取り除くことができなかった。上気道感染によって誘発される免疫応答は、下気道感染によって誘導される免疫応答とは異なることが、最近注目された(van Benten I.J.他、J. Med. Virol. 2003年10月;71(2):290-7)。したがって、上気道および/または下気道RSV感染症の予防および治療の必要性が存在する。
中耳炎：
中耳炎とは、中耳の感染症または炎症である。多くの場合、この炎症は咽頭炎、風邪、または他の呼吸器もしくは呼吸の障害を引き起こす感染症が中耳に伝播した場合に開始される。これらはウイルスまたは細菌感染症であることができる。RSVは、中耳炎と関連づけられている主要なウイルスである。小児の75%が、3回目の誕生日までに少なくとも1回の中耳炎の発症を経験する。これらの小児のうち、ほぼ半数がその最初の3年間に3回以上、耳感染症に罹患する。中耳炎が原因の医療費および逸失賃金は、米国で年間の合計50億ドルになると推定される(Gates GA、1996、Cost-effectiveness considerations in otitis media treatment. Otolaryngol Head Neck Sur. 114 (4): 525-530)。中耳炎は主に幼児および幼い小児の疾患であるが、成人を冒す場合もある。
中耳炎は、激痛を引き起こすだけでなく、治療しない場合は重篤な合併症をもたらし得る。未治療の感染症は、中耳から脳を含めた頭部の近隣部分へと移行することができる。中耳炎によって引き起こされる聴覚損失は通常一時的であるが、未治療の中耳炎は永久の難聴をもたらし得る。中耳に持続的に流体が存在することおよび慢性中耳炎は、言語発達に重要な時期に小児の聴覚を低下させる場合がある。頻繁な耳感染症から初期の難聴を患っている小児は、言語障害を有する可能性が高い。
多くの医師は耳感染症の治療に抗生物質の使用を勧めるが、抗生物質耐性が疾患の有効な治療において重要な問題となっている。さらに、中耳炎、特にRSVに関連するウイルス感染症を予防または治療するための新しい治療が必要である。
喘息および反応性気道疾患(RAD)：
米国で約120万人が喘息に罹患しており、これが小児の入院の主要な原因である。The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (第17版、1999)。
喘息とは、気道過敏症(「AHR」)、気管支収縮(すなわち喘鳴)、好酸球性炎症、粘液過剰分泌、上皮下線維症、およびIgEレベルの上昇を特徴とする肺の炎症性疾患である。喘息発作は、環境刺激(たとえば、ダニ、昆虫、動物(たとえば、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ラット、およびトリ)、真菌、空気汚染物質(たとえばタバコの煙)、刺激ガス、煙、蒸気、エアロゾル、化学物質、もしくは花粉)、運動、または冷気によって始動されることができる。喘息の原因は不明である。しかし、喘息の家族歴(London他、2001、Epidemiology 12(5):577-83)、塵ダニ、タバコの煙、およびゴキブリなどのアレルゲンへの早期曝露(Melen他、2001、56(7):646-52)、ならびにRSVなどの呼吸器感染症(Wenzel他、2002、Am J Med, 112(8):672-33およびLin他、2001、J Microbiol Immuno Infect、34(4):259-64)が、喘息の発生の危険性を高め得ると推測されている。危険因子、動物モデル、および炎症性マーカーを含めた喘息の総説は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているO'ByrneおよびPostma (1999)、Am. J. Crit. Care. Med. 159:S41-S66に見つけることができる。
現在の治療は、主に喘息を管理することに向けられており、β-アドレナリン作動性薬物(たとえばエピネフリンおよびイソプロテレノール)、テオフィリン、抗コリン薬(たとえば、アトロピンおよび臭化イプラトルピウム)、コルチコステロイド、ならびにロイコトリエン阻害剤の投与が含まれる。これらの治療は、薬物相互作用、口渇、かすみ目、小児における成長抑制、および閉経期の女性における骨粗鬆症などの副作用に関連している。炎症細胞からの介在物質の放出を阻害し、気道過敏症を軽減し、アレルゲンに対する応答を遮断するために、クロモリンおよびネドクロミルを予防的に投与する。しかし、喘息を発生する危険性の高い被験体において喘息の発生を予防するために利用可能な治療は現在存在しない。したがって、副作用がより少なく、予防上および/または治療上の有効性がより良好な新しい喘息の治療が必要である。
反応性気道疾患とは、喘息様の症状のより広範な(かつ多くの場合同義の)特徴づけであり、一般に、慢性咳、痰生成、喘鳴または呼吸困難を特徴とする。
喘鳴：
喘鳴(wheezing、sibilant rhonchiとしても知られる)とは、一般に、空気が狭窄した呼吸管、特に肺の奥深くに位置するより小さな細い気道を通ることによって生じる音を特徴とする。これは、RSV感染症、ならびに喘息および細気管支炎などの二次RSV状態の一般的な症状である。喘鳴の臨床的な重要性は、気道狭小化の指標であることであり、呼吸困難を示し得る。
喘鳴は、呼息の際(息を吐く)に最も明らかであるが、吸息(息を吸う)または呼息のどちらの際にも存在し得る。喘鳴はほとんどの場合より小さな気管支(胸部の奥深くの呼吸管)から生じるが、閉塞したより大きな気道からも起こり得る。
本明細書中の参考文献の引用または記述は、それらが本発明の従来技術であるという自白と解釈すべきでない。
3.発明の概要
本発明は、本発明者らが、完全長IgG1モノクローナル抗体、特にそれだけには限定されないがNS0細胞などの骨髄腫細胞中で組換えによって発現させたものの製剤の断片化および凝集プロフィールを分析するために、分析用超遠心(AUC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)または粒子計数分析などの高感度の分析技術を用いたことに基づいている。したがって、本発明は、従来の抗体製剤と比較して断片化および凝集プロフィールが改善されている(すなわち、断片化および/もしくは凝集の合計が低下している、または特定の種類の断片もしくは凝集体の量が減少している、または凝集もしくは断片化の率が低下している)抗体製剤を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、好ましくは治療または予防の標的に特異的な完全長IgG1抗体を含む抗体製剤を提供し、前記製剤の全タンパク質画分のうちの0.5%以下(しかし、特定の実施形態では、全タンパク質画分のうちの少なくとも0.1%または検出可能なレベル未満である)が、抗体I型断片を含む(または、他の実施形態では、検出可能なレベルまで不純物もしくは断片としてそれからなる)。他の実施形態では、前記製剤の全タンパク質画分のうちの0.5%以下(かつ、特定の実施形態では、全タンパク質画分のうちの少なくとも0.1%または検出可能なレベル未満である)が、抗体I型断片および抗体II型断片を含む(または、他の実施形態では、検出可能なレベルまで不純物もしくは断片としてそれらからなる)。好ましくは、抗体I型断片は、抗体の重鎖の1つまたは複数のC末端部分を含み、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された抗体の試料の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)分析によって決定された重鎖C末端部分の分子量は約25.6kD、約25.7kD、約25.8kD、約26.0kD、または約26.1kDである。さらに、抗体II型断片は抗体の重鎖の1つまたは複数のN末端部分を含み、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された抗体の試料のLC-MS分析によって決定された重鎖N末端部分の分子量は約24.4kD、約24.6kD、約24.7kD、約24.9kD、または約25.1kDである。さらに、抗体I型断片は重鎖の1つまたは複数のC末端部分を含んでいてもよく、重鎖C末端部分は、IgG1重鎖のアミノ酸残基223〜449(カバット(Kabat)ナンバリングに従う)、IgG1重鎖のアミノ酸残基224〜449、IgG1重鎖のアミノ酸残基225〜449、IgG1重鎖のアミノ酸残基226〜449、IgG1重鎖のアミノ酸残基227〜449、IgG1重鎖のアミノ酸残基228〜449およびIgG1重鎖のアミノ酸残基229〜449を含み、また、抗体II型断片は1つまたは複数の重鎖N末端部分を含み、これは、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜222、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜223、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜224、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜225、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜226、IgG1重鎖のアミノ酸残基1〜227またはI
gG1重鎖のアミノ酸残基1〜228を含む。特定の実施形態では、抗体製剤は任意の他の種類の断片を検出可能なレベルで含まない。特定の実施形態では、抗体製剤は、I型断片のうちの1、2、3、4、5、6もしくは7個および/またはII型断片のうちの1、2、3、4、5、6もしくは7個を含む。
特定の実施形態では、本発明の製剤は、直径2〜4μmが約3.4E+5未満の粒子/ml、直径4〜10μmが約4.0E+4未満の粒子/ml、直径10〜20μmが約4.2E+3未満の粒子/ml、直径20〜30μmが約5.0E+2未満の粒子/ml、直径30〜40μmが約7.5E+1未満の粒子/ml、および直径40〜60μmが約9.4未満の粒子/mlであり、かつ、粒子マルチサイザー(multisizer)によって決定された粒子プロフィールを含む(または凝集体画分としてそれからなる)。特定の実施形態では、製剤は、40μmを超える、または30μmを超える検出可能な粒子を含まない。他の実施形態では、本発明の製剤は、前記製剤の脱気した試料の濁度値が約6.4NTU(特定の実施形態では4〜8NTU、他の実施形態では、10NTU未満、8NTU未満、7NTU未満、または6.5NTU未満)である。
本発明の抗体製剤は、同様に、断片化および凝集の上記パラメータのうち1つまたは複数の組合せを有し得る。
本発明の抗体製剤は、好ましくは少なくとも10mg/mlの抗体、より好ましくは、15mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、150mg/mlまたは200mg/mlである。本発明の抗体製剤中の抗体は、治療的、予防的または診断的な有用性を有する任意の抗体であり得る。好ましい実施形態では、本発明の製剤中の抗体はRSVに特異的であり、具体的な実施形態では、パリビツマブではない。より特異的かつ好ましい実施形態では、抗RSV抗原はRSVのFタンパク質に結合し、特定の実施形態では、RSV抗原は、Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337)を含む、またはそれからなりさえする。他の実施形態では、抗体は、表2に記載の抗体の1つ、好ましくは抗体A4B4L1FR-S28Rであるか、または、表2に記載の抗体の1つ、好ましくはA4B4L1FR-S28Rとの結合に対して競合する。
本発明の抗体製剤は、好ましくは、保存に際して、たとえば、長期間(たとえば、それだけには限定されないが、6カ月、1年間、2年間、3年間もしくは5年間)、室温もしくは4℃で、または一定期間(それだけには限定されないが、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、6カ月もしくは1年間など)、38℃〜42℃などの高い温度で、改善された凝集および断片化プロフィールを維持する。このような製剤は、pH5〜7、好ましくはpH6.0であり得る。したがって、特定の実施形態では、完全長IgG1抗体を含む本発明の抗体製剤は、38〜42℃、pH6.0、1カ月、6カ月、9カ月または14カ月での保存に際して、(完全長IgG1抗体以外の、または断片画分として)1つまたは複数の抗体I型断片を含む、あるいはそれからなる。別の特定の実施形態では、完全長IgG1抗体を含む本発明の抗体製剤は、38〜42℃、pH6.0、1カ月、6カ月、9カ月または14カ月での保存に際して、(完全長IgG1抗体以外の、または断片画分として)1つまたは複数の抗体I型断片および1つまたは複数の抗体II型断片を含むか、あるいはそれからなる。保存に際して、タンパク質の合計量の割合としての断片のレベルは、好ましくは0.5%未満であり、特定の実施形態では、少なくとも0.1%または断片の検出可能なレベル未満である。
さらに、保存中、このような製剤は、好ましくは、それだけには限定されないが、0〜4℃、10〜15°、20〜24℃の室温、または38〜42℃の高温などの温度、およびそれだけには限定されないが、2週間、1カ月、6カ月、1年間、3年間または5年間などの長期間で、一定の凝集率および断片化率を示す。特定の実施形態では、抗体製剤は、任意の他の種類の断片を検出可能なレベルで含まない。したがって、特定の実施形態では、完全長IgG1を含む本発明の抗体製剤は、全タンパク質に対する凝集体の割合が、20〜24℃では0.2%/月〜0.35%/月だけ増加し、好ましくは4℃では0.02%以下/月だけ増加する。さらなる実施形態では、完全長IgG1を含む本発明の抗体製剤は、全タンパク質に対する断片の割合（％）が、20〜24℃では0.015%/月〜0.03%/月を超えて増加しない、好ましくは4℃では0.00%/月を超えて増加しない。特定の実施形態では、抗体製剤は、1、2、3、4、5もしくは6個もしくはI型断片を含む、および/またはII型断片のうちの1、2、3、4、5、6もしくは7個を含む。
特定の実施形態では、保存後、本発明の製剤は、直径2〜4μmが約3.4E+5未満の粒子/ml、直径4〜10μmが約4.0E+4未満の粒子/ml、直径10〜20μmが約4.2E+3未満の粒子/ml、直径20〜30μmが約5.0E+2未満の粒子/ml、直径30〜40μmが約7.5E+1未満の粒子/ml、および直径40〜60μmが約9.4未満の粒子/mlであり、かつ、粒子マルチサイザーによって決定された粒子プロフィールを含む(または凝集体画分としてそれらからなる)。特定の実施形態では、製剤は、40μmを超える、または30μm超える検出可能な粒子を含まない。他の実施形態では、本発明の製剤は、保存後、前記製剤の脱気した試料の濁度値が約6.4NTU(特定の実施形態では、4〜8NTU、他の実施形態では10NTU未満、8NTU未満、7NTU未満、または6.5NTU未満)である。
本発明の抗体製剤は、保存後、同様に、断片化および凝集の上記パラメータのうち1つまたは複数の組合せを有し得る。
本発明の他の態様は、上述の断片化および凝集パラメータのための、具体的な抗体製剤を最適化する方法を提供する。このような方法は、抗体を製造、精製および配合すること、ならびに1つもしくは複数のステップ、または最終製剤で、断片化および/または凝集のレベルについて、それだけには限定されないが、AUC、SEC、LC-MSまたは粒子マルチサイジングなどの方法を用いて監視し、その後、製造、精製および/もしくは配合プロセスの1つもしくは複数のステップの1つもしくは複数のパラメータまたは製剤自体を変化させ、パラメータを変化させることによって、断片化および/または凝集のレベルが低下するかどうかを評価することが含まれる。このようなスクリーニングおよび監視ステップによって、本発明の方法を用いて抗体製剤を最適化し得る。そのようなパラメータには、1つまたは複数のステップを実施する温度、抗体の凍結/解凍サイクルの短縮または排除、限外濾過などの濾過ステップの導入、1つまたは複数のカラムクロマトグラフィーステップの追加または変更、pHの変更などが含まれる。
本発明は、Fab断片を含む抗体であって、RSV抗原(たとえば、Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337))に免疫特異的に結合し、Fab断片のTmは少なくとも約87℃であり、前記抗体パリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ(motavizumab))、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、およびA17h4のいずれかではない抗体を提供する。具体的な実施形態では、このような抗体中のFabは、パリビツマブのFabとは異なる。別の実施形態では、このような抗体は、パリビツマブのVHまたはVLドメインとは異なるVHまたはVLドメインを含む。好ましい実施形態では、Fab断片のTmは少なくとも約90℃または少なくとも約93℃である。別の好ましい実施形態では、抗体のpIは約8.5〜9.5または約9.0〜9.5である。
別の具体的な実施形態では、抗体は、抗体A4B4L1FR-S28RのVHドメイン(配列番号48)を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、抗体A4B4L1FR-S28RのVLドメイン(配列番号11)を含む。さらに別の実施形態では、前記Fabは、抗体A4B4L1FR-S28RのFabである。
本発明はまた、1〜26℃の範囲の任意の温度で10.00cP未満の粘度を有する、上述した抗体を含む抗体製剤も提供する。
本発明はまた、38〜42℃の範囲の任意の温度で15%未満/日の凝集率を有する、上述した抗体を含む抗体製剤も提供する。
本発明はまた、予防上または治療上有効な量の、そのような抗体を含む抗体製剤を投与することを含む、被験体においてRSV感染症に関連する1つまたは複数の症状、たとえば、中耳炎、喘息、および喘鳴を予防、治療、または改善させる方法も提供する。一実施形態では、製剤を非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与または鼻腔内投与する。
本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する完全長IgG1抗体を含み、1〜26℃の範囲の任意の温度で10.00cP未満の粘度を有する抗体製剤も提供する。本発明はまた、38〜42℃の範囲の任意の温度で15%未満/日の凝集率を有する、任意のそのような抗体を含む抗体製剤も提供する。一実施形態では、抗体はパリビツマブではない。別の実施形態では、抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、およびA17h4のいずれかではない。
3.1用語
本明細書中、ポリペプチドとの関連で使用する用語「類似体」とは、RSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、もしくは抗体と類似または同一の機能を保有するが、必ずしもRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、もしくは抗体と類似もしくは同一のアミノ酸配列を含まない、またはRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、もしくは抗体と類似もしくは同一の構造を保有するポリペプチドをいう。類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、以下のうちの少なくとも1つを満たすポリペプチドをいう:(a)本明細書中に記載のRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体のアミノ酸配列と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド;(b)少なくとも5個のアミノ酸残基、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも25個のアミノ酸残基、少なくとも40個のアミノ酸残基、少なくとも50個のアミノ酸残基、少なくとも60個のアミノ残基、少なくとも70個のアミノ酸残基、少なくとも80個のアミノ酸残基、少なくとも90個のアミノ酸残基、少なくとも100個のアミノ酸残基、少なくとも125個のアミノ酸残基、または少なくとも150個のアミノ酸残基の本明細書中に記載のRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体をコードしているヌクレオチド配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド;および(c)本明細書中に記載のRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体をコードしているヌクレオチド配列と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド。本明細書中に記載のRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体に類似の構造を有するポリペプチドとは、RSVポリペプチド、RSVの断片、または本明細書中に記載の抗体と類似の二次、三次または四次構造を有するポリペプチドをいう。ポリペプチドの構造は、それだけには限定されないが、X線結晶構造解析、核磁気共鳴、および結晶学的電子顕微鏡観察を含めた、当業者に知られている方法によって決定することができる。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の%同一性を決定するためには、最適な比較目的のために配列のアラインメントを行う(たとえば、第2のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第1のアミノ酸または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる)。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合は、分子はその位置で同一である。2つの配列間の%同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である(すなわち、%同一性=同一の重複位置の数/位置の合計の数×100%)。一実施形態では、2つの配列は同じ長さである。
2つの配列間の%同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することもできる。2つの配列の比較に利用する数学アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877のように改変した、KarlinおよびAltschul、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268アルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul他、1990、J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに統合されている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセット、たとえば、スコア=100、ワード長=12を用いて、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために行うことができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムパラメータセット、たとえば、スコア50、ワード長=3を用いて、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために行うことができる。比較目的でギャップを導入したアラインメントを行うために、Altschul他、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389 3402に記載のようにギャップを導入したBLASTを利用することができる。あるいは、分子間の遠位関係を検出する繰り返し検索を行うために、PSI BLASTを用いることができる(同上)。BLAST、ギャップを導入したBLAST、およびPSI Blastプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム(たとえば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメータを用いることができる(たとえば、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照)。配列の比較に利用する数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、1988、CABIOS 4:11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に統合されている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。
2つの配列間の%同一性は、ギャップを許容してまたは許容せずに、上述のものに類似の技術を用いて決定することができる。%同一性を計算するにあたって、典型的には、完全一致のみを計数する。
本明細書中で使用する用語「RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体」および類似用語とは、RSVポリペプチドまたはRSVポリペプチドの断片に特異的に結合し、他のポリペプチドに非特異的に結合しない抗体をいう。RSVポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応性を有し得る。好ましくは、RSVポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は他の抗原と交差反応しない。RSVポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、たとえば、免疫アッセイまたは当業者に知られている他の技術によって同定することができる。
本発明の抗体には、それだけには限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えによって製造した抗体、多特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、単鎖Fv(scFv)(たとえば、単一特異性および二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記の任意のもののエピトープ結合断片が含まれる。具体的には、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、RSV抗原(好ましくはRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子(たとえば、抗RSV抗体の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR))が含まれる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の任意の種類(たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであることができる。
本明細書中、非タンパク質性類似体との関連で使用する用語「類似体」とは、第1の有機または無機分子と類似または同一の機能を保有し、第1の有機または無機分子と構造的に類似である、第2の有機または無機分子をいう。
本明細書中で使用する用語「抗体断片」とは、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体の断片をいう。抗体断片は、当業者に知られている任意の技術およびタンパク質分解性または非タンパク質分解的切断によって製造し得る。たとえば、FabおよびF(ab')2断片は、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって、パパイン(Fab断片を作製するため)またはペプシン(F(ab')2断片を作製するため)などの酵素を用いて製造し得る。F(ab')2断片は、完全な軽鎖、ならびに重鎖の可変領域、CH1領域およびヒンジ領域を含む。抗体断片は、組換えDNA技術によって製造することもできる。抗体断片は、抗体の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)であり得る。
本明細書中で使用する用語「抗体I型断片」とは、ヒトIgG1免疫グロブリンにおいて、システイン223、アスパラギン酸224、リシン225、スレオニン226、ヒスチジン227、スレオニン228またはシステイン229でN末端を有し、リシン449でC末端を有する、完全長の抗体軽鎖、完全長の抗体重鎖および抗体重鎖C末端部分を含む多量体タンパク質をいう。定常ドメインのアミノ酸の番号付けは、別段に指定しない限りは、カバットEUナンバリングスキームに従って与える(本明細書中に参考として組み込まれているKabat, E. A.、T. T. Wu、H. M. Perry、K. S. Gottesman、およびFoeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Public Health Service、National Institutes of Health、Washington, D.C.)。具体的な実施形態では、完全長の抗体軽鎖、完全長の抗体重鎖および抗体重鎖C末端部分は、図14に示すように、ジスルフィド結合によって連結されている。別の具体的な実施形態では、I型断片は、目的の抗原に免疫特異的に結合することができる。
本明細書中で使用する用語「抗体II型断片」とは、ヒトIgG1免疫グロブリン中では、セリン222、システイン223、アスパラギン酸224、リシン225、スレオニン226、ヒスチジン227またはスレオニン228でC末端を有し、グリシン1でN末端を有する、抗体軽鎖および抗体重鎖N末端部分を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をいう。具体的な実施形態では、完全長の抗体軽鎖および抗体重鎖N末端部分は、図14に示すように、ジスルフィド結合によって連結されている。別の具体的な実施形態では、II型断片は、目的の抗原に免疫特異的に結合することができる。
本明細書中、ポリペプチドとの関連で使用する用語「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって変更したRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、またはRSVポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。本明細書中で使用する用語「誘導体」とは、修飾されている、すなわち、任意の種類の分子とポリペプチドとの共有結合によって修飾されている、RSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、またはRSVポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体もいう。たとえば、それに限定するわけではないが、RSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体は、たとえば、既知の保護/遮断基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾し得る。RSVポリペプチドの誘導体、RSVポリペプチドの断片、または抗体は、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた当業者に知られている技術を用いた化学修飾によって修飾し得る。さらに、RSVポリペプチドの誘導体、RSVポリペプチドの断片、または抗体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。ポリペプチド誘導体は、本明細書中に記載のRSVポリペプチド、RSVポリペプチドの断片、または抗体と類似または同一の機能を保有する。
本明細書中、非タンパク質性誘導体との関連で使用する用語「誘導体」とは、第1の有機または無機分子の構造に基づいて形成される第2の有機または無機分子をいう。有機分子の誘導体には、それだけには限定されないが、たとえば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミン基の付加または欠失によって修飾した分子が含まれる。また、有機分子は、エステル化、アルキル化および/またはリン酸化されていてもよい。
本明細書中で使用する用語「有効量」とは、疾患または障害の重篤度および/または持続期間を軽減および/または改善させるために十分な治療(たとえば本発明の抗体)の量をいう。たとえば、抗RSV抗体の「有効量」とは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、ならびに/またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の重篤度および/または持続期間を軽減および/または改善させるために十分な量、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎ならびに/またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態の悪化または進行を予防する(たとえば、上気道RSV感染症から下気道RSV感染症への進行を予防する)ために十分な量、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、ならびに/またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の再発、発生、または発症を予防するために十分な量、ならびに/あるいは、別の治療(たとえば本発明の抗体以外の治療)の予防的または治療効果(もしくは複数の効果)を増強/改善させるために十分な量である。本発明の抗体の有効量の非限定的な例は、下記5.3節に提供する。RSV感染症の治療に関して、治療上有効な量とは、ウイルスの複製を減少もしくは阻害する、ウイルスによる細胞の感染を阻害もしくは減少する、ウイルス粒子の産生を阻害もしくは減少する、ウイルス粒子の放出を阻害もしくは減少する、他の組織もしくは対象へのウイルスの伝播を阻害もしくは減少する、または感染症に関連する1つもしくは複数の症状を改善させるために十分な、治療剤の量をいう。具体的な実施形態では、治療剤の治療上有効な量により、RSV生活環の以下のステップの1つまたは複数、すなわち、ウイルス粒子の細胞へのドッキング、ウイルス遺伝情報の細胞内への導入、ウイルスタンパク質の発現、新しいウイルス粒子の産生、および細胞からのウイルス粒子の放出が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%減少する。別の具体的な実施形態では、治療剤の治療上有効な量により、ウイルスの複製、増殖または伝播が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%減少する。
本明細書中で使用する用語、抗RSV抗体の「有効な中和力価」とは、臨床的に有効(ヒトにおいて)またはたとえばコットンラットにおいてウイルスを99%減少させることが示されている、動物(ヒトまたはコットンラット(cotton rat))の血清中に存在する量に対応する抗体の量をいう。99%の減少は、たとえば、103pfu、104pfu、105pfu、106pfu、107pfu、108pfu、または109pfuのRSVの特異的免疫誘発（チャレンジ）によって定義される。
本明細書中で使用する用語「高齢者」とは、年齢が65歳以上のヒト被験体をいう。
本明細書中で使用する用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの断片をいう。免疫原性活性を有するエピトープとは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドの断片である。抗原性活性を有するエピトープとは、当分野で周知の任意の方法、たとえば本明細書中に記載の免疫アッセイによって決定される、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドの断片である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
本明細書中で使用する用語「賦形剤」とは、一般的に薬物の希釈剤、ビヒクル、保存料、結合剤、または安定化剤として用いられる不活性物質をいい、それだけには限定されないが、タンパク質(たとえば血清アルブミンなど)、アミノ酸(たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど)、脂肪酸およびリン脂質(たとえば、スルホン酸アルキル、カプリレートなど)、界面活性剤(たとえば、SDS、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤など)、糖類(たとえば、スクロース、マルトース、トレハロースなど)ならびにポリオール(たとえば、マンニトール、ソルビトールなど)が含まれる。その全体が本明細書中に組み込まれているRemington's Pharmaceutical Sciences (Joseph P. Remington、第18版、Mack Publishing Co.、Easton, Pennsylvania)も参照されたい。
本明細書中で使用する用語「断片」とは、ポリペプチドに免疫特異的に結合するポリペプチドまたは抗体のアミノ酸配列の、少なくとも5個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも10個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも15個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも20個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも25個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも40個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも50個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも60個の連続的なアミノ残基、少なくとも70個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも80個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも90個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも連続的な100個のアミノ酸残基、少なくとも125個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも150個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも175個の連続的なアミノ酸残基、少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドをいう。具体的な実施形態では、抗原に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは抗体の断片は、ポリペプチドまたは抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの機能を保持している。
本明細書中で使用する用語「融合タンパク質」とは、抗体のアミノ酸配列および異種ポリペプチドまたはタンパク質(すなわち、通常は抗体の一部ではないポリペプチドまたはタンパク質(たとえば非-抗RSV抗原抗体))のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。
本明細書中で使用する用語「高濃度」および「濃縮抗体」とは、抗体製剤中における抗体またはその抗原結合断片の濃度が50mg/ml以上、好ましくは95mg/ml以上であることをいう。
本明細書中で使用する用語「高力価」とは、本明細書中に記載のアッセイなど、生物活性(たとえばRSVの中和)の様々なアッセイにおいて決定された、高力価を示す抗体をいう。たとえば、本発明の高力価抗体は、本明細書中に記載の微量中和アッセイの測定により、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1.75nM未満、1.5nM未満、1.25nM未満、1nM未満、0.75nM未満、0.5nM未満、0.25nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.025nM未満、または0.01nM未満のIC50値を有する。さらに、本発明の高力価抗RSV抗体は、コットンラットにおいて、105pfuを用いて免疫誘発を行った5日後に、前記抗体を投与していないコットンラットよりも少なくとも75%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは99%低いRSV力価をもたらす。本発明の特定の実施形態では、本発明の高力価抗RSV抗体は、1つまたは複数のRSV抗原に対して高い親和性および/または高い結合力を示す(たとえば、1つまたは複数のRSV抗原に対して少なくとも2×108M-1、好ましくは少なくとも2.5×108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、または少なくとも5×1012M-1の親和性を有する抗体)。
本明細書中で使用する用語「宿主」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトをいう。
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」とは、核酸分子を用いて形質移入した特定の対象細胞およびそのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。そのような細胞の子孫は、継代世代または宿主細胞ゲノム内への核酸分子の組み込みにおいて起こり得る突然変異または環境的影響により、核酸分子を用いて形質移入した親細胞とは同一でない場合がある。
本明細書中で使用する用語「ヒト幼児」とは、24カ月未満、好ましくは16カ月未満、12カ月未満、6カ月未満、3カ月未満、2カ月未満、または1カ月未満の年齢のヒトをいう。
本明細書中で使用する用語「未熟出生のヒト幼児」とは、在胎期間が40週間未満、好ましくは在胎期間が35週間未満、6カ月齢未満、好ましくは3カ月齢未満、より好ましくは2カ月齢未満、最も好ましくは1カ月齢未満で出生したヒトをいう。
本明細書中で使用する用語「組み合わせて」とは、複数の治療の使用をいう。用語「組み合わせて」の使用は、治療を感染症に罹患している被験体に投与する順序を制限しない。第1の治療は、疾患または障害に罹患していた、罹患している、またはそれに感受性のある被験体に第2の治療を投与する前(たとえば、1分間、45分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間)、それと同時に、またはその後(たとえば、1分間、45分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間)に投与することができる。任意の追加の治療を、任意の順序で、他の追加の治療と共に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体を、1つまたは複数の非抗体治療と組み合わせて投与することができる。本発明の抗体と組み合わせて投与することができる治療の非限定的な例には、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫調節剤が含まれる。
本明細書中で使用する用語「感染症」とは、宿主中でのRSVの生活環のすべての段階(それだけには限定されないが、細胞または体組織におけるRSVによる侵襲およびその複製を含む)、ならびにRSVによる侵襲およびその複製から生じる病理的状態をいう。RSVによる侵襲およびその増殖には、それだけには限定されないが、以下のステップが含まれる:RSV粒子の細胞へのドッキング、ウイルス遺伝情報の細胞内への導入、RSVタンパク質の発現、新しいRSV粒子の産生および細胞からのRSV粒子の放出。
本明細書中で使用する用語「無機塩」とは、酸の水素または酸の一部またはすべてを金属または金属様に作用する基によって置き換えることで生じる、炭素を含まない任意の化合物をいい、多くの場合、生体物質の薬剤組成物および製造物中で等張性調節化合物といて用いられる。最も一般的な無機塩は、NaCl、KCl、NaH2PO4などである。
「単離した」または「精製した」抗体は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または化学合成した場合は化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。言葉「細胞物質を実質的に含まない」には、抗体が、それを単離したまたは組換えによって製造した細胞の細胞構成成分から分離されている抗体製造物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体には、約30%、20%、10%、または5%未満(乾重量)の異種タンパク質(本明細書中で「汚染タンパク質」ともいう)を有する抗体調製物が含まれる。抗体を組換えによって製造する場合は、培地も実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約20%未満、10%、または5%を表す。抗体を化学合成によって製造する場合は、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、抗体はタンパク質の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、そのような抗体調製物は、約30%未満、20%、10%、5%(乾重量)の化学物質前駆体または目的の抗体以外の化合物を有する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は単離または精製されている。
「単離した」核酸分子とは、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、「単離した」核酸分子、たとえばcDNA分子は、他の細胞物質を実質的に含まない、もしくは組換え技術によって製造した場合は培地を実質的に含まない、または化学合成した場合は化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことができる。具体的な実施形態では、本発明の抗体をコードしている核酸分子(または複数の核酸分子)は単離または精製されている。
本明細書中で使用する語句「低〜検出不可能の凝集レベル」とは、高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)またはマルチサイザーの測定により、タンパク質の重量の5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、最も好ましくは0.5%以下の凝集を含む試料をいう。
本明細書中で使用する用語「低〜検出不可能の断片化レベル」とは、たとえばAUCまたはLC-MSの決定により、全タンパク質の95%、98%、99%、99.5%または99.9%以上を含む試料をいう。
用語「下気」道とは、気管(windpipe、trachea)ならびに気管支、細気管支、および肺胞を含めた肺を含めた下気道の主要な通路および構造体をいう。
本明細書中で使用する用語「低耐用(low tolerance)」とは、患者が治療からの副作用を患い、副作用からの有害作用および/または害が治療の利点に勝るために患者が治療から利点を得ないおよび/または治療を継続しない状態をいう。
本明細書中で使用する用語「管理する」、「管理すること」および「管理」とは、感染症の治癒はもたらさない、被験体が治療(たとえば予防剤または治療剤)から得る有益な効果をいう。特定の実施形態では、感染症、1つもしくは複数のその症状、またはRSV感染症に関連する、それによって増強される、もしくはそれを増強する呼吸器の状態を「管理」して、感染症の進行または悪化を予防するために、被験体に1つまたは複数の治療(たとえば予防剤または治療剤)を投与する。
本明細書中で使用する用語「非応答性」および「不応性(refractory)」とは、RSV感染症、1つもしくは複数のその症状、またはRSV感染症に関連する、それによって増強される、もしくはそれを増強する呼吸器の状態について、感染症に関連する1つまたは複数の症状の軽減に臨床的に十分でない、現在利用可能な治療(それだけには限定されないが、予防剤または治療剤など)を用いて治療した患者を説明する。典型的には、そのような患者は、重篤な持続的に活性のある感染症に罹患しており、その感染症または呼吸器の状態に関連する症状を改善させるために追加の治療を必要とする。
本明細書中で使用する用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」には、DNA分子(たとえば、cDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(たとえばmRNA)、DNAおよびRNA分子の組合せまたはハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子の類似体が含まれる。そのような類似体は、たとえば、それだけには限定されないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含めたヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。また、そのような類似体は、たとえばヌクレアーゼ耐性または細胞膜を横切る能力の増加などの、分子に有益な属性を与える改変した主鎖を含むDNAまたはRNA分子を含むこともできる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であることができ、一本鎖および二本鎖部分をどちらも含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
本明細書中で使用する用語「製薬上許容される」とは、動物、より具体的にはヒトでの使用について連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可されている、または米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。
本明細書中で使用する用語「ポリオール」とは、通常の糖類よりも多くの-OH基を含む糖をいう。
本明細書中で使用する用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、被験体における上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態などの疾患または障害の発生または発症の予防または阻害、治療(たとえば予防剤または治療剤)の投与によりもたらされる上気道RSV感染症から下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態への進行の予防または阻害、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態の症状の予防、あるいは治療の組合せ(たとえば予防剤または治療剤の組合せ)の投与をいう。
本明細書中で使用する用語「予防剤」とは、疾患または障害、たとえば上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の再発、伝播または発症を予防する、ならびに/あるいは上気道RSV感染症から下気道RSV感染症または中耳炎への進行を予防することができる、任意の薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「予防剤」とは本発明の抗体をいう。特定の他の実施形態では、用語「予防剤」とは、本発明の抗体以外の薬剤をいう。好ましくは、予防剤は、RSV感染症(好ましくは上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎、ならびに/またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態の、発症、発生、進行および/または重篤度を予防または防止するために有用であることが知られている、あるいはそのために使用されていたまたは現在使用されている薬剤である。
本発明の特定の実施形態では、「予防上有効な血清力価」とは、被験体において上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎ならびに/またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態の発生率を低下させる、前記被験体、好ましくはヒトにおける血清力価である。一部の実施形態では、予防上有効な血清力価は、上気道RSV感染症から下気道RSV感染症または中耳炎への進行を予防する。好ましくは、予防上有効な血清力価は、RSV感染症から生じる合併症の確率が最も高いヒトにおいて(たとえば、嚢胞性線維症、気管支肺異形成、先天性心疾患、先天性免疫不全もしくは後天性免疫不全に罹患しているヒト、骨髄移植を受けたヒト、ヒト幼児、または高齢のヒト)、RSV感染症の発生率を低下させる。本発明の特定の他の実施形態では、「予防上有効な血清力価」とは、105pfuを用いて免疫誘発を行った5日後にもたらされるRSV力価が、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体を投与していないコットンラットにおいて105pfuのRSVを用いて免疫誘発を行った5日後のRSV力価よりも99%低い、コットンラットにおける血清力価である。
本明細書中で使用する用語「不応性」とは、1つまたは複数の治療(たとえば現在利用可能な治療)に応答性でない、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態をいう。特定の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態が治療に不応性とは、前記上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態に関連する症状の少なくともある程度の顕著な一部分が、その治療によって排除または軽減されないことを意味する。上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態が不応性であるかどうかの決定は、感染症、中耳炎またはそれに関連する呼吸器の状態に対する治療の有効性のアッセイを行う当分野で知られている任意の方法によって、in vivoまたはin vitroのどちらかで行うことができる。
用語「RSV抗原」とは、抗体が免疫特異的に結合するRSVポリペプチドをいう。また、RSV抗原とは、抗体が免疫特異的に結合するRSVポリペプチドの類似体もしくは誘導体またはその断片もいう。
本明細書中で使用する用語「血清力価」とは、少なくとも10人、好ましくは少なくとも20人、最も好ましくは少なくとも40人の被験体の集団における平均血清力価をいう。
本明細書中で使用する用語「糖類」とは、多価アルコールの誘導体である分子のクラスをいう。糖類は一般的に炭水化物と呼ばれ、様々な量の糖(糖類)単位、たとえば、単糖、二糖および多糖類を含み得る。
本明細書中で使用する用語「副作用」には、治療(たとえば予防剤または治療剤)の所望しないかつ有害な作用が包含される。有害作用は常に所望しないが、所望しない作用は必ずしも有害ではない。治療(たとえば予防剤または治療剤)からの有害作用は、有害または不快または危険であり得る。副作用の例には、それだけには限定されないが、嘔気、嘔吐、摂食障害、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重減少、脱水、脱毛症、呼吸困難、不眠症、眩暈、粘膜炎、神経および筋肉の効果、疲労、口渇、および食欲不振、投与部位における発疹または腫脹、発熱、悪寒および疲労などのインフルエンザ様の症状、消化管の問題ならびにアレルギー反応が含まれる。患者が経験するさらなる望ましくない効果は多数存在し、当分野で知られている。多くはPhysician's Desk Reference (第58版、2004)に記載されている。
本明細書中、抗体または抗原結合断片を含む製剤との関連で使用する用語「安定性」および「安定した」とは、製剤中の抗体または抗体断片の、所与の製造、製造、輸送および保存条件下における熱および化学的なアンフォールディング、凝集、分解または断片化に対する耐性をいう。本発明の「安定した」製剤は、所与の製造、製造、輸送および保存条件下で80%以上、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、または99.9%の生物活性を保持する。抗体または抗体断片の安定性は、凝集、分解もしくは断片化の度合または特定の断片(たとえばI型断片またはII型断片)のレベルまたは凝集体の種類もしくは大きさによって、それだけには限定されないが、参照、たとえば6%のマンニトールを含む50mMのヒスチジン/3.2mMのグリシン緩衝液、pH6.0で100mg/mlに再構成した市販の凍結乾燥パリビツマブと比較した、還元AUC、SEC、LC-MS、粒子マルチサイザー毛細ゲル電気泳動(rCGE)、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびHPSECを含めた当業者に知られている方法によって、評価することができる。参照は、HPSECによって単一のピーク(≧97%面積)を定期的に与える。RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含む製剤の全体的な安定性は、RSVの特異的エピトープを用いて、たとえばELISAおよびラジオイムノアッセイを含めた様々な免疫学的アッセイによって、評価することができる。
本明細書中で使用する用語「被験体」および「患者」は、互換性があるように用いる。本明細書中で使用する被験体とは、好ましくは、非霊長類(たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)ならびに霊長類(たとえば、サルおよびヒト)などの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。一実施形態では、被験体は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、被験体は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎を発生する危険性にある哺乳動物、好ましくはヒトである(たとえば、免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の哺乳動物、または遺伝的素因を有する哺乳動物)。一実施形態では、被験体は、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、またはそれに関連する呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴またはRADを含む)に罹患しているヒトである。
本明細書中で使用する用語「パリビツマブ標準参照」または類似用語は、Physicians' Desk Reference、第56版、2002年に記載のように、市販の凍結乾燥パリビツマブをいう。再構成したパリビツマブは、たとえば、以下の賦形剤、すなわち、47mMのヒスチジン、3.0mMのグリシンおよび5.6%のマニトール、ならびに溶液1mlあたり100mgの濃度で活性成分の抗体を含み得る。
本明細書中で使用する用語「被験体」および「患者」は、互換性があるように用いる。本明細書中で使用する用語「被験体」および「複数の被験体」とは、非霊長類(たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス)ならびに非霊長類(たとえば、カニクイザル(cynomolgous monkey)などのサルおよびヒト)、より好ましくはヒトを含めた、動物、好ましくは哺乳動物をいう。
本明細書中で使用する用語「界面活性剤を実質的に含まない」とは、0.0005%未満、0.0003%未満、もしくは0.0001%未満の界面活性剤および/または0.0005%未満、0.0003%未満、もしくは0.0001%未満の界面活性剤を含む、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片の製剤をいう。
本明細書中で使用する用語「塩を実質的に含まない」とは、0.0005%未満、0.0003%未満、または0.0001%未満の無機塩を含む、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片の製剤をいう。
本明細書中で使用する用語「界面活性剤」とは、両親媒性構造を有する有機物質をいい、すなわち、これらは対立する溶解傾向の基、典型的には油溶性の炭化水素鎖および水溶性のイオン性基からなる。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に応じて、陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性界面活性剤に分類することができる。多くの場合、界面活性剤は、生体物質の様々な薬剤組成物および製造物の湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、および分散剤として使用される。
本明細書中で使用する用語「相乗的」とは、任意の2つ以上の単独治療の相加効果よりも有効な治療の組合せ(たとえば予防剤または治療剤の使用)をいう。たとえば、予防剤または治療剤の組合せの相乗効果により、1つもしくは複数の薬剤をより低い用量で用いることおよび/または前記薬剤をより低頻度でRSV感染症に罹患している被験体に投与することが可能となる。予防的もしくは治療的治療をより低い用量で利用する能力および/または前記治療をより低頻度で投与する能力により、RSV感染症の予防、管理または治療における前記治療の有効性を減少させずに、前記治療を被験体に投与することに関連する毒性が軽減される。さらに、相乗効果は、RSV感染症の予防または治療において、治療の有効性の向上をもたらすことができる。最後に、治療の組合せ(たとえば予防剤または治療剤)の相乗効果により、任意の単独の治療の使用に関連する有害なまたは所望しない副作用が回避または軽減され得る。
本明細書中で使用する用語「治療剤」とは、疾患または障害、たとえば、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれらに関連する呼吸器の状態の治療、管理、予防または改善に用いることができる任意の薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「治療剤」とは本発明の抗体をいう。特定の他の実施形態では、用語「治療剤」とは、本発明の抗体以外の薬剤をいう。好ましくは、治療剤は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎、またはそれに関連する呼吸器の1つもしくは複数の症状もしくは状態を、予防、治療、管理もしくは改善するために有用であることが知られている、またはそのために使用されていたもしくは現在使用されている薬剤である。
本発明の特定の実施形態では、「治療上有効な血清力価」とは、被験体においてRSV感染症の重篤度、持続期間および/またはそれに関連する症状を軽減させる、前記被験体、好ましくはヒトにおける血清力価である。好ましくは、治療上有効な血清力価は、感染症から生じる合併症の確率が最も高いヒトにおいて(たとえば、嚢胞性線維症、気管支肺異形成、先天性心疾患、先天性免疫不全もしくは後天性免疫不全に罹患しているヒト、骨髄移植を受けたヒト、ヒト幼児、または高齢のヒト)、上気道および/または下気道RSV感染症に関連する重篤度、継続期間および/または症状の数を低下させる。本発明の特定の他の実施形態では、「治療上有効な血清力価」とは、105pfuを用いて免疫誘発を行った5日後にもたらされるRSV力価が、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体を投与していないコットンラットにおいて105pfuのRSVを用いて免疫誘発（チャレンジ）を行った5日後のRSV力価よりも99%低い、コットンラットにおける血清力価である。
本明細書中で使用する用語「治療」とは、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)などの疾患または障害の予防、治療または管理に用いることができる、任意のプロトコル、方法および/または薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「治療」および「複数の治療」とは、医療関係者などの当業者に知られている、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の治療、管理、予防および/または改善に有用な生物療法、支持療法、および/または他の治療をいう。
本明細書中で使用する用語「治療する」、「治療」および「治療すること」とは、1つまたは複数の治療の投与(それだけには限定されないが、1つまたは複数の予防剤または治療剤の投与を含む)によりもたらされる、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せ等)などの疾患または障害の、進行、重篤度、および/または継続期間の軽減または改善をいう。具体的な実施形態では、このような用語は、RSVの複製の減少または阻害、RSVの他の組織または対象への伝播の阻害または軽減(たとえば下気道への伝播)、RSVによる細胞の感染の阻害または軽減、あるいは上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎に関連する1つまたは複数の症状の改善をいう。
用語「上気および/または下気」道とは、鼻または鼻孔、鼻腔、口、咽頭(throat、pharynx)、および喉頭(voice box、larynx)を含めた、上気道および/または下気道の主要な通路および構造体をいう。
4.図面の説明
（後述の「図面の簡単な説明」の項を参照のこと。）
5.発明の詳細な説明
5.1抗体製剤の製造方法
本発明は、目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体、またはその誘導体、類似体、もしくは断片の製剤の製造方法を提供する。そのような抗体は、抗体を精製するための当分野で知られている任意の方法に従って精製し得る。図1および図2は、精製抗体を製造するための代替の概要を示す模式図である。一実施形態では、本発明の液体製剤の製造方法は、精製抗体または断片を含む画分を、適切な分子量(MW)カットオフ(たとえば、全抗体分子およびF(ab')2断片には30kDのカットオフ;Fab断片などの抗体断片には10kDのカットオフ)を有する半透膜を用いて約15mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約110mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約200mg/ml、約250mg/ml、または約300mg/mlの最終抗体または断片濃度まで濃縮すること、ならびに同じ膜を用いて濃縮抗体画分を配合緩衝液中へとジフィルトレーションすることを含む。抗体は、好ましくは骨髄腫細胞、より好ましくはネズミ(murine)骨髄腫細胞、最も好ましくはNSO細胞中で発現させる。
図1によって概要を示した実施形態では、目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含む馴化培地をCUNO濾過に供し、濾過した抗体をHS50陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。その後、HS50陽イオン交換クロマトグラフィーからの画分をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーに供し、続いて低pH処理を行った。低pH処理後、抗体画分をsuperQ650陰イオン交換クロマトグラフィー、その後ナノ濾過に供した。その後、ナノ濾過後に得られた抗体の画分をダイアフィルトレーションに供して、同じ膜を用いて抗体画分を配合緩衝液中へと濃縮した。
図2の実施形態を用いて、目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含む馴化培地をCUNO濾過に供し、濾過した抗体をFractogel(登録商標)S陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。その後、陽イオン交換クロマトグラフィーからの画分をsuperQ陰イオンクロマトグラフィーに供し、続いてPlanova(登録商標)20Nナノフィルターを用いてナノ濾過を行った。その後、ナノ濾過後に回収された抗体画分を、低pH処理、続いてヒドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィーに供した。その後、HAクロマトグラフィー後に得られた抗体の画分をダイアフィルトレーションに供して、同じ膜を用いて抗体画分を配合緩衝液中へと濃縮した。
本発明の配合緩衝液は、好ましくは、ヒスチジンを約1mM〜約100mM、約10mM〜約50mM、約20mM〜約30mM、または約23mM〜約27mMの範囲の濃度で含む。好ましくは、本発明の配合緩衝液は、ヒスチジンを約25mMの濃度で含む。製剤は、グリシンを100mM未満、50mM未満、3.0mM未満、2.0mM未満、または1.8mM未満の濃度でさらに含み得る。好ましくは、製剤は、グリシンを1.6mMの濃度で含む。抗体の等電点における抗体の沈殿を回避するために、製剤中のグリシンの量は、顕著な緩衝を引き起こさないべきである。製剤のpHは、約5.0〜約7.0、好ましくは約5.5〜約6.5、より好ましくは約5.8〜約6.2、最も好ましくは約6.0の範囲であり得る。特定の抗体について適切なpHを得るために、ヒスチジンを(加える場合はグリシンも)最初に水に溶かして所望のpHよりも高いpHを有する緩衝溶液を得て、その後、HClを加えることによってpHを所望のレベルまで下げることが好ましい。この方法で、無機塩の形成(たとえば、塩酸ヒスチジンをヒスチジンとして用い、NaOHを加えることによってpHを所望のレベルまで上げる場合の、たとえばNaClの形成)を回避することができる。
本発明の製剤は、1回使用のための液体製剤のアリコートを含むバイアルを製造することによって、単位剤型として製造することができる。たとえば、バイアル1個あたりの単位用量は、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、または20mlの、約15mg/ml〜約300mg/mlの範囲の様々な濃度の目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含み得る。必要な場合は、それぞれのバイアルに滅菌希釈剤を加えることによって、これらの製造物を所望の濃度に調節することができる。
本発明の製剤は、滅菌濾過、放射線照射などを含めた様々な滅菌方法によって滅菌し得る。最も好ましい実施形態では、ジフィルトレーションを行った抗体製剤は、事前に滅菌した0.22ミクロンのフィルターを用いてフィルター滅菌する。具体的な実施形態では、滅菌した本発明の液体製剤を、RSV感染症、1つもしくは複数のその症状、またはRSV感染症に関連する、それによって増強される、もしくはそれを増強する呼吸器の状態を予防、治療、管理または改善させるために、被験体に投与し得る。
本発明の製剤は、目的の抗原に免疫特異的に結合する標識した抗体、その誘導体および類似体を含み、存在または前記抗原に関連するおよび/もしくはそれを特徴とする障害を検出、診断、または監視するための診断目的に用いることができる。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合する標識した抗体、その誘導体および類似体を含み、RSV感染症を検出、診断、または監視するための診断目的に用いることができる。
本発明は、製剤の液体および凍結乾燥形態をどちらも包含する。液体製剤の凍結乾燥形態を生成するための方法は、当分野でよく特徴づけられている。一実施形態では、本発明の製剤の成分は、たとえば、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器中で、単位剤型で個別に供給するか、または一緒に混合して供給する。組成物をインフュージョンによって投与する場合は、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含むインフュージョンボトルを用いて投薬することができる。組成物を注射によって投与する場合は、投与前に成分を混合し得るように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明の組成物は、中性または塩形態で配合することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンと共に形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの陽イオンと共に形成される塩が含まれる。
本発明の製剤はさらに、即時または持続放出のための経口または非経口剤型に加工することができる。製剤は、希釈剤、充填剤、崩壊剤、甘味料、潤滑剤および香味料などの、薬剤調節物に通常用いられる不活性成分をさらに含むことができる。また、製剤を、ボーラス注射もしくは持続点滴のどちらかによる静脈内投与、または埋め込みカプセルからの放出用に加工し得る。典型的な静脈内投与用の製剤では、生理食塩水を希釈剤として利用する。
5.2抗体の製剤
本発明は、障害の診断、検出、または監視、障害または1つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理、または改善、および/あるいは研究において使用するための、本発明の抗体を含む製剤を提供する。具体的な実施形態では、本発明の製剤は1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、1つまたは複数の抗体および1つまたは複数の抗体以外の予防剤または治療剤を含む。好ましくは、障害または1つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理、または改善に有用であることが知られているあるいはそれに使用されていたまたは現在使用されている、予防剤または治療剤。これらの実施形態に従って、組成物は担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
本発明の製剤は、界面活性剤、無機塩、および/または他の賦形剤を実質的に含まないが、それでも長期間の保存中に高い安定性を示す抗体製剤を提供する。具体的な実施形態では、そのような抗体製剤は均質である。本発明の製剤は、1〜100mMの濃度のヒスチジンおよび目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体を約15mg/ml〜約300mg/mlの濃度で含む。一実施形態では、本発明の製剤は、水または適切な溶媒以外の他の成分を含まない。具体的な実施形態では、抗体はRSV抗原に免疫特異的に結合し、好ましい実施形態では、パリビツマブまたはその断片ではない。
一実施形態では、本発明の製剤の抗体は、それだけには限定されないが、異種ポリペプチド、別の抗体または別の断片、マーカー配列、診断剤、治療剤、放射性金属イオン、ポリマー、アルブミン、および固体担体を含めた別の部分にコンジュゲートした抗体または抗体断片である。別の実施形態では、本発明の製剤は、目的の抗原に免疫特異的に結合する2つ以上の抗体またはそれらの断片を含む。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合する2つ以上の抗体またはそれらの断片を含み、抗体または抗体断片の少なくとも一方はパリビツマブまたはその断片ではない。
本発明の製剤中に含まれる抗体またはその断片の濃度は、少なくとも15mg/ml、少なくとも20mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも30mg/ml、少なくとも35mg/ml、少なくとも40mg/ml、少なくとも45mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも55mg/ml、少なくとも60mg/ml、少なくとも65mg/ml、少なくとも70mg/ml、少なくとも75mg/ml、少なくとも80mg/ml、少なくとも85mg/ml、少なくとも90mg/ml、少なくとも95mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも105mg/ml、少なくとも110mg/ml、少なくとも115mg/ml、少なくとも120mg/ml、少なくとも125mg/ml、少なくとも130mg/ml、少なくとも135mg/ml、少なくとも140mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/ml、少なくとも250mg/ml、または少なくとも300mg/mlである。
本発明の製剤中に含まれるヒスチジンの濃度の範囲は、約1mM〜約100mM、約10mM〜約50mM、約20mM〜約30mM、または約23mM〜約27mMであり、最も好ましくは約25mMである。ヒスチジンは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、またはそれらの混合物の形態であることができるが、L-ヒスチジンが最も好ましい。また、ヒスチジンは水和物の形態であることもできる。ヒスチジンは、塩酸塩(たとえば、一塩酸塩および二塩酸)、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの製薬上許容される塩の形態で用い得る。ヒスチジンの純度は、少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは少なくとも99.5%であるべきである。
製剤のpHは、製剤中で用いる特定の抗体の等電点に等しくないべきであり、約5.0〜約7、好ましくは約5.5〜約6.5、より好ましくは約5.8〜約6.2、最も好ましくは約6.0の範囲であり得る。
ヒスチジンおよび抗体またはその断片に加えて、本発明の製剤は、グリシンを100mM未満、50mM未満、3.0mM未満、2.0mM未満、または1.8mM未満、最も好ましくは1.6mMの濃度でさらに含み得る。抗体の等電点における抗体の沈殿を回避することができるように、製剤中のグリシンの量は、顕著な緩衝効果を引き起こさないべきである。また、グリシンは、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの製薬上許容される塩の形態でも用い得る。グリシンの純度は、少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは99.5%であるべきである。具体的な実施形態では、グリシンは本発明の製剤中に含まれる。
任意選択で、本発明の製剤は、糖類(たとえば、スクロース、マンノース、トレハロース等)およびポリオール(たとえば、マンニトール、ソルビトール等)などの他の賦形剤をさらに含み得る。一実施形態では、他の賦形剤は糖である。具体的な実施形態では、糖類は、約1%〜約20%、好ましくは約5%〜約15%、より好ましくは約8%〜10%の範囲の濃度のスクロースである。別の実施形態では、他の賦形剤はポリオールである。しかし、好ましくは、本発明の液体製剤はマンニトールを含まない。具体的な実施形態では、ポリオールは、約0.001%〜約1%、好ましくは、約0.01〜約0.1の範囲の濃度のポリソルベート(たとえばTween20)である。
本発明の製剤は、AUC、LC-MS、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)もしくは粒子マルチサイザーの評価により、38℃〜42℃の温度範囲で少なくとも60日間、一部の実施形態では、少なくとも120日間、20℃〜24℃で少なくとも1年間、2℃〜8℃(具体的には4℃)で少なくとも3年間、少なくとも4年間、または少なくとも5年間、および-20℃で少なくとも3年間、少なくとも4年間、または少なくとも5年間、安定性を示す。すなわち、本発明の製剤は、上記で定義した期間保存した後に本明細書中に定義した低〜検出不可能の凝集および/または断片化レベルを有する。好ましくは、AUC、LC-MS、SECまたはHPSECの測定により、抗体または抗体断片の5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、最も好ましくは0.5%以下(しかし、特定の実施形態では少なくとも0.1%)が、上記で定義した期間保存した後に凝集体または断片(特に断片Iもしくは断片II)を形成する。さらに、それだけには限定されないが、抗体または抗体断片が目的の抗原に免疫特異的に結合する能力を測定するための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイを含めた様々な免疫学的アッセイ、ならびに抗体の補体活性化能力を測定するためのC3a/C4aアッセイの評価により、本発明の製剤では、上記条件下での長期保存中に抗体または抗体断片の生物活性の損失がほとんど示されない。本発明の製剤は、上記で定義した期間保存した後に、保存前の製剤の初期生物活性の80%を超える、85%を超える、90%を超える、95%を超える、98%を超える、99%を超える、または99.5%を超える生物活性を保持する。
本発明の製剤は単位剤型として製造することができる。たとえば、バイアル1個あたりの単位用量は、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、または20mlの、約15mg/ml〜約300mg/mlの範囲の様々な濃度のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含み得る。必要な場合は、それぞれのバイアルに滅菌希釈剤を加えることによって、これらの製造物を所望の濃度に調節することができる。
本発明は、目的の抗原に免疫特異的に結合する単一の抗体またはその断片を含む、安定した液体製剤を包含する。具体的な実施形態では、本発明は、RSV抗原に免疫特異的に結合する単一の抗体またはその断片を含む、安定した液体製剤を包含するが、ただし前記抗体はパリビツマブではない。本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する2つ以上の抗体またはそれらの断片を含む、安定した液体製剤も包含する。一実施形態では、本発明の安定した液体製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合する2つ以上の抗体またはそれらの断片を含み、抗体または抗体断片の一方はパリビツマブまたはその断片ではない。
5.3本発明の製剤において有用な抗体
本発明において有用な抗体には、それだけには限定されないが、モノクローナル抗体、合成抗体、多特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv(scFv)(二重特異性scFvを含む)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、および上記の任意のもののエピトープ結合断片が含まれる。具体的には、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類(たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであることができる。好ましくは、本発明の抗体は、IgG、より好ましくは、IgG1である。
本発明において有用な抗体は、鳥および哺乳動物を含めた任意の動物源に由来し得る(たとえば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)。好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化したモノクローナル抗体である。本明細書中で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリまたはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスもしくは他の動物から単離した抗体が含まれる。
本発明において有用な抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより高度な多特異性であり得る。多特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに免疫特異的に結合し得るか、またはポリペプチドおよび異種ポリペプチドもしくは固体担体材料などの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合し得る。たとえば、国際公開公報WO93/17715号、WO92/08802号、WO91/00360号、およびWO92/05793号;Tutt他、1991、J. Immunol. 147:60-69;米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号;ならびにKostelny他、1992、J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
本発明において有用な抗体には、抗体の誘導体が含まれる。たとえば、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介の突然変異誘発を含めた当業者に知られている標準の技術を用いて、本発明の方法で用いる抗体をコードしているヌクレオチド配列内に突然変異を導入することができる。好ましくは、誘導体には、最初の分子と比較して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換が含まれる。好ましい実施形態では、誘導体は、1つまたは複数の予測された非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の電荷を有する側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝鎖状側鎖(たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。あるいは、飽和突然変異誘発などによって、突然変異をコード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、生じた突然変異体を、活性を保持している突然変異体を同定するために、生物活性についてスクリーニングすることができる。突然変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。
本発明において有用な抗体には、修飾された誘導体、すなわち、共有結合などの任意の種類の分子と抗体との共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。たとえば、それに限定するわけではないが、抗体誘導体には、たとえば、既知の保護/遮断基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾された抗体が含まれる。数々の化学修飾の任意のものを、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの存在下での合成などを含めた既知の技術によって実施し得る。さらに、誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。
本発明において有用な抗体またはその断片は、当業者に知られているフレームワーク領域を含むこともできる。特定の実施形態では、1つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは、本発明の方法で用いる抗体またはその断片のフレームワーク領域の全体がヒトである。本発明の特定の他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片の断片領域はヒト化されている。特定の実施形態では、本発明の方法で用いる抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化キメラ抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、または二重特異性抗体である。
本発明の特定の実施形態では、本発明において有用な抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、12時間を超える、1日間を超える、3日間を超える、6日間を超える、10日間を超える、15日間を超える、20日間を超える、25日間を超える、30日間を超える、35日間を超える、40日間を超える、45日間を超える、2カ月を超える、3カ月を超える、4カ月を超える、または5カ月を超える半減期を有する。in vivo半減期が増加した抗体またはその抗原結合断片は、当業者に知られている技術によって作製することができる。たとえば、in vivo半減期が増加した抗体またはその抗原結合断片は、FcドメインとFcRn受容体との相互作用に関与すると同定されているアミノ酸残基を改変すること(たとえば、置換、欠失または付加)によって作製することができる(たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、PCT公報WO97/34631号および米国特許出願第10/020,354号、題名「Molecules with Extended Half-Lives, Compositions and Uses Thereof」、2001年12月12日出願、Johnson他を参照)。このような抗体またはその抗原結合断片は、当業者に知られている方法、たとえば本明細書中に記載の免疫アッセイによって、RSV抗原に対する結合活性およびin vivo有効性について試験することができる。
さらに、in vivo半減期が増加した抗体またはその抗原結合断片は、前記抗体または抗体断片に高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー分子を結合させることによって作製することができる。多官能性リンカーを用いてまたは用いずに、PEGと前記抗体もしくは抗体断片のN-もしくはC-末端との部位特異的コンジュゲーションまたはリシン残基上に存在するε-アミノ基のいずれかを介して、PEGを前記抗体または抗体断片に結合させることができる。もたらされる生物活性の損失が最小限である直鎖状または分枝鎖状ポリマー誘導体化を用いる。PEG分子と抗体との正しいコンジュゲーションを確実にするために、コンジュゲーションの度合をSDS-PAGEおよび質量分析によって細かく監視する。未反応のPEGは、たとえば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。PEG誘導体化抗体またはその抗原結合断片は、当業者に知られている方法、たとえば本明細書中に記載の免疫アッセイによって、RSV抗原に対する結合活性およびin vivo有効性について試験することができる。
本発明において有用な抗体は単鎖抗体であることができる。単鎖抗体の設計および構築は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているMarasco他、1993、Proc Natl Acad Sci 90:7889-7893に記載されている。
特定の実施形態では、本発明において有用な抗体は細胞内エピトープに結合する、すなわち、これらは細胞内抗体である。細胞内抗体は、抗原に免疫特異的に結合する能力を有する抗体の少なくとも一部分を含み、好ましくは、その分泌をコードしている配列を含まない。このような抗体は、その抗原に細胞内で結合する。一実施形態では、細胞内抗体は単鎖Fv(「sFv」)を含む。sFvとは、抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体断片であり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドはさらに、VHドメインとVLドメインとの間に、sFvが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。sFvの総説には、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New York、269-315頁 (1994)を参照されたい。
さらなる実施形態では、細胞内抗体は、作動可能な分泌配列をコードしておらず、したがって細胞内に保たれることが好ましい(一般に、Marasco, WA、1998、「Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications」 Springer:New Yorkを参照)。
5.3.1抗体コンジュゲート
本発明はまた、それだけには限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬、無機分子、および有機分子を含めた1つまたは複数の部分とコンジュゲートまたは融合した抗体を含む製剤も包含する。
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種タンパク質またはポリペプチド(もしくはその断片、好ましくは少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個もしくは100個のアミノ酸のポリペペチド)と、組換えによって融合したまたは化学的にコンジュゲートした(共有および非共有コンジュゲーションをどちらも含む)抗体を含む製剤を包含する。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こり得る。たとえば、in vitroまたはin vivoのどちらかで、抗体を、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲーションさせることによって、抗体を、特定の細胞種を異種ポリペプチドの標的とするために用い得る。また、当分野で知られている方法を用いて、異種ポリペプチドと融合またはコンジュゲートした抗体をin vitro免疫アッセイおよび精製方法に用い得る。たとえば、その全体で参考として組み込まれている、国際公開公報WO93/21232号;欧州特許EP439,095号;Naramura他、1994、Immunol. Lett. 39:91-99;米国特許第5,474,981号;Gillies他、1992、PNAS 89:1428-1432;およびFell他、1991、J. Immunol. 146:2446-2452を参照されたい。
本発明には、抗体断片と融合またはコンジュゲートした異種タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含む製剤がさらに含まれる。たとえば、異種ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、VL CDR、またはその断片と融合またはコンジュゲートしていてよい。ポリペプチドを抗体の一部分と融合またはコンジュゲーションさせる方法は、当分野で周知である。たとえば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号;欧州特許EP307,434号およびEP367,166号;国際公開公報WO96/04388号およびWO91/06570号;Ashkenazi他、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng他、1995、J. Immunol. 154:5590-5600;およびVil他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい(前記参考文献はその全体で参考として組み込まれている)。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング(「DNAシャフリング」と総称される)の技術によって作製し得る。DNAシャフリングは、本発明の抗体またはその断片の活性を変更するために用い得る(たとえば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片)。一般に、米国特許第5,605,793号;第5,811,238号;第5,830,721号;第5,834,252号;および第5,837,458号、ならびにPatten他、1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson他、1999、J. Mol. Biol. 287:265-76;ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、Biotechniques 24(2):308-313を参照されたい(これらの特許および出版物のそれぞれは、その全体が参考として本明細書中に組み込まれている)。抗体もしくはその断片、またはコードされている抗体もしくはその断片は、組換えの前に、誤りがちなPCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム突然変異誘発に供することによって変更し得る。抗体または抗体断片をコードしているポリヌクレオチドの1つまたは複数の部分を、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換え得る。
さらに、精製を容易にするために、抗体またはその断片をペプチドなどのマーカー配列を融合することができる。実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、多くが市販されているもののうち、とりわけ、pQEベクター(QIAGEN, Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、Calif.、91311)中に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz他、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、たとえば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、それだけには限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「HA」タグ(Wilson他、1984、Cell 37:767)および「flag」タグが含まれる。
他の実施形態では、本発明において有用な抗体またはその断片、類似体もしくはその誘導体は、診断剤または検出可能な薬剤とコンジュゲートさせることができる。そのような抗体は、特定の治療の有効性の決定など、臨床試験手順の一部として障害の発生または進行を監視または予後診断するために有用である可能性がある。そのような診断および検出は、抗体を、それだけには限定されないが、それだけには限定されないが西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素;それだけには限定されないがストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなどの補欠分子族;それだけには限定されないがウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンなどの蛍光物質;それだけには限定されないがルミノールなどの発光性物質;それだけには限定されないがルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光性物質;それだけには限定されないがヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、ならびに117Tinなどの放射性物質;様々な陽電子放射断層撮影、非放射性常磁性金属イオン、および分子放射標識したまたは特定の放射性同位体とコンジュゲートさせた分子を用いた陽電子放出金属を含めた、検出可能な物質とカップリングさせることによって、達成することができる。
本発明は、治療部分をコンジュゲートした抗体を含む製剤をさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、たとえば、細胞分裂抑制性もしくは細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン、たとえばα-放射体などの治療部分とコンジュゲートしていてよい。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。治療部分には、それだけには限定されないが、代謝拮抗剤(たとえば、メトトレキサート(methotrexate)、6-メルカプトプリン(6-mercaptopurine)、6-チオグアニン(6-thioguanine)、シタラビン(cytarabine)、5-フルオロウラシルデカルバジン(5-fluorouracil decarbazine))、アルキル化剤(たとえば、メクロレタミン(mechlorethamine)、チオエパクロラムブシル(thioepa chlorambucil)、メルファラン(melphalan)、カルムスチン(carmustine)(BCNU)およびロムスチン(lomustine)(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン(busulfan)、ジブロモマンニトール(dibromomannitol)、ストレプトゾトシン(streptozotocin)、マイトマイシンC(mytomycin C)、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(たとえば、ダウノルビシン(daunorubicin)(以前はダウノマイシン(daunomycin))およびドキソルビシン(doxorubicin))、抗生物質(たとえば、ダクチノマイシン(dactinomycin)(以前はアクチノマイシン(actinomycin))、ブレオマイシン(bleomycin)、ミトラマイシン(mithramycin)、およびアンスラマイシン(anthramycin)(AMC))、アウリスタチン(auristatin)分子(たとえば、アウリスタチンPHE、ブリオスタチン1(bryostatin 1)、およびソラスタチン10(solastatin 10);すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Woyke他、Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woyke他、Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammad他、Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wall他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammad他、Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)を参照)、ホルモン(たとえば、糖質コルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、およびエストロゲン)、DNA修復酵素阻害剤(たとえば、エトポシド(etoposide)またはトポテカン(topotecan))、キナーゼ阻害剤(たとえば、化合物ST1571、メシル酸イマチニブ(imatinib mesylate)(Kantaijian他、Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002))、細胞毒性剤(たとえば、パクリタキセル(paclitaxel)、サイトカラシンB(cytochalasin B)、グラミシジンD(gramicidin D)、臭化エチジウム(ethidium bromide)、エメチン(emetine)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、コルヒチン(colchicin)、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、ミトラマイシン(mithramycin)、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン(1-dehydrotestosterone)、プロカイン(procaine)、テトラカイン(tetracaine)、リドカイン(lidocaine)、プロプラノロール(propranolol)、およびプロマイシン(puromycin)、およびそれらの類似体または相同体)ならびに米国特許第6,245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,911,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示されている化合物)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(たとえば、R115777、BMS-214662、および、たとえば、米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,211,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号、および第6,040,305号に開示されているもの)、トポイソメラーゼ阻害剤(たとえば、カンプトテシン(camptothecin);イリノテカン(irinotecan);SN-38;トポテカン;9-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin);GG-211(GI147211);DX-895If;IST-622;ルビテカン(rubitecan);ピラゾロアクリジン(pyrazoloacridine);XR-5000;セイントピン(saintopin);UCE6;UCE1022;TAN-1518A;TAN-1518B;KT6006;KT6528;ED-110;NB-506;ED-110;NB-506;およびレベッカマイシン(rebeccamycin));ブルガレイン(bulgarein);Hoescht色素33342およびHoechst色素33258などのDNA副溝結合剤;ニチジン(nitidine);ファガロニン(fagaronine);エピベルベリン(epiberberine));コラリン(coralyne);β-ラパコン(beta-lapachone);BC-4-1;ビスホスホネート(たとえば、アレンドロネート、シマドロント(cimadronte)、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレンドロネート)HMG-CoAレダクターゼ阻害剤、(たとえば、ロバスタチン(lovastatin)、シンバスタチン(simvastatin)、アトルバスタチン(atorvastatin)、プラバスタチン(pravastatin)、フルバスタチン(fluvastatin)、スタチン(statin)、セリバスタチン(cerivastatin)、レスコール(lescol)、ルピトール(lupitor)、ロスバスタチン(rosuvastatin)およびアトルバスタチン(atorvastatin))ならびにそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物、クラスレート、およびプロドラッグ。たとえば、Rothenberg, M. L.、Annals of Oncology 8:837-855(1997);およびMoreau, P.他、J. Med. Chem. 41:1631-1640(1998)を参照)、抗センスオリゴヌクレオチド(たとえば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号、および第5,618,709号に開示されているもの)、免疫調節物質(たとえば、抗体およびサイトカイン)、抗体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤(たとえば、リン酸フルダラビンおよび2-クロロデオキシアデノシン)が含まれる。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を改変する治療部分または薬物部分とコンジュゲートしていてもよい。治療部分または薬物部分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。たとえば、薬物部分は、所望の生物活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、たとえば、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化剤、アポトーシス剤、たとえば、TNFα、TNFβ、AIM I(国際公開公報WO97/33899号を参照)、AIM II(国際公開公報WO97/34911号を参照)、Fasリガンド(Takahashi他、1994、J. Immunol., 6:1567-1574)、およびVEGI(国際公開公報WO99/23105を参照)、血栓剤または抗血管形成剤、たとえば、アンジオスタチン、エンドスタチンまたは凝血経路の構成成分(たとえば組織因子);または、たとえば、リンホカイン(たとえば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、成長因子(たとえば成長ホルモン(「GH」))、もしくは凝血剤(たとえば、カルシウム、ビタミンK、組織因子、たとえば、それだけには限定されないが、ハーゲマン因子(XII因子)、高分子量キニノーゲン(HMWK)、プレカリクレイン(PK)、凝血タンパク質-II因子(プロトロンビン)、V因子、XIIa因子、VIII因子、XIIIa因子、XI因子、XIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、リン脂質。フィブリノーゲンのαおよびβ鎖由来の線維素ペプチドAおよびB、フィブリン単量体)などの生物学的応答改変剤が含まれ得る。
さらに、抗体を、213Bi等のα-放射体などの放射性金属イオン、またはそれだけには限定されないが131In、131LU、131Y、131Ho、131Smを含めた放射性金属イオンとポリペプチドとのコンジュゲーションに有用な大環状キレート剤などの治療部分とコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子によって抗体に付着させることができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"'-四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は一般的に当分野で知られており、それぞれがその全体で参考として組み込まれているDenardo他、1998、Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson他、1999、Bioconjug. Chem. 10(4):553-7;およびZimmerman他、1999、Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
治療部分を抗体とコンジュゲーションさせる技術は知られており、たとえば、Arnon他、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld他編、243-56頁 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom他、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery (第2版)、Robinson他編、623-53頁 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pinchera他編、475-506頁 (1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin他編、303-16頁 (Academic Press 1985)、およびThorpe他、1982、Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
あるいは、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているSegal、米国特許第4,676,980号に記載されているように、抗体を第2の抗体とコンジュゲートさせて、抗体異種コンジュゲートを形成することができる。
抗体またはその断片とコンジュゲートした治療部分または薬物は、被験体における特定の障害に対して所望の予防的または治療効果(もしくは複数の効果)が達成されるように選択すべきである。臨床家または他の医療関係者は、どの治療部分または薬物を抗体またはその断片とコンジュゲートさせるかを決定する際に、疾患の性質、疾患の重篤度、および被験体の状態を考慮すべきである。
また、抗体を、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用な固体担体に結合させてもよい。そのような固体担体には、それだけには限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれる。
5.3.2特定の抗原に特異的に結合する精製抗体を含む製剤
さらなる実施形態では、本発明は、1つまたは複数の特定の抗原に特異的に結合する抗体を含む単離した抗体または組成物を含む製剤を包含する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス(human metapneumovirus)(hMPV)の抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、hMPVの抗原に特異的に結合するヒト化抗体である。特定の実施形態では、本発明の抗体はインテグリンαvβ3に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体はMEDI-522(ビタキシン(Vitaxin)(登録商標))である。特定の実施形態では、本発明の抗体はCD2に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体はシプリズマブ(siplizumab)である。特定の実施形態では、本発明の抗体はCD19に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体はMT-103である。さらなる実施形態では、本発明の抗体はEphA2に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化したEA2またはEA5である。特定の実施形態では、本発明の抗体はEphA4に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、EphA4に特異的に結合するヒト化抗体である。特定の実施形態では、本発明の抗体はIL-9に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、IL-9に特異的に結合するヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体はMEDI-528である。
一部の実施形態では、抗体はパリビツマブではない。一部の実施形態では、抗体はMEDI-522(ビタキシン(登録商標))ではない。一部の実施形態では、抗体はシプリズマブではない。一部の実施形態では、抗体はMT-103ではない。一部の実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化したEA2またはEA5ではない。一部の実施形態では、抗体はMEDI-528ではない。
本発明において有用な抗体は、高力価抗体であり得る。高力価抗体は、適切な抗体遺伝子配列を遺伝子操作し、抗体配列を適切な宿主中で発現させることによって、製造することができる。製造した抗体は、たとえば、BIAcoreアッセイにおいて高いkon値を有する抗体を同定するためにスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本発明において有用な抗体は、1つまたは複数の抗原に対して高い結合親和性を有する。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、会合速度定数すなわちkon速度(抗体(Ab)+抗原(Ag)kon→Ab-Ag)が少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1である。好ましい実施形態では、本発明の抗体のkonは、少なくとも2×105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1である。
別の実施形態では、本発明の抗体のkoff速度(抗体(Ab)+抗原)は、10-1s-1未満、5×10-1s-1未満、10-2s-1未満、5×10-2s-1未満、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または10-10s-1未満である。好ましい実施形態では、本発明の抗体のkonは、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または10-10s-1未満である。
特定の実施形態では、本発明の抗体の親和定数すなわちKa(kon/koff)は、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1である。本発明はまた、少なくとも2×108M-1、少なくとも2.5×108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1の親和定数で抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を含む製剤も提供する。
さらに別の実施形態では、本発明において有用な抗体の解離定数すなわちKd(koff/kon)は、10-2M未満、5×10-2M未満、10-3M未満、5×10-3M未満、10-4M未満、5×10-4M未満、10-5M未満、5×10-5M未満、10-6M未満、5×10-6M未満、10-7M未満、5×10-7M未満、10-8M未満、5×10-8M未満、10-9M未満、5×10-9M未満、10-10M未満、5×10-10M未満、10-11M未満、5×10-11M未満、10-12M未満、5×10-12M未満、10-13M未満、5×10-13M未満、10-14M未満、5×10-14M未満、10-15M未満、または5×10-15M未満である。
特定の実施形態では、本発明において有用な抗体の中央有効濃度(EC50)は、in vitro微量中和アッセイにおいて0.01nM未満、0.025nM未満、0.05nM未満、0.1nM未満、0.25nM未満、0.5nM未満、0.75nM未満、1nM未満、1.25nM未満、1.5nM未満、1.75nM未満、または2nM未満である。中央有効濃度とは、in vitro微量中和アッセイにおいて抗原の50%を中和する、抗体または抗体断片の濃度である。好ましい実施形態では、本発明の抗体のEC50は、in vitro微量中和アッセイにおいて0.01nM未満、0.025nM未満、0.05nM未満、0.1nM未満、0.25nM未満、0.5nM未満、0.75nM未満、1nM未満、1.25nM未満、1.5nM未満、1.75nM未満、または2nM未満である。
本発明はまた、目的の抗原に免疫特異的に結合する、目的の抗原に免疫特異的に結合する本明細書中に記載のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、およびVL CDRの誘導体を含む、抗体も提供する。たとえば、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介の突然変異誘発を含めた当業者に知られている標準の技術を用いて、本発明の分子をコードしているヌクレオチド配列内に突然変異を導入することができる。好ましくは、誘導体には、最初の分子と比較して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換が含まれる。好ましい実施形態では、誘導体は、1つまたは複数の予測された非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の電荷を有する側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖(たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝鎖状側鎖(たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。あるいは、飽和突然変異誘発などによって、突然変異をコード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、生じた突然変異体を、活性を保持している突然変異体を同定するために、生物活性についてスクリーニングすることができる。突然変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。
5.3.3RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体
RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体は当分野で知られていることを理解されたい。たとえば、パリビツマブは、小児患者においてRSV感染症の予防に現在使用されているヒト化モノクローナル抗体である。本発明は、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体の製剤を提供する。好ましくは、本発明において有用な抗体は、RSVの株に関係なく1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する。本発明はまた、1つのRSV株に対して別のRSV株で示差的または優先的にRSV抗原に結合する抗体も提供する。具体的な実施形態では、製剤は、RSV F糖タンパク質、G糖タンパク質またはSHタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含む。好ましい実施形態では、製剤は、RSV F糖タンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含む。別の好ましい実施形態では、製剤は、RSV F糖タンパク質のA、B、またはC抗原部位に結合する抗体を含む。
本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合し、本明細書中に記載のまたは当業者に知られている(たとえばBIAcoreアッセイ)を用いた評価により3000pM未満、2500pM未満、2000pM未満、1500pM未満、1000pM未満、750pM未満、500pM未満、250pM未満、200pM未満、150pM未満、100pM未満、75pM未満の解離定数(KD)を有する抗体を含む。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合し、本明細書中に記載のまたは当業者に知られている(たとえばBIAcoreアッセイ)を用いた評価により25〜3400pM、25〜3000pM、25〜2500pM、25〜2000pM、25〜1500pM、25〜1000pM、25〜750pM、25〜500pM、25〜250pM、25〜100pM、25〜75pM、25〜50pMの解離定数(KD)を有する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合し、本明細書中に記載のまたは当業者に知られている(たとえばBIAcoreアッセイ)を用いた評価により500pM、好ましくは100pM、より好ましくは75pM、最も好ましくは50pMの解離定数(KD)を有する抗体を含む。
本発明は、in vitro微量中和アッセイにおいて5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1.75nM未満、1.5nM未満、1.25nM未満、1nM未満、0.75nM未満、0.5nM未満、0.25nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.025nM未満、または0.01nM未満の中央抑制濃度(IC50)を有する抗体を含む製剤を提供する。IC50とは、in vitro微量中和アッセイにおいてRSVの50%を中和する抗体の濃度である。好ましい実施形態では、本発明の抗体のIC50は、in vitro微量中和アッセイにおいて5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1.75nM未満、1.5nM未満、1.25nM未満、1nM未満、0.75nM未満、0.5nM未満、0.25nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.025nM未満、または0.01nM未満である。
具体的な実施形態では、本発明の製剤は、当分野で知られているまたは本明細書中に記載のアッセイ(たとえばBIAcoreアッセイ)による評価によって、RSV F抗原に対する親和性がパリビツマブまたはその抗体結合断片と比較して約20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、90倍、100倍以上である抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、当分野で知られているまたは本明細書中に記載のアッセイによる評価によって、パリビツマブまたはその抗原結合断片よりも約1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、またはそれ以上高いKaを有する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、本明細書中に記載のものなどのin vitro微量中和アッセイにおいて、パリビツマブまたはその抗原結合断片よりも約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、または20倍以上強力な抗体を含む。パリビツマブのアミノ酸配列は、たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれているJohnson他、1997、J. Infectious Disease 176:1215-1224、および米国特許第5,824,307号に開示されている。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、パリビツマブまたはパリビツマブの断片またはパリビツマブの抗原結合断片ではない抗体を含む、たとえば、配列番号7のVHドメインおよび/または配列番号8のVLドメインを含む抗体ではない。
本発明は、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合し、図3に示す、可変軽鎖(VL)ドメインおよび/または可変重鎖(VH)ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有するパリビツマブのアミノ酸配列を含む抗体を提供する。本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、1つもしくは複数のVL CDRおよび/または1つもしくは複数のVH CDR中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有するパリビツマブのアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、抗体は、表1に太字および下線で示したアミノ酸残基の、1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有するパリビツマブのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体は、表1に太字および下線で示したアミノ酸残基の1つまたは複数のアミノ酸残基置換ならびにパリビツマブの可変ドメインのフレームワーク領域の1つまたは複数のアミノ酸残基置換(たとえば、重鎖のフレームワーク領域4および/または軽鎖可変ドメイン中の突然変異)を有するパリビツマブのアミノ配列を含む。これらの実施形態に従って、アミノ酸残基置換は保存的または非保存的であることができる。パリビツマブのVHドメイン、VH CDR、VLドメインおよび/またはVL CDR中に置換を導入することによって製造した抗体は、たとえば、RSV F抗原に結合するその能力、RSVを中和するその能力、あるいは上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療または改善させるその能力に関して、in vitroおよびin vivoで試験することができる。
Figure 2008546805
本発明の製剤はまた、本出願の表2および実施例の部で参照する抗体および抗体の抗原結合断片も含む。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、抗体AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の抗原結合断片(たとえばFab断片)を含む。好ましい実施形態では、本発明の製剤は、抗体A4B4L1FR-S28Rまたはその抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、および/またはA17h4は、パリビツマブのフレームワーク領域および定常領域を含む(図3参照)。好ましい実施形態では、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、および/またはA17h4は、パリビツマブのフレームワーク領域および定常領域を含むが、例外的に、重鎖フレームワーク4(FR4)中にA105Qのアミノ酸置換(本明細書中で用いる番号付けは、Kabat他(1991) Sequences of proteins of immunological interest (U.S. Department of Health and Human Services、Washington, D.C.)第5版に従う)(「カバットナンバリング」)(すなわち配列番号7中の位置112(パリビツマブVHドメイン))および軽鎖FR4中にL104Vのアミノ酸置換(すなわち配列番号8中の位置103(パリビツマブVLドメイン))が存在する。これらのVHおよびVLの単一突然変異を有するフレームワークの抗体の例は、図4(1X-493L1FR)および図5(A4B4L1FR-S28R)に示されている。
具体的な実施形態では、本発明は、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を提供し、前記抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4のVH鎖および/またはVL鎖のアミノ酸配列を有するVH鎖および/またはVL鎖を含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、RSV F抗原に免疫特異的に結合し、前記抗体は、A4B4L1FR-S28のVHおよび/またはVL鎖のアミノ酸配列を有するVH鎖および/またはVL鎖を含む(VH鎖、配列番号254;VL鎖、配列番号255)。別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を提供し、前記抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4のVHドメインおよび/またはVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよび/またはVLドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、RSV F抗原に免疫特異的に結合し、前記抗体は、A4B4L1FR-S28RのVHドメインおよび/またはVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよび/またはVLドメインを含む(VHドメイン、配列番号48;VLドメイン、配列番号11)。
別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(MEDI-524、モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のCDRのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のCDRを含む。好ましい実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記抗体は、A4B4L1FR-S28Rの1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のCDRのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のCDRを含む。さらに別の実施形態では、本発明の製剤は、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、および/またはA17h4のVH CDRおよび/またはVL CDRのアミノ酸配列を有するVH CDRおよび/またはVL CDRの組合せを含む。好ましい実施形態では、本発明の製剤は、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記抗体は、A4B4L1FR-S28RのVH CDRおよび/またはVL CDRのアミノ酸配列を有するVH CDRおよび/またはVL CDRの組合せを含む。
本発明は、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表2に記載のVH鎖の任意の1つのアミノ酸配列を有する可変重鎖(「VH」)鎖を含む。特定の実施形態では、抗体はパリビツマブではなく、かつ/またはVH鎖はパリビツマブのVH鎖ではない。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、表2に記載のVHドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。本発明の特定の実施形態では、抗体はパリビツマブではなく、かつ/またはVHドメインはパリビツマブのVHドメインではない。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、表2および/または表3A〜3Cに記載のVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有するVH相補性決定領域(「CDR」)(たとえば、VH CDR1、VH CDR2、および/またはVH CDR3)を含む。本発明の特定の実施形態では、表2および/または表3A〜3Cに記載のVH CDRの任意の1つのアミノ酸を有するVH CDRを含む抗体は、パリビツマブではない。一部の実施形態では、抗体またはその結合断片は、表2および/または表3A〜3Cに記載のVH CDRの1つ、2つまたは3つを含む。
Figure 2008546805
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 一実施形態では、本発明の製剤は、配列番号1、配列番号10または配列番号18のアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号2、配列番号19、配列番号25、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号305または配列番号329のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号3、配列番号12、配列番号20、配列番号29、配列番号79または配列番号311のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号1、配列番号10または配列番号18のアミノ酸配列を有するVH CDR1、配列番号2、配列番号19、配列番号25、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号305または配列番号329のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および配列番号3、配列番号12、配列番号20、配列番号29、配列番号79または配列番号311のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の製剤は、配列番号10のアミノ酸配列を有するVH CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む抗体を含む。これらの実施形態に従って、抗体はRSV F抗原に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、抗体は、パリビツマブ、パリビツマブのFab断片、またはその抗原結合断片ではない。具体的な実施形態では、抗体はRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に対して高い親和性を有する。
一実施形態では、VHドメインのアミノ酸配列は
Figure 2008546805
(配列番号48)であり、3つの下線領域はそれぞれVHのCDR1、CDR2、およびCDR3領域を示し;4つの下線のない領域はそれぞれVLのFR1、FR2、FR3、FR4に関連し;アスタリスクは図1B(配列番号7)に示すパリビツマブのVH FR4と比較したVH FR4中のA→Q突然変異の位置を示す。このVHドメイン(配列番号48)は、本明細書中の他の箇所に記載し、図13Aに示したモタビツマブ抗体のものと同一である。一部の実施形態では、このVH FRは、表1および/または表3A〜Cに同定したVH CDRのいずれかと組み合わせて用いることができる。一実施形態では、モタビツマブ抗体は、図13A(配列番号208)のVHドメインならびにJohnson他、(1997) J. Infect. Dis. 176、1215-1224および米国特許第5,824,307号に記載のC-γ-1(nG1m)定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号208のアミノ酸配列を有するVH鎖を含む。
本発明は、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表2に記載のVL鎖の任意の1つのアミノ酸配列を有するVL鎖を含む。特定の実施形態では、抗体はパリビツマブではなく、かつ/またはVL鎖はパリビツマブのVL鎖ではない。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体(たとえばRSV F抗原)も提供し、前記抗体は、表2に記載のVLドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有する可変軽鎖(「VL」)ドメインを含む。特定の実施形態では、抗体はパリビツマブではなく、かつ/またはVHドメインはパリビツマブのVHドメインではない。本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体(たとえばRSV F抗原)も提供し、前記抗体は、表2および/または表3D〜3Fに記載のVL CDRの任意の1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。特定の実施形態では、抗体はパリビツマブではない。一部の実施形態では、抗体は、表2および/または表3D〜3Fに記載のVL CDRのうちの1つ、2つまたは3つを含む。
本発明の一実施形態では、抗体は、配列番号4、配列番号14、配列番号22、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号72、配列番号314、配列番号320または配列番号335のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号5、配列番号15、配列番号23、配列番号27、配列番号32、配列番号35、配列番号43、配列番号50、配列番号53、配列番号57、配列番号59、配列番号63、配列番号66、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号308、配列番号315、配列番号321、配列番号326、配列番号332または配列番号336のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号6、配列番号16または配列番号61のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号4、配列番号14、配列番号22、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号72、配列番号314、配列番号320または配列番号335のアミノ酸配列を有するVL CDR1、配列番号5、配列番号15、配列番号23、配列番号27、配列番号32、配列番号35、配列番号43、配列番号50、配列番号53、配列番号57、配列番号59、配列番号63、配列番号66、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号308、配列番号315、配列番号321、配列番号326、配列番号332または配列番号336のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および配列番号6、配列番号16または配列番号61のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の製剤は、配列番号39のアミノ酸配列を有するVL CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗体を含む。これらの実施形態に従って、抗体はRSV F抗原に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、抗体はパリビツマブまたはその抗原結合断片(たとえばパリビツマブのFab断片)ではない。別の具体的な実施形態では、抗体はRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に対して高い親和性を有する。
一実施形態では、VLドメインのアミノ酸配列は
Figure 2008546805
(配列番号8)であり、3つの下線領域はそれぞれVLのCDR1、CDR2、およびCDR3領域を示し;4つの下線のない領域はそれぞれVLのFR1、FR2、FR3、FR4に関連し;アスタリスクは図1Aに示すパリビツマブのVL FR4と比較したVL FR4中のL→V突然変異の位置を示す。このVLドメイン(配列番号8)は、本明細書中の他の箇所に記載し、図13Bに示したモタビツマブ抗体のものと同一である。一部の実施形態では、このVLフレームワークは、表1および/または表3D〜3Fに同定したVL CDRのいずれかと組み合わせて用いることができる。一実施形態では、モタビツマブ抗体は、図13BのVLドメイン(配列番号209)ならびにJohnson他、(1997) J. Infect. Dis. 176、1215-1224および米国特許第5,824,307号に記載のC-κ定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号209のアミノ酸配列を有するVL鎖を含む。
本発明はさらに、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、本明細書中に開示したVL鎖、または他のVL鎖と組み合わせた、本明細書中に開示したVH鎖を含む。本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体も提供し、抗体は、本明細書中に開示したVH鎖、または他のVH鎖と組み合わせた、本明細書中に開示したVL鎖を含む。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する抗体(たとえばRSV F抗原)も提供し、前記抗体は、本明細書中に開示したVLドメイン、または他のVLドメインと組み合わせた、本明細書中に開示したVHドメインを含む。本発明はさらに、1つまたは複数のRSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、本明細書中に開示したVHドメイン、または他のVHドメインと組み合わせた、本明細書中に開示したVLドメインを含む。
具体的な実施形態では、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号7、配列番号9、配列番号17、配列番号24、配列番号28、配列番号33、配列番号36、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号51、配列番号55、配列番号67、配列番号78、配列番号304、配列番号310、配列番号317、配列番号323または配列番号328のアミノ酸配列を有するVHドメイン、および配列番号8、配列番号13、配列番号21、配列番号26、配列番号30、配列番号34、配列番号38、配列番号42、配列番号46、配列番号49、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号68、配列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号76、配列番号307、配列番号313、配列番号319、配列番号325、配列番号331または配列番号334のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。好ましい実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号48のアミノ酸配列を有するVHドメインおよび配列番号11のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む。具体的な実施形態では、抗体はパリビツマブまたはその抗原結合断片(たとえばFab断片)ではない。別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に対して高い親和性を有する。
本発明はさらに、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVH CDR1を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR2(もしくは他のVH CDR2)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR3(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR1(もしくは他のVL CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR2(もしくは他のVL CDR2)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR3(もしくは他のVL CDR3)と組み合わせて含む。本発明はまた、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体も提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVH CDR2を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR1(もしくは他のVH CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR3(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR1(もしくは他のVL CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR2(もしくは他のVL CDR2)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR3(もしくは他のVL CDR3)と組み合わせて含む。本発明はまた、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体も提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVH CDR3を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR1(もしくは他のVH CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR2(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR1(もしくは他のVL CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR2(もしくは他のVL CDR2)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR3(もしくは他のVL CDR3)と組み合わせて含む。本発明はまた、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体も提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVL CDR1を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR1(もしくは他のVH CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR2(もしくは他のVH CDR2)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR3(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR2(もしくは他のVL CDR2)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR3(もしくは他のVL CDR3)と組み合わせて含む。本発明はさらに、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVL CDR2を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR1(もしくは他のVH CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR2(もしくは他のVH CDR2)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR3(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR1(もしくは他のVL CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR3(もしくは他のVL CDR3)と組み合わせて含む。本発明はまた、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に特異的に結合する抗体も提供し、抗体は、本明細書中に開示した任意のVL CDR3を、任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR1(もしくは他のVH CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR2(もしくは他のVH CDR2)と組み合わせて)、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVH CDR3(もしくは他のVH CDR3)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR1(もしくは他のVL CDR1)と組み合わせて、および/または任意選択で本明細書中に開示した任意のVL CDR2(もしくは他のVL CDR2)と組み合わせて含む。
本発明はまた、表2および/または表3A〜3Fに記載の1つまたは複数のVH CDRおよび1つまたは複数のVL CDRを含む抗体も提供する。具体的には、本発明は、VH CDR1およびVL CDR1;VH CDR1およびVL CDR2;VH CDR1およびVL CDR3;VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR3およびVH CDR1;VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR3およびVL CDR3;VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CD
R1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;または表2および/もしくは表3A〜3Fに記載のVH CDRおよびVL CDRの任意の組合せを含む抗体を提供する。具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に対して高い親和性を有する抗体を含む。
本発明はまた、VH CDR1およびVL CDR1、VH CDR1およびVL CDR2、VH CDR1およびVL CDR3、VH CDR1およびVL CDR1;VH CDR1およびVL CDR2;VH CDR1およびVL CDR3;VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR3およびVH CDR1;VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR3およびVL CDR3;VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL C
DR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;または上記表2および/もしくは表3A〜3Fに記載のVH CDRおよびVL CDRの任意の組合せを含む、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供する。別の具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に対して高い親和性を有する抗体を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、配列番号1、配列番号10または配列番号18のアミノ酸配列を有するVH CDR1および配列番号4、配列番号14、配列番号22、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号314、配列番号320または配列番号335のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号1、配列番号10または配列番号18のアミノ酸配列を有するVH CDR1および配列番号5、配列番号15、配列番号23、配列番号27、配列番号32、配列番号35、配列番号43、配列番号50、配列番号53、配列番号57、配列番号59、配列番号63、配列番号66、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号308、配列番号315、配列番号321、配列番号326、配列番号332または配列番号336のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号1、配列番号10または配列番号18のアミノ酸配列を有するVH CDR1および配列番号6、配列番号16または配列番号61のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗体を含む。これらの実施形態に従って、抗体はRSV F抗原に免疫特異的に結合する。
別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号2、配列番号19、配列番号25、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号305または配列番号329のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および配列番号4、配列番号14、配列番号22、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号314、配列番号320または配列番号335のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号2、配列番号19、配列番号25、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号305または配列番号329のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および配列番号5、配列番号15、配列番号23、配列番号27、配列番号32、配列番号35、配列番号43、配列番号50、配列番号53、配列番号57、配列番号59、配列番号63、配列番号66、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号308、配列番号315、配列番号321、配列番号326、配列番号332または配列番号336のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号2、配列番号19、配列番号25、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号305または配列番号329のアミノ酸配列を有するVH CDR2、および配列番号6、配列番号16または配列番号61のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。これらの実施形態に従って、抗体はRSV F抗原に免疫特異的に結合する。
別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号3、配列番号12、配列番号20、配列番号29、配列番号79または配列番号311のアミノ酸配列を有するVH CDR3、および配列番号4、配列番号14、配列番号22、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号314、配列番号320または配列番号335のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、配列番号3、配列番号12、配列番号20、配列番号29、配列番号79または配列番号311のアミノ酸配列を有するVH CDR3、および配列番号5、配列番号15、配列番号23、配列番号27、配列番号32、配列番号35、配列番号43、配列番号50、配列番号53、配列番号57、配列番号59、配列番号63、配列番号66、配列番号69、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号308、配列番号315、配列番号321、配列番号326、配列番号332または配列番号336のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号3、配列番号12、配列番号20、配列番号29、配列番号79または配列番号311のアミノ酸配列を有するVH CDR3、および配列番号6、配列番号16または配列番号61のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。これらの実施形態に従って、抗体はRSV F抗原に免疫特異的に結合する。
本発明は、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたは抗原結合断片中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有する、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、1つまたは複数のVH CDRおよび/または1つまたは複数のVL CDR中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有する、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。置換されていてもよい、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4のVH CDRおよびVL CDR中のアミノ酸残基の非限定的な例は、表2に太字で示した。本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、1つもしくは複数のVHフレームワークおよび/または1つもしくは複数のVLフレームワーク中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有する、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、VL CDRおよび/またはフレームワーク中に置換を導入することによって作製した抗体は、たとえば、RSV抗原に結合するその能力、ならびに上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、または1つもしくは複数のその症状を予防、治療および/または改善させるその能力に関して、in vitroおよび/またはin vivoで試験することができる。
具体的な実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、パリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(MEDI-524、モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、A17h4、またはその抗原結合断片をコードしているヌクレオチド配列(または複数のヌクレオチド配列)に、ストリンジェント条件下、たとえば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃における、フィルターに結合したDNAとのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC/0.1%のSDS、約50〜65℃での1回もしくは複数回の洗浄、高ストリンジェント条件下、たとえば、6×SSC中、約45℃における、フィルターに結合した核酸とのハイブリダイゼーション、0.1×SSC/0.2%のSDS、約68℃での次いで1回もしくは複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(たとえば、Ausubel, F.M.他編、1989、Current Protocols in Molecular Biology、第I巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.、New York、6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照)でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、もしくはA17h4、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列と、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、またはその抗原結合断片のアミノ酸配列と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2に記載のVHおよび/またはVLドメインの任意の1つをコードしているヌクレオチド配列に、ストリンジェント条件下、たとえば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃における、フィルターに結合したDNAとのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC/0.1%のSDS、約50〜65℃での1回もしくは複数回の洗浄、高ストリンジェント条件下、たとえば、6×SSC中、約45℃における、フィルターに結合した核酸とのハイブリダイゼーション、0.1×SSC/0.2%のSDS、約68℃での次いで1回もしくは複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(たとえば、Ausubel, F.M.他編、1989、Current Protocols in Molecular Biology、第I巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.、New York、6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照)でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、VHドメインのアミノ酸配列および/またはアミノ酸配列VLドメインを含む。別の実施形態では、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2および/または表3A〜3Fに記載のVH CDRまたはVL CDRの任意の1つをコードしているヌクレオチド配列に、ストリンジェント条件下、たとえば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃における、フィルターに結合したDNAとのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC/0.1%のSDS、約50〜65℃での1回もしくは複数回の洗浄、高ストリンジェント条件下、たとえば、6×SSC中、約45℃における、フィルターに結合した核酸とのハイブリダイゼーション、0.1×SSC/0.2%のSDS、約68℃での次いで1回もしくは複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、VH CDRのアミノ酸配列またはVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、それぞれ表2および/または表3A〜3Fに記載のVH CDRおよびVL CDRの任意の1つをコードしているヌクレオチド配列に、ストリンジェント条件下、たとえば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃における、フィルターに結合したDNAとのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC/0.1%のSDS、約50〜65℃での1回もしくは複数回の洗浄、高ストリンジェント条件下、たとえば、6×SSC中、約45℃における、フィルターに結合した核酸とのハイブリダイゼーション、0.1×SSC/0.2%のSDS、約68℃での次いで1回もしくは複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、VH CDRのアミノ酸配列およびVL CDRのアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2に記載のVHドメインの任意の1つと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、VHドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2および/または表3A〜3Cに記載のVH CDRのいずれかと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、1つまたは複数のVH CDRのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2に記載のVLドメインの任意の1つと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、VLドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、表2および/または表3D〜3Fに記載のVL CDRのいずれかと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、1つまたは複数のVL CDRのアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、RSV F抗原との結合に対して表2に記載の抗体またはFab断片と競合する抗体も提供する。本発明はまた、RSV F抗原との結合に対して、表2に記載のVLドメインおよび/またはVHドメインを含むポリペプチド、タンパク質またはペプチドと競合する、VLドメインおよび/またはVHドメインを含むポリペプチド、タンパク質およびペプチドも包含する。さらに、本発明は、RSV F抗原との結合に対して、表2および/または表3A〜3Fに記載のVL CDRおよび/またはVH CDRを含むポリペプチド、タンパク質またはペプチドと競合する、VL CDRおよび/またはVH CDRを含むポリペプチド、タンパク質およびペプチドを包含する。
本発明の製剤は、修飾された誘導体、すなわち、共有結合などの任意の種類の分子と抗体との共有結合によって修飾された誘導体を含めた抗体を含む。たとえば、それに限定するわけではないが、抗体誘導体には、たとえば、既知の保護/遮断基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾された抗体が含まれる。数々の化学修飾の任意のものを、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた既知の技術によって実施し得る。さらに、誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。
本発明はまた、当業者に知られているフレームワーク領域(たとえばヒトまたは非ヒト断片)を含む、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体も提供する。フレームワーク領域は、天然に存在するものまたはコンセンサスフレームワーク領域であり得る。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒトである(たとえば、ヒトフレームワーク領域のリストには、その全体が参考として本明細書中に組み込まれている、Chothia他、1998、J. Mol. Biol. 278:457-479を参照)。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のフレームワーク領域を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体は、表2に記載の抗体のCDRのうちの1つもしくは複数(すなわち、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、もしくはA17h4)および/または表3A〜3FのCDRのうちの1つもしくは複数のアミノ酸配列、ならびに以下の残基のうちの1つ、2つ、3つ以上において1つまたは複数のアミノ酸置換を有するヒトフレームワーク領域を含む:(a)ネズミ(murine)抗体フレームワーク(すなわちドナー抗体フレームワーク)とヒト抗体フレームワーク(すなわちアクセプター抗体フレームワーク)とで異なるrareフレームワーク残基;(b)ベニエ(Venier)ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワークとで異なる場合はゾーン残基;(c)ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワークとで異なる、VH/VL境界における鎖間パッキング残基;(d)ドナー抗体フレームワークとアクセプター抗体フレームワーク配列とで異なる基準残基、特にネズミ抗体CDRループの基準クラスの定義に重要なフレームワーク領域;(e)CDRに隣接する残基;(g)抗原と相互作用することができる残基;(h)CDRと相互作用することができる残基;および(i)VHドメインとVLドメインとの間の接触残基。
本発明は、RSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む製剤を包含し、前記抗体は、フレームワーク領域中に突然変異(たとえば1つまたは複数のアミノ酸置換)を有する、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体は、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有する、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の可変重鎖ドメインおよび/もしくは可変軽鎖ドメインまたはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む製剤も包含し、前記抗体は、フレームワーク領域中に突然変異(たとえば1つまたは複数のアミノ酸置換)を有するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域中に1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体は、図2または図13に示すフレームワーク領域を含む。
本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、超可変およびフレームワーク領域中に突然変異(たとえば1つまたは複数のアミノ酸残基置換)を有する、表2の抗体(すなわち、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4)の可変重鎖ドメインおよび/または可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を含む。好ましくは、超可変およびフレームワーク領域中のアミノ酸置換は、抗体とRSV抗原との結合を改善する。
本発明はまた、1つまたは複数のRSV F抗原に免疫特異的に結合する抗体も提供し、前記抗体は、可変およびフレームワーク領域中に突然変異(たとえば1つまたは複数のアミノ酸残基置換)を有するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、当業者に知られている定常領域を含む、RSV抗原(たとえばRSV F抗原)に免疫特異的に結合する抗体も提供する。好ましくは、本発明の抗体の定常領域はヒトである。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)の定常領域を含む。
本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体および異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。好ましくは、抗体が融合する異種ポリペプチドは、気道上皮細胞を抗体の標的とするために有用である。
本発明はまた、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体のパネルを含む製剤も包含する。具体的な実施形態では、本発明は、異なる会合速度定数、異なる解離速度定数、RSV抗原に対する異なる親和性、および/またはRSV抗原に対する異なる特異性を有する抗体のパネルを提供する。本発明は、少なくとも10個、好ましくは少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも100個、少なくとも125個、少なくとも150個、少なくとも175個、少なくとも200個、少なくとも250個、少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個、少なくとも500個、少なくとも550個、少なくとも600個、少なくとも650個、少なくとも700個、少なくとも750個、少なくとも800個、少なくとも850個、少なくとも900個、少なくとも950個、または少なくとも1000個の抗体のパネルを提供する。抗体のパネルは、たとえば、ELISAなどのアッセイのために96ウェルプレート中で用いることができる。
本発明はさらに、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための、1つまたは複数の抗体を提供する。具体的な実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、および/またはA17h4を含む。別の具体的な実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8C7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、またはA4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4の抗原結合断片を含む。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2に記載のVHドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVHドメインを含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Aに記載の任意の1つのVH CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR1を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Bに記載の任意の1つのVH CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR2を含む、1つまたは複数の抗体を含む。好ましい実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Cに記載の任意の1つのVH CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR3を含む、1つまたは複数の抗体を含む。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2に記載のVLドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVLドメインを含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2または表3Dに記載のVL CDR1の任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR1を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Eに記載の任意の1つのVL CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR2を含む、1つまたは複数の抗体を含む。好ましい実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Fに記載の任意の1つのVL CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR3を含む、1つまたは複数の抗体を含む。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2に記載のVHドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVHドメインおよび表2に記載のVLドメインの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVLドメインを含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Aに記載の任意の1つのVH CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR1ならびに表2および/または表3Dに記載の任意の1つのVL CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR1を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Aに記載の任意の1つのVH CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR1ならびに表2および/または表3Eに記載の任意の1つのVL CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR2を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Aに記載の任意の1つのVH CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR1ならびに表2および/または表3Fに記載の任意の1つのVL CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR3を含む、1つまたは複数の抗体を含む。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Bに記載の任意の1つのVH CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR2ならびに表2および/または表3Dに記載の任意の1つのVL CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR1を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Bに記載の任意の1つのVH CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR2ならびに表2および/または表3Eに記載の任意の1つのVL CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR2を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、表2および/または表3Bに記載の任意の1つのVH CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR2ならびに表2および/または表3Fに記載の任意の1つのVL CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR3を含む、1つまたは複数の抗体を含む。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Cに記載の任意の1つのVH CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR3ならびに表2および/または表3Dに記載の任意の1つのVL CDR1アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR1を含む、1つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Cに記載の任意の1つのVH CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR3ならびに表2および/または表3Eに記載の任意の1つのVL CDR2アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR2を含む、1つまたは複数の抗体を含む。好ましい実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、表2および/または表3Cに記載の任意の1つのVH CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDR3ならびに表2および/または表3Fに記載の任意の1つのVL CDR3アミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDR3を含む、1つまたは複数の抗体を含む。好ましい実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療、および/または改善に用いるための製剤は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)またはその抗原結合断片を含む。さらに別の実施形態では、本発明の製剤は、本発明の1つまたは複数の融合タンパク質を含む。
以下により詳細に記載するように、本発明の製剤は、単独でまたは他の組成物と組み合わせて用い得る。抗体はさらに、異種ポリペプチドとNもしくはC末端で組換えによって融合しているか、またはポリペプチドもしくは他の組成物と化学的にコンジュゲート(共有および非共有コンジュゲーションを含む)していてもよい。たとえば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチド、または毒素などのエフェクター分子と、組換えによって融合またはコンジュゲートしていてもよい。たとえば、PCT公報WO92/08495号;WO91/14438号;WO89/12624号;米国特許第5,314,995号;および欧州特許EP396,387号を参照されたい。
本発明の抗体は、in vitroおよびin vivoの診断方法および治療方法のどちらにおいても、たとえば、RSV抗原を精製、検出、および標的とするために用い得る。たとえば、抗体は、痰などの生体試料中のRSVのレベルを定性的および定量的に測定するための免疫アッセイにおいて使用がある。たとえば、Harlow他、Antibodies: A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988)を参照されたい(その全体が参考として本明細書中に組み込まれている)。
本発明は、Fab断片を含み、RSV抗原(たとえば、Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337))に免疫特異的に結合する抗体を提供し、Fab断片のTmは少なくとも約87℃であり、前記抗体は、パリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、およびA17h4のいずれかではない。具体的な実施形態では、このような抗体中のFabは、パリビツマブのFabとは異なる。別の実施形態では、このような抗体は、パリビツマブのVHまたはVLドメインとは異なるVHまたはVLドメインを含む。好ましい実施形態では、Fab断片のTmは少なくとも約90℃または少なくとも約93℃である。別の好ましい実施形態では、抗体のpIは約8.5〜9.5または約9.0〜9.5である。
別の具体的な実施形態では、抗体は、抗体A4B4L1FR-S28RのVHドメイン(配列番号48)を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、抗体A4B4L1FR-S28RのVLドメイン(配列番号11)を含む。さらに別の実施形態では、抗体のFabは、抗体A4B4L1FR-S28RのFabであり、好ましくは、この定常ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。
本発明はまた、上述した抗体を含み、1〜26℃の範囲、または5〜25℃の範囲、または10〜25℃の範囲の任意の温度で10.00cP未満または5.00cP未満の粘度を有する抗体製剤も提供する。
本発明はまた、上述した抗体を含み、38〜42℃の範囲の任意の温度で約5%未満、10%未満、または15%未満/日の凝集率を有する抗体製剤も提供する。
上述した抗体は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれている、2005年7月1日に出願のChristian B. Allanの米国仮特許出願第60/696,113号に記載されている方法によって作製することができる。具体的な実施形態では、このような抗体は、標的(たとえばRSV抗原)に対して高い結合親和性を有する複数の候補抗体ドメイン(たとえば、Fab、FcおよびFv)を、その溶解度および熱安定性についてスクリーニングすることを含む方法によって作製する。タンパク質ドメインをその溶解度および熱安定性についてスクリーニングするための、当分野で知られている任意の方法を用いることができる。その後、高い溶解度および/または熱安定性を有する1つまたは複数の抗体ドメインを選択し、完全な抗体を作製するためにそれらを適切なドメイン(または複数のドメイン)と合わせることによって、完全な抗体を構築するために用いる。一実施形態では、少なくとも87℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、または120℃よりも高いTm値を有する1つまたは複数の候補Fabドメインを、完全な抗体を構築するために選択する。別の実施形態では、約6.5、7.0、7.5、8.0、8.5または9.0よりも高いpI値を有する1つまたは複数の候補ドメインを、完全な抗体を構築するために選択する。具体的な実施形態では、複数の候補Fabドメインは、以下の抗体、すなわちパリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、および/またはA17h4のFabドメインに1つまたは複数のアミノ酸残基置換を含むFabドメインを含む。
選択した閾値を超える親和性を有するRSV抗原に結合する複数の抗原結合ドメイン(たとえば、Fab、scFvなど)は、たとえば、ファージディスプレイライブラリの親和性スクリーニングによって得られ得る。その後、抗原結合ドメインの製剤の特性を特徴づける1つまたは複数の測定指標を、抗原結合ドメインのそれぞれについて評価する。複数の抗原結合ドメインを1つまたは複数の測定指標に従って順位付けする。一実施形態では、複数の抗原結合ドメインをそのTm値に従って順位付けし、順位付けしたリストの上位から1つまたは複数の抗原結合ドメインを選択する。別の実施形態では、複数の抗原結合ドメインをそのpI値に従って順位付けし、順位付けしたリストの上位から1つまたは複数の抗原結合ドメインを選択する。さらに別の実施形態では、複数の抗原結合ドメインをTmおよびpIを合わせた順位に従って順位付けし、順位付けしたリストの上位から1つまたは複数の抗原結合ドメインを選択する。その後、選択した抗原結合ドメインを、完全な抗RSV抗体分子(たとえば、抗体、二重特異性抗体など)を構築するために用いる。
別の実施形態では、複数の抗体定常領域ドメイン(たとえば、Fc、CH2、CH3など)を、溶解度および熱安定性についてスクリーニングする。一実施形態では、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、または120℃よりも高いTm値を有する1つまたは複数の候補抗体定常領域ドメインを、完全な抗体を構築するために選択する。別の実施形態では、約6.5、7.0、7.5、8.0、8.5または9.0よりも高いpI値を有する1つまたは複数の候補抗体定常領域ドメインを、完全な抗体(たとえば、抗体、Fc-融合タンパク質など)を構築するために選択する。
そのような抗体は、それだけには限定されないが、Tm、pI、溶解度、安定性を含めた好ましい製剤の特徴および/または特性のためにタンパク質を操作する方法によって作製することもできる。一実施形態では、この方法は、抗体の製剤の特徴を改善するために1つまたは複数のドメインを操作することを含む。好ましい実施形態では、操作したドメインは、それだけには限定されないが、その標的に対する抗体の結合特異性、結合親和性および/もしくは結合力を含めた抗体の薬理学的特徴、または抗体のFcエフェクター機能、たとえば、Fc-受容体(FcR)結合、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/もしくは血清半減期を顕著に低下させずに、製剤の特徴の向上を示す。より好ましい実施形態では、操作したドメインは、抗体の薬理学的特徴に実質的に影響を与えずに、製剤の特徴の向上を示す。
好ましい実施形態では、ドメインの安定性が増加するようにドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって、ドメインを操作する。一実施形態では、そのTm値が増加するようにドメインを操作する。一実施形態では、所定の閾値よりも高いTmを有するようにドメインを操作する。一部の好ましい実施形態では、所定のTm閾値は、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、または120℃である。具体的な実施形態では、このような操作したFabドメインは、パリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、またはA17h4のFabドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって作製する。
別の好ましい実施形態では、ドメインの溶解度が増加するようにドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって、ドメインを操作する。一実施形態では、そのpI値が増加するようにドメインを操作する。一実施形態では、所定の閾値よりも高いpIを有するようにドメインを操作する。一部の好ましい実施形態では、所定のpI閾値は、約6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0である。
一実施形態では、タンパク質の製剤の特徴、たとえば、Tm、pI、または安定性を改善するために、抗原結合(たとえばFab)および/または定常領域(たとえばFc)ドメインを操作する。好ましい実施形態では、操作した抗体は、抗体の薬理学的特徴、たとえば、その標的に対する抗体の結合特異性、結合親和性および/もしくは結合力、または抗体のFcエフェクター機能、たとえば、Fc-受容体(FcR)結合、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/もしくは血清半減期を顕著に低下させずに、製剤の特徴の向上を示す。別の実施形態では、操作した抗体は、製剤の特徴の向上、ならびに薬理学的特徴、たとえば、その標的に対する抗体の結合特異性、結合親和性および/もしくは結合力、または抗体のFcエフェクター機能、たとえば、FcR結合、ADCC、CDC、および/もしくは血清半減期の向上を示す。
タンパク質の溶解度は、pIを調節するためにタンパク質中のイオン化可能な残基の数および位置を変更することによって最適化し得る。たとえば、ポリペプチドのpIは、適切なアミノ酸置換を行うことによって操作することができる(たとえば、リシンなどの電荷アミノ酸をアラニンなどの無電荷残基で置換することによる)。任意の理論に束縛されることを望まずに、前記タンパク質のpIの変化をもたらすタンパク質のアミノ酸置換は、タンパク質の溶解度および/または安定性を向上し得る。当業者は、所望のpIを達成するために特定のタンパク質に最も適切なアミノ酸置換を決定できるであろう。タンパク質のpIは、それだけには限定されないが等電点電気泳動を含めた様々な方法によって決定し得る。また、これは、様々なコンピュータアルゴリズムの任意の1つを用いて推定することもできる(たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているBjellqvist他、1993、Electrophoresis 14:1023を参照)。
一実施形態では、操作した抗体結合ドメインのpIはpH6.2〜pH10.0である。一実施形態では、抗原結合ドメインのpIの変更をもたらす置換は、抗原に対するその結合親和性を顕著に減弱させない。一実施形態では、操作した抗体定常領域ドメインのpIはpH6.2〜pH10.0である。さらに別の実施形態では、定常領域ドメインのpIの変更をもたらす置換は、そのエフェクター結合および/または機能を顕著に減弱させない。抗体ドメインのpIの変更をもたらす置換が、抗体ドメインのpIおよび他の薬理学的特徴の両方、たとえば、その標識に対する抗体の結合特異性、結合親和性および/もしくは結合力、または抗体のFcエフェクター機能が向上するように選択し得ることも企図される。本発明者らは、ヒンジ領域の特定の修飾が抗体のpIおよびTmを顕著に変化させないことを見出した。したがって、一実施形態では、本発明は、抗体の製剤の特性を低下させずに抗体の生物活性を向上させるために抗体を操作する方法を提供する。
一実施形態では、本明細書中に記載の抗体ドメインの修飾を、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Duncan他、1988、Nature 332:563-564; Lund他、1991、J. Immunol 147:2657-2662; Lund他、1992、Mol Immunol 29:53-59; Alegre他、1994、Transplantation 57:1537-1543; Hutchins他、1995、Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis他、1995、Immunol Lett. 44:111-117; Lund他、1995、Faseb J 9:115-119; Jefferis他、1996、Immunol Lett 54:101-104; Lund他、1996、Immunol 157:4963-4969; Armour他、1999、Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie他、2000、J Immunol 164:4178-4184; Reddy他、2000、J Immunol 164:1925-1933; Xu他、2000、Cell Immunol 200:16-26; Idusogie他、2001、J Immunol 166:2571-2575; Shields他、2001、J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis他、2002、Immunol Lett 82:57-65; Presta他、2002、Biochem Soc Trans 30:487-490);米国特許第5,624,821号;第5,885,573号;第6,194,551号;米国特許出願第60/601,634号および第60/608,852;PCT公報WO00/42072号およびWO99/58572号に開示されているものなどの、Fcドメインの既知の修飾と組み合わせ得る。
一実施形態では、Fc領域の修飾、典型的には、抗体のpIおよびTmを低下させずに血清半減期、補体の固定、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細胞性細胞傷害などの抗体の1つまたは複数の機能的特性を変更するための修飾が含まれるように、抗体を操作し得る。さらに、ここでも抗体の1つまたは複数の機能的特性を変更するために、そのグリコシル化を変更するために抗体を化学修飾(たとえば、1つもしくは複数の化学部分を抗体に結合させることができる)または修飾し得る。
一実施形態では、Fc領域のアミノ酸配列は、上述の抗体の機能的特性のうちの1つまたは複数を変更するために、少なくともアミノ酸残基の欠失、付加および/または置換によって修飾する。この手法は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Duncan他、1988、Nature 332:563-564; Lund他、1991、J. Immunol 147:2657-2662; Lund他、1992、Mol Immunol 29:53-59; Alegre他、1994、Transplantation 57:1537-1543; Hutchins他、1995、Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis他、1995、Immunol Lett. 44:111-117; Lund他、1995、Faseb J 9:115-119; Jefferis他、1996、Immunol Lett 54:101-104; Lund他、1996、J Immunol 157:4963-4969; Armour他、1999、Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie他、2000、J Immunol 164:4178-4184; Reddy他、2000、J Immunol 164:1925-1933; Xu他、2000、Cell Immunol 200:16-26; Idusogie他、2001、J Immunol 166:2571-2575; Shields他、2001、J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis他、2002、Immunol Lett 82:57-65; Presta他、2002、Biochem Soc Trans 30:487-490);米国特許第5,624,821号;第5,885,573号;第5,677,425号;第6,165,745号;第6,277,375号;第5,869,046号;第6,121,022号;第5,624,821号;第5,648,260号;第6,194,551号;第6,737,056号、米国特許出願第10/370,749号およびPCT公報WO94/2935号;WO99/58572号;WO00/42072号;WO04/029207号にさ
らに記載されている。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変されている。たとえば、グリコシル化されていない抗体(すなわち、グリコシル化を欠く抗体)を作製することができる。たとえば、標的抗原に対する抗体の親和性を増加するために、グリコシル化を変更することができる。このような炭水化物の改変は、たとえば、抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。たとえば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を排除することでその部位でのグリコシル化の排除をもたらす、1つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加し得る。このような手法は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳述されている。
さらにまたはその代わりに、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または二分したGlcNAc構造が増加した抗体などの、グリコシル化の種類が変更された抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増加することが実証されている。このような炭水化物の改変は、たとえば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として用いて、グリコシル化が変更された抗体を産生させることができる。たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Shields, R.L.他、(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana他、(1999) Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに欧州特許EP1,176,195号;PCT公報WO03/035835号;WO99/54342号を参照されたい。
別の実施形態では、結合特徴を低下させずに抗体の製剤の特徴を変更するために、抗原結合ドメイン中に改変が含まれるように抗体を操作し得る。当業者は、抗体のアミノ酸置換および他の修飾はその抗原結合特徴(結合特徴の例には、それだけには限定されないが、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離速度および会合速度(それぞれKoffおよびKon)、結合親和性ならびに/または結合力が含まれる)を変更する場合があり、特定の変更が多かれ少なかれ望ましいことを理解されよう。たとえば、抗原結合を保存または増強する改変が、抗原結合を減弱または変更した改変よりも好ましい。標的抗原に対する抗体の結合特徴は、たとえば、それだけには限定されないが、平衡方法(たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)もしくはラジオイムノアッセイ(RIA))、または動力学(たとえばBIACORE(登録商標)分析;実施例2を参照)を含めた様々な方法によって決定し得る。抗体の結合特徴を検査するための他の一般的に用いられる方法は、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、Harrow他、1999およびAntibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY; Harlow他、1989に記載されている。
平衡解離定数(KD)がkoff/konとして定義されることは、当分野で周知である。低いKDを有する抗体が高いKDを有する抗体よりも好ましいことは、一般に理解されている。しかし、一部の例では、konまたはkoffの値がKDの値よりも関連性があり得る。当業者は、どの動力学的パラメータが所与の抗原結合ドメインおよび応用に最も重要であるかを決定することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、製剤の特徴が向上しており、かつ前記修飾なしの抗原結合ドメインの動力学的パラメータと比較して1つまたは複数の抗原結合特徴(たとえば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および/または結合力)が少なくとも2%、または少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%向上している抗原結合ドメインをもたらす。
別の実施形態では、本発明の方法は、製剤の特徴が向上しているが、抗原結合が実質的に減弱していない、改変された抗原結合ドメインをもたらす。たとえば、本発明の方法では、向上した製剤の特徴を示すが、好ましくはどの抗原結合特徴(たとえば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および/もしくは結合力)も低下していない、または前記置換なしの抗体の抗原結合と比較して、1つもしくは複数の抗原結合特徴が1%未満、もしくは5%未満、もしくは10%未満、もしくは20%未満、もしくは30%未満、もしくは40%未満、もしくは50%未満、もしくは60%未満、もしくは70%未満、もしくは80%未満低下している抗原結合ドメインが作製される。
一実施形態では、その後、選択または操作した抗原結合および抗体定常ドメインを用いて、当分野で知られている方法を用いて完全な抗RSV抗体を構築する。その後、最適な製剤を決定するために、そのような抗体を製剤の開発に供することができる。
5.3.4ヒトメタニューモウイルス(hMPV)に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)の抗原に特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。用語「抗hMPV-抗原抗体」とは、hMPV抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその抗体断片をいう。hMPV抗原とは、hMPVポリペプチドまたはhMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV小疎水性タンパク質、hMPV RNA依存性hMPVポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質、およびhMPV Gタンパク質などのその断片をいう。また、hMPV抗原は、hMPVポリペプチドまたはhMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV小疎水性タンパク質、hMPV RNA依存性hMPVポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質、およびhMPV Gタンパク質などのその断片と比較して類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもいう。
本発明で用いる抗hMPV-抗原抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗hMPV抗体は、2003年7月25日に出願、2004年5月20日に米国特許公報US2004/0096451 A1号として公開されている米国特許出願第10/628,088号に開示されている抗体である。
本セクションの抗hMPV-抗原抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2003年7月25日に出願、2004年5月20日に米国特許公報US2004/0096451 A1号として公開されている米国特許出願第10/628,088号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。
5.3.5インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、インテグリンαvβ3に特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物も含む。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗インテグリンαvβ3抗体は、MEDI-522(ビタキシン(登録商標))である。ビタキシン(登録商標)およびビタキシン(登録商標)を含む組成物または製剤は、たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、国際公開公報WO98/33919号、WO00/78815号、およびWO02/070007号;米国特許出願第09/339,222号;2002年3月4日に出願、2002年11月12日に米国特許公報US2002/0168360として公開されている米国特許出願第10/091,236号に開示されている。
さらなる実施形態では、インテグリンαvβ3免疫特異的に結合する抗体は、ビタキシン(登録商標)またはビタキシン(登録商標)の抗原結合断片ではない。インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する既知の抗体の例には、それだけには限定されないが、11D2(Searle)、ネズミモノクローナルLM609(その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Scripps、国際公開公報WO89/05155号および米国特許第5,753,230号)、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている国際公開公報WO98/33919号およびWO00/78815号)、17661-37Eおよび17661-37E1-5(USBiological)、MON2032および2033(CalTag)、ab7166(BV3)およびab7167(BV4)(Abcam)、ならびにWOW-1(Kiosses他、Nature Cell Biology、3:316-320)が含まれる。
新しい血管上および多くの固形腫瘍の表面上で見つかっているインテグリンであるαvβ3は、マクロファージ、単球、および破骨細胞を活性化した。したがって、本セクションの抗インテグリンαvβ3抗体は、たとえば、治験抗体として、またはいくつかの破壊性疾患の予防もしくは治療に用いることができる。
本節の抗インテグリンαvβ3抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2002年3月4日に出願、2002年11月12日に米国特許公報US2002/0168360号として公開されている米国特許出願第10/091,236号;2004年1月30日に出願の米国特許出願第10/769,712号;2004年1月30日に出願、2004年9月9日に米国特許公報US2004/0176272号として公開されている米国特許出願第10/769,720号;2003年3月4日出願の米国特許出願第10/379,145号;2003年3月4日に出願、米国特許公報US2004/0001835号として公開されている米国特許出願第10/379,189号;2004年1月30日出願のPCT出願PCT/US04/02701号;国際公開出願WO00/78815 A1号、題名「Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same and methods」、Huse他;および国際公開出願WO98/33919 A1号、題名「Anti-alpha-V-veta-3 recombinant humanized antibodies, nucleic acids encoding same and methods of use」、Huse他;国際公開公報WO89/05155号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。
5.3.6CD2に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、CD2に免疫特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗CD2抗体はシプリズマブ(MEDI-507)である。シプリズマブは、CD2抗原を発現する細胞(具体的にはT細胞、ナチュラルキラー細胞および胸腺細胞)に選択的に結合することができ、たとえば、T細胞リンパ腫または他の関連する状態の予防および治療に用いることができる。MEDI-507は、たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、国際公開公報WO99/03502号、国際出願PCT/US02/22273号およびPCT/US02/06761号、ならびに米国特許出願第09/462,140号、第10/091,268号、および第10/091,313号に開示されている。MEDI-507は、ヒトCD2ポリペプチドに免疫特異的に結合する、ヒト化IgG1κクラスのモノクローナル抗体である。MEDI-507は、ラットモノクローナル抗体LO-CD2a/BTI-322からのCDRをヒトIgG1フレームワーク内に挿入するために分子学的技術を用いて構築された。LO-CD2a/BTI-322は、たとえば、米国特許第5,730,979号、第5,817,311号、および第5,951,983号;ならびに米国特許出願第09/056,072号および第09/462,140号(そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている)に開示されているアミノ酸配列、または1993年7月28日に寄託番号HB11423としてアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC(登録商標))、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209に寄託された細胞系によって産生されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列を有する。
本節の抗CD2抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2002年3月4日に出願、2003年4月15日に米国特許公報US2003/0068320号として公開されている米国特許出願第10/091,268号;2002年3月4日に出願、2003年3月6日に米国特許公報US2003/0044406号として公開されている米国特許出願第10/091,313号;および2003年9月5日に出願、2004年12月30日に米国特許公報US2004/0265315として公開されている米国特許出願第10/657,006号に記載のように、作製、配合、投与、治療用もしくは予防用、または他の関連で使用することができる。
5.3.7CD19に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、CD19に免疫特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗CD19抗体はMT-103である。MT-103は、二重特異性T細胞エンゲージャー(Bi-Specific T Cell Engagers)(BiTE(商標))と呼ばれる新規クラスの抗体誘導体の最先端の臨床的代表格である。BiTE化合物MT-103は、癌細胞に対する患者の自己免疫系を指示および活性化し、B腫瘍細胞(癌性白血球)を破壊するようにT細胞(非常に強力な白血球種)を刺激する。MT-103は、癌性B細胞上に存在するが他の種類の血液細胞または健康な組織上には存在しない特定のタンパク質(CD19抗原)を特異的に標的とすることによって、従来の化学療法の副作用を回避する。
本節の抗CD19抗体は、米国特許第6,723,538号、および米国特許公報第2004/0162411号に記載のように、作製、配合、投与、治療用もしくは予防用、または他の関連で使用することができる。
ヒトCD19分子は、ヒトB細胞の表面上で発現される構造的に判明な細胞表面受容体である。本発明は、ヒトCD19抗原に結合する治療抗体を用いた、ヒト被験体におけるGVHD、液性拒絶、および移植後リンパ球増殖性障害;自己免疫疾患および障害;ならびに癌を予防ならびに治療するための、免疫治療組成物および方法に関する。
HB12aおよびHB12b抗CD19抗体を産生するハイブリドーマは、ATCC寄託番号PTA-6580およびPTA-6581の下で寄託されている。また、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、譲渡予定の米国特許出願(代理人明細書第11605-006-999号)および2006年2月15日出願の米国特許出願第11/355,905号も参照されたい。
5.3.8EphA2に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、EphA2に免疫特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の実施形態では、本発明の抗EphA2抗体はEA2である。一部の好ましい実施形態では、EA2抗体はヒトまたはヒト化されている。他の実施形態では、EA5である。一部の好ましい実施形態では、EA5抗体はヒトまたはヒト化されている。本発明の抗EphA2抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の目的の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)に寄託されており、表4に示すように参考として組み込まれている寄託番号が割り当てられている。
Figure 2008546805
EphA2は、成人上皮中で発現される130kDaの受容体チロシンキナーゼであり、ここでは低レベルで見つかり、細胞-細胞接着の部位で富化されている(Zantek他、Cell Growth & Differentiation 10:629、1999; Lindberg他、Molecular & Cellular Biology 10: 6316、1990)。EphA2は、多数の攻撃的癌細胞中でアップレギュレーションされている。本発明の抗EphA2抗体は、たとえば、乳房癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌および皮膚癌を含めた様々な腫瘍の治療、ならびに転移の予防に用いることができる。
本節の抗EphA2抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2004年4月12日出願の米国特許出願第10/823,259号;2004年4月12日出願の米国特許出願第10/823,254号;2003年5月12日に出願、2004年2月12日に米国特許公報第2004/0028685号として公開されている米国特許出願第10/436,782号;2003年5月12日に出願、2004年5月13日に米国特許公報第2004/0091486号として公開されている米国特許出願第10/436,783号;2004年12月3日出願の米国特許出願第11/004,794号;2004年11月19日出願の米国特許出願第10/994,129号;2004年12月3日出願の米国特許出願第11/004,795号;および2004年10月27日出願の米国仮特許出願第60/662,517号、第60/622,711号、第60/622,489号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。
5.3.9EphA4に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、EphA4の抗原に免疫特異的に結合する単離した抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。本発明の抗EphA4抗体を産生するハイブリドーマは、2004年6月4日に特許手続上の目的の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規約の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)に寄託されており、寄託番号PTA-6044およびPTA-4381が割り当てられており、参考として組み込まれている。
EphA4は、脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤、膵臓(Fox他、Oncogene 10:897、1995)およびメラニン形成細胞(Easty他、Int. J. Cancer 71:1061、1997)中で発現される受容体チロシンキナーゼである。EphA4はいくつかの癌で過剰発現されている。本セクションの抗EphA4抗体は、たとえば、膵臓癌の治療などにおいてEphA4の発現を減少させるために用いることができる。
本節の抗EphA4抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2004年6月7日出願の米国特許出願第10/863,729号;2004年12月3日出願の米国特許出願第11/004,794号;2004年12月3日出願の米国特許出願第11/004,794号および第11/004,795号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。
5.3.10IL-9に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、IL-9に免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含む。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。一部の好ましい実施形態では、抗IL-9抗体はMEDI-528である。
IL-9が喘息の主要な媒介物である可能性があり、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および嚢胞性線維症を含めた他の呼吸器疾患にも寄与し得ることが示されている。本節の抗IL-9抗体は、喘息の予防または治療に用い得る。
本節の抗IL-9抗体は、その内容がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2004年4月12日に出願、2000年1月6日に米国特許公報US2005/0002934 A1として公開されている米国特許出願第10/823,253号;2004年4月12日出願の米国特許出願第10/823,810号;2002年4月12日出願の米国仮特許出願第60/371,728号および60,371,683号;ならびに2004年4月12日出願の米国仮特許出願第60/561,845号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。
5.3.11.HMG1に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、HMG1に免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
初期炎症誘発性サイトカイン(たとえば、TNF、IL-1など)は炎症を媒介し、血清中に蓄積され、遅延性の致死性および初期炎症誘発性サイトカインのさらなる誘発を媒介するタンパク質である高移動度タンパク質1(HMG1)(HMG-1、HMG1、およびHMGB1としても知られる)の後期放出を誘導する。
HMG1は、分子のアセチル化を要するプロセス中に刺激されたマクロファージまたは単球によって活動的に分泌されることができることが示されており、これにより核から分泌性リソソームへの転位置が可能となり、HMG1アセチル化した形態の分泌がもたらされる。PCT/IB2003/005718号を参照されたい。したがって、壊死細胞から受動的に放出されるHMG1および炎症細胞によって活動的に分泌されるHMGB1は、分子的に異なる。
さらに、HMG1は、内毒血症における遅延性の致死性のサイトカイン媒介物として関連づけられている。たとえば、米国特許第6,468,533号および第6,448,223号を参照されたい。より具体的には、活性化に対する後期応答として、細菌内毒素(リポ多糖(LPS))が、HMG1を放出するように単球/マクロファージを活性化し、毒性がある血清HMG1レベルの上昇をもたらすことが実証されている。HMG1に対する抗体は、抗体の投与が初期サイトカイン応答の後まで遅れた場合にも、内毒素の致死性を妨げることが示されている。他の炎症誘発性サイトカインと同様、HMG1は単球の強力な活性化剤である。HMG1の気管内への施用により急性肺傷害が引き起こされ、抗HMG1抗体は内毒素に誘発される肺浮腫に対して保護する。さらに、血清HMG1レベルは敗血症または昜出血性ショックに罹患している危篤状態の患者で上昇しており、生存者に比べて非生存者のレベルが有意に高い。
本節の抗HMG1抗体は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2005年10月21日出願の米国特許公報第2006-0099207 A1号に記載のように、作製、配合、投与、治療用に使用するまたは予防用に使用することができる。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている2005年10月21日出願の米国特許公報第2006-0099207 A1号に記載のように、3つのクローン、すなわちS6、S16およびG4がアメリカンタイプカルチャーコレクション(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)に寄託されており、ATCC寄託番号PTA-6143(2004年8月4日に寄託)、PTA-6259(2004年10月19日に寄託)およびPTA-6258(2004年10月19日に寄託)が割り当てられている(本明細書中でそれぞれ「S6」、「S16」、および「G4」とも呼ぶ)。
5.3.12.ALKに免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、ALKに免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
その全体が本明細書中に参考として組み込まれている2001年6月14日に出願、2002年3月21日に米国特許公報第20020034768号として公開されている米国特許出願第09/880,097号に記載の、ALKに対するモノクローナル抗体、および、ALKモノクローナル抗体8B10、16G2-3および9C10-5(アメリカンタイプカルチャーコレクション(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)に寄託され、それぞれ割り当て予定のATCC寄託番号が割り当てられている)を産生するハイブリドーマ細胞系。
プレイオトロフィン(PTN)は、血管形成における役割を含めた多様な機能を有する、136個のアミノ酸の、分泌性の、ヘパリン結合サイトカインである。PTNは、受容体チロシンキナーゼ、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)に特異的に結合することが示されており、そのような結合により、受容体の自己リン酸化ならびに続くIRS-1、PLC-γ、PI3キナーゼ、およびShcなどのいくつかのシグナル伝達分子のリン酸化をもたらし、細胞生存経路を活性化する。PCT特許出願公報WO01/96364号を参照されたい。したがって、ALKに媒介されるシグナル伝達経路を調節する薬剤および治療処置は、たとえば血管形成を含めた1つまたは複数のALKに調節される機能に影響を与えることができる。ALKは、癌および所望しないまたは過剰の血管形成に関連する疾患を含めた様々な病状に関与する。さらに、ALKは、創傷治癒などの特定のプロセスにおいて、望ましい様式で関与する。ALKおよび/またはPTNは、多くの場合高レベルで、様々な腫瘍中で発現される。したがって、ALKおよび/またはPTNの機能のダウンレギュレーションを行う薬剤は、腫瘍細胞に対する直接的効果、腫瘍によって動員される血管形成プロセスに対する間接的効果、または直接的効果および間接的効果の組合せによって、腫瘍に影響を与え得る。
5.3.13.CD20に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、CD20に免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
CD20は、Bリンパ球のみによって発現される(Stashenko他、(1980) J Immunol 125:1678-1685; Tedder他、1988a)。CD20は、Bリンパ球において細胞周期の進行およびシグナル伝達の調節に機能的に重要なホモまたはヘテロ四量体複合体を形成する(TedderおよびEngel、1994)。CD20はさらに、場合によってはCa++透過性陽イオンチャネルの機能的構成成分として、膜Ca++コンダクタンスを調節する(Bubien他、J Cell Biol 121:1121-1132; Kanzaki他、(1997a) J Biol Chem 272:14733-14739; Kanzaki他、(1997b) J Biol Chem 272:4964-4969; Kanzaki他、(1995) J Biol Chem 270:13099-13104)。CD20に対する抗体は、非ホジキンリンパ腫の治療に有効である(McLaughlin他、(1998) Oncology 12:1763-1769; Onrust他、(1989) J Biol Chem 264:15323-15327; Weiner (1999) Semin Oncol 26:43-51)。
また、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2003年9月30日に出願、2004年7月15日にUS20040137566号として公開されている米国特許出願第10/433,287号も参照されたい。
5.3.14.CD22に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、CD22に免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
抗CD22抗体は、たとえば、米国特許第5,484,892号;第6,183,744号;第6,187,287号;第6,254,868号;第6,306,393号、およびTuscano他、Blood 94(4):1382-92 (1999)に記載されている(そのそれぞれがその全体で参考として本明細書中に組み込まれている)。非ホジキンリンパ腫の治療における抗CD22抗体を含めたモノクローナル抗体の使用は、たとえば、Renner他、Leukemia 11(Suppl. 2):S5509 (1997)に総説が記載されている。
ヒト化CD22抗体の使用は、自己免疫障害の治療(Tedder、米国特許出願公報US2003/0202975号を参照)ならびにリンパ腫および白血病などのB細胞悪性疾患の治療(Tuscano、米国特許出願公報U.S.2004/0001828号を参照)について記載されている。CD22上の特異的エピトープを標的とするヒト化CD22抗体は、癌における治療的使用のための免疫コンジュゲートの使用について記載されている(Leung、米国特許第5,789,554号および第6,187,287号を参照)。
本発明の例示的なVHおよびVK抗体領域をアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託した。具体的には、RHOv2と命名した本発明のヒト化抗CD22VH配列をコードしているプラスミドは、2006年2月9日にATCC寄託番号PTA-7372の下に寄託した。RHOv2ACDと命名した本発明のヒト化抗CD22VH配列をコードしているプラスミドは、2006年2月9日にATCC寄託番号PTA-7373の下に寄託した。本発明のヒト化抗CD22VK配列をコードしているプラスミド、RKAは、2006年2月9日にATCC寄託番号PTA-7370の下に寄託した。本発明のヒト化抗CD22VK配列をコードしているプラスミド、RKCは、2006年2月9日にATCC寄託番号PTA-7371の下に寄託した。
また、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2006年3月6日出願の譲渡予定の米国仮特許出願、代理人整理番号第BC320P1も参照されたい。
5.3.15.キチナーゼに免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、キチナーゼに免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
キチナーゼ/キチナーゼ様タンパク質をin vivoで遮断することにより、骨および軟骨の保護ならびにマウスRAモデルにおいて体重減少がもたらされることが記載されている。これらの結果は、慢性炎症性疾患におけるキチナーゼ/キチナーゼ様タンパク質の役割、より詳細には骨代謝および結合組織の障害および疾患を含めたOCL関連疾患におけるキチナーゼ/キチナーゼ様タンパク質の役割を支持している。さらに、これらの結果により、ヒトキチナーゼ/キチナーゼ様タンパク質がOCL関連疾患の予防および治療の潜在的な治療標的として有効となる。
また、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2002年7月23日に出願、2003年3月13日にUS20030049261号として公開されている米国特許出願第10/202,436号も参照されたい。
5.3.16.インターフェロンαに免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、インターフェロンαに免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
本発明は、被験体におけるインターフェロン-αに媒介される疾患が治療されるように被験体に本発明の抗IFNα抗体を投与することを含む、被験体においてインターフェロンαに媒介される疾患または障害を治療する方法を提供する。治療することができる疾患の例には、自己免疫疾患(たとえば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬、自己免疫甲状腺炎、関節リウマチおよび糸球体腎炎)、移植片拒絶ならびに移植片対宿主病が含まれる。
また、抗インターフェロンαモノクローナル抗体は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2004年12月10日出願の米国特許第11/009,410号にも記載されている。
5.3.17.インターフェロンα受容体に免疫特異的に結合する抗体
本発明の製剤は、インターフェロンα受容体に免疫特異的に結合する抗体およびこの抗体を含む組成物を含むことができる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができる。
本発明はまた、I型インターフェロンの生物活性が阻害されるように細胞を本発明の抗体と接触させることを含む、インターフェロンα受容体1を発現する細胞上のI型インターフェロンの生物活性を阻害する方法も提供する。本発明はまた、被験体におけるI型インターフェロンに媒介される疾患が治療されるように被験体に本発明の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、治療を必要としている被験体においてI型インターフェロンに媒介される疾患または障害を治療する方法も提供する。I型インターフェロンに媒介される疾患は、たとえば、インターフェロンαに媒介される疾患であることができる。
本発明の方法を用いて治療することができる疾患または障害の例には、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性真性糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、自己免疫甲状腺炎、関節リウマチ、糸球体腎炎、HIV感染症、AIDS、移植片拒絶および移植片対宿主病が含まれる。
抗インターフェロン受容体モノクローナル抗体は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2006年2月9日公開、2005年6月20日出願の米国特許公報第2006-0029601 A1号に記載されている。
5.3.18治療的有用性を有する抗体
本発明の製剤は、それだけには限定されないが表5に記載の抗体を含めた、治療的有用性を有する抗体を含む。
Figure 2008546805
Figure 2008546805
Figure 2008546805
Figure 2008546805
5.3.19.炎症性障害または自己免疫疾患に用いることができる抗体
本発明の製剤は、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療および/または予防に当分野で知られている抗体のいずれかをさらに含む。本発明に従って操作することができる炎症性障害の治療または予防に用いる抗体の非限定的な例を表6Aに示し、自己免疫障害の治療または予防に用いる抗体の非限定的な例を表6Bに示す。
Figure 2008546805
Figure 2008546805
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5.4抗体の製造方法
本発明で用いる抗体は、抗体の合成に当分野で知られている任意の方法によって、具体的には化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって製造することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含めた当分野で知られている広範な技術を用いて製造することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当分野で知られており、たとえばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988); Hammerling他、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier、N.Y.、1981)に教示されているものを含めたハイブリドーマ技術を用いて製造することができる(前記参考文献はその全体で参考として組み込まれている)。本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造した抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核、原核、またはファージクローンを含めた単一のクローンに由来する抗体をいい、それを製造する方法ではない。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を製造およびスクリーニングする方法は日常的であり、当分野で周知である。手短に述べると、マウスを抗原(完全長のタンパク質またはそのドメイン、たとえば細胞外もしくはリガンド結合ドメインのいずれか)で免疫化し、免疫応答が検出された後、たとえば特定の抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出された後、マウス脾臓を採取して脾細胞を単離することができる。その後、周知の技術によって、脾細胞を任意の適切な骨髄腫細胞、たとえばATCCから入手可能な細胞系SP20由来の細胞と融合させる。限界希釈によってハイブリドーマを選択およびクローニングする。その後、ハイブリドーマクローンを、当分野で知られている方法によって、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞についてアッセイする。マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫化することによって、一般に抗体を高レベルで含む腹水を作製することができる。
したがって、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって作製することができ、好ましくは、ハイブリドーマは、抗原で免疫化したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、その後、融合から生じたハイブリドーマを、抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることによって作製する。
本発明で用いる抗体断片は、当業者に知られている任意の技術によって作製し得る。たとえば、本発明のFabおよびF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生じるため)またはペプシン(F(ab')2断片を生じるため)などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって生成し得る。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。さらに、本発明の抗体は、当分野で知られている様々なファージディスプレイ方法を用いて作製することもできる。
ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインは、それをコードしているポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。具体的には、VHおよびVLドメインをコードしているDNA配列を動物のcDNAライブラリ(たとえば、ヒトまたはネズミのリンパ組織のcDNAライブラリ)から増幅する。VHおよびVLドメインをコードしているDNAをscFvリンカーと共にPCRによって一緒に組換えを行い、ファージミドベクター(たとえば、pCANTAB6またはpComb3HSS)内にクローニングする。ベクターを大腸菌(E.coli)内に電気穿孔し、大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法で用いるファージは、典型的にはfdおよびM13を含めた線維状ファージであり、VHおよびVLドメインは通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのどちらかと組換えによって融合されている。目的のエピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、たとえば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉されている抗原を用いて選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために用いることができるファージディスプレイ方法の例には、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Brinkman他、1995、J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames他、1995、J. Immunol. Methods 184:177; Kettleborough他、1994、Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic他、1997、Gene 187:9; Burton他、1994、Advances in Immunology 57:191-280;国際出願PCT/GB91/01134号;国際公報WO90/02809号、WO91/10737号、WO92/01047号、WO92/18619号、WO93/11236号、WO95/15982号、WO95/20401号、およびWO97/13844号;ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108号に開示されているものが含まれる。
ファージを抗原結合活性についてスクリーニングし得る。上記参考文献中に記載したように、ファージの選択後、たとえば以下に記載のように、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含めた全抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために用い、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主中で発現させることができる。組換えによってFab、Fab'およびF(ab')2断片を生成する技術も、国際公開公報WO92/22324号;Mullinax他、1992、BioTechniques 12:864; Sawai他、1995、AJRI 34:26;およびBetter他、1988、Science 240:1041に開示されているものなどの当分野で知られている方法を用いて、採用することができる(前記参考文献はその全体で参考として組み込まれている)。
全抗体を作製するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローン中でVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に知られているクローニング技術を利用して、PCRで増幅したVHドメインを、VH定常領域、たとえばヒトγ4定常領域を発現するベクター内にクローニングすることができ、PCRで増幅したVLドメインを、VL定常領域、たとえばヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター内にクローニングすることができる。好ましくは、VHまたはVLドメインを発現させるためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。また、VHおよびVLドメインは、必要な定常領域を発現する1つのベクター内にクローニングしてもよい。その後、当業者に知られている技術を用いて、完全長の抗体、たとえばIgGを発現する安定したまたは一過性の細胞系を作製するために重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系内に同時形質移入する。
ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含めた一部の使用には、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましい場合がある。ヒト被験体の治療処置には完全にヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いた上述のファージディスプレイ方法を含めた、当分野で知られている様々な方法によって作製することができる。また、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている上記米国特許第4,444,887号および第4,716,111号;ならびに国際公開公報WO98/46645号、WO98/50433号、WO98/24893号、WO98/16654号、WO96/34096号、WO96/33735号、およびWO91/10741を参照されたい。
ヒト抗体はまた、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて製造することができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムにまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞内に導入し得る。あるいは、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えてヒトの可変領域、定常領域、および多様領域をマウス胚性幹細胞内に導入し得る。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入とは別々にまたはそれと同時に、非機能的にし得る。具体的には、JH領域のホモ接合性欠失は、内在性抗体の産生を妨げる。改変した胚性幹細胞を増殖し、胚盤胞内に微量注入してキメラマウスを作製する。その後、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製する。トランスジェニックマウスを、通常の様式で、選択した抗原、たとえば本発明のポリペプチドの全体または一部分を用いて免疫化する。抗原に向けたモノクローナル抗体は、免疫化したトランスジェニックマウスから、慣用のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞の分化中に再編成され、引き続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar (1995、Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するこの技術ならびにこのような抗体を製造するプロトコルの詳細な記述には、たとえば、その全体で参考として本明細書中に組み込まれている国際公開公報WO98/24893号、WO96/34096号、およびWO96/33735号;ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照されたい。さらに、上述した技術に類似の技術を用いて選択した抗原に向けられたヒト抗体を提供するために、Abgenix, Inc.(Fremont, CA)およびMedarex(Princeton, NJ)などの会社と契約することができる。
キメラ抗体とは、非ヒト抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体の製造方法は当分野で知られている。たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Morrison、1985、Science 229:1202; Oi他、1986、BioTechniques 4:214; Gillies他、1989、J. Immunol. Methods 125:191-202;ならびに米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照されたい。非ヒト種からの1つまたは複数のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、たとえば、CDR移植(欧州特許EP239,400号;国際公開公報WO91/09967号;米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号)、ベニヤ加工(veneering)または再表面化(resurfacing)(欧州特許EP592,106号;欧州特許EP519,596号;Padlan、1991、Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka他、1994、Protein Engineering 7:805;およびRoguska他、1994、PNAS 91:969)、ならびに鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)を含めた当分野で知られている様々な技術を用いて製造することができる。
多くの場合、抗原結合を変更、好ましくは改善するために、フレームワーク領域中のフレームワーク残基をCDRドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法によって、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための、CDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。(たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第5,585,089号;およびRiechmann他、1988、Nature 332:323を参照。)
ヒト化抗体とは、所定の抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRを含む、抗体もしくはその変異体またはその断片である。ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの、可変ドメインの実質的にすべてを含み、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン(すなわちドナー抗体)のそれに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域(Fc)の少なくとも一部分も含む。通常、抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインをどちらも含む。また、抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含めた免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含めた任意のアイソタイプから選択することができる。通常、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが望ましい場合は、定常ドメインは補体結合の定常ドメインであり、クラスは典型的にはIgG1である。そのような細胞傷害活性が望ましくない場合は、定常ドメインはIgG2クラスのものであり得る。ヒト化抗体は複数のクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは当分野の通常の技量の範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は親配列に正確に対応している必要はなく、たとえば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークを、その部位でのCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体のどちらかに対応しないように、少なくとも1つの残基の置換、挿入または欠失によって突然変異誘発し得る。しかし、そのような突然変異は大規模ではない。通常、ヒト化抗体の残基の少なくとも75%、より多くの場合は90%、最も好ましくは95%を超える残基が、親フレームワーク領域(FR)およびCDR配列のそれに対応する。ヒト化抗体は、それだけには限定されないが、CDR移植(欧州特許EP239,400号;国際公開公報WO91/09967号;米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号)、ベニヤ加工または再表面化(欧州特許EP592,106号および欧州特許EP519,596号;Padlan、1991、Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka他、1994、Protein Engineering 7(6):805-814;およびRoguska他、1994、PNAS 91:969-973)、鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに、たとえば、米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開公報WO9317105、Tan他、2002、J. Immunol. 169:1119-25、Caldas他、2000、Protein Eng. 13:353-60、Morea他、2000、Methods 20:267-79、Baca他、1997、J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguska他、1996、Protein Eng. 9:895-904、Couto他、1995、Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Couto他、1995、Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu、1994、Gene 150:409-10、Pedersen他、1994、J. Mol. Biol. 235:959-73、Jones他、1986、Nature 321:522-525、Riechmann他、1988、Nature 332:323、およびPresta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596に開示されている技術を含めた当分野で知られている様々な技術を用いて作製することができる。多くの場合、抗原結合を変更、好ましくは改善するために、フレームワーク領域中のフレームワーク残基をCDRドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法によって、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための、CDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列決定によって同定される。(たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれているQueen他、米国特許第5,585,089号;およびRiechmann他、1988、Nature 332:323を参照。)
さらに、本発明の抗体は、立ち代って、当業者に周知の技術を用いて抗イディオタイプ抗体を作製するために利用することができる。(たとえば、GreenspanおよびBona、1989、FASEB J. 7:437-444;ならびにNissinoff、1991、J. Immunol. 147:2429-2438を参照)。本発明は、本発明の抗体またはその断片をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を採用した方法を提供する。
5.4.1抗体の組換え発現
本発明で用いる抗体、誘導体、類似体またはそれらの断片(たとえば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部分あるいは本発明の単鎖抗体)の組換え発現は、抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を要する。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその一部分(好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含むが、必ずではない)をコードしているポリヌクレオチドを得た後、抗体分子を製造するためのベクターを、当分野で周知の技術を用いた組換えDNA技術によって製造し得る。したがって、抗体をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を製造する方法を、本明細書中に記載する。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、抗体の重鎖または軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインまたはその一部分、あるいは重鎖または軽鎖のCDRをコードしているヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードしているヌクレオチド配列を含んでいてよく(たとえば、国際公開公報WO86/05807号およびWO89/01036号;ならびに米国特許第5,122,464号を参照)、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖全体および軽鎖全体の両方を発現させるために抗体の可変ドメインをこのようなベクター内にクローニングしてよい。
慣用技術によって発現ベクターを宿主細胞に移入し、その後、慣用技術によって形質移入した細胞を培養して本発明の抗体を製造した。したがって、本発明には、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体またはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分、あるいは本発明の単鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。二本鎖抗体を発現するための実施形態では、以下に詳細を記載するように、重鎖および軽鎖をどちらもコードしているベクターを、免疫グロブリン分子全体を発現させるために宿主細胞中で同時発現させ得る。
本発明の抗体分子を発現させるために様々な宿主-発現ベクター系を利用し得る(たとえば米国特許第5,807,715号を参照)。そのような宿主-発現系は、目的のコード配列を生成して続いて精製するビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換または形質移入した場合に本発明の抗体分子をin situで発現する細胞も表す。これらには、それだけには限定されないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換させた細菌(たとえば、大腸菌および枯草菌(B.subtilis))などの微生物;抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換させた酵母(たとえばサッカロミセスピキア(Saccharomyces Pichia));抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(たとえばバキュロウイルス)を用いて感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(たとえば、カリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus)、CaMV;タバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus)、TMV)を用いて感染させた、もしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(たとえばTiプラスミド)を用いて形質転換させた植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(たとえばメタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(たとえば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築体を保有する哺乳動物細胞系(たとえば、COS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞)が含まれる。好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞を、組換え抗体分子の発現、特に全組換え抗体分子の発現に用いる。たとえば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せた、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である(Foecking他、1986、Gene 45:101;およびCockett他、1990、BioTechnolog 8:2)。具体的な実
施形態では、免疫特異的に結合して苦しむ抗体またはその断片をコードしているヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節されている。
細菌系では、発現させる抗体分子に意図する使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択し得る。たとえば、抗体分子の薬剤組成物を作製するためにこのようなタンパク質を大量に製造する場合は、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、それだけには限定されないが、抗体コード配列を、融合タンパク質が産生されるようにlac Zコード領域とインフレームで個別にベクター内にライゲートし得る大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther他、1983、EMBO 12:1791);pINベクター(InouyeおよびInouye、1985、Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van HeekeおよびSchuster、1989、J. Biol. Chem. 24:5503-5509);などが含まれる。外来ポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるためにpGEXベクターも用い得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングした標的遺伝子産物がGST部分から放出されるように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いる。このウイルスはスポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域(たとえば多角体遺伝子)内に個別にクローニングし、AcNPVプロモーター(たとえば多角体プロモーター)の制御下に置き得る。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、たとえば、後期プロモーターおよび三ツ組(tripartite)リーダー配列にライゲートし得る。その後、in vitroまたはin vivo組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム内に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域(たとえば領域ElまたはE3)内への挿入により、生存可能であり、感染した宿主内で抗体分子を発現することができる組換えウイルスがもたらされる(たとえば、LoganおよびShenk、1984、PNAS 8 1:355-359を参照)。挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳には特異的な開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と同相でなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源であることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって増強し得る(たとえば、Bittner他、1987、Methods in Enzymol. 153:516-544を参照)。
さらに、挿入した配列の発現を調節する、または所望する特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のそのような修飾(たとえばグリコシル化)およびプロセッシング(たとえば切断)は、タンパク質の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的を達成するために、遺伝子産物の一次転写物の正しいプロセッシング、グリコシル化、およびリン酸化の細胞機構を保有する真核宿主細胞を用い得る。そのような哺乳動物宿主細胞には、それだけには限定されないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1、T47D、NS0(免疫グロブリン鎖を内在的に全く産生しないネズミ骨髄腫細胞系)、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が含まれる。
少なくとも1つのゼロ次チオエーテルを含む抗体を、当業者に知られている抗体を産生するための任意の細胞系によって、組換えによって製造することができる。本発明の抗体を黒色腫細胞中で産生させることが有利であることが判明している。特定の実施形態では、本発明の抗体は、黒色腫細胞中で組換えによって製造する。一部の実施形態では、本発明の抗体は、CHO細胞系中で組換えによって産生しない。他の実施形態では、本発明の抗体は、NS0細胞系中で組換えによって産生しない。
組換えタンパク質の長期的な高収率の製造には、安定した発現が好ましい。たとえば、抗体分子を安定して発現する細胞系を操作し得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いる代わりに、宿主細胞を、適切な発現制御要素(たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入に続いて、操作した細胞を1〜2日間、富化培地中で増殖し、その後、選択培地に交換し得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を与え、プラスミドが細胞の染色体内に安定して組み込まれ、増殖して増殖巣を形成し、次いでそれをクローニングして細胞系へと拡大することが可能となる。この方法を、抗体分子を発現する細胞系を操作するために有利に用い得る。このような操作した細胞系は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
それだけには限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler他、1977、Cell 11:223)、グルタミン合成酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaおよびSzybalski、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy他、1980、Cell 22:8-17)遺伝子を含めたいくつかの選択系を用いてよく、それぞれtk-、gs-、hgprt-またはaprt-細胞中で用い得る。また、以下の遺伝子の選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を用いることもできる:メトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler他、1980、PNAS 77:357; O'Hare他、1981、PNAS 78:1527);ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(MulliganおよびBerg、1981、PNAS 78:2072);アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo(WuおよびWu、1991、Biotherapy 3:87; Tolstoshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan、1993、Science 260:926;ならびにMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev. Biochem. 62: 191; 1993年5月、TIB TECH 11:155-);およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerre他、1984、Gene 30:147)。所望の組換えクローンを選択するために組換えDNA技術の分野で一般的に知られている方法を日常的に適用してよく、このような方法は、たとえば、その全体が参考として本明細書中に組み込まれているAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY (1993); Kriegler、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press、NY (1990);ならびに第12章および第13章、Dracopoli他編、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY (1994); Colberre-Garapin他、1981、J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加することができる(総説には、BebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、第3巻. (Academic Press、New York、1987)を参照)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合は、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加する。増幅される領域は抗体遺伝子に関連しているので、抗体の産生も増加する(Crouse他、1983、Mol. Cell. Biol. 3:257)。
宿主細胞は本発明の2つの発現ベクターを用いて同時形質移入してもよく、第1のベクターは重鎖に由来するポリペプチドをコードしており、第2のベクターは軽鎖に由来するポリペプチドをコードしている。2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドをどちらもコードしており、それらを発現することができる単一のベクターを用い得る。このような状況では、毒性がある遊離重鎖の過剰を回避するために、軽鎖は重鎖の前に配置すべきである(Proudfoot、1986、Nature 322:52;およびKohler、1980、PNAS 77:2197)。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含み得る。
組換え発現によって本発明の抗体分子を産生した後、免疫グロブリン分子を精製するための当分野で知られている任意の方法によって、たとえば、クロマトグラフィー(たとえば、イオン交換、親和性、特にタンパク質A後の特異的抗原には親和性によって、およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的溶解度、またはタンパク質を精製する任意の他の標準の技術によって精製し得る。さらに、精製を容易にするために、本発明の抗体またはその断片を、本明細書中に記載のまたは他の様式で、当分野で知られている異種ポリペプチド配列と融合し得る。
5.5本発明の抗体および組成物の使用
抗体およびその組成物を含む製剤は、当業者が認識する任意の関連で用いることができる。たとえば、本発明の製剤は、特定の抗原に対して直接用いることができる。また、抗体および組成物を含む本発明の製剤は、被験体または生体試料(たとえば、細胞もしくは組織)中における抗原の発現を検出/同定するための、in vivoまたはin vitroのどちらかの診断的アッセイで用いることもできる。抗体および組成物を含む本発明の製剤は、障害または1つもしくは複数のその症状を治療、管理、予防または改善させるために、単独でまたは他の予防剤もしくは治療剤と組み合わせて用いることができる。
本発明は、それを必要としている被験体に、本発明の1つまたは複数の抗体を、単独でまたは本発明の抗体以外の1つもしくは複数の治療(たとえば1つもしくは複数の予防剤もしくは治療剤)と組み合わせて投与することを含む、障害を予防、管理、治療、または改善させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の1つまたは複数の抗体および本発明の抗体以外の1つまたは複数の予防剤または治療剤を含む製剤、ならびに前記組成物を利用した、障害または1つもしくは複数のその症状を予防、管理、治療、または改善させる方法も提供する。治療剤または予防剤には、それだけには限定されないが、小分子、合成薬、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸(たとえば、それだけには限定されないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重鎖、RNAi、および生物活性のあるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含めたDNAおよびRNAヌクレオチド)抗体、合成または天然無機分子、模倣剤、および合成または天然有機分子が含まれる。
障害または1つもしくは複数のその症状の予防、管理、治療、または改善に有用であることが知られている、またはそのために使用されていたまたは現在使用されている任意の治療を、本明細書中に記載の本発明に従って、本発明の抗体または組成物と組み合わせて用いることができる。障害または1つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理、または改善に使用されていたまたは現在使用されている治療(たとえば予防剤または治療剤)に関する情報には、たとえば、Gilman他、Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics、第10版、McGraw-Hill、New York、2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、Berkow, M. D.他編、第17版、Merck Sharp & Dohme Research Laboratories、Rahway, N.J.、1999; Cecil Textbook of Medicine、第20版、BennettおよびPlum編、W. B. Saunders、Philadelphia、1996を参照されたい。そのような薬剤の例には、それだけには限定されないが、免疫調節剤、抗炎症剤(たとえば、副腎コルチコイド、コルチコステロイド(たとえば、ベクロメタゾン(beclomethasone)、ブデソニド(budesonide)、フルニソリド(flunisolide)、フルチカゾン(fluticasone)、トリアムシノロン(triamcinolone)、メスリプレドニゾロン(methlyprednisolone)、プレドニゾロン(prednisolone)、プレドニゾン(prednisone)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone))、糖質コルチコイド、ステロイド、非ステロイド抗炎症薬(たとえば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、およびCOX-2阻害剤)、抗癌剤、鎮痛剤、ロイコトレイン拮抗剤(たとえば、モンテルカスト(montelukast)、メチルキサンチン、ザフィルルカスト(zafirlukast)、およびジロートン(zileuton))、β2-作用剤(たとえば、アルブテロール(albuterol)、ビテロール(biterol)、フェノテロール(fenoterol)、イソエタリー(isoetharie)、メタプロテレノール(metaproterenol)、ピルブテロール(pirbuterol)、サルブタモール(salbutamol)、テルブタリンフォルモテロール(terbutalin formoterol)、サルメテロール(salmeterol)、およびサルブタモールテルブタリン(salbutamol terbutaline))、抗コリン剤(たとえば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム)、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン、抗マラリア剤(たとえばヒドロキシクロロキン)、抗ウイルス剤、ならびに抗生物質(たとえば、ダクチノマイシン(dactinomycin)(以前はアクチノマイシン(actinomycin))、ブレオマイシン(bleomycin)、エリトマイシン(erythomycin)、ペニシリン、ミトラマイシン(mithramycin)、およびアンスラマイシン(anthramycin)(AMC))が含まれる。
具体的な実施形態では、本発明は、1つまたは複数のヒト化抗IL-9抗体を含む製剤を、被験体、好ましくはヒト被験体に、呼吸器の状態または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理、または改善させるために投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、呼吸器疾患または1つもしくは複数のその症状(たとえば、アレルギー、喘鳴、および喘息)を予防、治療、管理、または改善させる方法を包含し、前記方法は、それを必要としている被験体に、予防上または治療上有効な量の用量の、ヒト化抗IL-9抗体の1つまたは複数を含む製剤を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、呼吸器感染症または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理、または改善させる方法を提供し、前記方法は、予防上または治療上効果的な量の、1つまたは複数のヒト化抗IL-9抗体を投与することを含む。
具体的な実施形態では、本発明は、1つまたは複数のヒト化抗EphA2抗体の製剤を、被験体、好ましくはヒト被験体に、過剰増殖性細胞疾患または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理、または改善させるために投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、1つまたは複数のヒト化抗EphA2抗体を、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、被験体に、癌または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理、または改善させるために投与する(たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第10/436,782号を参照)。別の実施形態では、1つまたは複数のヒト化抗EphA2抗体を、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、被験体に、非新生物性過剰増殖性細胞、具体的には過剰増殖性上皮および内皮細胞に関与する障害、またはその1つもしくは症状を予防、治療、管理、または改善させるために投与する(たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願第60/462,024号を参照)。さらに別の実施形態では、1つまたは複数のヒト化抗EphA2抗体を診断またはスクリーニングの目的のために用いる。
本発明の抗体および組成物を含む製剤は、特定の抗原に対して直接用いることができる。一部の実施形態では、本発明の抗体および組成物は、抗体が結合する細胞の溶解を媒介することができるサブクラスまたはアイソタイプに属する。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、細胞表面タンパク質と複合体形成した際に、血清補体を活性化するおよび/またはナチュラルキラー細胞もしくはマクロファージなどのエフェクター細胞を活性化することによって抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を媒介する、サブクラスまたはアイソタイプに属する。
抗体の生物活性は、かなりの程度まで抗体分子の定常ドメインまたはFc領域によって決定されることが知られている(UananueおよびBenacerraf、Textbook of Immunology、第2版、Williams & Wilkins、218頁 (1984))。これには、補体を活性化し、白血球によってもたらされる抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を媒介するその能力が含まれる。異なるクラスおよびサブクラスの抗体はこの点で異なり、同じサブクラスに属するが異なる種の抗体もそうである。本発明によれば、所望の生物活性を有するクラスの抗体を製造する。これらの抗体の製造は、抗体定常ドメインを選択することおよび既知の技術によってそれらをヒト化抗体中に組み込ませることを含む。たとえば、IgG3およびIgG2aクラスのマウス免疫グロブリンは、同族抗原を発現する標的細胞に結合した際に血清補体を活性化することができ、したがって、特定の治療の応用にはIgG3およびIgG2aエフェクター機能を組み込んだヒト化抗体が望ましい。
一部の実施形態では、抗体および組成物を含む本発明の製剤は、患者の受動的免疫化に有用である。
抗体および組成物を含む本発明の製剤は、被験体または生体試料(たとえば、細胞もしくは組織)中における抗原の発現を検出/同定するための、in vivoまたはin vitroのどちらかの診断的アッセイで用いることもできる。診断的アッセイで抗体または抗体を含む組成物を用いる非限定的な例は、米国特許第6,392,020号;第6,156,498号;第6,136,526号;第6,048,528号;第6,015,555号;第5,833,988号;第5,811,310号;第85,652,114号;第5,604,126号;第5,484,704号;第5,346,687号;第5,318,892号;第5,273,743号;第5,182,107号;第5,122,447号;第5,080,883号;第5,057,313号;第4,910,133号;第4,816,402号;第4,742,000号;第4,724,213号;第4,724,212号;第4,624,846号;第4,623,627号;第4,618,486号;第4,176,174号(すべて本明細書中に参考として組み込まれている)に示されている。抗原およびその抗体に適切な診断的アッセイは、用いる具体的な抗体に依存する。非限定的な例は、ELISA、サンドイッチアッセイ、および立体阻害アッセイである。本発明の抗体を用いたin vivoの診断的アッセイには、抗体を、X線、コンピュータ断層撮影(CT)、超音波、または磁気共鳴画像法(MRI)などのイメージング技術によって検出することができる標識とコンジュゲートさせ得る。また、本発明の抗体は、組換え細胞培養物または天然源からの抗原の親和性精製に用いることもできる。
5.5.1RSV感染症に対する抗体製剤の予防的および治療的使用
本発明は、本発明の抗体を、被験体、好ましくはヒトに、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、または改善させるために投与することを含む、抗体に基づいた治療を提供する。本発明の予防剤および治療剤には、それだけには限定されないが、抗体(本明細書中に記載のその類似体および誘導体を含む)ならびに抗体をコードしている核酸(本明細書中に記載のその類似体および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む)が含まれる。抗体は、当分野で知られているまたは本明細書中に記載の製薬上許容される組成物として提供し得る。
RSV感染症の拮抗剤として機能する抗体を含む本発明の製剤を、被験体、好ましくはヒトに、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療、予防または改善させるために投与することができる。たとえば、RSV抗原とその宿主細胞受容体との相互作用を破壊または妨げる抗体を、被験体、好ましくはヒトに、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療、予防または改善させるために投与し得る。
具体的な実施形態では、抗体は、RSVがその宿主細胞受容体に結合することを、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSVとその宿主細胞受容体との結合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。別の実施形態では、抗体の組合せは、RSVがその宿主細胞受容体に結合することを、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSVとその宿主細胞受容体との結合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。
具体的な実施形態では、抗体は、RSVによって誘導される融合を、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSVによって誘導される融合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。別の実施形態では、抗体の組合せは、RSVによって誘導される融合を、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSVによって誘導される融合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。
具体的な実施形態では、抗体は、ウイルスの細胞への付着後にRSVによって誘導される融合を、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のウイルスの細胞への付着後にRSVによって誘導される融合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。別の実施形態では、抗体の組合せは、ウイルスの細胞への付着後にRSVによって誘導される融合を、当業者に知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のウイルスの細胞への付着後にRSVによって誘導される融合と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%妨げるまたは阻害する。
RSVがその宿主細胞受容体に結合することを妨げないが、RSV複製を阻害またはダウンレギュレーションする抗体も、被験体に、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療、予防または改善させるために投与することができる。抗体がRSV複製を阻害またはダウンレギュレーションする能力は、本明細書中に記載のまたは他の様式で、当分野で知られている技術によって決定し得る。たとえば、RSV複製の阻害またはダウンレギュレーションは、被験体、好ましくはヒトの肺中のRSV力価を検出することによって決定することができる。さらなる実施形態では、RSV複製の阻害またはダウンレギュレーションは、当分野で知られている方法(たとえば、ノーザンブロット分析、RT-PCR、ウエスタンブロット分析など)によって鼻道または中耳中のRSVの量を検出することによって決定することができる。
一部の実施形態では、本発明の製剤は、肺中のRSV力価の約1倍、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、約50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍、約100倍、約105倍、約110倍、約115倍、約120倍、約125倍以上の低下をもたらす抗体を含む。RSV力価の低下の倍数は、陰性対照(プラセボなど)と比較したもの、別の治療(それだけには限定されないが、パリビツマブを用いた治療を含む)と比較したもの、または抗体投与前の患者中の力価と比較したものであり得る。
具体的な実施形態では、本発明の製剤は、RSV複製を、当分野で知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSV複製と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%阻害またはダウンレギュレーションする抗体を含む。別の実施形態では、抗体の組合せは、RSV複製を、当分野で知られているまたは本明細書中に記載のアッセイにおいて、前記抗体を存在させない場合または陰性対照を存在させた場合のRSV複製と比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%阻害またはダウンレギュレーションする。
一部の実施形態では、本発明の製剤は、上気道中のRSV力価の約1倍、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、約50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍、約100倍、約105倍、約110倍、約115倍、約120倍、約125倍以上の低下をもたらす抗体を含む。RSV力価の低下の倍数は、陰性対照(プラセボなど)と比較したもの、別の治療(それだけには限定されないが、パリビツマブを用いた治療を含む)と比較したもの、または抗体投与前の患者中の力価と比較したものであり得る。
他の実施形態では、本発明の製剤は、下気道中のRSV力価の約1倍、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、約50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍、約100倍、約105倍、約110倍、約115倍、約120倍、約125倍以上の低下をもたらす抗体を含む。RSV力価の低下の倍数は、陰性対照(プラセボなど)と比較したもの、別の治療(それだけには限定されないが、パリビツマブを用いた治療を含む)と比較したもの、または抗体投与前の患者中の力価と比較したものであり得る。
1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する、本発明に関連する1つまたは複数の抗体は、予防剤または治療剤として局所的または全身的に用い得る。また、抗体は、たとえば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させる役割を果たす、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体と組み合わせて、またはリンホカインもしくは造血成長因子(たとえば、IL-2、IL-3およびIL-7など)と組み合わせて、有利に利用し得る。また、抗体は、たとえば免疫応答を増加させる役割を果たす、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体と組み合わせて、またはリンホカインもしくは造血成長因子(たとえば、IL-2、IL-3およびIL-7など)と組み合わせて、有利に利用し得る。また、抗体は、たとえば抗ウイルス剤などの、RSV感染症を治療するために用いられる1つまたは複数の薬物と組み合わせて有利に利用し得る。本発明の抗体は、以下の薬物の1つまたは複数と組み合わせて用い得る:NIH-351(Gemini Technologies)、組換えRSVワクチン(Aviron)、RSVf-2(Intracel)、F-50042(Pierre Fabre)、T-786(Trimeris)、VP-36676(ViroPharma)、RFI-641(American Home Products)、VP-14637(ViroPharma)、PFP-1およびPFP-2(American Home Products)、RSVワクチン(Avant Immunotherapeutics)、ならびにF-50077(Pierre Fabre)。具体的な実施形態では、有効量の抗体および有効量の別の治療を用いる。
抗体を含む本発明の製剤は、単独でまたは他の種類の治療(たとえば、ホルモン療法、免疫療法、および抗炎症剤)と組み合わせて投与し得る。一般に、患者と同じ種の種起源または種反応性(抗体の場合)の生成物を投与することが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、ヒトもしくはヒト化抗体、誘導体、類似体、または核酸を、治療または予防のためにヒト患者に投与する。
具体的な実施形態では、抗体を1つまたは複数の抗IL-9抗体(米国特許公報第2005/0002934号に開示されているものなど)と組み合わせて、それだけであるいは本発明の1つもしくは複数の抗体および/または他の種類の治療もしくは他の薬剤(たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公報第2005/0002934号に開示されているものなどのホルモン治療、免疫療法、および抗炎症剤)と組み合わせて、投与する。
RSVに向けられた免疫アッセイ、ならびに上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、管理または治療のどちらにも、RSV抗原に免疫特異的に結合する、高親和性および/または強力なin vivo阻害抗体および/または中和抗体を用いることが好ましい。また、RSVに向けられた免疫アッセイ、ならびに上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の治療のどちらにも、RSV抗原に免疫特異的に結合する高親和性および/または強力なin vivo阻害抗体および/または中和抗体をコードしているポリヌクレオチドを用いることも好ましい。そのような抗体は、好ましくは、RSV F糖タンパク質および/またはF糖タンパク質の断片に対して親和性を有する。
本発明の方法は、1つまたは複数の抗体を、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)に罹患しているまたは罹患することが予測される患者(たとえば、遺伝的素因を有する患者または以前に罹患していた患者)に、投与することを含む。そのような患者は、たとえば、本発明の抗体以外の治療で、感染症、中耳炎、または呼吸器の状態について以前に治療されていたまたは現在治療されていてもよい。一実施形態では、本発明の方法は、1つまたは複数の抗体を免疫無防備状態または免疫抑制状態の患者に投与することを含む。特定の実施形態では、抗体を免疫無防備状態または免疫抑制状態の患者に投与する。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)に関連する1つまたは複数の症状を治療、予防または改善させるために、抗体を、嚢胞性線維症、気管支肺異形成、先天性心疾患、先天性免疫不全もしくは後天性免疫不全に罹患しているヒト、または骨髄移植を受けたヒトに投与する。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎に関連する1つまたは複数の症状を治療、予防または改善させるために、抗体を含む本発明の製剤を、ヒト幼児、好ましくは早産のヒト幼児またはRSV感染症で入院する危険性にあるヒト幼児に投与する。さらに別の実施形態では、抗体を含む本発明の製剤を、高齢者またはグループホーム(たとえば、養護ホームもしくはリハビリテーションセンター)の居住者に投与する。本発明に従って、抗体を含む本発明の製剤は、それだけには限定されないが、それだけには限定されないが第1系統、第2系統、第3系統および第4系統の治療を含めた第1系統、第2系統、第3系統および第4系統の治療を含めた任意の治療系統として用い得る。さらに、本発明に従って、抗体を含む本発明の製剤を、抗体以外の治療の任意の有害作用または不耐性が起こる前に用いることができる。本発明は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎の発症または再発を予防するために、1つまたは複数の抗体を投与する方法を包含する。
一実施形態では、本発明はまた、現在の治療の代替方法として、上気道および/もしくは下気道RSV感染症(好ましくはRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する)、中耳炎またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療、管理、予防および/または改善する方法も提供する。具体的な実施形態では、現在の治療は、患者に対して毒性が強すぎると判明しているまたは判明し得る(すなわち、許容されないまたは耐え難い副作用をもたらす)。別の実施形態では、抗体は、現在の治療と比較して副作用を低減させる。別の実施形態では、患者は現在の治療に不応性であることが判明している。そのような実施形態では、本発明は、任意の他の抗感染症の治療なしで本発明の1つまたは複数の抗体を投与することを提供する。特定の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療するために、1つまたは複数の抗体を、それを必要としている患者に、別の治療の代わりに投与することができる。一実施形態では、本発明は、活動的な上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を治療、管理、予防および/または改善させる方法を提供する。
本発明はまた、抗体以外の治療に不応性であるまたは不応性となった患者において、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎の症状を治療または改善させるために1つまたは複数の抗体を投与するための方法も包含する。感染症が不応性であるかどうかの決定は、感染症における患部細胞、特に上皮細胞において、または本発明の抗体以外の治療に不応性であるもしくは不応性となった患者において治療の有効性をアッセイする、当分野で知られている任意の方法によって、in vivoまたはin vitroのどちらかで行うことができる。
特定の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、管理、治療、および/または改善させるために、本発明の製剤中の有効量の1つまたは複数の抗体を、1つまたは複数の支援手段と組み合わせて、それを必要としている被験体に投与する。支援手段の非限定的な例には、超音波噴霧器による空気の加湿、エアロゾル化したラセミ体エピネフリン、経口デキサメタゾン、静脈内輸液、挿管、解熱剤(たとえば、イブプロフェン(ibuprofen)、アセトメタフィン(acetometaphin))、ならびに抗生物質および/または抗真菌治療(すなわち、二次細菌感染症および/または真菌感染症を予防または治療するため)が含まれる。
具体的な実施形態では、本発明は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させるための方法を提供し、前記方法は、それを必要としている被験体に、有効量の本発明の1つまたは複数の抗体を、単独で、またはそれだけには限定されないが、アマンタジン(amantadine)、リマンタジン(rimantadine)、オセルタミビル(oseltamivir)、ズナミビル(znamivir)、リババリン(ribavarin)、RSV-IVIG(すなわち静脈内免疫グロブリンインフュージョン)(レスピガム(商標))、EphA2/エフリンA1モジュレーター、および/もしくは抗IL-9抗体(たとえば米国特許公報第2005/0002934号を参照)などの1つもしくは複数の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することを含む。
具体的な実施形態では、本発明は、原発性ウイルス感染症に対する1つまたは複数の二次応答を予防、治療、管理、および/または改善させるための方法を提供し、前記方法は、有効量の1つまたは複数の抗体を、単独で、または有効量の他の治療(たとえば、他の予防剤または治療剤)と組み合わせて投与することを含む。原発性ウイルス感染症に対する二次応答の例には、それだけには限定されないが、粘膜刺激に対する喘息様の応答性、全呼吸抵抗の上昇、二次ウイルス感染症、細菌感染症、および真菌感染症に対する罹患率の増加、ならびに、それだけには限定されないが、細気管支炎、肺炎、クループ、および熱性気管支炎などの状態の発生が含まれる。
具体的な実施形態では、本発明は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させる方法を提供し、前記方法は、それを必要としている被験体に、有効量の1つまたは複数の抗体を、有効量のEphA2/エフリンA1モジュレーターと組み合わせて投与することを含む(その全体が参考として本明細書中に組み込まれている、2004年10月27日に出願、題名「Use of Modulators of EphA2 and EphrinA1 for the Treatment and Prevention of Infections」の米国特許仮出願第60/622,489号)。別の具体的な実施形態では、本発明は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させるための方法を提供し、前記方法は、それを必要としている被験体に、有効量の1つまたは複数の抗体を、有効量のシプリズマブと組み合わせて投与することを含む(その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、MedImmune, Inc.、国際公報WO02/069904号)。別の実施形態では、本発明は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理および/または改善させる方法を提供し、
前記方法は、それを必要としている被験体に、有効量の1つまたは複数の抗体を、有効量の1つまたは複数の抗IL-9抗体、たとえば、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公報第2005/0002934号に開示されているものなどと組み合わせて投与することを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させるための方法を提供し、前記方法は、それを必要としている被験体に、有効量の本発明の1つまたは複数の抗体を、有効量の以下の2つ以上、すなわちEphA2/エフリンA1モジュレーター、抗IL-9抗体および/またはシプリズマブと組み合わせて投与することを含む。
本発明の抗体、組成物、または組合せ療法を含む本発明の製剤は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、および/または改善させるために、それだけには限定されないが、治療の第1系統、第2系統、第3系統、第4系統、または第5系統を含めた任意の治療系統として用い得る。また、本発明には、他の疾患または障害(たとえば非RSV感染症)の治療を受けている患者において、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させる方法も含まれる。本発明は、本発明の抗体以外の治療の任意の有害作用または不耐性が発生する前に、患者においてRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、管理、治療、および/または改善させる方法を包含する。
本発明はまた、不応性患者においてRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させる方法を包含する。特定の実施形態では、上気道および/または下気道RSV感染症に罹患している患者は、感染症が顕著に根絶されなかった場合および/または症状が顕著に緩和されなかった場合に、治療に不応性である。患者が不応性であるかどうかの決定は、感染症に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で知られている任意の方法によって、このような関連における当分野で受け入れられている「不応性」の意味を用いて、in vivoまたはin vitroのどちらかで行うことができる。様々な実施形態では、上気道および/または下気道RSV感染症に罹患している患者は、ウイルス複製が減少していない場合または増加している場合に不応性である。本発明はまた、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)などの感染症または中耳炎を発生する危険性にある患者において、その発症または再発を予防する方法を包含する。
本発明はまた、慣用の治療に対する有害な反応に感受性のある患者において、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、管理、治療、および/または改善させる方法も包含する。本発明はさらに、抗ウイルス治療が存在しないRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)または中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させる方法を包含する。
本発明は、本発明の抗体以外の治療に不応性であることが判明しているが、もはやその治療を受けていない患者において、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、管理、および/または改善させる方法を包含する。特定の実施形態では、本発明の方法に従って治療する患者は、既に抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または他の生物療法/免疫療法で治療されている患者である。このような患者には、とりわけ、不応性患者、慣用の治療には若すぎる患者、ならびに既存の治療で治療したにもかかわらず上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)が再発している患者が存在する。
本発明は、他の慣用の治療の代替方法としてRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療および/または改善させる方法を包含する。具体的な実施形態では、本発明の方法に従って治療されている患者は、他の治療に不応性であるか、またはそのような治療からの有害な反応に感受性を有する。患者は、免疫系が抑制された人(たとえば、手術後の患者、化学療法患者、および免疫不全疾患に罹患している患者)、腎臓または肝臓の機能不全に罹患している人、高齢者、小児、幼児、早産の幼児、神経精神障害に罹患している人または向精神薬を服用している人、癲癇発作の病歴のある人、あるいは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を予防、治療、および/または改善させるために用いられている慣用の薬剤と負に相互作用する医薬品を服用している人であり得る。
本明細書中に提供する投与の用量および頻度は、用語「有効量」、「治療上有効な」および「予防上」有効によって包含される。用量および頻度は、典型的には、投与する具体的な治療剤または予防剤、感染症の重篤度および種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に依存するそれぞれの患者に特異的な要素に従ってさらに変動する。適切なレジメンは、そのような要素を考慮することによって、および、たとえば、文献中に報告され、Physician's Desk Reference (第58版、2004)に推奨される用量にしたがうことによって、当業者が選択することができる。本発明によって提供される予防剤および治療剤の具体的な投与の用量および頻度には、5.3節を参照されたい。
5.6抗体の投与方法
具体的な実施形態、本発明は、被験体に有効量の抗体、または本発明の抗体を含む製剤を含む薬剤組成物を投与することによる、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の治療、予防、および改善方法を提供する。好ましい態様では、抗体は実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。治療を投与する被験体は、好ましくは非霊長類(たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)ならびに霊長類(たとえば、カニクイザルなどのサルおよびヒト)などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。別の好ましい実施形態では、被験体はヒト幼児または早産のヒト幼児である。別の実施形態では、被験体は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、RSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎、嚢胞性線維症、気管支肺異形成、先天性心疾患、先天性免疫不全もしくは後天性免疫不全に罹患しているヒト、骨髄移植を受けたヒト、または高齢のヒトである。
それだけには限定されないが、リポソーム中へのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体を発現することができる組換え細胞、受容体に媒介されるエンドサイトーシス(たとえば、WuおよびWu、J. Biol. Chem.、262:4429-4432(1987)を参照)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などを含めた様々な送達系が知られており、予防剤または治療剤(たとえば本発明の抗体)を投与するために用いることができる。予防剤もしくは治療剤(たとえば本発明の抗体)、または薬剤組成物の投与方法には、それだけには限定されないが、非経口投与(たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外、ならびに粘膜(たとえば、鼻腔内および経口経路)が含まれる。具体的な実施形態では、予防剤もしくは治療剤(たとえば本発明の抗体)、または薬剤組成物は、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与する。予防剤もしくは治療剤、または組成物は、任意の好都合な経路によって、たとえばインフュージョンまたはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の裏層(たとえば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など)を通る吸収によって投与してよく、他の生物活性のある薬剤と共に投与し得る。投与は全身性または局所的であることができる。さらに、たとえば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む製剤を用いることによって、肺投与を用いることもできる。たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号、および第4,880,078号;ならびにPCT公報WO92/19244号、WO97/32572号、WO97/44013号、WO98/31346号、およびWO99/66903号を参照されたい。具体的な実施形態では、抗体、または本発明の製剤は、Alkermes AIR(商標)の肺薬物送達技術(Alkermes, Inc.、Cambridge, MA)を用いて投与する。
具体的な実施形態では、予防剤もしくは治療剤、または本発明の薬剤製剤を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、たとえば、それだけには限定されないが、局所動注、注射によって、または移植片を用いることによって達成してよく、前記移植片は、シアラスチック膜などの膜、または線維を含めた、多孔性、非多孔性、またはゼラチン材料からなる。好ましくは、本発明の抗体を投与する際は、抗体が吸収しない材料を用いるように注意する必要がある。
別の実施形態では、予防剤もしくは治療剤、または本発明の製剤は、小胞、具体的にはリポソーム中で送達することができる(Langer、1990、Science 249:1527-1533; Treat他、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler編、Liss、New York、353-365頁 (1989); Lopez-Berestein、同書317-327頁を参照;一般に同書を参照)。
別の実施形態では、予防剤もしくは治療剤、または本発明の製剤は、徐放性または持続放出系で送達することができる。一実施形態では、徐放または持続放出を達成するためにポンプを用い得る(Langer、上記; Sefton、1987、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald他、1980、Surgery 88:507; Saudek他、1989、N. Engl. J. Med. 321:574を参照)。別の実施形態では、予防剤もしくは治療剤(たとえば本発明の抗体)または本発明の製剤の徐放または持続放出を達成するために高分子材料を用いることができる(たとえば、Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise編、CRC Pres.、Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall編、Wiley、New York (1984); RangerおよびPeppas、1983、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照;また、Levy他、1985、Science 228:190; During他、1989、Ann. Neurol. 25:351; Howard他、1989、J. Neurosurg. 7 1:105も参照);米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;PCT公報WO99/15154;およびPCT公報WO99/20253号。持続放出製剤中で用いるポリマーの例には、それだけには限定されないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態では、持続放出製剤中で用いるポリマーは、不活性であり、浸出可能な不純物を含まず、保存中に安定しており、無菌であり、生分解性である。さらに別の実施形態では、徐放または持続放出系は、治療標的、すなわち、鼻道または肺の近くに配置することができ、これにより全身性用量の一部のみが必要となる(たとえば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115-138頁 (1984)を参照)。
徐放系は、Langer (1990、Science 249:1527-1533)の総説に記載されている。当業者に知られている任意の技術を用いて、本発明の1つまたは複数の抗体を含む持続放出製剤を生成することができる。たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第4,526,938号、PCT公報WO91/05548号、PCT公報WO96/20698号、Ning他、1996、「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」、Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Song他、1995、「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleek他、1997、「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、およびLam他、1997、「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
具体的な実施形態では、本発明の製剤は、1つ、2つまたはそれ以上の下記の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の製剤は、1つ、2つまたはそれ以上の下記の抗体、および前記抗体以外の予防剤または治療剤を含む。具体的な実施形態では、これらの薬剤は、RSV感染症(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の予防、治療または改善に有用であることが知られている、またはそのために使用されていたもしくは現在使用されている。予防剤または治療剤に加えて、本発明の組成物は担体も含み得る。
本発明の製剤には、単位剤型の製造に用いることができる、薬剤組成物(たとえば、被験体または患者への投与に適した組成物)の製造に有用なバルク薬物組成物が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の組成物は薬剤組成物である。そのような組成物は、予防上または治療上有効な量の1つまたは複数の予防剤または治療剤(たとえば、本発明の抗体または他の予防剤もしくは治療剤)、および製薬上許容される担体を含む。好ましくは、薬剤組成物は、被験体への投与経路に適するように配合する。
具体的な実施形態では、用語「製薬上許容される」とは、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」とは、治療剤を共に投与する希釈剤、アジュバント(たとえばフロイントアジュバント(完全および不完全))、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような製薬担体は、水および油などの滅菌液体であることができ、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれる。薬剤組成物を静脈内投与する場合は水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液ならびにグリセロール溶液も、特に注射用溶液の液体担体として用いることができる。適切な製薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望する場合は、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。経口製剤には、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体が含まれることができる。適切な製薬担体の例は、E.W. Martinの「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、患者へ適切に投与するための形態を提供するために、予防上または治療上有効な量の好ましくは精製した形態の抗体を、適切な量の担体と共に含む。製剤は投与様式に適しているべきである。
好ましい実施形態では、製剤は、人間への静脈内投与に適応した薬剤組成物として、日常的な手順に従って製造する。典型的には、静脈内投与用の組成物は滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合は、組成物は、注射部位での痛みを和らげるために、可溶化剤およびリグノカムネ(lignocamne)などの局所麻酔剤も含み得る。
一般に、本発明の組成物の成分は、たとえば、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性成分の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器中で、単位剤型で個別に供給するか、または一緒に混合して供給する。組成物をインフュージョンによって投与する場合は、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含むインフュージョンボトルを用いて投薬することができる。組成物を注射によって投与する場合は、投与前に成分を混合し得るように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明はまた、製剤が抗体の量を示したアンプルまたはサシェットなどの密閉容器中に梱包されていることも提供する。一実施形態では、抗体を含む本発明の製剤を密閉容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給し、たとえば、被験体に投与するために適切な濃度まで水または生理食塩水で再構成することができる。一実施形態では、抗体を含む本発明の製剤を、少なくとも3mg、より好ましくは少なくとも5mg、少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも30mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも60mg、または少なくとも75mgの単位用量で、密閉容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給する。抗体を含む本発明の凍結乾燥した製剤は2〜8℃で、その最初の容器中に保存すべきであり、抗体は再構成した後、12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与すべきである。代替実施形態では、抗体を含む本発明の製剤は、抗体の量および濃度を示した密閉容器中に液体形態で供給する。好ましくは、抗体を含む本発明の製剤の液体形態は、少なくとも1mg/ml、より好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも3mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも30mg/ml、または少なくとも60mg/mlで、密閉容器中で供給する。
抗体を含む本発明の製剤は、中性または塩の形態で配合することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンと共に形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンと共に形成される塩が含まれる。
上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の治療、予防または改善に有効となる、予防剤もしくは治療剤(たとえば本発明の抗体)、または本発明の組成物の量は、標準の臨床技術によって決定することができる。たとえば、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または1つもしくは複数のその症状の治療、予防または改善に有効となる、予防剤もしくは治療剤、または組成物の用量は、組成物をコットンラットに投与し、105pfuのRSVを用いてコットンラットに免疫誘発を行った後にRSV力価を測定し、そのRSV力価を予防剤もしくは治療剤、または組成物を投与していないコットンラットで得られたRSV力価と比較することによって、決定することができる。したがって、105pfuのRSVを用いて免疫誘発を行ったが予防剤もしくは治療剤、または組成物を投与していないコットンラットと比較して、105pfuのRSVを用いて免疫誘発を行ったコットンラットのRSV力価の2logの低下または99%の低下をもたらす用量が、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を治療、予防または改善させるためにヒトに投与することができる組成物の用量である。
上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状の治療、予防または改善に有効となる組成物の用量は、動物モデル(たとえば、コットンラットまたはサル)に組成物を投与し、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体の血清力価、肺濃度または鼻甲介および/もしくは鼻水中の濃度を測定することによって、決定することができる。したがって、少なくとも1μg/ml、好ましくは2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、少なくとも30μg/ml、少なくとも35μg/ml、少なくとも40μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも75μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも400μg/ml、または少なくとも450μg/mlの血清力価をもたらす抗体または組成物の用量を、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を治療、予防または改善するためにヒトに投与することができる。さらに、最適な用量範囲の同定を支援するために、任意選択でin vitroアッセイを用い得る。
製剤中で用いる正確な用量は、投与経路、ならびに上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎の重篤性にも依存し、従事者の判断およびそれぞれの患者の状況に応じて決定すべきである。有効な用量は、in vitroまたは動物モデル(たとえば、コットンラットまたはカニクイザル)の試験系に由来する用量応答曲線から外挿し得る。
抗体では、患者に投与する用量は、典型的には患者の体重1kgあたり0.1mg〜100mgである。一部の実施形態では、患者に投与する用量は、患者の体重1kgあたり約3mg〜約60mgである。好ましくは、患者に投与する用量は、患者の体重1kgあたり0.1mg〜20mg、より好ましくは患者の体重1kgあたり1mg〜15mgである。一般に、外来ポリペプチドに対する免疫応答が原因で、人体内においてヒト抗体は他の種からの抗体よりも長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体でより低い用量およびより低頻度の投与が可能である。さらに、たとえば脂質化などの修飾によって抗体の取込みおよび組織貫通(たとえば、鼻道および/または肺内)を増強することによって、本発明の抗体の投与の用量および頻度を低下し得る。好ましい実施形態では、投与するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)またはその抗原結合断片の用量は、患者の体重1kgあたり60mg、50mg、40mg、30mg、15mg、10mg、5mg、3mg、または2mgである。
具体的な実施形態では、抗体または抗体を含む組成物を含む本発明の製剤を、RSV季節の直前またはそれ中に月1回投与する。別の実施形態では、本発明の方法に従って生成した抗体、または抗体を含む組成物を含む本発明の製剤を、RSV季節の直前またはそれ中に2カ月毎に投与する。さらに別の実施形態では、抗体、または抗体を含む組成物を、RSV季節の直前またはそれ中に1回投与する。用語「RSV季節」とは、RSV感染が起こる可能性が最も高い季節をいう。典型的には、北半球におけるRSV季節は、11月に始まり4月まで続く。好ましくは、抗体は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のVHおよびVLドメイン(図13)またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態では、約60mg/kg以下、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の本発明の抗体を、RSV季節中5回、4回、3回、2回または1回、被験体、好ましくはヒトに投与する。一部の実施形態では、抗体を、RSV季節中約1〜12回、被験体に投与し、用量は、医師によって決定されるように、必要に応じて、たとえば週1回、週2回、月1回、2カ月毎、3カ月毎などで投与し得る。一部の実施形態では、RSV季節中、より低い用量(たとえば5〜15mg/kg)をより頻繁に(たとえば3〜6回)投与することができる。他の実施形態では、RSV季節中、より高い用量(たとえば30〜60mg/kg)をより低頻度で(たとえば1〜3回)投与することができる。しかし、当業者には明らかなように、他の投薬量およびスケジュールが容易に決定可能であり、本発明の範囲内にある。
一実施形態では、約60mg/kg以下、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の抗体を、RSV季節中、被験体、好ましくはヒトに、月1回で5回筋肉内投与する。別の実施形態では、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の本発明の抗体を、RSV季節中、被験体、好ましくはヒトに、月1回で3回筋肉内投与する。さらに別の実施形態では、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の抗体を、RSV季節中、被験体、好ましくはヒトに、月1回で1〜2回筋肉内投与する。好ましくは、抗体は、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)のVHおよびVLドメイン(図13)またはその抗原結合断片を含む。
具体的な実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を予防、治療または改善させるために、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の持続放出製剤中の抗体を、被験体、好ましくはヒトに投与する。別の具体的な実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を予防、治療または改善させるために、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の持続放出製剤中でないボーラスの本発明の抗体を、被験体、好ましくはヒトに投与し、一定期間後、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の持続放出中の本発明を、前記被験体に、RSV季節中2回、3回または4回筋肉内投与する。本実施形態に従って、一定期間は1〜5日間、1週間、2週間、または1カ月であることができる。別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を予防、治療または改善させるために、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の持続放出製剤中の抗体を、被験体、好ましくはヒトに、RSV季節中2回、3回または4回筋肉内投与する。好ましくは、抗体はA4B4L1FR-S28またはその抗原結合断片である。
別の実施形態では、上気道および/もしくは下気道RSV感染症、中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)または1つもしくは複数のその症状を予防、治療または改善させるために、約60mg/kg、約45mg/kg以下、約30mg/kg以下、約15mg/kg以下、約10mg/kg以下、約5mg/kg以下、約3mg/kg以下、約2mg/kg以下、または約1.5mg/kg以下の本発明の1つまたは複数の抗体を、被験体に鼻腔内投与する。好ましくは、抗体はA4B4L1FR-S28またはその抗原結合断片である。好ましくは、抗体はA4B4L1FR-S28またはその抗原結合断片である。
一実施形態では、単一用量の抗体(好ましくはモタビツマブ)を含む本発明の製剤を患者(好ましくはヒト)に投与し、用量は、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、または約75mg/kgからなる群から選択される。
一部の実施形態では、単一用量の抗体(好ましくはモタビツマブ)を含む本発明の製剤を患者(好ましくはヒト)に、1年間の間に(あるいはRSV季節の間に)2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、21回、22回、23回、24回、25回、または26回、2週間(たとえば約14日間)毎の間隔で投与し、用量は、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、またはそれらの組合せからなる群から選択される(すなわち、それぞれの用量月1回の用量は同じであっても同じでなくてもよい)。
別の実施形態では、単一用量の抗体(好ましくはモタビツマブ)を含む本発明の製剤を患者(好ましくはヒト)に、1年間の間に(あるいはRSV季節の間に)2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、または12回、ほぼ月1回(たとえば約30日間)の間隔で投与し、用量は、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、またはそれらの組合せからなる群から選択される(すなわち、それぞれの用量月1回の用量は同じであっても同じでなくてもよい)。
一実施形態では、単一用量の抗体(好ましくはモタビツマブ)を含む本発明の製剤を患者(好ましくはヒト)に、1年間の間に(あるいはRSV季節の間に)2回、3回、4回、5回、または6回、ほぼ2カ月(たとえば約60日間)毎の間隔で投与し、用量は、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、またはそれらの組合せからなる群から選択される(すなわち、それぞれの2カ月毎の用量は同じであっても同じでなくてもよい)。
一部の実施形態では、単一用量の抗体(好ましくはモタビツマブ)を含む本発明の製剤を患者(好ましくはヒト)に、1年間の間に(あるいはRSV季節の間に)2回、3回、または4回、ほぼ3カ月(たとえば約120日間)毎の間隔で投与し、用量は、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、またはそれらの組合せからなる群から選択される(すなわち、それぞれの3カ月毎の用量は同じであっても同じでなくてもよい)。
特定の実施形態では、抗体を含む本発明の製剤の用量の患者への投与経路は、筋肉内、静脈内、またはそれらの組合せである(すなわち、それぞれの用量は、同じ投与経路によって投与してもしなくてもよい)。一部の実施形態では、本発明の抗体は、同一または異なる本発明の抗体の他の用量と同時にまたは連続的に、複数の投与経路によって投与し得る。
5.7生物活性
抗体を含む本発明の製剤は、様々な方法で特徴づけ得る。具体的には、抗体を、RSV抗原に免疫特異的に結合する能力についてアッセイし得る。そのようなアッセイは、溶液中(たとえば、Houghten、1992、Bio/Techniques 13:412-421)、ビーズ上(Lam、1991、Nature 354:82-84)、チップ上(Fodor、1993、Nature 364:555-556)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号;第5,403,484号;および第5,223,409号)、プラスミド上(Cull他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ上(ScottおよびSmith、1990、Science 249:386-390; Devlin、1990、Science 249:404-406; Cwirla他、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382;ならびにFelici、1991、J. Mol. Biol. 222:301-310)で行い得る(これらの参考文献のそれぞれはその全体で参考として本明細書中に組み込まれている)。その後、RSV抗原に免疫特異的に結合すると同定された抗体(たとえばRSV F抗原)を、RSV抗原に対するその特異性および親和性についてアッセイすることができる。
抗体を含む本発明の製剤は、当分野で知られている任意の方法によって、RSV抗原との免疫特異的結合および他の抗原との交差反応性についてアッセイし得る。免疫特異的結合および交差反応性を分析するために用いることができる免疫アッセイには、いくつか挙げると、それだけには限定されないが、ウエスタンブロットなどの技術を用いた競合的および非競合的アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質A免疫アッセイが含まれる。そのようなアッセイは日常的であり、当分野で周知である(たとえば、その全体が参考として本明細書中に組み込まれているAusubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkを参照)。例示的な免疫アッセイを以下に手短に記載する(しかし、限定することを意図しない)。
免疫沈降のプロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤(たとえば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を添加したRIPA緩衝液(1%のNP-40またはTriton X-100、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、0.15MのNaCl、0.01Mのリン酸ナトリウム、pH7.2、1%のトラジロール(Trasylol))などの溶解緩衝液に細胞の集団を溶解すること、目的の抗体を細胞溶解液に加えること、一定期間(たとえば1〜4時間)、40℃でインキュベーションすること、タンパク質Aおよび/またはタンパク質Gセファロースビーズを細胞溶解液に加えること、約1時間以上、40℃でインキュベーションすること、ビーズを溶解緩衝液で洗浄すること、ならびにビーズをSDS/試料緩衝液に再懸濁させることを含む。特定の抗原を免疫沈殿させる目的の抗体の能力は、たとえば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体と抗原との結合を増加させ、バックグラウンドを低下させるために改変することができるパラメータに関する知識を有するであろう(たとえば、セファロースビーズを用いて細胞溶解液を事前に清澄にすること)。免疫沈降のプロトコルに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New York、10.16.1を参照されたい。
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を製造すること、ポリアクリルアミドゲル(たとえば、抗原の分子量に応じて8%〜20%のSDS-PAGE)中でタンパク質試料の電気泳動を行うこと、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDFまたはナイロンなどの膜に移すこと、膜を遮断溶液(たとえば、3%のBSAまたは無脂肪乳を含むPBS)中でインキュベーションすること、膜を洗浄緩衝液(たとえばPBS-Tween20)で洗浄すること、膜を遮断緩衝液で希釈した一次抗体(目的の抗体)と共にインキュベーションすること、膜を洗浄緩衝液で洗浄すること、膜を、遮断緩衝液で希釈した、酵素基質(たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(たとえば、32Pもしくは125I)とコンジュゲートした二次抗体(一次抗体を認識する抗体、たとえば抗ヒト抗体)と共にインキュベーションすること、膜を洗浄バッファーで洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを減少させるために改変することができるパラメータに関する知識を有するであろう。ウエスタンブロットのプロトコルに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New York、10.8.1を参照されたい。
ELISAは、抗原を製造すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすること、酵素基質(たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物とコンジュゲートした目的の抗体をウェルに加えて一定期間インキュベーションすること、および抗原の存在を検出することを含む。ELISAでは、目的の抗体は検出可能な化合物とコンジュゲートしていなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物とコンジュゲートした(目的の抗体を認識する)第2の抗体をウェルに加え得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングし得る。この場合、検出可能な化合物とコンジュゲートした第2の抗体は、コーティングしたウェルに目的の抗原を加えた後に加え得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために改変することができるパラメータ、および当分野で知られているELISAの他の変形に関する知識を有するであろう。ELISAに関するさらなる記述には、たとえば、Ausubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New York、11.2.1を参照されたい。
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体-抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増する量の未標識の抗原の存在下で標識した抗原(たとえば、3Hまたは125I)を目的の抗体と共にインキュベーションすること、および標識した抗原に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。RSV抗原に対する本発明の抗体の親和性および結合の解離速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定することができる。第2の抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合、漸増する量の未標識の第2の抗体の存在下で、RSV抗原を標識した化合物(たとえば、3Hまたは125I)とコンジュゲートした本発明の抗体と共にインキュベーションする。
好ましい実施形態では、BIAcore動力学的分析を用いて、抗体とRSV抗原との結合の会合速度および解離速度を決定する。BIAcore動力学的分析は、その表面上に固定された抗体を有するチップからのRSV抗原の結合および解離を分析することを含む。
抗体を含む本発明の製剤は、当業者に知られている技術を用いて、RSVがその宿主細胞受容体に結合することを阻害するその能力についてアッセイすることもできる。たとえば、RSVに対する受容体を発現する細胞を、抗体を存在させてまたは存在させずにRSVと接触させることができ、抗体がRSVの結合を阻害する能力を、たとえば、フローサイトメトリーもしくはシンチレーションアッセイによって測定することができる。RSVとその宿主細胞受容体との相互作用の検出を可能にするために、RSV(たとえば、F糖タンパク質もしくはG糖タンパク質などのRSV抗原)または抗体を、放射性標識(たとえば、32P、35S、および125I)または蛍光標識(たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒドおよびフルオレスカミン)などの検出可能な化合物で標識することができる。あるいは、RSVがその受容体に結合することを阻害する抗体の能力は、細胞を含まないアッセイで決定することができる。たとえば、RSVまたはG糖タンパク質などのRSV抗原を抗体と接触させることができ、RSVまたはRSV抗原がその宿主細胞受容体に結合することを阻害する抗体の能力を決定することができる。好ましくは、抗体を固体担体上に固定し、RSVまたはRSV抗原を検出可能な化合物で標識する。あるいは、RSVまたはRSV抗原を固体担体上に固定し、抗体を検出可能な化合物で標識する。RSVまたはRSV抗原は、部分的にもしくは完全に精製されているか(たとえば、他のポリペプチドを部分的にもしくは完全に含まない)、または細胞溶解液の一部であってよい。さらに、RSV抗原は、RSV抗原およびグルタチオニンSトランスフェラーゼなどのドメインを含む融合タンパク質であり得る。あるいは、当業者に周知の技術(たとえば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals;Rockford, IL)を用いてRSV抗原をビオチン標識することができる。
抗体を含む本発明の製剤は、当業者に知られている技術を用いて、RSV複製を阻害またはダウンレギュレーションするその能力についてアッセイすることもできる。たとえば、RSV複製は、たとえば、Johnson他、1997、Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224に記載のものなどの溶菌斑アッセイによってアッセイすることができる。本発明の抗体は、RSVポリペプチドの発現を阻害またはダウンレギュレーションするその能力についてアッセイすることもできる。それだけには限定されないが、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、およびRT-PCRを含めた当業者に知られている技術を用いて、RSVポリペプチドの発現を測定することができる。さらに、本発明の抗体は、合胞体の形成を妨げるその能力についてアッセイすることができる。
抗体を含む本発明の製剤は、ヒトで使用する前に、所望の治療活性または予防活性について、好ましくはin vitroで、次いでin vivoで試験する。たとえば、本発明の特定の抗体または組成物の投与が示されるかどうかを決定するために用いることができるin vitroアッセイには、被験体の組織試料を培養中で増殖させ、本発明の抗体または組成物に曝すまたは他の方法で投与し、組織試料に対するそのような本発明の抗体または組成物の効果を観察する、in vitro細胞培養アッセイが含まれる。様々な具体的な実施形態では、RSV感染症に関与する細胞種の代表的な細胞(たとえば気道上皮細胞)でin vitroアッセイを実施して、本発明の抗体または組成物がそのような細胞種に対して所望の効果を有するかどうかを決定することができる。好ましくは、本発明の抗体または組成物は、ヒトに投与する前にin vitroアッセイおよび動物モデル系でも試験する。具体的な実施形態では、コットンラットに本発明の抗体、または本発明の組成物を投与し、105pfuのRSVを用いて免疫誘発を行い、4日以上後にラットを屠殺してRSV力価および抗RSV抗体血清力価を決定する。さらに、本実施形態に従って、屠殺したラットの組織(たとえば肺組織)を、組織学的な変化に関して検査することができる。
本発明に従って、本発明の抗体の予防上および/または治療上の有効性を実証するためにヒト被験体での臨床治験を行う必要はない。抗体を用いたin vitroおよび動物モデルの研究をヒトに外挿することができ、これが前記抗体の予防的および/または治療的有用性を実証するために十分である。
治療で用いるための本発明の抗体または組成物を含む本発明の製剤は、それだけには限定されないが、ラット、マウス、ウシ、サル、およびウサギを含めた適切な動物モデル系において、その毒性について試験することができる。抗体または組成物の毒性のin vivo試験には、当分野で知られている任意の動物モデル系を用い得る。
上気道および/または下気道RSV感染症の治療または予防における有効性は、本発明の抗体または組成物の、ウイルスの複製を阻害する能力、感染を阻害するもしくはウイルスがその宿主内で自体を確立することを防ぐ能力、上気道および/もしくは下気道RSV感染症の発生率を低下する能力、上気道RSV感染症から下気道RSV感染症への進行を予防もしくは軽減する能力、または上気道および/もしくは下気道RSV感染症に関連する1つもしくは複数の症状を予防、改善もしくは緩和させる能力を決定することによって実証し得る。中耳炎の治療または予防における有効性は、本発明の抗体または組成物の、発生率または中耳炎を低下する能力、中耳炎の継続期間を縮小する能力、上気道および/もしくは下気道RSV感染症から中耳炎への進行を予防もしくは軽減する能力、または中耳炎の1つもしくは複数の症状を改善させる能力を決定することによって実証し得る。本発明の抗体または組成物を投与した後に、たとえば、ウイルス量の減少、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎の1つまたは複数の症状、あるいはそれらに関連する呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RADまたはそれらの組合せを含む)の改善、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎の継続期間の縮小、下気道RSV感染症の軽減、あるいは死亡率および/または罹患率の低下が存在する場合に、治療は治療的と見なされる。さらに、1つまたは複数のRSV抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を投与した後に免疫応答が増加した場合に、治療は治療的と見なされる。
本発明の抗体または組成物を含む本発明の製剤は、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12およびIL-15などのサイトカインの発現を誘発する能力について、in vitroおよびin vivoで試験することができる。当業者に知られている技術を用いてサイトカインの発現レベルを測定することができる。たとえば、サイトカインの発現レベルは、たとえばRT-PCRおよびノーザンブロット分析によってサイトカインのRNAのレベルを分析することによって、ならびに、たとえば免疫沈降、次いでウエスタンブロット分析およびELISAによってサイトカインのレベルを分析することによって、測定することができる。好ましい実施形態では、本発明の抗体または組成物は、IFN-γの発現を誘発するその能力について試験する。
本発明の抗体または組成物を含む本発明の製剤は、免疫細胞、好ましくはヒト免疫細胞(たとえば、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)の生物活性を調節するその能力について、in vitroおよびin vivoで試験することができる。免疫細胞の生物活性を調節する本発明の抗体または組成物の能力は、抗原の発現を検出すること、免疫細胞の増殖を検出すること、シグナル伝達分子の活性化を検出すること、免疫細胞のエフェクター機能を検出すること、または免疫細胞の分化を検出することによって、評価することができる。当業者に知られている技術を用いてこれらの活性を測定することができる。たとえば、細胞増殖は、3Hチミジン取込みアッセイおよびトリパンブルー細胞計数によってアッセイすることができる。抗原発現は、たとえば、それだけには限定されないが、ウエスタンブロットなどの技術を用いた競合的および非競合的アッセイ系、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質A免疫アッセイおよびFACS分析を含めた免疫アッセイによってアッセイすることができる。シグナル伝達分子の活性化は、たとえば、キナーゼアッセイおよび電気泳動シフトアッセイ(EMSA)によってアッセイすることができる。
本発明の抗体または組成物を含む本発明の製剤は、ウイルス複製を阻害するまたはウイルス量を減少させるその能力について、in vitro、ex vitroおよびin vivoアッセイで試験することもできる。本発明の抗体または組成物は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の経時変化を減少するその能力について試験することもできる。本発明の抗体または組成物は、RSV感染症(好ましくは、上気道および/または下気道RSV感染症)に罹患しているヒトの生存期間を少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%増加させるその能力について試験することもできる。さらに、本発明の抗体または組成物は、RSV感染症(好ましくは、上気道および/または下気道RSV感染症)に罹患しているヒトの入院期間を少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%縮小するその能力について試験することができる。当業者に知られている技術を用いて、本発明の抗体または組成物の機能をin vivoで分析することができる。
5.8RSV感染症を検出するための抗体の診断使用
RSV抗原に免疫特異的に結合する標識した抗体ならびにその誘導体および類似体は、上気道および/もしくは下気道RSV感染症または中耳炎(好ましくは、上気道および/もしくは下気道RSV感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)を検出、診断、または監視するための診断目的に用いることができる。本発明は、(a)RSV抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を用いて、被験体の細胞または組織試料中のRSV抗原の発現をアッセイすること;ならびに(b)RSV抗原のレベルを、対照レベル、たとえば、RSVに感染していない正常組織試料中のレベルと比較し、RSV抗原の対照レベルと比較したRSV抗原のアッセイしたレベルの増加は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の指標であることを含む、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の検出を提供する。
本発明は、(a)RSV抗原に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を用いて、個体の細胞または組織試料中のRSV抗原のレベルをアッセイすること;ならびに(b)RSV抗原のレベルを、対照レベル、たとえば、RSVに感染していない正常組織試料中のレベルと比較し、RSV抗原の対照レベルと比較したRSV抗原のアッセイしたレベルの増加は、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の指標であることを含む、RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)を診断するための診断的アッセイを提供する。RSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)のより決定的な診断により、医療従事者が予防的手段または攻撃的治療をより早期に用いることが可能となり、したがって、RSV感染症または中耳炎の発生またはさらなる進行が予防され得る。
本発明の抗体は、本明細書中に記載または当業者に知られているように、古典的な免疫組織学的方法を用いて生体試料中のRSV抗原レベルをアッセイするために用いることができる(たとえば、Jalkanen他、1985、J. Cell. Biol. 101:976-985;およびJalkanen他、1987、J. Cell . Biol. 105:3087-3096を参照)。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの免疫アッセイおよびラジオイムノアッセイ(RIA)が含まれる。適切な抗体アッセイ標識は当分野で知られており、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識;ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121In)、およびテクネチウム(99Tc)などの放射性同位体;ルミノールなどの発光性標識;フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。
本発明の一態様は、ヒトにおけるRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)の検出および診断である。一実施形態では、診断は、a)被験体に、RSV抗原に免疫特異的に結合する標識した抗体を有効量で投与すること(たとえば、非経口、皮下、または腹腔内);b)標識した抗体が、RSV抗原が発現される被験体中の部位(たとえば、鼻道、肺、口および耳)で優先的に濃縮される(および未結合の標識した分子がバックグラウンドレベルまで除去される)ことを可能にするために、投与後に一定の時間間隔待つこと;c)バックグラウンドレベルを決定すること;ならびにd)バックグラウンドレベルを超える標識した抗体の検出が、被験体がRSV感染症(すなわち上気道および/もしくは下気道RSV感染症)、中耳炎(好ましくは上気道および/もしくは下気道感染症などのRSV感染症から派生する、それによって引き起こされる、もしくはそれに関連する中耳炎)、またはそれに関連する症状もしくは呼吸器の状態(それだけには限定されないが、喘息、喘鳴、RAD、もしくはそれらの組合せを含む)に罹患していることを示すように、被験体において標識した抗体を検出することを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識した分子の量を、特定の系について事前に決定した標準の値と比較することを含めた、様々な方法によって決定することができる。
対象の大きさおよび用いるイメージング系により診断イメージを生成するのに必要なイメージング部分の量が決定されることは、当分野で理解されるであろう。放射性同位体部分の場合は、ヒト被験体では、注射する放射活性の量の範囲は、通常約5〜20ミリキュリーの99Tcである。その後、標識した抗体は、特異的なタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。in vivo腫瘍イメージングは、S.W. Burchiel他、「Immunopharmacokinetics or Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」 (第13章、Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer、S.W. BurchielおよびB.A. Rhodes編、Masson Publishing Inc. (1982)に記載されている。
用いる標識の種類および投与様式を含めたいくつかの変数に応じて、標識した抗体が被験体中の部位で優先的に濃縮され、未結合の標識した抗体がバックグラウンドレベルまで除去されることを可能にするための、投与後の時間間隔は、6〜48時間または6〜24時間または6〜12時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は5〜20日間または5〜10日間である。
一実施形態では、上気道および/または下気道RSV感染症の監視は、上気道および/または下気道RSV感染症を診断する方法を、たとえば、最初の診断の1カ月後、最初の診断の6カ月後、最初の診断の1年後に繰り返すことによって実施する。
標識した分子の存在は、被験体中で、当分野で知られているin vivoスキャンの方法を用いて検出することができる。これらの方法は、用いる標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定できるであろう。本発明の診断方法で用い得る方法および装置には、それだけには限定されないが、コンピュータ断層撮影(CT)、位置放射断層撮影(PET)などの全身スキャン、磁気共鳴画像法(MRI)、および超音波検査が含まれる。
具体的な実施形態では、分子は放射性同位体で標識し、放射線照射応答性外科用機器を用いて患者において検出する(Thurston他、米国特許第5,441,050号)。別の実施形態では、分子は蛍光化合物で標識し、蛍光応答性スキャン機器を用いて患者において検出する。別の実施形態では、分子は陽電子放出金属で標識し、陽電子放射断層撮影を用いて患者において検出する。さらに別の実施形態では、分子は常磁性標識で標識し、磁気共鳴画像法(MRI)を用いて患者において検出する。
5.9キット
本発明はまた、本発明の薬剤製剤の成分の1つまたは複数で満たした1つまたは複数の容器を含む、製薬パックまたはキットも提供する。任意選択で、このような容器(または複数の容器)に、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の注意書を添付することができ、この注意書は、ヒト投与のための製造、使用または販売に関する機関の認可を反映する。
本発明は、上記方法で用いることができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、本発明の抗体、好ましくは精製抗体を、1つまたは複数の容器中に含む。具体的な実施形態では、本発明のキットは、実質的に単離したRSV抗原を対照として含む。好ましくは、本発明のキットは、RSV抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。別の具体的な実施形態では、本発明のキットは、抗体とRSV抗原との結合を検出する手段を含む(たとえば、抗体は蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光性化合物などの検出可能な基質とコンジュゲートしていてもよく、または第1の抗体を認識する第2の抗体が検出可能な基質とコンジュゲートしていてもよい)。具体的な実施形態では、キットは、組換えによって製造したまたは化学合成したRSV抗原を含み得る。また、キット中に提供するRSV抗原は、固体担体に付着していてもよい。より具体的な実施形態では、上述のキットの検出手段には、RSV抗原が付着している固体担体が含まれる。このようなキットには、付着していない、レポーターで標識した抗ヒト抗体も含まれていてよい。この実施形態では、抗体とRSV抗原との結合は、前記レポーターで標識した抗体の結合によって検出することができる。
6. 実施例
以下の実施例は本発明を例示するために提供し、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
＜実施例１＞
6.1 抗体の断片化および凝集のための抗体製剤の特徴づけ
本実施例は、抗体の断片化および凝集のための抗体製剤の特徴づけを例示する。抗体A4B4L1FR-S28Rを本実施例で用いる。上記の節で記載したように、抗体A4B4L1FR-S28Rとは、RSVの融合(F)タンパク質のA抗原部位中のエピトープに特異的に結合する、組換えDNA技術によって生成したIgG1モノクローナル抗体である。A4B4L1FR-S28Rはヒト化抗体であり、標的抗原に特異的なCDR領域ならびにヒトγ1重鎖およびκ軽鎖の定常領域からなる。このモノクローナル抗体は、重鎖と軽鎖とを連結する2つの鎖間ジスルフィド結合を有し、ヒンジ領域で別の2つの鎖間ジスルフィド結合を有する。別段に指定しない限りは、本実施例中のすべての抗体試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中、100mg/mlの濃度で配合した。さらなる保存条件は、実験結果を記載したセクションに報告されている。
材料および方法
サイズ排除クロモトグラフィー(SEC)
抗体の凝集体および断片の存在について抗体製剤を分析するために、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。試験試料をサイズ排除G3000SWXLカラム(5μm、300Å、7.8×300mm、TosoHaas)上に注入した。移動相は0.1Mのジ-リン酸ナトリウム、0.1Mの硫酸ナトリウムおよび0.05%のアジ化ナトリウム(pH6.7)であり、0.25〜1.0mL/分の流速で、定組成で流した。溶出されたタンパク質を280nmでのUV吸光度によって検出し、さらなる特徴づけのために採取した。検出された任意のタンパク質種の相対量を、最初に含めた体積ピークを排除した検出された他のすべてのピークの合計面積と比較した、生成物のピークの面積%として報告した。抗体単量体のピークよりも早く溶出されたピークは凝集体の百分率に記録し、抗体単量体のピークよりも遅いが緩衝液のピークよりも早く溶出されたピークは断片の百分率に記録した。個々のピークの水力学的半径および分子量は、結合多角度光散乱検出器を用いて得た。
分析用超遠心(AUC)
抗体製剤を特徴づけるために分析用超遠心(AUC)も用いた。AUCは、液体試料中の巨大分子の沈降係数(Svedbergに報告されている、S)を決定する、直交性の技術である。SECと同様、AUCは抗体の断片/凝集体を単量体から分離して検出することができ、さらに分子質量の情報も提供することができる。SECと比較して、AUCでは固相の相互作用による凝集体の損失の可能性が排除され、所与の巨大分子の異なる種をより良好に分離することができる。
Beckman Optima XL-A分析用超遠心機を用いて沈降速度実験を行った。試験試料を、標準緩衝液(20mMのクエン酸、100mMのNaCl、1.5%のマンニトール、50μMのジエチレントリアミン五酢酸、0.02%のポリソルベート80(Polysorbate 80)、pH6.0)で0.5mg/mlの抗体濃度まで希釈した。415μlの希釈した抗体試料および412μlまたは標準緩衝液を、それぞれ試料および参照チャネル中の12mmの遠心分離細胞に負荷した。負荷した細胞をAN-50Ti分析用ローターに入れ、25℃まで平衡化した。試料は、280nm、42000rpmのローター速度で、完全真空でスキャンした。それぞれの細胞について合計80回のスキャンを分析用に収集した。メニスカスによって生じる偽信号を避けるために、それぞれの試料の最初のスキャンは排除した。
N.I.H.のPeter Shuckによって開発されたc(s)方法およびc(s)を実行するSEDFIT(バージョン8.8)プログラムを用いてデータを分析した。c(s)方法を用いて、沈降係数の分布を導き出すために生のデータスキャンをSのラム(Lamm)関数に直接当てはめた。当てはめの手順に用いたパラメータは、解像度400;信頼区間0.75;グリッドサイズ1000;部分比体積0.7245;緩衝液密度、1.000;および緩衝液粘度0.1002であった。摩擦比、メニスカスおよび底部位置は近似パラメータとして設定した。時間に依存しないノイズも近似した。検出されたピークを積分し、以下のように分類した:0〜6Sは断片;6〜9Sは単量体;9〜20Sは凝集体。
濁度の測定
抗体製剤中のタンパク質凝集は、濁度の測定によっても特徴づけた。濁度は溶液中の粒子が光を散乱させる量の測定値であり、したがって、タンパク質の凝集または変性の一般的な指示薬として用い得る。
約3〜4mlの製剤試料をガラス試験管に移し、インラインの真空システムを用いて2分間脱気した。その後、分析のために脱気した試料を室温で濁度計(2100ANまたは2100N、Hatch)の試料区画中に入れた。濁度計は40、200、1000STABLCAL(登録商標)の安定したフォルマジン(Formazin)濁度標準(Hatch)および4000NTU(比濁分析濁度ユニット)を用いて較正し、3、6、18、30のフォルマジンおよび60NTUの対照懸濁液を分析することによって確認した。
結果
SECを用いて、3つの温度範囲で9カ月に渡って保存したA4B4L1FR-S28Rの製剤における抗体の凝集体および断片の形成を監視した。提案した保存温度である2〜8℃を超える温度範囲を用いて製剤にストレスを与え、これが長期保存の効果を刺激することが期待された。図6A、BおよびCは、2〜8℃、20〜24℃および38〜42℃で保存した単一のモタビツマブの製剤の、単量体(純度)、凝集体および断片の相対的な割合をそれぞれ表す。断片化および凝集の相対的な割合は時間および温度のどちらにも伴って増加した。しかし、単一の温度範囲では、断片化および凝集率はどちらも一定であった。この知見により、より高い保存温度によって加速されたタイムスケールが正確に刺激されることが証明された。
断片化/凝集の推定率の対数も、保存温度の逆数に一次従属性を示した(図7)。この直線性が確立された後は、任意の温度での所与の製剤の凝集/断片化率、または、より重要なことに、そのような温度における任意の時点での製剤の特徴を予測することが可能となる。
図8は、38〜42℃、70〜80%の相対湿度で1カ月間保存した後の、抗体製剤の代表的なSECプロフィールを表す。これらの条件下では、SECは、抗体の凝集体および断片を単量体から明確に分離することができた。しかし、凝集体/断片の相対レベルが低い場合は、図8で凝集体および断片Iとして同定されたピークは明確性が低下し始め、単量体のピークの肩に合流する。このような肩は正確に分析することができない。
代替方法として、抗体製剤中の凝集および断片化の低い相対レベルを特徴づけるための方法として、AUCを調査した。図9および表7は、初期、9カ月および14カ月の時点での製剤試料のAUCおよびSEC分析を比較する(9カ月および14カ月の試料は、38〜42℃、70〜80%の相対湿度で保存した)。AUCでは、約50KDaおよび約90KDaで2つの主要な断片化ピークが同定された。AUCはまた断片化および凝集のピークを分離する能力が高かった。9カ月の試料では、SECは大きな断片のピークを分離することができなかったが、AUCは明らかに分解することができた。14カ月の試料では、SECでの大きな断片のピークは単量体ピークの肩として観察され、積分後、AUCによって決定されたものよりも高い断片Iの%がもたらされた。AUCおよびSECの凝集体値は匹敵していた。AUCの凝集体のピークの分子質量の推定により、凝集体の大多数が抗体の二量体であったことが示された。
SECと比較して、AUCはまた、所与の巨大分子の異なる種を分解する能力も高い。しかし、AUCのノイズ/シグナル比は試料中の抗体の濃度に依存するので、最初に適切な試料希釈率を確立することが必要である(図10)。A4B4L1FR-S28Rの記載した製剤では(25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中に100mg/ml)、200倍希釈を用い、0.5mg/mlの試料抗体濃度がもたらされた。これらの条件下では、AUCは、38〜42℃、70〜80%の相対湿度での5日間の保存に渡って観察された製剤の組成のわずかな変化を分離することができた(図11)。
Figure 2008546805
タンパク質凝集の一般的な指示薬として、濁度の変化についても抗体製剤を監視し得る。約100mg/mlの濃度で抗体を含む製剤の4つのロットを、38〜42℃で1カ月間保存した後、HACH濁度計を用いて濁度を測定した(表8)。結果は、製剤の異なるロットの濁度レベルは匹敵する濁度測定値、匹敵するNTUを有することを示しているが、1つのロットが高い測定値を示していた。高い濁度は、より高レベルの凝集または粒子の数の増加/大きさの増大を示し得る。
Figure 2008546805
＜実施例２＞
6.2 抗体断片の特徴づけおよび製剤の粒子径分布
本実施例は、AUCまたはSECによって同定される抗体断片の特徴づけを例示する。抗体A4B4L1FR-S28Rを本実施例で用いる。別段に指定しない限りは、本実施例中のすべての抗体試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中、100mg/mlの濃度で配合した。さらなる保存条件は、実験結果を記載したセクションに報告されている。
材料および方法
液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)
SECの断片のピークを採取し、PNGase Fとしても知られるN-グリコシダーゼFを用いて、37℃で終夜消化した。PNGase Fは、N結合糖タンパク質の高マンノース、ハイブリッドおよび複合オリゴ糖の最内側のGlcNAcとアスパラギン残基との間を切断するアミダーゼである。脱グリコシル化された試料(約7.5μL)を約42.5μLの還元緩衝液(2.5mg/mLのDTT、6.0MのグアニンジンHCl、pH8.2)と混合し、水浴中、56℃で60分間保った。その後、無水4-ビニルピリジン(Aldrich Chem. Co.、WI)(約0.5μL)を試料に加え、反応混合物を周囲温度で30分間保った。脱グリコシル化、還元およびアルキル化された試料をすぐに逆相カラムに載せて、修飾された試料を反応物質から分離し、LC-ESI-MSによって分析した。
二成分勾配HPLC系(Agilent1100)で、逆相カラム(Jupiter 5μmのC4、300Å、250×2.00mm、Phenomenex)を用いて、脱グリコシル化、還元、およびアルキル化された試料を分画した。移動相Aは、0.1%のトリフルオロ酢酸を含む水中の30%のアセトニトリルからなり、移動相Bは、0.1%のトリフルオロ酢酸を含む水中の50%のアセトニトリルからなっていた。試料は、水中に30〜50%のアセトニトリルの直線勾配を用いて、16分間に渡って、200μL/分の流速で分離した。カラム溶出液をUV検出器に供し、その後、1:1に分割し、半量の一方をイオントラップ質量分析装置(LTQ、ThermoElectro、San Jose, CA)のスイッチ弁に送り、残りの半分を廃棄した。スイッチ弁は、クロマトグラフィー実行の15〜30分の部分の間にのみ、カラム溶出液流を質量分析装置に送った。
カフェイン、酢酸L-メチオニル-アルギニル-フェニルアラニル-アラニン・H2O、およびウルトラマーク(Ultramark)1621の混合物を用いて、製造者の指示に従ってイオントラップ質量分析装置の較正を行った。ESI-MSデータは陽性ESIフルスキャンモードで得た。BioWorkの逆重畳プログラム(ThermoFinnigan)を用いて、その最初の質量スペクトルからペプチド/タンパク質の質量スペクトルを再構築し、分子質量を得た。
ジスルフィド結合の測定
抗体の試験試料を、10mMのリン酸緩衝液、250mMのNaCl、5mMのNEM、6Mのグアニジン、pH7.0中、37℃で1〜3時間変性させた。その後、変性した試料を、100mMのリン酸緩衝液、0.1mMのEDTA、pH7.0で6倍希釈し、これに、Lys-Cを1:10の酵素:タンパク質の比で加えた。反応混合物を37℃で16〜24時間インキュベーションした。5〜10μLの100mMのDTTを加え、37℃で1時間インキュベーションすることによって、反応混合物の半分を還元した。
逆相HPLC(Phenomenex Jupiter 5m C18カラム;250×2.1mm)によってLys-C消化物を分離し、UV-検出器およびオンラインLCQまたはLTQイオントラップ質量分析装置(ThermoElectron)によって分析した。RP-HPLCの移動相AはH2O中の0.1%のTFAであり、移動相Bはアセトニトリル中の0.1%のTFAであった。ペプチドは0.2mL/分の流速で、以下の勾配を用いて溶出させた:
0〜2分、5%の移動相B
2〜32分、5〜20%の移動相B
32〜132分、20〜40%の移動相B
132〜152分、40〜60%の移動相B
152〜155分、60〜95%の移動相B
LCQ源の塩汚染を避けるために、最初の15分間は、カラムの溶出液をUV検出器後に直接廃棄に送った。
粒子の計数
溶液中の粒子の数および大きさは、Beckman Coulter Multisizer 3によって特徴づけた。
結果
SECによって同定された凝集体および断片を特徴づけるために、SECクロマトグラフィー系から断片画分を採取し、LC-MSによって分析した(抗体断片Iおよび抗体断片II、それぞれ図12および13)。LC-MSの検出限界を超える優勢な断片を、両断片ピーク(抗体I型断片および抗体II型断片)について同定した(図14および表9)。抗体I型および抗体II型断片は、重鎖の抗体のヒンジ領域の1つでの切断によって生じていた。観察された切断部位は、セリン222とシステイン223との間、システイン223とアスパラギン酸224との間、アスパラギン酸224とリシン225との間、リシン225とスレオニン226との間、スレオニン226とヒスチジン227との間、ヒスチジン227とスレオニン228との間、およびスレオニン228とシステイン229との間であった。
LC-MS/MSの還元および非還元条件を用いたペプチドマップの比較も、モノクローナル抗体中のジスルフィド結合スクランブリングまたは他の共有結合性の修飾を検出するために用いた。凝集体、単量体および断片のプロフィールの比較により、凝集体中に低レベルのジスルフィド結合スクランブリングのみが存在したことが示される(図15および16)。また、結果は、単量体と比較して有意なプロフィールの変化は観察されなかったことから、凝集体のほとんどが非共有結合した凝集体であったことも示唆している。
Figure 2008546805
抗体製剤の粒子径分布を特徴づけるためにマルチサイザーも用いた。100mg/mlの製剤の試験試料をBeckman Coulter Multisizer 3で分析した(表10)。
Figure 2008546805
6.3 BIACORE(商標)によるA4B4L1FR-S28Rの結合の動力学的分析
A4B4L1FR-S28RおよびパリビツマブとRSV Fタンパク質との相互作用の動力学は、BIAcore3000機器(BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ)を用いた表面プラズモン共鳴によって決定した(たとえば、Jonsson他、1991、Biotechniques 11(5):620-627およびJohne, B. (1989). Epitope mapping by surface plasmon resonance in the BIAcore. Molecular Biotechnology 9(1):65-71を参照)。組換えによって製造したC末端が切断されたRSV(A2株)のFタンパク質(Wathen他、1989、J Infect Dis 159(2):255-264)を、これらの研究の抗原として用いた。膜アンカーを欠く切断されたFタンパク質は、組換えバキュロウイルス発現系を用いた分泌産物として産生され、続くコンカナバリンAおよびQ-セファロースカラムによるクロマトグラフィーステップによって精製した。精製したFタンパク質は、製造者のプロトコルに従って、共有結合によって、N-ヒドロキシスクシンイミド-N-エチル-N'-[3-ジエチルアミノプロピル]-カルボジイミド(EDC/NHS)で活性化させたCM5センサーチップに、低タンパク質密度でカップリングさせた。未反応の活性エステル基は1Mのエタノールアミンで遮断した。参照目的のために、抗原を含まない空の表面を同一固定条件下で製造した。
反応速度の測定には、装着緩衝液(HBS/Tween-20、BIAcore, Inc.)中で作製したそれぞれのmAbの100nm〜0.2nmの一連の2倍段階希釈を、直列に連結されたFタンパク質および参照細胞表面上に注入した。それぞれの分析において、解離相の後に100mMのHClの短いパルスを表面上に通すことによって、残存する結合した抗体をセンサーチップから除去した。データ組全体が収集された後、BIAevaluationソフトウェア(BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ)を用いて生じた結合曲線を1:1Langmuir結合モデルに包括的に当てはめた。このアルゴリズムは会合速度(kon)および解離速度(koff)をどちらも計算し、これから、それぞれの抗体について見かけの平衡結合定数KDが、2つの速度定数であるkoff/konの比として推定される。それぞれの速度定数を導くことに関するより詳細な説明は、BIAevaluationのソフトウェアハンドブック(BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ)中に見つけることができる。
BIAcore評価による結合の動力学的分析(表11)により、用いた低密度表面の条件下では、RSV Fタンパク質に対するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)の親和性がパリビツマブよりも約70倍高いことが明らかとなった。RSV Fタンパク質に対するモタビツマブの高い親和性は、会合速度の4倍の上昇および解離速度の約17倍の減少に起因すると考えられる。モタビツマブがFタンパク質表面から解離する速度はBIAcore3000機器の検出限界に近づいているので、モタビツマブについて生じた解離速度は推定である。
Figure 2008546805
＜実施例３＞
6.4 微量中和アッセイ
本発明の抗体の中和は微量中和アッセイによって決定した。この微量中和アッセイは、Anderson他によって記載されている手順の改変である(1985、J. Clin. Microbiol. 22:1050-1052、その開示はその全体が参考として本明細書中に組み込まれている)。ここで用いる手順は、その開示がその全体で参考として本明細書中に組み込まれているJohnson他、1999、J. Infectious Diseases 180:35-40に記載されている。抗体の希釈は、96ウェルプレートを用いて3つ組で行った。10個のTCID50の呼吸器合胞体ウイルス(RSV-Long株)を、試験する抗体(またはFab)の連続希釈と共に、96ウェルプレートのウェル中、2時間、37℃でインキュベーションした。その後、RSV感受性HEp-2細胞(2.5×104個)を各ウェルに加え、5日間、37℃、5%のCO2中で培養した。5日後、培地を吸引し、細胞を洗浄し、80%のメタノールおよび20%のPBSを用いてプレートに固定した。その後、Fタンパク質の発現によってRSV複製を測定した。固定した細胞を、ビオチンとコンジュゲートした抗Fタンパク質モノクローナル抗体(pan Fタンパク質、C部位特異的なmAb133-1H)と共にインキュベーションし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたアビジンをウェルに加えた。ウェルを再度洗浄し、基質TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)の代謝回転を450nmで測定した。中和力価は、ウイルスのみの対照細胞から450nmでの吸光度(OD450)の少なくとも50%の減少が引き起こされた抗体濃度として表現した。表2に記載のモノクローナル抗体およびFab断片のアッセイからの結果を、上記表11および下記表12に示す。
Figure 2008546805
6.5 RSV微量中和アッセイ
RSV(Long株)のin vitro複製を阻害するA4B4L1FR-S28R(モタビツマブ)およびパリビツマブの能力を、RSV微量中和アッセイを用いて評価した。このアッセイは、Johnson他、(Johnson他、1997、J Infect Dis 176: 1215-1224)によって記載されている、Anderson他、(Anderson他、1985、J Clin Microbiol 22: 1050-1052)の手順の改変である。抗体の希釈は、96ウェルプレートの2つ組〜4つ組のウェル中で行った。約100〜1000 TCID50のRSV(Long)を各希釈ウェルに加え、2時間、37℃でインキュベーションを行った。その後、継代数の低いRSV感受性HEp-2細胞(2.5×104個)を各ウェルに加え、5日間、37℃で、加湿5%CO2インキュベーター内で培養した。4または5日後、細胞をPBS-0.1%のTween20で洗浄し、20%のPBSを用いた80%のアセトンを用いてプレートに固定した。RSV複製は、Fタンパク質特異的ELISAを用いたFタンパク質の発現の定量によって決定した。固定した細胞を、C部位特異的なpa RSV Fタンパク質mAb133-1H(Chemicon, Inc.)と共にインキュベーションし、洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGと共にインキュベーションし、再度洗浄した。ペルオキシダーゼ基質TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を各ウェルに加え、2MのH2SO4を加えることによって反応を20分後に停止した。マイクロプレートリーダーを用いて基質の代謝回転を450nm(OD450)で測定した。中和力価は、ウイルスのみを有する対照ウェルからOD450値の少なくとも50%の減少がもたらされた抗体濃度として表現した(IC50)。図17に示すこのアッセイの結果は、モタビツマブ(平均IC50=18ng/ml)がパリビツマブ(平均IC50=315ng/ml)よりも約18倍強力であることを示している。
6.6 カニクイザルBAL試料を用いたRSV微量中和アッセイ
RSVのin vitro複製を阻害する治療した動物の肺中に存在するモタビツマブの能力を、RSV微量中和アッセイを用いて評価した。4匹の若いメスのカニクイザル(平均体重2.0kg)をテラゾール(Telazol)で鎮静させ、体重1kgあたり30mgのモタビツマブを、外部注入ポンプを用いて伏在静脈を介して静脈内(i.v.)投薬を行った。4日後、動物をテラゾールで麻酔し、右肺の1つの肺葉でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて気管支肺胞洗浄(BAL)を行った。BAL液中のモタビツマブの力価は、モタビツマブ特異的ELISAを用いて決定した。BAL試料は、上記のRSV微量中和アッセイで、精製したモタビツマブを対照として含めて、希釈せずにおよび2倍段階希釈で試験した。図18に示すこのアッセイの結果は、モタビツマブがインフュージョンの4日後にカニクイザルの肺中で完全なRSV中和活性を保持していることを示している。
6.7 RSV融合阻害アッセイ
ウイルスの細胞への付着の後にRSVによって誘導される融合を遮断する本発明の抗体の能力を、融合阻害アッセイで決定する。このアッセイは微量中和アッセイと同じであるが、抗体を加える前に細胞をRSV(Long)で4時間感染させる(Taylor他、1992、J. Gen. Virol. 73:2217-2223)。
6.8 物理的特徴づけ
本実施例は、モタビツマブおよびパリビツマブの物理的特徴を例示する。TmおよびpIを含めたいくつかのパラメータを検査した。さらに、モタビツマブおよびパリビツマブの凝集率および粘度プロフィールを決定した。
材料および方法
抗体断片の作製
FabおよびFcドメインは、完全長のパリビツマブ抗体からパパインを用いて作製した。Pierceの市販のキット(ImmunoPure Fab製造キットPierce製品番号44885:ImmunoPure IgG結合緩衝液、ImmunoPure IgG溶出緩衝液、AffinityPak固定タンパク質Aカラム、固定パパイン、システイン一リン酸、リン酸緩衝液、および血清分離器)を用いて未処置の抗体を消化した。Mabの最良の切断を手頃な時間内で達成するために酵素学を最適化した。FabおよびFcドメインは、以下のステップを用いてパリビツマブから作製した:すなわち、a)抗体をパパインに加え、37℃で終夜インキュベーションすること、1回の消化あたり〜10mgのIgG;b)粗消化物を固定した酵素から分離すること;c)消化物をタンパク質Aカラムに施用すること;d)保持されなかった画分中のFab断片をpH8.0で溶出させること;e)pH3.0でFc断片を溶出させること;およびf)断片を所用の緩衝液中で透析すること。
示差スキャン熱量
熱融解温度(Tm)は、VP-DSC(MicroCal、LLC)で、1.0℃/分のスキャン速度および25〜120℃の温度範囲を用いて測定した。8秒間のフィルター期間および5分間のスキャン前の恒温状態を用いた。試料は、Pierce透析カップ(3.5kD)を用いた10mMのヒスチジン-HCl、pH6中での透析によって準備した。A280によって決定した平均MAb濃度は50μg/mLであった。融解温度は、製造者の手順に従って、系と共に供給されたOriginソフトウェアを用いて決定した。手短に述べると、熱平衡を確立するために、複数のベースラインを試料および参照細胞のどちらも緩衝液で実行した。ベースラインを試料の温度記録から差し引いた後、データの濃度正規化を行い、逆重畳関数(deconvolution function)を用いて当てはめた。
等電点電気泳動ゲル電気泳動
multi temp 3冷蔵浴循環ユニットおよびEPS3501XL電源装置を備えたPharmacia Biotech Multiphor 2電気泳動系を用いて等電点を測定した。事前に形成したアンフォライン(ampholine)ゲル(Amersham Biosciences、pI範囲2.5〜10)に5μgのタンパク質を載せた。広範囲pIマーカー標準物質(Amersham、pI範囲3〜10、8μL)を用いてMabの相対pIを決定した。電気泳動は1500V、50mAで105分間行った。精製水で1×まで希釈したSigma固定溶液(5×)を用いてゲルを固定した。染色は、シンプリーブルー(Simply Blue)染料(Invitrogen)を用いて終夜、室温で行った。脱染色は、25%のエタノール、8%の酢酸および67%の精製水からなる溶液で実施した。等電点は、Bio-Rad濃度計を用いて、標準物質の検量線に対して決定した。
粘度プロフィール
mAB溶液の粘度は、ViscoLabピストンを備えたViscoLab 4000 Viscometer System(Cambridge Applied Systems)(SN:7497、0.3055’’、1〜20cP)およびS6S参照標準物質(Koehler Instrument Company, Inc.)を用いて測定した。粘度計を水浴に連結し、系を20℃に平衡化する。S6S粘度参照標準物質を用いてピストンを確認した(20.00℃で8.530cP)。ピストンはRODI H2Oを用いても確認した(20.0℃で1.00cP)。ピストンは、それぞれの異なる溶液種類を測定する毎に、石鹸および水で清浄にして完全に濯いだ。それぞれのMabは、10mMのヒスチジン-HCl、pH6中に100mg/mLの濃度であった。その後、系を≦2℃まで冷却した。系の温度が2℃以下になった後、試料をチャンバ内に入れ、ピストンを試料中に下げた。試料がチャンバの温度まで平衡化された後、測定を開始した。温度は≧25℃の最終温度まで7〜10分毎に1℃上げた。温度は水浴で調節したが、記録した温度は粘度計に表示されたものであった。粘度の結果は、温度を上昇させる直前に記録した。再平衡化の必要を最小限にするために、ピストンは測定中動かしたままであった。
凝集率
一定の温度範囲に渡る凝集プロフィールをHPSECによって決定した。具体的には、約250μgの、たとえば、標的抗原に免疫特異的に結合する抗体または抗体断片(10mg/mlの前記抗体または抗体断片を含む約25μlの液体調製物)を、TSK SW×1ガードカラム(6.0mm CX4.0cm)をはめ込んだTosoH Biosep TSK G3000SWXLカラム(7.8mm×30cm)上に注入した。0.1Mの硫酸ナトリウムおよび0.05%のアジ化ナトリウムを含む0.1Mのリン酸二ナトリウムを用いて、0.8〜1.0ml/分の流速で抗体または抗体断片の定組成溶出を行った。溶出されたタンパク質を280nmでのUV吸光度を用いて検出した。対照として適切な参照標準物質をアッセイで実行し、結果は、約12〜14分間で観察された、含まれる体積のピークを排除したすべての他のピークと比較した生成物の単量体のピークの面積%として報告した。単量体のピークよりも早く溶出されたピークを%凝集体として記録した。
結果
完全長のパリビツマブの融解曲線を検査するために示差スキャン熱量(DSC)を用いた(図19、上部)。FabおよびFcドメイン断片をパリビツマブから作製し、精製した断片をDSCによって個別に分析したDSC(図19、下部)。結果は、完全な抗体の個々のTmのピークを個々のドメインに割り当て得ることを示している。具体的には、最大のピークが完全長の抗体のFab部分のTmを表す。パリビツマブのFabのTmは約87.6℃である。
同様の分析をモタビツマブで行った(データ示さず)。モタビツマブFabのTmは有意に高いことが判明し、約93.1であった。これら2つの分子は13個のアミノ酸しか異ならないので、この知見は予想外であった。
これらの分子をさらに特徴づけるために、それぞれの完全長mAbのpIを等電点電気泳動ゲル電気泳動によって決定した。モタビツマブのpIは9.0であり、パリビツマブのpIは9.1であることが判明した。比較のために、それぞれの抗体についてFab-TmおよびmAb-pI値を図20にプロットした。
モタビツマブおよびパリビツマブの100mg/ml溶液の粘度を、約2〜約25℃の温度範囲に渡ってそれぞれ検査した。モタビツマブの粘度は、最高が2℃で約6.0cPから最低が約25℃で約3.0cPの範囲であった。パリビツマブの粘度は、最高が2℃で約4.5cPから最低が約25℃で約2.0cPの範囲であった(図21)。
パリビツマブおよびモタビツマブの凝集率を、それぞれの抗体についてFab Tmに対してプロットした(図22)。Fab Tmおよび凝集率の低下の間に相関が見られる。有意に高いFab Tmを有するモタビツマブは、パリビツマブよりも凝集体を形成する傾向がはるかに低い。
7. 均等物
当業者は、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を、認識できるか、または日常的な実験以上を行わずに確認できるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
本明細書中で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願を具体的かつ個別に本明細書中に参考として組み込まれていると示した場合と同程度に、本明細書中に参考として組み込まれている。
RSV抗原に免疫特異的に結合する精製抗体を製造するための概要を示す模式図である。 RSV抗原に免疫特異的に結合する精製抗体を製造するための概要を示す模式図である。 RSV抗原に結合するモノクローナル抗体の(A)軽鎖可変領域および(B)重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図であり、その力価は、本明細書中または出願人の同時係属出願第60/168,426号および第60/186,252号ならびに米国特許第6,656,467号に記載の方法によって増大することができる。参照目的のために、これは、Johnson他、1997、J. Infect. Dis. 176:1215-1224および米国特許第5,824,307号に開示されているパリビツマブ抗体のアミノ酸配列である。ここでは、CDR領域に下線を引き、下線のない残基は抗体の可変領域のフレームワーク(FR)領域を形成する。この抗体では、CDRはマウス抗体に由来し、フレームワーク領域はヒト抗体に由来する。定常領域(示さず)もヒト抗体に由来する。 抗体配列の(A)軽鎖可変領域および(B)重軽鎖可変領域を示す図である。CDR領域に下線を引き、下線のない残基は抗体の可変領域のフレームワークを形成する。この配列は、軽鎖のVH CDR1の最初の4個の残基、軽鎖FR4の残基103および重鎖FR4の残基112において、図1A〜1Bに開示した配列とは異なる。参照目的のために、これらのVLおよびVH配列は、IX-493L1FRのVLおよびVHドメインと同一である(表2参照)。 A4B4L1FR-S28RのVHドメインのヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を示す図である。CDR配列に下線を引いた。パリビツマブがA4B4L1FR-S28Rと異なる箇所は、パリビツマブのアミノ酸をモタビツマブの配列の下に示す。IX-493L1FRの鋳型に導入した残基(再度図2を参照)を太字で示す。 A4B4L1FR-S28RのVLドメインのヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を示す図である。CDR配列に下線を引いた。パリビツマブがA4B4L1FR-S28Rと異なる箇所は、パリビツマブのアミノ酸をモタビツマブの配列の下に示す。IX-493L1FRの鋳型に導入した残基(再度図2を参照)を太字で示す。 UV検出を備えたSECによって決定した、(黒菱形)2〜8℃、(白四角)20〜24℃および(黒三角)38〜42℃で保存中のA4B4L1FR-S28Rの凝集体、断片および単量体の定量を示す図である。(A)%凝集体;(B)%断片および(C)%純度(単量体)。 図19A〜19CのSECデータに基づいた、A4B4L1FR-S28Rの凝集および断片化率のプロットを示す図である。(黒菱形)凝集率、(黒四角)断片化率。 25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合したA4B4L1FR-S28Rの、38〜42℃で1カ月間保存した後のSECプロフィールを示す図である。 初期（開始時点）、9カ月および14カ月時点での、A4B4L1FR-S28RのAUCおよびSECの分析の比較を示す図である。すべての試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、9および14のガの時点には、38〜42℃で保存した。(A)AUC;(B)SEC。 AUC分析のシグナル/ノイズ比の抗体試料の濃度依存性の比較を示す図である。 25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、38〜42℃で5日間に渡って保存したA4B4L1FR-S28RのAUC分析を示す図である。 脱グリコシル化、還元およびアルキル化された抗体I型断片のLC-MS分析を示す図である。試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、38〜42℃で1カ月間保存したA4B4L1FR-S28RのSECから採取した。 脱グリコシル化、還元およびアルキル化された抗体II型断片のLC-MS分析を示す図である。試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、38〜42℃で1カ月間保存したA4B4L1FR-S28RのSECから採取した。 抗体I型および抗体II型断片を形成する、A4B4L1FR-S28Rの特徴的な断片化パターンを示す図である。(A)抗体重鎖のヒンジ領域中の切断部位。太字の矢印は、好ましいまたは主な切断部位を示す。(B)抗体I型および抗体II型断片の特徴を示す模式図。RSV抗原に免疫特異的に結合する精製抗体を製造するための概要。抗体I型断片は、完全長の抗体軽鎖、完全長の抗体重鎖、および、ヒトIgG1免疫グロブリンではシステイン223、アスパラギン酸224、リシン225、スレオニン226、ヒスチジン227、スレオニン228またはシステイン229でN末端を有する、抗体重鎖C末端部分を含む。抗体II型断片は、抗体軽鎖、および、ヒトIgG1免疫グロブリンではセリン222、システイン223、アスパラギン酸224、リシン225、スレオニン226、ヒスチジン227またはスレオニン228でC末端を有する抗体重鎖N末端部分を含む。 25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、38〜42℃で1カ月間保存したA4B4L1FR-S28RのSECから採取した、Lys-C消化した凝集体、単量体および断片のクロマトグラムを示す図である。矢印は、低レベルのジスルフィド結合スクランブリングピークを指している。 還元ありおよび還元なしの、Lys-C消化した凝集体のクロマトグラムを示す図である。試料は、25mMのヒスチジン-HCl、pH6.0中で配合し、38〜42℃で1カ月間保存したA4B4L1FR-S28RのSECから採取した。矢印は、低レベルのジスルフィド結合スクランブリングピークを指している。 抗RSV抗体A4B4L1FR-S28Rおよびパリビツマブを用いたRSV微量中和アッセイの結果を要約する図であり、両抗体がアッセイにおいてRSV(Long)のin vitro複製を阻害する能力を比較している。 A4B4L1FR-S28Rが微量中和アッセイにおいてRSV(Long)のin vitro複製を阻害する能力を実証する、RSV微量中和アッセイの結果を要約する図である。 完全長のパリビツマブのDSC温度記録を示す図(上部パネル)ならびにパリビツマブの精製したFabおよびFc断片から得た温度記録を重ねた図である(下部パネル)。Fcドメインの2つの明確なピークが約68℃および83℃で見られる。Fab断片の単一のピークが約87℃で見られる。 パリビツマブおよびモタビツマブのTmおよびpI値のプロットを示す図である。 約2〜25℃の温度範囲でのパリビツマブおよびモタビツマブの100mg/ml溶液の粘度のプロットを示す図である。 それぞれの抗体について、Fab Tmに対するパリビツマブおよびモタビツマブの凝集率のプロットを示す図である。

Claims (81)

  1. RSV抗原に免疫特異的に結合しかつパリビツマブではない、完全長IgG1抗体を含む抗体製剤であって、(i)製造後の所定の期間内に、前記製剤の全タンパク質画分のうちの所定の割合（％）以下が抗体I型および抗体II型断片であり、前記所定の期間が少なくとも約1週間であり、前記所定の割合（％）が約0.5%であるか、あるいは、(ii)製造後1カ月以内かつ38〜42℃の温度および6.0のpH下で、UV検出を備えたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定された前記製剤の全タンパク質画分のうちの5%未満が抗体凝集体を含むことを特徴とする、前記抗体製剤。
  2. 製造後の所定の期間内に、前記製剤の全タンパク質画分のうちの所定の割合（％）以下が抗体I型および抗体II型断片であり、前記所定の期間が少なくとも約1週間であり、前記所定の割合（％）が約0.5%である、請求項1に記載の製剤。
  3. 前記RSV抗原がFタンパク質エピトープである、請求項1または2に記載の製剤。
  4. 前記RSV抗原が前記Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337)を含む、請求項1または2に記載の製剤。
  5. 前記RSV抗原が前記Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337)からなる、請求項1または2に記載の製剤。
  6. 前記抗体が抗体A4B4L1FR-S28Rと前記RSV抗原との結合を競合的に阻害する、請求項1から5のいずれか一項に記載の製剤。
  7. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも1つの可変重鎖(VH)CDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも2つの可変重鎖(VH)CDRまたは前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも3つの可変重鎖(VH)CDRを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の製剤。
  8. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも1つの可変軽鎖(VL)CDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも2つの可変軽鎖(VL)CDRまたは前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも3つの可変軽鎖(VL)CDRを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の製剤。
  9. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28RのVHドメイン(配列番号48)を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の製剤。
  10. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28RのVLドメイン(配列番号11)を含む、請求項1から6および8のいずれか一項に記載の製剤。
  11. A4B4L1FR-S28Rの可変重鎖(VH)ドメイン(配列番号48)を有する重鎖およびA4B4L1FR-S28Rの可変軽鎖(VL)ドメイン(配列番号11)を有する軽鎖を含む完全長IgG1抗体を少なくとも100mg/ml含み、製造後1カ月以内かつ38〜42℃およびpH6.0下で、前記製剤の前記全タンパク質画分のうちの0.5%以下が抗体I型断片である、抗体製剤。
  12. A4B4L1FR-S28Rの可変重鎖(VH)ドメイン(配列番号48)を有する重鎖およびA4B4L1FR-S28Rの可変軽鎖(VL)ドメイン(配列番号11)を有する軽鎖を含む完全長IgG1抗体を少なくとも100mg/ml含み、製造後1カ月以内かつ38〜42℃およびpH6.0下で、前記製剤の前記全タンパク質画分のうちの0.5%以下が抗体II型断片である抗体製剤。
  13. それぞれの前記抗体I型断片が重鎖C末端部分を含み、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された前記保存した抗体の試料の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)分析によって決定された前記重鎖C末端部分の分子量が約25.6kD、約25.7kD、約25.8kD、約26.0kD、または約26.1kDである、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体製剤。
  14. それぞれの前記抗体II型断片が重鎖N末端部分を含み、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された前記保存した抗体の試料のLC-MS分析によって決定された前記重鎖N末端部分の分子量が約24.4kD、約24.6kD、約24.7kD、約24.9kD、または約25.1kDである、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体製剤。
  15. 製造後1カ月以内かつ38〜42℃の温度および6.0のpH下で、UV検出を備えたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定された前記製剤の全タンパク質画分のうちの5%未満が抗体凝集体を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の製剤。
  16. 製造後1カ月以内かつ38〜42℃の温度および6.0のpH下で、前記製剤の脱気した試料の濁度値が約6.5NTU未満である、請求項1から15のいずれか一項に記載の製剤。
  17. 製造後1カ月以内かつ38〜42℃の温度および6.0のpH下で、前記製剤が、直径2〜4μmが約3.4E+5未満の粒子/ml、直径4〜10μmが約4.0E+4未満の粒子/ml、直径10〜20μmが約4.2E+3未満の粒子/ml、直径20〜30μmが約5.0E+2未満の粒子/ml、直径30〜40μmが約7.5E+1未満の粒子/ml、および直径40〜60μmが約9.4未満の粒子/mlである、かつ、マルチサイザーによって決定された粒子プロフィールを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の製剤。
  18. 製造後1カ月以内かつ38〜42℃の温度および6.0のpH下で、前記抗体I型断片が前記重鎖の1つまたは複数のC末端部分を含み、重鎖C末端部分が前記抗体のアミノ酸残基223〜449;前記抗体のアミノ酸残基224〜449、前記抗体のアミノ酸残基225〜449、前記抗体のアミノ酸残基226〜449、前記抗体のアミノ酸残基227〜449、前記抗体のアミノ酸残基228〜449および前記抗体のアミノ酸残基229〜449を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の製剤。
  19. それぞれの前記抗体II型断片が重鎖N末端部分を含み、重鎖N末端部分が前記抗体のアミノ酸残基1〜222、前記抗体のアミノ酸残基1〜223、前記抗体のアミノ酸残基1〜224、前記抗体のアミノ酸残基1〜225、前記抗体のアミノ酸残基1〜226、前記抗体のアミノ酸残基1〜227または前記抗体のアミノ酸残基1〜228を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の製剤。
  20. 前記製剤がヒスチジンをさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の製剤。
  21. ヒスチジンの濃度が約1mM〜約100mMまたは約10mM〜約50mMである、請求項20に記載の製剤。
  22. 前記ヒスチジンの濃度が約20mM〜約30mMであり、前記製剤がグリシンを2mM未満の濃度でさらに含み、界面活性剤、無機塩または他の賦形剤を実質的に含まない、請求項20に記載の製剤。
  23. ヒスチジンの濃度が約25mMであり、グリシンの濃度が約1.6mMである、請求項22に記載の製剤。
  24. 前記製剤が界面活性剤および無機塩を実質的に含まない、請求項20に記載の製剤。
  25. 前記製剤が他の賦形剤を実質的に含まない、請求項20に記載の製剤。
  26. 前記製剤が界面活性剤以外の賦形剤をさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の製剤。
  27. 前記賦形剤がグリシンである、請求項26に記載の製剤。
  28. グリシンの濃度が150mM未満、100mM未満、50mM未満、3mM未満または2mM未満である、請求項27に記載の製剤。
  29. 前記製剤のpHが約6.0である、請求項36に記載の製剤。
  30. 前記賦形剤が糖類である、請求項26に記載の製剤。
  31. 前記糖類がスクロースである、請求項30に記載の製剤。
  32. 前記スクロースの濃度が約1%〜約20%である、請求項31に記載の製剤。
  33. 前記賦形剤がマンニトール以外のポリオールである、請求項26に記載の製剤。
  34. 前記ポリオールがポリソルベートである、請求項33に記載の製剤。
  35. 前記ポリオールが約0.001%〜約1%の濃度のTweenである、請求項33に記載の製剤。
  36. 前記製剤のpHが約5.5〜約7.0である、請求項1から35のいずれか一項に記載の製剤。
  37. 前記製剤のpHが約5.5〜約6.5である、請求項36に記載の製剤。
  38. 前記抗体の濃度が少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも20mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも110mg/ml、少なくとも150mg/mlまたは少なくとも160mg/mlである、請求項1から40のいずれか一項に記載の製剤。
  39. 前記抗体製剤が、(a)前記抗体をコードしているmRNAの転写を指令することができる組換えベクターによる、ネズミ骨髄腫細胞系の形質転換;(b)形質転換細胞の維持;(c)形質転換細胞の培養物からの馴化培地の回収;(d)陽イオン/陰イオン交換クロマトグラフィー;(e)ナノ濾過;および(f)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含むプロセスによって製造および精製した抗体を含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の製剤。
  40. 前記抗体が、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも1つのCDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも2つのCDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも3つのCDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも4つのCDR、前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも5つのCDRまたは前記抗体A4B4L1FR-S28Rの少なくとも6つのCDRを含む、請求項1に記載の製剤。
  41. 前記製剤が水性担体中にある、請求項1から40のいずれか一項に記載の製剤。
  42. 前記水性担体が蒸留水である、請求項41に記載の製剤。
  43. 前記製剤が無菌である、請求項1から42のいずれか一項に記載の製剤。
  44. 前記製剤が均質である、請求項1から43のいずれか一項に記載の製剤。
  45. 前記製剤を、乾燥ステップを有さない方法によって製造する、請求項1から44のいずれか一項に記載の製剤。
  46. 前記製剤を、凍結乾燥ステップを有さない方法によって製造する、請求項1から45のいずれか一項に記載の製剤。
  47. ヒトへの非経口投与に適しており、適切な容器中に存在する、請求項1から46のいずれか一項に記載の製剤を含む医薬単位剤型。
  48. 前記製剤が皮下、静脈内または筋肉内投与に適している、請求項47に記載の医薬単位剤型。
  49. ヒトへのエアロゾル投与に適しており、適切な容器中に存在する、請求項1から46のいずれか一項に記載の医薬単位剤型。
  50. 請求項1から46のいずれか一項に記載の製剤を含む密封容器。
  51. 請求項1から46のいずれか一項に記載の製剤を予防上または治療上有効な量で投与することを含む、被験体においてRSV感染症に関連する1つまたは複数の症状を予防、治療、または改善させる方法。
  52. 前記製剤を非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与または鼻腔内投与する、請求項51に記載の方法。
  53. 抗体断片化について抗体製剤を最適化する方法であって、第1のプロトコルに従って製造した第1の抗体製剤と第2のプロトコルに従って製造した第2の抗体製剤との断片化レベルを分析用超遠心(AUC)によって比較することを含み、第1および第2の抗体製剤は、A4B4L1FR-S28Rの可変重鎖(VH)ドメイン(配列番号48)を有する重鎖およびA4B4L1FR-S28Rの可変軽鎖(VL)ドメイン(配列番号11)を含む前記軽鎖を含む完全長IgG1抗体を少なくとも100mg/ml含み、前記第1および第2の抗体製剤は38〜42℃、pH6.0で1カ月間保存し、前記第1の抗体製剤中の断片化レベルと比較して前記第2の抗体製剤中の断片化レベルが低下している場合に、抗体製剤は断片化レベルについて最適化されている、前記方法。
  54. 抗体断片化について抗体製剤を最適化する方法であって、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された前記保存した抗体の試料の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)分析によって決定する抗体I型および抗体II型断片の存在量について、第1のプロトコルに従って製造した第1の抗体製剤と第2のプロトコルに従って製造した第2の抗体製剤とを比較することを含み、第1および第2の抗体製剤は、A4B4L1FR-S28Rの可変重鎖(VH)ドメイン(配列番号48)を有する重鎖およびA4B4L1FR-S28Rの可変軽鎖(VL)ドメイン(配列番号11)を含む前記軽鎖を含む完全長IgG1抗体を少なくとも100mg/ml含み、前記第1および第2の抗体製剤は38〜42℃、pH6.0で1カ月間保存し、前記第1の抗体製剤中の抗体I型および抗体II型断片のレベルと比較して前記第2の製剤中の抗体I型および抗体II型断片のレベルが低下している場合に、抗体製剤は抗体断片化について最適化されている、前記方法。
  55. 前記抗体I型断片は1つまたは複数の重鎖C末端部分を含み、重鎖C末端部分の分子量は約25.6kD、約25.7kD、約25.8kD、約26.0kD、または約26.1kDであり、前記抗体II型断片は前記重鎖の1つまたは複数のN末端部分を含み、重鎖N末端部分の分子量は約24.4kD、約24.6kD、約24.7kD、約24.9kD、または約25.1kDであり、前記部分の分子量は、脱グリコシル化、還元およびアルキル化された前記抗体製剤の試料の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)分析によって決定する、請求項54に記載の方法。
  56. 前記第2のプロトコルが追加のクロマトグラフィー精製ステップを含む、請求項53から55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記クロマトグラフィー精製ステップでヒドロキシアパタイトカラムを利用する、請求項56に記載の方法。
  58. 前記第1のプロトコルが追加のクロマトグラフィー精製ステップを含む、請求項53から55のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記クロマトグラフィー精製ステップでrProtein A親和性カラムを利用する、請求項58に記載の方法。
  60. 前記第2の抗体製剤が、(a)前記抗体をコードしているmRNAの転写を指令することができる組換えベクターによる、ネズミ骨髄腫細胞系の形質転換;(b)形質転換細胞の維持;(c)形質転換細胞の培養物からの馴化培地の回収;(c)陽イオン/陰イオン交換クロマトグラフィー;(e)ナノ濾過;および(f)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含むプロセスによって製造および精製した抗体を含む、請求項53から55のいずれかに記載の方法。
  61. 前記第2のプロトコルが、前記第1のプロトコルの1つまたは複数のステップの温度の変更を含む、請求項53から55のいずれかに記載の方法。
  62. RSV抗原に免疫特異的に結合する、かつ、Fab断片を含む抗体であって、前記Fab断片のTmは少なくとも約87℃であり、前記抗体がパリビツマブ、AFFF、P12f2、P12f4、P11d4、Ale9、A12a6、A13c4、A17d4、A4B4、A8c7、1X-493L1FR、H3-3F4、M3H9、Y10H6、DG、AFFF(1)、6H8、L1-7E5、L2-15B10、A13a11、A1h5、A4B4(1)、A4B4L1FR-S28R(モタビツマブ(motavizumab))、A4B4-F52S、A17d4(1)、A3e2、A14a4、A16b4、A17b5、A17f5、およびA17h4のいずれでもない、前記抗体。
  63. 前記FabがパリビツマブのFabとは異なる、請求項62に記載の抗体。
  64. 前記抗体がパリビツマブのVHドメインとは異なるVHドメインを含む、請求項62に記載の抗体。
  65. 前記抗体がパリビツマブのVLドメインとは異なるVLドメインを含む、請求項62に記載の抗体。
  66. 前記Fab断片のTmが少なくとも約90℃または少なくとも約93℃である、請求項62に記載の抗体。
  67. 前記抗体のpIが約8.5〜9.5または約9.0〜9.5である、請求項62に記載の抗体。
  68. 前記RSV抗原がFタンパク質エピトープである、請求項62に記載の抗体。
  69. 前記RSV抗原が前記Fタンパク質エピトープNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNN(配列番号337)を含む、請求項62に記載の抗体。
  70. 前記抗体が抗体A4B4L1FR-S28Rと前記RSV抗原との結合を競合的に阻害する、請求項62に記載の抗体。
  71. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28RのVHドメイン(配列番号48)を含む、請求項62に記載の抗体。
  72. 前記抗体が前記抗体A4B4L1FR-S28RのVLドメイン(配列番号11)を含む、請求項62に記載の抗体。
  73. 前記Fabが抗体A4B4L1FR-S28RのFabである、請求項62に記載の抗体。
  74. RSV抗原に免疫特異的に結合するかつ完全長IgG1抗体を含み、1〜26℃の範囲の任意の温度で約10.00cP未満の粘度を有する抗体製剤。
  75. RSV抗原に免疫特異的に結合するかつ完全長IgG1抗体を含み、38〜42℃の範囲の任意の温度で15%未満/日の凝集率を有する抗体製剤。
  76. 1〜26℃の範囲の任意の温度で10.00cP未満の粘度を有する、請求項62から73のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体製剤。
  77. 38〜42℃の範囲の任意の温度で15%未満/日の凝集率を有する、請求項62から73のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体製剤。
  78. 請求項62から73のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体製剤または請求項74から77に記載の抗体製剤を、予防上または治療上有効な量で投与することを含む、被験体においてRSV感染症に関連する1つまたは複数の症状を予防、治療、または改善させる方法。
  79. RSV感染症が上気道感染症である、請求項51または78に記載の方法。
  80. 前記製剤を非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与または鼻腔内投与する、請求項78に記載の方法。
  81. 前記1つまたは複数の症状が中耳炎、喘息、および喘鳴のうちの1つまたは複数である、請求項51または78に記載の方法。
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