CN102459334A - 靶定补体蛋白c3b的抗体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人和猕猴补体蛋白C3b的抗体及其抗原结合片段，以及使用其的组合物和方法。

Description

靶定补体蛋白C3B的抗体的组合物和方法
发明背景
年龄相关性黄斑变性(AMD)是进行性疾病，并且是美国年龄65岁及以上老年人视觉丧失和失明的主要原因。AMD主要影响黄斑；其为负责阅读或开车所需的高视敏度的视网膜的一部分。大多数AMD患者遭受该疾病的早期阶段，所述疾病的特征在于存在称为玻璃疣的细胞外视网膜沉积物。玻璃疣是细胞碎片的细胞外视网膜沉积物、炎症介质、和细胞外基质组分。AMD的晚期阶段表现为干涩或湿润形式，两者均与视觉丧失相关。干涩AMD，也称为地图样萎缩，在检眼镜检查中呈现为界线清楚的区域，其对应于视网膜色素上皮细胞(RPE)丧失的局部区域。湿润AMD与脉络膜的新血管形成相关，引起Bruch’s膜完整性受损和视网膜中脉管生长，其中它们经常出血。这种渗漏引起对视网膜细胞的永久性损伤，它们相继死亡的，并在中央视觉区产生盲点。
人先天性系统由补体途径组成。补体途径作用于防御化脓性细菌感染，桥接先天性和适应性免疫；并去除免疫复合体的产物和炎性损伤。补体是在血浆和细胞表面参与级联反应的多于30种蛋白质的系统。补体系统及其补体组分参与多种免疫过程。例如，补体C5b-9复合体，也称为末端复合体或膜攻击复合体(MAC)，通过诱导膜通透性损伤而在细胞死亡中起重要作用。
近期工作已经证明，补体组分C3和C5是AMD患者中玻璃疣的主要成分。Mulling，R.F.等(2000)FASEB J 14，835-46。已经推测它们以及膜攻击复合体(MAC)C5b-9和其它急性期反应蛋白在玻璃疣上RPF细胞中的存在参与了可激发补体激活和MAC形成的过程。Johnson，L等(2001)Exp Eye Res 73，887-896。因此，越来越多的证据表明，补体组分不仅仅是先天性免疫的介体。
已经建议营养干预用于抑制干涩AMD发展成湿润AMD。目前，仅FDA批准的湿润AMD的治疗包括光动力学疗法(PDT)、抗VEGF适体，如pegaptanib，和抗VEGF抗体ranibizumab。这些药物或治疗通常向已患有重大视觉丧失的患者施用。
仍然需要开发AMD的有效治疗，来替换或补充目前的治疗。尤其是，需要可以提供早期检测、预防或恢复视觉丧失的治疗。
发明概述
本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人或猕猴补体C3b蛋白，其中所述抗体以低于或等于100pM的KD结合人C3b，并以低于或等于200pM的KD结合猕猴C3b。例如，此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于90pM、低于或等于80pM、低于或等于70pM、低于或等于60pM、低于或等于50pM、低于或等于40pM、低于或等于30pM，并优选高达低于或等于20、19、18、17、16、15、14、13、12或11pM的KD结合人C3b。优选的是，抗体或其抗原结合片段以低于或等于10pM的Kd结合人C3b。例如，抗体或其抗原结合片段可以低于或等于9pM、低于或等于8pM、低于或等于7pM、低于或等于6pM、低于或等于5pM、低于或等于4pM、低于或等于3pM、低于或等于2pM，或高达低于或等于1pM的KD结合C3b。此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于250pM、低于或等于240pM、低于或等于230pM、低于或等于220pM、低于或等于210pM、低于或等于200pM、低于或等于190pM、低于或等于180pM、低于或等于170pM、低于或等于160pM、低于或等于150pM、低于或等于140pM、低于或等于130pM、低于或等于120pM、低于或等于110pM、低于或等于100pM、低于或等于90pM、低于或等于80pM、低于或等于70pM、低于或等于60pM、低于或等于50pM、低于或等于40、39、38、37、36、35、34、33、32或31pM、低于或等于30pM、低于或等于20、19、18、17、16、15、14、13、12或11pM并优选高达低于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1pM的KD结合猕猴C3b。
优选通过溶液平衡滴定(SET)测定此处描述的抗体的结合亲和力。SET的方法为本领域所知并在下文中进行了进一步的详细描述。
本发明的抗体可用于抑制补体旁路。例如，此处描述的抗体或其片段如体外溶血测定所测定以低于或等于70nM、优选低于或等于65nM、优选低于或等于50nM、优选低于或等于40nM、30nM或20nM，并更优选低于或等于10nM的IC50抑制补体旁路。此处描述的抗体或其片段如体外溶血测定所测定以低于或等于100nM、优选低于或等于90nM、优选低于或等于80nM、优选低于或等于75nM，并更优选低于或等于70nM的IC50抑制猕猴中的补体旁路。此处描述的抗体或其片段如体外C3b沉积所测定以低于或等于30nM、低于或等于25nM、低于或等于20nM，并优选低于或等于10nM的IC50抑制补体旁路。此处描述的抗体或其片段可如体外C3b沉积所测定以低于或等于70nM、低于或等于50nM、低于或等于40nM，并优选低于或等于30nM的IC50抑制猕猴中的补体旁路。
此处描述的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于5nM，优选低于或等于4nM、3nM、2nM，并更优选低于或等于1nM的IC50抑制补体旁路。此处描述的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于20nM，优选低于或等于19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM或13nM，并更优选低于或等于10nM的IC50抑制猕猴中的补体旁路。
此处描述的抗体或其片段如通过产生C3a和C5a测定以低于或等于100nM，优选低于或等于90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM或20nM，并更优选低于或等于10nM抑制补体旁路。
本发明描述的抗体或其抗原结合片段优选具有如表12中所示的Fab的结合特征。
本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人或猕猴的补体C3b蛋白，并与表1中描述的抗体交叉竞争。
此处描述的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、人或人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、Fv片段、F(ab’)2片段、或ScFv片段、和/或IgG同种型。
本发明的抗体可包括这样的构架，其中氨基酸已经替换成来自各人VH或VL种系序列的抗体构架。
一方面，本发明的抗体以比所述抗体结合C3的亲和力高至少1000倍的亲和力结合C3b。
本发明包括具有表1中抗体9556的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9611的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9612的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9609的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9610的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9674的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中抗体9675的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9124的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9397的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9398的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9136的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9141的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中抗体9373的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9423的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
本发明包括具有表1中抗体9556的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9611的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9612的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9609的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9610的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9674的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中9675抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中9124抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9397抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9398抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9136抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9141抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中9373抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9423抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ IDNOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的重链CDR1；选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的重链CDR2；和选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的重链CDR3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。在其它方面，分离的抗体或其抗原结合片段还包括选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ IDNOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs 5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs 6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ IDNOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的重链可变域序列，还包括选自SEQ ID NOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的轻链可变域序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自SEQ IDNOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的轻链可变域序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与选自SEQ IDNOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域，其中所述抗体结合C3b。一方面，分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自SEQ ID NOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与选自SEQ IDNOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域，其中所述抗体结合C3b。
本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与选自SEQ ID NOs 9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的序列具有至少95％序列同一性的重链，其中所述抗体结合C3b。一方面，分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自SEQ ID NOs10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链。
本发明进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与选自SEQID NOs 10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链，其中所述抗体结合C3b。
本发明还包括药物组合物，其包含此处描述的抗体组合物以及药学上可接受的载体。尤其是，本发明包括药物组合物，其包含表1的抗体或其抗原结合片段，例如抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674、9675、9124、9397、9398、9136、9141、9373或9423。本发明还包括药物组合物，其包含表1的两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合。
本发明还包括分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包括与选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域。
本发明还涉及分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包括与选自SEQ ID NOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
一方面，本发明还包括这样的载体，其包括一种或多种此处描述的核酸分子。
本发明还包括分离的宿主细胞，其包括编码上文描述的抗体重链的重组DNA序列，和编码所述抗体轻链的第二个重组DNA序列，其中所述DNA序列有效连接启动子，并能够在宿主细胞中表达。期望抗体可以是人单克隆抗体。还期望宿主细胞是非人哺乳动物细胞。
本发明还涉及治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其片段的组合物的步骤。期望受试者是人。
本发明还提供在受试者中抑制补体旁路的方法，其中所述方法包括向需要抑制的受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。一方面，受试者是人。
本发明还提供抑制C3b结合因子B、P或H的方法，其包括使C3b与此处描述的抗C3b抗体或其片段接触。
本发明还提供抑制C3转变酶、C4转变酶和C3b-C3b二聚体形成的方法，其包括使C3b与抗C3b抗体或其片段接触。
本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与选自SEQ IDNOs：1、2、3、4、5、6、15、16、17、18、19、20、29、30、31、32、33、34、43、44、45、46、47、48、57、58、59、60、61、62、71、72、73、74、75、76、85、86、87、88、89和90的序列具有至少80％、85％、90％，以及高达至少95％的序列同一性的至少一个互补性决定区(CDR)序列，其中所述抗体结合补体蛋白C3b。
本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ IDNOs：1、2、3、15、16、17、29、30、31、43、44、45、57、58、59、71、72、73、85、86和87的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体结合C3b。
本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ IDNOs：4、5、6、18、19、20、32、33、34、46、47、48、60、61、62、74、75、76、88、89和90的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体结合C3b。
本发明还包括分离的抗原结合多肽，其包含选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71和85的重链CDR1；选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72和86的重链CDR2；和选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73和87的重链CDR3，其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白C3b。
本发明还包括抗原结合多肽，其包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74和88的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs 5、19、33、47、61、75和89的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs 6、20、34、48、62、76和90的轻链CDR3，其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白C3b。
除了包括上文指出的重链CDR序列的抗原结合多肽外，抗原结合多肽还包括选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74和88的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs 5、19、33、47、61、75和89的轻链CDR2；和选自SEQID NOs 6、20、34、48、62、76和90的轻链CDR3。
此处描述的抗体结合多肽以低于或等于100pM，优选低于或等于10pM，优选低于或等于2pM的KD结合C3b。此外，优选地，抗原结合多肽结合人和猕猴C3b。
本发明还包括调节C3b的方法，其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
定义
除非另有定义，此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同意思。
如此处所用的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区(此处缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布着称为构架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由以下面顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一个组分(Clq)的结合。
如此处所用，术语抗体的“抗原结合部分”指完整抗体的一个或更多片段，其保留与给定抗原(例如C3b)特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”中包括的结合片段的实例包括Fab片段，其为VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等，1989Nature 341：544-546)，其由VH结构域或VL结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可使用重组方法，通过人工肽接头将它们连接，所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参阅例如Bird等，1988 Science 242：423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体包括抗体的一个或更多“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选所述片段，以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
抗原结合部分也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv(参阅例如Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参阅美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体体)。
抗原结合部分可掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，所述串联Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如此处所用，术语“亲和力”指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在每一抗原位点中，抗体“臂”的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
如此处所用，术语“亲合力”指抗体-抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量度。其受三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原与抗体两者的效价；和相互作用部分的结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性，即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
术语“氨基酸”指天然发生的和合成的氨基酸，以及与天然发生的氨基酸以相似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及稍后被例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。氨基酸类似物指这样的化合物，其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合物，但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
如此处所用，术语“结合特异性”指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的Fab部分，并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。其为抗原决定簇与抗体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
两个实体之间的特异性结合表示平衡常数(KA)为至少1x107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1的结合。短语与抗体(例如，C3b结合抗体)的“特异性(或选择性)结合”指决定近亲抗原(例如人C3b或猕猴C3b)在蛋白质和其它生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数(KA)，本发明的C3b结合抗体通常还具有约1x10-2s-1、1x10-3s-1、1x10-4s-1、1x10-5s-1或更低的解离速率常数(Kd)，并且以比其结合非特异性抗原(例如C3)的亲和力至少10倍，优选100倍，或高达1000倍或更高的亲和力结合C3b。。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”此处可与“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如此处所用，“neo-表位”或“neo-抗原”可互换使用，并且是蛋白水解切割C3后C3b上存在的蛋白质的抗原部分。这些neo-表位在未切割的C3上不容易接近。
术语“与黄斑变性相关的状况或病症”指任何多种这样的状况，其中例如因黄斑细胞生长降低引起视网膜黄斑变性或无功能，增加了黄斑细胞(例如RPE细胞)的死亡或重排、正常生物学功能的丧失，或这些事件的组合。黄斑变性导致细胞组织结构的完整性和/或正常黄斑的胞外基质的缺失和/或黄斑细胞的功能缺失。黄斑变性相关病症的实例包括AMD、北卡罗来纳黄斑营养不良、Sorsby′s眼底营养不良、隐性黄斑营养不良、模式营养不良、卵黄状黄斑变性、显性玻璃疣，和malattia leventinese(辐射玻璃疣)。该术语还包括黄斑异常和/或变性之前或之后发生的黄斑外改变。因此，术语“黄斑变性相关病症”还广泛地包括改变或损坏黄斑完整性或功能的任何状况(例如，RPE或Bruch′s膜的损伤)。例如，该术语包括视网膜脱落、脉络膜视网膜变性、视网膜变性、光感受器退化、RPE变性、粘多糖病、视杆-视椎营养不良、视椎-视杆营养不良和视椎变性。
术语“补体组分”、“补体蛋白”或“补体组分蛋白”指参与激活补体系统的分子。经典途径组分包括，例如C1q、C1r、C1s、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9和C5b-9复合体(膜攻击复合体：MAC)。旁路途径组分包括，例如因子B、因子D、备解素、H和I。
术语“调节”或“调节”在此处互换使用，指活性或生物学过程(例如，补体过程)的上调(即，激活或刺激(例如，通过激动或加强))和下调(即，抑制或阻遏(例如，通过拮抗、降低或抑制))。“调节”旨在描述过程的上调或下调。可通过刺激物的拮抗剂抑制通过该刺激物上调的过程。相反地，可通过修饰剂的激动剂抑制通过该修饰剂下调的过程。
术语“补体途径相关分子”、“补体途径分子”和“补体途径相关蛋白”可互换使用，并指在补体激活和响应激活的补体系统介导的或激活的补体系统触发的下游细胞活性中起作用的多种分子。它们包括补体途径的起始物(即，直接或间接触发补体系统激活的分子)、在补体激活过程中产生的或起作用的分子(例如，补体蛋白/酶，如C3、C5、C5b-9、因子B、因子D、MASP-1和MASP-2)、补体受体或抑制剂(例如，簇蛋白、玻连蛋白、CR1或CD59)，和激活的补体系统调节或触发的分子(例如，膜攻击复合体抑制因子、MACIF；参阅例如，ugita等，J Biochem，106：589-92，1989)。因此，除了此处指出的补体蛋白，补体途径相关分子还包括，例如C3/C5转变酶调节子(RCA)，如补体受体类型1(也称为CR1或CD35)、补体受体类型2(也称为CR2或CD21)、膜辅因子蛋白(MCP或CD46)，和C4bBP；MAC调节子，如玻连蛋白、簇蛋白(也称为“SP40，40”)、CRP、CD59，和同源限制因子(HRF)；免疫球蛋白链，如Igκ、Igλ或Igγ；C1抑制剂；和其它蛋白质，如CR3、CR4(CD11b/18)和DAF(CD 55)。
术语“补体途径调节的细胞活性”包括因以下引起的细胞损伤：C5b-9攻击复合体、血管通透性改变、平滑肌细胞的收缩和迁移、T细胞增殖、免疫粘着、树突状细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的聚集、嗜中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞的吞噬、迁移和激活。
此外，补体途径的激活导致补体途径中副产物产生的促炎症反应的增加。与补体途径激活相关的病症包括肾炎、哮喘、再灌注损伤、血液透析、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化症、移植、阿尔茨海默氏病、aHUS、MPGN II或任何其它补体介导的疾病。与黄斑变性相关的病症包括AMD、北卡罗来纳黄斑营养不良、Sorsby′s眼底营养不良、隐性黄斑营养不良、模式营养不良、卵黄状黄斑变性、显性玻璃疣，和malattia leventinese(辐射玻璃疣)、黄斑异常和/或变性之前或之后发生的黄斑外改变、视网膜脱落、脉络膜视网膜变性、视网膜变性、光感受器退化、RPE变性、粘多糖病、视杆-视椎营养不良、视椎-视杆营养不良和视椎变性粘多糖病。
如此处所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有的非人脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、啮齿类、兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸟、两栖动物、爬行动物等。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接不同种类或改变种类的恒定区、效应功能和/或物种，或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，可通过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替换，嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性，同时与最初的小鼠抗体相比，在人中具有降低的抗原性。
术语“补体C3b蛋白”或“C3b”互换使用，并指不同物种中的C3b蛋白。例如，人C3b具有SEQ ID NO：197(A链)和198(B链)中阐明的序列。可从Complement Technology Inc.(Tyler，TX)获得人C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴C3b。
术语“保守修饰的变体”应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者其中所述核酸不编码氨基酸序列，则指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一位置上(其中密码子确定丙氨酸)，可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的每一密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各替换、缺失或添加，其导致对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton，Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“交叉-阻断”、“交叉-阻断的”在此处可互换使用，表示抗体或其它结合剂在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与C3结合的能力。
可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与C3结合的能力或程度，并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定法包括使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一测定法使用基于ELISA的方法。
术语“表位”表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位一般由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，并一般具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象和非构象表位可以区分开，因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合，而不失去与后者的结合。
如此处所用，术语IgG抗体或其片段(例如，Fab片段)的“高亲和力”指对靶抗原具有10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M、或10-11M或更低、或10-12M或更低、或10-13M或更低的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合指具有10-7M或更低，或10-8M或更低的KD的抗体。一方面，此处描述的抗C3b抗体或其抗原结合片段具有低于或等于1nM，优选低于或等于200pM，更优选低于或等于100pM，并甚至更优选低于或等于10pM的KD。
如此处所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，在所述可变区中构架和CDR区均来自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也来自此类人序列，例如人种系序列，或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体，在所述可变区中构架和CDR区均来自人序列。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物，例如转基因小鼠中获得的B细胞，所述转基因非人动物具有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性，而在人中具有更低免疫原性的抗体。例如这可通过保留非人CDR区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分(即，恒定区以及可变区的构架部分)来实现。参阅例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：169-217，1994。人工程化技术的其它实例包括，但不限于在US5,766,886中公开的Xoma技术。
在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”指相同的两条或更多序列或子序列。当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查测定，比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时，如果两条序列具有特定百分比(即，在特定区域上或当不指定时，在全长序列上60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)的相同氨基酸残基或核苷酸，那么两条序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度至少100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如此处所用，“比较窗口”包括参考选自20到600、一般约50到约200，更一般约100到约150的任何一定数量相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法，通过搜索Pearson和Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手工比对和视觉检查(参阅，例如Brent等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(Ringbou编辑，2003))进行序列最佳比对用于比较。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977；和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中。用于进行BLAST分析的软件通过National Center for BiotechnologyInformation公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，当在数据库序列中用相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等，上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSPs。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分；总＞0)和N(对错配残基的罚分；总＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当：所述累积比对得分从其最高达到值跌落X量；因一个或更多负得分残基比对累积，所述累积比对得分到达零或以下；或到达任何一条序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3，和期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参阅Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参阅例如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 90：5873-5787，1993)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，并最优选低于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。
也可使用已经整合到ALIGN算法(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分12和空位罚分4测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
除了上文指出的序列同一性的百分比，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文描述。因此，多肽通常与第二条多肽基本相同，例如，其中两条肽仅因保守替换而不同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
术语“分离的抗体”指抗体，其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体(例如，特异性结合C3b的分离的抗体基本不含特异性结合除C3b外的抗原的抗体)。然而，特异性结合C3b的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学品。
术语“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体种类(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG4)。同种型也包括这些种类中一种的修饰形式，其中已经进行修饰以改变Fc功能，例如来增强或减弱效应功能或与Fc受体的结合。
如此处所用，术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如此处所用，术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如此处所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获得于Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)并表达为摩尔浓度(M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法是通过使用表面等离振子共振，或使用生物传感器系统如系统。
如此处所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单个分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
术语“核酸”此处与术语“多核苷酸”可互换使用，并指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其为合成的、天然发生的和非天然发生的，其与参考核酸具有相似的结合性质，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括，但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有指出，特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。尤其是，如下文详细描述，可通过产生这样的序列完成简并密码子替换，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081，1991；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608，1985；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98，1994)。
术语“有效连接”指两个和更多多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，其指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录，那么该启动子或增强子序列有效连接编码序列。一般地，有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列，如增强子不需要与编码序列(增强子增强其转录)在物理空间上邻近或位于其附近。
如此处所用，术语“优化的”表示已经使用生产细胞或生物，一般是真核细胞，例如毕赤酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列，以编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
术语“多肽”和“蛋白质”此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用到氨基酸聚合物，其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物，还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
如此处所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从中制备的杂交瘤中分离的抗体、从经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体、从重组、组合人抗体库文中分离的抗体，和通过任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体，所述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪切成其它DNA序列。此类重组人抗体具有可变区，其中构架和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中，此类重组人抗体可进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是当来自并与人种系VH和VL序列相关时可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)指已经向其中引入重组表达载体的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞，还指此细胞的后代。因为某些修饰可能因突变或环境影响而在后代中出现，所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然包括在此处所用术语“宿主细胞”的范围内。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“受试者”此处可互换使用。
术语“治疗”包括施用组合物或抗体，以防止或延迟症状、并发症或疾病(例如AMD)的生物化学指征的开始，缓解症状或阻止或抑制疾病、状况或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以防止或延迟疾病开始，或防止其临床或亚临床症状的表现)或在疾病表现后治疗性抑制或缓解症状。
术语“载体”旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指已经连接额外DNA片段的环形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，如腺伴随病毒载体(AAV或AAV2)，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与所述宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明旨在包括此类其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其起等同的功能。
如此处所用，术语“C3b活性”表示C3b产生下游的补体旁路的活性，包括但不限于例如C3转变酶的活性，C5转变酶的活性。可使用此处描述的测定，如但不限于溶血测定，测定C3a和C5a产生的测定、C3b沉积测定，和膜攻击复合体(MAC)沉积测定来测定C3b活性。如此处所用，“C3b活性的改变”或“C3b活性的调节”指通过一种或多种此处描述的测定法测定C3b活性，其中C3b活性相对于相关对照增加或降低至少10％。例如，当存在抗体或片段的情况下C3b活性相对于缺少抗体或片段情况下C3b的活性降低或增加至少10％时，可以说本发明的抗体或抗原结合片段调节C3b活性。
如此处所用，术语“cyno”或“猕猴”指猕猴(Macaca fascicularis)。
附图简述
图1显示，C3b抗体以相对于C3高至少1000倍的选择性结合C3b。
图2显示了在10％人或猕猴血清中抗C3b抗体抑制溶血的能力的实例。
图3显示了C3b抗体抑制C3b产生为C3分解产物的能力的实例。
图4显示了证明C3b抗体抑制MAC沉积的能力的示例性数据。
图5显示，C3b抗体通过抑制产生C3a和C5a阻断旁路途径驱动的补体激活。
图6A显示了SDS-PAGE凝胶，其显示了tick-over转变酶活性的抑制。图6B显示了6A凝胶中对C3b产生的抑制的定量。图6C显示了抗C3b抗体抑制预形成的C3转变酶活性。
图7显示抗体C3b抗体体外抑制C5转化酶活性。
图8A显示了通过C3b抗体抑制因子B结合C3b。图8B显示了通过C3b抗体抑制因子P结合C3b。图8C显示了通过C3b抗体抑制因子H结合C3b。图8D显示了通过C3b抗体抑制C3b-C3b二聚体形成。
图9显示了针对C3d的抗体交叉反应性测定的结果。
图10显示了针对C5的抗体交叉反应性测定的结果。
图11显示了测定C3b抗体是否结合i C3b或C3c的结合测定的结果。
图12显示了物种交叉反应性研究的结果。图12A显示了大鼠交叉反应性。图12B显示了兔交叉反应性。图12C显示了猪交叉反应性。图12D显示了小鼠交叉反应性。图12E显示了豚鼠交叉反应性。图12F显示了狗交叉反应性。
发明详述
本发明部分基于这样抗体分子的发现，所述抗体分子特异性结合人和猕猴C3b。本发明涉及全长IgG形式的抗体(参阅例如，抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674和9675)以及其抗原结合片段，如Fab片段(例如，参阅抗体9124、9397、9398、9136、9141、9373和9423)。
因此，本发明提供特异性结合补体C3b蛋白(例如，人C3b，猕猴C3b)的抗体、药物组合物、生产方法和使用此类抗体和组合物的方法。
C3b抗体
本发明提供特异性结合C3b(例如，人C3b，猕猴C3b)的抗体。在一些实施方案中，本发明提供特异性结合人和猕猴C3b的抗体。本发明的抗体包括，但不限于如实施例中所述分离的人单克隆抗体。
本发明提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的氨基酸序列的VH结构域。本发明还提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含具有下文表1中列出的任何一个VH CDRs的氨基酸序列的VH CDR。具体而言，本发明提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含(或者，组成为)具有下文表1中列出的任何一个VH CDRs的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或更多VH CDRs。
本发明提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的氨基酸序列的VL结构域。本发明还提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含具有下文表1中列出的任何一个VL CDRs的氨基酸序列的VL CDR。具体而言，本发明提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体，所述抗体包含(或者，组成为)具有下文表1中列出的任何一个VL CDRs的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多VL CDRs。
本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸，其在CDR区中仍然与表1所述序列中描述的CDR区具有至少百分之60、70、80、85、90或95的同一性。在一些实施方案中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中描述的CDR区比较时CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经发生突变。
本发明还提供编码特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表1显示了抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674和9675，以及Fab片段9124、9397、9398、9136、9141、9373和9423的重链和轻链的优化核酸序列)。
表1.本发明C3b抗体、Fabs与C3b蛋白质的实例
表1
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本发明的其它抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经发生突变，但与表1中描述的序列仍然具有至少百分之60、65、70、75、80、85、90或95的同一性的那些抗体。在一些实施方案中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中描述的序列中的可变区比较时在可变区内不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经发生突变，但却保留基本相同的治疗活性。
因为这些抗体中每一抗体均可结合C3b，所以可以“混和并匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)，以产生本发明的其它C3b结合抗体。可使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA，和实施例部分中描述的其它测定法)测试此类“混和并匹配的”C3b结合抗体。当这些链进行混合和匹配时，应该用结构相似的VH序列替换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样，应该用结构相似的全长重链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列。同样，应该用结构相似的VL序列替换来自特定VH/VL配对的VL序列。同样应该用结构相似的全长轻链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列。因此，一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的氨基酸序列的重链可变域；和包含选自SEQ ID NO：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的氨基酸序列的轻链可变域；其中所述抗体特异性结合C3b(例如，人和/或猕猴C3b)。
另一方面，本发明提供(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含选自SEQID NOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的氨基酸序列的全长重链，已经优化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达；和包含选自SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的氨基酸序列的全长轻链，已经优化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达；或(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
另一方面，本发明提供C3b结合抗体，其包含如表1中所述的重链和轻链CDR1s、CDR2s和CDR3s，或其组合。所述抗体的VH CDR1s的氨基酸序列示于SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183中。所述抗体的VH CDR2s的氨基酸序列示于SEQID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184中。所述抗体的VH CDR3s的氨基酸序列示于SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185中。所述抗体的VL CDR1s的氨基酸序列示于SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186中。所述抗体的VL CDR2s的氨基酸序列示于SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187中。所述抗体的VL CDR3s的氨基酸序列示于SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188中。使用Kabat系统描绘CDR区(Kabat，E.A.，等，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。
如果这些抗体中的每一抗体均可结合C3b并且主要通过CDR1、2和3区提供抗原结合特异性，VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列就可进行“混和并匹配”(即，可将来自不同抗体的CDRs进行混和并匹配，尽管每一抗体优选含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3，以产生本发明的其它C3b结合分子)。可使用本领域已知的结合测定法和实施例中描述的那些方法(例如ELISA)来测试此类“混和并匹配的”C3b结合抗体。当VH CDR序列进行混和并匹配时，应该用结构相似的CDR序列替换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3。同样，当VL CDR序列进行混和并匹配时，应该用结构相似的CDR序列替换来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对本领域普通技术人员显而易见的是可用来自此处对本发明单克隆抗体所示的CDR序列的结构相似的序列替换一个或更多VH和/或VL CDR区来产生新的VH和VL序列。在一个实施方案中，除了上述的，此处描述的抗体的抗原结合片段可包含VHCDR1、2和3，或VL CDR 1、2和3，其中所述片段作为单个可变域结合C3b。
因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其包含：包含选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中所述抗体特异性结合C3b。
本发明包括具有表1中抗体9556的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9611的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9612的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9609的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中抗体9610的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中抗体9674的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中9675抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表1中9124抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9397抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9398抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9136抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9141抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表1中9373抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表1中9423抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
在特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：2的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：3的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：4的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：5的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：6的轻链可变区CDR3。在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：19的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：20的轻链可变区CDR3。
在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：29的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：30的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR3。在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：43的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：44的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：45的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR3。
在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：57的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：58的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：59的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：60的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：61的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：62的轻链可变区CDR3。在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：71的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：72的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：73的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：74的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：75的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：76的轻链可变区CDR3。
在另一特定实施方案中，特异性结合C3b的抗体包含SEQ ID NO：85的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：86的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：87的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：88的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：89的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：90的轻链可变区CDR3。
在某些实施方案中，特异性结合C3b的抗体是表1中描述的抗体。在优选实施方案中，结合C3b的抗体是9556。在其它优选实施方案中，结合C3b的抗体是9610。在其它优选实施方案中，结合C3b的抗体是9674。在其它优选实施方案中，结合C3b的抗体是9675。在又一其它优选实施方案中，结合C3b的抗体是9609。
如此处所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，其“产自”或“来自”特定种系序列，如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的话。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体的序列在序列上最相近(即，最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定“产自”或“来自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。“产自”或“来自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发生的体细胞突变或刻意引入定点突变的氨基酸差异。然而，在VH或VL构架区，所选人抗体在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并含有氨基酸残基，当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)比较时，其将人抗体鉴定为人的。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在VH或VL构架区具有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。人种系免疫球蛋白基因的实例包括，但不限于下文描述的可变域种系片段以及DP47和DPK9。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明提供包含与表1所述序列同源的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，并且所述抗体结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)，并保留表1所述那些抗体的期望功能性质。
例如，本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的分离的单克隆抗体(或其功能抗原结合片段)，其中所述重链可变域包含与选自SEQ ID NO：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变域包含与选自SEQ ID NO：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合C3b(例如，人和/或猕猴C3b)，并且所述抗体在溶血测定中可以抑制红细胞溶解。在特定实例中，此类抗体在10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于50nM的IC50值。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1中阐明的序列具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以相同，只是在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置上具有氨基酸替换。可通过诱变(例如定点或PCR介导诱变)分别编码SEQ ID NO：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175、189、8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的核酸分子来获得这样的抗体，所述抗体具有与表1所述的那些抗体的VH和VL区具有高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区，然后使用此处所述的功能测定法测试所编码的经改变的抗体保留的功能。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列与表1中阐明的序列具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可通过诱变(例如定点或PCR介导的诱变)分别编码此类多肽的核酸分子来获得这样的抗体，其具有分别与SEQ ID NOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191任何一个的全长重链和SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192任何一个的全长轻链具有高(即，80％或更高)同一性的全长重链和全长轻链，然后使用此处所述的功能测定法测试编码的经改变抗体保留的功能。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列与上文阐明的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在其它实施方案中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区与上文阐明的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
如此处所用，两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函数(即，％同一性等于相同位置的数量/位置总数x100)，其中考虑空位数量和每一空位长度，需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。如下文非限制性实施例所述，可使用数学算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
此外或备选地，本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索，例如来鉴定相关序列。例如，可使用Altschul等，1990 J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中一个或更多这些CDR序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明C3b结合抗体的期望功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体，或其功能抗原结合片段，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：所述重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183，及其保守修饰；所述重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184，及其保守修饰；所述重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188，及其保守修饰；所述抗体或其抗原结合片段特异性结合C3b，并在如此处所述溶血测定中抑制红细胞溶解。
在其它实施方案中，优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中一个或更多这些序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明C3b结合抗体的期望功能性质。因此，本发明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体，其由全长重链和全长轻链组成，其中：所述全长重链具有选自SEQ ID NOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的氨基酸序列，及其保守修饰；并且所述全长轻链具有选自SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的氨基酸序列，及其保守修饰；所述抗体特异性结合C3b(例如，人和/或猕猴C3b)；并且所述抗体在如此处所述的溶血测定中抑制红细胞溶解。在特定实施方案中，当使用用100pM人C5重构的人C5耗尽的血清时，此类抗体在10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于50nM的IC50值。
结合相同表位的抗体
本发明提供与表1所述C3b结合抗体结合相同表位的抗体。因此可基于它们在C3b结合测定中与本发明其它抗体交叉竞争(例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合C3b；根据非限制性理论，该抗体和与其竞争的抗体结合C3b上相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在某一实施方案中，与本发明抗体结合C3b上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如此处所述制备并分离这种人单克隆抗体。如此处所用，当竞争抗体浓度高于竞争抗体的106xKD，竞争抗体抑制本发明抗体结合C3b高于50％时，抗体“竞争”结合。
改造和修饰的抗体
还可使用具有一个或更多此处所示VH和/或VL序列的抗体作为起始材料制备本发明的抗体，以改造修饰的抗体，所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)，例如一个或更多CDR区和/或一个或更多构架区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地，可通过在恒定区内修饰残基来改造抗体，例如来改变所述抗体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区改造是CDR移植。抗体主要通过定位在六个重链和轻链互补决定区(CDRs)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDRs内的氨基酸序列在各抗体之间比CDRs外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的，所述表达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的CDR序列(参阅例如，Riechmann，L.等，1998 Nature 332：323-327；Jones，P.等，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等，1989Proc.Natl.Acad.，U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区分别包含具有选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的氨基酸序列的CDR3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区分别包含具有选自SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的氨基酸序列的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR，但仍然含有来自这些抗体的不同构架序列。
可从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类构架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，以及Kabat，E.A.，等，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH公开号91-3242；Tomlinson，I.M.，等，1992 J.fol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等，1994 Eur.J Immunol.24：827-836；各自内容此处明确引入作为参考。
用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列，例如本发明单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、2和3序列，以及VL CDR1、2和3序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基因中的序列具有相同序列的构架区上，或者所述CDR序列可移植到与种系序列相比含有一个或更多突变的构架区上。例如，已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以维持或增强抗体的抗原结合力(参阅例如，Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。可用作其上构建此处所述抗体和抗原结合片段的支架的构架包括，但不限于VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2和Vk2。额外的构架为本领域所知，并可见于例如万维网vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&MMN_position＝1:1上的vBase数据库。
另一类型的可变区修饰是在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内突变氨基酸残基，由此改善目的抗体的一种或更多结合性质(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变引入突变，并在如此处所述以及实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其它目的功能性质的影响。可引入保守修饰(如上文讨论)。所述突变可以是氨基酸替换、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供分离的C3b结合单克隆抗体，或其抗原结合片段，其由重链可变区组成，所述重链可变区具有：由选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ IDNOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的氨基酸序列，或与SEQID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
抗原结合域移植到备选构架或支架中
可使用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要所得多肽包括至少一个特异性结合C3b的抗原结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的5个主要个体基因型，并包括其它动物物种，优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体，如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面十分重要。本领域技术人员不断发现并开发新的构架、支架和片段。
一方面，本发明涉及使用其上可移植本发明CDRs的非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或未知非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对靶C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括，但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，Switzerland)、结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA，and Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)、脂笼蛋白(PierisProteolab AG，Freising，Germany)、小模块免疫药物(TrubionPharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.，MountainView，CA)、A蛋白(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，Germany)。
纤连蛋白支架基于纤连蛋白类型III结构域(例如，纤连蛋白类型III的第十个模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白类型III结构域具有在两个β折叠之间分布的7个或8个β链，所述两个β折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心，并进一步含有将β链彼此连接且暴露在溶剂中的环(与CDRs类似)。在β折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环，其中所述边缘是与β链方向垂直的蛋白质边界(参阅US 6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管总体折叠与最小功能抗体片段、在骆驼和骆马IgG中包含完整抗原识别单位的重链可变区十分相近。因为该结构，非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。这些支架可用于体外环随机化和改组策略，其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准克隆技术用本发明的CDRs替换所述分子的环区。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支架，所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的α螺旋和β转角组成的33个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
Avimers来自含有如LRP-1蛋白质的天然A结构域。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中超过250个蛋白质在结构上基于A结构域。Avimers由通过氨基酸接头连接的大量不同的“A结构域”单体(2-10)组成。可使用例如美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512和20060008844中描述的方法产生可以结合靶抗原的Avimers。
Affibody亲和配体是由基于A蛋白一个IgG结合域的支架的三螺旋束组成的小的简单蛋白质。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个随机化以产生具有大量配体变体的affibody文库(参阅例如，US5,831,012)。Affibody分子模拟抗体，它们与150kDa的抗体分子量相比具有6kDa的分子量。尽管其具有小的尺寸，但affibody分子的结合位点与抗体的结合位点类似。
Anticalins是Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，其为一大类小且坚固的蛋白质，一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。蛋白质结构表明为免疫球蛋白，在刚性构架上面具有高变环。然而，与抗体或它们的重组片段相比，脂笼蛋白由具有160到180个氨基酸残基的单条多肽链组成，仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的四环组显示明显的结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑，以识别具有高亲和力和特异性的不同形状的规定靶分子。脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)已经用于通过诱变处理四环组来开发anticalins。描述anticalins的专利申请的一个实例在PCT公开号WO 199916873中。
Affilin分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的affilin分子，每一所述文库基于来自不同人的支架蛋白。Affilin分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。目前，使用两个affilin支架，其中一个是γ晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质，另一个是“泛素”超家族蛋白质。两个人支架均非常小，显示高的温度稳定性，并对pH改变和变性剂几乎是有抵抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质扩展的β折叠结构。γ晶体蛋白来源的蛋白质的实例描述于WO200104144中，并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
蛋白质表位模拟(PEM)是模拟蛋白质β发夹二级结构的中等大小、环形的、肽样分子(MW 1-2kDa)，所述主要二级结构参与蛋白质-蛋白质相互作用。
人抗体或人源化抗体
本发明提供特异性结合C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的完全人抗体。与嵌合或人源化抗体相比，当对人受试者施用时，本发明的人C3b结合抗体具有进一步降低的抗原性。
可使用本领域已知的方法产生人C3b结合抗体。例如，人类工程技术用于将非人抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号20050008625描述了用抗体中人可变区替换非人抗体可变区的体内方法，同时维持相同或提供比非人抗体的结合性质更好的结合性质。所述方法依赖于完全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。所得人抗体一般在结构上与参考非人抗体不相关，但与所述参考抗体结合相同抗原上的相同表位。简言之，在响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下，通过在细胞中“竞争者”与参考抗体(“测试抗体”)多种杂合物的文库之间建立竞争结合有限量的抗原，使得可以进行连续表位引导的互补性替换方法。所述竞争者可以是参考抗体或其衍生物，如单链Fv片段。所述竞争者也可以是天然的或人造的抗原配体，其与参考抗体结合相同的表位。所述竞争者唯一需要的是其可以与参考抗体结合相同的表位，并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自非人参考抗体的一个共同的抗原结合V区，和从不同来源如人抗体的所有组成成分库中随机选择的其它V区。来自参考抗体的共同V区用作引导者，将所述测试抗体置于抗原上的相同表位上，并且在同一方向，从而选择是偏向于对参考抗体具有最高抗原结合保真度。
许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如，互补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体，使得仅当测试抗体结合抗原时发生片段互补的报告子激活。当测试抗体和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时，报告子激活变得依赖于所述测试抗体与竞争者竞争的能力，其与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的其它报告系统包括如美国专利申请系列号10/208,730(公开号20030198971)中公布的自抑制的报告子再激活系统(RAIR)的再激活子，或在美国专利申请系列10/076,845(公开号20030157579)中公开的竞争激活系统。
利用连续表位引导的互补替换系统，进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、抗原和报告子组分的细胞。在这些细胞中，每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例，其又与测试抗体对抗原的亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时，开始在其相对于参考抗体的活性基础上选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组“杂合”抗体，其中每一抗体包含来自参考抗体的相同非人V区和来自文库的人V区，并且每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力与参考抗体相当或更高。
在第二个V区替换步骤中，使用在第一步骤中选择的人V区作为选择同族人V区的多样文库替换剩余非人参考抗体V区的指导。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组完全人抗体，其在结构上不同于参考抗体，但与参考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在这些所选人抗体中，一个或更多抗体以与参考抗体相当或比其高的亲和力结合相同表位。
使用上文描述的一种小鼠或嵌合C3b结合抗体作为参考抗体，可容易地使用该方法来产生以相同结合特异性及相同或更高结合亲和力结合人C3b的人抗体。此外，也可从通常生产人抗体的公司，例如KaloBios，Inc.(Mountain View，CA)通过商业途径获得此类人C3b结合抗体。
骆驼(camelid)抗体
从骆驼和单峰骆驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员，包括新世界成员如骆马物种(Lama paccos、Lama glama和Lamavicugna)中获得的抗体蛋白质已经在大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于来自其它动物的抗体的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO 94/04678)。
可通过遗传改造获得鉴定为VHH的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的抗体来源蛋白质，称为“骆驼纳米抗体”。参阅1998年6月2日提交的美国专利号5,759,808；还参阅Stijlemans，B.等，2004J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin，M.等，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger，M.等2003Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等2002 Int JCancer 89：456-62；和Lauwereys，M.等1998 EMBO J 17：3512-3520。例如从Ablynx，Ghent，Belgium通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。如同非人来源的其它抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，来获得与人序列更像的序列，即纳米抗体可以进行“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
骆驼纳米抗体的分子量是人IgG分子的大概十分之一，并且所述蛋白质物理直径仅几纳米。小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的抗原位点，即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的试剂，并可能用作治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制靶蛋白质的沟或窄缝中特异位点的结合，并因而可具有这样的能力，其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且抗原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织，甚至穿过血脑屏障，可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参阅2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合表明巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)中完全表达，并用噬菌体表达为融合蛋白，且是有功能的。
因此，本发明的特征是对C3b具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在此处的某些实施方案中，所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生，即，使用此处为其它抗体描述的技术，用C3b或其肽片段免疫骆驼来产生。或者，改造，即如此处实施例中所述使用C3b作为靶标的淘选方法，通过例如从展示适当诱导的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择产生C3b结合的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体，以在受体受试者中具有从45分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中，如PCT/EP93/02214所述，通过将本发明人抗体的重链或轻链的CDRs序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
双特异性分子和多价抗体
另一方面，本发明描述了包含本发明C3b结合抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生或连接另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体)，来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其它功能分子，以产生结合多于两种不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此处所用的术语“双特异性分子”也旨在包括此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可在功能上连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)一个或更多其它结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以便产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含对C3b的至少第一种结合特异性，和对第二个靶表位的第二种结合特异性。例如，所述第二个靶表位是C3b的不同于第一个靶表位的另一表位。
此外，对于其中双特异性分子是多特异性的发明，除了第一个和第二个靶表位之外，所述分子可以还包括第三种结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，包括例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。所述抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Ladner等美国专利号4,946,778中描述的Fv或单链构建体。
双抗体是二价的双特异性分子，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，通过太短以至于不能在同一条链上两个结构域之间配对的接头连接。所述VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点(参阅例如，Holliger等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak等，1994 Structure 2：1121-1123)。可通过在同一细胞中表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)，或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链来产生双抗体。大多数的双抗体在细菌中以可溶形式表达。通过连接两条双抗体形成多肽链与大约15个氨基酸残基的接头产生单链双抗体(scDb)(参阅Holliger和Winter，1997 CancerImmunol.Immunother.，45(3-4)：128-30；Wu等，1996 Immunotechnology，2(1)：21-36)。scDb在细菌中以可溶的活性单体形式表达(参阅Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(34)：128-30；Wu等，1996Immunotechnology，2(1)：21-36；Pluckthun和Pack，1997Immunotechnology，3(2)：83-105；Ridgway等，1996 Protein Eng.，9(7)：617-21)。双抗体可融合到Fc上，以产生“二-双抗体”(参阅Lu等，2004J.Biol.Chem.，279(4)：2856-65)。
可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。
可使用本领域已知的方法，通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，可单独产生双特异性分子的每一结合特异性，然后相互缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(磺基-SMCC)(参阅例如，Karpovsky等，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括在Paulus，1985Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等，1985 Science 229：81-83和Glennie等，1987 J.Immunol.139：2367-2375中描述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两条重链的C末端铰链区的巯基成键而缀合。在特定实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，例如1个。
或者，两种结合特异性可在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达并装配。其中双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白质时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以单链分子，其包含一个单链抗体和结合决定簇，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。例如在美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述了用于制备双特异性分子的方法。
例如，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或Western印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂(例如抗体)检测特别重要的蛋白质-抗体复合物的存在。
另一方面，本发明提供多价化合物，其包含结合C3b的本发明抗体的至少两个相同或不同的抗原结合部分。所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接在一起。或者，已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过交联本发明的抗体与结合本发明抗体的恒定区，例如Fc或铰链区获得四价化合物。
例如在Borean专利EP 1 012 280B1中描述了三聚化结构域。例如在PCT/EP97/05897中描述了五聚化模块。
具有延长半衰期的抗体
本发明提供特异性结合C3b蛋白质的在体内具有延长半衰期的抗体。
许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如，肾过滤、肝中的新陈代谢、蛋白酶解酶(蛋白酶)的降解和免疫原性应答(例如，抗体的蛋白质中和及巨噬细胞和树突状细胞的吸收)。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如，通过化学连接聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体、和糖类保护层；通过遗传融合到结合血清蛋白质的蛋白质，如白蛋白、IgG、FcRn，和转移；通过偶联(遗传上或化学上)到其它结合部分，所述结合部分结合血清蛋白质，如纳米抗体、Fabs、DARPins、avimers、affibodies和anticalins；通过遗传融合rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合蛋白质和Fc；或通过掺入到nancarriers中，减缓释放制剂和医疗设备。
为了延长抗体在体内的血清循环，可使用或不使用多功能接头通过PEG位点特异性缀合到抗体N或C末端或通过赖氨酸残基上存在的ε氨基将惰性聚合分子如高分子量PEG附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一个或更多PEG基团变得附着到抗体或其片段的条件下进行反应。可利用活性PEG分子(或类似活性水溶性聚合物)通过酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如此处所用，术语“聚乙二醇”旨在包括任何的PEG形式，其已经用于衍生其它蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合的程度，来保证PEG分子与抗体的正确缀合。可通过大小排排阻或通过离子交换层析从抗体-PEG缀合物中分离未反应的PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法，例如通过此处描述的免疫测定法测试PEG衍生抗体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知，并可应用到本发明的抗体中。参阅例如，Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
其它修改的聚乙二醇化技术包括重建化学正交指导的改造技术(ReCODE PEG)，其将化学上特定的侧链通过包括tRNA合成酶和tRNA的重建系统掺入到生物合成蛋白质中。该技术能够在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中将多于30个新氨基酸掺入到生物合成蛋白质中。所述tRNA将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置，使琥珀密码子从终止密码子转化成信令化学上特定的氨基酸掺入的一个密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期延长。该技术包括将300-600个氨基酸未组织的蛋白质尾巴融合到现有的药物蛋白质上。因为该未组织蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，所以极大延长了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀合和再纯化的常规聚乙二醇化相反，该制备方法极其简化并且产品是同质的。
多唾液酸化是另一种技术，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长活性生命并提高治疗肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸的聚合物(糖)。当用于蛋白质和治疗肽药物递送时，聚唾液酸在缀合上提供保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性生命并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然见于人体中。其被某些细菌采用，所述细菌进化了超过数百万年，用所述PSA聚合物包被自身的壁。通过分子拟态，这些天然多唾液酸化细菌然后能够挫败身体的防御系统。PSA是自然界的最终偷窃技术，可容易地自此类细菌大量产生并具有预定的物理特点。甚至当与蛋白质偶联时，细菌PSA也是完全非免疫原性的，因为它与人体中的PSA在化学上相同。
另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是来自蜡状玉米淀粉的修饰的天然聚合物，并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用HES溶液来替换不足的血液体积并改善血液的流变学性质。抗体的羟乙基化使得能够通过提高分子的稳定性，以及降低肾清除率来延长循环半衰期，产生提高的生物学活性。通过改变不同的参数，如HES的分子量，可定制广泛的HES抗体缀合物。
也可通过向IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)中引入一个或更多氨基酸修饰(即，替换、插入或缺失)产生在体内具有增加的半衰期的抗体。参阅例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利号6,277,375。
另外，抗体可缀合到白蛋白(例如，人血清白蛋白；HSA)上，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知，参阅例如国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622。此外，在上文描述的双特异性抗体的背景中，可设计抗体的特异性，以便抗体的一个结合域结合C3b，而抗体的第二个结合域结合血清白蛋白，优选HSA。
提高半衰期的策略特别用于纳米抗体、基于纤连蛋白的结合子，和期望提高体内半衰期的其它抗体或蛋白质。
抗体缀合物
本发明提供特异性结合C3b蛋白质的抗体或其片段，其重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到异源蛋白质或多肽(或其片段，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)，以产生融合蛋白质。具体而言，本发明提供包含此处所述抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白质。用于融合或缀合蛋白质、多肽或肽到抗体或抗体片段上的方法为本领域所知。参阅例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO 96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等，1995，J.Immunol.154：5590-5600；和Vil等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术产生额外的融合蛋白质。可使用DNA改组来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)。一般参阅美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等，1999，J.Mol.Biol.287：265-76；以及Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques 24(2)：308-313(这些专利和出版物每一文件以其整体引入作为参考)。可在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合C3b蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或更多异源分子的一个或更多组分、基序、断片、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体或其片段可融合到标记序列上，如肽，以利于纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，其中许多可以通过商业途径获得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824中所述，六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯化。可用于纯化的其它肽标签包括，但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于来自流行性感冒血凝素蛋白质的表位(Wilson等，1984，Cell 37：767)和“flag”标签。
在其它实施方案中，本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。此类抗体可用于监测或预后疾病或病症的开始、发展、进行和/或严重性，作为临床试验程序的一部分，如测定特定治疗的功效。可通过将抗体与可检测物质偶联完成此类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；和使用多种正电子发射断层术的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。
本发明还包括缀合治疗部分的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可缀合到治疗部分，如细胞毒素，例如细胞生长抑制剂或细胞自杀剂，治疗剂或放射性金属离子，例如α粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
另外，抗体或其片段可缀合到修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分。治疗部分或药物部分不解释为限制为典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有想要的生物学活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可包括例如，毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂、抗血管生成剂；或生物反应修饰因子，例如淋巴因子。
此外，抗体可缀合到治疗部分，如放射性金属离子，如α粒子发射体，如用于将放射性金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)缀合到多肽上的213Bi或大环螯合剂。在某些实施方案中，所述大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N’”-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域所熟知，并描述于Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；和Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，每一参考文献以其整体引入作为参考。
用于将治疗部分缀合到抗体上的技术是众所周知的，参阅例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For DrugDelivery”，Controlled Drug Delivery(第2版Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review”，Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62：119-58。
抗体也可附着到固相支持体上，所述固相支持体特别用于靶抗原的免疫测定或纯化。此类固相支持体包括，但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
产生本发明抗体的方法
编码抗体的核酸
本发明提供基本纯化的核酸分子，其编码包含上文描述的C3b结合抗体链的区段或结构域的多肽。本发明的一些核酸包含编码示于SEQ ID NO：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的重链可变区的核苷酸序列，和/或编码示于SEQ ID NO：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176的轻链可变区的核苷酸序列。在特定实施方案中，核酸分子是在表1中鉴定的那些核酸分子。本发明的一些其它核酸分子包含与表1中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同(例如至少65、80％、95％或99％)的核苷酸序列。当从适当表达载体进行表达时，这些多核苷酸编码的多肽能够显示C3b抗原结合能力。
本发明还提供的是编码来自上文阐明的C3b结合抗体的重链和轻链的至少一个CDR区以及一般地所有三个CDR区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码上文阐明的C3b结合抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子的简并性，多种核酸序列编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。一些本发明的核酸序列包含编码成熟重链序列的核苷酸，所述成熟重链序列与在SEQ IDNOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191中阐明的成熟重链序列基本相同(例如，至少80％、90％或99％)。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链序列的核苷酸，所述成熟轻链序列与在SEQID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192中阐明的成熟轻链序列基本相同(例如，至少80％、90％或99％)。
可通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码C3b结合抗体或其结合片段的现有序列(例如下文实施例中描述的序列)来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法，如Narang等，1979，Meth.Enzymol.68∶90的磷酸三酯法；Brown等，Meth.Enzymol.68：109，1979的磷酸二酯法；Beaucage等，Tetra.Lett.，22：1859，1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持物法完成核酸的直接化学合成。如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.A.Erlich(编辑)，Freeman Press，NY，NY，1992；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Innis等(编辑)，Academic Press，San Diego，CA，1990；Mattila等，Nucleic Acids Res.19：967，1991；和Eckert等，PCR Methodsand Applications 1：17，1991中描述的进行通过PCR向多核苷酸序列中引入突变。
本发明还提供用于产生上文所述C3b结合抗体的表达载体和宿主细胞。可使用多种表达载体来表达编码C3b结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体，通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人工染色体(参阅例如，Harrington等，NatGenet 15：345，1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达C3b结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen，San Diego，CA)、MPSV载体，和本领域中已知用于表达其它蛋白质的许多其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参阅，Brent等，上文；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等，Cell 68：143，1992。
表达载体的选择依赖于其中待表达所述载体的预期宿主细胞。通常，所述表达载体含有有效连接编码C3b结合抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达(除了在诱导条件下之外)。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条件下扩大转化生物的培养，而不偏向编码序列的群体，宿主细胞能更好地耐受所述编码序列的表达产物。除了启动子，也需要或想要其它调节元件用于C3b结合抗体链或片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其它序列。此外，可通过包括适合于使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参阅例如，Scharf等，Results Probl.Cell Differ.20：125，1994；和Bittner等，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体也可提供分泌信号序列位置，以与插入的C3b结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白质。更经常地，所述插入的C3b结合抗体序列在包括在载体中之前连接信号序列。待用于接受编码C3b结合的抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时候也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白质，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人的恒定区。
用于携带并表达C3b结合抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌是用于克隆并表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。适于使用的其它微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，存在任何数量的多种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自λ噬菌体的启动子系统。所述启动子通常任选地与操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始并完成转录和翻译。其它微生物，如酵母也可用于表达本发明的C3b结合多肽。也可使用昆虫细胞与杆状病毒载体组合。
在一些优选的实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本发明的C3b结合多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，实施例中描述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常致死或正常或非正常永生动物或人细胞。例如，已经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。一般在例如Winnacker，FROM GENES TO CLONES，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987中讨论了哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参阅例如，Queen等，Immunol.Rev.89：49-68，1986)、和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的、和/或可调整的或可调节的。有用的启动子包括，但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。(一般参阅Sambrook，等，上文)。其它方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物射弹方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O′Hare，Cell 88：223，1997)、DNA的试剂增强的吸收和离体转导。对于重组蛋白质的长期、高产量生产，通常想要稳定表达。例如，可使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体制备稳定表达C3b结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。使用对细胞类型合适的组织培养技术增殖具有抗性的稳定转染的细胞。
本发明单克隆抗体的产生
可通过多种技术，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975 Nature 256：495的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体(mAbs)。可使用产生单克隆抗体的许多技术，例如，病毒转化或B淋巴细胞的致癌性转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源化抗体。可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并进行改造以含有非鼠类(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区(参阅例如，Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可使用本领域已知的方法将鼠类CDR区插入人构架中。参阅例如，Winter的美国专利号5225539，和Queen等的美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370。
在某一实施方案中，本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对C3b的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括此处分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在此处统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure BDA0000120426130001081
(Medarex，Inc.)含有编码未重排人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及失活内源μ和K链基因座的靶向突变(参阅例如，Lonberg，等，1994Nature368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示降低表达的小鼠IgM或K，并且响应免疫时，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力人IgGK单克隆抗体(Lonberg，N.等，1994上文；综述见于Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.，1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等，1992Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等，1993 InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：3720-3724；Choi等，1993Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等，1993EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等，1994 International Immunology 579-591；和Fishwild，D.等，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429 Surani等的美国专利号5,545,807；均为Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等的PCT公开号WO 01/14424。
在另一实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在Ishida等的PCT公开WO 02/43478中详细描述了此处称为“KM小鼠”的这种小鼠。
进一步，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得，并可用于产生本发明的C3b结合抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统。在例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述了此类小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得，并可用于产生本发明的C3b结合抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；在Tomizuka等，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述了这种小鼠。另外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中(Kuroiwa等，2002 NatureBiotechnology 20：889-894)，并可用于产生本发明的C3b结合抗体。
也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体，用于筛选人免疫球蛋白基因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法。参阅例如：Ladner等的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，在所述SCID小鼠中已经重建了人免疫细胞，使得在免疫后产生人抗体应答。例如在Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。
构架或Fc改造
本发明的改造抗体包括其中VH和/或VL内构架残基已经进行了修饰，例如以改善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或更多构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。可通过比较抗体构架序列与抗体来源的种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型，例如通过定点诱变可以将体细胞突变“回复突变”到种系序列中。此类“回复突变的”抗体也旨在包括在本发明内。
另一类型的构架修饰包括突变构架区，或甚至一个或更多CDR区内的一个或更多残基，来去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。
除了在构架或CDR区内进行修饰外或作为备选，可改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常用来改变抗体的一种或更多功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。另外，可化学修饰(例如，一个或更多化学部分可附着到抗体上)或修饰本发明的抗体以改变其糖基化，再次用于改变抗体的一种或更多功能性质。在下文中进一步详细描述了这些实施方案中每一个实施方案。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变，例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数量。在Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，例如用来便于轻链和重链装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更特别地，向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或更多氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在Ward等的美国专利号6,165,745中进一步描述了该方法。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如，可引入一个或更多以下突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物学半衰期，可在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的挽救受体结合表位，如Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022所述。
在其它实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区域，以改变抗体的效应功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或更多氨基酸，使得所述抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。在Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了该方法。
在另一实施方案中，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或更多氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在Idusogie等的美国专利号6,194,551中进一步详细描述了该方法。
在另一实施方案中，改变一个或更多氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。在Bodmer等的PCT公开WO 94/29351中进一步详细描述了该方法。
在再一实施方案中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或更多氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。在Presta的PCT公开WO 00/42072中进一步详细了描述该方法。此外，已经在人IgG1上对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图，并且已经描述了具有提高结合的变体(参阅Shields，R.L.等，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在再一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可制备无糖基化抗体(即，所述抗体缺少糖基化)。可改变糖基化，例如用来增加抗体对“抗原”的亲和力。可通过例如改变抗体序列中一个或更多糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如，可进行一个或更多氨基酸替换，由此去除该位点上的糖基化，所述氨基酸替换导致一个或更多可变区构架糖基化位点的去除。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细了描述该方法。
此外或备选地，可以制备具有改变类型糖基化的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经显示此类改变的糖基化模式提高抗体的ADCC能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变糖基化机器的细胞，并且其可用作宿主细胞，在其中表达本发明重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)-连接的糖类上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参阅Shields，R.L.等，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了经改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性提高(也参阅Umana等，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
改造改变的抗体的方法
如上讨论，此处显示的具有VH和VL序列或全长重链和轻链序列的C3b结合抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或附着到其上的恒定区产生新的C3b结合抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明C3b结合抗体的结构特征用于产生结构上相关的C3b结合抗体，其保留了本发明抗体的至少一种功能性质，如结合人C3b，以及抑制C3b的一种或更多功能性质(例如，在溶血测定中抑制红细胞溶解)。
例如，本发明抗体的一个或更多CDR区或其突变可与已知的构架区和/或其它CDRs重组组合以产生本发明额外的重组改造的C3b结合抗体，如上讨论。其它类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是此处提供的一个或更多VH和/或VL序列，或其一个或更多CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际制备(即，表达为蛋白质)具有此处提供的一个或更多VH和/或VL序列，或其一个或更多CDR区的抗体。而是，序列中包含的信息用作起始材料，来产生来自初始序列的“第二代”序列，然后制备所述“第二代”序列并将其表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供用于制备C3b结合抗体；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体序列；并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法，所述C3b结合抗体由以下组成：具有选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的CDR1序列、选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184序列，和/或选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和具有选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的CDR1序列、选自SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的CDR3序列的轻链可变区抗体序列。
因此，在另一实施方案中，本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表达的C3b结合抗体；改变全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体序列；并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法，所述C3b结合抗体由以下组成：具有选自SEQ ID NOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的序列的全长重链抗体序列；和具有选自SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列的全长轻链抗体序列。
也可通过筛选抗体文库制备改变的抗体序列，所述抗体文库具有如US20050255552中描述的固定的CDR3序列或最小基本结合决定簇以及CDR1和CDR2序列上的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术，如噬菌体展示技术进行筛选。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。所述改变的抗体序列编码的抗体是保留此处所述C3b结合抗体的一种、一些或所有功能性质的抗体，所述功能性质包括，但不限于与人和/或猕猴C3b的特异性结合；和所述抗体在溶血测定中抑制红细胞溶解。
可使用本领域中可得的标准测定法，如在实施例中阐明的那些测定法(例如，ELISA)评估经改变的抗体的功能性质。
在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中，可沿全部或部分C3b结合抗体编码序列随机或选择性引入突变，并且可如此处描述的筛选所得的经修饰C3b结合抗体的结合活性和/或其它功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合用于产生并筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的方法。
本发明抗体的表征
可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如，它们可通过它们在溶血测定中抑制红细胞溶解的能力、与C3b蛋白质(例如，人和/或猕猴C3b)的亲和力、它们抑制C3a或C5a产生的能力、它们抑制C3b沉积的能力、表位装箱(binning)、它们对蛋白酶解的抗性、及阻断补体级联的能力，例如它们抑制MAC形成的能力来表征。
多种方法可用于测定补体途径分子的存在和补体系统的激活(参阅例如，美国专利号6,087,120；和Newell等，J Lab Clin Med，100：437-44，1982)。例如，可通过(i)测定红细胞的补体介导的溶解(溶血)的抑制；(ii)测定抑制C3或C5切割的能力；和(iii)旁路途径介导的溶血的抑制来监测补体活性。
两种最常用的技术是溶血测定(参阅例如Baatrup等，Ann Rheum Dis，51：892-7，1992)和免疫学测定(参阅例如Auda等，Rheumatol Int，10：185-9，1990)。所述溶血技术测量经典或旁路途径中完整序列的功能能力。免疫学技术测量特定补体组分或裂解产物的蛋白质浓度。在本发明方法中可用于检测补体激活或测定补体组分活性的其它测定法包括，例如T细胞增殖测定(Chain等，J Immunol Methods，99：221-8，1987)和迟发型超敏反应(DTH)测定(Forstrom等，1983，Nature 303：627-629；Halliday等，1982，Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test，Academic，New York第1-26页；Koppi等，1982，Cell.Immunol.66：394-406；和美国专利号5,843,449)。
在溶血技术中，所有的补体组分必须存在且具有功能。因此，溶血技术可筛选功能完整性和补体系统的不足(参阅例如Dijk等，J ImmunolMethods 36：29-39，1980；Minh等，Clin Lab Haematol.5：23-341983；和Tanaka等，J Immunol 86：161-170，1986)。为了测定经典途径的功能能力，用溶血素包被的羊红细胞(针对绵羊红细胞的兔IgG)或用兔抗鸡抗体致敏的鸡红细胞用作靶细胞(致敏细胞)。这些Ag-Ab复合体激活了经典途径，并当所述组分有功能且以足够浓度存在时导致靶细胞的溶解。为了确定旁路途径的功能能力，兔红细胞用作靶细胞(参阅例如美国专利号6,087,120)。
为了测试抗体抑制MAC(膜攻击复合体)形成的能力，可进行MAC沉积测定。简言之，酵母多糖可用于激活旁路途径，并且IgM可用于激活经典途径。用人血清预温育Fabs，并将其加到用酵母多糖或IgM包被的平板中。可计算每一样品的MAC沉积相对于基线(EDTA处理的人血清)和阳性对照(人血清)的百分比抑制。
为了测试本发明抗体在替代途径中抑制补体蛋白C3的能力，测定在酵母多糖上沉积的C3分解产物C3b的产生。在下文实施例中详细描述了用于测定C3b沉积的特定方法。
可通过例如使用特异性抗C5a抗体，如从US Biologics获得的小鼠抗人C5a-des-Arg抗体的ELISA测定法抗体抑制测定C5分解产物C5a的产生的能力。
可通过直接标记目的抗体检测抗体结合C3b的能力，或不标记抗体并使用本领域中已知的多种夹层测定法间接检测结合。
在一些实施方案中，本发明的C3b结合抗体阻断或竞争参考C3b结合抗体与C3b多肽的结合。这些可以是上文描述的完全人C3b结合抗体。它们也可以是其它小鼠、嵌合或人源化C3b结合抗体，其与参考抗体结合相同的表位。阻断或竞争参考抗体结合的能力表明测试中的C3b结合抗体结合参考抗体定义的相同或相似表位，或与参考C3b结合抗体结合的表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能具有为参考抗体鉴定到的有利性质。可通过例如竞争结合测定法来确定阻断参考抗体或与其竞争的能力。利用竞争结合测定法，检测测试中的抗体抑制参考抗体特异结合共同抗原，如C3b多肽的能力。如果过量的测试抗体基本抑制参考抗体的结合，那么测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑制表示测试抗体降低参考抗体的特异结合通常至少10％、25％、50％、75％或90％。
有许多已知的竞争结合测定法，其可用于评估C3b结合抗体与参考C3b结合抗体竞争结合C3b蛋白质。这些测定法包括，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹层竞争测定(参阅Stahli等，Methods in Enzymology 9：242-253，1983)；固相直接生物素-亲和素EIA(参阅Kirkland等，J.Immunol.137：3614-3619，1986)；固相直接标记测定、固相直接标记夹层测定(参阅Harlow&Lane，上文)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参阅Morel等，Molec.Immunol.25：7-15，1988)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology 176：546-552，1990)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32：77-82，1990)。通常，这种测定包括使用结合到固体表面或细胞的纯化抗原，所述固体表面或细胞携带未标记的测试C3b结合抗体和标记的参考抗体中任何一种。通过测定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞上的标记的量来测定竞争抑制。所述测试抗体一般过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体，所述临近表位与参考抗体结合的表位足够接近以发生位阻。
为了测定所选的C3b结合单克隆抗体是否结合唯一的表位，可使用市售试剂(例如，来自Pierce，Rockford，IL的试剂)将每一抗体生物素化。可使用C3b多肽包被的ELISA平板，使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可利用链霉抗生物素蛋白-亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb结合。为了测定纯化的C3b结合抗体的同种型，可进行同种型ELISA。例如，可用1μg/ml抗人IgG在4℃下过夜包被微量滴定板的孔。用1％BSA封闭后，平板与1μg/ml或更少的单克隆C3b结合抗体或纯化的同种型对照在室温下反应1到2小时。所述孔然后与人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。然后将平板显影，并对其进行分析，以便测定纯化抗体的同种型。
为了证明单克隆C3b结合抗体与表达C3b多肽的肝细胞的结合，可使用流式细胞术。简言之，表达C3b的细胞系(在标准生长条件下生长)可与含0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中多种浓度的C3b结合抗体混和，并在37℃下温育1小时。洗涤后，细胞与萤光素标记的抗人IgG抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过FACScan仪器使用光和侧向散射性质门控单个细胞来分析样品。(除了或者替代)流式细胞术测定外，还可使用利用荧光显微术的备选测定法。可如上所述将细胞染色，并通过荧光显微术检测所述细胞。该方法允许显示单个细胞，但根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
可通过蛋白质印迹进一步测试本发明的C3b结合抗体与C3b多肽或抗原片段的反应性。简言之，可制备纯化的C3b多肽或融合蛋白质，或来自表达C3b的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝基纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)显色。
在下文实施例部分也描述了功能测定的实例。
预防和治疗用途
本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗与提高的补体活性相关的疾病或病症的方法。在特定实施方案中，本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法。
尤其可使用本发明的抗体来预防干性AMD向湿性AMD的发展、减慢和/或防止地图样萎缩的发展、治疗或预防黄斑水肿、和改善因干性AMD发展引起的视力丧失。其也可以与抗VEGF治疗组合使用来治疗湿性AMD患者。
在一些实施方案中，本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗补体相关疾病或病症的方法。已知补体相关疾病或病症的实例包括：神经障碍、多发性硬化、中风、吉-巴综合征、外伤性脑损伤、帕金森病、不恰当或不想要补体激活的疾病、血液透析并发症、超急性同种异体移植物排斥、异种移植物排斥、IL-2治疗过程中白细胞介素2诱导的毒性、炎性疾病、自身免疫病炎症、克隆病、成人呼吸道窘迫综合征、包括烧伤或冻伤的热伤、局部缺血后再灌注状况、心肌梗塞、气囊血管成形术、心肺转流术或肾脏转流术中的泵后综合征、血液透析、肾缺血、表面重建后肠系膜动脉再灌注、传染病或脓毒、免疫复合物病症和自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、SLE肾炎、增殖性肾炎、溶血性贫血、和重症肌无力。此外，其它已知补体相关疾病是肺部疾病和病症，如呼吸困难、咯血、ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、肺栓塞和梗塞、肺炎、致纤维化粉尘疾病、惰性粉尘和矿物质(例如，硅、煤炭粉末、铍和石棉)、肺纤维化、有机粉尘疾病、化学损伤(因刺激性气体和化学物质，例如氯、光气、二氧化硫、硫化氢、二氧化氮、铵和盐酸)、烟雾损伤、热损伤(例如，烧伤、冻伤)、哮喘、变态反应、支气管收缩、超敏感性肺炎、寄生虫病、肺出血肾炎综合征、肺血管炎和免疫复合物相关的炎症。
在特定实施方案中，本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗补体相关疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症是哮喘、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、自身免疫性心脏病、多发性硬化、炎性肠病、缺血-再灌注损伤、巴-西综合征、血液透析、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化、移植、中枢神经系统疾病如阿尔茨海默氏病和其它神经变性状况、aHUS、肾小球肾炎、大疱性类天疱疮或MPGNII。
在特定实施方案中，本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物来治疗肾小球肾炎的方法。肾小球肾炎的症状包括，但不限于蛋白尿；降低的肾小球滤过率(GFR)；血清电解质改变，包括氮质血症(尿毒症、过度血尿氮-BUN)和盐滞留，致使水滞留，导致高血压和水肿；血尿和异常尿沉淀，包括红细胞管型；低白蛋白血症；高脂血症；和脂肪尿。在特定实施方案中，本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物来治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的方法。
在特定实施方案中，本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物来减少与体外循环相关的免疫和止血系统功能异常的方法。本发明的抗体可用于任何方法中，所述方法涉及使患者血管中血液循环穿过导管，并回流到患者血管中，所述导管具有网眼表面，所述网眼表面包含能够引起补体激活、血小板激活、白细胞激活或血小板-白细胞粘着至少一种的材料。此类方法包括，但不限于所有形式的ECC，以及涉及向患者血液循环中引入人工或外源器官、组织或血管的方法。
也可利用治疗与黄斑变性相关状况的已知方法，如在美国专利号6,218,368中描述的抗生素治疗向待用本发明治疗剂治疗的受试者施用其它治疗剂。在其它治疗中，免疫抑制剂如环孢菌素是能够抑制免疫应答的治疗剂。这些治疗剂包括细胞毒性药物、皮质类固醇、非类固醇抗炎药物(NSAIDs)、特异的T淋巴细胞免疫抑制剂，和抗体或其片段(参阅Physicians′Desk Reference，第53版，Medical Economics Company Inc.，Montvale，N.J.(1999))。通常以一周、一个月、三个月、六个月或一年的间隔继续免疫抑制治疗。在一些患者中，在患者余生中施用治疗。
当本发明的治疗剂与另一治疗剂一起施用时，可以任何顺序连续施用或同时施用两种治疗剂。在一些方面，本发明的抗体向也接受第二种治疗剂(例如维替泊芬)治疗的受试者施用。另一方面，结合分子与外科治疗结合施用。
与C3b结合抗体组合治疗的合适治疗剂包括本领域中已知的治疗剂，其能够调节补体组分的活性(参阅例如，美国专利号5,808,109)。已经报道其它治疗剂降低补体介导的活性。此类治疗剂包括：氨基酸(Takada，Y.等Immunology 1978，34，509)；膦酸酯(Becker，L.Biochem.Biophy.Acta 1967，147，289)、聚阴离子物质(Conrow，R.B.等J.Med.Chem.1980，23，242)；磺酰氟(Hansch，C.；Yoshimoto，M.J.Med.Chem.1974，17，1160，和其中引用的参考文献)；多核苷酸(DeClercq，P.F.等Biochem.Biophys.Res.Commun.1975，67，255)；海松酸(Glovsky，M.M.等J.Immunol.1969，102，1)；卟吩(Lapidus，M.和Tomasco，J.Immunopharmacol.1981，3，137)；一些抗炎药(Burge，J.J.等J.Immunol.1978，120，1625)；酚类(Muller-Eberhard，H.J.1978，Molecular Basis of Biological DegradativeProcesses，Berlin，R.D.等，编辑Academic Press，New York，第65页)；和苄脒类(Vogt，W.等Immunology 1979，36，138)。这些治疗剂中的一些治疗剂通过一般性抑制蛋白酶和酯酶起作用。其它治疗剂对补体途径中任何特定中间步骤并不是特异的，但是却抑制补体激活的一个以上的步骤。后面化合物的实例包括苄脒类，其阻断C1、C4和C3b的利用(参阅例如Vogt等Immunol.1979，36，138)。
可抑制补体组分活性的本领域已知的额外治疗剂包括来自葡萄穗霉属(Stachybotrys)的真菌代谢物K-76(Corey等，J.Amer.Chem.Soc.104：5551，1982)。已经显示K-76和K-76COOH主要在C3b步抑制补体(Hong等，J.Immunol.122：2418，1979；Miyazaki等，Microbiol.Immunol.24：1091，1980)，并防止从正常人补体中产生趋化因子(Bumpers等，Lab.Clinc.Med.102：421，1983)。在高浓度的K-76或K-76COOH中，显示了对C2、C3、C6、C7和C9与其各自先前媒介物的反应的一定抑制。也已经报道了K-76或K-76COOH抑制补体的C3b激活系统(Hong等，J.Immunol.127：104-108，1981)。用于实践本发明方法的其它合适治疗剂包括灰黄霉素(griseofulvin)(Weinberg，Principles of Medicinal Chemistry，第2版，Foye，W.O.，编辑，Lea&Febiger，Philadelphia，Pa.，第813页，1981)、isopannarin(Djura等，Aust.J.Chem.36：1057，1983)和Siphonodictyoncoralli-phagum的代谢物(Sullivan等，Tetrahedron 37：979，1981)。
组合治疗方案可以是累加的，或其可以产生协同结果(例如，补体途径活性的减少超出组合使用两种治疗剂的预期)。在一些实施方案中，本发明提供使用本发明的C3b结合抗体和抗血管发生剂，如抗VEGF治疗剂来预防和/或治疗AMD或如上所述另一补体相关疾病的组合治疗。
诊断用途
一方面，本发明包括用于在生物学样品(例如，血液、血清、细胞、组织)的背景中或遭受疾病或病症、或处于发生与AMD相关病症的风险的个体中测定C3b蛋白质和/或核酸表达以及C3b蛋白质功能的诊断测定法。
诊断测定法，如竞争性测定法依赖于标记的类似物(“示踪物”)与测试样品分析物竞争共同结合配偶体上有限数量的结合位点的能力。结合配偶体一般在竞争前或竞争后不溶解，然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通过倾析(其中结合配偶体预先不溶解)或通过离心(其中竞争反应后结合配偶体沉淀)完成该分离。如通过标记物质的量测定，测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。制备已知量的分析物的剂量反应曲线，并与测试结果进行比较，以定量测定测试样品中存在的分析物的量。当酶用作检测标记时，这些测定称为ELISA系统。在该形式的测定中，抗体与C3b结合抗体之间的竞争性结合导致结合的C3b蛋白质，优选本发明的C3b表位成为血清样品中抗体的量度，最特别的是中和血清样品中的抗体。
测定的显著优势是直接对中和抗体(即，干扰与C3b蛋白质，尤其是表位结合的那些抗体)进行测定。这种测定，特别是ELISA测试形式在临床环境和常规血液筛查中具有相当多的应用。
免疫学技术使用针对多种补体组分(例如C3、C4、C5)的不同表位的多克隆或单克隆抗体来检测例如，补体组分的裂解产物(参阅例如，Hugli等，Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460，1980；Gorski等，JImmunol Meth 47：61-73，1981；Linder等，J Immunol Meth 47：49-59，1981；和Burger等，J Immunol 141：553-558，1988)。然后可测定抗体与所述裂解产物和已知浓度的标记裂解产物的竞争结合。可获得多种测定，如放射免疫测定、ELISA′s和放射扩散测定来检测补体裂解产物。
免疫学技术提供高灵敏度来检测补体激活，因为它们允许测定来自患有或不患有黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者的血液中裂解产物的形成。因此，在本发明的一些实施方案中，通过测试受试者的血浆中补体组分的可溶性裂解产物的定量来测定异常补体激活以获得对眼病症相关病症的诊断。如在Chenoweth等，N Engl J Med 304：497-502，1981；和Bhakdi等，Biochim Biophys Acta 737：343-372，1983中描述进行测定。优选地，仅测定体内形成的补体激活。这可通过在含有补体系统的抑制剂的培养基中收集来自受试者的生物学样品(例如血清)，随后在所述样品中测定补体激活(例如裂解产物的定量)来完成。
在患有眼疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中，补体蛋白质的检测与来自正常受试者的相应生物学样品中的水平的比较表明患者患有与黄斑变性相关的病症。
在US2006/0067935中描述了体内诊断或成像。简言之，这些方法一般包括向患者施用或引入诊断有效量的C3b结合分子，其有效附着到通过非创性方法可检测的标记或标签上。允许抗体-标记缀合物足够时间定位并结合眼睛内的补体蛋白质。然后将所述患者暴露在检测设备下来鉴定可检测标记，因此在患者眼睛中形成C3b结合分子的定位图像。通过检测抗体-标记是否结合眼睛的组分来检测C3b结合抗体或其抗原结合片段的存在。与未患有AMD疾病的正常个体相比，所选补体蛋白质或蛋白质组合增加水平的检测表明与黄斑变性相关的病症的倾向性和/或发作。也优选本发明的这些方面用于眼睛成像方法以及组合的血管发生诊断和治疗方法。
本发明还涉及预测医学领域，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，由此预防性治疗个体。
本发明还提供用于测定个体是否具有发生与补体途径活性失调相关病症的风险的预后(或预测)测定法。例如，可测定生物学样品中C3b基因中的突变。此类测定法可用于预后或预测目的，由此在病症发作之前预防性治疗个体，所述病症的特征在于C3b蛋白质、核酸表达或活性或与其相关。
本发明的另一方面提供用于在个体中测定C3b核酸表达或C3b蛋白质活性的方法，由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂(此处称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型来选择治疗剂(例如，药物)用于个体的治疗性或预防性治疗(例如，检查个体的基因型以测定所述个体对特定治疗剂应答的能力)。
本发明的另一方面涉及在临床试验中监测治疗剂(例如，药物)对C3b蛋白质的表达或活性的影响。
药物组合物
本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的C3b结合抗体(完整的或结合片段)的药物组合物。所述组合物可额外地含有适合于治疗或预防补体相关疾病(例如AMD)的一种或更多其它治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或者可用于利于组合物的制备。药学上可接受的载体包括，生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
可通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和/或方式根据想要的结果而变化。优选静脉、肌内、腹膜内、或皮下施用、或在靶位点附近施用。在特定实施方案中，配制本发明的抗体，使得它们可经玻璃体内向眼睛施用。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，可以材料包衣活性化合物，即抗体，双特异和多特异分子，以保护所述化合物免于酸和可能失活所述化合物的其它自然条件的作用。
组合物应该是无菌且是流体的。可使用包衣，如卵磷脂，在分散情况下维持需要的颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。可通过在组合物中引入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝或明胶)产生可注射组合物的长期吸收。
可根据本领域所熟知的且常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参阅例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，MackPublishing Co.，第20版，2000；和Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。优选在GMP条件下制备药物组合物。通常，在本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的C3b结合抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将C3b结合抗体配制成药学上可接受的剂量形式。调整剂量方案来提供最想要的应答(例如，治疗应答)。例如，可施用快速灌注，可随时间施用若干分份剂量或根据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其利于容易施用和剂量的均一性。此处所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单一剂量的物理分离单位；每一单位含有预定量的活性化合物，其经计算以产生与需要的药学载体相关的想要的治疗效果。
可改变本发明药物组合物中活性成份的实际剂量水平，以获得活性成份的量，其对特定患者、组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答，而对所述患者无毒。所选剂量水平依赖于多种药物代谢动力学因素，包括所用本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、年龄、性别、体重、状况、一般健康和待治疗患者的先前医疗史等因素。
医师或兽医可以比需要达到想要的治疗效果更低的水平开始施用药物组合物中所用本发明抗体的剂量，并逐渐增加剂量，直至达到想要的效果。一般地，用于治疗此处描述的变应性炎性病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药剂、以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以使安全性和效力达到最佳。对于抗体的全身施用，剂量范围在约0.0001到100mg/kg宿主体重，并更一般在0.01到15mg/kg宿主体重之间。示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每3到6个月一次进行全身施用。对于抗体的玻璃体内施用，剂量范围在约0.0001到约10mg之间。示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每3到6个月一次进行全身施用。
一般在多种情况下施用抗体。单次剂量的间隔可以是每周一次、每月一次或每年一次。如通过测定患者中C3b结合抗体的血液水平指示，间隔也可以是不规则的。在全身施用的一些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中达到25-500μg/ml。或者，抗体可作为持续释放制剂施用，在所述情况下需要更不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地，人源化抗体比嵌合抗体和非人抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量，直至疾病的发展减慢或终止，并优选直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。此后，可对患者施用预防性方案。
实施例
提供以下实施例来进一步阐明本发明，但不限制其范围。本发明的其它变型对本领域的普通技术人员而言是显而易见的并包括在所附权利要求中。
实施例1：抗原的产生和质量控制
生物素化C3b的产生
使用来自的Pierce标记试剂，以20倍摩尔过量的生物素化试剂生物化纯化的C3b。在室温下进行生物素化，并使用0.5ml Zeba Spin脱盐柱分离未缀合的生物素。使用EZ-Link NHS-LC-LC-生物素标记C3b的赖氨酸残基，并使用EZ-Link Maleimide-PEG2-生物素标记半胱氨酸残基。使用HABA测定和LC-MS/MS定量生物素化的程度。通过LC-MS/MS验证参与C3上硫酯键形成的单个半胱氨酸的生物素化。
结合琼脂糖珠子的C3b的产生
使用来自Amersham Biosciences(17-0851-01)的PD-10脱盐柱将纯化的C3b(Quidel A413，lot 903726)缓冲液交换成偶联缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH 8.5)。SulfoLink偶联凝胶(Pierce 20401)和所有其它试剂均平衡至室温。以4凝胶床体积的偶联缓冲液平衡SulfoLink偶联凝胶，并离心，去除上清液。然后将缓冲液交换的C3b蛋白溶液加入到离心平衡的SulfoLink偶联凝胶(SulfoLink Coupling Gel)中。混合物在室温下摇动15分钟，然后在不混合的情况下保持静止30分钟。然后用3凝胶床体积的偶联缓冲液洗涤缀合的C3b偶联凝胶。然后，向C3b偶联凝胶中加入1凝胶床体积的Quenching Reagent(偶联缓冲液中50mM L-半胱氨酸-HCL(44889))，并在室温下保持摇动15分钟。15分钟后，缀合的C3b偶联凝胶在室温下不混合的情况下保持30分钟。用至少6凝胶床体积的洗涤溶液(1M NaCl)洗涤缀合的C3b偶联凝胶，然后用2凝胶床体积的除气StorageBuffer(含有0.05％叠氮化纳的磷酸盐缓冲盐水)进行洗涤。最后的步骤是向凝胶床体积中加入1凝胶床体积的Storage Buffer至估计1mg/ml的蛋白质。
C3b-SulfoLink偶联凝胶蛋白浓度测定
以下量的C3b在还原条件下4-12％变性蛋白质凝胶上运行：2μg、1.5μg、1μg、0.75μg、0.5μg和0.25μg。在这些泳道后，还将2μl、4μl和8μl的50％珠子悬浮液(C3b偶联凝胶)在还原性条件下上样。由于α链与珠子共价连接，它在蛋白质凝胶上将不会出现，因此通过比较β链来测定蛋白质浓度。估计1μl的偶联凝胶有约1μg的C3b，因此可获得大于90％的偶联效率。
计算在SulfoLink偶联凝胶上活性C3b百分比
用在4种不同浓度(0.122μM、0.244μM、0.367μM和0.489μM)的因子B、固定浓度的可溶性C3b(所有4种浓度均为0.294μM)和固定浓度的因子D(所有4种浓度均为0.47μM)设置四种对照。从这些对照反应中省略因子P。反应在37℃下温育15分钟。此时将所有对照样品立即加入到4X的样品缓冲液中并放于95℃10分钟，以稍后在4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上电泳。C3b偶联的珠子浓度为每1mg柱床体积约1mg C3b。以下7个反应由0.294μM固定浓度的偶联C3b的珠子、2.68μM固定浓度的因子P和0.95μM固定浓度的因子D组成。因子B的浓度如下：0.367μM、0.489μM、0.978μM、1.467μM、1.955μM、2.933μM和3.910μM。对于这7个反应，除因子D外均在37℃下温育30分钟。经30分钟温育后，加入0.95uM的因子D并将反应温育2分钟。此时将所有样品立即加入到4X样品缓冲液中并在还原性条件下在4-12％Bis-Tris凝胶上电泳。当分析数据时，在所有泳道中比较Bb条带。
珠子-C3b稳定性
在C3b-SulfoLink偶联凝胶缀合后，将珠子离心并在100％甘油(使甘油终浓度为50％)中轻轻重悬浮。随后将珠子置于-80℃进行几次冻融(检测了高达3次)。随后在冰上解冻珠子并转移至15ml锥形管中。加入5柱体积的1XPBS来重悬浮珠子。将其在850g离心5分钟。完成用10柱体积的1XPBS进行的两次额外洗涤。最终步骤是用1XPBS重悬浮珠子获得终浓度50％的浆料溶液。每次冻融检测Bb产生：与3μM因子B、0.5μM因子D、1μM的C3b珠子和5mM的MgCl温育1小时并寻找完全的Bb产生。除此之外，在-80℃储存几周后经Bb产生检测冰冻的珠子。
Cyno C3的纯化和Cyno C3b的产生
Cyno血浆购自Alphagenesis(Yemassee，SC)。用PBS、10mM EDTA和2份完全的混和抑制剂片剂(Roche)将50ml血浆稀释到200ml。缓慢将40％的PEG6000加入到溶液中至终浓度为4％，并在4度轻轻搅拌额外30分钟。通过在17,500rpm下离心20分钟去除沉淀。再次将PEG6000加入到上清液中至终浓度为12.5％并在4度搅拌30分钟。17,500rpm下离心20分钟后去除上清液。在50ml 1XPBS、10mM EDTA缓冲液中再次溶解沉淀，并将含C3的溶液通过15ml的蛋白质G(GE)柱子两次以去除CynoIgG。用4L 20mM Tris pH 8.0、10mM EDTA对来自蛋白质G柱子的流出液透析过夜。同时，用0.5M NaOH将20ml MonoQ柱(GE)清洗，并随后用水和大量体积的20mM Tris pH8.0和10mM EDTA清洗直至柱基线清楚且平衡。随后将透析的溶液装载至ATKA 100(GE)的MonoQ柱中，流速为0.8ml/分钟。装载后，用10柱体积的20mM Tris pH 8.0和10mM EDTA洗涤柱子或直至基线达到稳定。用20柱体积的从0至500mM的NaCl线性梯度将所述蛋白质从柱子上洗脱下来并以4ml/管收集级分。在非还原和还原性条件下经SDS-PAGE凝胶鉴定级分中的C3蛋白峰。进一步经蛋白质印迹和MS肽谱分析验证C3。随后将纯度为85％的C3级分混合并用PBS缓冲液通过2660sephacryl 300凝胶过滤柱(GE)进一步纯化。同样经SDS-PAGE和MS分析证实C3峰级分。混合纯的级分并用millipore浓缩器浓缩至约1mg/ml，等份分装并保存在-80度冰箱用于后续使用。
在PBS缓冲液中将Cyno C3稀释至500ug/ml。通过在PBS缓冲液中加入0.4μM fB(Comptech)、0.05μM fD(CompTech)和5mM MgCl2将C3完全转化为C3b，并在室温温育30分钟。随后通过2660sephacryl 300凝胶过滤柱将所述C3b进一步纯化。混合含C3b的峰组分，其由millipore浓缩器浓缩。在C3转化酶测定中检测cyno C3b的活性。所述蛋白质显示出与人C3b(CompTech)相当的Bb产生活性。
通过补体因子和商品化抗体结合进行C3b试剂的质量控制
酶联免疫吸附测定(ELISA)结合(表位保守性)
在ELISA中比较生物素化的C3b分子和非生物素化的C3b，来评估由市售抗体识别的C3b表位的保守性。
用包被缓冲液(碳酸氢盐pH 9.5-9.8)中2μg/ml的100μl/孔市售抗C3或抗C3b抗体包被Maxisorp板，并将其在4℃温育过夜。用PBST洗涤3次后，用300μl/孔稀释剂(Synblock，AbD Serotec)在室温下封闭所述板2小时。抽出封闭溶液后，在稀释剂中稀释的100μl C3b(+/-生物素)样品在室温下温育1小时。加入在稀释剂(多聚HRP稀释剂)中1∶5000稀释的100μl/孔Strep-HRP(聚HRP链霉抗生物素蛋白)或HRP缀合的抗C3Ab 30分钟。用PBST洗涤4次后，加入100μl/孔TMB底物(Ultra TMB底物溶液)5-10分钟。通过50μl/孔的终止液(2N H2SO4)来终止反应。读取吸光度(A450-A570)并使用SoftMax Pro分析数据。
通过补体因子和商业化Abs的结合
检测琼脂糖珠子上固定的C3b其结合商业化抗体和补体因子蛋白的能力。
向各管中加入4μl的C3b珠子浆料(对应于～1μg的C3b)。将珠子重悬浮于100μl稀释剂中。然后利用稀释剂+Ab或补体因子蛋白使管中的总体积达到200μl。在室温下摇动管1小时，然后用稀释剂洗涤1次。向小柱中应用珠子浆料，并再洗涤2次。快速甩出剩余的液体(1,200G，1分钟)。塞紧柱子，然后加入稀释剂中500μl的二级抗体或抗补体因子Ab(1∶5000)。在室温下温育1小时，然后用稀释剂洗涤4次。[对于补体因子，利用二级Ab重复上述步骤]。快速甩出剩余的液体(1,200G，1分钟)。填充柱子，然后加入100μl的TMB底物。将液体快速甩入(1,200G，1分钟)新鲜管中。转移溶液到96孔板中。用50μl/孔终止溶液(2N H2SO4)终止反应。读取吸光度(A450-A570)，并使用SoftMax Pro分析数据。
实施例2：从HuCAL
Figure BDA0000120426130001291
文库中产生C3b特异性抗体
使用市售噬菌体展示文库Morphosys HuCAL
Figure BDA0000120426130001292
文库作为抗体变体蛋白质来源，通过选择具有高结合亲和力的克隆产生抗C3b抗体。HuCAL
Figure BDA0000120426130001293
文库是Fab文库(Knappik等，2000)，其中所有六个CDR均因适当突变而变得多样化，并且其使用CysDisplay TM技术将Fab连接到噬菌体表面(例如见WO01/05950)。
HuCAL
Figure BDA0000120426130001294
噬菌体-抗体提供为12个单独的子库：VH1κ、VH1λ、VH2κ、VH2λ、VH3κ、VH3λ、VH4κ、VH4λ、VH5κ、VH5λ、VH6κ、VH6λ。根据特定实验需要，可以任何组合混合12个子库。对于结合C3b的抗体的选择，应用三种不同的淘选策略：
a)利用生物素化的人C3b的溶液淘选，其中通过链霉抗生物素蛋白磁珠捕获噬菌体-抗原复合体，
b)基于珠子的淘选，其中C3b结合到琼脂糖珠子上，和
c)差异肽淘选，其中偶联到载体蛋白的肽上的选择循环与全长C3b(结合琼脂糖珠子的生物素化)上的选择循环交替进行。
噬菌粒复苏、噬菌体扩增和纯化
在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2xYT培养基(2xYT-CG)中扩增HuCAL
Figure BDA0000120426130001295
文库。在用OD600nm为0.5的VCSM13辅助噬菌体感染后(37℃下不摇动，30分钟；37℃下250rpm摇动30分钟)，将细胞离心(4120g；5分钟；4℃)，在2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中重悬浮，并在22℃下培养过夜。从上清液中PEG沉淀噬菌体，将其在PBS/20％甘油中重悬浮并储存在-80℃。如下进行两个淘选循环之间的噬菌体扩增：用洗脱的噬菌体感染对数中期大肠杆菌TG1细胞并接种到补充有1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB琼脂(LB-CG平板)上。在30℃下过夜温育后，从琼脂平板上刮去所述TG1菌落，并将其用于接种2xYT-CG，直至达到0.5的OD600nm。如上所述加入VCSM13辅助噬菌体用于感染。
溶液淘选
用于该淘选策略中的抗原是生物素化的C3b。存在生物素化C3b的两种不同生物素化的变体。在一种变体中，生物素通过附着到C3b上半胱氨酸残基的马来酰亚胺-PEG-接头连接C3b。该变体在下文中称为C3b-半胱氨酸-生物素。在另一变体中，生物素通过附着到C3b上的3个不同赖氨酸残基的磺基-NHS-LCLC-接头连接C3b。该变体在下文中称为C3b-赖氨酸-生物素。在选择循环中交替进行两种不同变体上的选择，以不选择结合接头分子的噬菌体。
用PBS洗涤链霉抗生物素蛋白磁珠(Dynabeads M-280；Dynal)一次，并用Chemiblocker在室温下封闭2小时。还在旋转器上利用Chemiblocker在室温下封闭PBS洗脱的噬菌体1-2小时。封闭的噬菌体针对封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠预吸附两次30分钟。将噬菌体上清液转移到新封闭的2ml反应管中，加入人生物素化的C3b，并将混合物在室温下旋转器上温育1-2小时。向各淘选库中加入100μl封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠，并在旋转器上温育20分钟。用颗粒分离器(Dynal MPC-E)收集珠子大概2.5分钟，并小心地去除溶液。
然后使用旋转器在PBST中洗涤珠子7次，随后用PBS再洗涤3次。向各管中加入10mM Tris/HCl pH 8中的200μl 20mM DTT从Dynabeads上洗脱噬菌体，并温育10分钟。通过磁性颗粒分离器去除Dynabeads，并向生长至OD600nm为0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG-1培养物中加入上清液。为了噬菌体感染，在37℃下50ml塑料管中不摇动情况下温育所述培养物45分钟。4120xg离心5分钟后，细菌沉淀物各自在800μl 2xYT培养基中重悬浮，接种到3xYT-CG琼脂平板上，并在37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落，如上所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择。
为了选择C3b特异性噬菌体，在多个子库中应用利用C3蛋白质的几种不同封闭方法。一般地，当用Chemiblocker封闭噬菌体时，加入纯化的C3或含有C3的血清，并在旋转器上温育1-2小时。因此，当与C3b接触时，可能的C3b/C3交叉反应性噬菌体应该已结合到抗原上并应仅选择C3b特异性噬菌体。对于淘选1812.1，以10倍摩尔过量加入纯化的C3(仅在第一轮过程中)。对淘选1889的子库1-6不应用封闭。对于子库7-12，在所有三轮选择中应用使用人血清的多种封闭条件。对于子库7和8，加入未稀释的人血清，产生超过C3b大约70倍摩尔过量的C3。因为我们担心血清因子可能降解C3b，所以加入蛋白酶抑制剂(Pefabloc SC，Roche，终浓度4mM)。对于子库9-12，加入稀释的人血清，产生超过C3b大约2倍摩尔过量的C3。子库9和10含有蛋白质抑制剂，对于库11和12不加入抑制剂。
基于珠子的淘选
用于基于珠子淘选的抗原是偶联sulfolink琼脂糖珠子的C3b。通过MorphoSys利用半胱氨酸(来自SulfoLink Immobilization Trial Kit)处理琼脂糖珠子(SulfoLink Coupling Gel)产生用于将噬菌体预吸附到封闭的柱子上的珠子，所述半胱氨酸封闭珠子上所有可能的结合位点。
在旋转器上室温下，用Chemiblocker封闭PBS稀释的噬菌体1-2小时。封闭的噬菌体预吸附封闭的琼脂糖珠子两次，30分钟。将噬菌体上清液转移到新的封闭的2ml反应管中，加入偶联人C3b的琼脂糖珠子，并在旋转器上室温下温育混合物1-2小时。通过在台式离心机中离心(1000g，1分钟)收集琼脂糖珠子，并去除上清液。通过在1ml洗涤缓冲液中温和重悬浮、在洗涤缓冲液中温育并通过离心收集来反复洗涤沉淀物。
通过向各管中加入10mM Tris/HCl pH 8中的200μl 20mM DTT，并温育10分钟从琼脂糖珠子上洗脱噬菌体。通过离心沉淀珠子，并向生长至OD600nm为0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG-1培养物中加入上清液。为了噬菌体感染，在37℃下50ml塑料管中不摇动情况下温育所述培养物45分钟。4120xg下离心5分钟后，细菌沉淀物各自在800μl 2xYT培养基中重悬浮，接种到3xYT-CG琼脂平板上，并在37℃下温育过夜。从平板上刮去菌落，如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二和第三轮选择。
琼脂糖珠子的沉淀物难以看得见，并且容易溶解在上清液中。因此，决定使用至少25μl珠子，以能够看得见沉淀物。这导致相对高的抗原浓度，其对于第一轮对于所有子库是不同的，因为使用了不同的体积。第一轮子库中C3b的浓度大约如下：子库1820.1中为189nM、子库1820.2中为128nM、子库1820.3中为257nM、子库1820.4中为98nM、子库1820.5和1820.6中为66nM。在第二轮选择中，C3b浓度是，子库1820.1-3中为112nM，子库1820.4-6中为57nM。在第三轮选择中，C3b的浓度在所有子库中为57nM。
通过加入纯化的C3至大约475nM的终浓度将利用C3的封闭应用到子库1820.4-6的第一轮选择中。
差异肽淘选
用于差异肽淘选的抗原是代表C3b上不同表位的肽。这些肽在蛋白质结构分析中已经鉴定为C3b特异的，所述分析比较C3b相比于C3上表面暴露的残基。通过上文描述的MorphoSys进行与两种不同载体蛋白BSA和转铁蛋白的偶联。在选择循环中必须交替两种不同的载体蛋白，以不选择结合载体蛋白的噬菌体。此外，在肽上的选择循环与在全长C3b上的选择循环交替进行，以保证所选的噬菌体结合到正确折叠的全长C3b上。
肽淘选中的实际淘选步骤是使用肽偶联载体蛋白作为结合Maxisorp平板的抗原的固相淘选。用PBS中浓度为50μg/ml的偶联肽的300μl载体蛋白包被Maxisorp平板(F96 Nunc-Immunoplate)一定数量的孔(取决于预封闭噬菌体的体积)。密封平板并在4℃温育过夜。
用400μl PBS洗涤包被的孔两次，并在微量滴定板摇床上室温下用350μl PBS/5％奶粉封闭2小时。在旋转器上室温下用PBST/5％奶粉和终浓度为0.5％(v/v)的未偶联载体蛋白封闭噬菌体2小时。在封闭程序后用400μl PBS洗涤包被的孔两次。向各包被孔中加入300μl预封闭的噬菌体，并在摇床上室温下温育2小时。通过加入七次400μl PBST进行洗涤，然后用PBS洗涤七次(细节见表8和10)。
以每孔10mM Tris/HCl pH8中的300μl 20mM DTT从平板上洗脱噬菌体10分钟。向在37℃下2YT培养基中生长至OD600为0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG-1中加入DTT噬菌体洗脱液，并为了噬菌体感染，在37℃下50ml塑料管中不摇动情况下温育45分钟。4120xg离心5分钟后，细菌沉淀物各自在600μl 2xYT培养基中重悬浮，接种到3xYT-CG琼脂平板上，并在37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落，如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。
对于淘选1849，第一轮和第三轮选择是如上所述进行的肽淘选。第二轮是如此处所述在结合琼脂糖珠子的C3b上的选择，稍微做了以下修改：已经使用奶粉而非半胱氨酸封闭了用于噬菌体预吸附的琼脂糖珠子上的结合位点，还如上所述在PBST/5％奶粉中预封闭所述噬菌体。对于淘选1883，第一轮和第三轮选择是使用如此处所述进行的生物素化C3b的溶液淘选。第二轮是如上所述的肽淘选(该部分)。
淘选结果
三轮淘选后选择的克隆已经亚克隆到表达载体中，然后筛选与用于选择中的C3b或肽的结合。认为显示高于背景水平至少2倍的结合信号的克隆为初级命中。
第一轮溶液淘选1812的输出是筛选在Neutravidin平板上与生物素化的C3b的结合，产生531个初级命中。以C3b筛选鉴定的78个克隆平行进行在生物素化的C3上的筛选，其在C3b上比在C3上显示更强的信号。78个克隆的序列分析揭示了27条独特序列，其中19条是结合并纯化的。仅小比例的这些克隆在捕获ELISA中显示与cyno C3b的交叉反应性。鉴定cyno交叉反应性C3bneo抗体为本发明抗体的期望性状，并特异选择C3bneo结合子的cyno交叉反应性。从Cyno猴血浆中纯化Cyno C3b蛋白，并且在筛选过程中纯的cyno C3b作为抗原与人C3b一起使用。猕猴是极好的非人灵长类安全/毒性物种。期望C3bneo抗体与cyno的潜力和亲和力在人的5-10倍以内。选择该标准，以实现对cyno中C3b浓度的显著抑制，因此允许评估显著抑制C3b浓度引起的可能毒性。在筛选期，因为没有或有弱cyno交叉反应性，必须丢弃许多克隆。为了鉴定更多的cyno交叉反应性克隆，进行淘选1812的再筛选。为了再筛选，选择178个克隆，其已经在Neutravidin平板上显示了与C3b的显著结合(高于背景至少5倍)并且之前并未测序过。178个克隆中的38个显示与cyno C3b的结合，并进一步进行C3反筛(counter screen)。38个克隆中的10个进行反筛，产生纯化的1个新的独特克隆。
使用巯基平板的ELISA用于筛选基于珠子的淘选1820。79个初级命中，49个在C3b上比在C3上显示更强的信号。将这些测序，产生13条独特序列，其中7条是结合且纯化的。
筛选来自不同肽淘选1849的微表达Fabs与用于各选择的肽的结合。偶联肽的载体蛋白用作ELISA中的直接包被抗原。鉴定了2944中的566个初级命中，但仅22个初级命中显示高于背景至少5倍的信号。这22个克隆和32个额外克隆(其显示接近背景5倍的信号)进一步进行筛选，以检查与全长C3b的结合。54个克隆中没有一个显示与全长C3b的结合。
与先前的差异肽淘选相反，在差异肽淘选1883中进行全长C3b上的两轮选择和肽上的仅一轮选择。淘选1883的结果是在捕获ELISA中筛选与C3b的结合。4416个克隆的筛选产生了497个初级命中。已经显示高于背景至少5倍信号的275个初级命中进一步进行反筛。将经过反筛的183个克隆测序，产生9个独特克隆。7个独特克隆是结合且纯化的。
第二轮溶液筛选1889的结果是在捕获ELISA中筛选与C3b的结合，产生4416个初级命中的2878个。大多数初级命中(2469/2878)显示高于背景至少5倍的结合信号。决定挑选396个代表性克隆进行反筛，其来自不同淘选子库并具有不同的信号强度。396个克隆中的158个通过反筛，并进行测序，产生14条独特序列和最终11个纯化的Fabs。为了不丢失任何感兴趣的克隆，检测对C3b具有高于背景至少5倍结合信号的剩余克隆与cyno C3b的结合，所述剩余克隆(2073/2469)未曾进行反筛选。筛选所得的129个cyno交叉反应性克隆对C3b相比于C3的特异性。25个克隆显示优于C3结合的C3b选择性，最后产生4条新的独特序列。4个克隆中的3个是结合且纯化的。
表位装箱(Epitope bining)
根据制造商说明，使用试剂盒(ECL Protein biotinylation Module，GE)生物素化纯化的Fabs。通过使其流过Zeba Desalt Spin Column(Pierce)从未结合的生物素上清洗生物素化的Fab。检测与生物素化的Fab的人C3b的结合活性，在捕获ELISA(此处所述)中直接与其未生物素化的前体(progenitor)比较。仅挑选其结合活性未受生物素化影响的Fabs继续研究。
通过竞争ELISA进行表位装箱。所用的捕获抗体是指向C3b蛋白质兔多克隆抗人C3d Ab，Abcam的抗体，其是C3b的亚结构域。用在PBS中稀释到2μg/ml的捕获抗体填充Maxisorp平板的孔。密封平板并在4℃下温育过夜。
第二天，通过加入PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤2次。以在PBST/5％奶粉中稀释的终浓度为2.5μg/ml加入C3b。平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤2次。
同时，均在PBS中稀释的终浓度2.5μg/ml的C3b、生物素化的Fab和未生物素化的Fab(高于生物素化的Fab 100倍摩尔过量)加入到孔中。平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤2次。
为了检测生物素化的Fabs，加入AP缀合的链霉抗生素蛋白(Zymed)，平板在室温下温育1小时，然后用TBST洗涤5次。根据制造商的说明书使用荧光底物AttoPhos。在Tecan GENios Pro平板读出器上测量荧光。
通过如上所述的竞争ELISA进行表位装箱。向人C3b中加入生物素化的Fab和未生物素化的Fab(100倍过量)的混合物。检测生物素标记。阴性对照Fab MOR03207获得的信号设置为100％值。与100％信号相比评定抑制。
鉴定了6个表位组(在下文表中进行了概述)。组B和C，以及组D和E共有部分重叠的表位。
表2：表位组的概述
Figure BDA0000120426130001371
实施例3.亲和力成熟和优化
产生亲和力成熟文库
为了增加所选抗体片段的亲和力和生物活性，使用三核苷酸定向诱变通过盒诱变平行地优化L-CDR3和H-CDR2区(
Figure BDA0000120426130001381
等，1994)，而构架区保持不变。在克隆用于亲和力成熟之前，所有亲本Fab片段从相应的表达载体(
Figure BDA0000120426130001382
x9_MH)经过XbaI/EcoRI转移到CysDisplayTM载体
Figure BDA0000120426130001383
25_LHC中。通过去除干扰文库克隆的一个BssHII位点从HuCAL展示载体
Figure BDA0000120426130001385
23_LHC产生25_LHC，用于H-CDR2优化。
为了优化亲本Fabs的L-CDR3，通过BpiI/SphI去除轻链(405bp)的L-CDR3、构架4和恒定区，并用多样化L-CDR3与构架4和所述恒定域的所有组成成分替换。大约1.5μg的Fab载体片段与3到5倍摩尔过量的携带多样化L-CDR3s的插入片段连接。在第二个文库组中，使H-CDR2(XhoI/BssHII)多样化，而连接构架区保持不变。为了监测克隆效率，在将多样化H-CDR2盒克隆之前用模拟物替换亲本H-CDR2。
在4ml大肠杆菌TOP10F细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中将文库的连接混合物电穿孔，产生108到109个独立克隆。该文库大小保证覆盖理论多样性。如此处所述进行文库的扩增。对于质量控制，随机挑取单个克隆并进行测序。
制备噬菌体用于亲和力成熟淘选
在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖(2xYT-CG)的2xYT培养基中扩增
Figure BDA0000120426130001387
成熟文库。用OD600nm为0.5的VCSM13辅助噬菌体感染后(在37℃，不摇动30分钟；在37℃，250rpm摇动30分钟)，收集细胞(4120xg；5分钟；4℃)，在2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mMIPTG中重悬浮并在22℃下培养过夜。从上清液中PEG沉淀噬菌体两次，在PBS中重悬浮并如下所述用于成熟淘选。
(a)成熟淘选
用于成熟中的选择方法是如上文所述的溶液淘选。为了增加淘选的严格性并选择提高的解离速率，降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件(高达24小时)。在4℃下进行过夜洗涤步骤，所有其他洗涤步骤在室温下进行。
选择亲和力成熟的候选物
已经在多种测定中表征了来自初次淘选的Fabs。根据以下标准将它们分级并分组成可能的成熟候选物：
●结合C3b相比于结合C3的选择性
●溶血测定中的潜力
●C3b和MAC沉积测定中的潜力
●作用方式
●表位箱
●亲和力
8个一级抗体进行成熟，其因此在下文中称为“亲本”抗体。
亲本抗体MOR08035、8598和8599属于初次淘选后发现的最大一组Fabs。它们是表位箱D的成员，在功能测定中展示活性，并抑制C3和C5转化酶。这些抗体强烈抑制因子B与C3b的结合，抑制因子H结合的程度较低。
亲本抗体MOR08552展示相同的特征，只是其具有稍微不同的表位(箱C)。
MOR08672和MOR08675均属于表位箱D。它们非常好地抑制因子H的结合，但仅显示对其它因子结合的弱抑制。它们可能通过与上文抗体不同的机制起作用。同样，缺少其它因子的竞争可以导致以较低亲和力实现相同潜力。这种论点尤其用于MOR08675，其显示适当的潜力，尽管与C3b的亲和力实际上是低的。
MOR08555是表位组C的成员，其与MOR08305组具有相似的特征，但不抑制C5转化酶。
MOR08653属于表位箱B，其与箱C部分重叠。其在功能测定中的存在导致对所检测的所有机制的抑制：因子P、因子B和因子H的结合、C3b二聚体形成的抑制以及C3和C5转化酶的抑制。
分别构建来自各亲本的成熟文库，以能够在淘选库的组成中维持灵活性。在稍晚时间点上编辑库。对于各亲本抗体，根据抗体发挥的主要抑制机制定义靶KD值。在2个库的各库中编辑MOR08598和MOR08653，还有MOR08555和MOR08599。在每各库中，抗体展示对抗原的相似亲和力，很好地表达，具有相同的靶KD，并且不共有重叠表位。
用于亲和力成熟的文库
通过LCDR3和HCDR2盒的平行交换进行亲和力成熟。通过三核苷酸定向盒诱变优化CDR序列。将来自表达载体
Figure BDA0000120426130001401
x9_Fab_MH的Fab片段克隆到噬菌粒载体
Figure BDA0000120426130001402
25中。
通过标准克隆方法产生16个不同的亲和力成熟文库(对于各亲本抗体，一个LCDR3和一个HCDR3文库)并将多样化的克隆转化到电感受态大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen)中。文库大小合适，在5x108-4x109范围内。对随机挑取的克隆测序显示100％的多样性。在挑取的克隆中没有发现亲本结合子。最后，分别制备了所有16个文库的噬菌体。
用于亲和力成熟的淘选策略
在选择过程中分别保存HCDR2和LCDR3文库。8个亲本中的4个处理为前导；其余4个亲本在2个库中各自排列。从所产生的亲和力成熟文库中复苏的约1012个噬菌体进行成熟淘选。
使用生物素化的抗原进行使用各噬菌体库的溶液淘选，在人和cynoC3b之间交替。为了增加淘选严格性并选择提高的解离速率，降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件(高达24小时)。在上文中概述了淘选和洗涤条件。成熟淘选后，将富集的噬菌粒库亚克隆到
Figure BDA0000120426130001403
x9_MH表达载体中。
亲和力筛选和成熟淘选结果
从所有淘选中筛选了共2464个克隆作为在人C3b上具有提高亲和力的细菌裂解物。通过溶液平衡滴定(SET)评估初步的亲和力。认为估计与其亲本克隆相比亲和力提高的克隆是初级命中。
从各淘选子库中获得初级命中，并对所有初级命中测序，8305-LCDR3文库除外，其中对65个初级命中最好的17个测序。在261个初级命中中鉴定了共173条独特序列。可鉴定来自所有亲本Fabs(除了MOR08598)的衍生物。从亲本MOR08552和MOR08599中没有鉴定到HCDR2成熟的衍生物。
选择亲和力优化的Fabs用于蛋白质纯化
将独特的初级命中挑取到微孔培养板中，并用于微量表达Fab。Fab裂解物用于第二轮筛选中，在捕获ELISA中检测与人C3b、cyno C3b的结合、在捕获ELISA中检查与对抗靶标C3d和C5的交叉反应性，并进行反筛。通过筛选的克隆继续用于研究。目的是从各亲本中大规模表达并纯化大约12种衍生物。在多于12种衍生物通过第二轮筛选的情况下，用于蛋白质纯化的选择基于序列变异性。以下段落详细描述了各淘选子库的选择方法。
已经从亲本MOR08305中鉴定了在HCDR2中成熟的23个独特克隆，和在LCDR3中成熟的11个克隆。21/23HCDR2成熟的克隆通过了反筛，并且18/21与人C3b很好地结合。但仅1/18克隆与cyno C3b显示很好的结合。选择该克隆(MOR09124)用于大规模纯化。根据序列变异性选择额外的5个克隆用于大规模纯化。纯化对MOR09122不起作用。3/11LCDR3成熟的克隆不经过反筛，但2/3包括在大规模纯化中(MOR09130和9131)，因为它们在人C3b上的高结合信号暗示了低亲和力，其反过来可导致在血清上的残余结合。纯化对MOR09132不起作用。
已经从亲本8552中鉴定了16个LCDR3成熟的衍生物。根据上文描述的相似标准选择7/16的衍生物用于大规模纯化。但对于它们全部，纯化均失败了。因此，所有剩余9种衍生物进行大规模纯化。纯化仅对2/9(MOR09308和9313)起作用。
已经从亲本MOR08555中鉴定到了在HCDR2中成熟的1个独特克隆，和在LCDR3中成熟的3个独特克隆。因为总共仅有4种衍生物，决定全部纯化它们，不管它们在第二轮筛选中的行为。
已经从亲本MOR08599中鉴定到了在LCDR3中成熟的25个独特克隆。它们中的大多数在第二轮筛选过程中进行的所有测试中表现良好。用于大规模纯化的克隆的选择基于序列变异性。
已经从亲本MOR08653中鉴定到了在HCDR2中成熟的25个独特克隆，和在LCDR3中成熟的10个独特克隆。各亚组中仅1个在反筛中表现良好。这些克隆(MOR09198和9202)继续用于研究。其它克隆的选择基于序列变异性。
已经从亲本MOR08672中鉴定到了在HCDR2中成熟的5个独特克隆，和在LCDR3中成熟的29个独特克隆。仅1/5HCDR2成熟的克隆通过反筛，并继续用于研究(MOR09139)。选择了2个额外的HCDR2成熟的克隆。纯化仅对MOR09137起作用。大多数LCDR3成熟的克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
已经从亲本MOR08675中鉴定到了在HCDR2中成熟的7个独特克隆，和在LCDR3中成熟的17个独特克隆。1/7HCDR2成熟的克隆显示仅与人和cyno C3b的弱结合，并且被排除在外。在剩余的6个克隆中，仅3个不含有潜在的糖基化位点，并进行大规模纯化。在选择中包括含有潜在的糖基化位点的2个额外克隆。大多数LCDR3成熟的克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
选择亲和力优化的Fabs继续研究
考虑了先前部分中给出的所有可用数据，包括未显示的与亲和力优化的Fabs的表征相关的数据(例如，结合亲和力、溶血的抑制、C3b沉积的抑制)后，选择最佳Fabs继续研究。选择由22个成熟的Fabs组成，其来自4种不同的亲本抗体。表5概述了所选Fabs的关键特征。
表5：被选择用于继续研究的22个成熟的Fabs的关键特征
Figure BDA0000120426130001431
优化的Fabs的IgG转化以及在IgG水平上的杂交克隆
将所有8个亲本Fabs、几个成熟的Fabs和具有期望谱的几个成熟修复(去除潜在糖基化位点的)Fabs亚克隆到人IgG形式中。
通过用轻链和重链构建体的组合转染细胞完成IgG水平上的杂交克隆。因为MOR09124是鉴定到的唯一HCDR2成熟的克隆，所以杂交克隆仅对各家族(MOR08305衍生物)是可能的，其中MOR09121的重链与其它成熟家族成员的轻链组合。为杂交克隆给出了新的MOR号，其概述于表8中。
表8：杂交克隆抗体的MOR号。
  MOR0   类型   MOR0的重链   MOR0的轻链
  9395   杂交克隆   9124   9128
  9396   杂交克隆   9124   9129
  9397   杂交克隆   9124   9130
  9398   杂交克隆   9124   9131
  9399   杂交克隆   9124   9255
  9400   杂交克隆   9124   9256
在上述亲和力成熟的Fabs、修复的Fabs(去除糖基化位点的)，和杂交克隆的Fabs中，根据此处描述的方法测定Fabs 9124、9397、9398、9136、9141、9373和9423的结合特征。表9概述了这些Fabs的结合亲和力、功能潜能和补体因子结合的抑制。
Figure BDA0000120426130001451
在下文详细描述了用于测定在表8中概述的Fabs的结合亲和力和功能性质的方法。如从表8中的数据可以看出，本发明的Fab片段能够以低于或等于100pM，在许多情况下以低于或等于10pM的亲和力结合人和猕猴C3b。此外，Fab片段以低于或等于100nM，在大多数情况下低于或等于50nM的IC50显示对人和猕猴C3b的功能潜能。
实施例4IgG形式的C3b结合子的产生和表征
IgGs的种系化
通过Geneart(Geneart AG，Regensburg，Germany)将编码轻链和重链的免疫球蛋白可变区的pM2表达载体中的区域种系化并进行优化，以匹配种系化序列，避免不适合在哺乳动物细胞中表达的密码子，并避免隐藏的剪接位点。将所有重链的N末端QVQ变成EVQ，因为末端Q可能形成pyroglutamine。选择来自各亲本家族的抗体，用于种系化/优化。简言之，如下在IgG形式中种系化并表达抗体。
转化成IgG
为了表达全长免疫球蛋白，将Fab重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆到IgG1表达载体中。限制酶MfeI和BlpI用于将VH结构域片段亚克隆到
Figure BDA0000120426130001461
2_h_IgG1AA中，其中234和235位上的亮氨酸突变成丙氨酸来消除FcRγ结合并减弱效应功能。经EcoRV和BsiWI位点将VL结构域片段亚克隆至
Figure BDA0000120426130001462
2_h_Igκ中，而使用EcoRV和HpaI完成亚克隆到
Figure BDA0000120426130001463
2_h_Igλ2中。
人IgG的瞬时表达和纯化
用1∶1的比例的IgG重链和轻链表达载体DNA转染真核HKB11和HEK293细胞。在转染后3天或7天收集细胞培养物上清液，并进行标准的A蛋白亲和层析(MabSelect SURE，GE Healthcare)。除非另有说明，缓冲液交换成1x Dulbcecco′s PBS(pH 7.2，Invitrogen)并无菌过滤样品(0.2μm)。在SDS-PAGE中或通过使用Agilent BioAnalyzer分析变性的还原和非还原条件下的IgG的纯度，并通过HP-SEC分析天然状态中IgG的纯度。
为种系化的抗体给出了新的MOR号，如表10中所示。
表10：种系化的抗体的MOR号。
  种系化抗体的MOR0   祖先抗体的MOR0
  9555   9140
  9556   9124
  9609   9136
  9610   9141
  9611   9397
  9612   9398
  9613   9314
  9674   9373
  9675   9423
当然，进一步表征了种系化抗体9556、9611、9612、9609、9610、9674和9675。
亲和力测定
C3bneo抗体通过结合C3b分子上的新表位阻断补体激活。C3b上的新表位也是血浆中其它丰富补体蛋白的结合位点，例如因子H、因子B和因子P，其通过旁路途径调节补体激活。C3bneo抗体因此应该具有高的亲和力，以与这些丰富补体蛋白竞争，来通过阻断这些补体蛋白结合C3b而有效阻断补体激活。高亲和力为实现低治疗剂量所需。例如，血浆中因子H的浓度在3μM左右，因子H与C3b的结合亲和力(Kd)是～30nM；因子H浓度比其Kd高100倍。当C3bneo抗体与因子H竞争结合C3b时，其需要10pM Kd C3bneo抗体的1nM浓度(高于其Kd100倍抗体浓度)来抑制因子H结合C3b的50％。等于或低于10pM Kd C3bneo抗体因此会以适当的治疗抗体剂量实现旁路途径补体激活的有效阻断。因此，选择的本发明的抗体分子具有低于或等于65pM，优选低于或等于10pM范围的高结合亲和力。例如，选择本发明的抗体分子以对C3b具有9、8、7、6、5、4、3或2pM或更低的结合亲和力(即，低于2pM的更高亲和力)。
如下通过Biacore和溶液平衡滴定(SET)测定种系化的IgG抗体结合C3b的亲和力。
Biacore测定
使用CM5传感器芯片(GE Healthcare，BR-1005-30)在25℃下以BIAcore T100(GE Healthcare)完成Biacore动力学实验。运行缓冲液是HBS-EP(+)(GE Healthcare，BR-1001-88)。简言之，进行以下步骤以测定结合亲和力。
●制备抗C3d IgG固定化的传感器芯片：根据供应商的说明书(GEHealthcare，BR-1000-50)，通过使用氨基偶联方法，以10ul/分钟的流速在CM5芯片上将兔抗C3d多克隆抗体(Abcam，ab-15981)(在乙酸盐pH5.0偶联缓冲液中50ug/ml(GE Healthcare，BR-1003-51))偶联到两个不同的流动池(Fc1和2)上600秒。最终固定化的水平将＞7000RU。
●在第二个流动池上捕获C3b：在第二个流动池上以10ul/分钟注射运行缓冲液中的1ug/ml的C3b，以对Fab而言达到～70RU的捕获水平，或对IgG动力学分析而言达到～20RU的水平。
●在两个流动池上注射不同浓度的抗C3b Fab或IgG：在两个流动池(Fc1和2)上以60ul/分钟注射抗C3b溶液(在运行缓冲液中0.3125nM～10nM；1∶2系列稀释)240秒。
●解离：在两个流动池上以60ul/分钟注射HBS-EP(+)运行缓冲液，以监测C3b与抗C3b Fab/IgG之间的解离。对于5nM和2.5M Fab/IgG浓度，解离时间设置为2400秒，而对于包括另一5nM Fab/IgG浓度的所有其它浓度设置为300秒。
●再生：在两个流动池上以甘氨酸-HCl pH1.6(从甘氨酸-HCl pH1.5和甘氨酸pH2.0，GE Healthcare制备)+0.05％P20表面活性剂(GEHealthcare，BR-1000-54)，60ul/分钟的流速在各循环结束时进行再生40秒，两次。
●动力学分析：以BIAevaluation 1.1软件通过应用1∶1结合模型获得动力学速率常数，其中局部拟合Rmax值。
在下文表11中显示了Biacore结合动力学测定的结果。如所示，此处所述的抗体对人C3b显示高亲和力结合，KD值通常低于或等于10pM，并在许多情况下低于或等于5pM。这些抗体对cyno C3b也显示非常高的亲和力(低于200pM的结合亲和力)。
表11
Figure BDA0000120426130001491
SET测定
对于通过溶液平衡滴定(SET)对KD的测定，使用抗体蛋白质的单体级分(至少90％的单体含量，通过分析SEC分析；Superdex75(AmershamPharmacia)用于Fab或Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience)用于IgG)。
基本如参考文献中所述进行溶液中的亲和力测定(Friguet等305-19)。为了提高SET方法的灵敏度和准确度，从经典ELISA转换成基于ECL的技术(Haenel等，2005)。
根据制造商的说明书利用MSD Sulfo-TAGTM NHS-Ester(Meso ScaleDiscovery，Gaithersburg，MD，USA)标记1mg/ml山羊抗人(Fab)2片段特异性抗体(Dianova)。
在聚丙烯微量滴定板中进行实验并以含有0.5％BSA和0.02％Tween20的PBS pH 7.4作为测定缓冲液。以比预期KD高至少10倍的浓度开始，以2n系列稀释未标记的人C3b或cyno C3b。没有抗原的孔用于测定Bmax值；具有测定缓冲液的孔用作测定背景。加入例如10pM Fab(60μL终体积中的终浓度)后，在室温下过夜温育混合物。所应用的Fab浓度与预期KD相似或低于预期KD。
用PBS中0.05μg/ml人C3b(30μL/孔)过夜包被标准MSD平板，并用PBS中的3％BSA封闭1小时。用测定缓冲液洗涤平板后，将平衡的样品转移到那些平板中(每孔30μL)并温育20分钟。洗涤后，向MSD平板中加入30μL/孔最终稀释1∶1500的MSD磺基-标签标记的检测抗体(山羊抗人(Fab)2)，并在室温下Eppendorf摇床上(700rpm)温育30分钟。
洗涤平板并加入含表面活性剂的30μL/孔MSD Read缓冲液T后，使用Sector成像仪6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA)检测电化学发光信号。
用XLfit(IDBS)软件，应用定制的拟合模型评估数据。对于Fab分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据Haenel等，2005，根据Abraham等改进)：
y = B max - ( B max 2 [ Fab ] t ( [ Fab ] t + x + K D - ( [ Fab ] t + x + K D ) 2 - 4 x [ Fab ] t ) )
[Fab]t：应用的总Fab浓度
X：应用的总可溶性抗原浓度(结合位点)
Bmax：没有抗原的Fab的最大信号
KD：亲和力
原则上，应用相同的方案来测定IgG分子的KD值，除以下不同：向稀释系列的抗原中加入完整IgG分子，而不是Fab分子，并且在室温下平衡过夜。随后，如上所述处理样品。
对于数据评估，即IgG分子的KD测定，使用IgG的以下拟合模型(根据Piehler等，1997改进)：
y = 2 B max [ IgG ] ( [ IgG ] 2 - ( x + [ IgG ] + K D 2 - ( x + [ IgG ] + K D ) 2 4 - x [ IgG ] ) 2 2 [ IgG ] )
[IgG]：应用的总IgG浓度
x：应用的总可溶性抗原浓度(结合位点)
Bmax：没有抗原的IgG的最大信号
KD：亲和力
尽管没有特定地显示，SET数据验证了此处所述的抗体是人C3b的高亲和力结合子，其结合亲和力在低于或等于10pM，在许多情况下低于或等于5pM的范围内。同样地，此处描述的抗体以高亲和力结合猕猴C3b，通常以低于或等于200pM的KD结合猕猴C3b。
C3b抗体显示对C3的显著结合选择性
检查C3b抗体，以测定它们对C3b的结合相对于C3b前体C3是否是选择性的。简言之，通过进行以下步骤测定对C3b的结合选择性。用碳酸盐缓冲液中2μg/ml的抗C3d兔单克隆抗体(abcam 17453)以100μl/孔包被Maxisorp平板Nunc(442404)。密封平板并在4℃下温育过夜。抽干平板并用PBS/0.5％Tween 20洗涤3次。用稀释剂(PBS，4％BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)，0.1％Tween 20(Sigma P1379)，0.1％Triton X-100(Sigma P234729))封闭平板，并在室温下温育2小时或在4℃下温育过夜。然后用PBS/0.5％Tween 20洗涤平板一次。在稀释剂中以1μg/ml稀释纯化的C3b(补体技术A114 lot 21)和C3(补体技术A113c)，并在每孔中接种100μl。在室温下温育1小时。然后用PBS/0.5％Tween 20洗涤3次。以100nM稀释Fabs，随后在稀释剂中稀释(或更高浓度)，并在每孔中接种100μl。在室温下温育1小时。用PBS/0.5％Tween 20洗涤平板3次。在稀释剂中加入100μl/孔的1∶400的抗组氨酸HRP单克隆检测抗体，并在室温下温育1小时。然后用PBS/0.5％Tween 20洗涤4次。加入100μl的TMB底物(Pierce 34028)，并在室温下温育高达5分钟。向各孔中加入50μl的终止溶液(2N硫酸)，并在450nm处读取平板，并在570nm处校正塑料读数。
如图1所示，C3b抗体对C3结合具有选择性。抗体实现了相对于C3结合高1000倍的C3b结合选择性。尽管图1显示了对抗体9556的结合选择性的实例，1000倍的结合选择性是此处公开的七种IgG C3b抗体具有的性质。
C3b抗体抑制备选补体途径
为了证明抗C3b抗体抑制备选补体途径，进行以下测定。
溶血测定
溶血测定是基本的功能测定，其检测补体激活并已经用于评估抗人C3b mAbs和Fab分子阻断红细胞(RBCs)通过补体途径溶解的能力(Evanset al.(1995).In vitro and in vivo inhibition of complement activity by asingle-chain Fv fragment recognizing human C5.Mol Immunol 32，1183-1195；Thomas et al.(1996).Inhibition of complement activity byhumanized anti-C5 antibody and single-chain Fv.Mol Immunol 33，1389-1401；Rinder et al.(1995).Blockade of C5a and C5b-9 generationinhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation.J Clin Invest 96，1564-1572)。简言之，对于经典途径测定，敏化的红细胞用作通过血清中存在的补体蛋白质进行溶解的靶标。该测定对于高亲和力抗人C3b mAbs的表征和筛选是重要的。
从Rinder等，(1995)和Thomas等，(1996)改进该方法。
试剂：
兔红细胞(Rb RBCs)-Lampire，Cat#7246408
人血清-Novartis Blood Research Program；或Cyno血清-AlphaGenesis
明胶佛罗那缓冲液(GVB)-Boston BioProducts，Cat#IBB-300
EGTA-Boston BioProducts，Cat#BM-151
MgCl2
U型底96-孔板-Corning，Cat#3795
平底96孔板-Corning，Cat#3370
NP-40-Sigma，Cat#74385
方案：
1.洗涤Rb RBCs并在GVB/EGTA/Mg++中调整至8.33e7细胞/ml
2.向96孔圆底平板的孔中加入在GVB中稀释的50μl Ab；Ab的浓度应该是期望终浓度的2倍。
3.加入在含有EGTA和Mg++的GVB中稀释的50μl血清。
a.制备对照孔：血清+0nM Ab，0％溶解对照(仅缓冲液)、100％溶解对照(0.1％NP-40)，和血清、缓冲液，和NP-40对照。
b.如果对10％血清检测Ab，使用10mM EGTA和5mM Mg++(最终)；如果对50％血清检测Ab，使用15-30mM EGTA，5mM Mg++(最终)。
4.在室温下温育30分钟。
5.向样品和对照孔中加入30μl Rb RBCs；向空白孔中加入30μl缓冲液。在37℃下温育30分钟。
6.在2000rpm下离心平板5分钟。
7.收集上清液，转移至平底平板中。
8.读取OD415和OD570。计算％溶血：
图2显示了抗C3b抗体在10％人或猕猴血清中抑制溶血的能力的实例。此处所述的各C3b抗体以低于或等于50nM的IC50抑制溶血。
相反，当使用敏化的红细胞进行测定时，为了检查经典补体途径的激活，发现此处所述的抗C3b抗体不激活经典补体途径(数据未显示)。
C3b沉积测定
测定在旁路途径中补体C3的抑制剂活性的一种方法是测定其沉积在酵母多糖上的分解产物C3b。根据以下步骤进行这种基于ELISA的测定：在4℃下Maxisorp 384-孔ELISA平板(Nunc 464718)中用碳酸盐缓冲液，pH 9.6(Pierce Cat#28382)中25μl的1mg/ml Zymosan A(Sigma Z4250)包被过夜。第二天，抽吸酵母多糖包被的平板并用每孔100μl的ELISA封闭缓冲液，Synblock(AbD Serotec BUFO34C)在室温下封闭2小时。在各反应中，向补充MgCl2和EGTA(最终总的反应浓度为1mM MgCl2和10mMEGTA)的10％血清中加入在明胶佛罗那缓冲液(Boston BioproductsIBB320-10mM Barbital，145mM NaCl，0.1％明胶，0.5mM MgCl2，10mMEGTA)中系列稀释的抑制剂。阳性对照不含有抑制剂，而阴性对照含有25mM EDTA。通过在室温下温育30分钟允许混合物达到平衡。为了去除封闭缓冲液，抽吸平板并用TBS/0.05％Tween-20洗涤一次。向平板中加入每孔25μl含有抑制剂的10％血清或对照，并在37℃下温育30分钟(先前通过时间过程测定在酵母多糖上的C3b沉积的线性范围内)。30分钟温育后，用TBS/0.05％Tween-20洗涤平板3次。为了检测酵母多糖上的C3b沉积，向平板中加入在含有2％BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN16006980)、0.1％Tween20(Sigma Cat#P1379)和0.1％TritonX-100(SigmaCat#P234729)的PBS中根据制造商稀释的鸡抗人C3-HRP缀合的多克隆抗体(Immunology Consultants Laboratory，Inc.Cat#CC3-80P-1)，并在室温下温育1小时。然后，用TBS/0.05％Tween-20洗涤平板3次，然后加入25μl的Ultra TMB底物溶液(Pierce Cat#34028.)。当孔中的溶液变蓝时，用15μl的2N硫酸终止反应。使用Spectromax在450nm读取平板(OD450-570nm读数)，在570nm处为塑料平板进行校正。使用以下公式计算在酵母多糖上C3b沉积的百分比：
Figure BDA0000120426130001541
图3显示了C3b抗体抑制C3产生为C3b的分解产物的能力的实例。显示各检测抗体以至少低于或等于10nM的IC50抑制C3b沉积。
MAC沉积测定
测定C3b抗体抑制备选补体途径的功能能力的另一种测定是测定抗体抑制产生膜攻击复合体(MAC)的能力，其位于C3b加工的下游。简言之，以碳酸盐缓冲液，pH 9.5中1mg/ml在平板上包被Zymosan A(Sigma)来激活旁路途径。Fabs或IgGs各自与血清(2％血清，5mM MgCl2，10mMEDTA)预温育，然后加入到平板中并在室温下温育过夜。用TBST洗涤平板3次后，通过与抗C5b-9-ALP(Diatec)温育1小时，然后用TBST洗涤3次，并与补充有2mM MgCl2的4-甲基伞形酮磷酸酯(Fisher)温育30分钟来检测MAC。用0.2M EDTA终止反应，并在ex＝355nm，em＝460nm处读取平板。计算各样品相对于基线(EDTA处理的人血清)和阳性对照(人血清)的MAC沉积的抑制，并利用PRISM来产生IC50曲线。
图4显示了示例性数据，其证明C3b抗体抑制MAC沉积的能力，因此表明抗体抑制补体旁路。尤其是，抗体以低于或等于5nM的IC50抑制MAC沉积。
C3a和C5a产生的抑制
可用于测定C3b抗体抑制补体旁路的能力的另一种测定是测量C3a和C5a的产生，两者是旁路途径中C3b下游的激活产物。
简言之，由申请人开发了C5a-des-Arg ELISA来测定溶血过程中C5a的产生以证实溶血测定中抑制性的抗体也抑制C5切割成C5a和C5b。
用包被缓冲液(碳酸氢盐pH 9.5-9.8)中1μg/ml的100μl/孔小鼠抗人C5a-des-Arg(US Biologics)包被Maxisorp平板，并将其在4℃温育过夜。用PBST洗涤3次后，用300μl/孔稀释剂(Synblock，AbD Serotec)在室温下封闭所述平板2小时。抽出封闭溶液后，以稀释剂稀释的100μl样品或标准品在室温下温育1小时。如下制备标准品：以20ng/ml标准品(rC5a-des-Arg)开始，制备1∶4连续稀释液用于7点曲线。在稀释液剂中以1∶5稀释溶血测定的样品(溶血测定上清液应该储存在-80℃，直至用于C5a ELISA)。中间用PBST洗涤平板3次。
加入稀释剂中稀释的100μl/孔的0.4μg/ml检测抗体(生物素-山羊抗人c5a，R&D Systems)，并且在室温下温育1小时后，加入HRP稀释剂(聚-HRP稀释剂)中1∶5000稀释的100μl/孔Strep-HRP(聚-HRP链霉抗生物素蛋白)30分钟。用PBST洗涤4次后，加入100μl/孔TMB底物(UltraTMB底物溶液)5-10分钟。用50μl/孔终止溶液(2N H2SO4)终止反应。读取吸光度(A450-A570)并使用SoftMax Pro分析数据。
同样地，由申请人开发了C3a-des-Arg ELISA来测定溶血过程中的C3a产生，以验证在溶血测定中抑制性的抗体也抑制C3切割成C3a和C3b。
用包被缓冲液(碳酸氢盐pH 9.5-9.8)中1μg/ml的100μl/孔小鼠抗人C3a-des-Arg neo(US Biologics)包被Maxisorp平板，并将其在4℃温育过夜。用PBST洗涤3次后，用300μl/孔稀释剂(Synblock，AbD Serotec)在室温下封闭所述平板2小时。抽出封闭溶液后，以稀释剂稀释的100μl样品或标准品在室温下温育1小时。如下制备标准品：以1μg/ml标准品(rC3a-des-Arg)开始，制备1∶3连续稀释液用于8点曲线。在稀释液剂以1∶5稀释溶血测定的样品(溶血测定上清液应该储存在-80℃，直至用于C5a ELISA)。中间用PBST洗涤平板3次。
加入稀释剂中稀释的100μl/孔的10μg/ml检测抗体(生物素-小鼠抗人c3a，Chemicon和内部生物素化的)，并且在室温下温育1小时后，加入HRP稀释剂(聚-HRP稀释剂)中1∶5000稀释的100μl/孔Strep-HRP(聚-HRP链霉抗生物素蛋白)30分钟。用PBST洗涤4次后，加入100μl/孔TMB底物(Ultra TMB底物溶液)5-10分钟。用50μl/孔终止溶液(2NH2SO4)终止反应。读取吸光度(A450-A570)并使用SoftMax Pro分析数据。
如图5所示，C3b抗体能够通过抑制产生C3a和C5a阻断旁路途径驱动的补体激活。更尤其是，此处所述的C3b抗体如抑制C3a和C5a产生所测定以低于或等于50nM的IC50抑制旁路途径。
C3b抗体抑制体外C3转化酶活性
基于C3水空转(Tick-over)转化酶凝胶的测定
在该测定中，Fabs/IgGs与10％的含C3-水的C3预温育，以便当加入因子D和因子B时，可以测量通过C3水空转的转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂：天然因子B(100nM)、因子D(40nM)、C3(400nM)、MgCl(5mM)和Fab/IgG 1000nM，随后进行稀释。在96孔聚丙烯平板中，加入多种稀释度的Fabs/IgGs(包括PBS对照样品)。为此，加入C3并在室温下温育1小时。然后将因子B、因子D和MgCl的储存混合物加入到1XPBS中。1小时温育后，将适当量的反应混合物加入到每孔Fab/IgG-C3中。立即取0时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。允许转化酶反应在室温下温育15分钟。然后取最后的时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。在还原条件下4-12％Bis-Tris凝胶上为各样品运行总体积(也可在省略因子D的单独反应中产生0时间点)。
基于C3b凝胶的转化酶测定
设计该测定，以便Fabs/IgGs与C3b预温育。温育后，将其加入到C3反应混合物中以检测转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂：天然C3b(32nM)、天然因子B(100nM)、因子D(40nM)、C3(400nM)、MgCl(5mM)和Fab/IgG 1000nM，随后进行稀释。在96孔聚丙烯平板中，加入适当体积的多种稀释度的Fabs/IgGs(包括PBS对照样品)。为此，每孔加入适当量的C3。在37℃下温育1小时。然后将因子B、因子D和MgCl的储存混合物加入到1XPBS中。1小时温育后，向储存混合物中加入C3，并将适当量的反应混合物立即加入到各孔Fab/IgG-C3中。立即取0时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。允许转化酶反应在室温下温育15分钟。然后取最后的时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。在还原条件下4-12％Bis-Tris凝胶上为各样品运行总体积(也可在省略因子D的单独反应中产生0时间点)。
进行基于C3转化酶凝胶的测定
设计该测定，以便使用C3b、因子B突变体和因子D产生稳定的转化酶。为此，加入Fabs/IgGs并允许温育。然后加入C3，并取样品进行分析。C3不能形成转化酶。以以下终浓度使用蛋白质试剂：天然C3b(32nM)、天然因子B突变体(16nM)、因子D(40nM)、C3(400nM)、MgCl(5mM)和Fab/IgG 1000nM，随后进行稀释。在96孔聚丙烯平板中，加入c3b、因子B、因子D和MgCl，并在37℃下温育10分钟。然后加入适当稀释的fabs/IgGs(PBS对照)并在37℃下温育20分钟。然后加入C3并在室温下温育15分钟。立即取0时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。允许转化酶反应在室温下温育15分钟。然后取最后的时间点，加入4X样品缓冲液，并放置在95℃。在还原条件下4-12％Bis-Tris凝胶上运行各样品的总体积(也可在省略因子D的单独反应中产生0时间点)。
如图6中所示，C3b抗体抑制旁路途径体外C3转化酶活性。图6A显示了SDS-PAGE凝胶，其显示了空转转化酶活性的抑制。图6B显示了6A凝胶中对C3b产生的抑制的定量。图6C显示了抗C3b抗体抑制预形成的C3转化酶活性。
C3b抗体体外抑制C5转化酶活性
为了进一步表征抗C3b抗体抑制补体旁路的能力，检查抗体抑制C5转化酶激活的能力。简言之，通过与纯化的C3和胰蛋白酶(Sigma)在室温下温育10分钟在Zymosan A(Sigma)上沉积C3b。将酵母多糖离心并去除上清液，通过加入纯化的C3、fB、fD和NiCl2扩增C3b。重复扩增步骤，直至在酵母多糖上达到想要密度的C3b。
Fabs/IgGs与Zymosan-C3b在室温下预温育45分钟。加入纯化的蛋白质(Complement Tech)：C5(100nM)、C6(100nM)、fB(500nM)、fD(160nM)和5mM NiCl2。反应在37℃下温育5中，并通过1∶10稀释到冰冷的GVB+10mM EDTA中来终止反应。使用溶血测定，通过向chRBCs(8E7/ml)和2％人血清中加入反应产物，并在37℃下温育30分钟来定量C5bC6水平。在2000rpm下将细胞离心5分钟，并在A415/A570处读取上清液。纯化的C5bC6蛋白质(Complement Tech)用作标准曲线。
如图7所示，C3b抗体抑制旁路途径体外C5转化酶活性。
通过C3b抗体阻断补体因子结合C3b
进行以下实验，以测定抗C3b抗体抑制C3b与补体旁路其它成员之间相互作用的能力，并因此证明了抗体抑制补体旁路的可能机制。简言之，在室温下48小时温育期间使用AminoLink Reductant(Pierce)将纯化的C3b和fP缀合到未缀合的受体或供体珠子(PerkinElmer)上。使用羧甲基胺半盐酸盐(Aldrich)淬灭珠子，通过在13000rpm下离心并用0.1M TBST洗涤三次进行纯化。在室温下使用20倍摩尔过量的NHS生色的生物素(Pierce)在30分钟温育期间生物素化纯化的fB(D24G/N260D)和fH，并使用Zeba 0.5ml脱盐柱(Pierce)进行纯化。
对于C3b-C3b和C3b-fP的近似性，Fabs或IgGs分别与C3b受体珠子(20μg/ml)在室温下预温育60分钟。然后加入C3b-供体珠子或fP-供体珠子(20μg/ml)，并在读数前在室温下温育平板过夜。对于C3b-fB和C3b-fH的近似性，抗体与C3b-受体珠子(20μg/ml)在室温下预温育60分钟。然后加入生物素化的fB(D24G/N260D)或fH，并在室温下温育60分钟。然后加入SA-供体珠子(20μg/ml)，并在读数前在室温下过夜温育平板钟。在BMGPherastar上读取平板(ex＝680，em＝520-620)。
如图8所示，C3b抗体阻断了几种补体因子与C3b的结合。如图中所见，抗C3b抗体利用不同的作用机制来阻断补体旁路。图8A显示了通过C3b抗体抑制因子B结合C3b。图8B显示了通过C3b抗体抑制因子P结合C3b。图8C显示了通过C3b抗体抑制因子H结合C3b。图8D显示了通过C3b抗体抑制C3b-C3b二聚体形成。
C3b抗体不与人C3d或人C5交叉反应
检测抗C3b抗体与人C3d和C5的交叉反应性。
用于检测与人C3b、人C3d或cyno C3b的结合的EILSAs中的捕获抗体是针对C3d蛋白质兔多克隆抗人C3d Ab，Abcam)的抗体，其为C3b的亚结构域。用在PBS中稀释至2μg/ml的捕获抗体填充Maxisorp平板的孔。密封平板并在4℃下温育过夜。为了检测Fabs与C5的结合，捕获抗体是以5μg/ml的终浓度使用的抗C5抗体(US Biologicals)。
第二天，通过加入PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤2次。以在PBST/5％奶粉中稀释的2.5μg/ml的终浓度加入C3b。平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤3次。制备Fabs的系列稀释，然后加入到封闭的平板中。平板在室温下温育1-2小时，然后用PBST洗涤3次。
对于Fabs的检测，加入抗HIS AP-缀合的抗体(Invitrogen，46-0284)，平板在室温下温育1小时，然后用PBST洗涤5次。根据制造商的说明书使用荧光底物AttoPhos。在Tecan GENios Pro平板读数器上测定荧光。
分别在图9和10中显示了来自这些实验的C3d和C5的结果。如所示，C3b抗体不结合C3d或C5。
C3b抗体等同地识别iC3b和C3c
为了测定此处所述的抗C3b抗体是否可以结合补体途径组分iC3b和C3c，进行以下步骤：直接向Coat Maxisorp平板Nunc(442404)以每孔100μl加入碳酸盐缓冲液中的2μg/ml iC3b(补体技术A115)、C3d(补体技术A117)或C3c(补体技术A116)。密封平板并在4℃下温育过夜。抽吸平板并用PBS/0.5％Tween 20洗涤3次。以稀释剂(PBS，4％BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)，0.1％Tween 20(Sigma P1379)，0.1％Triton X-100(Sigma P234729))封闭平板，并在室温下温育2小时或在4℃下温育过夜。然后用PBS/0.5％Tween 20洗涤平板1次。以100nM稀释Fabs，随后在稀释液中稀释(或如果需要，更高浓度)，并在每孔中接种100μl。在室温下温育1小时。用PBS/0.5％Tween 20洗涤平板3次。在稀释液中加入100μl/孔的1∶400的抗组氨酸HRP单克隆检测抗体，并在室温下温育1小时。然后用PBS/0.5％Tween 20洗涤4次。加入100μl的TMB底物(Pierce 34028)，并在室温下温育高达5分钟。向各孔中加入50μl的终止溶液(2N硫酸)，并在450nm处读取平板，并在570nm处校正塑料平板读数。
如图11中所示，C3b抗体与iC3b和C3c交叉反应。
物种交叉反应性
为了测定除了人和猕猴，此处所述的抗C3b抗体是否结合来自其它物种的C3b，如上文所述进行溶血测定。用于各物种的血清浓度如下：10％大鼠血清；20％兔血清；10％猪血清；20％小鼠血清；10％豚鼠血清；和10％狗血清。如图12中所示，C3b抗体能够与几种物种交叉反应，所述物种包括大鼠、兔、猪、小鼠和豚鼠。
Fab形式的C3bneo结合子
除了上文描述的全长IgG形式的抗C3b抗体，相同的可变域用于构建Fab形式的抗原结合片段。评估抗C3b Fabs，以根据上文描述的方法测定其结合特征。表11概述了亚组Fabs的补体因子结合的结合亲和力、功能潜能和抑制。
Figure BDA0000120426130001621
本发明的实施方案
本发明包括，但不限于以下实施方案：
1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人或猕猴补体C3b蛋白，其中所述抗体以低于或等于100pM的KD结合人C3b。
2.前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段也以低于或等于250pM的KD结合猕猴C3b。
3.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于或等于10pM的KD结合人C3b。
4.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于或等于2pM的KD结合人C3b。
5.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以低于或等于65nM的IC50抑制人补体旁路。
6.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体如通过体外C3b沉积所测定以低于或等于50nM的IC50抑制人补体旁路。
7.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于5nM的IC50抑制人补体旁路。
8.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体如通过产生C3a和C5a所测定以低于或等于100nM的IC50抑制补体旁路。
9.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人或猕猴的补体C3b蛋白，并与表1中描述的抗体交叉竞争。
10.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
11.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是人或人源化抗体。
12.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
13.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
14.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是Fab片段或ScFv片段。
15.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体是IgG同种型。
16.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体包括这样的构架，其中氨基酸已经替换到来自各人VH或VL种系序列的抗体构架。
17.任何前述段落中的分离的抗体，其中所述抗体以比所述抗体结合C3的亲和力高至少1000倍的亲和力结合C3b。
18.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的重链CDR1；选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的重链CDR2；和选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的重链CDR3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
19.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
20.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体还包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3。
21.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的重链可变域序列，还包括选自SEQ IDNOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的轻链可变域序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
22.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域，其中所述抗体结合C3b。
23.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域，其中所述抗体结合C3b。
24.任何前述段落中的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含与选自SEQ ID NOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
25.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs 9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的序列具有至少95％序列同一性的重链，其中所述抗体结合C3b。
26.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs 10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链，其中所述抗体结合C3b。
27.任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含与选自SEQ ID NOs 10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链。
28.药物组合物，其包含任何前述段落的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
29.分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域。
30.分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NOs 8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
31.载体，其包括前述段落的核酸。
32.分离的宿主细胞，其包含编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的重链的重组DNA序列，和编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组DNA序列，其中所述DNA序列有效连接启动子，并能够在宿主细胞中表达。
33.前述段落的分离的宿主细胞，其中所述抗体是人单克隆抗体。
34.先前两段中的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。
35.治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
36.前述段落的方法，其中所述受试者是人。
37.在受试者中抑制补体旁路的方法，其包括向需要抑制的受试者施用有效量的包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
38.前述段落的方法，其中所述受试者是人。
此处引用的所有专利、专利申请和出版的参考文献以其整体引入作为参考。尽管参考本发明的优选实施方案特别显示并描述了本发明，但本领域技术人员应该理解的是，其中可在形式和细节上进行多种改变，但不背离所附权利要求包括的本发明的范围。
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Claims (38)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人或猕猴补体C3b蛋白，其中所述抗体以低于或等于100pM的KD结合人C3b。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段也以低于或等于250pM的KD结合猕猴C3b。
3.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于或等于10pM的KD结合人C3b。
4.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于或等于2pM的KD结合人C3b。
5.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以低于或等于65nM的IC50抑制人补体旁路。
6.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体如通过体外C3b沉积所测定以低于或等于50nM的IC50抑制人补体旁路。
7.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于5nM的IC50抑制人补体旁路。
8.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体如通过产生C3a和C5a所测定以低于或等于100nM的IC50抑制补体旁路。
9.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人或猕猴的补体C3b蛋白，并与表1中描述的抗体交叉竞争。
10.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
11.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是人或人源化抗体。
12.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
13.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
14.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是Fab片段或ScFv片段。
15.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体是IgG同种型。
16.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体包含这样的构架，其中氨基酸已经替换到来自各人VH或VL种系序列的抗体构架。
17.任一前述权利要求的分离的抗体，其中所述抗体以比所述抗体结合C3的亲和力高至少1000倍的亲和力结合C3b。
18.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：1、15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169和183的重链CDR1；选自SEQ ID NOs：2、16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170和184的重链CDR2；和选自SEQ ID NOs：3、17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171和185的重链CDR3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
19.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
20.权利要求18的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体还包含选自SEQ ID NOs：4、18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172和186的轻链CDR1；选自SEQ ID NOs：5、19、33、47、61、75、89、103、117、131、145、159、173和187的轻链CDR2；和选自SEQ ID NOs：6、20、34、48、62、76、90、104、118、132、146、160、174和188的轻链CDR3。
21.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的重链可变域序列，还包括选自SEQID NOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的轻链可变域序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白C3b。
22.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域，其中所述抗体结合C3b。
23.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域，其中所述抗体结合C3b。
24.权利要求20-23的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含与选自SEQ ID NOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
25.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs：9、23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177和191的序列具有至少95％序列同一性的重链，其中所述抗体结合C3b。
26.任一前述权利要求的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链，其中所述抗体结合C3b。
27.权利要求25的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含与选自SEQ ID NOs：10、24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178和192的序列具有至少95％序列同一性的轻链。
28.药物组合物，其包含任一前述权利要求的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
29.分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NOs：7、21、35、49、63、77、91、105、119、133、147、161、175和189的序列具有至少95％序列同一性的重链可变域。
30.分离的核酸，其包含编码这样的多肽的序列，所述多肽包含与选自SEQ ID NOs：8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190的序列具有至少95％序列同一性的轻链可变域。
31.载体，其包含权利要求27或28的核酸。
32.分离的宿主细胞，其包含编码任一前述权利要求的抗体或其抗原结合片段的重链的重组DNA序列，和编码任一前述权利要求的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组DNA序列，其中所述DNA序列有效连接启动子，并能够在宿主细胞中表达。
33.权利要求30的分离的宿主细胞，其中所述抗体是人单克隆抗体。
34.权利要求30的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。
35.治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含权利要求1-27的抗体或其抗原结合片段的组合物。
36.权利要求33的方法，其中所述受试者是人。
37.在受试者中抑制补体旁路的方法，其包括向需要抑制的受试者施用有效量的包含权利要求1-27的抗体或其抗原结合片段的组合物。
38.权利要求35的方法，其中所述受试者是人。
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