KR20230101087A

KR20230101087A - Prox1 단백질에 중화 활성을 갖는 결합 분자

Info

Publication number: KR20230101087A
Application number: KR1020210190878A
Authority: KR
Inventors: 김진우; 이은정
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-06
Also published as: EP4206229A1; US20230331829A1

Abstract

본 발명은 PROX1 (Prospero homeobox protein 1) 단백질 결합 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 결합 분자는 PROX1 단백질에 대한 우수한 결합 능력을 가지며 PROX1 단백질에 대한 우수한 중화 효과를 갖는 결합 분자에 관한 것으로, 망막신경 퇴화 질환에 대한 진단, 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

Description

PROX1 단백질에 중화 활성을 갖는 결합 분자 {A binding molecules able to neutralize PROX1 protein}

PROX1 단백질에 대한 중화 활성을 갖는 결합 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 결합 분자는 PROX1 단백질에 대한 우수한 결합 능력을 가지며 PROX1 단백질에 대한 우수한 중화 효과를 갖는 결합 분자에 관한 것이다.

망막(retina)이란 안구의 가장 안쪽을 덮고 있는 투명한 신경조직으로, 안구 내로 들어온 빛은 망막의 내층을 지나 망막의 시세포에 감지된다. 시세포는 빛 정보를 다시 전기적 정보로 전환하고 이 정보는 망막 내층의 신경세포와 시신경을 지나 뇌로 전달되며, 이러한 과정을 통해 사물을 볼 수 있게 된다. 안구의 가장 바깥쪽은 무혈관성 섬유층(각막, 공막), 중간층은 혈관성 조직인 포도막(홍채, 섬모체, 맥락막)으로 중간층인 맥락막 안쪽을 덮고 있는 투명한 신경 조직이 망막이다. 망막은 두께가 다른 얇은 투명한 막으로 위치에 따라 망막의 중 심부는 중심와, 중심와부근, 중심와주위로 다시 나뉜다. 중심와는 임상적으로 황반이라고 불린다.

한편, 망막이 선천적 또는 후천적으로 손상되거나 고혈압, 당뇨병과 같은 만성질환의 합병증에 의해 망막신경 퇴행성 질환이 발생할 수 있다. 구체적으로, 어두운 곳에서 잘 보이지 않는 야맹증을 초기 증상으로 보이는 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa)과 유전성 망막 이상증인 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis (LCA))와 같은 선천성 망막 퇴화질환, 망막이 찢기고 떨어지는 망막박리(Retinal Detachment), 황반변성, 당뇨로 인해 발생하는 당뇨망막증, 중심성망막증, 노인성 망막퇴화 등이 있다. 이러한 질환에 의해 시력감소, 시야장애를 비롯해 야맹증, 색약, 색맹, 광시증(눈을 움직일 때 불빛이 번쩍하는 듯 보임), 비문증(눈앞에 하루살이처럼 무언가 떠다니는 것이 보임), 변형시(물체가 휘어 보임), 중심암점(시야 중심이 까맣게 보임) 등의 증상이 나타난다. 그러나 망막신경세포의 재생이 가능한 하등 척추동물과 달리 포유동물에서는 망막신경세포의 재생이 일어나지 않으며 이식도 불가능한 신경조직이기 때문에 망막은 한번 손상이 발생하면 회복되지 않아 결과적으로 실명에 이를 수 있다.

이러한 망막신경 퇴화 질환은 발생률이 급격히 증가하고 있음에도 불구하고 현재 효과적인 치료제나 치료법이 거의 없는 실정이다. 최근, 망막세포의 대체와 보호를 위해 다양한 줄기세포를 이용한 세포치료제 연구가 진행되고 있으나 아직 임상 적용은 되지 못하고 있으며(한국 등록특허, 10-1268741), 망막색소상피 세포를 표적으로한 스타가르트병 유전자 치료가 임상에 적용되었으나 이는 일부 유전자 변이가 일어난 환자에만 제한되는 것으로, 퇴화된 망막을 재생하여 시각 기능을 복구할 수 있는 기술은 현재 전무한 상태이다.

또한, 손상된 포유류 망막 내 뮬러글리아로의 PROX1 단백질의 이동을 억제함으로써 뮬러글리아의 분열을 유도하여 망막 신경의 재생 효과를 나타냄을 확인하였으나, 생체 내에서 PROX1 단백질에 직접 결합하여 기능을 억제하는 중화 효능을 가진 항 PROX1 항체(anti-PROX1 antibody)에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

따라서, 근원적으로 망막신경재생이 불가능한 인간을 비롯한 포유류에서 망막 퇴화에 의한 다양한 질환에 광범위하게 적용될 수 있으면서도 안전하고 효과적인 치료제의 개발의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 PROX1 (Prospero homeobox protein 1) 단백질에 대한 결합 능력을 갖는 결합 분자를 개발하였고, 이 결합 분자가 PROX1 단백질에 대하여 우수한 결합력 및/또는 중화 효력을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 결합 단편에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는, 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는, 망막신경 퇴화 질환 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 발현하는, 아데노부속바이러스 (Adeno-associated virus)를 제공하는 것이다.

본 발명은 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.

본 발명의 결합 분자는 PROX1 단백질에 대해 우수한 결합능을 가지면서 우수한 중화능을 나타낼 수 있다. 일 구체예로, 본 발명의 결합 분자는 PROX1 단백질에 결합하여 중화능을 나타내는 분자로 스크리닝된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 PROX1 (Prospero homeobox protein 1)의 유전자에 의해 암호화되는 PROX1 단백질은 호메오 단백질의 한 종류로써 DNA 및 RNA에 결합하는 60-아미노산 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 구조로 구성된 호메오 도메인 (Homeo domain)을 포함한다. 상기 단백질은 척추동물에서 보존되어 있으며 간이나 망막, 림프계 등의 발생에서 다양한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 세포의 증식을 조절하며, 세포들이 적절한 위치로 이동하도록 하고, 그 세포들이 독특한 기능을 갖도록 분화시키는 기능 모두를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 결장, 뇌, 혈액, 유방, 췌장, 간 및 식도와 같은 조직들에서 발생하는 암에서 상기 단백질의 수준 변화가 보고되어 있다. 포유류의 망막에서 PROX1 단백질은 망막 내 신경세포에서 발현되며 뮬러글리아에서 PROX1 단백질은 매우 적은 양이 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 용어 "호메오 도메인"은 60여개의 아미노산으로 이루어진 유전자 결합활성을 나타내는 구조의 단백질을 말한다. 상기 호메오도메인은 호메오상자라고 알려진 180bp 크기의 유전자로부터 발현된다. 타깃 유전자 프로모터 부위에 염기서열 특이적으로 결합하여 유전자발현을 촉진하거나 저해하는 기능을 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 결합 분자는 PROX1 단백질 상의 호메오 도메인 (Homeo domain) 영역에 특이적으로 결합하는 결합 분자일 수 있다.

본 발명에서, 상기 뮬러글리아(M

ller glia)는 Heinrich M

ller에 의해 처음 발견된 망막 아교세포의 한 종류로써 다른 신경교세포와 같이 뉴런의 지지세포로써 척추동물의 망막에서 가장 일반적인 유형의 아교세포이다. 포유동물의 망막에서는 뮬러글리아의 세포분열이 억제되어 있기 때문에 망막신경세포의 재생이 일어나지 않는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로블린인 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면 PROX1 단백질과 결합에 있어서, 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인, 효소, 수용체, 단백질을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 항체의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 PROX1 단백질 결합 분자를 이용하여 포유동물의 망막에서 망막 신경 손상 시 나타나는 뮬러글리아 내 PROX1 단백질의 축적을 억제하는 경우, 뮬러글리아의 분열을 촉진시킴으로써 망막신경세포의 재생을 유도할 수 있다. 또한, 상기 PROX1 단백질 결합 분자를 이용하여 뮬러글리아 내 PROX1 단백질의 축적을 억제하는 경우, 식세포작용 및 염증반응을 유도하는 미세교아세포의 증식을 억제하여 효과를 나타낼 수도 있다.

본 발명에서, 상기 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자는 PROX1 단백질의 이동을 억제할 수 있다. 구체적으로, PROX1 단백질에 특이적으로 결합하거나 PROX1 단백질과 뮬러글리아 세포막과의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자는 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하거나 PROX1 단백질과 뮬러글리아 세포막과의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 결합 단편일 수 있다.

본 명세서에서 '항체'는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 망막 손상 이후 뮬러글리아로의 PROX1 단백질의 이동을 억제하기 위해 PROX1 중화 항체를 투여한 결과 뮬러글리아 내 PROX1 단백질 수준이 증가하지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해 안구 내 PROX1 중화 항체의 주입을 통해 뮬러글리아로의 PROX1 단백질 이동을 억제함으로써 뮬러글리아의 분열을 유도할 수 있으며, 장차 뮬러글리아의 망막신경세포로의 재생을 유도할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 a) 서열번호 3으로 기재되는 경쇄 가변 영역; 및 b) 서열번호 4로 기재되는 중쇄 가변 영역;을 포함하는, 항체 또는 그의 결합 단편일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 a) 서열번호 6으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 7로 기재되는 CDR2 영역, 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 b) 서열번호 9로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 10으로 기재되는 CDR2 영역, 및 서열번호 11로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;을 포함하는, 항체 또는 그의 결합 단편일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 6 내지 11로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디 (diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예는 PROX1 단백질에 결합하는 scFv-Fc를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 PROX1 단백질에 결합하는 인간화 단일 사슬 항체(scFv-hFc)를 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 결합 분자의 기능적 변이체를 포함한다. 결합 분자들은 변이체들이 PROX1 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 결합 분자와 경쟁할 수 있고, PROX1 단백질에 대한 중화 능력을 보유한다면 본 발명의 결합 분자의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본원 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체 (truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 PROX1 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 경쇄 또는 중쇄의 상보성 결정 영역 (Complementarity-determining region, CDR)을 포함하나 이에 한정되지 않는 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit를 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자 생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트를 제공한다. 구체적으로, 상기 이뮤노컨쥬게이트는 항체 또는 그의 결합 단편에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 태그는 헥사-히스티딘(His) 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, V5 태그 또는 Flag 태그 일 수 있다. 구체적으로, 상기 태그는 헥사-히스티딘 태그 일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 결합 분자에 약물이 추가로 부착될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 결합 분자는 약제가 결합된 항체-약물 접합체(conjugate)의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체(ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성 뿐만 아니라 폴리클로날 및 모노클로날 항체(mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.

약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 즉 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수 비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.

또한, 본 발명은 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 DNA 서열 또는 서열번호 13으로 표시되는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.

상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국특허등록 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않으며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.

본 발명의 결합 분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다.

상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그(His), 헤마글루티닌 태그(HA), Myc 태그, V5 태그 또는 Flag 태그를 포함하나 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.

또한, 본 발명은 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 항체 또는 그 단편은 망막 신경 손상 시 나타나는 뮬러글리아 내 PROX1 단백질의 축적 억제를 통해 포유동물에서 망막신경의 손상 또는 퇴화에 의한 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 식세포작용 및 염증반응을 유도하는 미세교아세포(microglia)의 증식을 억제하여 망막신경세포의 재생을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 망막신경 퇴행성 질환은 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis; LCA), 망막박리(Retinal Detachment), 황반변성(macular degeneration), 당뇨망막증(diabetic retinopathy), 녹내장(glaucoma), 중심성망막증 및 노인성 망막퇴화로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 망막신경 퇴행성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 망막신경 퇴행성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 조성물은 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 병용하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 신경세포의 분화를 촉진하는 약물과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 주입 백과 같은 주입제, 에어로졸 제제와 같은 분무제, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 제제는 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 주입제, 분무제형, 액상제형 또는 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 안구를 포함한 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 상기 조성물을 포함하는, 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 약학 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형 또는 액상제형인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 약학 제제는 안구 국소투여용인 것 일 수 있다.

또한, 본 발명은 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는, 망막신경 퇴행성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 진단용 키트에 사용되는 본 발명의 결합 분자는 검출 가능하게 표식될 수 있다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다. 검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.

본 발명의 진단용 키트는 샘플과 상기 결합 분자를 접촉시킨 후, 반응을 확인하여 PROX1 단백질의 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.

본 발명의 일 구체예는, a) 상기 결합 분자; 및 b) 용기를 포함하는 키트일 수 있다.

본 발명의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 있어서, 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.

또한, 본 발명은 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 발현하는 아데노부속바이러스 (Adeno-associated virus)를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 아데노부속바이러스는 a) 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 15의 DNA 서열을 포함하는 아데노부속바이러스일 수 있다.

또한, 본 발명은 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 PROX1 (Prospero homeobox protein 1) 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 망막신경 퇴행성 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편의 망막신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편의 망막신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PROX1 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물의, 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본원에 기재된 상기 각 특징들은 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 각 특징들이 특허청구범위의 서로 다른 종속항에 기재된다는 사실은 이들이 조합되어 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.

본 발명의 결합 분자는 PROX1 단백질에 대한 우수한 결합 능력을 가지고, 우수한 중화 효과를 나타내므로, 망막신경 퇴화 질환에 대한 진단, 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

도 1은 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-His)의 PROX1 단백질 중화 효능을 면역침강(immunoprecipitation, IP)을 통해 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-hFc) 제조 방법 및 상기 제조된 단일사슬항체를 웨스턴블롯 (Western blot)을 통해 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 3a는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체의 중화 효능을 in vitro 상에서 확인하는 방법에 관해 나타낸 도이다. 도 3b는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체의 중화 효능을 면역형광염색법을 통해 확인한 도이다.
도 4a는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-hFc)의 생체 내 PROX1 단백질의 이동 억제를 통한 뮬러글리아 세포 분열 촉진 기능을 확인하는 방법에 관해 나타낸 도이다. 도 4b는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-hFc)의 생체 내 PROX1 단백질의 이동 억제를 통한 뮬러글리아 세포 분열 촉진 기능을 면역형광염색법을 통해 확인한 도이다.
도 5a는 인터루킨2(interleukin-2; IL2)의 분비서열(Signal peptide, SP)이 추가된, 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체를 발현하는 제2 혈청형 AAV2 (AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag)를 제작하여, 생후 30일 생쥐의 눈에 주사하는 투여 시기를 나타낸 것이다. 도 5b는 손상된 생쥐 망막에서 IL2'SP -anti-PROX1-scFv-Flag의 발현을 면역형광염색법을 통해 확인한 도이다.
도 6은 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체의 생체 내 PROX1 단백질 이동 억제를 통한 뮬러글리아 세포 분열 촉진 기능을 면역형광염색법을 통해 확인한 도이다.
도 7은 scFv-His의 서열 (clone#1A11)을 나타낸 도이다.
도 8은 scFv-hFc의 서열을 나타낸 도이다.
도 9는 AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag의 서열을 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 및 실험예

실험예 1. 실험재료 및 실험방법

1.1. 실험용 마우스 제작

실험에 사용된 마우스들은 특정 병원체가 없는 마우스 시설에서 유지 및 사육되었으며, 본 연구에서 수행된 모든 동물실험은 한국과학기술원(KAIST)의 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 승인된 프로토콜(KAIST IACUC 13-130)에 따라 수행되었다.

상기 마우스의 눈 망막 손상을 위해, 마우스의 복강에 비히클(0.05% 아세트산이 함유된 PBS) 또는 DNA 손상인자인 N-Methyl-N-nitrosourea(MNU)(비히클에 60 mg/kg)를 주사하여 성체 마우스의 망막에서 광수용체세포(photoreceptor cells; PRs)를 선택적으로 퇴화시켰다.

1.2. 세포배양 및 형질감염

293T와 HeLa 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)에서 유지시켰다. 이어서, 293T 세포를 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 함께 형질 감염시켰으며, HeLa 세포를 제조사의 매뉴얼에 따라 Genjet DNA 시험관 내 형질 감염 시약(Signagen)으로 형질 감염시켰다.

1.3. 세포 공동배양 (Co-culture)

V5-태깅된 인간 PROX1 단백질(V5-PROX1), 혹은 붉은 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP)-태깅된 Tubulin(RFP-Tubulin)을 24시간동안 과발현시킨 HeLa 세포를 Trypisn-EDTA를 처리하여 분리시킨 후, 동일한 개수의 세포를 하나의 세포 배양 플레이트에 모아 공동배양시켰다. 공동배양을 시작할때부터 세포의 생장배지에 PROX1 중화항체를 첨가하여 24시간 추가 배양함으로써 PROX1 중화항체의 세포간 PROX1 단백질의 이동 억제 효과를 확인하였다.

1.4. 면역세포화학염색법(immunocytochemistry, ICC)

커버 슬라이드상에서 공동배양된 HeLa 세포를 20분 동안 4 % PFA/PBS에 고정시켰으며, 이후 실온에서 1시간 동안 차단 용액 (10 % 정상 당나귀 혈청 및 0.1 % Triton X-100을 포함하는 PBS)에서 배양하였다. 그 다음으로, 세포를 16시간 동안 4 ℃에서 Triton X-100이 없는 1차 항체 (Rabbit-anti-RFP (abcam), Chicken-anti-GFP (abcam), mouse-anti-V5(GenWay Biotech))를 포함하는 차단 용액에서 추가로 배양한 후, 1차 항체를 인식하는 형광단-컨쥬게이트된, 2차 항체와 함께 배양하였다. 이어서, ICC 신호의 형광 이미지를 Olympus FV1000 공초점 현미경을 이용하여 획득하였다.

1.5. 면역침강법(immunoprecipitation, IP)

PROX1 단백질 결합 분자의 PROX1 단백질과의 결합 능력을 확인하기 위하여 면역침강(immunoprecipitation, IP) 실험을 수행하였다.

PROX1 단백질을 발현하지 않는 생쥐 대뇌피질(cortex) 조직과 PROX1 단백질을 발현하는 생쥐 망막(retina) 조직으로부터 단백질 샘플을 준비하고 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-His)와 4℃에서 16시간 동안, 이어서 4시간 동안 Ni-NTA 비드와 함께 배양하였다. 이후, Ni-NTA 비드 면역 복합체를 세척완충제 (50mM imidazole 및 프로테아제 억제제)로 5회 세척하고 웨스턴블롯(Western blot) 실험을 수행함으로써 상기 단일사슬항체의 PROX1 단백질과의 결합 능력을 확인하였다.

1.6. 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry, IHC)

마우스 눈을 1시간 동안 4 % 파라포름알데히드 (PFA)를 함유하는 PBS에서 후속 고정을 위해 단리하였다. 이어서, 샘플을 티슈텍 O.C.T.에서 냉동 보존하기 전에 16 시간 동안 4 ℃에서 후속 배양을 위해 20 % 수크로스/PBS 용액으로 이동시켰다. 동결된 마우스 안구 조직 절편(20 μm)을 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액(10% 당나귀 혈청 및 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS)에서 배양하였다. 다음으로, 상기 조직 절편에 Triton X-100이 첨가되지 않고 1차 항체가 포함된 블로킹 용액을 처리하고 4℃에서 16시간 동안 배양하였다 (Rb-anti-Prox1 (milipore), EdU-cy5 (invitrogen), Rabbit-anti-Iba1 (Wako), Goat-anti-Sox2 (R&D), mouse-anti-Flag (sigma)). 이어서 형광단(fluorophore)이 접합된 2차 항체를 처리한 후 배양하고, 이후 Olympus FV1000 공초점 현미경으로 조직 절편의 형광 신호를 관찰 및 분석하였다.

실험예 2. 단일사슬항체 (scFv-His), 인간화 단일사슬항체 (scFv-hFc) 및 분비형 PROX1 중화항체 발현 아데노부속바이러스(AAV) 제작

하기와 같은 방법으로, 단일사슬항체 (scFv-His), 인간화 단일사슬항체 (scFv-hFc) 및 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체 발현 아데노부속바이러스(AAV)를 제작하였다.

실시예 1. His-태킹된 단일사슬항체 (scFv-His) 제작

PROX1 단백질의 호메오도메인을 포함하는 C-말단 재조합단백질을 항원으로 닭 항체 파지 라이브러리 검색 (chicken antibody phage display screening)을 통해 항원과 결합 능력이 있는, His-태킹된 단일사슬항체(anti-PROX1-single chain Fv-His, anti-PROX1-scFv-His) 1종을 확보하였다 (clone#1A11) (도 1 참조).

표 1은 scFv-His (clone#1A11)에 대한 서열이다.

서열번호	서열	명칭
1	LTQPSSVSANLGETVEITCSGGSGSYGWYQQKSPGSAPVTLIYDNANRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGNVDSSTYVGMFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVAAIDDDGSYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGSGYCYRGANSSYTCGTYNAGDIDAWGHGTEVIVSSTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS	단백질 서열
2	AACCTGAGATTAAATGAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCTAGGAGAAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTAGTGGCAGCTATGGCTGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCTATGACAACGCCAACAGACCCTCGAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACGGGCACATTAACCATCACTGGGGTCCGAGCCGAGGATGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAATGTAGACAGCAGCACTTATGTTGGTATGTTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGGGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGCCATGAACTGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCTGCTATTGATGATGATGGTAGTTACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAAGCTGCTGGTAGTGGTTACTGTTATCGTGGTGCTAATAGTAGTTATACTTGTGGTACTTATAACGCTGGTGACATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAGGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGTGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGGGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAG	DNA 서열
3	LTQPSSVSANLGETVEITCSGGSGSYGWYQQKSPGSAPVTLIYDNANRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGNVDSSTYVGMFGAGTTLTVL	경쇄 가변 영역
4	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVAAIDDDGSYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGSGYCYRGANSSYTCGTYNAGDIDAWGHGTEVIVSSTS	중쇄 가변 영역
5	GQSSRSSGGGGSSGGGGS	링커
6	GGSGSYG	CDR 1
7	DNAN	CDR 2
8	GNVDSSTY	CDR 3
9	SYAMN	CDR 4
10	IDDDGSYTGY	CDR 5
11	KAAGSGYCYRGANSSYTCGTYNAGDIDA	CDR 6

실시예 2. 인간화 단일사슬항체 (scFv-hFc) 제작

추가로 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv)를 포유동물세포주(mammalian cell line)에서 발현이 가능하게 하는 동시에, 이들이 2가 결합을 이루어 더 효과적이면서 더 안정적인 구조를 이룰 수 있도록 만들어주기 위하여, 상기 단일사슬항체를 TGEX-SCblue 벡터(Antibody Design Laboratories)로 클로닝하여 human IgG의 Fc부위를 추가함으로써 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-hFc)를 제작하였다.

구체적으로, 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체를 293T 세포에 과발현 시킨 후 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)에서 유지시켰다. 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체의 생산을 확인하기 위하여 세포의 생장배지를 FreeStyle serum-free media (GIBCO BRL)로 교체하고, 3일간 배양 후에 수집하였다. 수집한 배양액을 2,400g, 4 ℃ 조건에서 1시간동안 원심분리하여 PROX1 중화항체가 포함된 상청액 분획을 얻어내고 0.22-um-pore-size filter를 사용하여 여과멸균함으로써 최종 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체를 획득하였다 (도 2 참조).

표 2는 scFv-hFc에 대한 서열이다.

서열번호	서열	명칭
12	METDTLLLWVLLLLAAQPALTQPSSVSANLGETVEITCSGGSGSYGWYQQKSPGSAPVTLIYDNANRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGNVDSSTYVGMFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVAAIDDDGSYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGSGYCYRGANSSYTCGTYNAGDIDAWGHGTEVIVSSTSGPGGPEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*	단백질 서열
13	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTTAGCGGCCCAGCCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCTAGGAGAAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTAGTGGCAGCTATGGCTGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCTATGACAACGCCAACAGACCCTCGAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACGGGCACATTAACCATCACTGGGGTCCGAGCCGAGGATGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAATGTAGACAGCAGCACTTATGTTGGTATGTTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGGGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGCCATGAACTGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCTGCTATTGATGATGATGGTAGTTACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAAGCTGCTGGTAGTGGTTACTGTTATCGTGGTGCTAATAGTAGTTATACTTGTGGTACTTATAACGCTGGTGACATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCCGGGAGGCCCCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA	DNA 서열

세포 배양액의 hFc를 검출하는 웨스턴블롯(Western blot) 실험을 통하여(#1; 대조군 세포의 배양액 30μl, #2; PROX1 중화 단일사슬항체-hFc를 과발현 시킨 세포의 배양액 30μl) 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv-hFc)가 정상적으로 생산되고 있음을 확인하였다 (도 2 참조).

실시예 3. PROX1 중화 단일사슬항체 발현 아데노부속바이러스(AAV) 제작

또한, 항체 단백질 치료제가 가지는 낮은 조직 침투 문제를 극복하고 장기간 중화항체 효과를 유지하고자 본 연구실에서는 본 연구진이 새롭게 확보한 PROX1 중화 단일사슬항체(anti-PROX1-scFv)를 AAV(adeno-associated virus)를 이용해 조직 내에 발현하고자 하였다.

인터루킨2(interleukin-2; IL2)의 분비서열(signal peptide, SP)과 Flag 표지자를 클로닝하여 제2혈청형 AAV2 (AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag, 8.9 x 10¹⁰ Genome Copies/μl)를 제작하였다.

표 3은 AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag에 대한 서열이다.

서열번호	서열	명칭
14	MYRMQLLSCIALSLALVTNSMLTQPSSVSANLGETVEITCSGGSGSYGWYQQKSPGSAPVTLIYDNANRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGNVDSSTYVGMFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVAAIDDDGSYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGSGYCYRGANSSYTCGTYNAGDIDAWGHGTEVIVSSTSGQAGQMDYKDDDDK**	단백질 서열
15	ATGTACAGAATGCAACTCCTGTCTTGTATTGCACTAAGTCTCGCACTTGTCACAAACAGTatgCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCTAGGAGAAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTAGTGGCAGCTATGGCTGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCTATGACAACGCCAACAGACCCTCGAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACGGGCACATTAACCATCACTGGGGTCCGAGCCGAGGATGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAATGTAGACAGCAGCACTTATGTTGGTATGTTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGGGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGCCATGAACTGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCTGCTATTGATGATGATGGTAGTTACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAAGCTGCTGGTAGTGGTTACTGTTATCGTGGTGCTAATAGTAGTTATACTTGTGGTACTTATAACGCTGGTGACATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGatggactacaaagacgatgacgacaagTAGTAG	DNA 서열

실험예 3. His-태깅된 단일사슬항체의 PROX1 단백질과의 결합능 확인

닭 항체 파지 라이브러리 검색을 통해 확보한 His-태킹된 단일사슬항체(anti-PROX1-single chain Fv-His, anti-PROX1-scFv-His) 1종의 PROX1 단백질과의 결합 능력을 확인하기 위하여 면역침강(immunoprecipitation, IP) 실험을 수행하였다.

PROX1 단백질을 발현하지 않는 생쥐 대뇌피질(cortex) 조직과 Prox1 단백질을 발현하는 생쥐 망막(retina) 조직으로부터 단백질 샘플을 준비하고, 이를 His-태킹된 단일사슬항체가 포함된 파지세포막공간추출액(phage periplasmic supernatant)과 4℃에서 16시간 동안, 이어서 4시간 동안 Ni-NTA 비드와 함께 배양하였다. 이후, Ni-NTA 비드 면역 복합체를 세척완충제 (50mM imidazole 및 프로테아제 억제제)로 5회 세척하고 웨스턴블롯(Western blot) 실험을 수행함으로써 PROX1 중화 단일사슬항체의 PROX1 단백질과의 결합 능력을 확인하였다 (도 1 참조).

실험예 4. 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체의 중화 효능 검증

4.1. 생체 외 중화 효능 검증 (in vitro)

상기 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체 (anti-PROX1-scFv-hFc)의 중화 효능을 배양 세포 간 PROX1 단백질 이동 억제 효과를 확인하여 검증하였다 (도 3a 및 3b 참조).

그 결과, 대조군 세포의 배양액을 처리한 경우(control media)에는 PROX1 단백질(옥색)이 공여세포(donor cell, 초록색 세포, 하얀색 화살표)로부터 수용세포(recipient cell, 빨간색 세포, 노란색 화살표)로 이동하여 수용세포 내에 존재하지만 (노란색 실선 동그라미), 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체를 처리한 경우에는 수용세포 (노란색 화살표)내에 PROX1 단백질이 존재하지 않는다는 것을 확인하였다 (하얀색 점선 동그라미) (도 3b 참조).

이는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체가 PROX1 단백질의 세포 간 이동을 효과적으로 억제할 수 있음을 의미하며, 이는 이 항체가 PROX1 단백질에 대한 중화 효능을 가지고 있음을 의미한다.

4.2. 생체 내 중화 효능 검증 (in vivo)

마우스의 복강에 MNU를 주사하여 망막을 손상시키고 1일 후, 마우스 안구에 대조군 생장배지(1μl) 또는 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체(1μl)를 주입하였다. 이때 모든 주사 용액은 블런트 33-게이지 바늘이 장착된 해밀턴 주사기에 로딩하여 마우스 눈의 유리체(vitreal) 공간으로 주사하였다.

안구내 주사 3일 후 생쥐 안구를 적출하여 손상된 생쥐 망막에서 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체의 PROX1 단백질 이동 억제 효과 및 세포분열 촉진 효과를 면역형광염색(immunohistochemistry, IHC)으로 확인하였다. 이때, 신규하게 생성된 세포는 EdU로 표지하였다 (도 4 참조).

손상된 정상 생쥐 망막(왼쪽에서 두 번째 패널) 및 대조군 세포배양액을 주입한 생쥐 망막(왼쪽에서 세 번째 패널)에서는 세포 분열을 의미하는 EdU로 표지된 거의 모든 신생세포들이 Sox2로 표지된 뮬러글리아가 아닌 Iba1으로 표지된 식세포작용 및 염증반응을 유도하는 미세아교세포로 판명된 반면 (하얀색 화살표), 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체가 포함된 세포배양액을 주입한 생쥐 망막(오른쪽에서 첫 번째와 두 번째 패널)에서는 EdU로 표지된 신생 세포들 중 많은 수가 Sox2로 표지되는 뮬러글리아로 판명되었다 (노란색 화살표).

이러한 결과는, 본 연구진이 새롭게 제작한 인간화 PROX1 중화 단일사슬항체는 손상된 생쥐 망막에서 뮬러글리아로의 PROX1 단백질의 이동을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이로써 뮬러글리아의 분열을 유도할 수 있음을 의미한다.

실험예 5. 마우스 안구 내 AAV 주사

상기 제작된 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체를 발현하는 제2혈청형 아데노부속바이러스(AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag)를 생후 30일 생쥐의 눈에 위와 동일한 방법으로 블런트 33-게이지 바늘이 장착된 해밀턴 주사기에 로딩하여 주사(1μl)하였고, 망막 내에 항체가 충분히 발현될 수 있도록 20일간 추가로 사육하였다.

20일 후 MNU 시약을 복강에 주사하여 망막을 손상을 유도하고, 다시 4일 후에 생쥐 안구를 적출하여 손상된 생쥐 망막에서 IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag의 발현을 항체 단백질 말단에 연결된 Flag 표지자를 검출하는 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry, IHC)으로 확인하였다.

그 결과, AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag를 주사한 생쥐 망막(오른쪽에서 첫 번째와 두 번째 패널)에서 PROX1 중화 단일사슬항체가 매우 효과적으로, 그리고 강하게 발현(옥색)되고 있음을 확인하였다 (도 5b 참조).

실험예 6. PROX1 중화 단일사슬항체의 생체 내 PROX1 단백질 이동 억제를 통한 뮬러글리아 세포 분열 촉진 기능 확인

PROX1 중화 단일사슬항체의 PROX1 단백질 이동 억제 효과 및 세포분열 촉진 효과를 확인하기 위해 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체 발현 아데노부속바이러스(AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag)와 대조군 아데노부속바이러스를 도 5a와 같이 생쥐 안구에 주사하고, 해당 생쥐 망막 내 뮬러글리아 분열을 면역형광염색으로 조사하였다 (도 6 참조).

대조군 아데노부속바이러스를 발현한 생쥐 망막에서는 세포 분열을 의미하는 EdU로 표지된 거의 모든 신생세포들이 Sox2로 표지된 뮬러글리아가 아닌 Iba1으로 표지된 식세포작용 및 염증반응을 유도하는 미세아교세포로 판명된 반면 (하얀색 화살표), 분비형 PROX1 중화 단일사슬항체 발현 아데노부속바이러스를 주사한 생쥐 망막에서는 EdU로 표지된 신생 세포들 중 많은수가 Sox2로 표지되는 뮬러글리아로 판명되었다 (노란색 화살표).

이러한 결과는, 상기 PROX1 중화 단일사슬항체가 손상된 생쥐 망막에서 뮬러글리아로의 PROX1 단백질 이동을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이로써 뮬러글리아의 분열을 유도할 수 있음을 의미한다.

<110> KAIST(Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A binding molecules able to neutralize PROX1 protein <130> PD21-452 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His <400> 1 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Ala Asn Arg 35 40 45 Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Gly Asn Val Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Asp Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser 180 185 190 Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg 195 200 205 Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ser Gly 210 215 220 Tyr Cys Tyr Arg Gly Ala Asn Ser Ser Tyr Thr Cys Gly Thr Tyr Asn 225 230 235 240 Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 245 250 255 Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala 260 265 270 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 275 280 <210> 2 <211> 1224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His <400> 2 aacctgagat taaatgagaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc tggtttcgct 60 accgtggccc aggcggccct gactcagccg tcctcggtgt cagcaaacct aggagaaacc 120 gtcgagatca cctgctccgg gggtagtggc agctatggct ggtatcagca gaagtcacct 180 ggcagtgccc ctgtcactct gatctatgac aacgccaaca gaccctcgaa catcccttca 240 cgattctccg gttccaaatc cggctccacg ggcacattaa ccatcactgg ggtccgagcc 300 gaggatgagg ctgtctatta ctgtgggaat gtagacagca gcacttatgt tggtatgttt 360 ggggccggga caaccctgac cgtcctaggt cagtcctcta gatcttccgg cggtggtggc 420 agctccggtg gtggcggttc cgccgtgacg ttggacgagt ccgggggcgg cctccagacg 480 cccggaggag ggctcagcct cgtctgcaag gcctccgggt tcaccttcag cagttatgcc 540 atgaactggg tgcgacaggc gcccggcaag gggctggagt gggtcgctgc tattgatgat 600 gatggtagtt acacaggcta cgggtcggcg gtgaagggcc gtgccaccat ctcgagggac 660 aacgggcaga gcacagtgag gctgcagctg aacaacctca gggctgagga caccgccatc 720 tactactgcg ccaaagctgc tggtagtggt tactgttatc gtggtgctaa tagtagttat 780 acttgtggta cttataacgc tggtgacatc gacgcatggg gccacgggac cgaagtcatc 840 gtctcctcca ctagtggcca ggccggccag caccatcacc atcaccatgg cgcatacccg 900 tacgacgttc cggactacgc ttcttaggag ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag 960 ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga ttttgattat 1020 gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga aaacgtgcta 1080 cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc tgctatcgat 1140 ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg ggattttgct 1200 ggctctaatt cccaaatggc tcag 1224 <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His light chain <400> 3 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Ala Asn Arg 35 40 45 Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Gly Asn Val Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 4 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His heavy chain <400> 4 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Tyr Arg Gly Ala Asn Ser Ser 100 105 110 Tyr Thr Cys Gly Thr Tyr Asn Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His 115 120 125 Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser 130 135 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His linker <400> 5 Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR1 <400> 6 Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 1 5 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR2 <400> 7 Asp Asn Ala Asn 1 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR3 <400> 8 Gly Asn Val Asp Ser Ser Thr Tyr 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR4 <400> 9 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR5 <400> 10 Ile Asp Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-single chain Fv-His CDR6 <400> 11 Lys Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Tyr Arg Gly Ala Asn Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Gly Thr Tyr Asn Ala Gly Asp Ile Asp Ala 20 25 <210> 12 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-scFv-hFc <400> 12 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gln Pro Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu 20 25 30 Thr Val Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr 35 40 45 Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn 50 55 60 Ala Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser 65 70 75 80 Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Asn Val Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Met 100 105 110 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu 130 135 140 Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp 165 170 175 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp 180 185 190 Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala 195 200 205 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn 210 215 220 Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala 225 230 235 240 Gly Ser Gly Tyr Cys Tyr Arg Gly Ala Asn Ser Ser Tyr Thr Cys Gly 245 250 255 Thr Tyr Asn Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val 260 265 270 Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Ser Ser 275 280 285 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 290 295 300 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 305 310 315 320 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 325 330 335 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 340 345 350 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 355 360 365 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 370 375 380 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 385 390 395 400 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 405 410 415 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 420 425 430 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 435 440 445 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 450 455 460 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 465 470 475 480 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 485 490 495 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 500 505 510 Pro Gly Lys *** 515 <210> 13 <211> 1548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PROX1-scFv-hFc <400> 13 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct tagcggccca gccggccctg 60 actcagccgt cctcggtgtc agcaaaccta ggagaaaccg tcgagatcac ctgctccggg 120 ggtagtggca gctatggctg gtatcagcag aagtcacctg gcagtgcccc tgtcactctg 180 atctatgaca acgccaacag accctcgaac atcccttcac gattctccgg ttccaaatcc 240 ggctccacgg gcacattaac catcactggg gtccgagccg aggatgaggc tgtctattac 300 tgtgggaatg tagacagcag cacttatgtt ggtatgtttg gggccgggac aaccctgacc 360 gtcctaggtc agtcctctag atcttccggc ggtggtggca gctccggtgg tggcggttcc 420 gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagg gctcagcctc 480 gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agttatgcca tgaactgggt gcgacaggcg 540 cccggcaagg ggctggagtg ggtcgctgct attgatgatg atggtagtta cacaggctac 600 gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 660 ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccatct actactgcgc caaagctgct 720 ggtagtggtt actgttatcg tggtgctaat agtagttata cttgtggtac ttataacgct 780 ggtgacatcg acgcatgggg ccacgggacc gaagtcatcg tctcctccac tagtggcccg 840 ggaggccccg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 900 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 960 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 1020 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1080 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1140 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca aagccctccc agcccccatc 1200 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1260 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1320 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1380 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1440 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1500 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1548 <210> 14 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag <400> 14 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Met Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu 20 25 30 Gly Glu Thr Val Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 35 40 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr 50 55 60 Asp Asn Ala Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 65 70 75 80 Lys Ser Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu 85 90 95 Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Asn Val Asp Ser Ser Thr Tyr Val 100 105 110 Gly Met Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser 115 120 125 Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val 130 135 140 Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu 145 150 155 160 Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 165 170 175 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala 180 185 190 Ile Asp Asp Asp Gly Ser Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly 195 200 205 Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Tyr Arg Gly Ala Asn Ser Ser Tyr Thr 245 250 255 Cys Gly Thr Tyr Asn Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr 260 265 270 Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Met Asp Tyr 275 280 285 Lys Asp Asp Asp Asp Lys *** *** 290 295 <210> 15 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2/2-IL2'SP-anti-PROX1-scFv-Flag <400> 15 atgtacagaa tgcaactcct gtcttgtatt gcactaagtc tcgcacttgt cacaaacagt 60 atgctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacctaggag aaaccgtcga gatcacctgc 120 tccgggggta gtggcagcta tggctggtat cagcagaagt cacctggcag tgcccctgtc 180 actctgatct atgacaacgc caacagaccc tcgaacatcc cttcacgatt ctccggttcc 240 aaatccggct ccacgggcac attaaccatc actggggtcc gagccgagga tgaggctgtc 300 tattactgtg ggaatgtaga cagcagcact tatgttggta tgtttggggc cgggacaacc 360 ctgaccgtcc taggtcagtc ctctagatct tccggcggtg gtggcagctc cggtggtggc 420 ggttccgccg tgacgttgga cgagtccggg ggcggcctcc agacgcccgg aggagggctc 480 agcctcgtct gcaaggcctc cgggttcacc ttcagcagtt atgccatgaa ctgggtgcga 540 caggcgcccg gcaaggggct ggagtgggtc gctgctattg atgatgatgg tagttacaca 600 ggctacgggt cggcggtgaa gggccgtgcc accatctcga gggacaacgg gcagagcaca 660 gtgaggctgc agctgaacaa cctcagggct gaggacaccg ccatctacta ctgcgccaaa 720 gctgctggta gtggttactg ttatcgtggt gctaatagta gttatacttg tggtacttat 780 aacgctggtg acatcgacgc atggggccac gggaccgaag tcatcgtctc ctccactagt 840 ggccaggccg gccagatgga ctacaaagac gatgacgaca agtagtag 888

Claims

PROX1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 a) 서열번호 3으로 기재되는 경쇄 가변 영역; 및 b) 서열번호 4로 기재되는 중쇄 가변 영역;을 포함하는, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 a) 서열번호 6으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 7로 기재되는 CDR2 영역, 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 b) 서열번호 9로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 10으로 기재되는 CDR2 영역, 및 서열번호 11로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 결합 단편은 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 4에 있어서, 상기 항체는 인간화 단일 사슬 항체인 것인, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 결합 단편은 PROX1 단백질 중화능이 있음을 특징으로 하는, 항체 또는 그의 결합 단편.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트.
청구항 7에 있어서, 상기 태그는 헥사-히스티딘(His) 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, V5 태그 및 Flag 태그로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 이뮤노컨쥬게이트.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
청구항 9의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는, 망막신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 망막신경 퇴행성 질환은 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis; LCA), 망막박리(Retinal Detachment), 황반변성(macular degeneration), 당뇨망막증(diabetic retinopathy), 녹내장(glaucoma), 중심성망막증 및 노인성 망막퇴화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 망막신경 퇴화 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는, 망막신경 퇴화 질환 예방 또는 치료용 키트.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편을 발현하는, 아데노부속바이러스 (Adeno-associated virus).
청구항 14에 있어서, 상기 아데노부속바이러스는 a) 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 b) 서열번호 15의 DNA 서열을 포함하는, 아데노부속바이러스.