BR112019013953A2

BR112019013953A2 - Anticorpo anti-a-syn e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019013953A2
Application number: BR112019013953-2A
Authority: BR
Inventors: Ahn Jinhyung; An Sungwon; Kim Dongin; Sung Eunsil; Eom Jaehyun; Hoon Lee Sang; Lee Seung-Jae; Kyung Kim Tae; Sun Choi Min; You Weonkyoo; Jung Jaeho; Kim Juhee; Jung Jinwon; Kim Yeunju; Son Yonggyu; Sung Byungje
Original assignee: Abl Bio Inc.
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2020-02-11
Also published as: MX2019008029A; CN110494445B; EA201991464A1; US20230227540A1; JP6908709B2; KR102014066B1; KR20180081465A; EA039807B1; JP2020515233A; CN110494445A

Abstract

a divulgação revela anticorpos anti a-syn que reconhecem preferencialmente agregados a-syn. os anticorpos da presente invenção se ligam a agregados a-syn com alta afinidade e especificidade e inibem o acúmulo ou transferência intercelular de agregados a-syn, e assim podem ser usados para detecção, diagnóstico e/ou tratamento ou prevenção de várias doenças causadas pelo acúmulo de agregados a-syn.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ANTICORPO ΑΝΤΙ-α-SYN E USO DO MESMO

CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a um anticorpo antiα-syn e seu uso.

ANTECEDENTE DA TÉCNICA [002] A alfa-sinucleina (α-syn) é uma proteína composta por 140 aminoácidos que é expressa principalmente nos terminais pré-sinápticos dos neurônios. É um monômero naturalmente desdobrado em condições normais. A alfasinucleína é conhecida por manter o suprimento de vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos e por regular a liberação de dopamina, que é um neurotransmissor que controla os movimentos voluntários ou involuntários.

[003] No entanto, em condições patológicas, a alfasinucleína sofre alterações estruturais através da ligação e interação com gotículas, bicamadas fosfolipídicas ou membranas lipídicas etc. para formar agregados incluindo, por exemplo, dímeros, oligômeros e/ou moléculas fibrosas, por meio de estrutura secundária α-helicoidal dobrada ou dobrada da alfa-sinucleína. Sabe-se que estes agregados causam toxicidade às células e são o principal componente de um agregado proteico anormal de corpos de Lewy que são encontrados em neurônios da doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy e várias outras doenças. Além disso,

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2/164 modificações pós-traducionais, tal como a fosforilação ou a ubiquitinação da alfa-sinucleína, também são conhecidas por estarem envolvidas na agregação e neurotoxicidade da alfasinucleína.

[004] Sabe-se que a agregação da alfa-sinucleína está associada à causa da doença de Parkinson (DP), demência da doença de Parkinson (DCP) , demência com corpos de Lewy (DLB), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e várias doenças neurodegenerativas denominadas α-sinucleinopatias, incluindo muitas doenças neuro-axonais (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73).

[005] Além disso, ambas as formas oligoméricas e monoméricas de alfa-sinucleína foram encontradas em amostras de líquido cefalorraquidiano e plasma de pacientes com doença de Parkinson, indicando que agregados de alfa-sinucleína com pequeno peso molecular podem penetrar na membrana celular e acessar o espaço extracelular. Também foi demonstrado que a alfa-sinucleína dobrada pode ser liberada a partir das células por exocitose e, em seguida, transferida de uma região do cérebro para outra região por transferência intercelular como proteínas priônicas (Brundin P. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2010, 11: 301-307).

[006] Portanto, a alf a-sinucleína é um alvo para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para a asinucleinopatia, tal como a doença de Parkinson. As

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3/164 principais estratégias de desenvolvimento incluem inibição da formação de agregados, silenciamento gênico e remoção de agregados. No primeiro caso, Epigalocatequina-3-galato (EGCG) (Bieschke J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 2010 107: 7710-7715), 3-(1,3-benzodioxol-bromofenil)-IH-pirazol (anlel38b) (Wagner J. et al. Acta Neuropathol 2013, 125: 795-813), CLR0120 (Prabhudesai S. et al. Neurotherapeutics 2012, 9: 464-476) e KYP-20479 do inibidor da prolil oligopeptidase (Myohanen TT et al. Brit J Pharmacol 2012, 166: 1097-1113) estão incluídos. Anticorpos que se ligam à alfa-sinucleína são divulgados na patente US 8.609.820, US 8.940.276 e semelhantes.

[007] Os compostos com um baixo peso molecular devem ser administrados em altas doses, devido à baixa capacidade de ligação específica direcionada e meia-vida curta. Em comparação com os compostos com baixo peso molecular, o anticorpo tem uma especificidade de alvo e meia-vida longa. No entanto, para aumentar o potencial terapêutico da doença, são necessários anticorpos preferencialmente ligados aos agregados com alta afinidade.

[008] Por conseguinte, para o tratamento de doenças associadas com a acumulação anormal de agregados de a-Syn, é necessário o desenvolvimento de anticorpos capazes de se ligarem preferencialmente à alfa-sinucleína, particularmente agregados de alfa-sinucleína.

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DIVULGAÇÃO

PROBLEMA TÉCNICO [009] A presente invenção é para fornecer um anticorpo que reconhece especificamente a α-syn, especialmente o agregado de α-Syn com alta afinidade de ligação.

SOLUÇÃO TÉCNICA [0010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-Syn ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção compreende (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade de CDRH1, CDRH2 e CDRH3, e/ou (ii) região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade de CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e o CDRH1 é qualquer um selecionado a partir das SEQ ID NOs: 1 a 14; e o CDRH2 é qualquer um selecionado entre as SEQ ID NOs: 15 a 28; e o CDRH3 é qualquer um selecionado entre as SEQ ID NOs: 29 a 42; e o CDRL1 é qualquer um selecionado entre as SEQ ID NOs: 43 a 56; e o CDRL2 é qualquer um selecionado entre as SEQ ID NOs: 57 a 70; e o CDRL3 é qualquer um selecionado entre as SEQ ID NOs: 71 a 84.

[0011] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção compreende (i) uma região variável da cadeia pesada

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5/164 compreendendo as regiões determinantes de complementaridade de CDRH1, CDRH2 e CDRH3, e/ou (ii) uma região variável da cadeia leve compreendendo as regiões determinantes de complementaridade de CDRL1, CDRL2 e CDRL3:

[	0012] (aa) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	1,	15 e
29,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :
43,	57 e 71, respectivamente;
[	0013] (ab) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	s ID SEQ NOs:	2,	16 e
30,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3 s SEQ	ID	NOs :
44,	58 e 72, respectivamente;
[	0014] (ac) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	3,	17 e
31,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :
45,	59 e 73, respectivamente;
[	0015] (ad) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	4,	18 e
32,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :
46,	60 e 74, respectivamente;
[	0016] (ae) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	5,	19 e
33,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :
47,	61 e 75, respectivamente;
[	0017] (af) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	6,	20 e
34,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :
48,	62 e 76, respectivamente;
[	0018] (ag) CDRH1, CDRH2 e	CDRH3	são SEQ	ID NOs:	7,	21 e
35,	respectivamente, e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são SEQ	ID	NOs :

49, 63 e 77, respectivamente;

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[0019]	(ah) CDRH1,	CDRH2 e	CDRH3	são	SEQ	ID	NOs :	θ,	22 e
36, respectivamente,	e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são	SEQ	ID	NOs :
50, 64 e	78, respectivamente;
[0020]	(ai) CDRH1,	CDRH2 e	CDRH3	são	SEQ	ID	NOs :	9,	23 e
37, respectivamente,	e CDRL1,	CDRL2	e CDRL3	são	SEQ	ID	NOs :
51, 65 e	79, respectivamente;
[0021]	(aj) CDRH1,	CDRH2 e	CDRH3	são	SEQ	ID	NOs :	10	, 24

e 38, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 52, 66 e 80, respectivamente;

[0022] (ak) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 11, 25 e 39, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 53, 67 e 81, respectivamente;

[0023] (al) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 12, 26 e 40, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 54, 68 e 82, respectivamente;

[0024] (am) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 13, 27 e 41, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 55, 69 e 83, respectivamente; ou [0025] (an) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 14, 28 e 42, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 56, 7 0 e 84.

[0026] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada do anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-Syn ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção incluem uma sequência

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7/164 de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 85 a 98, pelo menos de 90% ou mais tendo identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 85 a 98, ou pelo menos 95% ou mais tendo identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 85 a 98.

[0027] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve do anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-Syn ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção, incluem uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 99 e 112, pelo menos 90% ou mais possuindo uma sequência de identificação de uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 99 e 112, ou, pelo menos, 95% ou mais possuindo uma sequência de identificação de uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 99 a 112.

[0028] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-Syn ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção inclui qualquer um da região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve como segue. As sequências da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve podem incluir a SEQ ID NO: 85 e 99; SEQ ID NO: 86 e 100; SEQ ID NO: 87 e 101; SEQ ID NO: 88 e 102; SEQ ID NO: 89 e 103; SEQ ID NO: 90 e 104; SEQ ID NO: 91

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8/164 e 105; SEQ ID NO: 92 e 106; SEQ ID NO: 93 e 107; SEQ ID NO: 94 e 108; SEQ ID NO: 95 e 109; SEQ ID NO: 96 e 110; SEQ ID NO: 97 e 111; ou SEQ ID NO: 98 e 112.

[0029] Alguns anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser um anticorpo monoclonal ou fragmento scFV, e o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligando a um agregado de a-Syn.

[0030] O anticorpo da presente invenção pode ser anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico.

[0031] O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser dos tipos IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0032] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento, F(ab') fragmento, diacorpo ou scFV.

[0033] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-syn ou ao fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção inclui qualquer uma das cadeias pesada e leve como se segue. As sequências da cadeia pesada e da cadeia leve são a SEQ ID NO: 113 e a SEQ ID NO: 141; SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 143; SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 146; SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO:

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147; SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 153; ou SEQ ID NO: 126 e SEQ ID NO: 154. O anticorpo inclui IgG2a de camundongo como região constante .

[0034] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado de α-syn ou ao fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção inclui qualquer uma das cadeias pesada e leve como se segue. As sequências da cadeia pesada e da cadeia leve são SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 130 e SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 161; SEQ ID NO: 134 e SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 135 e SEQ ID NO:

163; SEQ ID	NO: 136 e	SEQ	ID	NO:	164;	SEQ ID	NO	: 137 e	SEQ
ID NO: 165;	SEQ ID NO:	138	e	SEQ ID NO	: 16 6;	SEQ	ID NO:	139
e SEQ ID NO	: 167; ou	SEQ	ID	NO:	140	e SEQ	ID	NO: 168	. O

anticorpo inclui IgGl humana como região constante.

[0035] Um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para a inibição da transferência intercelular do agregado de aSyn; degrada o agregado de α-Syn; ou inibe a formação de agregados a-Syn.

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10/164 [0036] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um polinucleotideos isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção. Exemplos de tais polinucleotideos incluem as sequências representadas pelas SEQ ID NOs: 169 a 224.

[0037] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção.

[0038] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma célula ou linhagem celular procariótica ou eucariótica transformada com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

[0039] Em outra modalidade, a presente invenção fornece ainda um método para produzir um anticorpo isolado que se liga especificamente a α-Syn ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo a cultura da célula da presente invenção sob as condições que suficientemente expressam o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e o isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da linhagem celular.

[0040] Em outra modalidade, a presente invenção também fornece um kit ou composição que compreende um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção, em que a composição pode ser fornecida como uma composição farmacêutica ou de diagnóstico. A

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11/164 composição farmacêutica pode compreender um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e a composição de diagnóstico pode ainda compreender reagentes necessários para diagnóstico ou detecção.

[0041] A composição farmacêutica ou um kit de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para o tratamento de α-sinucleinopatia. Por exemplo, a α-sinucleinopatia pode ser selecionada do grupo que consiste em doença de Parkinson (DP) , demência da doença de Parkinson (DCP), demência com corpos de Lewy (DLB), variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, ou atrofia de múltiplos sistemas (MSA).

[0042] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de detecção de um agregado de α-Syn em uma amostra biológica, compreendendo o fornecimento de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, contactando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com uma amostra biológica para ser detectado para o agregado de α-Syn. As amostras biológicas incluem várias amostras que requerem a detecção do agregado de α-Syn, incluindo, por exemplo, fluido cerebrospinal, sangue incluindo plasma ou urina, e células, tecidos ou órgãos. O método pode ser realizado in vitro ou in vivo. A imagiologia in vivo pode ser realizada utilizando, por exemplo, tomografia por emissão de positron (PET),

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12/164 tomografia por emissão de fotons simples (SPECT), imagiologia ótica de infravermelhos próximos (NIR) ou imagiologia por ressonância magnética (MRI).

[0043] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de α-sinucleinopatia de um indivíduo ou modular uma concentração de agregado de α-Syn no indivíduo, a administração de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção, ou uma composição compreendendo o mesmo, para o indivíduo com necessidade de um tratamento de alfasinucleinopatia e/ou modulação da concentração de um agregado de a-Syn.

[0044] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de diagnóstico de alfa-sinucleinopatia, em um indivíduo com necessidade do diagnóstico de alfasinucleinopatia, em que o método compreende a medição/detecção de uma concentração ou de localização intercelular do agregado de α-Syn no indivíduo utilizando qualquer anticorpo ou fragmento de ligação antígeno do mesmo da presente invenção, e comparando a concentração ou a localização intercelular do agregado de α-Syn medido no indivíduo com a de uma amostra de controle, e em que a similaridade ou diferenças em comparação com o resultado da amostra de controle representa o indivíduo com asinucleinopatia. No método, o grupo controle pode ser uma

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13/164 amostra normal ou uma amostra de paciente com asinucleinopatia.

[0045] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um uso do anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno ou uma composição compreendendo o mesmo, no tratamento de asinucleinopatia em um indivíduo com uma a-sinucleinopatia, em que o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo destes ou uma composição compreendendo os mesmos inibe a transferência intercelular do agregado de α-Syn, degrada o agregado de α-Syn; ou inibe a formação de agregados a-Syn no indivíduo, ou no cérebro do indivíduo.

[0046] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um uso do anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno ou uma composição compreendendo o mesmo, na modulação da concentração do agregado de α-Syn em uma célula do cérebro, em que o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma composição que apresente o mesmo inibe a transferência intercelular do agregado de α-Syn, degrada o agregado de α-Syn; ou inibe o agregado de α-Syn no cérebro do indivíduo.

EFEITOS VANTAJOSOS [0047] Os anticorpos aqui divulgados se ligam preferencialmente a α-Syn, especialmente ao agregado de aSyn, com elevada afinidade de ligação. O anticorpo e os fragmentos de ligação ao antígeno com alta afinidade podem

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14/164 reduzir a formação de agregados α-Syn e reduzir a concentração de agregados no cérebro. Além disso, o anticorpo e os fragmentos de ligação ao antígeno com alta afinidade ao agregado de α-Syn podem reduzir a formação do agregado de aSyn fora do sistema nervoso central, resultando na redução da concentração de agregados no sistema nervoso central, alterando o estado de equilíbrio da forma de α-Syn no limite da barreira hematoencefálica.

[0048] Também tem a vantagem de ser administrado em baixa dosagem devido à alta afinidade. Isto tem grandes vantagens clínicas, uma vez que o anticorpo, por exemplo, pode ser administrado da mesma maneira que uma injeção subcutânea mais simples, de modo a conseguir eficácia suficiente, mas não é limitado a.

[0049] Os anticorpos aqui divulgados podem efetivamente remover o agregado de α-Syn e promover a degradação, e inibir a transferência intercelular de α-Syn, sendo deste modo úteis para o tratamento de doenças associadas com a acumulação do agregado de a-Syn.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0050] A Figura 1 é um resultado de dot-blot mostrando que o anticorpo monoclonal produzido se liga preferencialmente ao agregado de α-syn, como um resultado da medição se o anticorpo monoclonal reconhece ou não especificamente a α-syn nativa na forma agregada.

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15/164 [0051] A Figura 2 é um resultado de análise por ELISA da afinidade do anticorpo monoclonal produzido em uma modalidade da presente invenção. O anticorpo da presente invenção se liga preferencialmente ao agregado de α-syn com elevada afinidade, mas a afinidade para um monômero não pode ser obtida devido à afinidade mais baixa do que o agregado ou nenhuma ligação ao monômero. Estes resultados indicam que é possível remover ou inibir eficazmente a atividade de agentes causadores de doenças neurodegenerativas com uma patogênese da alfa-sinucleína, tal como a doença de Parkinson.

[0052] A Figura 3a é o resultado da análise de BIAcore para a especificidade de ligação preferencial e afinidade do anticorpo monoclonal produzido em uma modalidade da presente invenção para o agregado de α-syn. O resultado indica que o anticorpo da presente invenção se liga preferencialmente ao agregado de α-Syn com alta afinidade. Estes resultados indicam que é possível remover ou inibir eficazmente a atividade de agentes causadores de doenças neurodegenerativas com uma patogênese da alfa-sinucleína, tal como a doença de Parkinson.

[0053] A Figura 3b é uma tabela mostrando os resultados da Figura 3a.

[0054] A Figura 4 é o resultado da análise de Octeto quanto à especificidade de ligação preferencial do anticorpo

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16/164 monoclonal produzido em uma modalidade da presente invenção que se liga preferencialmente ao agregado de α-Syn. 0 resultado mostra que o anticorpo da presente invenção se liga preferencialmente ao agregado de α-syn e é consistente com o resultado da Figura 1. 0 anticorpo # 274 utilizado como um grupo comparativo revelou-se ligar bem a monômeros e agregados.

[0055] A Figura 5 é um resultado de dot-blot mostrando que o anticorpo monoclonal selecionado pela técnica de apresentação de fagos em uma modalidade da presente invenção se liga preferencialmente ao agregado de α-syn, como um resultado de medir se o anticorpo monoclonal reconhece ou não especificamente o α-syn nativo na forma agregada.

[0056] A Figura 6 resultado da análise de Octeto para a especificidade de ligação preferencial do anticorpo monoclonal utilizado na Figura 5 para o agregado de a-syn. O resultado mostra que o anticorpo da presente invenção se liga preferencialmente ao agregado de α-syn. Este resultado indica que é possível remover ou inibir a atividade de agentes causadores de doenças neurodegenerativas com uma patogênese de alfa-sinucleína, tais como a doença de Parkinson de forma eficaz.

[0057] A Figura 7 mostra o princípio e o resultado da experiência de analisar se o anticorpo monoclonal produzido em uma modalidade da presente invenção inibe a transmissão

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17/164 célula-a-célula de α-syn. Aqui, azul é o núcleo e verde é o sinal quando a α-syn liberada de uma célula é propagada para outra célula e forma agregados ao encontrar outra α-syn. 0 número de células que exibem um sinal verde versus uma IgG de controle negativo foi significativamente reduzido quando os anticorpos 9B11, 3A9 e 11F11, de acordo com a presente invenção foram tratados. Este resultado indica que o anticorpo da presente invenção, que se liga especificamente a agregados com elevada afinidade, pode inibir eficazmente a transferência intercelular de a-syn.

[0058] A Figura 8a mostra o resultado de analisar se o anticorpo monoclonal produzido em uma modalidade da presente invenção remove o agregado de α-Syn em um modelo animal de camundongo (TG) superexpressando a α-Syn humana, colorindo o tecido cerebral do camundongo com p-129 α-syn depois de administrar o anticorpo ao camundongo e medi-lo. Na figura, HP é Hippocampus, p-129 α-syn é um fabricante de agregados na forma do 129° resíduo fosforilado de α-syn, e a seta indica α-syn fosforilada. Este resultado mostra que o anticorpo da presente invenção pode eliminar notavelmente asyn. WT e IgG são controles negativos e o anticorpo 274 é um grupo comparativo que liga tanto monômeros como agregados. Estes resultados indicam que o anticorpo da presente invenção pode inibir eficazmente a acumulação de agregados de a-syn

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18/164 e assim pode ser eficazmente utilizado para a prevenção e/ou tratamento de doenças relacionadas com a α-Sinpatogênese.

[0059] A Figura 8b é um resultado da mesma experiência que na Figura 8a, mas como um marcador, utilizando o anticorpo contra α-syn total. A seta representa a a-syn humana. Os anticorpos 9B11, 11F4 e 11F11 inibiram eficazmente a acumulação de α-syn. A detecção de α-syn indica que o anticorpo da presente invenção tem a capacidade de limpar a própria sinucleina e inibir a transmissão celular de a-syn. Em outro aspecto, isso também pode ser interpretado como inibindo a formação de monômeros em agregados, ou removendo todos os monômeros.

[0060] A Figura 9a mostra o resultado da análise de se o anticorpo monoclonal produzido de uma modalidade da presente invenção pode reduzir a microgliose ín vivo, por coloração do tecido cerebral de camundongo com anticorpo Iba-1 (microgliose) como um marcador após a administração do anticorpo para o camundongo e medindo-o. A seta indica microglia ativada, e o resultado indica que a ativação microglial é significativamente reduzida nos cérebros de camundongos nos quais foram administrados os anticorpos 3A9, 9B11 e 11F11.

[0061] A Figura 9b mostra o resultado da análise de se o anticorpo monoclonal produzido de uma modalidade da presente invenção pode reduzir a microgliose in vivo, por coloração

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19/164 do tecido cerebral de camundongo com o anticorpo GFAP (astrogliose) após a administração do anticorpo para o camundongo e medi-lo. A seta indica astrócito ativado e ο resultado indica que os anticorpos 3A9, 9B11 e 11F11 efetivamente inibem a astrogliose em um nível significativo.

[0062] A Figura 9c mostra o resultado da análise de se o anticorpo monoclonal produzido de uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias ín vivo, por coloração do tecido cerebral de camundongo com um anticorpo beta IL-1 como um marcador após a administração do anticorpo para o camundongo e medi-lo. As setas indicam células expressando IL-1 beta. A IL-1 beta induz inflamação e morte de várias células nervosas. A IL-1 beta é significativamente reduzida no tecido cerebral de camundongos administrados com o anticorpo da presente invenção.

[0063] A Figura 9d mostra o resultado da análise de se o anticorpo monoclonal produzido de uma modalidade da presente invenção pode reduzir as citocinas inflamatórias ín vivo, por coloração do tecido cerebral de camundongo com anticorpo IL-6 como um marcador após a administração do anticorpo para o camundongo e medi-lo. As setas indicam células expressando IL-6 de uma citocina inflamatória. O resultado indica que a IL-6 foi reduzida no tecido cerebral de camundongos administrados com o anticorpo da presente invenção.

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20/164 [0064] As Figuras 10a e 10b mostram o resultado da medição que os anticorpos monoclonais 3A9 e 11F11 produzidos em uma modalidade da presente invenção podem reconhecer especificamente os corpos de Lewy e neurites de Lewy, em tecido cerebral humano, respectivamente. Isto mostra que os anticorpos da presente invenção se ligam aos corpos de Lewy (seta) e às neurites de Lewy (forma de rosca inferior, esquerdo). Estes resultados indicam que o anticorpo da presente invenção pode especificamente se ligar a agregados de α-syn em tecido cerebral humano e pode ser eficazmente utilizado para a prevenção e/ou tratamento de doenças relacionadas com a patogênese de a-Syn.

[0065] A Figura 11 é uma representação gráfica dos resultados de mapeamento de epítopo dos anticorpos produzidos na presente invenção, e os anticorpos da presente invenção ligam-se principalmente à região C-terminal. Os anticorpos α-syn que reconhecem o N-terminal não reconhecem agregados de outras doenças, tal como a atrofia de múltiplos sistemas (MSA) pertencente à sinucleionopatia, mas os anticorpos α-syn que reconhecem o C-terminal têm uma vantagem de reconhecer não apenas a doença de Parkinson, mas também os agregados de outras várias doenças da sinucleinopatia.

MODO DE INVENÇÃO [0066] A presente invenção se refere a um método para detectar o agregado de α-Syn, bem como reduzir o agregado de

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21/164 α-Syn, inibir a formação do agregado de α-Syn e/ou agregado de α-Syn e/ou inibir transferência celular do agregado de aSyn, com base no desenvolvimento de anticorpos capazes de se ligar ao agregado de α-Syn com alta especificidade.

[0067] Os títulos utilizados na presente seção são apenas para conveniência da especificação e não limitam a presente invenção.

[0068] Salvo indicação em contrário, os termos científicos e técnicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que o normalmente entendido pelos especialistas na técnica. Além disso, a menos que o contexto exija especificamente, o singular inclui o plural e o plural inclui o singular.

Definição [0069] Aqui, polinucleotídeo ou ácido nucleico inclui um polímero nucleotídico de cadeia simples ou dupla. O nucleotídeo compreendendo esse polinucleotídeo pode ser um ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo ou as suas formas modificadas.

[0070] A menos que aqui indicado de outro modo, a extremidade esquerda do polinucleotídeo aqui declarado é a extremidade 5' e a sua extremidade direita representa a extremidade 3'.

[0071] Aqui, molécula isolada de ácido nucleico significa DNA ou RNA de origem genômica ou mRNA, cDNA de

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22/164 origem sintética ou suas combinações, que está ligado ao polinucleotideo que toda ou uma porção dele não está associada a um polinucleotideo presente na natureza, ou não é observado na natureza. No propósito da presente invenção, a molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência especifica de ácido nucleico não compreende um cromossoma intacto. Em vez disso, a molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência especifica de ácido nucleico pode compreender pelo menos várias sequências de codificação de proteínas adicionais, em adição a sua sequência específica, ou pode ainda compreender uma sequência reguladora e/ou um vetor para a expressão da sequência de ácido nucleico específica.

[0072] Aqui, o termo sequência reguladora significa uma sequência polinucleotídica que pode afetar a expressão e o processamento de uma sequência codificante estando operativamente ligada a ela. Esta propriedade da sequência reguladora pode ser influenciada por tipos de hospedeiros. Por exemplo, a sequência reguladora aplicável em uma célula procariótica pode incluir um promotor, ocasionalmente um operador, um sítio de ligação ao ribossoma e uma sequência de terminação da transcrição. Em uma célula eucariótica, a sequência reguladora pode compreender um promotor compreendendo múltiplos sítios de reconhecimento, um intensificador de transcrição, uma sequência de

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23/164 poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição. A sequência reguladora pode ainda compreender uma sequência de leitura e/ou uma sequência de parceiros de fusão.

[0073] Aqui, vetor significa qualquer molécula utilizada para distribuir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína para uma célula hospedeira, compreendendo, por exemplo, um ácido nucleico, um plasmídeo, um bacteriófago ou um vírus.

[0074] Aqui, vetor de expressão significa um vetor que é adequado para a transformação de uma célula hospedeira e compreende uma sequência de ácido nucleico que está operativamente conectada a um vetor de expressão e regula a expressão de sequências heterólogas que codificam uma proteína alvo. Este vetor de expressão pode também estar operativamente ligado à sequência de codificação, e no caso de transcrição, tradução e de que um intron está presente, pode compreender uma sequência que regula o processamento de RNA ou o afeta.

[0075] Aqui, operacionalmente conectado significa que as sequências de ácido nucleico a serem conectadas são posicionadas de modo a realizar uma função de direcionamento sob uma condição apropriada. Por exemplo, se a transcrição da sequência de codificação é afetada pela sequência reguladora sob uma condição adequada em um vetor que

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24/164 compreende uma sequência de codificação e uma sequência reguladora, que está operacionalmente ligado.

[0076] Aqui, célula hospedeira significa uma célula que pode expressar um gene alvo que é transformado ou para ser transformado por uma sequência de ácido nucleico de direcionamento. O termo inclui a descendência da célula hospedeira, desde que expresse o gene alvo, independentemente da identidade da célula hospedeira e da forma e composição genética.

[0077] Aqui, transdução significa comumente o movimento de um ácido nucléico de uma bactéria para outra bactéria por um bacteriófago. Por exemplo, inclui o movimento de um ácido nucleico para uma célula eucariótica usando um retrovirus que não pode replicar.

[0078] Aqui, transfecção significa que uma célula toma um DNA estranho ou exógeno, e neste caso, o DNA é introduzido em uma célula através de uma membrana celular. Isto pode referir a métodos conhecidos na técnica, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2012), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates.

[0079] Aqui, transformação significa uma mudança de propriedades genéticas de uma célula, que são modificadas de modo que uma célula compreenda um novo DNA ou RNA. Por

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25/164 exemplo, uma célula pode ser transformada à medida que suas propriedades genéticas são alteradas, introduzindo um novo material genético por meio de transdução, transfecção ou outras técnicas. 0 DNA transformado por métodos incluindo transdução ou transfecção etc., pode estar presente por estar fisicamente integrado em um cromossoma de uma célula, ou pode estar temporariamente presente como uma forma de epissoma sem replicação ou um plasmideo replicável. Quando o DNA transformado é replicado com a divisão de uma célula hospedeira, é considerado como transformado de forma estável.

[0080] Aqui, aminoácido inclui o significado comum entendido na técnica. Vinte aminoácidos de ocorrência natural e as suas abreviaturas são como as habitualmente utilizados na técnica (Imunology-A Synthesis, 2a Edição, E. S. Golub e D.R. Green, eds., Sinauer Associates: Sunderland, Mass. 1991) . O aminoácido inclui aminoácidos típicos, estereoisômeros de 20 aminoácidos típicos (D-aminoácidos), aminoácidos não naturais, por exemplo, aminoácidos α,αdissubstituídos, aminoácidos N-alquil e outros aminoácidos não-típicos. Como exemplos de aminoácidos não típicos, 4hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetillisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, o-Nmetilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes

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26/164 (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na marca do polipeptídeo aqui utilizado, como vulgarmente utilizado na técnica, a esquerda de uma sequência é um terminal amino e a direita representa um terminal carboxil.

[0081] Aqui, polipeptídeo ou proteína significa um polímero de um resíduo de aminoácido, e é aqui usado indistintamente. Isto também inclui não só os polímeros de ocorrência natural de resíduos de aminoácido, mas também polímeros de seus análogos ou miméticos. Além disso, o polipeptídeo ou a proteína podem compreender a modificação tal como a adição de carboidratos para a fosforilação ou glicosilação etc. Além disso, o polipeptídeo ou a proteína podem ser produzidos em uma célula recombinante ou encontrados naturalmente. Além disso, o polipeptídeo ou proteína pode incluir aqueles em que uma porção de uma sequência do tipo selvagem ou a sequência de aminoácidos é eliminada, adicionada e/ou substituída. Adicionalmente, o polipeptídeo ou proteína inclui um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-a-syn (ou denominado como anticorpo asyn), proteína de ligação à α-syn ou um fragmento de ligação ao antígeno, ou uma sequência na qual um ou mais aminoácidos na sequência são eliminados, adicionados e/ou substituídos. Além disso, fragmento polipeptídico significa um polipeptídeo possuindo uma deleção do terminal amino, uma deleção do terminal carboxil e/ou uma deleção interna, em

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27/164 comparação com uma proteína inteira. Este fragmento também pode incluir aminoácidos modificados em comparação com uma proteína de comprimento total. Em uma modalidade, o fragmento pode ter cerca de 5 a 500 aminoácidos de comprimento, por exemplo, pelo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450, ou mais aminoácidos de comprimento. Considerando o objetivo da presente invenção, o fragmento polipeptídico útil inclui um fragmento funcional imunológico de um anticorpo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno. No caso do anticorpo de ligação a aSyn, um tal fragmento útil inclui uma sequência CDR compreendendo 1, 2 ou 3 de cadeias pesadas ou cadeias leves, ou a totalidade ou uma porção da cadeia de anticorpo compreendendo uma região variável ou região constante de uma cadeia pesada ou cadeia leve, mas não limitada.

[0082] Aqui, polipeptídeo, anticorpo ou proteína isolados são aqueles em que não existe qualquer outra proteína a ser encontrada em conjunto com eles comumente e pelo menos cerca de 50% ou mais de lipídeos, carboidratos e polinucleotídeos ligados naturalmente a eles são removidos. Tipicamente, a proteína, polipeptídeo ou anticorpo isolado compreende pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25% ou pelo menos cerca de 50%, em uma certa composição. Este polipeptídeo pode ser codificado por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA de origens sintéticas

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28/164 ou quaisquer combinações dos mesmos. Em particular, a proteína isolada, polipeptídeo ou anticorpo está substancialmente livre de contaminantes de outras proteínas ou outros polipeptídeos, que interferem com as suas pesquisas terapêuticas, de diagnóstico e profiláticos ou aplicação para outros usos.

[0083] Aqui, variante de um polipeptídeo como por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno, uma proteína ou um anticorpo é um polipeptídeo em que um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos, eliminados, adicionados e/ou substituídos, em comparação com outra sequência polipeptídica, e inclui um polipeptídeo de fusão. Além disso, uma variante da proteína inclui uma modificada por enzima de corte da proteína, fosforilação ou outra modificação póstradução, mas mantendo a atividade biológica do anticorpo aqui descrito, por exemplo, de se ligar α-syn e especificidade. A variante pode ser de cerca de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% ou 80% idênticas sequência do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado.

[0084] O derivado do polipeptídeo significa aqui um polipeptídeo quimicamente modificado em um ou mais resíduos através de conjugação com outra porção química, que é

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29/164 diferente de uma variante de inserção, deleção, adição ou substituição.

[0085] Aqui, o termo encontrado naturalmente usado com relação a um polipeptídeo, ácido nucléico, célula hospedeira etc. significa um material que ocorre naturalmente.

[0086] Como aqui utilizado, α-Syn é α-Syn nativo (NCBI ID: NP_000336) consistindo em 140 aminoácidos codificados pelo gene SNCA e inclui várias formas processadas, bem como proteínas não processadas com comprimento total. Além disso, o α-Syn inclui variantes naturais de α-Syn, tais como mutantes, variantes de splicing ou variantes alélicas. As variantes podem incluir formas de proteína com 126 e 112 resíduos (CAG3339.1), além de 140 proteínas residuais, nas quais o exon 3 ou o exon 5 é eliminado. Sabe-se também que polimorfismos específicos ou mutações de missense do gene SNCA estão associados à ocorrência da doença de Parkinson (Singleton AB, et al. , Science 2003, 302: 841), e essas variantes também estão incluídas na variante de α-Syn, betaSyn e gama-syn são homólogas a α-Syn. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção reconhece especificamente α-Syn. A sequência de aminoácidos de a-Syn é mostrada na SEQ ID NO: 225.

[0087] Como aqui utilizado, o termo agregado de a-Syn se forma devido a uma mudança na conformação de α-Syn, e se refere a uma estrutura ou agregado incluindo pelo menos um

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30/164 de um oligômero, uma protofibrila e/ou uma fibrila devido a uma mudança na conformação de a-Syn.

[0088] Aqui identidade significa a semelhança de sequência de dois ou mais polipeptideos ou dois ou mais polinucleotideos, que são determinados organizando e comparando dois ou mais polipeptideos ou dois ou mais polinucleotideos. Essa identidade entre sequências é comumente representada por porcentagem de identidade, e isso significa a proporção de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos entre as moléculas a serem comparadas, e é calculada com base no menor tamanho de molécula, entre as moléculas a serem comparadas. Os seguintes documentos podem ser referidos para métodos a serem utilizados para calcular a identidade entre muitas moléculas, organizando ácidos nucleicos ou polipeptideos: Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Nova Iorque: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., org.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M. e Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nova Iorque: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, Nova Iorque: M. Stockton Press; e Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073.

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31/164 [0089] Quando a percentagem de identidade é calculada, as sequências a serem comparadas são organizadas de modo a fornecer a correspondência máxima entre sequências e, nas sequências arranjadas, a lacuna, a correspondência e a correspondência incorreta podem estar presentes, e isso é tratado por um modelo matemático especifico ou um algoritmo de computador. Em uma modalidade, esta percentagem de identidade pode ser determinada utilizando um pacote de programas GCG incluindo um programa GAP que organiza duas sequências no sentido de maximizar a correspondência entre sequências a serem comparadas e minimizar o número de intervalos, utilizando o algoritmo de Needlman e Wunsch (Devereux et al. , 1984, Nucl. Acid Res. 1984, 12: 387; Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA) . O algoritmo de computador GAP determina span correspondente, organizando duas sequências na maneira de maximizar a correspondência entre elas e minimizar o número de lacunas em duas sequências polipeptidicas ou polinucleotidicas a serem comparadas. 0 algoritmo também usa uma penalidade de abertura de intervalo [isto é calculado como 3 x diagonal média, em que diagonal média é a média de diagonais da matriz de comparação a ser usada; e diagonal é uma pontuação ou número atribuído para cada correspondência completa de aminoácidos por uma matriz de comparação específica] e uma penalidade de extensão de lacuna

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32/164 (isso é geralmente 1/10 vezes da penalidade de abertura de lacuna) e uma matriz de comparação, por exemplo, PAM 250 ou BLOSUM 62 juntos. Em uma modalidade especifica, uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff et al, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 1978, 5: 345-352 para comparação PAM matriz 250; se referem a Henikoff et al, Proc Natl Acad. Sci. USA 1992, 89: 10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) . Em uma modalidade, os parâmetros recomendados para determinar a percentagem de identidade de polipeptídeos ou polinucleotídeos em que o programa GAP é utilizado são os seguintes: algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453; matriz de comparação: BLOSUM 62 (Henikoff et al., 1992, supra); penalidade de gap: 12 (sem penalidade por um gap terminal); penalidade de comprimento de lacuna: 4; limiar de similaridade: 0.

[0090] Quando duas sequências são arranjadas usando parâmetros específicos, embora não exista uma relação significativa entre duas sequências, o resultado de que elas são combinadas com alta identidade em uma região de sequência curta pode ser derivado. Neste caso, para que duas sequências sejam dispostas através de pelo menos 50 aminoácidos sequenciais, os parâmetros do algoritmo usado como o programa GAP podem ser corrigidos.

[0091] O termo substancialmente puro aqui utilizado é que uma molécula alvo está presente como uma espécie

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33/164 predominante. Em outras palavras, isso significa que, com base em mole, a concentração é maior do que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em uma modalidade, uma molécula substancialmente pura é formada como pelo menos cerca de 50% (com base em mole) , pelo menos, cerca de 80%, cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 99%, entre todos os polímeros compreendidos em uma composição. Em outra modalidade, a molécula de direcionamento é substancialmente homogeneamente purificada até que mais nenhum contaminante não seja detectado usando um método convencional, e, por conseguinte, a composição compreende um tipo de material de polímero homogêneo.

[0092] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo recombinante que se liga especificamente à proteína α-syn ou à proteína α-syn humana, ou ao fragmento de ligação ao antígeno da mesma. Neste aspecto, proteína recombinante é uma proteína preparada usando uma técnica de recombinação, nomeadamente, através da expressão do ácido nucleico recombinante descrito na presente invenção. Os métodos e técnicas para a produção de uma proteína recombinante são amplamente conhecidos na técnica.

[0093] Aqui, afinidade, grau de afinidade ou afinidade de ligação é a força da interação entre um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um antígeno, e é determinado pelas propriedades do antígeno

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34/164 como tamanho, forma e/ou carga de antígeno, e sequências de CDR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Os métodos para determinar a afinidade são conhecidos na técnica, e os seguintes podem ser referidos.

[0094] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é chamado de ligação específica ao seu alvo, tal como um antígeno, quando uma constante de dissociação (Kd) é < icr⁶ Μ. O anticorpo se liga especificamente a um alvo com alta afinidade, quando Kd é í 1 x ICr⁸ Μ. o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção têm uma elevada afinidade de í 1 x ICr⁹ M, particularmente < 1 x ICr¹⁰ M, ou mais particularmente < 1 x ICR¹¹ M ao agregado.

[0095] Como aqui utilizado, ligação preferencial inclui a ligação apenas ao agregado de α-Syn, ou a ligação a ambos do monômero de α-Syn e agregado de α-Syn com maior afinidade para o agregado em vez do monômero. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção se liga especificamente ao agregado com elevada afinidade, mas não se liga ao monômero de α-Syn. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção pode se ligar a ambos o monômero e agregado, mas se liga ao agregado de aSyn com uma afinidade mais elevada em comparação com o monômero. Em uma modalidade, a afinidade para o agregado de

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35/164 α-Syn é pelo menos duas vezes superior à afinidade para o monômero de α-Syn, ou para uma força de ligação baixa que não pode ser determinada para se ligar especificamente como um anticorpo ou com uma força de ligação que não é mensurável na faixa de concentração experimental do anticorpo.

[0096] Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, a elevada afinidade do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção para o agregado de α-Syn é Kd ú 1,0 x 10~⁸ M; Kd ú 1,0 x 10~⁹ M em outra modalidade; Kd ú 1,0 x 10~¹⁰ M em outra modalidade; Kd ú 1 χ 10^-11 M; e Kd < 1 x 10~¹² M em mais uma modalidade. Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno com tais afinidades elevadas podem ser administrados em doses mais baixas comparativamente com anticorpos possuindo uma afinidade menor, por exemplo, superior a Kd 10~⁷ M ou ICT⁸ M, mas não limitados a estes. Existe uma grande vantagem na prática clínica, porque a eficácia suficiente pode ser obtida pela administração da mesma maneira que uma injeção subcutânea simples. Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno com alta afinidade para o agregado de α-Syn podem reduzir a formação de agregados de α-Syn, resultando em uma concentração reduzida de agregados no cérebro. Além disso, o anticorpo e os fragmentos de ligação ao antígeno com alta afinidade para o agregado de α-Syn podem reduzir a formação de agregado de α-Syn fora do sistema nervoso central, e assim

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36/164 alterar o estado de equilíbrio das formas α-Syn no limite da barreira hematoencefálica, reduzindo assim a concentração de agregados no interior do sistema nervoso central.

[0097] Aqui, região ou sítio de ligação ao antígeno significa uma proteína ou uma parte da proteína que se liga especificamente a um antígeno específico. Por exemplo, uma parte de um anticorpo que compreende um resíduo de aminoácidos que fornece o anticorpo com a especificidade e afinidade a um antígeno através da interação com o antígeno. Esta região de ligação ao antígeno compreende tipicamente uma ou mais regiões determinantes complementares (CDR). Uma região específica de ligação ao antígeno também compreende uma ou mais regiões de framework (FR). As CDRs são sequências de aminoácidos que contribuem para a especificidade e afinidade da ligação ao antígeno. A região de framework ajuda a manter uma conformação adequada destas CDRs, facilitando assim a ligação entre a região de ligação ao antígeno e um antígeno.

[0098] Aqui, anticorpo significa um fragmento de ligação ao antígeno, que pode competir com um anticorpo intacto para a ligação a qualquer isotipo de imunoglobulina intacta, ou um antígeno alvo. Por exemplo, inclui anticorpos quiméricos, humanizados, humanos completos e duploespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. O anticorpo é um tipo de proteínas de ligação ao antígeno por

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37/164 si só. 0 anticorpo intacto compreende geralmente pelo menos 2 cadeias pesadas completas e 2 cadeias leves completas, mas em alguns casos como encontrado naturalmente em animais Camelideos, o anticorpo pode compreender apenas cadeias pesadas. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser derivado a partir de apenas uma fonte ou quimérico. 0 anticorpo quimérico compreende uma parte derivada de dois tipos de anticorpos diferentes, e descrito em mais detalhe abaixo. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido por hibridoma, a técnica de DNA recombinante ou de corte enzimático ou químico de um anticorpo intacto. Salvo indicação em contrário, neste documento, o termo anticorpo inclui um anticorpo compreendendo 2 cadeias pesadas completas e 2 cadeias leves completas e seus derivados, variantes, fragmentos e mutantes, e os seus exemplos como descritos abaixo.

[0099] Aqui, a cadeia leve inclui uma cadeia leve de tamanho completo possuindo uma sequência de região variável suficiente para fornecer especificidade de ligação a um antígeno ou epitopo e seu fragmento. A cadeia leve de tamanho completo compreende um domínio de região variável VL e um domínio de região constante CL. O domínio da região variável da cadeia leve está presente em um terminal amino de um polipeptídeo de cadeia leve. Os tipos de cadeias leves incluem cadeias kappa e lambda.

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38/164 [00100] Aqui, cadeia pesada inclui uma cadeia pesada de comprimento completo possuindo uma sequência de região variável suficiente para fornecer especificidade de ligação a um antígeno ou epítopo e o seu fragmento. A cadeia pesada de comprimento integral inclui um domínio de região variável VH e 3 domínios da região constante CHI, CH2 e CH3. O domínio VH está presente em um terminal amino de um polipeptídeo de cadeia pesada e o domínio CH está presente em um terminal carboxi e o CH3 está posicionado mais próximo de um terminal carboxi. A cadeia pesada compreende IgG (compreendendo os subtipos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4), IgA (compreendendo os subtipos IgAl e IgA2) e os isotipos IgM e IgE.

[00101] O termo fragmento de ligação ao antígeno de uma cadeia (cadeia pesada ou cadeia leve) de um anticorpo ou de imunoglobulina inclui uma parte de um anticorpo que carece de alguns aminoácidos, em comparação com uma cadeia de comprimento completo, mas pode se ligar especificamente a um antígeno. Este fragmento pode ser considerado como tendo atividade biológica, em um aspecto que pode se ligar especificamente a um antígeno alvo, ou pode competir com outros anticorpos ou um fragmento de ligação ao antígeno para ligar um epítopo específico. Em um aspecto, este fragmento compreende pelo menos uma CDR presente em uma cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento completo, e em algumas modalidades, compreende uma cadeia pesada de cadeia

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39/164 curta e/ou cadeia leve, ou a sua parte. Este fragmento ativo biológico pode ser produzido por uma técnica de DNA recombinante ou pode ser produzida por exemplo, por corte de um anticorpo intacto enzimaticamente ou quimicamente. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional inclui Fab, Fab', F (ab')2, Fv, anticorpo de domínio e cadeia simples Ab, mas não se limitam a estes, e podem ser derivados de qualquer mamífero incluindo humano, camundongo, rato, camelídeo ou coelho, mas não limitado a esses. A parte funcional do anticorpo, tais como uma ou mais CDRs aqui descritos podem ser ligados com uma proteína secundária ou um composto molecular pequeno por uma ligação covalente, assim, ser utilizado como um agente terapêutico alvo para um alvo específico.

[00102] Aqui, fragmento Fab consiste em 1 cadeia leve e 1 cadeia pesada compreendendo uma região variável e somente CHI. O fragmento Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra cadeia pesada.

[00103] Aqui, a região Fc compreende dois fragmentos da cadeia pesada que compreende os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Estes 2 fragmentos de cadeia pesada são combinados entre si por interação hidrófoba de duas ou mais ligações dissulfeto e domínio CH3.

[00104] Aqui, fragmento Fab compreende uma região entre os domínios CHI e CH2 de uma cadeia pesada, além do fragmento

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Fab, e pode formar uma ligação dissulfeto entre duas cadeias pesadas de duas moléculas do fragmento Fab', para formar uma molécula F(ab')2.

[00105] Aqui, fragmento F(ab')2 compreende duas cadeias leves, e duas cadeias pesadas compreendendo uma região variável, CHI e uma parte de uma região constante entre os domínios CHI e CH2, como mencionado anteriormente, e assim uma ligação dissulfeto intracadeia entre 2 cadeias pesadas é formada. Assim, o fragmento F(ab')2 consiste em dois fragmentos Fab' e os dois fragmentos Fab' encontram-se entre si pela ligação dissulfeto entre eles.

[00106] Aqui, região Fv é um fragmento de um anticorpo que compreende cada região variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, mas não compreende uma região constante. O sdFV pode ser aquele que uma cadeia pesada e uma cadeia leve estão ligadas por uma ligação dissulfeto. O scFc pode ser aquele que o Fv está ligado por um ligante flexível. scFvFc pode ser aquele que Fc está ligado ao scFV. O minibody pode ser aquele que o CH3 está ligado ao scFV. O diacorpo compreende duas moléculas de scFV.

[00107] Aqui, anticorpo de cadeia única (scAb) é uma cadeia polipeptídica única compreendendo uma região variável de uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve na qual uma região variável de cadeia pesada e cadeia leve é ligada por um ligante flexível. O anticorpo de cadeia curta

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41/164 pode referir-se, por exemplo, à patente U.S. No. 5.260.203, e isto é aqui divulgado por referência.

[00108] Aqui, anticorpo de domínio (dAb) é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou apenas uma região variável de cadeia leve. Em uma modalidade, duas ou mais das regiões VH estão ligados por uma ligação covalente através de um ligante peptídico, para formar um anticorpo de domínio bivalente. Duas regiões VH deste anticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo o mesmo antígeno ou diferente.

[00109] Aqui, proteína de ligação ao antígeno bivalente ou anticorpo bivalente compreende dois (sítios de ligação ao antígeno. Dois sítios de ligação ao antígeno compreendidos neste anticorpo bivalente podem ter a mesma especificidade de antígeno ou podem ser um anticorpo específico dual ligado a diferentes antígenos separadamente.

[00110] Aqui, proteína de ligação a antígeno multiespecífica ou anticorpo multiespecífico tem como alvo dois ou mais antígenos ou epitopos.

[00111] Aqui, a proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno específico ou biespecífico é uma proteína ou um anticorpo de ligação ao antígeno híbrido que possui dois locais de ligação ao antígeno diferentes. Este anticorpo biespecífico é um tipo de proteína de ligação ao antígeno multiespecífico ou anticorpo multiespecífico, e pode ser

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42/164 produzido através de vários métodos conhecidos, por exemplo, métodos tais como fusão de hibridoma ou ligação do fragmento Fab'. Por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clln. Exp. Immunol. 1990, 79: 315-321; Kostelny et al, J. Immunol. 1992, 148: 1547-1553 etc. podem ser referidos. Os 2 epitopos diferentes entre si, aos quais 2 sítios de ligação de antígeno da proteína de ligação ao antígeno biespecífica ou anticorpo se ligam, podem ser posicionados no mesmo ou em alvo proteico diferente.

[00112] Aqui, o termo antígeno ou imunógeno significa uma molécula ou uma parte da molécula que por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo imunologicamente funcional) pode se ligar a, e pode ser usada para produção de um anticorpo que se pode ligar a um antígeno em um animal. O antígeno pode compreender um ou mais epitopos que podem interagir com um anticorpo diferente ou o seu fragmento. Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, o antígeno é uma proteína de α-syn de comprimento completo ou uma proteína de α-syn parcial de 1 a 120 resíduos de aminoácidos com C terminal suprimido.

[00113] Aqui, epitopo é uma parte de uma molécula que é ligada ou reconhecida por uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno, e inclui, por exemplo, moléculas determinantes sendo capazes de se ligar especificamente à

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43/164 proteína de ligação ao antígeno, como um anticorpo ou um receptor de células T. 0 epítopo pode ser consecutivo ou não consecutivo e, por exemplo, pode ser um resíduo de aminoácido que está em uma localização separada e não consecutiva na sequência polipeptídica e está ligado a uma proteína de ligação ao antígeno, tal como um epítopo conformacional. Em uma modalidade, o epítopo inclui uma estrutura tridimensional que é semelhante a um epítopo utilizado para a produção de anticorpos, mas pode ser um mimético de um aspecto que ele não inclui todas os resíduos ou uma parte dos resíduos no epítopo utilizado para a produção de anticorpos. Comumente, o epítopo é uma proteína, mas pode ser de outros tipos de materiais, tal como um ácido nucleico. 0 fator determinante do epítopo pode ser um grupo quimicamente ativo formado em uma superfície por uma molécula, tal como um aminoácido, uma cadeia lateral de açúcar, um grupo fosforil ou um grupo sulfonil, ou pode ter propriedades estruturais tridimensionais específicas e/ou propriedades de carga específica. Geralmente, o anticorpo específico para um antígeno alvo específico pode reconhecer o epítopo do antígeno alvo no complexo proteico e/ou polimérico. 0 anticorpo da presente invenção pode reconhecer o C terminal. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção reconhece um C terminal da proteína aSyn, em particular 110-120 resíduos ou 111-122 resíduos em

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44/164 outras modalidades. Particularmente, quando o anticorpo reconhece de 110 a 122 resíduos, o anticorpo mostra a propriedade de ligação preferencial ao agregado.

[00114] Aqui, conjugado significa uma molécula diferente do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno deste aqui divulgado, particularmente uma molécula quimérica com particularmente transportes de barreira hematoencefálica descritos abaixo ou um agente terapêutico. No conjugado, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção está ligada a outras moléculas através de uma ligação covalente, Van der Waals ou de interação hidrofóbica, encapsulação, incorporação ou o método de combinação dos mesmos. No conjugado de uma modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser ligado por um agente de ligação peptídico. Além disso, no conjugado, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser ligado com um agente terapêutico por um grupo álcool, grupo ácido, grupo carbonila, grupo tiol ou um grupo amina utilizando os métodos de síntese química convencionais (por exemplo, US2010/0028370). Aqui, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção forma uma proteína de fusão, quando está ligada a outro peptídeo por uma ligação covalente ou um ligante peptídico.

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45/164 [00115] Como aqui utilizado, o termo barreira hematoencefálica ou BHE é uma barreira formada por uma junção apertada na membrana celular endotelial capilar do cérebro, que sai entre o cérebro, a coluna vertebral e o seu sistema circulatório circundante. Estas barreiras são muito robustas e limitam a passagem de pequenas moléculas com cerca de 60 Da de peso molecular para o cérebro. A barreira hematoencefálica, a barreira vascular medular e a barreira retiniana vascular são barreiras capilares contínuas dentro do sistema nervoso central e são comumente referidas como BHE.

[00116] O termo transporte de barreira hematoencefálica se refere a proteínas incluindo peptídeo e polipeptídeo, ácidos nucleicos, anticorpos ou composto com um baixo peso molecular que podem passar através das barreiras hematoencefálicas e entregar o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção.

[00117] Aqui, agente terapêutico significa uma molécula a ser administrada a um indivíduo para um efeito terapêutico alvo. O indivíduo inclui um mamífero não humano, por exemplo, primatas ou um humano. Os exemplos do agente terapêutico incluem uma proteína compreendendo um peptídeo e um polipeptídeo, um ácido nucleico, um anticorpo ou um composto molecular pequeno. Em outro aspecto, o agente terapêutico pode ser utilizado como um agente terapêutico de doenças

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46/164 relacionadas com o agregado de α-syn, estando ligado ao anticorpo da presente invenção.

[00118] Aqui, o termo tratar significa redução, alivio, alivio ou tratamento de uma lesão, doença ou sintoma ou condição da doença; fazer com que um paciente seja capaz de suportar uma lesão, doença ou sintoma ou condição mórbida da doença; atrasar a taxa de deterioração de uma lesão, doença ou sintoma ou condição mórbida da doença; ou alivio ou tratamento de uma lesão, doença ou sintoma ou condição da doença, incluindo parâmetros objetivos ou subjetivos, melhorando a qualidade de vida de um paciente mentalmente ou fisicamente. O alivio ou tratamento de uma lesão, doença ou sintoma ou condição da doença pode ser determinado com base nos resultados do exame físico, exame de vários indices relacionados a uma doença e exame de imagem. Em uma modalidade, o termo inclui o tratamento de doenças relacionadas com o α-syn, redução da frequência de ocorrência da doença, redução da gravidade da doença e/ou alivio dos sintomas de uma doença relacionada com a α-syn no método da presente invenção.

[00119] Como usado aqui, o termo doença relacionada ao agregado de α-Syn é um grupo de doenças neurodegenerativas chamado de alfa-sinucleinopatia, e tem as características que agregados de α-Syn são encontrados em lesões incluindo populações de neurônios e gliais, degeneração do sistema de

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47/164 dopamina, alteração no desempenho do movimento, deficiência cognitiva e formação de corpos de Lewy e das neurites de Lewy (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73; McKeith et al., Neurology (1996) 47: 1113-24) . As doenças incluem doença de Parkinson (DP), demência da doença de Parkinson (DCP), demência com corpos de Lewy (DLB), variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBV) , doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, atrofia de múltiplos

sistemas	(MSA)	e outras	várias doenças relacionadas	com
axônios	nervosos, mas	não	limitadas a	eles. Em	uma
modalidade, o	anticorpo	da	presente invenção pode	ser
utilizado	para	tratamento	de	PD.
[00120]	Aqui,	dose eficaz significa	comumente	uma
quantidade suficiente j	iara	reduzir a	gravidade	e/ou

frequência de ocorrência de sintomas devido a uma doença, particularmente, uma doença relacionada a α-syn, remover sintomas devido a uma doença, particularmente, uma doença relacionada à α-syn e/ou uma causa-raiz da ocorrência da doença, ou prevenir a ocorrência de sintomas devido a uma doença, particularmente, uma doença relacionada a α-syn e/ou uma causa raiz, e/ou melhorar ou corrigir danos devidos a uma doença, Particularmente, uma doença relacionada com asyn. Em algumas modalidades, a dose eficaz é uma dose terapêutica eficaz ou uma dose eficaz profilática. A dose terapêutica eficaz é uma quantidade suficiente para tratar

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48/164 uma doença, particularmente sintomas ou condições relacionadas a α-syn, ou prevenir, retardar uma doença, particularmente sintomas ou condições relacionadas a a-syn, ou reverter seu progresso. A dose profilática efetiva é uma quantidade para prevenir ou retardar a ocorrência ou recorrência de uma doença, particularmente, uma doença relacionada a α-syn ou sintomas da doença, particularmente, uma doença relacionada a α-syn, e reduzir sua probabilidade. 0 efeito terapêutico ou profilático completo pode ser causado por várias vezes da administração da dose, e não por uma única administração de dose. Portanto, a dose eficaz terapêutica ou profilática pode ser administrada uma vez ou mais por administração.

Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno [00121] A presente invenção descreve um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à proteína de α-syn, incluindo humana à α-syn. O anticorpo de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo compreendendo uma ou mais regiões ou locais determinantes complementares (CDR), como aqui divulgado.

[00122] Em uma modalidade, uma CDR é compreendido em uma região de framework e a estrutura orienta uma CDR (s) de modo que esta CDR (s) pode(m) ter propriedades de ligação ao antígeno adequadas.

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49/164 [00123] O anticorpo de acordo com a presente invenção se liga especificamente à proteína de α-syn encontrada no cérebro derivada de humano, especialmente ao agregado de asyn de alta afinidade.

[00124] Em uma modalidade, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode preferencialmente se ligar ao agregado de α-Syn com uma elevada afinidade e diminuir a sua concentração. A redução ou degradação do agregado de a-Syn pelo anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção envolve a divagem efetiva e a degradação do patógeno causada pelo complexo antígenoanticorpo para facilitar a degradação do agregado de a-Syn pelos lisossomos na célula.

[00125] Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga preferencialmente ao agregado de α-Syn com alta afinidade e, assim, pode impedir a formação adicional de agregado de aSyn, redução da concentração, inibição do transporte intercelular e diminuir a dose efetiva no desenvolvimento da droga.

[00126] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga preferencialmente ao agregado de α-Syn com elevada afinidade, inibindo ou impedindo assim que a forma de agregado de α-Syn seja transferida de uma célula para outra célula.

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50/164 [00127] Em uma modalidade, o anticorpo inclui um anticorpo monoclonal, um anticorpo de especificidade dupla, um anticorpo duplo, um anticorpo multiespecifico, um anticorpo múltiplo, um minicorpo, um anticorpo de domínio, um mimético de anticorpo (ou anticorpo sintético), um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, ou uma fusão de anticorpo (ou conjugado de anticorpo) e fragmentos dos mesmos, mas não limitado a eles, e inclui várias formas de anticorpos aqui descritos. Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo do anticorpo aqui divulgado inclui molécula de anticorpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpo ou molécula de anticorpo de cadeia simples em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve estão ligadas através de um espaçador. Em outra modalidade, o anticorpo aqui divulgado pode incluir um polipeptídeo de apenas cadeias leves ou apenas cadeias pesadas incluindo regiões variáveis divulgadas na Tabela la e na Tabela 1b.

[00128] Um anticorpo divulgado aqui compartilha uma região específica ou sequência com outro anticorpo aqui divulgado. Em uma modalidade, ele pode compartilhar uma região constante do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em outra modalidade, ele pode compartilhar uma região Fc. Em outra modalidade, ele pode compartilhar uma estrutura de região variável.

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51/164 [00129] Foi confirmado que os anticorpos aqui divulgados se ligam a agregados α-Syn humanos com alta afinidade. Como adicionalmente descrito nos Exemplos, foram testados clones de anticorpos múltiplos e verificou-se que possuem um epítopo nos resíduos 110-120 ou 111-122 no C terminal. Embora não esteja limitado a esta teoria, a ligação preferida e a elevada afinidade para os agregados dos anticorpos na presente invenção podem ser devidas ao reconhecimento dos resíduos 110-120, em comparação com os anticorpos convencionais que reconhecem os resíduos 121-130 no C terminal.

[00130] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção tem uma estrutura típica de um anticorpo encontrado na natureza. Os animais camelídeos produzem um anticorpo que consiste em uma única cadeia pesada, mas a unidade estrutural deste anticorpo compreende geralmente um polipeptídeo tetramérico, e o tetrâmero compreende dois de um par de corpos de cadeia polipeptídica consistindo em diferentes cadeias polipeptídicas. Em um anticorpo típico, o um par de corpo de cadeia polipeptídica compreende uma cadeia leve de comprimento total (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada de comprimento total (cerca de 50 a 70 kDa). Cada cadeia apresenta um padrão de dobragem característico e consiste em vários domínios de imunoglobulina, consistindo em cerca de 90 a 110 aminoácidos. Estes domínios são unidades

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52/164 básicas consistindo em um polipeptídeo de anticorpo. A parte amino-terminal de cada cadeia tipicamente compreende uma parte chamada região variável ou região V que é uma parte que reconhece um antígeno. A parte carboxi-terminal é conservada evolutivamente mais que o terminal amino, e compreende uma parte chamada região constante ou região C. A cadeia leve humana é comumente classificada como cadeias leves kapa (k) e lambda (λ), e estas compreendem uma região variável e uma região constante, respectivamente. A cadeia pesada é tipicamente classificada como cadeia mu (μ), delta (δ), gama (γ), alfa (a) ou épsilon (ε), e estas são definidas como isotipos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG inclui IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, mas possui numerosos subtipos ilimitados. 0 subtipo de IgM inclui IgM e IgM2. 0 subtipo de IgA inclui IgAl e IgA2. Em humanos, os isotipos de IgA e IgD compreendem 4 cadeias pesadas e 4 cadeias leves; os isotipos IgG e IgE compreendem 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves, e o isotipo IgM compreende 5 cadeias pesadas e 5 cadeias leves. A região constante da cadeia pesada mostra tipicamente uma função efetora, mas compreende um ou mais domínios. 0 número de domínios da região constante da cadeia pesada torna-se diferente dependendo dos isotipos. A cadeia pesada de IgG, por exemplo, compreende domínios da região 3C conhecidos como CHI, CH2 e CH3, respectivamente. 0 anticorpo aqui descrito pode ser qualquer um destes isotipos e

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53/164 subtipos. Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4 subtipo.

[00131] A região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de acordo com a presente invenção podem estar ligadas a pelo menos uma parte de uma região constante de humano. A seleção de uma região constante pode ser determinada pelo fato da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente do anticorpo, e/ou citotoxicidade dependente do complemento é necessário parcialmente. Por exemplo, o isotipo humano IgGl e IgG3 têm citotoxicidade dependente de complemento e o isotipo humano IgG2 e IgG4 não tem esta citotoxicidade. Além disso, as IgGl e IgG3 humanas induzem uma função efetora mediada por células mais forte que IgG2 e IgG4 humanas. A região constante da cadeia leve pode ser lambda ou kappa.

[00132] Em uma modalidade, o anticorpo anti-a-syn de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo humano, e a região constante da cadeia pesada pode ser do tipo IgGl, IgG2-, IgG3- ou IgG4. Em uma outra modalidade, o anticorpo da presente invenção é do tipo IgGl ou IgG2.

[00133] Na cadeia leve e cadeia pesada de comprimento total, uma região variável e uma região constante são ligadas pela região J que tem cerca de 12 ou mais aminoácidos de

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54/164 comprimento, e a cadeia pesada também compreende a região D de cerca de 10 ou mais de aminoácidos. Por exemplo, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nova York: Raven Press pode ser referido. Tipicamente, uma região variável do par de cadeia leve/cadeia pesada de um anticorpo forma um local de ligação ao antígeno.

[00134] Uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina tem a mesma estrutura geral comumente, e compreende uma região de framework relativamente conservada (FR) ligado por 3 regiões hipervariáveis chamados locais determinantes de complementaridade ou região ou domínio ou CDR (região determinante de complementaridade). A CDR de uma região variável derivada de cada cadeia consistindo em um par de cadeias pesadas/cadeia leve é tipicamente organizada por uma região de framework, formando assim uma estrutura que se liga especificamente a um epitopo específico de uma proteína alvo (α-syn). Estes fatores de regiões de cadeia leve e cadeia pesada de ocorrência natural são tipicamente compreendidos do N terminal para o C terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A posição das sequências de aminoácidos correspondentes a cada um deles na região variável pode ser determinada pelo sistema de numeração de Rabat (Rabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, NIH, Bethesda, MD) ,

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orChothia	& Lesk, J. Mol.	Biol, 1987, 196: 901-	917;	Chothia
et al., 1989,	Nature 1989	, 342: 878-883) .
[00135]	As	sequências <	de CDR são compostas	das	regiões
variáveis	da	cadeia leve	e da cadeia pesada do	anticorpo ou
fragmento	de	ligação ao	antígeno de acordo	com	uma da

presente invenção divulgadas na Tabela la a Tabela 1B, respectivamente. Em cada região variável, as sequências CDR estão sublinhadas e representam as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, na ordem da frente para trás. As sequências CDR na região variável são mostradas em sublinhado. As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 são mostradas na ordem da frente para trás, respectivamente.

[00136] [Tabela la]

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	[1 Seque W CM SBQ W MV 1 cadei	ncia de aminoácidos da região variável de j a pesada VH e SEQ ID Nos.
H,	r		Sequência de aminoácidos
w	1	15	29 J S5	’ ν.·ΑΑ a ..'.ΛϊΤ’Ύ -<.
^:®íí	2		I® ps	χ„ ... X . Αχ , X ί,χ>
3A$	3	o........	3' 5 «i.^xvx. ϊ, Ύ x, : \| * ™.·.—... :
	4	iB	ai 1M <i[
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[00137] [Tabela lb]

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¥L Μ 5δθ ll »	Sequência de aminoácidos da região variável de
elaáft	cadeia leve VL e SEQ ID Nos.

Sequência de aminoácidos

ΪΒ4

9Β1Ϊ

W

3A9

BB

m.èV·: Wi+i

wmr p4»m

Iff 11

S1

7S

AC8

A.B8

AA>

DG5

AD2

Air

DG11 |DG8

S3

WS

50^:

SI

S4 §S t_w

S2

5S |W p3

5S

1SS

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IW . %'. _'..... ' ' '......% ' ......'......'; 1/........ ' [00138] Em uma modalidade da presente invenção, de cadeias leves da cadeia pesada e regiões variáveis do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno divulgados na tabela la e 1b Tabela podem ser combinadas de várias maneiras para preparar os diferentes anticorpos. Adicionalmente, as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno descrito na

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Tabela la e na Tabela 1b podem ser combinadas livremente sem qualquer método limitado.

[00139] Cada uma das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada aqui descritos pode se ligar às várias regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada, para formar cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo intacto, respectivamente. Adicionalmente, cada uma das sequências da cadeia pesada e da cadeia leve ligadas a regiões constantes como esta pode também ser combinada para formar uma estrutura de anticorpo intacta.

[00140] Qualquer região variável de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser ligado a pelo menos uma parte das regiões constantes. As regiões constantes podem ser selecionadas de acordo com se a citotoxicidade, a fagocitose dependente de anticorpo mediada por células dependente de anticorpo de células e/ou citotoxicidade dependente do complemento etc., é exigido. Por exemplo, o isotipo IgGl e IgG3 humano têm citotoxicidade dependente de complemento, e o isotipo IgG2 e IgG4 humano não tem citotoxicidade. As IgGl e IgG3 humanas também induzem uma função efetora mediada por células mais forte que IgG2 e IgG4 humanas. Por exemplo, a região variável de cadeia pesada pode se ligar a regiões constantes de IgG, incluindo IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4, e a região variável da cadeia leve pode se ligar a uma capa ou lambda região

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59/164 constante. Para a região constante, uma apropriada como desejado pode ser utilizado e, por exemplo, um humano ou um derivado de camundongo pode ser utilizado.

[00141] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada aqui descrito pode ser ligada a uma região de IgG2a murina constante, ou uma região constante de IgGl humana, que pode ser mostrado em SEQ ID NOs: 113-126 (incluindo um IgG2a murino região constante) ou SEQ ID NOs: 127-140 (incluindo uma região constante de IgGl humana), respectivamente.

[00142] Em outra modalidade, as regiões variáveis de cadeia leve aqui divulgadas podem estar ligadas a uma região constante kapa de camundongo ou kapa humano da região constante, o que pode ser mostrado em SEQ ID NOs: 141-154 (kapa de camundongo região constante) e SEQ ID NOs: 155 para 168 (região constante kappa humana).

[00143] Além disso, tais sequências da região constante de ser combinada com as regiões variáveis aqui divulgadas são exemplar, e os peritos na técnica saberão que a outra região constante, incluindo as regiões constantes modificadas que podem ser para a estabilidade, expressão, fabrico ou outras propriedades de direcionamento.

[00144] A presente invenção compreende uma ou mais sequências de aminoácidos possuindo identidade de sequência substancial com uma ou mais sequências de aminoácidos aqui

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60/164 divulgadas. A identidade substancial significa manter o efeito aqui divulgado no qual a variação da sequência está presente. Em uma modalidade, tem cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade com as regiões variáveis da cadeia pesada divulgadas na Tabela la. Em outra modalidade, tem cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade com as regiões variáveis da cadeia leve divulgadas na Tabela 1b. Por exemplo, no caso da variante mostrando 90%, 95% ou 99% de identidade com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui divulgado, qualquer variação é ocorrida em um quadro de regiões variáveis do que as CDRs.

[00145] Aqui, é divulgado um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou uma parte ou totalidade da sua parte de fragmento de ligação ao antígeno aqui divulgada. O ácido nucleico inclui um iniciador de PCR ou análise de sequência utilizado para amplificação, investigação, análise ou indução de um polinucleotídeo codificando cada cadeia de anticorpo ou fragmento do anticorpo, o seu mutante, derivado ou variante, um polinucleotídeo codificando uma cadeia leve ou região variável de cadeia pesada ou apenas CDR, um polinucleotídeo suficiente para ser utilizado como sonda de hibridação e um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo. Os ácidos nucleicos podem ser de qualquer comprimento. Estes podem ser, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450,

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500, 750, 1000 ou 1500 ou mais de polinucleotideos de comprimento e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras e/ou podem ser um ácido nucleico maior, por exemplo, uma parte do vetor. O ácido nucleico pode ser uma cadeia simples ou cadeia dupla e pode compreender polinucleotídeo de RNA e/ou DNA e a sua variante artificial (por exemplo, ácido nucleico peptídico).

[00146] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o seu fragmento aqui descrito é um ácido nucleico que codifica uma CDR aqui divulgado, uma região variável que compreende a CDR, um anticorpo de comprimento completo que compreende a região variável e a região constante. Quando a sequência de aminoácidos é determinada, a sequência de ácido nucleico pode ser determinada com utilidade, considerando um uso inversa conhecido programa transcrição e códons etc. A sequência de ácido nucleico exemplar pode ser SEQ ID NOs: 169-182 (cadeia pesada incluindo camundongo constante de IgG2a região), SEQ ID NOs: 83-196 (cadeia pesada incluindo região constante de IgGl humana), SEQ ID NOs: 197-210 (cadeia leve incluindo região constante kappa de camundongo), e SEQ ID NOs: 211-224 (cadeia leve incluindo região constante kappa).

[00147] A presente invenção também inclui uma ou mais sequências de ácido nucleico tendo a identidade de sequência substancial com uma ou mais sequências de ácido nucleico

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62/164 aqui divulgadas. A identidade substancial significa que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno codificado pelo ácido nucleico mantém o efeito aqui divulgado, mesmo no caso de causar substituição conservativa ou variação de aminoácido em que a variação de ácido nucleico não acompanha a substituição de aminoácido.

Especificidade e afinidade do anticorpo a um agregado [00148] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção particularmente tem especificidade para ácido α-syn afinidade agregado e alta. Em uma modalidade, de acordo com a Figura 6, a afinidade para um agregado é Kd ú 1,0 x 10~⁹ M; em outra modalidade, é Kd ú 1,0 x 1O~¹⁰ M; e em outra modalidade, Kd ú 1,0 x 10^-11 M. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção com elevada afinidade tem uma vantagem na medida em que pode ser administrado em uma quantidade de administração inferior, em comparação com um anticorpo com baixa afinidade, por exemplo, 10~⁷ M ou 10~⁸ M de afinidade. Isto não limita o anticorpo, por exemplo, mas, uma vez que a eficácia suficiente pode ser obtida, apesar da administração por via mais simples, tal como injeção subcutânea, existe uma grande vantagem clinicamente.

[00149] Além disso, o anticorpo e seus fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tendo uma elevada afinidade para o agregado de α-Syn pode inibir e/ou reduzir-Syn α

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63/164 formação de agregados e/ou acumulação, e/ou o transporte intercelular, diminuindo assim a concentração do agregado. Além disso, o anticorpo e os fragmentos de ligação ao antígeno com alta afinidade ao agregado de α-Syn podem reduzir a formação de agregados α-Syn fora do sistema nervoso central, resultando na redução da concentração de agregados dentro do sistema nervoso central, alterando o equilíbrio estado da forma α-Syn no limite da barreira hematoencefálica. Embora não esteja limitado a esta teoria, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção pode inibir a formação de agregados pela remoção de monômeros, ou remover ambos os monômeros e agregados.

Região variável do anticorpo [00150] A presente invenção relaciona-se com a cadeia leve do anticorpo da região variável ou região variável da cadeia pesada do anticorpo apresentada na Tabela la e 1b de mesa, e um anticorpo (e correspondente sequência de ácido nucleico), incluindo um fragmento imunológica funcional, um derivado, uma proteína mutante e uma variante das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada.

[00151] Além disso, as sequências de ácido nucleico que codificam para as regiões variáveis mostradas nas Tabelas la e 1b estão incluídas. As sequências de ácido nucleico n s divulgadas adicionalmente, porque s incluas no anticorpo inteiro apresentado nas SEQ ID NOs: 169-182 (cadeia pesada

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64/164 compreendendo uma região constante de IgG2a de murino), SEQ ID NOS: 183-196 (cadeia pesada compreendendo uma região constante de IgGl humana), SEQ ID NOs: 197-210 (cadeia leve compreendendo uma região constante de um kappa de camundongo) e uma sequência de ácido nucleico codificando um anticorpo de comprimento total divulgado na SEQ ID NO: 211 a 224 (cadeia leve compreendendo um humano região constante kappa). Os peritos na técnica podem obter facilmente a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência proteica, com base na sequência de aminoácidos da região variável apresentada na Tabela 1.

[00152] O anticorpo em que as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de acordo com a presente invenção são combinados de várias pode ser representado por VHX/Vly, em que x corresponde à região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO, e y corresponde à região variável de cadeia leve SEQ ID NO. Em uma modalidade, a região variável de acordo com a presente invenção pode incluir as seguintes combinações, mas não limitadas a elas: VH85/VL99, VH85/VL100, VH85/VL101, VH85/VL102, VH85/VL103, VH85/VL104, VH85/VL105, VH85/VL106, VH85/VL107, VH85/VL108, VH85/VL109, VH85/VL110, VH85/VL111, VH85/VL112; VH86/VL99, VH86/VL100, VH86/VL101, VH86/VL102, VH86/VL103, VH86/VL104, VH86/VL105, VH86/VL106, VH86/VL107, VH86/VL108, VH86/VL109, VH86/VL110, VH86/VL111, VH86/VL112; VH87/VL99, VH87/VL100, VH87/VL101,

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VH87/VL102,

VH87/VL107,

VH87/VL112;

VH88/VL103,

VH88/VL108,

VH89/VL99,

VH89/VL104,

VH89/VL109,

VH90/VL100,

VH90/VL105,

VH90/VL110,

VH91/VL101,

VH91/VL106,

VH91/VL111,

VH92/VL102,

VH92/VL107,

VH92/VL112;

VH93/VL103,

VH93/VL108,

VH94/VL99,

VH94/VL104,

VH94/VL109,

VH95/VL100,

VH95/VL105,

VH95/VL110,

VH87/VL103,

VH87/VL108,

VH88/VL99,

VH88/VL104,

VH88/VL109,

VH89/VL100,

VH89/VL105,

VH89/VL110,

VH90/VL101,

VH90/VL106,

VH90/VL111,

VH91/VL102,

VH91/VL107,

VH91/VL112;

VH92/VL103,

VH92/VL108,

VH93/VL99,

VH93/VL104,

VH93/VL109,

VH94/VL100,

VH94/VL105,

VH94/VL110,

VH95/VL101,

VH95/VL106,

VH95/VL111,

VH87/VL104,

VH87/VL109,

VH88/VL100,

VH88/VL105,

VH88/VL110,

VH89/VL101,

VH89/VL106,

VH89/VL111,

VH90/VL102,

VH90/VL107,

VH90/VL112;

VH91/VL103,

VH91/VL108,

VH92/VL99,

VH92/VL104,

VH92/VL109,

VH93/VL100,

VH93/VL105,

VH93/VL110,

VH94/VL101,

VH94/VL106,

VH94/VL111,

VH95/VL102,

VH95/VL107,

VH95/VL112;

VH87/VL105,

VH87/VL110,

VH88/VL101,

VH88/VL106,

VH88/VL111,

VH89/VL102,

VH89/VL107,

VH89/VL112;

VH90/VL103,

VH90/VL108,

VH91/VL99,

VH91/VL104,

VH91/VL109,

VH92/VL100,

VH92/VL105,

VH92/VL110,

VH93/VL101,

VH93/VL106,

VH93/VL111,

VH94/VL102,

VH94/VL107,

VH94/VL112;

VH95/VL103,

VH95/VL108,

VH96/VL99,

VH87/VL106,

VH87/VL111,

VH88/VL102,

VH88/VL107,

VH88/VL112;

VH89/VL103,

VH89/VL108,

VH90/VL99,

VH90/VL104,

VH90/VL109,

VH91/VL100,

VH91/VL105,

VH91/VL110,

VH92/VL101,

VH92/VL106,

VH92/VL111,

VH93/VL102,

VH93/VL107,

VH93/VL112;

VH94/VL103,

VH94/VL108,

VH95/VL99,

VH95/VL104,

VH95/VL109,

VH96/VL100,

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66/164

VH96/VL101, VH96/VL102, VH96/VL103, VH96/VL104, VH96/VL105, VH96/VL106, VH96/VL107, VH96/VL108, VH96/VL109, VH96/VL110, VH96/VL111, VH96/VL112; VH97/VL99, VH97/VL100, VH97/VL101, VH97/VL102, VH97/VL103, VH97/VL104, VH97/VL105, VH97/VL106, VH97/VL107, VH97/VL108, VH97/VL109, VH97/VL110, VH97/VL111, VH97/VL112; VH98/VL99, VH98/VL100, VH98/VL101, VH98/VL102, VH98/VL103, VH98/VL104, VH98/VL105, VH98/VL106, VH98/VL107, VH98/VL108, VH98/VL109, VH98/VL110, VH98/VL111, ou VH98/VL112.

[00153] As várias combinações de regiões variáveis como acima mencionado podem ser usadas como um anticorpo intacto e várias formas de anticorpos compreendendo scFV etc.

CDR [00154] O anticorpo aqui divulgado é um polipeptídeo no qual uma ou mais CDRs de acordo com a presente invenção são enxertadas, inseridas e/ou ligadas. Em uma modalidade, o anticorpo pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs. Assim, o anticorpo pode ter, por exemplo, uma CDR1 de cadeia pesada (CDRH1) e/ou uma CDR2 de cadeia pesada (CDRH2) e/ou uma CDR3 de cadeia pesada (CDRH3) e/ou uma luz cadeia CDR1 (CDRL1) e/ou uma CDR2 de cadeia leve (CDRL2) e/ou uma CDR3 de cadeia leve (CDRL3).

[00155] A posição das sequências de aminoácidos correspondentes a uma região determinante complementar (CDR) e uma região de framework (FR) de um anticorpo em uma região

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67/164 variável pode ser determinada por Kabat (Kabat et al.,

Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5 Ed. ,

Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, PHS, NIH, NIH Publicação n° 91-3242, 1991).

[00156] As CDRs a serem compreendidas na cadeia pesada e na cadeia leve do anticorpo de acordo com a presente invenção estão descritas na Tabela la a 1b (ou a cadeia pesada CDR H1 é representada pelas SEQ ID NOs: 1 a 14, e a cadeia pesada CDR H2 é representado pelas SEQ ID NOs: 15 a 28 e a CDR H3 da cadeia pesada representada pelas SEQ ID NOs: 29 a 42 e a CDR LI da cadeia leve representada pelas SEQ ID NOs: 43 a 56, e a CDR L2 da cadeia leve representada por SEQ ID NOs: 57 a 70 e CDR L3 de cadeia leve representado por SEQ ID NOs: 71 a 84).

[00157] A presente invenção também compreende uma ou mais sequências de aminoácidos possuindo identidade de sequência substancial com sequências de aminoácidos de uma ou mais CDRs divulgadas na Tabela la a lb. A identidade substancial significa manter o efeito aqui divulgado no qual a variação da sequência está presente.

[00158] A estrutura e

as propriedades da CDR de um

anticorpo que ocorre naturalmente são as mencionadas anteriormente. Simplesmente, em um anticorpo tico, a CDR está compreendida em um esqueleto de regiões varieis da cadeia pesada e da cadeia leve consistindo em uma região que

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68/164 está envolvida na ligação e reconhecimento do antígeno. A região variável compreende pelo menos 3 cadeias pesadas ou CDRs de cadeia leve em uma região de framework (Rabat et al. 1991, Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, Serviço de Saúde Pública NIH, Bethesda, MD; ou Chothia e Lesk, J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 1989, 342: 877-883) . Contudo, a CDR aqui divulgada é utilizada para definir uma estrutura típica de anticorpo do domínio de ligação ao antígeno e, além disso, como aqui divulgado, pode ser utilizada como compreendida em outras várias estruturas polipeptídicas.

[00159] Os peritos na técnica compreenderão que cada CDR divulgado pode ser selecionado e combinado independentemente um do outro, quando um anticorpo compreende uma ou mais CDRs aqui divulgadas. Assim, um anticorpo tendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de CDRs independentemente selecionados. Adicionalmente, os especialistas na técnica podem saber que quando a CDR selecionada para combinação, o mesmo tipo de CDR não utilizado repetidamente e, por exemplo, o anticorpo não habitualmente preparado como compreendendo duas regiões CDRH2.

Anticorpo monoclonal [00160] O anticorpo aqui divulgado compreende um anticorpo monoclonal que se liga a α-syn, especificamente agregado de

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69/164 α-Syn. 0 anticorpo monoclonal pode ser preparado utilizando qualquer técnica conhecida na técnica.

[00161] Além disso, o anticorpo monoclonal pode ser preparado utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Por exemplo, pode ser produzido imortalizando esplenitos recolhidos de um animal transformado imunizado. Os esplenitos podem ser imortalizados utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, fundindo-os com células de mieloma para produzir hibridoma. As células de mieloma a ser utilizadas para o processo de fusão do hibridoma de produção são de preferência não-anticorpo produtiva, têm elevada eficiência de fusão, e torná-los incapazes de crescer em um meio seletivo especifico que carece de certas enzimas e suporta o crescimento de apenas a fusão segmentação células (hibridoma). Os exemplos de linhagens celulares apropriadas a serem utilizadas para a fusão de camundongos incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63Ag8.653, NSl/l.Ag4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC -11, MPC11X45-GTG 1.7 e S194/5XXOBu e os exemplos de linhagens celulares utilizadas para a fusão de camundongo incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens celulares úteis para a fusão celular podem ser U-266, GM1500GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.

[00162] Em alguns casos, as linhagens celulares de hibridoma são produzidas através da recolha de esplenócitos

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70/164 a partir de um animal (por exemplo, animal transformada com uma sequência de imunoglobulina humana, animal imunizado por imunogênio α-syn); fundir esplenitos recolhidos em células de mieloma para produzir células de hibridoma; estabelecer linhagens celulares de hibridoma a partir de células de hibridoma e identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem uma ligação de anticorpo a-syn.

[00163] O anticorpo monoclonal segregado por linhagens celulares de hibridoma pode ser purificado utilizando uma técnica conhecida na técnica.

Anticorpo quimérico e humanizado [00164] O anticorpo também pode ser modificado por vários métodos para vários fins. Um anticorpo químico e anticorpo humanizado podem ser fornecidos. Um anticorpo químico um anticorpo que forma uma cadeia leve, cadeia pesada ou fragmento imunologicamente funcional, pelo fato de os fragmentos polipeptídicos derivados de diferentes anticorpos serem ligados por ligações covalentes. Comumente, uma parte da cadeia leve e/ou da cadeia pesada do anticorpo quimérico é uma sequência pertencente a uma determinada espécie ou a uma determinada classe ou subtipo, e a restante sequência pertence a outras espécies ou a outra classe ou subtipo. Para um método de preparação de um anticorpo quimérico, por exemplo, patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 podem ser

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71/164 consultados. Para o enxerto de CDR, por exemplo, podem ser referidas as patentes US 6.180.370, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089 e US 5.530.101.

[00165] Comumente, um propósito para preparar um anticorpo quimérico é maximizar o número de aminoácidos encontrados em um organismo no qual um anticorpo é usado. Um exemplo é um anticorpo enxertado com CDR, em que o anticorpo compreende uma ou mais CDR derivadas de uma determinada espécie, ou de uma determinada classe ou subtipo, e a parte restante é derivada de outras espécies ou outro anticorpo de classe ou subtipo. Por exemplo, para utilizá-lo em humanos, uma região variável ou CDR de aparência natural do anticorpo humano, por meio de uma região variável ou CDR selecionada do anticorpo de roedor é enxertada no anticorpo humano pode ser substituída ou vice-versa.

[00166] O tipo mais útil de anticorpo quimérico é o anticorpo humanizado. Geralmente, anticorpos humanizados são produzidos a partir de anticorpos monoclonais originalmente gerados em animais não humanos. Em tal anticorpo monoclonal, um resíduo de aminoácido particular, que constitui tipicamente a porção de reconhecimento de não antígeno do anticorpo, é modificado para ser homólogo ao resíduo correspondente do isotipo correspondente do anticorpo humano. A humanização pode ser realizada com vários modos conhecidos, por exemplo, substituindo pelo menos uma

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72/164 poro da região variável de roedor pela região correspondente de um anticorpo humano (Patentes US 5,585,089 e 5,693,762; Jones et al., Nature 1986, 321: 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332: 323-27; Verhoeyen et al. , Science 1988, 239: 1534-1536).

[00167] Em um aspecto, as CDR da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada dos anticorpos aqui divulgados são implantadas em regiões de framework (FRs) de anticorpos derivados da mesma espécie ou de espécies diferentes filogeneticamente. Por exemplo, as CDR da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve aqui divulgada podem ser transplantadas para uma FR humana conservada. Para gerar FR humanas conservadas, a sequência de aminoácidos de consenso de FR pode ser obtida por alinhamento de vários tipos de sequências de aminoácidos de cadeia pesada humana ou sequências de aminoácidos de cadeia leve e extraindo a sequência conservada das sequências alinhadas. Em outras modalidades, as FR da cadeia pesada cadeia leve ou aqui divulgados são substituídos por FR de diferente cadeia pesada ou cadeia leve, em um aspecto, enquanto os aminoácidos específicos encontrados apenas no FR da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo anti-a-Syn não são substituídos, os restantes aminoácidos FR podem ser substituídos. O aminoácido específico é tipicamente um aminoácido específico presente em uma posição que não é

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73/164 observada no FR. Em alternativa, uma região variável enxertada de uma cadeia pesada ou da cadeia leve pode ser usado com uma região constante que seja diferente da região constante de uma determinada cadeia pesada ou leve, tal como aqui divulgado. Em outras modalidades, a região variável enxertada pode ser uma parte de um anticorpo Fv de cadeia única. As CDR da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada dos anticorpos aqui divulgados podem ser utilizadas em uma forma transplantada em qualquer anticorpo.

[00168] Além disso, em uma modalidade, para uma região constante derivada a partir de espécies diferentes da humana, pode ser utilizado um anticorpo híbrido combinada com uma região variável derivada de humano.

Anticorpo humano completo [00169] Aqui, um anticorpo humano completo é também divulgado. Um anticorpo humano completo específico para determinado antígeno (anticorpo humano completo) pode ser preparado sem expor o humano a um antígeno. Um método que produz um anticorpo humano completo é humanizar um sistema imunológico humoral de camundongo. Um gene Ig endógeno pode introduzir loci genéticos de imunoglobulina humana (Ig) em um camundongo não ativado, produzindo assim um anticorpo monoclonal humano completo (mAb) no camundongo. Se se utilizar o anticorpo humano completo, pode ser minimizada

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74/164 uma reação imunológica e reação alérgica que pode ser causada pela administração de um mAb derivado de camundongo ou camundongo em humanos.

[00170] Este anticorpo humano completo pode ser produzido por imunização de um animal transformado (habitualmente, camundongo) que pode produzir um anticorpo humano pela falta de produção de uma imunoglobulina endógena. Um antígeno para este fim tem tipicamente 6 ou mais aminoácidos sequenciais e, aleatoriamente, é conjugado com um carreador, por exemplo, hapteno. Por exemplo, os seguintes podem ser referidos: Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 25512555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; e Bruggermann et al. , 1993, Year in Immunol. 7:33 Como um exemplo, neste método, o animal transformado é produzido por loci gênicos de imunoglobulina de camundongo endógenos incapacitantes codificando cadeias de imunoglobulina de cadeias pesadas e leves de camundongo e inserindo um fragmento de loci compreendendo um DNA de genoma humano codificando proteínas de cadeia pesada e cadeia leve humanas. Por cruzamento de um camundongo parcialmente modificado compreendendo parcialmente loci genéticos de imunoglobulina humana, é produzido um camundongo no qual são introduzidos os loci gênicos completos de imunoglobulina humana. Quando um imunogênio é administrado ao animal, um anticorpo que é imunoespecífico para o imunogênio, mas compreende uma região

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75/164 variável, tem uma sequência de aminoácidos humana não murina. Este método se refere a, por exemplo, WO96/33735 e W094/02602. Um método relacionado com um camundongo transformado para preparar um anticorpo humano pode referirse à patente U.S. No. 5.545.807; No. 6,713,610; No. 6,673,986; No. 6.162.963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6.255.458; No. 5.877.397; U.S. No. 5.874.299 e No. 5.545.806; WO91/10741, No. W090/04036 e EP No. 546073B1.

[00171] Utilizando a técnica de hibridoma, mAbs humanos específicos de antígeno com a especificidade desejada podem então ser gerados e selecionados a partir de camundongos transgênicos, por exemplo, os descritos acima. Tais anticorpos podem ser clonados e expressos utilizando vetores apropriados e células hospedeiras, ou os anticorpos podem ser colhidos de células de hibridoma cultivadas.

[00172] O anticorpo humano completo pode também ser derivado de uma biblioteca de apresentação em fagos (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; e Marks et al. , 1991, J. Mol. Biol. 222: 581) . A técnica de apresentação em fagos é um método que imita um tipo de seleção imunitária que exibe um repertório de anticorpos sobre uma superfície do bacteriófago filamentoso e daí, classifica uma ligação a um antígeno de segmentação fago. Esta técnica única pode referir-se aos exemplos aqui ou BWO 99/10494. Em uma modalidade, o anticorpo de α-syn humano completo da presente

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76/164 invenção triado através do modo de exibição em fagos (Krebber et al., J. Immunol. Methods. 1997, 201: 35).

Anticorpo bi-específico ou dual-funcional [00173] A presente invenção também se refere a um anticorpo que reconhece especificamente um ou mais antígenos além da α-syn. Em uma modalidade, o anticorpo aqui divulgado também compreende uma bi-funcional específica ou dupla compreendendo uma ou mais CDRs ou uma ou mais regiões variáveis, como descrito acima. Em alguns casos, um anticorpo dual-específico ou dual-funcional é um anticorpo híbrido artificial com dois pares de cadeias leves/cadeias leves diferentes e dois locais de ligação diferentes, e o anticorpo específico duplo pode ser preparado usando vários métodos como a fusão de hibridoma ou ligação do fragmento Fab' (Songsivilai e Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.).

[00174] Em uma modalidade de acordo com a presente divulgação, um anticorpo da presente invenção pode tomar a forma de um anticorpo biespecífico, compreendendo ainda uma ligação a um carreador para distribuição através da barreira hematoencefálica. Uma forma de administrar drogas através da barreira hematoencefálica envolve o uso de sistemas de liberação inerentes, como os carreadores de glicose e de aminoácidos, e a transcitose mediada por receptores do receptor para insulina ou transferrina. Exemplos de

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77/164 receptores na transcitose mediada por receptores são os seguintes:

[00175] receptor de insulina (por exemplo, receptor de insulina humana), receptor de transíerrina, LRP (por exemplo, LRP1, LRP6 e LRP8), receptor de melanocortina, receptor de acetilcolina nicotinica, receptor VACM-1, IGFR, EPCR, receptor de leptina, receptor de leptina, M6PR, lipoproteina receptor, NCAM, LIFR, LfR, MRP1, AchR, DTr, carreador de glutationa, SR-B1, MYOF, TFRC, ECE1, LDLR, PVR, CDC50A, SCARF1, MRC1, HLA-DRA, RAMP2, VLDLR, STAB1, TLR9, CXCL16 , NTRK1, CD74, DPP4, receptores do fator de crescimento endotelial 1, 2 e 3, receptor de glicocorticóide, receptor de glutamato ionotrópico, receptor M3, receptor de hidrocarboneto de arila, GLUT-1, receptor de inositol-1,4,5trifosfato (IP3), N receptor de -metil-D-aspartato, S1P1, receptor P2Y, TMEM30A e RAGE.

Várias variantes de anticorpos [00176] O anticorpo aqui divulgado é também uma variante do anticorpo aqui divulgado. Por exemplo, uma parte do antígeno compreende a substituição de aminoácidos conservativa em um ou mais dos resíduos da cadeia pesada ou cadeia leve, região variável ou sequência de CDR divulgada acima. Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser classificados com base nas propriedades comuns das propriedades da cadeia lateral como se segue: 1) hidrofóbico:

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78/164 norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; 2) neutro, hidrofilico:

Cys,	Ser,	Thr, Asn, Gin; 3) ácido:	Asp, Glu; 4)	básico:	His,
Lys,	Arg;	5) resíduo que afeta a	direção da corrente:	Gly,
Pro;	e 6)	aromático: Trp, Tyr, Phe.
[00177]	As substituições de	aminoácidos	conservados

referem-se à substituição em diferentes resíduos pertencentes à mesma classe na classificação. A substituição de aminoácido conservative pode também compreender um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente, tal como um peptídeo mimético, e este resíduo é tipicamente introduzido por síntese química, não por uma célula.

[00178] A substituição não conservativa inclui a substituição de um resíduo que pertence a outra classificação entre a classificação acima. Esta substituição pode ser introduzida em uma região de um anticorpo que é homólogo a um anticorpo humano ou a uma região não homóloga.

[00179] Para introduzir esta substituição, em uma modalidade, mostrando um índice de hidrofobicidade ou hidrofilicidade de um aminoácido (índice hidropático) pode ser considerada. O perfil do índice de uma proteína (perfil hidropático) é calculado designando o índice para cada aminoácido e, em seguida, repetindo a média desses valores. Os índices de cada aminoácido são designados com base na hidrofobicidade e propriedade de carga da seguinte forma: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8);

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79/164 fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5) .

[00180] Para dar uma função biológica interacional a uma proteína, a importância do perfil de índice é conhecida na técnica (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131) . Sabe-se que um aminoácido específico pode ser substituído por outro aminoácido possuindo um índice de valor numérico semelhante ou pontuação, e a atividade biológica semelhante pode ser mantida. Em uma modalidade, ao efetuar uma alteração com base no índice, a substituição de aminoácido com o índice dentro da faixa de ± 2, em ± 1 ou em ± 0,5 é incluída.

[00181] Além disso, a substituição entre aminoácidos semelhantes, em particular, quando uma proteína produzida por substituição é uma proteína com atividade imunológica tal como aqui descrita, pode ser realizada com base na hidrofilicidade. Em um exemplo de realização, o valor máximo de hidrofilicidade média local de uma proteína, que é determinada pela hidrofilicidade de um aminoácido próximo, está relacionado às propriedades biológicas de uma proteína, tais como imunogenicidade e propriedade de ligação ao antígeno.

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80/164 [00182] Os valores de hidrofilicidade dos resíduos de aminoácidos são os seguintes: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+ 3,0 ± 1); glutamato (+ 3,0 ± 1); serina ( + 0,3); asparagina ( + 0,2); glutamina ( + 0,2); glicina (0) ; treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). No caso de substituição com base em valores de hidrofilicidade semelhantes, em uma modalidade, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão em ± 2, em ± 1 ou em ± 0,5 é incluída. Adicionalmente, um epitopo pode ser identificado a partir da sequência primária de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Além disso, essas regiões são chamadas de regiões centrais do epitopo.

[00183] A substituição conservativa exemplar de aminoácidos é mostrada na Tabela 2.

[Tabela 2] substituição conservadora de aminoácidos

Resíduo original	Substituição exemplar
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Vai
Leu	Ile, Vai

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Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Vai	Ile, Leu

[00184] Os peritos na técnica determinarão uma variante apropriada do polipeptídeo aqui divulgado utilizando uma técnica conhecida. Os peritos na técnica encontrarão um local que pode alterar uma proteína sem destruir a atividade, visando uma região que não é considerada importante para a atividade no polipeptídeo. Os peritos na técnica também identificarão um resíduo ou parte a ser conservada entre polipeptideos semelhantes. Adicionalmente, em outra modalidade, para uma parte considerada importante para a atividade ou estrutura biológica, a substituição conservadora de aminoácidos pode ser realizada sem destruir a atividade biológica, ou afetando negativamente uma estrutura polipeptídica.

[00185] Além disso, os peritos na técnica podem realizar uma análise estrutural funcional para identificar um resíduo importante para a atividade ou estrutura em um polipeptídeo semelhante. Através desta análise, um resíduo de aminoácido importante em uma proteína de direcionamento pode ser previsto encontrando um resíduo correspondente a um resíduo de aminoácido importante relativamente à atividade ou estrutura de uma proteína semelhante a este, em uma proteína.

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Os peritos na técnica podem substituir o resíduo de aminoácido importante previsto neste sentido por um aminoácido quimicamente semelhante a este.

[00186] Os peritos na técnica, para além disso, pode prever um resíduo de aminoácido relacionado com uma estrutura tridimensional de um anticorpo com base na estrutura tridimensional de um polipeptídeo de análise e sequência de aminoácidos semelhante com ele relacionado. Os peritos na técnica não introduzem uma mudança rápida, uma vez que o resíduo de aminoácido previsto como presente em uma superfície de uma proteína pode estar envolvido em uma interação importante com outra molécula. Além disso, os peritos na técnica podem produzir variantes de teste compreendendo a substituição de um único aminoácido em cada resíduo de aminoácido alvo. Estas variantes são então rastreadas utilizando a capacidade de ligação a um antígeno, recolhendo assim informação sobre qual a substituição de aminoácidos que corresponde ao propósito. Utilizando esta informação, os peritos na técnica podem facilmente determinar uma posição a ser substituída ou uma posição a ser evitada.

[00187] Além disso, uma posição a ser substituída pode ser determinada com base na estrutura secundária de uma proteína. Por exemplo, um método de prever a estrutura secundária é baseado na modelagem de homologia. Por exemplo, 2

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83/164 polipeptídeos ou proteínas com mais de 30% de identidade de sequência ou mais de 40% de similaridade podem ter fases estruturais semelhantes (Holm et al. , 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244-247). Para métodos adicionais de previsão da estrutura secundária, threading (Jones, 1977, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-387; Sippl et al., 1996, Estrutura 4: 15-19), análise de perfil (Bowie et al. , 1991, Science 253: 164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. 84: 4355 -4358), e ligação evolutiva (Holm, 1999, ibid; e Brenner, 1997, ibid) estão incluídos.

[00188] Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos realiza (1) redução da sensibilidade à decomposição da proteína, (2) reduzir a sensibilidade à oxidação, (3) modificação de afinidade de ligação para formar um complexo de proteína, (4) modificando antígeno afinidade de ligação e/ou (5) modificando de modo a fornecer uma proteína com outras propriedades físico-químicas ou funcionais. Por exemplo, a substituição de aminoácidos simples ou múltiplas, incluindo substituição conservativa pode executar em substituição não um domínio que está envolvido em um contacto intermolecular, mas outras partes. Nesta modalidade, a substituição de aminoácidos conservadora que não altera substancialmente as propriedades estruturais de uma sequência parental, por exemplo, substituição de um

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84/164 ou mais dos aminoácidos que não alteram a estrutura secundária do anticorpo, podem ser utilizados. Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptideos conhecidos na técnica podem referir-se a Proteínas, Estruturas e Princípios Moleculares (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Nova Iorque: Freeman and Company; Introdução à Estrutura de Proteínas (Branden e Tooze, eds.), 1991, Nova Iorque: Garland Publishing; e Thornton et al., 1991, Nature 354: 105).

[00189] Em variantes de anticorpo preferíveis adicionais, é incluída uma variante em que um ou mais dos resíduos de cisteína são eliminados, ou os resíduos de cisteína são substituídos por outros aminoácidos tais como serina, em uma sequência parental. A variante da cisteína é, em particular, uma estrutura na qual um anticorpo tem atividade biológica, e é útil quando necessário para ser dobrado novamente. A variante da cisteína pode ter um pequeno número de resíduos de cisteína em comparação com um anticorpo parental e, geralmente, pode ser compreendida em um número par, de modo a minimizar a interação devido a cisteínas sem um par.

[00190] A cadeia pesada e cadeia leve, domínio da região variável e CDR aqui divulgado pode ser utilizado para a preparação de um polipeptídeo compreendendo uma região de ligação ao antígeno que se podem ligar especificamente a asyn. Por exemplo, uma ou mais CDR divulgadas na Tabela la a

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Tabela If podem ser ligadas não covalentemente ou covalentemente a uma molécula como um polipeptídeo e, desse modo, podem ser utilizadas como uma molécula de adesão imunogênica. Esta molécula de adesão imunogênica pode ser que uma CDR esteja integrada em um polímero grande, ou que uma CDR esteja ligada a outro polipeptídeo. Esta molécula de adesão imunológico permite a ligação específica a um antígeno alvo um polipeptídeo ligado ao mesmo ou outro material, por exemplo, α-syn ou um epítopo.

[00191] Um peptídeo mimético baseado na região variável e CDR aqui divulgado também fornecido. Este mimético pode ser um peptídeo, não peptídeo ou uma combinação de peptídeo e não peptídeo, e os seguintes podem ser referidos: Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber e Freidinger, 1985, TINS p. 392; e Evans et al. , 1987, J. Med. Chem. 30: 1229. Um peptídeo mimético estruturalmente semelhante a um polipeptídeo útil tem um efeito semelhante ao polipeptídeo original. Este composto pode ser desenvolvido usando uma modelagem molecular computadorizada. Comumente, o peptídeo mimético estruturalmente semelhante a um anticorpo que apresenta capacidade de ligação específica α-syn, mas uma ou mais ligações peptídicas podem ser substituídas por ligações selecionadas entre -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, - CH-CH- (cis e trans), -COCH₂-, -CH (OH) CH₂- e CH₂SO-, por um método amplamente conhecido na técnica. Para a produção de uma

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86/164 proteína mais estável, um ou mais dos resíduos de uma sequência conservativa podem ser substituídos no mesmo tipo de D-aminoácido (por exemplo, D-lisina em vez de L-lisina). Além disso, a molécula que pode ciclizar um peptídeo pode introduzir um resíduo de cisteína de formação de ligações cruzadas no interior, produzindo desse modo um peptídeo impondo restrições estruturais a uma sequência conservativa (Rizo e Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387).

[00192] A presente invenção também fornece um derivado do anticorpo aqui divulgado. O anticorpo derivado pode compreender qualquer molécula ou material que proporcione propriedades de direcionamento, por exemplo, uma semivida aumentada em determinadas utilizações para o anticorpo ou o seu fragmento. O anticorpo derivatizado pode compreender um resíduo detectável (ou rotulável) (por exemplo: molécula que se liga a uma esfera radioativa, colorimétrica, antigênica ou molécula de enzima, detectável (por exemplo: esferas magnéticas ou elétron-densas (por exemplo: ouro)) ou outras moléculas (por exemplo: biotina ou estreptavidina)), um resíduo terapêutico ou diagnóstico (por exemplo: resíduo radioativo, citotóxico ou farmaceuticamente ativo), ou uma molécula aumentando a adequação do anticorpo para usos especiais (por exemplo, administração a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, ou outros usos in vivo ou in vitro). Para exemplos de uma molécula a ser utilizada para

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87/164 derivatizar um anticorpo, incluem-se albumina (por exemplo: albumina do soro humano) e polietilenoglicol (PEG). Os derivados ligados a albumina e peguilados do anticorpo podem ser preparados utilizando técnicas amplamente conhecidas na técnica. Em uma modalidade, um polipeptídeo de cadeia simples peguilado é compreendido. Em outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado ou ligado a transtirretina (TTR) ou variante de TTR. A variante de TTR ou TTR pode ser quimicamente modificada por materiais químicos selecionados do grupo que consiste em por exemplo, dextrano, poli (nvinil pirrolidona), polietileno glicol, propilenoglicol homopolímero, óxido de polipropileno/copolímero de óxido de etileno, poliol polioxietilado e álcool polivinílico.

[00193] Outros derivados incluem um conjugado covalente ou aglomerante de proteína de ligação α-syn e outra proteína ou polipeptídeo, que pode ser preparado por exemplo, por expressão de uma proteína de fusão recombinante compreendendo um polipeptídeo heterogêneo fundido em Nterminal ou C-terminal de. proteína sin. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo sinal heterogêneo (ou leitor), por exemplo, um leitor de fator alfa de levedura, ou um peptídeo, por exemplo, um marcador epitópico. A proteína de fusão α-syn-anticorpo contendo pode compreender um peptídeo adicionado para fazer a purificação ou identificação de proteínas de ligação α-syn (por exemplo:

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88/164 poli-His) fácil. A proteína de ligação α-syn pode também estar ligada ao peptídeo LAG como descrito em Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204; e patente U.S. No. 5.011.912. O peptídeo FLAG tem excelente antigenicidade, e, por conseguinte, atua como um epítopo para ser ligado de forma reversível por um anticorpo monoclonal específico (mAb), permitindo assim a rápida confirmação e fácil purificação de uma proteína recombinante.

[00194] Em uma modalidade, se refere a um oligômero compreendendo múltiplos polipeptideos de ligação a-syn-a estar ligado através de interação covalente ou não-covalente entre os resíduos de peptídeo fundidas com a proteína de ligação α-syn. Este peptídeo a ser ligado pode ser um peptídeo tal como um ligante peptídico (espaçador) ou um fecho de leucina tendo uma propriedade de facilitar a oligomerização. Em uma modalidade, o oligômero compreende 2 ou 4 de proteínas de ligação α-syn. O resíduo da proteína de ligação α-syn do oligômero pode ser acima mencionado em qualquer forma, por exemplo, uma variante ou fragmento. De um modo preferido, o oligômero compreende uma proteína de ligação α-syn possuindo atividade de ligação a-syn.

[00195] Em uma modalidade, o oligômero é preparado utilizando um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina. A preparação de uma proteína de fusão compreendendo polipeptídeo heterogêneos fundidos com vários locais

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89/164 (incluindo um domínio Fc) de um polipeptídeo derivado de anticorpo pode referir-se, por exemplo, a Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 10535; Byrn et al. , 1990, Nature 344: 677; e Hollenbaugh et al., 1992 Construção de Proteínas de Fusão de Imunoglobulina, em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

[00196] Outra modalidade se refere a um dímero compreendendo 2 proteínas de fusão em que a proteína de ligação α-syn fundida com uma região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser preparado através da inserção de um gene de fusão que codifica para uma proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, expressar o gene de fusão de uma célula hospedeira transformada por um vetor de expressão recombinante, e permitindo que a proteína de fusão expressa a combinar de forma semelhante a uma molécula de anticorpo, e a este respeito, é formada uma ligação dissulfeto entre cadeias entre resíduos Fc para recolher o dímero.

[00197] O termo polipeptídeo Fc aqui utilizado é um polipeptídeo derivado de uma região Fc de um anticorpo e inclui uma forma do tipo selvagem ou mutante. Uma forma de corte de polipeptídeo compreendendo uma região charneira que facilita a dimerização é também incluída. A proteína de fusão compreendendo Fc ou oligômero formado a partir deste tem uma vantagem de ser separada facilmente com uma cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de proteína A ou proteína G.

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90/164 [00198] Para exemplos de polipeptídeos Fc apropriados, há aqueles descritos na patente U.S. No. 5.426.048 e No. 5.262.522, No. 5.457.035 e Baum et al. , 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. Na sequência de aminoácidos desta proteína mutante, o 19° resíduo de aminoácido de tipo selvagem é substituído de Leu por Ala e o 20° resíduo de aminoácido é substituído de Leu por Glu e o 22° resíduo de aminoácido é substituído por Gly por Ala. a proteína mutante, a afinidade para um receptor Fc é reduzida.

[00199] Em outra modalidade, a região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve de proteína de ligação α-syn aqui divulgado pode ser substituído e inserir uma região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um outro anticorpo.

Marcadores e grupos de efetores [00200] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais dos marcadores. Marcador significa qualquer material detectável. Para exemplos de grupos de marcadores apropriados, um isótopo radioativo ou nuclídeo radioativo (por exemplo: ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, Tc, ^i:L1In, ¹²⁵I, ¹³¹I), um grupo fluorescente (por exemplo: FITC, rodamina, substância fluorescente de lantanóide), um grupo enzimático (por exemplo: peroxidase de rábano, βgalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), um grupo quimioluminescente, um grupo biotinilo ou um certo epítopo

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91/164 polipeptídico reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequência de pares de fechos de leucina, sitio de ligação do anticorpo secundário, domínio de ligação de metal, marcador epitópico) está incluído, mas não limitado a este. Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado a um anticorpo através de vários comprimentos de braços de espaço para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcar uma proteína são conhecidos na técnica, e os peritos na técnica irá selecionar uma etiqueta apropriada e um método adequado para um fim específico.

[00201] O termo grupo efetor é um material a ser acoplado ou conjugado a um anticorpo ou material para funcionar como agente citotóxico. Os exemplos de materiais apropriados para tratamento incluem materiais radioativos para tratamento, tais como um isótopo radioativo ou um nuclídeo radioativo (e. G., ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, Tc, ⁴¹¹Ιη, ¹²⁵I, ¹³¹I). Em algumas modalidades, o grupo efetor é acoplado a um anticorpo através de vários comprimentos de braços espaçadores para reduzir o potencial impedimento estérico.

[00202] Comumente, os marcadores podem ser classificados de acordo com os métodos de detecção: a) etiqueta radioativa ou isotópica; b) etiqueta magnética (por exemplo: partícula magnética); c) oxidação-redução resíduo ativo; d) corante tico; grupo de enzima (por exemplo, peroxidase de rábano, βgalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupo

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92/164 biotinilo; e f) determinado epítopo polipeptídico reconhecido por um repórter secundário (por exemplo: sequência de pares de fechos de leucina, local de ligação para um anticorpo secundário, domínio de ligação a metais, marcador epitópico etc.). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado a um anticorpo através de vários comprimentos de braços espaçadores para reduzir o potencial impedimento estérico. Vários métodos para marcar uma proteína são conhecidos na técnica.

[00203] Em uma modalidade, o marcador compreende um corante ótico compreendendo um cromóforo, um fósforo e uma substância fluorescente, mas não limitados a estes. A substância fluorescente pode ser um material fluorescente de pequena massa molecular ou material fluorescente de proteína.

[00204] Etiqueta fluorescente significa qualquer molécula a ser detectada pelas propriedades fluorescentes que um material possui. Para exemplos do marcador fluorescente, fluoresceína, rodamina, tetrametil-rodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarina, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarelo lúcifer, azul cascata J, vermelho texano, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC vermelho 640, Cy 5, Cy 5.5, LC vermelho 705, verde Oregon, corante alexafluor (alexa-fluor 350, alexa-fluor 430, alexa-fluor 488, alexa-fluor 546, alexa-fluor 568, alexa-fluor 594, alexa

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93/164 fluor 633, alexa-fluor 647, alexa-fluor 660, alexa-fluor 680), cascata azul, amarelo cascata e R-ficoeritrina (PE), FITC, ) , Cy5, Cy5.5 e Cy7 etc. estão incluídos, mas não limitado a isso. Vários corantes óticos podem se referir ao Manual de Sondas Moleculares, Richard P. Haugland.

[00205] As substâncias de marcadores fluorescentes proteínas incluem proteínas fluorescentes verdes incluindo Renilla, Ptilosarcus ou espécies de Aequorea de GFP (Chalfie et al, 1994, Science 263:. 802-805) (Clontech Labs, Inc., número de acesso GenBank U55762), EGFP, proteínas azuis fluorescentes (BEP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebeque, Canad; Stauber, 1998 Biotechniques 24: 462-471; Heim et al. , 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), melhoraram proteínas fluorescentes amarelas (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferase (Ichiki et al. , 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), Galactosidase (Nolan et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2603 -2607), mas não limitado a isso.

Ácido nucléico [00206] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um ácido nucléico confundido com o ácido nucléico aqui divulgado sob uma condição de hibridização específica. O método de hibridação do ácido nucléico é amplamente conhecido na técnica. Por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 podem ser referidos. Nisto, uma condição de hibridação rigorosa

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94/164 usa solução de pré-lavagem que compreende cloreto de 5x de sódio/citrato de sódio (SSC) , 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); um tampão de hibridação de cerca de 50% de formamida, 6x SSC, e uma temperatura de hibridização de 55 °C (ou outra solução de hibridação semelhante, por exemplo, uma solução que compreende cerca de 50% de formamida, a uma temperatura de hibridação de 42 °C), e uma condição de lavagem de 60 °C em 0,5x SSC, 0,1% SDS. A condição de hibridação rigorosa é a hibridação por 6x SSC a 45 °C, e, em seguida, 0,1 x SSC a 68 °C, e um ou mais de lavagem em 0,2% de SDS. Além disso, os peritos na técnica selecionarão as condições de hibridização adequadas necessárias para que um ácido nucleico compreendendo pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de sequências nucleotidicas idênticas entre sequências tipicamente mantém um estado hibridizado entre si.

[00207] Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridação e condições apropriadas podem referir-se a, por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis, (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, acima; e Current Protocols em Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secção 2.10 e 6.3-6.4 Estas condições podem ser facilmente determinadas pelos peritos na técnica, com base, por exemplo, no

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95/164 comprimento e/ou composição de base (configuração de A, G, C e T (U)) do ácido nucleico etc.

[00208] O ácido nucleico aqui divulgado também inclui uma variante mutante. Uma alteração em uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (anticorpo ou derivado de anticorpo) que o ácido nucleico codifica pode ser induzida por mutação no ácido nucleico. O mutante pode ser introduzido utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Por exemplo, um método de mutagênese dirigida ao local, pode ser utilizado um método de mutagênese aleatória. O mutante de ácido nucleico preparado do mesmo modo, selecionado para um polipeptídeo possuindo propriedades de direcionamento.

[00209] Sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, o mutante pode ser introduzido no ácido nucleico. Por exemplo, a substituição de nucleotídeos que causa a substituição de aminoácidos em um resíduo de aminoácido não essencial pode ser realizada. Alternativamente, um ou mais mutantes que alteram seletivamente a atividade biológica de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico podem ser introduzidos no ácido nucleico. Por exemplo, o mutante pode alterar a atividade biológica quantitativa ou qualitativamente. Os exemplos de mudanças quantitativas incluem aumento, diminuição ou remoção de atividade. Os exemplos de mudanças qualitativas incluem uma mudança de

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96/164 especificidade para um antígeno de um anticorpo. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo ou o seu fragmento aqui divulgado pode ser mutado de modo a que a sequência de aminoácidos seja modificada, utilizando uma técnica de biologia molecular amplamente conhecida na técnica.

[00210] Em outro aspecto, além disso, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico adequada para ser utilizada como um iniciador ou sonda de hibridização para a detecção da sequência de ácido nucleico aqui divulgada. Este ácido nucleico pode compreender uma parte da sequência de ácido nucleico de comprimento total, por exemplo, um fragmento de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo inteiro ou um ácido nucleico de fragmento que codifica uma parte ativa (parte de ligação α-syn) de um polipeptídeo, para ser usado como uma sonda ou um iniciador.

[00211] O iniciador e sonda preparados com base na sequência de ácido nucleico podem ser utilizados para detectar um transcriptoma que codifica o ácido nucleico aqui divulgado ou ácido nucleico ou polipeptídeo semelhante. Em uma modalidade, esta sonda pode ser utilizada para identificar uma célula que expressa o polipeptídeo de acordo com a presente invenção. O iniciador ou sonda pode ser marcado por um material de etiqueta, tal como um isótopo

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97/164 radioativo, composto fluorescente, enzima ou cofator enzimático.

[00212] Em outro aspecto, além disso, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico codificando o polipeptídeo ou a sua parte (por exemplo, fragmento compreendendo uma ou mais CDR ou um ou mais domínios da região variável) de acordo com a presente invenção. Os exemplos do vetor incluem um plasmídeo, vetor de vírus, vetor de mamífero não-epissomal e vetor de expressão (recombinante) etc., mas não limitados a este. O vetor de expressão recombinante pode compreender uma forma adequada de ácido nucleico para expressão de ácido nucleico em uma célula hospedeira. O vetor de expressão recombinante compreende uma ou mais das sequências de regulação com base em uma célula hospedeira a ser utilizada para a expressão, e estas sequências reguladoras estão operacionalmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico a ser expressa. Na sequência reguladora, por exemplo, promotor do gene inicial SV40, promotor tal como promotor do vírus do sarcoma de Rous e promotor do citomegalovírus, que pode controlar a expressão de uma sequência nucleotídica em vários tipos de células hospedeiras; ou, por exemplo, sequência de regulador específico para o tecido, que controla a expressão de uma sequência nucleotídica apenas em uma célula hospedeira específica (Voss et al, 1986, Trends Biochem Sei 11: 287,

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Maniatis et al, 1987, Science 236: 1237), e o promoter de metalotioneina de trabalho em uma célula de mamífero, e Tetreativo e/ou estreptomicina promotor reativo a trabalhar em ambos os sistemas procariotas e eucariotas, que instrui expressão indutiva de uma sequência de nucleotideos por responder ao tratamento ou condições especiais, estão incluídas. Os peritos na técnica selecionarão um vetor apropriado e uma sequência reguladora, considerando fatores tais como os tipos de uma célula hospedeira a ser transformada, o grau de expressão de uma proteína alvo. 0 vetor de expressão selecionado pode ser entregue em uma célula hospedeira e pode ser utilizado para a produção de uma proteína codificada pelo ácido nucleico aqui descrito.

[00213] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira na qual é introduzido um vetor de expressão recombinante. A célula hospedeira pode ser qualquer procariota (por exemplo, E. coli) ou eucariota (por exemplo, célula de levedura, inseto ou mamífero). O DNA vetor pode ser introduzido em uma célula procariótica ou eucariótica através de uma técnica conhecida de transformação ou transfecção. Sabe-se que no caso de transfecção estável em uma célula de mamífero, dependendo dos tipos de vetor de expressão utilizados e das técnicas de transformação, apenas um pequeno número de células pode integrar o DNA distribuído por transfecção no seu genoma. Assim, para identificar e

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99/164 selecionar uma célula transfectada, é normalmente introduzido na célula hospedeira um gene que codifica um marcador selecionável, tal como um marcador resistente a antibióticos, juntamente com um gene de direcionamento. Para marcadores selecionáveis preferíveis, são incluídos medicamentos, por exemplo, aqueles que fornecem resistência a, por exemplo, G418, higromicina e metotrexato. A triagem de uma célula na qual um ácido nucleico alvo é introduzido de forma estável pode ser alcançada pela seleção de uma célula sobrevivida somente através do tratamento com drogas.

Preparação do anticorpo [00214] Aqui, um anticorpo não humano pode ser derivado de, por exemplo, qualquer animal produtor de anticorpo, por exemplo, primatas de camundongo, rato, coelho, cabra, burro ou não humano (por exemplo, macacos como um macaco cynomolgus ou rhesus) ou antropoide (por exemplo, chimpanzé). O anticorpo não humano pode ser produzido por imunização de um animal usando um método conhecido na técnica. O anticorpo pode ser policlonal, monoclonal ou pode ser sintetizado em uma célula hospedeira expressando um DNA recombinante. Um anticorpo humano completo pode ser preparado pela administração de um antígeno ao animal transformado compreendendo loci gênicos de imunoglobulina humana, ou tratando uma biblioteca de exibição de fago expressando um

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100/164 repertório de anticorpo humano com um antígeno, e então selecionando um anticorpo de interesse.

[00215] Um anticorpo monoclonal (mAb) pode ser produzida por várias técnicas, incluindo o método convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, uma técnica de hibridação de células somáticas padrão de documentos (ver: Kohler e Milstein, 1975, Nature 256: 495) . Alternativamente, por exemplo, pode ser utilizado um método de transformação de um linfócito B em um vírus ou gene tumoral e utilizando. Um sistema murino é um sistema animal amplamente utilizado para a produção de uma célula de hibridoma. Um protocolo de imunização e uma técnica de separação de esplenócitos de um camundongo imunizado para fusão são amplamente conhecidos na técnica. Neste método, uma célula B derivada de um camundongo imunizado é fundida com, por exemplo, uma célula parceira de fusão imortalizada, tal como uma linhagem celular de mieloma murino. Se for necessário, em vez do camundongo, um camundongo ou outros mamíferos podem ser imunizados, e uma célula B derivado a partir destes animais podem ser fundidos com uma linhagem celular de mieloma de murino, para produzir hibridomas. Alternativamente, como linhagem celular de mieloma utilizada para fusão, podem ser utilizados aqueles derivados de animais que não sejam ratos. O processo de fusão para preparar este hibridoma é também amplamente conhecido.

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101/164 [00216] O anticorpo único aqui divulgado pode ser produzido ligando fragmentos do domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve (região Fv), utilizando uma ligação cruzada de aminoácidos (ligante peptídico curto). Esta cadeia simples Fv (scFv) pode ser preparada fundindo DNA codificando um ligante peptídico entre DNA que codificam 2 polipeptídeos de domínio variável (Vl e Vh) . O polipeptídeo preparado pode formar um multímero de ligação ao antígeno por dobragem, ou pode formar um polímero (por exemplo, dímero, trímero ou tetrâmero), de acordo com o comprimento de um ligante flexível entre 2 domínios variáveis (Kortt et al. , 1997, Prot Eng. 10: 423; Kortt et al. , 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). Por combinação de diferentes polipeptídeos contendo VL e VH, pode ser formada uma ligação polimérica de scFv a diferentes epitopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31-40). Além disso, uma técnica para a produção de um anticorpo de cadeia única adicional pode referir-se, por exemplo, aos seguintes: Patente U.S. No. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423; Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178: 379-387. 0 anticorpo de cadeia simples aqui divulgado inclui scFv compreendendo uma combinação de domínios das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve descritas na Tabela la e 1b, ou uma combinação dos domínios variáveis da

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102/164 cadeia leve e da cadeia pesada compreendendo uma CDR descrita na Tabela 1, mas não limitado a isso.

[00217] O anticorpo aqui descrito também pode ser modificado em um anticorpo de subtipo diferente, através de troca de subtipo. Assim, um anticorpo IgG pode ser derivado de, por exemplo, um anticorpo IgM, e o inverso também é possível. Através desta técnica, preparação de um novo anticorpo tendo a mesma propriedade de ligação ao antígeno que um anticorpo parental, mas tendo uma propriedade biológica característica ao subtipo alterado que é diferente do anticorpo parental. Para esta mudança, uma técnica de DNA recombinante pode ser usada. Por exemplo, um DNA que codifica um domínio constante de um anticorpo de isotipo de direcionamento pode ser utilizado para a preparação deste anticorpo. Por exemplo, Lantto et al. , 2002, Methods Mol. Biol. 178: 303-316 pode ser referido. Além disso, no caso de troca de IgG4, para reduzir a tendência de formar uma ligação dissulfeto em uma cadeia pesada que pode causar heterogeneidade em um anticorpo IgG4, pode ser preferível introduzir mutação pontual (CPSCP-> CPPCP) em uma região de charneira como descrito no documento, Bloom et al. , 1997, Protein Science 6: 407.

[00218] Assim, o anticorpo aqui divulgado, compreende o anticorpo de combinação de domínio variável que é trocado

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103/164 por exemplo, com um isotipo de direcionamento (por exemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) divulgado aqui.

[00219] Além disso, é também conhecida uma técnica de preparação de um anticorpo possuindo propriedades diferentes, como um anticorpo com várias afinidades para um antígeno. Esta técnica é, por exemplo, o embaralhamento de cadeias realizado pela apresentação de um repertório de genes de domínio variável de imunoglobulina em uma superfície de bacteriófago de filamento, denominado fago. Uma técnica adicional pode ser referida à divulgação em Marks et al., 1992, BioTechnology 10: 779.

[00220] Para produzir uma proteína de ligação α-syn ter segmentação propriedades funcionais e bioquímicos preferíveis, modificação conservadora (e modificação correspondente a um ácido nucleico que o codifica) pode ser realizada a cadeia pesada e cadeia leve de regiões variáveis descritas na Tabela la e 1b Tabela, ou CDR descritas na Tabela 1b. O método para executar esta modificação é como acima mencionado.

[00221] O anticorpo de α-syn pode ser ainda modificado em vários métodos. Por exemplo, quando utilizado para um propósito terapêutico, para aumentar a semivida no soro, ou melhorar a distribuição de proteína, pode ser conjugado com polietilenoglicol, nomeadamente, peguilado. Alternativamente, a região variável do anticorpo ou o seu

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104/164 fragmento da presente invenção pode ser fundido com uma região Fc de uma molécula de anticorpo diferente. A região Fc utilizada para este fim não se liga a um complemento, e, portanto, quando uma proteína de fusão é utilizada como um agente terapêutico, que é modificado no sentido de reduzir a ocorrência de lise celular em um paciente. Adicionalmente, o anticorpo ou o seu fragmento funcional da presente invenção pode ser conjugado com uma albumina do soro humano para melhorar a semivida no soro do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Outro parceiro de fusão útil do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é a transtirretina (TTR) . A TTR possui uma capacidade de formar um tetrâmero e, assim, uma proteína de fusão anticorpo-TTR pode formar um anticorpo multivalente no qual a avidez de ligação de uma proteína é aumentada.

[00222] Alternativamente, podem ser conseguidas modificações substanciais para propriedades funcionais e/ou bioquímicas do anticorpo aqui divulgado através da substituição na sequência de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve, o que afeta significativamente, por exemplo, (a) uma estrutura de estrutura molecular na substituição, local como uma folha ou forma em espiral, (b) um grau de carga ou hidrofobicidade da molécula em um local alvo, ou (c) volume de uma cadeia lateral.

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105/164 [00223] A substituição de aminoácidos (conservadoras ou não conservadoras) do anticorpo aqui divulgado pode ser realizado por aqueles peritos na técnica mediante a aplicação de uma técnica comum. A substituição de aminoácidos pode ser utilizada para a identificação de um resíduo importante do anticorpo aqui descrito, ou aumentando ou diminuindo a afinidade do anticorpo para α-syn humano, ou modificar a afinidade de ligação de um outro anticorpo aqui descrito.

Método para expressar anticorpo [00224] A presente invenção também se refere a um sistema de expressão e a construção de uma forma de plasmídeo, vetor de expressão, a transcrição ou cassete de expressão que compreende pelo menos um polinucleotídeo, como acima mencionado, e uma célula hospedeira que compreende o sistema de expressão ou construo, e um método de produção de um anticorpo usando o sistema de expressão ou célula hospedeira.

[00225] O anticorpo aqui divulgado pode ser preparado utilizando a técnica acima mencionada. Por exemplo, o anticorpo de α-Syn pode ser preparado utilizando um sistema de expressão recombinante de acordo com a técnica conhecida na técnica, referindo anticorpos monoclonais, hibridomas: uma nova dimensão em análises biológicas, Kennet et al. (eds.) Pleem um Press, Nova Iorque (1980); e Anticorpos: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)

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106/164 [00226] O anticorpo pode ser expresso em uma linhagem celular de hibridoma ou em uma linhagem celular de expressão diferente de hibridoma. O construto de expressão que codifica um anticorpo pode ser utilizado para transformar uma célula hospedeira de mamífero, inseto ou microrganismo. A construção como um plasmídeo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira como acima mencionado. Os métodos detalhados podem ser diferentes de acordo com os tipos de células hospedeiras. O método de introdução de um polinucleotídeo heterogêneo em uma célula de mamífero é amplamente conhecido na técnica e, por exemplo, pode ser realizado por exemplo por transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, capsulação. de um polinucleotídeo entregue utilizando um lipossoma, mistura de um ácido nucleico e um lipídeo carregado positivamente, e microinjeção direta do DNA em um núcleo, mas não limitada aos mesmos.

[00227] A estrutura de expressão recombinante compreende, tipicamente, um molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais das CDR aqui descritos; região constante da cadeia leve; região variável de cadeia leve; região variável de cadeia pesada; região constante de cadeia pesada (por exemplo, CHI,

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CH2 e/ou CH3); e/ou a outra parte do esqueleto do anticorpo α-syn. A sequência de ácido nucleico é inserida em um vetor de expressão apropriado utilizando uma técnica de ligação padrão. Em uma modalidade, a cadeia ou cadeia leve da região constante pesada está ligado ao C-terminal da cadeia leve da cadeia pesada anti-a-especifica syn ou região variável, e é ligado no vetor de expressão. O vetor é selecionado de modo a funcionar em uma célula hospedeira especifica na qual o vetor é usado. Em outras palavras, o vetor deve amplificar e/ou expressar um gene compreendido no vetor usando um dispositivo da célula de mangueira a ser usada. Em uma modalidade, utiliza-se um vetor utilizando uma análise de complementação de fragmento de proteína utilizando um repórter de proteína, por exemplo, redutase de dihidrofolato divulgada na Patente U.S. No.6.27 0.964 . O vetor de expressão adequado pode ser adquirido comercialmente, por exemplo, de uma empresa como a Life Technologies ou a BD Biosciences. Os exemplos de outros vetores eis para clonar e expressar um anticorpo e um fragmento podem referir-se aos divulgados em Bianchi e McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84: 439-44; Methods Enzymol., Vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.

[00228] Tipicamente, um vetor de expressão utilizado em qualquer célula hospedeira pode compreender uma sequência bica necessária para manutenção do plasmídeo e clonagem e

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108/164 expressão de uma sequência nucleotidica exógena. Em uma modalidade específica, essa sequência bica compreende tipicamente uma ou mais das seguintes sequências nucleotídicas: um promotor, uma ou mais sequências estimuladoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação da transcrição, uma sequência de intron completa compreendendo sítios dadores e receptores, uma sequência que codifica uma sequência de leitura para a secreção de polipeptídeo, um local de ligação ao ribossoma, uma sequência poliadenilada, uma região poliligante para inserir um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo a ser expresso e uma sequência marcadora selecionável.

[00229] Seletivamente, o vetor pode compreender uma sequência codificadora de etiqueta, por outras palavras, uma molécula de oligonucleotídeo posicionada na extremidade 5 'ou 3' da sequência de codificação da proteína de ligação α-syn; a sequência oligonucleotídica codifica poliHis (pode por exemplo: hexaHis) ou outra presente tag de um anticorpo disponível comercialmente, por exemplo, FLAG®, HA (hemaglutinina do vírus da gripe), Fc ou myc. Tipicamente, estas marcas podem ser fundidas com um polipeptídeo e expressas e funcionar como meios de purificação por afinidade ou detecção durante a separação da proteína de ligação a-syn em uma célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser conseguida, por exemplo, por uma cromatografia em coluna

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109/164 utilizando um anticorpo para um marcador como uma matriz de afinidade. Seletivamente, estes marcadores podem ser removidos da proteína de ligação α-syn purificada por vários meios incluindo o uso de uma peptidase específica.

[00230] A sequência básica acima mencionada pode ser homogênea, heterogênea ou híbrida, sintética ou intrínseca. Desta forma, a sequência básica derivada de qualquer procariota ou eucariota, qualquer vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, se puder ser ativada e funcionar em um dispositivo de célula hospedeira.

[00231] A sequência básica útil compreendida em um vetor pode ser recolhida por vários métodos amplamente conhecidos na técnica. Tipicamente, a sequência bica aqui utilizada confirmada antecipadamente por mapeamento e/ou corte com enzima de restrição e, portanto, pode ser separada de uma fonte de fornecimento de tecido apropriada utilizando uma enzima de restrição adequada. Em alguns casos, a sequência nucleotídica total da sequência básica pode ser conhecida, e a sequência básica pode ser sintetizada utilizando a síntese de ácido nucléico ou o método de clonagem aqui descrito.

[00232] Independentemente se o total ou parte da sequência da sequência básica é conhecida, a sequência básica pode ser recolhida utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR), e/ou rastreio de uma biblioteca genômica com uma sonda

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110/164 apropriada, por exemplo, um oligonucleotídeo e/ou fragmento de sequência básica da mesma espécie ou de espécies diferentes. Se a sequência básica não for conhecida, um fragmento de DNA compreendendo a sequência básica pode ser separado de, por exemplo, uma sequência de codificação ou mesmo de um fragmento maior de DNA que pode compreender outro (s) gene (s) . Um fragmento de direcionamento pode ser separado utilizando tratamento com enzimas de restrição, purificação em gel de agarose e cromatografia em coluna ou outros modos conhecidos dos especialistas na técnica. É óbvio que os peritos na técnica podem selecionar uma enzima apropriada para alcançar tal finalidade.

[00233] A origem de replicação é necessária para a amplificação de um vetor em uma célula hospedeira, e, tipicamente, ele é compreendido em um vetor de expressão procariótico disponível comercialmente. Se um vetor selecionado não compreender a origem de replicação, pode ser quimicamente sintetizado com base na sequência conhecida e ligado ao vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, por exemplo, HPV ou BPV) il para clonar um vetor em uma célula de mamífero. Tipicamente, a origem de

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111/164 replicação n necessária para um vetor de expressão de mamífero (por exemplo, a origem de SV40 também utilizada, uma vez que compreende um promotor inicial de vírus).

[00234] Tipicamente, a sequência de terminação da transcrição está posicionada no extremo 3' de uma região codificante do polipeptídeo e funciona para terminar a transcrição. Comumente, a sequência de terminação da transcrição em um procariota é um fragmento rico em G-C seguido por uma sequência poli-T. Tal sequência pode ser facilmente clonada a partir de uma biblioteca, ou adquirida comercialmente, ou recolhida utilizando o método de síntese de ácido nucleico aqui descrito.

[00235] O gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento em um meio de cultura selecionável de uma célula hospedeira. O gene marcador selecionável típico codifica uma proteína (a) que fornece resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, no caso de uma célula hospedeira procariótica, ampicilina, tetraciclina ou canamicina; (b) complementando a deficiência auxotrófica de uma célula; ou (c) fornecimento de nutrientes importantes que não podem ser obtidos a partir de um meio complexo ou meio definido. Em uma modalidade, o marcador de seleção é um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à ampicilina e um gene de resistência à tetraciclina. Um gene resistente à neomicina pode também

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112/164 ser utilizado para seleção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

[00236] Outro gene selecionável pode ser usado para amplificação de um gene a ser expresso. A amplificação é um processo que um gene requerido para a produção de uma proteína importante para o crescimento ou sobrevivência de uma célula é repetido em série em um cromossoma de uma célula recombinante da geração subsequente. Os exemplos como marcadores selecionáveis adequados para uma célula de mamífero incluem o di-hidrofolato redutase (DHFR) e o gene da timidina cinase sem um promotor. Para um transformante de célula de mamífero, aplica-se uma pressão de seleção que permite que apenas o transformante seja sobrevivei por um gene selecionável presente em um vetor. A pressão de seleção pode ser aplicada aumentando gradualmente a concentração de um seletor compreendido em um meio e cultivando uma célula sob a condição de amplificar todos os genes que codificam um anticorpo que se liga a α-sin. Assim, a quantidade de um polipeptídeo expresso pelo DNA amplificado, por exemplo, um anticorpo, pode ser aumentada.

[00237] O sítio de ligação ao ribossoma é habitualmente necessário para o início da tradução de mRNA e caracterizado pela sequência de Shine-Dalgarno (procariota) ou sequência de Kozak (eucariota). Isto é tipicamente posicionado em 3'

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113/164 de um promotor e 5' de uma sequência de codificação de um polipeptídeo a ser expresso.

[00238] Quando a glicosilação é necessária em um sistema de expressão de células hospedeiras eucarióticas, para melhorar a glicosilação ou o rendimento, podem ser fabricadas várias pré- ou pro- sequências. Por exemplo, um local de corte de peptidase de um peptídeo de sinal específico pode ser modificado, ou pode ser adicionada uma pro-sequência que pode afetar a glicosilação. O produto proteico final pode ter um ou mais aminoácidos adicionais na posição -1 (para o primeiro aminoácido da proteína madura), uma vez que estes aminoácidos não são completamente removidos. Por exemplo, o produto proteico final pode ter um ou dois dos resíduos de aminoácidos encontrados no sítio de corte de peptídeo adicionado a um amino-terminal. Alternativamente, se se utilizar uma enzima de corte proteico, no caso de o sítio de corte estar compreendido em uma proteína de direcionamento, pode ser produzida uma forma cortada de proteína.

[00239] A expressão e clonagem podem tipicamente compreender a utilização de um promotor operacionalmente ligado a uma molécula que codifica uma proteína de ligação α-syn que é reconhecida por um organismo hospedeiro. O promotor é a classe superior do codon de iniciação de uma transcrição reguladora do gene estrutural do gene estrutural (habitualmente, dentro de cerca de 100 a 1000 pb) ,

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114/164 nomeadamente, uma sequência não transcricional posicionada em 5'. 0 promotor é classificado como um promotor induzivel e um promotor constante. 0 promotor induzivel responde a alterações de condições de cultura, por exemplo, presença ou ausência de um ingrediente especifico de um meio, ou a mudança de temperatura, e iniciados ou controles de transcrição a partir de DNA a ela ligados. Por outro lado, o promotor constante não controla a transcrição de um gene operativamente ligado ao mesmo e expressa constantemente. Numerosos promotores reconhecidos por várias células hospedeiras são amplamente conhecidos. Um promotor apropriado é operável ligado ao DNA que codifica uma cadeia pesada ou leve compreendendo uma proteína de ligação a-syn, inserindo-a em um vetor, após remoção de um promotor do DNA molde utilizando uma enzima de restrição.

[00240] Um promotor adequado para utilização em conjunto com um hospedeiro de levedura é também amplamente conhecido na técnica. Além do promotor de levedura, um intensificador de levedura também pode ser usado. Um promotor adequado para ser utilizado em uma célula hospedeira de mamífero inclui os recolhidos do genoma do vírus, por exemplo, poliomavírus, vírus da faringe, adenovirus (por exemplo, adenovirus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovirus, vírus da hepatite B e vírus antropoide 40 (SV40), mas não limitados a estes. Os exemplos

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115/164 de outros promotores de mamífero apropriados incluem um promotor de mamífero heterogêneo, por exemplo, um promotor de choque térmico e um promotor de actina.

[00241] Para um promotor adicional, o promotor inicial de SV40 (Benoist e Chambon, 1981, Nature 290: 304-310); Promotor de CMV (Thornsen et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81: 659-663); promotor compreendido na repetição terminal longa de 3 'do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797); promotor da timidina quinase do herpes (Wagner et al. , 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 14441445) ; sequência promotora e reguladora do gene da metalotionina (Prinster et al., Nature 296: 39-42, 1982); e promotor procariótico, por exemplo, promotor de betalactamase (Villa-Kamaroff et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731); ou promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25) está incluído, mas não limitado a estes. Além disso, pode ser utilizada uma região reguladora da transcrição de um animal como se segue, que é utilizada para um animal transformado com especificidade para o tecido: região reguladora do gene da elastase I que ativa em uma célula acinar pancreática (Swift et al. , 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al. , 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); região reguladora do gene da insulina que ativa em uma célula beta pancreática (Hanahan,

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1985, Nature 315: 115-122); região reguladora do gene da imunoglobulina que ativa em uma célula linfóide (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol 7: 14361444); região reguladora do vírus da glândula mamária de camundongo que é ativa em um testículo, mama, linfóide e mastócito (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495); região reguladora do gene da albumina que ativo no fígado (Pinkert et al. , Genes and Devei. 1: 268-276, 1987); região reguladora do gene da alfa-feto-proteína que ativa no fígado (Krumlauf et al. , 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253: 53-58); região reguladora do gene da alfa 1-antitripsina que ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes e Devei. 1: 161-171); região reguladora do gene da beta-globina que ativa em uma célula da medula (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al. , 1986, Cell 46: 89-94); região reguladora do gene da proteína bica da mielina que ativa em um oligodendrito no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); região reguladora do gene da cadeia leve da miosina-2 que é ativa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); e região reguladora do gene da hormônio de liberação de gonadotropina que ativa no hipotálamo (Mason et al. , 1986, Science 234: 1372-1378).

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117/164 [00242] A sequência potenciadora pode ser inserido em um vetor a fim de aumentar a transcrição de DNA que codifica uma cadeia leve ou de cadeia pesada que compreende uma proteína de ligação humana em um eucariota superior a-syn. A potenciadora é um fator de DNA que atua em cis tendo normalmente cerca de 10-300 pb de comprimento, o qual atua em um promotor e aumenta a transcrição. O intensificador é observado nas posições 5 'e 3' de uma unidade de transcrição e, relativamente, não é afetado pela posição e direção. Várias sequências estimuladoras são conhecidas em um gene de mamífero (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfafeto-proteína e insulina). No entanto, normalmente, um intensificador derivado de um vírus é usado. Os intensificadores exemplificativos para a ativação de um promotor conhecido na técnica incluem um potenciador de SV40, potenciador do promotor inicial de citomegalovírus, potenciador de polioma e potenciador de adenovirus. O potenciador para ativação de um promotor eucariótico pode ser disposto em 5 'ou 3' de uma sequência de codificação em um vetor, mas tipicamente, é posicionado em um local 5 'de um promotor. A sequência que codifica uma sequência sinal intrínseca ou heterogênea adequada (sequência do leitor ou peptídeo sinal) pode ser integrada em um vetor de expressão para facilitar a secreção extracelular de um anticorpo. A seleção da sequência de peptídeo de sinal ou leitor é

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118/164 determinada de acordo com o tipo de uma célula hospedeira em que é produzido um anticorpo, e a sequência de sinal intrínseco pode ser substituída com a sequência de sinal heterogêneo. Os exemplos de peptídeos de sinalização funcionais em uma célula de mamífero hospedeira incluem a sequência sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na patente dos EUA No. 4.965.195; a sequência sinal para o receptor da interleucina-2 descrito no documento Cosman et al, 1984, Nature 312:. 768; a sequência sinal para o receptor da interleucina-4 descrito na patente EP N. ° 0367 566; peptídeo de sinal do receptor de interleucina-1 tipo I descrito na patente U.S. No. 4.968.607; peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 do tipo II descrito na patente EP No. 0 460 846.

[00243] Aqui, o vetor de expressão pode ser fabricado utilizando um vetor comercialmente disponível. Este vetor de expressão pode compreender a totalidade ou parte de uma sequência básica de direcionamento ou não a compreender de todo. Quando uma ou mais das sequências básicas aqui descritas não estão presentes em um vetor antecipadamente, elas podem ser coletadas individualmente e ligadas a um vetor. O método de recolha de cada sequência compreendida nas sequências básicas é amplamente conhecido pelos técnicos no assunto.

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119/164 [00244] Após preparação de um vetor e inserção de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo uma cadeia ligante, cadeia pesada ou sequência de ligação ao antígeno α-syn em um sítio apropriado do vetor, este vetor recombinante pode ser introduzido em um vetor, célula hospedeira adequada, para amplificação e/ou expressão polipeptídica. O método de introdução de um vetor de expressão do anticorpo em uma célula hospedeira selecionada pode ser conseguida por transfecção, infecção, fosfato de cálcio co-precipitação, eletroporação, micro injeção, lipofecção, transfecção com DEAE-dextrano, ou outros métodos amplamente conhecidos. O método de introdução é determinado de acordo com os tipos de células hospedeiras a serem usadas principalmente. Este método é amplamente conhecido pelos peritos na técnica e, por exemplo, o documento acima mencionado, Sambrook et al., 2001, pode ser referido.

[00245] Subsequentemente, após cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas, um anticorpo é coletado de um meio de cultura (no caso de uma célula segregar um anticorpo para o meio), ou diretamente da célula hospedeira que a produz (no caso de um anticorpo não ser secretado). A seleção de uma célula hospedeira adequada pode ser afetada por vários fatores, por exemplo, tendo como alvo o nível de expressão, modificação do polipeptídeo que é preferível ou

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120/164 necessário para a atividade (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) e a facilidade de dobrar para a produção de uma molécula ativa de origem biológica etc.

[00246] As linhagens celulares de mamífero disponíveis para expressão são amplamente conhecidas na técnica e, por exemplo, uma célula imortalizada comprada de ATCC (American Type Culture Collection), por exemplo, célula de ovário de hamster Chinês (CHO), célula HeLa, rim de hamster bebê (BHK). ) células, células de rim de macaco (COS), células de carcinoma de células de fígado humano (por exemplo, Hep G2) e numerosas outras linhagens celulares estão incluídas, mas não limitadas a elas. Em uma modalidade, a linhagem de células pode ser determinada em conformidade com a expressão de um anticorpo possuindo uma propriedade de ligação a-syn com o nível de expressão elevado. Em outra modalidade, uma linhagem celular pode ser selecionada de um sistema de células B que tem uma capacidade para preparar e secretar um anticorpo heterogêneo, embora não possa preparar o seu próprio anticorpo.

Papel do α-syn na doença [00247] α-Syn é uma proteína que consiste em 140 aminoácidos que é principalmente expressa em sítios présinápticos do neurônio. Ela existe como um monômero que é naturalmente desdobrado no citoplasma em condições normais. A função precisa de α-Syn não foi elucidada e parece

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121/164 desempenhar um papel importante na manutenção do suprimento de vesícula sináptica em terminais pré-sinápticos maduros, com base em que ela é detectada somente após o desenvolvimento de sinapses (Murphy DD et al. J Neurosci 2000, 20: 3214-3220) . A α-syn pode modular a liberação de dopamina que regulam o exercício involuntário ou voluntário, ou pode afetar a memória e a função cognitiva (Kokhan VS et

al. Behav Brain	Res 2012, 231:	226230	) . Em	particular,	a
função de α-Syn	é importante à	medida	que	a atividade	da
sinapse aumenta	e envelhece, e	é um	fator	importante	na
neurodegeneração.
[00248] Em um	estado patoló	gico,	o a-	syn sofre	as

alterações estruturais ligando e interagindo com gotículas lipídicas, bicamadas fosfolipídicas ou membranas lipídicas para formar uma estrutura secundária de hélice α dobrada, resultando na formação de agregados incluindo dímeros, oligômeros e a forma fibrosa.

[00249] Em particular, a agregação α-syn está relacionada com a patogênese de um grupo de doenças neurodegenerativas chamado α-sinucleinopatia, incluindo doença de Parkinson (DP) , demência da doença de Parkinson (DCP), demência com corpos de Lewy (DLB), atrofia de múltiplos sistemas ) e muitas doenças neuro-axonais, e é secundário encontrado na doença de Alzheimer (Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73).

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122/164 [00250] Além disso, ambas as formas oligoméricas e monoméricas da alfa-sinucleina são encontradas em amostras de soro e líquido cefalorraquidiano de pacientes com doença de Parkinson, indicando que agregados de alfa-sinucleína com pequeno peso molecular permeiam a membrana celular para acessar o espaço extracelular. Também foi demonstrado que a alfa-sinucleína desdobrada pode ser liberada das células por exocitose e, em seguida, transferida de uma região do cérebro para outra região por transporte intercelular, como proteínas priônicas (Brundin P et al.: 301-307).

[00251] A a-sinucleinopatia é um grupo de doenças neurodegenerativas caracterizadas pela presença de entidades ou corpos contendo agregados α-Syn dentro de uma célula. Esses corpos são um pouco diferentes na aparência, dependendo da doença, e são chamados de corpos de Lewy na doença de Parkinson (DP) e demência com corpos de Lewy (DLB) , corpo citoplasmático dos gânglios em atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e esferoide de axônio em neurônios, doenças axonais. Anticorpos de acordo com a presente invenção reconhecem o agregado de α-Syn preferencial e especificamente, e assim reconhecendo estes corpos.

[00252] A Doença de Lewy Body (LBD) ou doença neuronal de alfa-sinucleína é caracterizada por degeneração do sistema dopaminérgico, disfunção motora, disfunção cognitiva e formação do corpo de Lewy (LB) (McKeith et al. Neurology

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1996, 47: 1113 -24) . Os corpos de Lewy são depósitos esféricos de proteínas encontrados nas células nervosas. 0 corpo de Lewy bloqueia a função normal do cérebro ao interferir com a ação de mensageiros químicos, incluindo a acetilcolina e a dopamina no cérebro. As doenças do corpo de Lewy incluem doença de Parkinson (incluindo doença de Parkinson idiopático (PD) ) , Doença de corpo de Lewy difusa (DLBD) também referida como demência com corpo de Lewy, doença combinada de doença de Alzheimer e doença de Parkinson e atrofia de sistema múltipla (MSA) . 0 DLBD tem os mesmos sintomas que a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson, mas a posição do corpo de Lewy é diferente da do mal de Parkinson. No DLBD, os leucócitos estão principalmente presentes no córtex e estão predominantemente na substância negra na doença de Parkinson.

[00253] Outras doenças do corpo de Lewy incluem Falha Autonômica Pura, desordem corporal de Lewy (disfagia), LBD incidental, LBD Herdado (por exemplo, mutantes do gene a-syn e genes PARK3 e PARK4) e Atrofia de Sistema Múltiplo (MSA, por exemplo, Atrofia Olivopontocerebelar, Striatonigral Degeneração e Síndrome de Shy-Drager).

[00254] O anticorpo anti-a-Syn da presente invenção que reconhece especificamente o agregado de α-Syn com uma elevada afinidade pode ser útil para o diagnóstico ou detecção de tais doenças. Além disso, o anticorpo α-Syn que reconhece

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124/164 especificamente o agregado de α-Syn de acordo com a presente invenção inibe a formação do agregado de α-Syn ou degrada o agregado e inibe a transferência intercelular do agregado, inibindo assim a α-sinucleinopatia, particularmente o corpo de Lewy doenças e doença de Parkinson.

Uso de anticorpo α-syn humano para fins diagnósticos e terapêuticos [00255] Os anticorpos aqui divulgados são úteis para a detecção de α-Syn, agregados α-Syn particulares, tais como o corpo de Lew, e a identificação de células ou tecidos contendo o agregado de α-Syn na amostra biológica. Por exemplo, um anticorpo anti-a-Syn pode ser usado para o diagnóstico, por exemplo, a detecção e/ou análise quantitativa de agregados α-Syn em uma amostra biológica, como sangue contendo soro, liquido cefalorraquidiano (LCR) ou urina, ou Agregados α-Syn expressos no interior de tecido ou células, e/ou o diagnóstico de α-sinucleinopatia com base nele.

[00256] Em particular, os anticorpos que se ligam especificamente aos agregados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de doenças relacionadas com a agregação α-syn em indivíduos com necessidade de tratamento, diagnóstico, e/ou a detecção de doenças relacionadas com o ácido agregado de α-Syn. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com

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125/164 a presente invenção pode ser eficazmente utilizada para o tratamento de doenças relacionadas com o ácido agregado de α-Syn, como descrito acima, inibindo a produção, promovendo a degradação, e inibição da transferência intercelular de agregado de a-Syn.

Método de diagnóstico [00257] O anticorpo aqui divulgado pode ser utilmente utilizado para detecção, diagnóstico ou monitorização de doenças ou sintomas relacionados com a-syn.

[00258] Em uma modalidade, o método da presente invenção é um método de diagnóstico de α-sinucleinopatia, em um indivíduo com necessidade do diagnóstico de asinucleinopatia, em que o método compreende a determinação da concentração ou localização intercelular do agregado de α-Syn no indivíduo utilizar o anticorpo e os fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção; e comparando a concentração ou a localização intercelular do agregado de α-Syn medido no indivíduo com o resultado da amostra de controle, e a similaridade ou diferença no resultado do controle indica que o indivíduo sofre de alfasinucleinopatia.

[00259] No método, o indivíduo inclui pacientes que não apresentam sintomas ou estão antes da ocorrência de sintomas. Em uma modalidade, o controle pode ser paciente com a asinucleinopatia incluindo PD, DLB ou MSA, em que a semelhança

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126/164 com o grupo de controle na etapa de comparação fornece o diagnóstico de que o indivíduo é paciente com a asinucleinopatia. Em outra modalidade, quando o controle é uma amostra derivada de uma pessoa normal, a diferença em relação ao grupo de controle na etapa de comparação, por exemplo, um aumento na concentração de agregado fornece o diagnóstico de que o indivíduo tem α-sinucleinopatia. Em outra modalidade, a idade do indivíduo e o controle podem ser correspondidos. 0 método pode ser realizado in vivo ou em uma amostra biológica separada do indivíduo, tal como sangue, líquido cerebrospinal (CSF), ou amostras de urina.

[00260] O método pode ser realizado com imagens in vivo. A imagem in vivo pode ser realizada utilizando, por exemplo, tomografia por emissão de positrões (PET), tomografia por emissão de fotões simples (SPECT), imagiologia ótica por infravermelhos próximos (NIR) ou imagiologia por ressonância magnética (MRI).

[00261] O método pode ser realizado in vitro. Os métodos podem ser realizados utilizando Western blot, imunoprecipitação, ELISA, radioimunoensaio (RIA), ou imunohistoquímica métodos que são bem conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo, Tijssen, 1993, teoria e prática de Imunoensaio Enzimático, Vol 15 (Eds RH Burdon e PH van Knippenberg, Elsevier, Amsterdã); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press,

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Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105: 3087-3096) . A detecção de α-syn pode ser realizada in vivo ou in vitro. Além disso, ELISA (ensaio imunoenzimático ligado a enzimas) e radioimunoensaio (RIA) estão incluídos.

[00262] Para a detecção ou diagnóstico utilize, tipicamente, o anticorpo pode ser marcado com uma substância de marcação detectável. As substâncias de rotulagem apropriadas incluem um radioisótopo ou nuclídeo radioativo (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, Tc, ⁴¹¹Ιη, ¹²⁵I, ¹³¹I), material fluorescente (por exemplo, FITC, rodamina, substância fluorescente de lantanóide), enzima ( por exemplo, peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), um grupo quimioluminescente, um grupo biotinilo ou epitopo polipeptídico reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequência de pares de fecho de leucina, local de ligação do anticorpo secundário, domínio de ligação de metal , epitopo tag), mas não limitado a isso. Em algumas modalidades, a substância marcadora pode ser acoplada a um anticorpo através de vários braços espaçadores de comprimento para reduzir o potencial impedimento estérico. Vários métodos para marcação de uma proteína são conhecidos na técnica e podem ser aqui aplicados.

[00263] Em outro aspecto, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado para identificação de um tecido incluindo

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128/164 agregado de α-syn. Em uma modalidade específica, o anticorpo é marcado por uma substância de marcação, e a ligação ao agregado de α-Syn do anticorpo marcado é detectado. Em uma modalidade, a ligação do anticorpo ao agregado de α-syn é detectada in vivo.

[00264] Em outro aspecto, a presente invenção divulga a detecção ou triagem de materiais de teste que competem com o anticorpo aqui divulgado pela ligação ao agregado de asyn. Por exemplo, na presença ou ausência de materiais de teste, está incluído um passo de detecção da quantidade de anticorpos livres em uma solução compreendendo agregado de α-syn. O aumento da concentração do anticorpo livre, isto é, o anticorpo que não está ligado ao agregado de α-syn pode instruir que a molécula de teste pode competir com o anticorpo pela ligação de α-syn. Em uma modalidade, o anticorpo é marcado com um grupo de marcação. Alternativamente, os materiais de teste são marcados e a quantidade de materiais de teste livres é monitorizada pela presença ou ausência do anticorpo.

[00265] Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui divulgado tem várias utilidades. Por exemplo, pode ser utilizado para análise de ligação específica, purificação de α-syn com base na afinidade ou método de rastreio para investigação de antagonistas de α-syn etc.

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Método de tratamento: formulação farmacêutica, via de administração [00266] 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento de doenças associadas com agregado de α-Syn, como descrito acima, através da inibição da produção, promovendo a degradação, e inibição do transporte intercelular de agregado de a-Syn.

[00267] Consequentemente, os métodos de tratamento utilizando o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção são também fornecidos. Em uma modalidade, o anticorpo é fornecido ao paciente. As doenças e os pacientes que podem ser tratados eficazmente pelo anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção são descritos acima.

[00268] Em uma modalidade, um anticorpo de acordo com a presente divulgação pode ser utilizado sob uma forma ligada a um carreador de entrega para a passagem através da barreira sangue cérebro. Muitos métodos para distribuir medicação através da barreira sanguínea do cérebro são divulgados. Por exemplo, existe um método de decompor a pressão osmótica do BHE usando um método como Brad quinina ou HIGU (ultrassom de focos de densidade Hign). Envolvem também o uso de sistema de entrega celular, por exemplo, transporte de glicose e aminoácidos e transcitose mediada por receptores de insulina

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130/164 ou transferrina, ou o bloqueio do carreador de efluxo de glicoproteinas. Os exemplos do receptor no sistema de transcitose mediada por receptores são descritos abaixo: receptor de insulina (por exemplo, receptor de insulina humana), receptor de transferrina, LRP (por exemplo, LRP1, LRP6 e LRP8), receptor de melanocortina, receptor nicotínico de acetilcolina, VACM-1 receptor, IGFR, EPCR, EGER, TNFR, receptor de leptina, M6PR, receptor de lipoproteína, NCAM, LIFR, LfR, MRP1, AchR, DTr, carreador de glutationa, SR-B1, MYOF, TFRC, ECE1, LDLR, PVR, CDC50A, SOAREI , MRC1, HLA-DRA, RAMP2, VLDLR, STAB1, TLR9, CXCL16, NTRK1, CD74, DPP4, receptores do fator de crescimento endotelial 1, 2 e 3, receptor de glicocorticóide, receptor de glutamato ionotrópico, receptor M3, receptor de hidrocarboneto de arila, GLUT-1, receptor de inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3), receptor de N-metil-D-aspartato, S1P1, receptor de P2Y, TMEM30A e RAGE.

[00269] Ainda em outra modalidade, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado na forma ligada a outros agentes terapêuticos para o tratamento de doenças associadas ao agregado de a-Syn.

[00270] É também fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo e um diluente, carreador, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou suplemento farmaceuticamente aceitável.

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Além disso, por exemplo, é incluído um método para o tratamento de um doente com cancro por administração de tal composição farmacêutica. 0 termo paciente inclui um paciente humano relacionado com a-syn.

[00271] Um material de formulação aceitável não é tóxico para um recipiente, em capacidade e concentração utilizadas. Em uma modalidade específica, uma composição farmacêutica que compreende uma dose terapeuticamente eficaz de anticorpo α-syn humana é fornecida.

[00272] Em uma modalidade específica, o material de formulação aceitável é preferencialmente não tóxico na capacidade e concentração utilizadas. Em uma modalidade, por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender uma material formulação específica para o pH, osmolaridade, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou de liberação, a modificação, manutenção ou conservação de absorção ou penetração, da composição. Nesta modalidade, o material de formulação apropriado inclui aminoácido (por exemplo: glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); agente antimicrobiano; antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico, sulfito de sódio ou bissulfito de sódio); tampão (por exemplo: borato, bicarbonate, Tris-HCl, citrato, fosfato ou outros ácidos orgânicos); agente de volume (por exemplo: manitol ou glicina); agente quelante (por exemplo:

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132/164 ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)); agente complexante (por exemplo, cafeína, polivinilpirrolidona, betaciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimento; monossacarídeo; dissacárido; e outros carboidratos (por exemplo: glucose, manose ou dextrina); proteína (por exemplo: albumina do soro, gelatina ou imunoglobulina); agente corante, agente aromatizante e diluente; emulsificante; polímero hidrofílico (por exemplo: polivinilpirrolidona); polipeptídeo de baixo peso molecular; contraio formador de sal (por exemplo, sódio); conservante (por exemplo, cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool feniletílico, metilparabeno, propilparabeno, clorohexidina, ácido sórbico ou peróxido); solvente (por exemplo: glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol) ; álcool de açúcar (por exemplo: manitol ou sorbitol); suspensão; sobrenadante ou agente umidificante (por exemplo: Pluronics, PEG, éster de sorbitano, polissorbato, por exemplo, polissorbato 20, polissorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapol); intensifleader de estabilidade (por exemplo: sacarose ou sorbitol); intensificador de robustez (por exemplo, haleto de metal alcalino, preferencialmente cloreto de sódio ou cloreto de potássio, manitol, sorbitol); carreador de entrega; diluente; excipiente e/ou suplemento farmacêutico, mas não limitada aos mesmos. Por exemplo, REMINGTON'S

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PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company pode ser referido.

[00273] Em uma modalidade especifica, a composição farmacêutica ótima pode ser determinada por aqueles peritos na especialidade de acordo com por exemplo, uma segmentação via de administração, o método de entrega e uma capacidade de direcionamento (ver, o acima REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES). Em uma modalidade especifica, esta composição pode afetar o estado, estabilidade, taxa de liberação física in vivo e taxa de depuração in vivo do anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, o principal carreador ou carreador na composição farmacêutica pode ser aquosa ou não-aquosa. Por exemplo, um carreador ou carreador apropriado pode ser possivelmente água para injeção, solução salina fisiológica suplementada por outros materiais comuns em uma composição para administração parentérica. Além disso, solução salina neutra tamponada ou solução salina misturada com albumina sérica pode ser usada como carreador. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode compreender cerca de pH 7,0-8,5 tampão Tris, ou cerca de pH 4,0-5,5 tampão acetato, e pode ainda compreender sorbitol ou substitutos apropriados. Em uma modalidade específica, a composição de anticorpo α-syn humano pode ser preparado por mistura de uma composição selecionada possuindo um nível de direcionamento de pureza em como forma de bolo liofilizado

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134/164 ou uma solução aquosa com qualquer agente de formulação (ver, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES) para armazenamento. Além disso, em uma modalidade específica, o anticorpo de asyn humana pode ser formulado como uma liofilização utilizando um excipiente adequado, por exemplo, sacarose.

[00274] A composição farmacêutica pode ser administrada parentericamente. Alternativamente, a composição pode ser inalada ou administrada através de um aparelho digestivo, por exemplo, oralmente. A preparação desta composição farmaceuticamente aceitável está dentro do nível técnico na técnica.

[00275] Os componentes requeridos para formulações estão presentes preferivelmente na concentração aceitável para locais de administração. Em uma modalidade específica, o tampão é utilizado para manter a composição a um pH fisiológico ou ligeiramente pH baixo ou, tipicamente, na gama de cerca de 5 a cerca de pH 8.

[00276] Em caso de administração parentérica, a composição terapêutica compreende uma proteína α-Syn humano segmentação de ligação em um carreador farmaceuticamente aceitável, e pode ser fornecida em uma forma de uma solução aquosa aceitável por via parentérica, que não compreende um pirogénio. O carreador que é particularmente apropriado para injeção parentérica é água destilada estéril, e aqui, o anticorpo de α-syn humana é formulado com uma solução

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135/164 isotônica estéril adequadamente conservada. Em uma modalidade especifica, esta formulação pode acompanhar a formulação utilizando um agente que fornece a liberação controlada ou de liberação sustentada de uma composição, que podem ser entregues por meio de injeção de depósito, por exemplo, uma microesfera injetável, biodegradável de partículas, o composto polimérico (por exemplo: ácido polilático ou ácido poliglicólico), talão ou lipossoma. Em uma modalidade específica, pode também ser usado um ácido hialurônico com um efeito de aumento do tempo de duração no sangue. Em uma modalidade específica, para fornecer um anticorpo de direcionamento, dispositivo de fornecimento de drogas implantáveis podem também ser usadas.

[00277] Além disso, a composição farmacêutica é formulada para inalação. Em algumas modalidades, o anticorpo de a-syn humana é formulado como um pó inalável a seco. Em uma modalidade específica, o anticorpo α-syn humano solução inalação pode ser também formulados como um propulsor de entrega de aerossol. Em uma modalidade específica, a solução pode ser pulverizada. Esta administração pulmonar e métodos de formulação são ainda descritos no pedido PCT No PCT/US94/001875. Algumas formulações podem ser administradas por via oral. O anticorpo de α-syn humana administrado deste modo pode ser formulado com uma forma de dose sólida, por exemplo, um carreador vulgarmente utilizado para purificação

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136/164 e preparação de cápsulas ou sem esse carreador. Em uma modalidade específica, a cápsula pode ser concebida de modo a liberar a parte ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Para facilitar a absorção do anticorpo da α-syn humana, um agente adicional pode ser compreendido. Um diluente, agente aromatizante, cera de baixo ponto de fusão, óleo vegetal, lubrificante, suspensão, agente de desintegração de comprimidos e agente de ligação podem também ser utilizados.

[00278] Algumas composições farmacêuticas compreendem a dose eficaz de anticorpo de α-syn humana misturada com um excipiente não tóxico próprio para a preparação de um comprimido. Ao dissolver o comprimido em água estéril ou outros carreadores apropriados, a solução pode ser preparada como uma forma de dose unitária. Os excipientes apropriados incluem um diluente inativo, por exemplo, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, bicarbonate de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agente de ligação, por exemplo, amido, gelatina ou acácia; ou lubrificante, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco, mas não limitado a estes.

[00279] A composição farmacêutica incluindo uma formulação adicional compreendendo outro anticorpo α-syn humano, compreendendo uma formulação prolongada ou controlada de

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137/164 entrega é óbvio para os peritos na técnica. Vários outros meios de liberação controlada ou controlada, por exemplo, uma técnica para a formulação de um carreador de lipossomas, material em particulados bioerosivos ou contas porosas e material de injeção de depósito são também conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, pode ser referido o PCT/US93/00829, no qual a liberação controlada de partículas poliméricas porosas é descrita. 0 agente de liberação sustentada pode compreender um produto moldado, por exemplo, uma forma de película, ou de microcápsulas de matriz de polímero semi-permeável. A matriz de liberação sustentada pode compreender um poliéster, hidrogel, polilactido (descrito na patente US N ° 3773919 e EP 058481), copolímero de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al, 1983, Biopolymers 2.: 547-556), poli(2- hidroxietilmetacrilato (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), etileno acetato de vinila (Langer et al., 1981, acima) ou ácido poliD (-) - 3-hidroxibutí rico (EP 133 988) A composição de liberação controlada pode também compreender um lipossoma a ser preparado por um dos vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688-3692, EP 036,676, EP 088,046 e EP 143,949 podem ser referidos.

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138/164 [00280] A composição farmacêutica a ser utilizada para administração in vivo pode ser fornecida tipicamente como um agente estéril. A esterilidade pode ser conseguida por filtração através de uma membrana filtrante estéril. Quando a composição é liofilizada, um processo de dissolução em uma solução, bem como liofilização deve ser estéril. A composição para administração parentérica pode ser armazenada em uma forma ou solução liofilizada. Por exemplo, a composição parenteral é comumente compreendida em um recipiente com uma porta de acesso estéril, como um frasco com uma tampa na qual uma agulha hipodérmica pode entrar ou uma bolsa de solução para administração intravenosa.

[00281] Em uma modalidade especifica, uma célula que expressa o anticorpo recombinante aqui descritos podem ser encapsulados para entrega (Invest Ophthalmol Vis Sci 43: 3292-3298, 2002; e Proc Natl Acad Sciences 103:. 3.896-3.901, 2006) .

[00282] Em uma formulação especifica, o anticorpo tem a concentração de, por exemplo, pelo menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml ou 150 mg/ml. Algumas formulações compreendem tampão, sacarose e polissorbato. Um exemplo de formulações é constituído por 50-100 mg/ml de anticorpo, 520 mM de acetato de sódio, 5-10% p/v de sacarose e 0, 0020,008% p/v de polissorbato. Um comprimido específico

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139/164 compreende, por exemplo, 65-75 mg/ml anticorpo em tampão de acetato de sódio 9-11 mM, de 8-10% p/v de sacarose, e 0,0050,006% p/v de polissorbato. O pH desta formulação especifica está dentro da faixa de 4,5-6. Outra formulação tem um pH de 5,0-5,5 (por exemplo, pH de 5,0, 5,2 ou 5,4).

[00283] Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser armazenada em um frasco estéril como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou pó desidratado ou liofilizado. Esta formulação pode ser armazenada em uma forma imediatamente utilizável ou em uma forma reestruturada imediatamente antes da administração (por exemplo, liofilizada) . Também é fornecido um kit para produzir uma unidade de administração de dose única. Este kit compreende um recipiente primário com uma proteína seca e um recipiente secundário com uma formulação aquosa. Em uma modalidade específica, é fornecido um kit compreendendo uma seringa pré-cheia com uma única câmara e câmara múltipla. A dose terapeuticamente eficaz da composição que compreende o anticorpo α-syn humano farmacêutica a ser utilizada pode ser afetada por, por exemplo, uma situação terapêutica e efeitos. Os peritos na especialidade podem compreender que a dose apropriada para o tratamento pode ser diferente, pelo menos parcialmente, de acordo com uma doença na qual o anticorpo de α-syn humana é utilizado, via de administração e condição corporal de um paciente (peso, superfície corporal ou órgão).

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140/164 tamanho) e/ou condição (idade e saúde geral). Em uma modalidade especifica, um clico pode determinar a dose ótima e mudar a via de administração para recolher o efeito terapêutico ótimo.

[00284] A dose típica pode estar em uma faixa entre cerca de 1 pg/kg e cerca de 30 mg/kg ou mais, considerando os fatores acima mencionados. Em uma modalidade específica, a dose pode estar na faixa de 10 pg/kg a cerca de 30 mg/kg, seletivamente, 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg ou, alternativamente, 0,3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em alguns casos, a dose é de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. Em alguns casos, o anticorpo é administrado a 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg.

[00285] A frequência de administração pode ser afetada pelos parâmetros farmacocinéticos da formulação utilizada do anticorpo de α-syn humana. Normalmente, um clínico administra uma composição até que a dose que atinge um efeito de direcionamento seja atingida. Assim, a composição pode ser administrada ao longo do tempo, como uma dose única, ou 2 vezes ou mais de doses, ou ser administrada como injeção contínua através de um dispositivo ou cateter implantável. A dose apropriada pode ser confirmada através do uso de dados apropriados de reação à dose. Em uma modalidade específica, o anticorpo pode ser administrado a um paciente durante um longo período de tempo. A administração crônica de um

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141/164 anticorpo pode minimizar uma imunorreação prejudicial ou reação alérgica, que geralmente acompanhada pelo anticorpo não um ser humano completo, por exemplo, o anticorpo produzido para um antígeno humano em um animal não humano, por exemplo, um anticorpo humano completo ou anticorpo não humano produzido em um animal não humano.

[00286] A via de administração da composição farmacêutica pode utilizar métodos conhecidos, por exemplo, através de injeção por via oral; via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intersticial), intraventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; sistema de liberação sustentada ou dispositivo de implante. Em uma modalidade específica, a composição pode ser continuamente administrada por injeção de bolus, injeção ou implante ou dispositivo.

[00287] Além disso, a composição pode ser administrada localmente implantando uma membrana, esponja ou outros materiais apropriados nos quais uma molécula alvo é absorvida ou encapsulada. Em uma modalidade específica, no caso de se utilizar o dispositivo de implante, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão apropriado, e o fornecimento de uma molécula de direcionamento pode ser conseguido por meio de difusão, bolus cronometrada ou administração contínua.

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142/164 [00288] Além disso, pode ser preferível utilizar a composição farmacêutica do anticorpo de α-syn humana in vitro. Neste caso, uma célula, tecido ou órgão removido de um paciente pode ser exposto para a composição farmacêutica de anticorpo de α-syn humana, e então a célula, tecido e/ou órgão é subsequentemente implantado no paciente.

[00289] Em particular, o anticorpo de α-syn humana pode ser distribuído implantando uma célula específica que é geneticamente modificada utilizando métodos aqui descritos, para expressar e secretar um polipeptídeo. Em uma modalidade específica, esta célula pode ser uma célula animal ou humana e pode ser derivada autóloga, não autóloga ou heterogeneamente. Em uma modalidade específica, a célula pode ser imortalizada. Em outra modalidade, para reduzir uma imunorreação, a célula pode ser encapsulada para evitar a penetração em um tecido circundante. Em uma modalidade adicional, o material encapsulado tipicamente permite a liberação de produtos de proteína, mas é um invólucro polimérico ou membrana prevenir ruptura celular por outros fatores nocivos a partir de um sistema imune ou tecido circundante semipermeáveis biocompatíveis de um paciente.

[00290] A seguir, exemplos desejáveis são apresentados para facilitar a compreensão da presente invenção. Contudo, os seguintes exemplos são fornecidos para uma melhor

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143/164 compreensão da presente invenção, e o âmbito da presente invenção não é limitado pelos seguintes exemplos.

[00291] Os termos e técnicas aqui utilizados relacionados com a cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, guímica de proteínas e ácidos nucleicos e hibridação são amplamente utilizados e conhecidos na técnica. Caso contrário, os métodos e as técnicas aqui divulgados podem ser praticados utilizando técnicas convencionais, que estão dentro da perícia dos peritos na técnica de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, a tecnologia de transformação genética, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante, imunologia e similares. Uma descrição mais detalhada de técnicas comuns pode ser encontrada nos seguintes livros e literatura. Para métodos gerais de biologia molecular e bioquímica, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a Ed. (Sambrook et al. , Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4^a Ed. (Ausubel et al. eds. , John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I e II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames e Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames e Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller e Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in

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Molecular Biology, 3^a Edition (Ausubel et al., eds.); e Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press); Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) podem ser referidos.

[00292] As técnicas de reação e purificação de proteína são realizadas rotineiramente na técnica ou de acordo com o método do fabricante como aqui descrito. Na presente invenção, os termos utilizados relacionados com química analítica, química orgânica sintética e técnicas e métodos laboratoriais de química medicinal e farmacêutica são bem conhecidos e vulgarmente utilizados na técnica. Técnicas padrão pode ser usadas para síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação e administração farmacêutica, tratamento de pacientes e similares.

Exemplo 1: Preparação de anticorpo a-syn

Exemplo 1-1: Anticorpo monoclonal de camundongo

Imunização [00293] Um monômero de α-syn com um comprimento completo (140 resíduos) ou clivado com 21 resíduos C-terminais (119 resíduos) foram colocados em um Thermomixer, a 37 °C, agregada com agitação a 1050 rpm, durante 14 dias, e submetida a ultrassons. Cada um dos 140 resíduos e 119 resíduos da fibrila de α-syn a 1 mg/ml foi misturado com o adjuvante em uma razão de 1: 1 (vol: vol).

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145/164 [00294] Em seguida, 200 pL da mistura preparada foram injetados subcutaneamente em camundongos fêmeas BALB/c com 5 a 7 semanas de idade. Após 2 semanas, 200 pL da mistura preparada foi adicionalmente injetada subcutaneamente para reforço de anticorpos. Após uma semana de reforço, o sangue foi recolhido e a titulação da imunização foi realizada pelo método ELISA, utilizando o antígeno administrado. Posteriormente, o terceiro reforço foi realizado por injeção subcutânea de antígeno sozinho.

Produção de hibridoma [00295] O baço do camundongo imunizado foi removido e as células do baço foram obtidas a partir do baço. As células do baço foram suspensas em meio Hybridoma-SEM (Thermo Fisher Scientific, EUA) suplementado com 10% de FBS. Para preparar o hibridoma, as células do baço e células SP2/0-Agl4 de uma célula de mieloma de murino foram misturadas em um meio de hibridoma-SFM sem soro, e seguido por centrifugação para remover o meio. Depois, adicionou-se PEG ao sedimento celular obtido e incubou-se a 37 °C durante 1 minuto para induzir a fusão celular.

Clonagem de célula única [00296] Após 2 semanas em fusão, a fusão com células B de camundongo produzindo anticorpos foi confirmada com um método de ELISA usando o antígeno administrado ao camundongo e um meio de cultura celular. Em seguida, a clonagem de

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146/164 célula única foi realizada usando um hibridoma para selecionar 16 hibridomas produtores de anticorpos monoclonais. Os clones de 1E4 e 9B11 (IgGl kappa, IgG3 kappa e IgG3 kappa, respectivamente) foram obtidos utilizando o agregado de comprimento total (140 resíduos) de α-Syn como um antígeno e os Clones de 3A9, 10F10 e 11F11 (IgG2b kappa, IgG2a kappa, IgG2b kapa, respectivamente) foram obtidos utilizando agregados de α-Syn com 21 resíduos C-terminais clivados como antígenos.

Purificação de anticorpos [00297] Cada hibridoma foi cultivado em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS. Para produção de anticorpos, o meio de cultura foi substituído por meio SEM isento de soro e cultivado durante cerca de 4 dias. O sobrenadante da cultura de células foi separado, centrifugado, filtrado com um filtro de 0,22 pm e purificado com uma coluna de proteína G para o tipo IgGl e a coluna de proteína A para os restantes anticorpos.

Determinação da sequência da região variável [00298] A região variável e as sequências de CDR foram determinadas por referência à divulgação Ahn et al., Mol. Cells 2004, 18 (2) : 237-241. Os hibridomas foram cultivados e centrifugados para isolar apenas as células. O RNA foi isolado a partir do hibridoma isolado pela adição de um triazol e foi utilizado para sintetizar o cDNA como molde.

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A região variável e a sequência CDR foram confirmadas por sequenciação.

[00299] As sequências de aminoácidos são mostradas na Tabela 1, e as sequências de nucleotideos são mostradas na Tabela 2.

Exemplo 1-2: Rastreio da biblioteca de fagos

Preparação do fago da biblioteca [00300] 1 X 10¹⁰ das células competentes do fragmento variável de cadeia única (ScFv) com diversidade derivada de humanos (obtidos de EHWA WOMANS UNIVERSITY) foram inoculadas em meio 2X YT [17 g de Tripton (CONDA, 1612.00), 10 g de extrato de levedura (CONDA , 1702.00) e 5 g de NaCl (Sigma, S7653)] contendo 34 pg/ml de cloranfenicol (Sigma, C0857), 2% de glicose (Sigma, G5400) e 5 mM MgCU (Sigma, C0857) a 30 °C durante 3 horas para ser OD600 de 0,5 a 0,7. Em seguida, as células foram infectadas com um fago auxiliar e cultivadas em meio 2X YT contendo 34 pg/ml de cloranfenicol, 5 mM MgCU, 70 pg/ml de canamicina (Sigma, K1876) e 1 mM de IPTG (ELPISBIO, IPTG025) a 30 °C durante 6 horas para induzir o empacotamento do fago. A solução de cultura foi centrifugada a 4500 rpm a 4 °C durante 15 minutos. O sobrenadante foi adicionado com PEG 6000 a 4% (Fluka, 81253) e NaCl a 3% (Sigma, S7653) e incubado durante 1 hora em gelo. O produto foi centrifugado a 8000 rpm durante 20 minutos a 4 °C e, em seguida, o sedimento foi suspenso em PBS e novamente

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148/164 centrifugado a 4 °C e 12.000 rpm durante 10 minutos para obter um sobrenadante contendo a biblioteca de fagos. O sobrenadante obtido foi armazenado a 4 °C até uso posterior.

Seleção de phage display [00301] De modo a selecionar anticorpos que se ligam preferencialmente aos agregados de alfa-sinucleína aos monômeros, foi realizada a seleção utilizando os agregados de alfa-sinucleína de comprimento completo preparados no Exemplo 1 e foi realizado o total de três seleções como se segue.

[00302] Adicionou-se albumina de soro bovino (BSA) às células em uma concentração de 3% em um tubo de ensaio a 4

°C durante	a	noite,	adicionando	10	pg/ml	de	agregados
recombinantes	de a-syn	e monômeros	ao	BBS em	um	imunotubo
(maxisorp	444202) foi	adicionada	ao	tubo de	ensaio e a
superfície	da	qual os	agregados e	monômeros	de	α-syn não

foram adsorvidos foi protegida. Após o esvaziamento do tubo de ensaio, a biblioteca de fagos de anticorpo de 1012 CFU dispersa em solução de BSA a 3% foi colocada no imunotubo no qual os agregados e monômeros de α-syn foram absorvidos e reagiram durante 1 hora (seleção negativa). Em seguida, os fagos não se ligaram a agregados de α-syn e os monômeros foram recuperados e reagiram durante 2 horas à temperatura ambiente nos agregados de α-syn e os monômeros foram adsorvidos. Solução salina tamponada com fosfato (0,05%

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Tween 20) foi usada para recuperar 100 mM de solução de trietilamina, que foi recuperada usando uma solução de PBST. de E. coli a 37 °C durante 1 hora, e a E. coli infectada foi pintada em um meio de ágar 2X YT e cultivada a 37 °C durante a noite (pH 7,4), foram infectadas por ER2537. No dia seguinte, a E. coli cultivada foi suspensa em 4 ml de solução de cultura de carbenicilina 2X YT e adicionou-se glicerol a 15%, e uma parte foi armazenada a -80 °C e o resto foi usado para preparar fagos para as próximas experiências. Repetindo este processo a 3 voltas no total, amplificou-se e concentrou-se um conjunto de fago especifico para o antígeno α-syn. À medida que a carreira de apresentação progrediu, o número de lavagens usando PBS-T foi aumentado para amplificar e concentrar o fago específico para o antígeno.

Triagem de clone único [00303] Para classificar os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao agregado de sinucleína do conjunto de fagos obtido através da filtração, realizou-se a experiência como se segue.

[00304] Para isolar os monoclones da piscina concentrada, depois de pintar o pool de fagos em um meio de ágar LBtetraciclina/carbenicilina e cultura, foi assegurada uma única colônia. Então, após a inoculação de monoclones em uma placa de 96 cavidades profundos em que 400 μΐ de 2X

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Tetraciclina/carbenicilina foram colocados por cavidade e crescendo durante a noite, 10 μΐ de solução de cultura foram colocados em uma nova placa de 96 cavidades profundas em que 390 μΐ foi colocado 2X de meio de tetraciclina/carbenicilina e foi cultivado a 37 °C durante 4 horas. 1 mM de IPTG foi colocado na solução de cultura e foi cultivado a 30 °C durante a noite. A solução de cultura cultivada durante a noite foi centrifugada para tomar um sobrenadante.

[00305] Em seguida, os clones que expressam um scFv solúvel em monoclone que se liga ao agregado de sinucleina foram selecionados usando o método ELISA como se segue (Steinberger. Rader e Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. Isted. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EUA, pp.11.9-11.12). especificamente, o anticorpo 7 B7 selecionado no Exemplo 1-1 foi colocado em uma placa de 96 cavidades (Nunc-Immuno Plates, NUNC, EUA) e foi revestido a 4 °C durante a noite. BSA a 3% foi adicionada a cada cavidade em uma quantidade de 200 μΐ, seguida de bloqueio a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, os agregados de sinucleina e o monômero foram carregados em uma concentração de 100 ng/cavidade, reagiram a 37 °C por 2 horas e foram lavados cinco vezes com 300 pL de PBS-T. O sobrenadante de clone único preparado foi misturado com 3% BSA em uma relação de volume de 1: 1 (vol: vol), e 100 pL da solução foi carregada

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151/164 na placa ligada ao agregado e monômero, seguido por reação a 37 °C por 2 horas. As células foram lavadas cinco vezes com 300 μΐ de PBS-T, e incubadas a 37 °C durante 1 hora com um anticorpo anti-HA conjugado com HRP, seguido de lavagem com PBS-T cinco vezes. Após a adição de 100 pL de TMB (Tetrametilbenzidina, Sigma, T0440), a reação foi interrompida pela adição de 50 pL de H2SO4 1 N para medir a absorbância a 450 nm. Os clones com uma absorbância de 0,5 ou superior foram considerados como reação positiva por ligação e clones ligados a BSA não especificamente foram excluídos.

[00306] Consequentemente, os clones de anticorpo AC8, AE8, AA9, DG5, AD2, AD7, DG11, DG8 e DA9 que se ligam especificamente aos agregados de sinucleína foram selecionados e executados por sequenciação das sequências proteicas e nucleotídicas. As sequências de ácido nucleico dos clones são divulgadas na SEQ ID NOs: 169-224.

Exemplo 2 Análise de Especificidade de Ligação ao Antígeno e Afinidade de Ligação utilizando um Anticorpo aSyn

Exemplo 2-1: Análise de Dot blot utilizando anticorpo monoclonal anti α-Syn de camundongo [00307] Experiências de Dot blot foram realizadas para analisar se o anticorpo de acordo com a presente invenção se liga a monômeros ou agregados no estado nativo. Para o

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152/164 experimento, 50 ng ou 100 ng de monômero α-syn ou proteína de fibrina (fabricada pelo professor Lee Seung-jae da Universidade Nacional de Seul; Bae et al., J. Neurosci 32: 13454, 2012) foram pontualmente carregados na membrana de nitrocelulose. Duas vezes o monômero diluído ou as proteínas da fibrila foram carregados sequencialmente do lado direito da membrana para a esquerda (12,5, 25, 50, 100 ng) . A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% da composição de TBST durante 1 hora à temperatura ambiente. 1 mg/ml do anticorpo de α-syn preparado no Exemplo 1 foi adicionado a TBST contendo albumina de soro bovino a 1% e foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a lavagem com TBST, os sinais foram analisados utilizando um substrato quimioluminscente (NEN) como substrato e anticorpo secundário conjugado com HRB (peroxidase de rábano) de acordo com o manual do fabricante. Os resultados foram visualizados usando um sistema de análise de imagem luminescente LAS-3000 (FUJIFILM Life Science). Os resultados são mostrados na Figura 1. Como aqui mostrado, verificou-se que o anticorpo de α-syn de acordo com a presente invenção se ligava preferencialmente apenas a agregados em comparação com monômeros de α-syn. Particularmente, 1E4, 9B11, 3A9 e 11F11 ligam-se apenas ao agregado e 10F10 ligam-se a ambos os agregados e monômeros. O anticorpo 274 (Bae et al., J Neurosci. 2012 26 de Setembro; 32 (39) : 13454-13469) foi

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153/164 utilizado como um anticorpo comparativo que se liga tanto a monômeros como a agregados.

Exemplo 2-2: Análise por ELISA utilizando anticorpo monoclonal anti a-Syn de camundongo [00308] A análise por ELISA foi realizada para analisar quantitativamente a afinidade de ligação do anticorpo da presente invenção ao antígeno. Para isto, o anticorpo alfasinucleína da presente invenção foi revestido em uma placa de 96 cavidades a uma concentração de 1 mg/ml e tratado com agregados de fibrina de alfa sinucleína a 10, 100, 1000 e 10.000 ng/ml. Após lavagem com PBS, tratou-se estreptavidina conjugada com HRP e anticorpo secundário conjugado com biotina e depois fez-se reagir com TMB como substrato. A absorbância foi medida. Os resultados são mostrados na Figura 2. Como aqui mostrado, verificou-se que os anticorpos da presente invenção se ligam preferencialmente a agregados com elevada afinidade de ligação. Os resultados ELISA mostraram que os anticorpos que se ligam aos agregados preferencialmente tiveram a afinidade de 0,1 ~ 2 x 10~⁹ M, enquanto os anticorpos que se ligam a ambos os monômeros e agregados apresentaram valores maiores de ~1 x 10~¹⁰ M.

Exemplos 2-3. Análise BIAcore usando anticorpo monoclonal anti-α-Syn de camundongo [00309] A análise quantitativa da ligação do anticorpo alfa-sinucleína preparado no Exemplo 1 ao antígeno

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154/164 monomérico e agregado foi realizada utilizando análise

BIAcore.

[00310] O instrumento utilizado foi ο T200 (GE Healthcare, S/N: 1565888) . A proteína A é usada como um chip (GE Healthcare, Cat. 29-1275-56). Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 (GE Healthcare, Cat. BR-1003-54) foi o tampão de regeneração. O tampão de corrida, a diluição do analito e o tampão de diluição da amostra foram HBS-EP. Os anticorpos α-syn (3A9, 9B11 e 11F11) preparados no Exemplo 1 foram diluídos com 1 x HBS-EP (GE Healthcare, Cat. BR-1006-69) e monômero de alfasinucleina (1 mg/ml) e proteína fibrila (3 mg/ml) foram diluídos em série em duplicado e analisados em 6 concentrações (0, 0,39, 1,56, 6,25, 25, 100 nm), incluindo 0 nM no total. Para a captura, o monômero foi para RU de 800 (teórico) , e uma fibrila foi para RU de 100 (teórica) . A fase de captura foi realizada no tempo de contato de 60 segundos, uma taxa de fluxo de 30 μΐ/min e um período de estabilização de 180 segundos. A fase de associação foi realizada no tempo de associação de 120 segundos e a taxa de fluxo foi de 30 μΐ/min. A fase de dissociação foi realizada no tempo de dissociação de 360 segundos e o fluxo de 30 μΐ/min. A fase de regeneração foi realizada duas vezes no tempo de regeneração de 240 segundos (primário) e 60 segundos (secundário) e uma taxa de fluxo de 30 μΐ/min. A adaptação foi realizada processando o modelo de ligação 1: 1, e o

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155/164 software de avaliação foi o software de avaliação BIACore T200 (GE healthcare) . Os resultados são mostrados nas Figuras 3a e 3b. Entre quatro anticorpos de alfa-sinucleína analisados, 3A9, 9B11 e 11F11, que se ligam preferencialmente a agregados nos outros métodos descritos acima, ligam-se apenas a agregados em BIAcore com cerca de 1 a 3 x ICr⁹ M de elevada afinidade.

Exemplos 2-4. Análise de Octetos utilizando anticorpo monoclonal anti-α-Syn de camundongo [00311] A análise quantitativa da ligação dos anticorpos alfa- sinucleína (3A9, 9B11, 11F11), preparado no Exemplo 1 para o monômero e o antígeno agregado foi realizada utilizando octeto.

[00312] Especificamente, o tampão de corrida foi tampão 1 x KB (cat. 18-1092) ou tampão 1 * PBS a 1000 rpm, e o tampão de imobilização foi acetato de sódio, pH 5 (10 mM, Cat 181068. os monômeros α-syn foram imobilizados O antígeno asyn, e fibrilas foram imobilizados o anticorpo teste. As concentrações-alvo foram 20 pg/ml para o monômero e 0,4 pg/ml para a fibrila. A concentração cinética foi diluída sequencialmente duas vezes de 50 nM para monômeros e de 100 nM para fibrilas, para dar 7 pontos no total, respectivamente. O tempo de associação/dissociação foi de 5 min/20 min para monômero e 5 min/25 min para fibrila. O

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156/164 biossensor foi ARG2 e o ajuste foi realizado usando modelo de ajuste 1: 1.

[00313] Os resultados são mostrados na Figura 4. Como mostrado aqui, 3A9, 9B11 e 11F11 mostrou pouca ligação aos monômeros (caixa vermelha pontilhada) e uma boa ligação aos agregados (gráfico upcline em caixas pontilhadas do vermelho). Estes resultados são semelhantes ou consistentes com os resultados em Dot blot, Octeto e ELISA. Como resultado, entre os quatro anticorpos α-syn testados, os anticorpos que preferencialmente se ligam aos agregados nos outros métodos, 3A9, 9B11 e 11F11 também se ligam apenas aos agregados na análise do Octeto.

Exemplos 2-5. Dot blot usando o ScFV do anticorpo anti-a-Syn [00314] O dot blotting foi realizado como descrito no Exemplo 2-1 utilizando anticorpos anti-a-Syn de ScFV selecionados no Exemplo 1-2. Os antígenos foram carregados na ordem de 6,25 ng, 12,5 ng, 25 ng e 50 ng da primeira linha à esquerda. Os anticorpos foram tratados com uma concentração de 1/mL e confirmados por anti-humano Fc-HRP 2 Ab.

[00315] Os resultados são mostrados na Figura 5. M representa um antígeno monomérico e A representa um antígeno agregado. A ligação seletiva de cada anticorpo a monômeros ou agregados foi mostrada na tabela à direita. Foi demonstrado que AA9, AD2, AD7, AC8, DG8, DG11, DA9 e DG5 se

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157/164 ligam apenas aos agregados, enquanto AE8 preferencialmente se liga aos agregados e se liga fracamente aos monômeros.

Exemplos 2-6. Análise de Octeto usando o anticorpo antiα-Syn de ScFV [00316] A análise de Octetos foi realizada como descrito nos Exemplos 2-4 utilizando os anticorpos anti-Syn ScFV selecionados no Exemplo 1-2. Os resultados são apresentados na Figura 6. Verificou-se que estes anticorpos tinham uma elevada afinidade de ~ 10~⁹ a ~ 10^-11 M em relação ao agregado de a-Syn.

Exemplo 3. Efeito inibidor do anticorpo monoclonal anti-α-Syn de camundongo no transporte mediado por células do agregado de alfa-sinucleina [00317] Uma vez que a transferência intercelular de agregados de alfa-sinucleina é apresentada como uma causa patogênica de doenças relacionadas com agregados de alfasinucleina, os anticorpos capazes de os inibir podem ser úteis como agentes terapêuticos. Para este propósito, a análise de BiFC (complementação de fluorescência bimolecular) foi realizada como se segue. O principio BiFc é mostrado esquematicamente no topo da Figura 7.

Cultura celular para análise de BIFC [00318] Linhagens de células de neuroblastoma humano SHSY5Y expressando alfa-sinucleina e metade de proteínas fluorescentes de Venus (Vênus 1-aSyn (VIS) e «Syn-Venus2

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158/164 (SV2)), respectivamente, foram cultivadas como descrito anteriormente (Lee HJ et al. , J Neurosci, 2004; 24: 18881896), Antes do experimento, 180.000 células expressando VIS e SV2 foram misturadas em uma lamínula e cultivadas por 3 dias. A co-cultura foi sub-cultivada a cada 48 horas para confirmar a migração intercelular contínua da alfasinucleina. Como o grau de transferência foi máximo no número de passagens de 6 em uma experiência separada (dados não mostrados), o efeito inibidor do anticorpo no transporte de célula para célula foi analisado utilizando a co-cultura de seis passagens.

Experimento com BiFC/tratamento com anticorpos [00319] No dia anterior à imagem, 50 pg/ml de IgG ou anticorpo de teste (3A9, 9B11, 11F11) foram adicionados à co-cultura. O sinal no canal de Vênus em cada co-cultura representa os agregados produzidos pela agregação de alfasinucleina, que foi considerada como o agregado formado pela migração de α-syn de uma célula para outra célula. Estes sinais foram automaticamente analisados com o IN Cell Analyzer (configuração do instrumento: tamanho do ponto: 0,1-0,4 pm, intensidade: 4000-7000).

[00320] Os resultados são mostrados na Figura 7. Como mostrado na figura, a cor azul indica cor nuclear e verde indica que a α-sinucleína que saiu de uma célula, encontrou α-syn de outras células e formou agregados. O gráfico no

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159/164 lado direito mostra a intensidade do sinal. Nos grupos de tratamento 9B11, 11F11 e 3A9, o número de células mostrando um sinal verde comparado com o controle negativo IgG foi diminuído. 0 resultado indica que os anticorpos da presente invenção podem inibir eficazmente a transferência intercelular de agregados.

Exemplo 4. Análise do efeito da remoção in vivo de agregados de alfa-sinucleina por anticorpo monoclonal anti α-Syn de camundongo [00321] De modo a analisar o efeito in vivo do anticorpo α-syn produzido na presente invenção, foram transfectados 10 mg/kg de alfa-sinucleina ou IgG humana para camundongos transgênicos (α-sinucleina humana mThy-1, UC San Diego). Foi administrado por via intraperitoneal todas as semanas durante 3 meses a camundongos transgênicos que expressam em excesso a alfa-sinucleina humana (α-sinucleína humana mThy1, UC San Diego). Utilizaram-se seis camundongos por grupo e utilizaram-se ninhadas não transgênicas como controles. A perfusão foi então realizada da seguinte forma.

[00322] Após a conclusão da última administração, para análise patológica do cérebro, os animais foram anestesiados com hidrato de cloral de acordo com os regulamentos humanitários e, em seguida, cardiopulmonar com solução salina a 0,9%. A seção sagital do cérebro perfundido foi armazenada em paraformaldeído a 4% (pH 7,4, 4 °C) em tampão

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160/164 fosfato até análise subsequente e a outra metade foi armazenada a congelado (70 °C) .

[00323] A análise patológica foi realizada da seguinte forma. A metade do cérebro fixado em paraformaldeido foi cortada em uma seção contínua de 40 pm de espessura pelo método de flutuação livre usando um vibratome. A fim de confirmar o nível de expressão de α-Syn nos cérebros de grupos administrados, as seções contendo córtex, estriado e hipocampo foram incubadas com anticorpo α-syn (anticorpo pl29 α-syn, abeam, ab59264 ou anticorpo α-syn total, que é um marcador do agregado, Cell Signalling Technology, # 2642) durante a noite a 4 °C. Para identificar a atividade dos astrócitos ou a atividade da microglia, as amostras cortadas foram tratadas com anticorpos para GFAP (proteína ácida fibrilar glial) (AB5804, millipore) ou Ibal (019-19741, Wako) (019-19741, Wako), respectivamente. De modo a identificar o grau de neuroinflamação, as amostras cortadas foram tratadas com anticorpo para IL-6 (NB600-1131, Novus Biologicals) ou IL-Ιβ (ab9722, abeam), respectivamente. Após incubação com o anticorpo primário, tratou-se IgG de cabra anti-coelho conjugada com biotina (Vetor 1: 100, Vetor Laboratories) e peroxidase de peroxidase Avidina D (1: 200, ABC Elite, Vetor Laboratories) com diaminobenzidina (DAB). Cada seção imunomarcada foi observada com um microscópio de campo claro para medir a densidade ótica.

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161/164 [00324] Os resultados são mostrados nas Figuras 8a e 8b.

A Figura 8a é um gráfico que mostra os resultados da análise do anticorpo p-129 α-Syn (um anticorpo que reconhece a-syn fosforilado em Ser 129), que é um marcador do agregado de aSyn. Como resultado, o camundongo TG (TransGenic) mostrou uma diminuição significativa nos níveis de agregados em CAI e CA3 do córtex e do hipocampo, em comparação com os camundongos de controle administrados apenas IgG (a parte relacionada é indicada por pontas de seta na amostra de IgG).

A Figura 8b mostra o resultado da coloração com o anticorpo total alfa-syn. O aumento da α-syn humana nos camundongos TG foi efetivamente removido pela administração de anticorpos. Estes resultados indicam que o anticorpo de acordo com a presente invenção reduz eficazmente o agregado de α-Syn e pode ser eficazmente utilizado para o tratamento de asinucleinopatia, tais como a doença de Parkinson.

Exemplo 5: Análise para a redução de microgliose e astrogliose e redução da liberação de citocinas inflamatórias de anticorpo anti α-Syn monoclonal de camundongo [00325] A gliose é uma reação inespecífica nas células da glia que responde ao dano do sistema nervoso central desencadeado por dano de BHE, TGF-beta ou interleucina. Exemplos representativos incluem Microgliose e Astrogliose,

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162/164 que são proteínas Iba-1 e GFAP como marcadores, respectivamente.

[00326] Como descrito no Exemplo 4, foi analisado o efeito do anticorpo de acordo com a presente invenção sobre a redução da microgliose e astrogliose e liberação de citocinas inflamatórias assim desencadeadas em camundongos.

[00327] Os resultados são mostrados nas Figuras 9a, 9b, 9c e 9d. Como mostrado, os anticorpos da presente invenção reduziram a microglobulose e a astrogliose e a liberação de citocinas inflamatórias, IL-lbeta e IL-6, que desencadeiam microgliose e astrogliose em comparação com o controle.

Exemplo 6. Detecção de corpo de Lewy no tecido de cérebro humano por anticorpo monoclonal anti-α-Syn de camundongo [00328] O corpo de Lewy e a neurite de Lewy nas seções do cérebro embebidas em parafina obtidas de pacientes que morreram da doença de Parkinson com uma espessura de dez micrômetros (Dr. Halliday, Universidade de Sydney) foram corados utilizando anticorpos da presente invenção no Exemplo 5 como se segue. As seções de tecido foram tratadas com ácido fórmico a 90% durante 3 minutos para recuperação do antígeno e depois a atividade de peroxidase do tecido foi inibida por H2O2 a 1% (base de etanol a 50%). Soro de cavalo normal a 10% foi tratado para prevenir a ligação não específica de tecidos. Após lavagem com tampão fosfato, as

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163/164 seções adjacentes foram tratadas com os anticorpos 3A9, 11F11 e 11F11 da presente invenção a 4 °C durante a noite. Após lavagem com tampão fosfato, o anticorpo IgG anti-humano conjugado com biotina foi tratado a 37 °C durante 30 minutos e o complexo avidina-biotina foi reagido à temperatura ambiente durante 30 minutos (kit Vectastatina Elite; Vetor Laboratories) . Em seguida, a cor foi desenvolvida com DAB contendo 0, 005% de H2O2. Cada seção foi contra-corada com violeta de cresila a 0,5%, para discriminar cada célula.

[00329] Os resultados são mostrados nas Figuras 10a e 10b. Como aqui mostrado, o anticorpo de acordo com a presente invenção mostrou estar efetivamente ligado ao corpo de Lewy e neurite de Lewy (indicado por uma seta) . Este resultado implica que é capaz de se ligar eficazmente ao agregado de α-Syn, um componente do corpo de Lewy do tecido cerebral humano. Mostra-se que os anticorpos entregues ao cérebro humano podem se ligar eficaz e especificamente ao agregado de a-Syn.

Exemplo 7. Análise de epitopos do anticorpo monoclonal anti-α Syn de camundongo [00330] O mapeamento de epitopos para os anticorpos 3A9 e 11F11 de acordo com a presente invenção foi realizado pelo solicitante PEPSCAN (Países Baixos) para análise de alelo de peptídeo.

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164/164 [00331] Os resultados são mostrados na Figura 11. Tal como mostrado na Figura 11, verificou-se que o anticorpo de acordo com a presente invenção reconhece parte do C terminal, especialmente a parte do resíduo de aminoácido 110 a 122 como descrito acima, com ligação preferida de agregação.

[00332] Será entendido pelos especialistas na técnica que podem ser feitas várias alterações na forma e nos detalhes sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, como definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e a CDRH1 é selecionada das SEQ ID NOs: 1 a 14; e a CDRH2 é selecionada das SEQ ID NOs: 15 a 28; e a CDRH3 é selecionada das SEQ ID NOs: 29 a 42, e a CDRL1 é selecionada das SEQ ID NOs: 43 a 56; e a CDRL2 é selecionada das SEQ ID NOs: 57 a 70; e a CDRL3 é selecionada das SEQ ID NOs: 71 a 84.

2. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 da região variável de cadeia pesada e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da região variável de cadeia leve é qualquer um dos seguintes:

(aa) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 1, 15 e 29 respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 43 57 e 71, respectivamente; (ab) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 2, 16 e 30

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respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 s SEQ ID NOs: 44 , 58 e 72, respectivamente; (ac) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 3, 17 e 31, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 45, 59 e 73, respectivamente; (ad) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 4, 18 e 32, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 46, 60 e 74, respectivamente; (ae) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 5, 19 e 33, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 47, 61 e 75, respectivamente; (af) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 6, 20 e 34, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 48, 62 e 76, respectivamente; (ag) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 7, 21 e 35, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 49, 63 e 77, respectivamente; (ah) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: θ, 22 e 36, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 50, 64 e 78, respectivamente; (ai) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 9, 23 e 37, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs : 51,

65 e 79, respectivamente;

(aj) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 10, 24 e 38, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 52,

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66 e 80, respectivamente;

(ak) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 11, 25 e 39, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 53,

67 e 81, respectivamente;

(al) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 12, 26 e 40, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 54,

68 e 82, respectivamente;

(am) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 13, 27 e 41, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 55,

69 e 83, respectivamente; ou (an) CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são SEQ ID NOs: 14, 28 e 42, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são SEQ ID NOs: 56,

70 e 84.

3. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada é

uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 85 a 98 r uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% ou mais de identificação de sequênc ia com uma sequência de

aminoácidos selecionada entre as SEQ ID NOs: 85 a 98, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% ou mais de identificação de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 85 a 98.

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4. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve é

uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 99 e 112, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% OU mais de identificação de sequênc ia com uma sequência de

aminoácidos selecionada entre as SEQ ID NOs: 99 a 112, ou

uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% ou mais de identificação de sequência com uma sequência de

aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 99 a 112.
5. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve compreendem sequências de aminoácidos de:

SEQ ID NO: 85 e 99; SEQ ID NO: 86 e 100; SEQ ID NO: 87 e 101; SEQ ID NO: 88 e 102; SEQ ID NO: 89 e 103; SEQ ID NO: 90 e 104; SEQ ID NO: 91 e 105; SEQ ID NO: 92 e 106;

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SEQ ID NO: 93 e 107; SEQ ID NO: 94 e 108; SEQ ID NO: 95 e 109; SEQ ID NO: 96 e 110; SEQ ID NO: 97 e 111; ou SEQ ID NO: 98 e 112 .
6. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é anticorpo monoclonal, Fab, Fab', F(ab'), diabody ou scFV.
7. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que ο anticorpo monoclonal é anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico.
8. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.

9. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende cadeia pesada e cadeia leve compreendendo as seguintes sequências de:

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SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 141; SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 143; SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 14 6; SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 14 8; SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 14 9; SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 153; ou SEQ ID NO: 126 e SEQ ID NO: 154 .

10. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende cadeia pesada e cadeia leve compreendendo as seguintes sequências de:

SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 130 e SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 160;

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SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 161; SEQ ID NO: 134 e SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 135 e SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 136 e SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 137 e SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 166; SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 167; ou SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 168 .
11. Anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno inibe a transferência intercelular do agregado aSyn; degrada o agregado α-Syn ou inibe a formação do agregado α-Syn.
12. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 .
13. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 12.
14. Célula transformada caracterizada pelo fato de compreender um vetor de expressão conforme definido na reivindicação 13.

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15. Método de preparação de um anticorpo isolado que se liga especificamente ao agregado α-syn ou fragmento de ligação ao antígeno caracterizado pelo fato de compreender:

cultivar a célula conforme definida na reivindicação 14; e isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno a partir da célula.
16. Composição caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a composição é usada para o tratamento ou diagnóstico de α-sinucleinopatia e compreende ainda um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, ou reagentes requeridos para diagnósticos ou detecção.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia é a doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variantes de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e Parkinson combinadas, ou atrofia de sistemas múltiplos (MSA) .
19. Método de detecção do agregado α-Syn em uma amostra biológica in vivo ou in vitro caracterizado pelo fato de que

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9/11 compreende uma etapa de colocar em contato a amostra biológica em necessidade de detecção do agregado α-Syn, com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
20. Método para o tratamento de α-sinucleinopatia ou modulação de uma concentração do agregado α-Syn em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, para o indivíduo em necessidade de tratamento de α-sinucleinopatia ou modulação de uma concentração do agregado a-Syn.
21. Método para diagnosticar α-sinucleinopatia em um indivíduo caracterizado pelo fato de compreender medir a concentração e/ou a localização intercelular do agregado α-syn no indivíduo com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10; e comparar a concentração e/ou a localização intercelular do agregado α-syn medida no indivíduo com o resultado de uma amostra de controle, em que a semelhança ou diferença ao resultado do grupo de controle indica que o indivíduo sofre de α-sinucleinopatia.
22. Método, de acordo com as reivindicações 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia é

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10/11 doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variantes de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, ou atrofia de sistema múltiplo (MSA) .
23. Uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 caracterizado pelo fato de ser para preparar uma composição para o tratamento de doenças de alfasinucleinopatia de um indivíduo com alfa-sinucleinopatia, em que o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno ou a composição compreendendo o mesmo inibe a transferência intercelular do agregado α-Syn, degrada o agregado α-Syn ou inibe a formação do agregado α-Syn no cérebro do indivíduo.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a α-sinucleinopatia é doença de Parkinson (PD) , demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variantes de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV), doença de Alzheimer e de Parkinson combinadas, ou atrofia de sistema múltiplo (MSA).
25. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, ou uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de ser para modular uma concentração de agregado

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11/11 α-Syn em células do cérebro, em que o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno ou as composições compreendendo os mesmos, inibe a transferência intercelular do agregado aSyn, degrada o agregado α-Syn ou inibe a formação do agregado α-Syn.