CN109021106A - 一种人源化cd70抗体ld70及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本技术属于生物工程领域，涉及到一种人源化CD70抗体LD70及其制备方法与应用。人源化CD70抗体LD70，其重链可变区(VH)序列如SEQ ID No.1所示，其轻链可变区(VL)如SEQ ID No.2所示。本发明通达在真核细胞内表达CD70蛋白，进而筛选得到人源化CD70抗体LD70，经验证，本发明抗体LD70与CD70的亲和力超过已报道过的CD70的抗体(SNG70)；本发明抗体首次用于乳腺癌动物模型治疗，有明显的抗体肿瘤效果,且优于已经报道过的抗体SNG70。

Description

一种人源化CD70抗体LD70及其制备方法与应用

技术领域

本技术属于生物工程领域，涉及到一种CD70的抗体制备方法以及CD70抗体序列，该抗体可以单独使用，抑制肿瘤的生长。

背景技术

CD70属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员，为Ⅱ型跨膜蛋白，又称为肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamility，TNFSF) 因子。主要表达于活化的T细胞、B细胞及成熟的树突状细胞(dendritic cells，DCs)中，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。

早期研究发现，CD70主要表达于生发中心的B细胞和局部淋巴组织的T细胞，胸腺髓质的上皮细胞中也可低水平表达CD70，白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、IL-12、TNF-α及粒-巨噬细胞集落刺激因子都可上调CD70的表达，而IL-4和IL-10则抑制CD70的表达。CD70的受体为CD27，与CD27相互作用可促进T细胞和B细胞的活化、增殖及分化，在调控免疫应答过程中发挥重要的作用。CD70与CD27结合后，导致TNF受体相关因子 -2，5(TNFreceptor-associated，TRAF-2，5)发生泛素化，激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)及C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)途径，在细胞增殖、分化及生存中扮演着重要角色。CD70-CD27信号通路可诱导CD4T细胞及CD8T 细胞的增殖及分泌细胞因子；在体液免疫中，CD70-CD27可促进B细胞活化、增殖及分化，促进生发中心的形成，从而诱导分泌抗体。CD27在IL-2的协同作用下，可促进NK细胞的活化和增殖，以增强NK细胞的细胞毒性作用，并诱导干扰素γ(interferonγ，IFNγ)的分泌。

研究表明，CD70通过与其配体CD27结合在T细胞增殖中起到类似第二信号的作用，但亦有研究表明CD70-CD27可引起活化淋巴细胞的凋亡。但CD27与Fas受体不同，CD27缺乏胞浆死亡结构域。CD70转导凋亡信号需要借助一种胞浆蛋白Siva。Siva蛋白含有一个胞浆死亡结构域，与CD27结合后可介导线粒体损伤和Caspase活化，从而触发凋亡。肿瘤细胞可通过引起淋巴细胞凋亡，从而逃避免疫监视，成为肿瘤免疫逃逸的一种机制。Oiegmnn等研究表明，有些肾癌细胞系表达CD70有些不表达CD70，并将表达CD70的肾癌细胞系与不表达CD70的肾癌细胞系分别和淋巴细胞共培养，发现与表达CD70的肾癌细胞共培养的淋巴细胞的凋亡率明显升高，可能是肾癌免疫逃逸的一种机制。

CD70在正常情况下主要表达于活化的淋巴细胞，然而在病理状态下却高表达于多种肿瘤组织中，因此，提示CD70可能作为肿瘤生物治疗的有效靶点分子，在肿瘤的防治中起着重要作用。

大量的研究表明，CD70在淋巴瘤、肾癌、成神经胶质细胞瘤及乳腺癌等多种肿瘤组织中高水平表达。另有研究结果显示CD70高水平表达于原发性及转移性肾癌中，其中在肾透明细胞癌的表达率达100％，在乳头状瘤中为40％，而正常肾组织则不表达；因此有研究者提出， CD70可作为透明细胞性肾癌的新型特异性肿瘤标志物，用于未确定组织学分类肿瘤的鉴别诊断。除此之外，CD70也表达在多种血源性恶性肿瘤中，如霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤及白血病等。有文献报道，CD70在霍奇金淋巴瘤中的表达率为96％，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中为71％，在滤泡状淋巴瘤中为33％，在B细胞淋巴细胞白血病中为50％，在Burkitt淋巴瘤中为25％，在多发性骨髓瘤中为63％，在巨球蛋白血症中为100％。Kaufmann 等^[10]通过实验证实了CD70与CD27分子的相互作用可促进白血病细胞的增殖。除此之外，CD70 在胸腺肿瘤、卵巢癌、成神经胶质细胞瘤、鼻咽癌及星型细胞瘤等多种肿瘤组织中高水平表达。

当抗CD70单克隆抗体与CD70结合后，通过免疫球蛋白Fc受体介导的ADCC和CDC而发挥抗肿瘤的作用。另外，CD70作为肿瘤细胞的靶点抗原，有利于抗体携带细胞毒性物质到达肿瘤细胞表面，然后通过内化作用使免疫毒素进入肿瘤细胞内，起到杀伤肿瘤细胞的作用。同时CD70在肿瘤组织表达的特点，还预示着其可能作为一种肿瘤标志物应用于临床，将有助于肿瘤的早期诊断。总之，CD70在肿瘤治疗中具有潜在的应用前景。

本发明涉及到一种全新序列的人源化Cd70抗体，该抗体可以单独或与DNA修复抑制剂联合使用，抑制肿瘤的生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的可用于肿瘤治疗的CD70抗体及其单链可变区片段 (scFv)。

本发明公开了一种人源化CD70抗体LD70，其重链可变区(VH)序列如SEQ ID No.1所示，其轻链可变区(VL)如SEQ ID No.2所示。

VH:(SEQ ID No.1)

EVQISESGvpLfQsGaScRgSdAAS ltTrS Whewf a a t WaRiAyGyGLEgfSgltfnGaAyStAeSwrGkpTISReNSKNTtYLQMNSLkAEDTAVwYCAR GqYFeYWGQGTLVTVSS

VL:(SEQ ID No.2)

DIQMTaSPsTLSLsPGEGATLSCvRvSfSVSyNYFGtYQnKPGQgPRLLIYGASSRATdIPfRFrGSGSsTDFTLTIh RLgPEDSAVYwCQnFqSLPLTFlGGiKVEIKR。

本发明还公开了所述人源化CD70抗体LD70的制备方法，包括以下步骤：

(1)抗原制备：

PCR扩增CD70全长基因，并使之与Fc融合，连接到pIRESneo2质粒(购买于clonetch公司)，然后转染CHO细胞；将过表达CD70-Fc的CHO细胞裂解，用protein G纯化CD70-Fc 蛋白；得到纯度大于90％的CD70-Fc蛋白,以此蛋白为抗原，进行抗体筛选；

(2)CD70抗体的筛选：

构建人源化ScFv噬菌体抗体库；然后以CD70-Fc为筛选抗原，以Fc为阴性对照，淘选能与CD70-Fc结合但不与Fc结合的噬菌体抗体克隆，经过3轮筛选，得到多个阳性克隆；从中选择阳性最高的克隆，命名为LD70。

本发明还公开了人源化CD70抗体LD70在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、转移性肾细胞癌、转移性结直肠癌、淋巴癌。

本发明的有益效果如下：

传统上抗原的获得以原核表达为主。但原核表达的蛋白通常缺少翻译后修饰，此外可能产生不正确的折叠，从而导致失去活性。为了获得更有效的CD70抗体用于抗体筛选，我们在真核细胞内表达CD70蛋白。这样的抗原具有天然活性构象。进而筛选得到本发明人源化CD70 抗体LD70，经验证，本发明抗体LD70与CD70的亲和力超过已报道过的CD70的抗体(SNG70)；本发明抗体首次用于乳腺癌动物模型治疗，有明显的抗体肿瘤效果,且优于已经报道过的抗体 SNG70。

附图说明

图1是CD 70在乳腺癌中高表达。图1显示CD70在MCF-7乳腺癌细胞中高表达，在MDA-MB231乳腺癌细胞中高表达。

图2是CD70SDS-PAGE图。

图3是CD70噬菌体文库筛选图。

图4是LD70-ScFv纯化。

图5是CD 70亲和力测定图。

图6是LD70–scFv阻断CD70与CD21的结合。将不同浓度的CD70Fc蛋白加入到CD21包被的ELSA板中,常温2小时后。洗去没有结合的CD70。结合在ELISA板上的CD70-Fc用anti-human Fc-HRP和TMB显色，在酶标仪读OD450。根据标准曲线将OD450找算成结合的CD70的量。

图7是CD70抗体LD70对肿瘤细胞生长的抑制作用。

图8是CD70抗体的抗肿瘤作用效果。

具体实施方式

实施例一：比较肿瘤细胞和正常细胞的CD70的表达水平，CD 70在乳腺癌中高表达。如图1，Western Blot发现，CD70在乳腺癌细胞中高表达，而在正常细胞上低表达。这个现象说明CD70可能可以作为肿瘤细胞的标记物。

实施例二：抗体的制备

(一)抗原制备

膜蛋白的提取

1构建CD70-Fc全长表达的质粒；

2.转染CHO细胞，构建过表达CD70的CHO细胞系；

3.培养CHO-CD70过表达的细胞，匀浆，分离提取膜蛋白。方法如下：

1)将细胞种于T75或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04％)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2)收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

3)按2.5毫升(T75)/每瓶或5毫升(T175/每瓶加入冰冷的匀浆液

4)(HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM)于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。

5)将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris–HCl(50mM,PH7.4)4℃,18000rpm(40000g)10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HClbuffer.4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。

6)在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶(T75)或500微升每瓶(T175)加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。

7)用Protein G纯化匀浆中的中的CD70-Fc蛋白。

8)蛋白的纯度用SDS-PAGE分析鉴定，如图2。

(二)CD70抗体的筛选

1、CD70噬菌体文库筛选

1)人源化scFv噬菌体文库的构建

从100名自愿者取血，提取总RNA，扩增全套VH和VL基因，重叠PCR法随机拼接成scFv。克隆到pCANTAB 5E载体后，转化感受态TG1细菌。

将菌液涂于SOBAG琼脂板上，37℃过夜培养。用2×YT培养液将其他菌落洗下，加入M13KO7 辅助噬菌体感染后离心，将沉淀重悬于2×YT-AK(100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素)中，30℃振荡培养过夜。加入1/5体积量PEG/NaCl(20％PEG，2.5mol/LNaCl) 沉淀后，得到初级人源化噬菌体scFv单链抗体库。

2)噬菌体文库的筛选

抗原稀释为50μg/mL包被96孔板，加入与5％BSA等体积混合的60μL初级人源化噬菌体 scFv单链抗体库37℃孵育3h，PBS及PBST(含0.05％Tween 20的PBS)各洗10次。将洗脱后的噬菌体感染对数生长期的TG1。扩增培养噬菌体抗体。

3)scFv单链抗体的ELISA检测

噬菌体抗体液加入到抗原包被的ELISA板中。室温孵育3h，用PBST充分洗涤3次，加入150μ L 1∶5 000稀释HRP标记抗M13抗体，室温孵育1h，PBST洗涤后，加入TMB显色，酶标仪测定A490值，以待测克隆A490值高于阴性对照3倍以上认为是阳性克隆。将筛选到的阳性最高的克隆命名为LD70(因为该LD70为抗体的单链可变区，所以在本说明书中又称为 LD70-scFv)。提取含有LD70基因的噬菌粒，测定其VH和VL序列。其VH序列为SEQ ID No.1， VL序列为SEQ ID No.2。

3)可溶性CD70scFv的表达、纯化及鉴定

将将表达有LD70-scFv的噬菌体感染对数生长期HB2151。经培养和IPTG诱导如果，裂解细胞，离心，吸取上清，分离纯化scFv。其纯度用SDS-PAGE分析，如图4。

实施例三、CD 70亲和力测定

将LD70序列克隆到pET28a载体中，转化到大肠杆菌中表达，获得LD70-Scfv蛋白。如图4。LD70-ScFv与CD70蛋白结合力高于目前已经的CD70抗体SNG70(图5)。

实施例四：LD70-ScFv阻断CD70与CD21的结合。

CD70与CD21的结合是促进肿瘤生长的重要信号通路。本发明的LD70-scfV可以阻断CD70 与CD21的结合。结果如图6所示。LD70-scfv对CD70-CD21结合的阻断作用，高于已报道的抗体SNG70。

实施例五：LD70对乳腺癌细胞生长的抑制作用

用以下方法测定LD70对乳腺癌细胞生长的抑制作用。

1、在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。

2、向培养板中加入10μL CD70抗体和对照抗体。

3、将培养板在培养箱孵育6小时。

4、向每孔加入10μL CCK-8溶液。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

结果表明，LD70可以有效地抑制乳腺癌细胞生长，其效果好于SNG70(图7)。

实施例六：CD70抗体的抗肿瘤作用

乳腺癌细胞MDA-MB-231购自ATCC。6—8周龄雌性C57BL/6小鼠30只，体质量(20±2)g，由南京师范大学动物实验中心提供。所有30只小老鼠接种乳腺癌细胞，然后随机将其分为对照组、Cd70抗体组、PD-1抗体组。各组小鼠尾静脉注射抗CD70抗体或磷酸盐缓冲液，观察其出瘤时间、肿瘤生长速度及生存情况。结果表明，LD70抗体有以有效抑制小鼠肿瘤细胞的生长。表明LD70是一个潜在的治疗乳腺癌抗体药物(图8)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江蓝盾药业有限公司

<120> 一种人源化CD70抗体LD70及其制备方法与应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Val Gln Ile Ser Glu Ser Gly Val Pro Leu Phe Gln Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Cys Arg Gly Ser Asp Ala Ala Ser Leu Thr Thr Arg Ser Trp His

20 25 30

Glu Trp Phe Ala Ala Thr Trp Ala Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Gly Leu

35 40 45

Glu Gly Phe Ser Gly Leu Thr Phe Asn Gly Ala Ala Tyr Ser Thr Ala

50 55 60

Glu Ser Trp Arg Gly Lys Pro Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ser Lys Asn

65 70 75 80

Thr Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Trp Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Val Arg Val Ser Phe Ser Val Ser Tyr

20 25 30

Asn Tyr Phe Gly Thr Tyr Gln Asn Lys Pro Gly Gln Gly Pro Arg Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp Ile Pro Phe Arg Phe

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Arg Leu

65 70 75 80

Gly Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Trp Cys Gln Asn Phe Gln Ser Leu

85 90 95

Pro Leu Thr Phe Leu Gly Gly Ile Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Claims (3)

1.一种人源化CD70抗体LD70，其特征在于，其重链可变区序列如SEQ ID No.1所示，其轻链可变区如SEQ ID No.2所示。

2.人源化CD70抗体LD70的制备方法，其特征在于：

(1)抗原制备：

PCR扩增CD70全长基因，并使之与Fc融合，连接到pIRESneo2质粒，然后转染CHO细胞；将过表达CD70-Fc的CHO细胞裂解，用protein G纯化CD70-Fc蛋白；得到纯度大于90％的CD70-Fc蛋白,以此蛋白为抗原，进行抗体筛选；

(2)CD70抗体的筛选：

构建人源化ScFv噬菌体抗体库；然后以CD70-Fc为筛选抗原，以Fc为阴性对照，淘选能与CD70-Fc结合但不与Fc结合的噬菌体抗体克隆，经过3轮筛选，得到多个阳性克隆；从中选择阳性最高的克隆，命名为LD70。

3.人源化CD70抗体LD70在制备治疗肿瘤药物中的应用。