BR112020023842A2

BR112020023842A2 - Formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão, formulação estável de proteína de fusão, e, métodos para obter uma formulação estável e para aumentar a estabilidade de proteína de fusão.

Info

Publication number: BR112020023842A2
Application number: BR112020023842-2A
Authority: BR
Inventors: Murali JAYARAMAN; Lakshmi Kanakadurga M
Original assignee: Dr. Reddy's Laboratories Ltd.
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2021-04-13
Also published as: AU2019274827A1; EP3801606A1; CO2020016014A2; ZA202007492B; SG11202011354VA; US20210179690A1; CN112512562A; WO2019224843A1; JP2021525255A

Abstract

formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão, formulação estável de proteína de fusão, e, métodos para obter uma formulação estável e para aumentar a estabilidade de proteína de fusão. a presente invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão, em que a formulação contém tampão, álcool de açúcar/poliol, aminoácido e tensoativo, e em que a formulação é desprovida de sacarose. adicionalmente, a formulação pode também ser desprovida de um sal. as formulações de proteína de fusão descritas são formulações líquidas que são também adequadas para liofilização.

Description

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FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA ESTÁVEL DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE PROTEÍNA DE FUSÃO, E, MÉTODOS PARA OBTER UMA FORMULAÇÃO ESTÁVEL E PARA AUMENTAR A ESTABILIDADE DE PROTEÍNA DE FUSÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a formulação estável de uma molécula de proteína de fusão. Em particular, a invenção descreve formulação de proteína de fusão estável de 4-imunoglobulina de proteína associada a linfócito T citotóxico estável (CTLA4-Ig), em que a formulação compreende sistemas de tampão e estabilizadores.

FUNDAMENTOS

[002] Nas últimas duas décadas, tecnologia de DNA recombinante levou a comercialização de muitas proteínas, particularmente produtos terapêuticos de anticorpo e moléculas de proteína de fusão.

[003] Proteínas de fusão, em particular, moléculas de proteína de fusão Fc (em que a porção Fc de imunoglobulina humana (Ig) é conjugada à porção particular de um receptor) estão ganhando significância, por causa de seu amplo uso em tratamento de vários distúrbios oncológicos e imunológicos. Etanercept (TNFR-IgFc), aflibercept (VEGFR-IgFc) e abatacept e belatacept (CTLA4-IgFc) estão entre as proteínas de fusão Fc aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para tratar vários distúrbios. A eficácia de molécula de proteína de fusão é principalmente dependente da estabilidade, via de administração e suas formas de dosagem e concentrações. Isso, por sua vez, necessita que essas moléculas da proteína sejam formuladas apropriadamente para reter estabilidade e atividade.

[004] Proteínas em geral, e proteínas de fusão Fc em particular, são tipicamente instáveis em solução e sensíveis a pH, temperatura e oxidação e, consequentemente, podem passar por uma variedade de reações covalentes e não covalentes, modificações ou degradações em solução. Os caminhos

2 / 23 degradação de proteína mais comuns incluem agregação, desamidação e/ou oxidação e sabe-se que esses caminhos de degradação são influenciados por pH, temperatura e condições de armazenamento, incluindo condições de formulação e excipientes. Esses caminhos assim levam a instabilidade tanto física quanto química de uma proteína em solução.

[005] Agregação em proteínas terapêuticas é de particular interesse, em virtude de frequentemente resultar em bioatividade diminuída/perda de atividade por um período de tempo e poder ser imunogênicas quando administradas a um paciente. No caso de proteínas de fusão, agregação é significante uma vez que elas envolvem fusão de duas ou mais proteínas, têm estrutura grande e complexa e tendem a formar agregados a uma taxa rápida comparadas com polipeptídeos ou anticorpos simples.

[006] Fora da agregação, um outro tipo de instabilidade de uma proteína multimérica, que ocorre especificamente nas regiões onde duas ou mais proteínas são fundidas, é fragmentação/corte que pode ser um resultado de desamidação, oxidação, isomerização e/ou hidrólise. Desamidação pode ocorrer em resíduos de aspargina ou glutamina, resultando em um(as) variante(s) de carga da proteína. Oxidação de proteínas de fusão envolve principalmente resíduos de metionina, e são em geral influenciados por fatores externos tais como exposição a luz e íons de metal de transição ou produto de degradação de um excipiente (por exemplo, peróxido de hidrogênio de degradação de polissorbato). Sabe-se que a presença desses produtos oxidados e variantes de carga em uma molécula de proteína terapêutica aumenta instabilidade e, assim diminui a bioatividade da proteína.

[007] Consequentemente, é essencial desenvolver uma mistura adequada de componente(s) de formulação que estabilizem uma molécula de proteína terapêutica (fusão) contra os muitos fatores de indução de instabilidade física e química. Adicionalmente, a formulação desenvolvida deve manter estabilidade coloidal em condições de armazenamento, uma vez

3 / 23 que ela mede e assegura que as moléculas de proteína permaneçam suspensas em uma solução aquosa em equilíbrio.

[008] Existem inúmeras classes de excipientes tais como açúcar e álcoois de açúcar, aminoácidos e tensoativos que são usados na estabilização de proteínas e moléculas de proteína de fusão. Entretanto, a escolha de excipientes formulando ao mesmo tempo uma proteína é governada por vários outros fatores tais como sua compatibilidade com a proteína e outros componentes na formulação, modo de administração e dosagem (pretendido) da proteína terapêutica, etc. Portanto, o desafio por trás de desenvolvimento de uma formulação envolve classificação e seleção de condições e excipientes de tampão adequadas, incluindo suas concentrações, para obter uma formulação estável. Adicionalmente, também espera-se que a formulação desenvolvida seja estável à temperatura ambiente e seja adequada para ser administrada em forma tanto liofilizada quanto líquida.

SUMÁRIO

[009] A presente invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma molécula de proteína de fusão compreendendo tampão, poliol, aminoácido e tensoativo, em que a proteína de fusão é uma molécula de CTLA4-Ig.

[0010] Em particular, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo tampão, poliol, aminoácido e tensoativo em que a dita formulação é desprovida de sacarose.

[0011] As formulações estáveis descritas anteriormente de proteína de fusão CTLA4-Ig, podem opcionalmente ser sem cloreto de sódio.

[0012] Além do mais, a invenção descreve um método para reduzir agregação e/ou fragmentação de proteína de fusão CTLA4-Ig em uma formulação compreendendo adição de histidina e poliol.

[0013] A invenção também descreve um método para aumentar a

4 / 23 estabilidade de formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig, compreendendo histidina e manitaol, em que os componentes de histidina e manitol são também adicionados durante a etapa do processo, em particular na etapa do processo de filtração de fluxo tangencial (uma etapa antes da etapa de formulação). Tal adição durante o processo confere estabilidade significante à formulação.

[0014] A proteína de fusão CTLA4-Ig descrita na dita formulação é estável a concentração mais baixa bem como mais alta (de 10 mg/ml a 200 mg/ml) e em várias temperaturas, incluindo a 30°C por pelo menos duas semanas. A dita formulação contém menos que cerca de 10% das moléculas de proteína de fusão em forma agregada e preferivelmente menos que 7,5% das moléculas de proteína de fusão em forma agregada.

[0015] Adicionalmente, a combinação de poliol e aminoácido confere estabilidade coloidal à molécula de proteína de fusão presente na formulação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0016] A expressão “proteína de fusão” significa uma proteína formada fundindo (isto é, unindo) todo ou parte de dois polipeptídeos que não são os mesmos. Tipicamente, proteínas de fusão são produzidas usando técnicas de DNA recombinante, unindo extremidade a extremidade os polinucleotídeos que codificam os dois polipeptídeos.

[0017] As expressões “CTLA4-Ig” ou “molécula de CTLA4-Ig” ou “molécula de CTLA4Ig” são usadas intercambiavelmente, e se referem a uma molécula de proteína que compreende um polipeptídeo tendo um domínio extracelular de CTLA4 ou uma porção do mesmo, e uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma. O domínio extracelular e a região constante de imunoglobulina podem ser tipo selvagem, ou mutante ou modificado, e mamífero, incluindo humano ou camundongo. O polipeptídeo pode compreender adicionalmente domínios de proteína adicionais. Uma

5 / 23 molécula de CTLA4-Ig pode também se referir a formas multiméricas do polipeptídeo, tais como dímeros, tetrâmeros, e hexâmeros. Uma molécula de CTLA4-Ig também é capaz de se ligar a CD80 e/ou CD86.

[0018] A expressão formulação “estável” se refere à formulação em que o anticorpo na mesma retém sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica, mediante armazenamento.

[0019] Estudos de estabilidade fornecem evidência da qualidade de um anticorpo sob a influência de vários fatores ambientais durante o curso de tempo. “Q1A: Teste de Estabilidade de Novas Substâncias e Produtos de Fármaco” do ICH estabelece que dados de estudos acelerados sobre estabilidade podem ser usados para avaliar o efeito de excursões a curto prazo maiores ou menores que podem rotular condições de armazenamento que podem ocorrer durante o transporte dos anticorpos.

[0020] Vários métodos analíticos são disponíveis para medir a degradação física e química da proteína de fusão nas formulações farmacêuticas. Uma proteína de fusão “retém sua estabilidade física” em uma formulação farmacêutica se ela não mostrar substancialmente nenhum sinal de agregação, precipitação e/ou desnaturação mediante exame visual de cor e/ou clareza, ou como medido por dispersão de luz UV ou por cromatografia de exclusão de tamanho. Diz-se que uma proteína de fusão “retém sua estabilidade química” em uma formulação farmacêutica quando ela mostra mínima ou nenhuma formação de variantes de produto que podem incluir variantes em decorrência de modificação química de proteína de fusão tais como desaminação, oxidação, etc. Métodos analíticos tais como cromatografia de troca iônica e cromatografia iônica hidrofóbica podem ser usados para investigar as variantes de produto químico.

[0021] O monômero, dímero e espécies de alto peso molecular (HMW) de molécula de CTLA4Ig podem ser separados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). SEC separa moléculas com base no tamanho

6 / 23 molecular. A separação é obtida pela exclusão ou inclusão molecular diferencial a medida que as moléculas migram ao longo do comprimento da coluna. Assim, a resolução aumenta em função do comprimento da coluna. A fim de manter a atividade apropriada de uma proteína de fusão, é desejável reduzir a formação de agregado ou fragmentação (monômero/espécies de baixo peso molecular) de produtos e, consequentemente, controlar o teor de dímero a um valor alvo. Dímero é principal forma presente em proteínas de fusão e elui como pico principal em cromatografia de exclusão de tamanho. As amostras de molécula de CTLA4Ig podem ser separadas usando um HPLC 2695 Alliance (Waters, Milford, Mass.) equipado com colunas TSK Gel® G3000SWXL (300 mm×7,8 mm) e TSK Gel® G3000SWXL (40 mm×6,0 mm) (Tosoh Bioscience, Montgomery, Pa.).

[0022] A estabilidade coloidal de uma proteína dá informação a respeito de interação de moléculas de proteínas dentro delas, e entre as moléculas circundantes, em um ambiente aquoso. Um indicador ou preditor comum de estabilidade coloidal de uma molécula de proteína em uma solução é o valor de coeficiente de difusão (kD), medido por técnica de dispersão de luz dinâmica (DLS). Quanto maior o valor de coeficiente de difusão, maiores as forças repulsivas, maior a solubilidade e menor a formação de agregado na molécula de proteína, e assim a proteína exibe estabilidade coloidal. E a estabilidade coloidal é um indicador de solubilidade de proteína, viscosidade, tipo de agregados de proteína etc.

[0023] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis se referem aos aditivos ou carreadores, que podem contribuir para estabilidade do anticorpo em formulação. Os excipientes podem englobar estabilizadores e modificadores de tonicidade. Exemplos de estabilizadores e modificadores de tonicidade incluem, mas não se limitando a açúcares, sais, tensoativos, e derivados e combinação dos mesmos.

[0024] Etapas de pré-formulação se referem a quaisquer ou múltiplas

7 / 23 etapas realizadas antes de formulação da proteína em um produto terapêutico. Exemplos de tais etapas incluem, cromatografia, filtração, (ultrafiltração, filtração estéril, nano filtração, diafiltração, filtração profunda), ou quaisquer outras etapas realizadas para concentrar a proteína ou para trocar o tampão para um tampão diferente/adequado. As etapas de filtração mencionadas aqui podem ser realizadas em um modo de filtração de fluxo tangencial.

[0025] A expressão “poliol” ou “álcool de açúcar” da maneira usada aqui inclui um composto orgânico contendo múltiplos grupos hidroxila. Exemplos de polióis incluem manitol, sorbitol, xilitol etc.,

[0026] Tensoativo se refere a excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados para proteger as formulações de proteína contra vários condições de tensão, como agitação, cisalhamento, exposição a alta temperatura etc. Os tensoativos adequados incluem mas não se limitando a ésteres do ácido graxo de polioxietilenossorbitano tais como Tween 20™ ou Tween 80™, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (por exemplo, Polaxâmero, Plurônico), dodecil sulfato de sódio (SDS) e similares ou combinação dos mesmos.

[0027] Exemplos de sais incluem, mas não se limitando a cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, tiocianato de sódio, tiocianato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio, cloreto de cálcio, cloreto de zinco e/ou acetato de sódio.

[0028] Certos aspectos específicos e modalidades da invenção são mais completamente descritos por referência aos exemplos seguintes. Entretanto, esses exemplos não devem ser considerados limitantes do escopo de maneira alguma. Descrição detalhada das modalidades

[0029] Muitas das formulações de proteína de fusão aprovadas contêm sacarose como um estabilizador. Entretanto, a presente invenção descreve uma formulação de proteína de fusão (CTLA4-Ig) que fornece

8 / 23 estabilidade sem a presença de sacarose.

[0030] A presente invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão compreendendo tampão, poliol, aminoácido e tensoativo.

[0031] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo tampão, poliol, aminoácido e tensoativo, e em que a formulação é desprovida de sacarose.

[0032] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo tampão, manitol, histidina e tensoativo, e em que a formulação é desprovida de sacarose.

[0033] Em qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, a razão de proteína de fusão CTLA4-Ig para poliol é 1:0,7 ou menos e a razão de proteína de fusão CTLA4-Ig para aminoácido é 1:0,1 ou menos.

[0034] Nas ditas modalidades anteriores da invenção, a formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig também não precisa de sal para estabilizar a formulação de proteína terapêutica.

[0035] Nas modalidades mencionadas anteriormente, a formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig pode adicionalmente ser sem sal, em que o sal é cloreto de sódio.

[0036] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão CTLA4-Ig que consiste essencialmente em tampão, manitol, histidina e tensoativo.

[0037] Nas ditas modalidades anteriores, a concentração de poliol presente na formulação é menos que cerca de 125 mg/ml, preferivelmente menos que cerca de 80 mg/ml, e a concentração de aminoácido presente na formulação é menos que cerca de 20 mg/ml, preferivelmente menos que 15

9 / 23 mg/ml e mais preferivelmente 10 mg/ml.

[0038] Em qualquer uma das ditas modalidades anteriores, a concentração de proteína de fusão na formulação é cerca de 10mg/ml a 200 mg/ml, preferivelmente 20 mg/ml a 150 mg/ml, mais preferivelmente 25 mg/ml a 125 mg/ml.

[0039] Em qualquer uma das ditas modalidades anteriores, a viscosidade da formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig é menor que 20 cp, preferivelmente menor que 10 cp, mais preferivelmente menor que 5 cp.

[0040] Em qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente da invenção, o pH da formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig é de 6,0 a 8,0, preferivelmente 6,5 a 7,5.

[0041] Nas ditas modalidades anteriores, o tampão mencionado na formulação é tampão orgânico, tampão inorgânico e/ou combinações dos mesmos.

[0042] Em qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente da invenção, o dito tampão orgânico é tampão de citrato, tampão de succinato ou tampão de acetato.

[0043] Ainda em uma outra modalidade da invenção, o tampão inorgânico mencionado na formulação é tampão de fosfato.

[0044] Em qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, os aminoácidos incluem aminoácido básico, aminoácidos hidrofóbicos e combinações dos mesmos.

[0045] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo tampão de fosfato, manitol, histidina e tensoativo.

[0046] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável compreendendo molécula de proteína de fusão CTLA4- Ig, tampão de citrato-fosfato, manitol, histidina e polaxâmero, e em que a formulação é estável e mantém pelo menos 94% de molécula de proteína de

10 / 23 fusão como um principal pico, quando analisada por cromatografia de exclusão de tamanho.

[0047] Ainda em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para reduzir agregação em formulação de proteína de fusão CTLA4- Ig, compreendendo adição de histidina e manitol à formulação, em que o teor agregado na formulação é menos que 7,5% da proteína, mediante armazenamento a 30°C por 2 semanas.

[0048] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para inibir fragmentação em formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig, compreendendo adição de histidina e manitol à formulação, em que o teor da molécula fragmentada na formulação é menos que 3%, preferivelmente menos que 1% e mais preferivelmente menos que 0,5% da proteína, mediante armazenamento a 30°C por 2 semanas.

[0049] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo, 125 mg/ml de proteína de fusão CTLA4-Ig, tampão de fosfato, 75 mg/ml de manitol, 15 mg/ml de histidina e 8 mg/ml de polaxâmero.

[0050] Em uma modalidade, a invenção descreve uma formulação farmacêutica estável de molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo 125 mg/ml de proteína de fusão CTLA4-Ig, tampão de fosfato, 85 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de histidina e 8 mg/ml de polaxâmero.

[0051] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para manter estabilidade coloidal de proteína de fusão CTLA4-Ig em uma formulação, compreendendo adição de histidina e poliol à formulação.

[0052] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para reduzir oxidação de proteína de fusão CTLA4-Ig em uma formulação, compreendendo adição de histidina e poliol.

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[0053] Em qualquer uma das modalidades anteriores da invenção, a formulação é uma formulação líquida/aquosa estável e é adequada para, e pode ser liofilizada como pós liofilizados. Adicionalmente, a formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig liofilizada pode ser reconstituída com diluente apropriado para obter a formulação líquida adequada para administração.

[0054] Em qualquer uma das modalidades mencionadas anteriormente, a proteína de fusão CTLA4-Ig é abatacept ou belatacept.

[0055] Em qualquer uma das ditas modalidades anteriores, o aminoácido presente na formulação funciona como um estabilizador e não forma parte de um agente de tamponamento.

[0056] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para aumentar a estabilidade de formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo, tampão, poliol, histidina e tensoativo, e em que histidina e poliol são também adicionados na etapa de processo de pré-formulação que é na etapa de filtração de fluxo tangencial [realizada como ultrafiltração (UF) e diafiltração (DF) para concentração de produto e troca de tampão].

[0057] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para aumentar a estabilidade da composição de proteína de fusão CTLA4-Ig, em que o método compreende adição de histidina e manitol durante a etapa do processo, em particular na etapa de filtração de fluxo tangencial. Observou-se que a estabilidade da molécula de proteína é significativamente aumentada quanto a estabilidade térmica e coloidal, quando componentes de histidina e manitol são adicionados na etapa de filtração de fluxo tangencial, especificamente na etapa de ultrafiltração e/ou diafiltração.

[0058] Ainda em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para aumentar a estabilidade de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo as etapas de expressão e purificação de proteína de fusão CTLA4-Ig; seguido por concentração e/ou troca de tampão da proteína por UF – DF - UF, em que o tampão usado em qualquer etapa de UF-DF-UF

12 / 23 inclui histidina e manitol; e seguido por formulação da proteína em um tampão compreendendo histidina, manitol e tensoativo; em que a estabilidade da proteína é aumentada comparada à formulação da proteína que foi processada por etapas de UF-DF-UF sem a inclusão de histidina e manitol em qualquer um de seu tampão.

[0059] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para preparar uma formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig de alta concentração estável compreendendo; a) obter molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig purificada a partir da etapa cromatográfica; b) submeter a proteína de fusão CTLA4-Ig obtida da etapa a) a ultrafiltração [UF] para concentrar a proteína; c) submeter a proteína de fusão CTLA4-Ig concentrada obtida da etapa b) a diafiltração usando um tampão compreendendo manitol e histidina; e d) submeter a molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig da etapa c) a segunda ultrafiltração para obter ingrediente ativo de proteína de fusão CTLA4-Ig adicional e altamente concentrado em que a concentração da formulação obtida na etapa d) é até 200 mg/ml e foi considerada estável medida pelos estudos de estabilidade padrão.

[0060] Observou-se que a estabilidade da molécula de proteína é significativamente aumentada quanto a estabilidade térmica e coloidal, quando componentes de histidina e manitol são adicionados na etapa de filtração de fluxo tangencial. E adição de histidina e manitol na etapa de UF ou DF resulta em um produto estável com % de HMW sendo consistentemente menos que 10, mesmo após ser submetido a estudos de estabilidade acelerada.

[0061] Na modalidade mencionada anteriormente, o ingrediente ativo obtido a partir do processo anterior é estável e medicamento preparado a

13 / 23 partir do ingrediente ativo é estável em condições de estabilidade acelerada, em que a concentração do medicamento é até 140 mg/ml, preferivelmente 130 mg/ml. A adição de histidina e açúcar durante etapa de DF de processo de TFF ajuda a obter maiores concentrações estáveis e solúveis de molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig (até ~200 mg/ml) que por sua vez ajuda na preparação de concentração desejada de medicamento em escala comercial por técnica de diluição simples. Isso adicionalmente economiza tempo e recurso.

[0062] Nas ditas modalidades anteriores, onde histidina e poliol são também adicionados à etapa de processo de pré-formulação de UF ou DF, a proteína formulada contém menos que 10% da proteína em forma agregada, mesmo quando armazenada a 30°C por pelo menos duas semanas.

[0063] As formulações de proteína de fusão descritas contendo apenas aminoácido(s) (e sem açúcar ou poliol), não estabilizam a proteína. Enquanto que, adição de manitol à formulação contendo aminoácido, exibe efeito estabilizante. Adicionalmente, manitol permite o uso de combinação de aminoácidos na formulação mistura. Entretanto, surpreendentemente, e ao contrário, formulação de proteína de fusão (CTLA4-Ig) a base de sacarose não exerce uma estabilização superior a manitol e não favorece o uso de combinação de aminoácidos e em vez disso exibe um efeito desestabilizante na proteína.

[0064] A formulação de proteína de fusão CTLA4-Ig descrita anteriormente é uma formulação líquida (aquosa) estável, que pode ser usada para administração parenteral. Administração parenteral inclui administração intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular ou qualquer outra via de administração em geral considerada dentro do escopo de administração parenteral e como é bem conhecida por um versado na técnica.

[0065] As formulações descritas da invenção usam excipientes mínimos e em menores quantidades para estabilizar a molécula de proteína

14 / 23 terapêutica de fusão.

[0066] As formulações descritas da invenção usam menores quantidades de álcool de açúcar para estabilizar a molécula de proteína terapêutica de fusão. E as formulações descritas de formulações de proteína de fusão CTLA4-Ig compreendendo tampão, poliol, aminoácido e tensoativo são estáveis e podem resistir a múltiplos ciclos de congelamento descongelamento e também tensão induzida por agitação.

[0067] A invenção descrita, isto é, a formulação da proteína de fusão, CTLA4-Ig (abatacept) é estabilizada por combinação de histidina e manitol principalmente. Surpreendentemente, adição de sacarose ou qualquer outro aminoácido à formulação, de fato não melhora a estabilidade da proteína de fusão. Abatacept sendo uma proteína de fusão e dimérica em natura é uma molécula complexa, propensa a agregação e oxidação é, entretanto, inesperadamente estabilizada apenas pelo aminoácido histidina (e poliol).

EXEMPLOS

[0068] A molécula de proteína de fusão CTLA4-Ig, abatacept, adequada para armazenamento na presente composição farmacêutica é produzida por métodos padrões conhecidos na técnica. Por exemplo, abatacept é preparada por expressão recombinante de CTLA4 fundida com porção CH2 e CH3 de IgG de humano em uma célula hospedeira de mamífero tais como células de Ovário de Hamster Chinês. Adicionalmente, a abatacept expressa é colhida e a colheita bruta é submetida a etapas de processo à jusante padrões que incluem etapas de purificação, filtração e opcionalmente diluição ou concentração. Por exemplo, a colheita bruta de abatacept pode ser purificada usando técnicas de cromatografia padrões tais como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica e combinações das mesmas. A solução de abatacept purificada pode adicionalmente ser submetida a uma ou mais etapas de filtração, e a solução obtida é submetida a estudos de formulação adicionais.

15 / 23 Exemplo 1: Classificação e seleção de tampão adequado para formular abatacept

[0069] Para selecionar tampão(ões) adequado(s) para estabilizar abatacept, vários tampões foram preparados. 40 mg/ml de abatacept em fundo de tampão de fosfato obtidos a partir de processo cromatográfico à montante foram trocados de tampão e diluídos para 25 mg/ml no(s) respectivo(s) diferente(s) fundo(s) de tampão. Detalhes das formulações são dados na Tabela 1.

[0070] Todas as formulações de abatacept foram submetidas a estudos de estabilidade acelerada a 25°C e 40°C por quatro semanas. Após o que, as amostras foram analisadas com relação às espécies de alto peso molecular (HMW) e espécies de baixo peso molecular (LMW) [resultados são mostrados na Tabela 2 e 3] usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e também verificadas com relação à mudança no pH [Tabela 4] e inspeção visual [Tabela 5]. Tabela 1: Composições de várias formulações de abatacept em diferentes tampões como pelo exemplo 1 Nome da Composição Amostra Aba-IV-1 25 mg/ml de abatacept, 10 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 Aba- IV-2 25 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de histidina, pH 7,1 Aba- IV-3 25 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de citrato, pH 7,1 Aba- IV-4 25 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de histidina-fosfato, pH 7,1 Tabela 2: Dados de SEC de formulações de abatacept (25 mg/ml) preparadas como pelo exemplo 1 Nome da Espécies de Alto Peso Molecular (HMW) Amostra T0 40°C 25°C 0W 1W 2W 4W ∆ 2W∆ 2W 4W ∆ 2W ∆ 4W 4W Aba-IV-1 26,7 34,9 37,4 40,4 10,7 13,7 29,1 29,7 2,4 3,0 Aba- IV-2 26,2 75,9 77,7 55,8 51,5 29,6 28,2 28,6 2,1 2,4 Aba- IV-3 27,3 41,7 41,2 40,4 13,9 13,1 32,5 32,5 5,2 5,2 Aba- IV-4 27,0 64,1 50,9 42,8 23,9 15,8 30,2 30,9 3,2 3,9 W-indica semanas, T0 indica ponto de tempo ‘zero’, ∆-Delta indica mudança em um valor do ponto de tempo zero para um ponto de tempo específico Tabela 3: Dados de SEC de formulações de abatacept (25 mg/ml) preparadas

16 / 23 como pelo exemplo 1 a 40°C e 25°C Nome da Espécies de Baixo Peso Molecular (LMW) Amostra T0 40°C 25°C 0W 1W 2W 4W ∆2W ∆ 4W 2W 4W ∆ 2W ∆ 4W Aba-IV-1 0,0 0,3 0,3 0,6 0,3 0,6 0,1 0,3 0,1 0,3 Aba- IV-2 0,0 0,1 0,2 3,4 0,2 3,4 0,0 0,0 0,0 0,0 Aba- IV-3 0,0 0,6 1,3 0,8 1,3 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0 Aba- IV-4 0,0 0,4 3,7 7,1 3,7 7,1 0,1 0,0 0,1 0,0 W-indica semanas, T0 indica ponto de tempo ‘zero’, ∆-Delta indica mudança em um valor do ponto de tempo zero para um ponto de tempo específico Tabela 4: pH de formulações de abatacept (25 mg/ml) preparadas como pelo exemplo 1 a 40°C e 25°C Nome da pH Amostra T0 40°C 25°C 0W 4W ∆ pH 4W ∆pH Aba-IV-1 7,1 7,3 0,2 7,3 0,2 Aba- IV-2 6,8 8,1 1,3 6,7 0,1 Aba- IV-3 7,1 8,5 1,4 8,6 1,5 Aba- IV-4 6,8 7,9 1,1 8,0 1,2 W-indica semanas, T0 indica ponto de tempo ‘zero’, ∆-Delta indica mudança em um valor do ponto de tempo zero para um ponto de tempo específico Tabela 5: Inspeção visual dados de formulações de abatacept (25 mg/ml) preparadas como pelo exemplo 1 Nome da Inspeção visual Amostra T0 40°C 25°C 0W 2W 4W 2W 4W Aba-IV-1 Clara Clara Clara Clara Clara Aba- IV-2 Clara Clara Clara Clara Clara Aba- IV-3 Clara Ligeiramente Ligeiramente opalescente opalescente opalescente opalescente Aba- IV-4 Clara opalescente opalescente opalescente opalescente W-indica semanas Exemplo 2: Formulações de abatacept de alta concentração (~125 mg/ml) na presença de açúcar(es) e aminoácido(s)

[0071] Aproximadamente 120 mg/ml de abatacept em fundo de tampão de fosfato obtidos a partir da etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF) do processo à montante foram trocados de tampão no respectivo fundo de tampão. Após o que, vários excipientes tais como açúcares e aminoácidos foram adicionados às formulações de abatacept de alta concentração em

17 / 23 diferentes combinações e concentrações. Detalhes das formulações são dados na Tabela 6. Formulação de abatacept subcutânea aprovada pela FDA contém tampão de fosfato, 170 mg/ml de sacarose e Polaxâmero. Consequentemente, para manter uma referência padrão, a ~ 120 mg/ml de abatacept internamente em fundo de tampão de fosfato, 170 mg/ml de sacarose e 8 mg/ml de Polaxâmero foram adicionados à formulação.

[0072] Todas as formulações de abatacept de alta concentração foram submetidas a estudos de estabilidade acelerada a 30°C por duas semanas. Após o que, as amostras foram analisadas com relação às espécies de alto peso molecular (HMW) [resultados são mostrados na Tabela 7] usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e também verificadas com relação à mudança no pH [Tabela 8] e inspeção visual [Tabela 9]. Dispersão de luz de amostras de proteína a 333 nm foi também verificada usando nano gota e resultados são representados na Tabela 10. Tabela 6: Composições de várias formulações de abatacept de alta concentração (~ 120 mg/ml) preparadas como pelo exemplo 2 Nome da Composição Amostra Aba-Ref 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 170 mg/ml de sacarose, 8 mg/ml de polaxâmero pH 6,8-7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de 1 polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 10 mg/ml de arginina, 8 mg/ml de 2 polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 10 mg/ml de histidina, 10 mg/ml de 3 arginina, 10 mM de NaCl, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 125 mg/ml de sacarose, 5 mg/ml de 4 lisina, 10 mg/ml de glicina, 10 mg/ml de arginina, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 125 mg/ml de manitol, 5 mg/ml de 5 lisina, 10 mg/ml de glicina, 10 mg/ml de arginina, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 125 mg/ml de sorbitol, 5 mg/ml de 6 lisina, 10 mg/ml de glicina, 10 mg/ml de arginina, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de fosfato, 125 mg/ml de sacarose, 10 mg/ml de 7 histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 120 mg/ml de abatacept, tampão de citrato-fosfato, 125 mg/ml de manitol, 10 mg/ml 8 de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Tabela 7: Dados de SEC de formulações de abatacept de alta concentração

18 / 23 (~120 mg/ml) preparadas como pelo exemplo 2 Nome da Teor de dímero a 30°C Espécies de alto peso Espécies de baixo peso Amostra molecular a 30°C molecular a 30°C 0W 1W 2W 0W 1W 2W 0W 1W 2W Aba-Ref 97,8 92,9 88,7 2,2 7,1 11,0 0,0 0,0 0,3 Aba-SC-1 97,6 84,8 75,2 2,4 15,2 24,8 0,0 0,0 0,0 Aba-SC-2 97,6 89,2 71,3 2,3 13,0 28,6 0,0 0,0 0,2 Aba-SC-3 97,7 89,7 79,7 2,3 10,3 20,1 0,0 0,0 0,2 Aba-SC-4 97,6 79,6 55,5 2,4 5,8 17,3 0,0 14,6 27,2 Aba-SC-5 97,6 94,5 86,8 2,4 4,7 10,7 0,0 0,8 2,5 Aba-SC-6 97,6 87,7 69,7 2,4 6,5 12,5 0,0 0,0 10,1 Aba-SC-7 97,6 92,4 86,8 2,4 7,6 13,2 0,0 0,0 0,0 Aba-SC-8 97,7 94,4 92,6 2,3 5,6 7,5 0,0 0,0 0,0 W-indica semanas Tabela 8: pH de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 2 a 30°C Nome da pH a 30°C Amostra 0W 1W 2W ∆ pH a 2W Aba-Ref 7,0 6,8 6,8 -0,2 Aba-SC-1 7,3 7,1 7,2 -0,1 Aba-SC-2 6,9 6,8 6,8 -0,1 Aba-SC-3 7,3 7,2 7,2 -0,1 Aba-SC-4 7,1 6,6 6,6 -0,5 Aba-SC-5 7,1 7,2 7,8 0,7 Aba-SC-6 7,1 6,6 7,4 0,3 Aba-SC-7 7,3 7,1 7,1 -0,2 Aba-SC-8 7,5 7,4 7,4 -0,1 W-indica semanas, ∆-Delta indica mudança em um valor do ponto de tempo zero para um ponto de tempo especificado.

Tabela 9: Dados de inspeção visual de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 2 Nome da Inspeção visual 30°C Amostra 0W 1W 2W Aba-Ref Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-1 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-2 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-3 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor

19 / 23 Aba-SC-4 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-5 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-6 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-7 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor Aba-SC-8 Clara, incolor Clara, incolor Clara, incolor W-indica semanas Tabela 10: Dados de dispersão de luz a 333 nm (A333) de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 a 30°C Nome da Amostra Dados de dispersão de luz 30°C 0W 1W 2W Aba-Ref 0,1 0,1 0,2 Aba-SC-1 0,0 0,2 0,4 Aba-SC-2 0,0 0,1 0,0 Aba-SC-3 0,1 0,1 0,0 Aba-SC-4 0,0 0,1 0,1 Aba-SC-5 0,0 0,2 0,2 Aba-SC-6 0,1 0,1 0,1 Aba-SC-7 Aba-SC-8 0,1 0,1 0,0 Exemplo 3: Adição de excipientes durante etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF) em estabilidade de proteínas de fusão CTLA4-Ig de alta concentração

[0073] No exemplo 2, CTLA4-Ig purificada obtida a partir da etapa cromatográfica à jusante foi adicionalmente trocado de tampão para tampão de fosfato e concentrado por filtração de fluxo tangencial (TFF). Após o que, excipientes foram adicionados às formulações. Entretanto, diferente dessa estratégia convencional, vários açúcares tais como sacarose e manitol e aminoácido tais como histidina e glicina foram incorporados durante a própria TFF (isto é, antes da etapa de formulação ou antes de formulação da proteína como um medicamento). 8 a 15 mg/ml de concentração de proteína de fusão abatacept em tampão de acetato obtidos a partir da etapa cromatográfica foram submetidos a ultrafiltração para concentrar até 60 mg/ml. Após o que, as amostras foram submetidas a diafiltração em que meio de diafiltração continha tampão de fosfato (tampão de formulação) sem e com excipientes tais como açúcares e aminoácido(s), e em um outro experimento separado, o

20 / 23 meio de diafiltração sem açúcar e aminoácido(s) no tampão de fosfato foi experimentado.

Após a diafiltração, as amostras foram submetidas a segunda ultrafiltração para concentrar até 180 mg/ml a 200 mg/ml.

Essas amostras de alta concentração foram consideradas estáveis sem nenhuma partícula/agregado visível.

As amostras altamente concentradas foram adicionalmente diluídas para 125 mg/ml e alguns dos excipientes tais como açúcares, tensoativo e opcionalmente aminoácido tal como glicina foram adicionados para preparar uma formulação final. 8 mg/ml de polaxâmero foram adicionados à toda formulação final.

Detalhes das formulações são dados na Tabela 11. Após o que, todas as amostras foram submetidas a estudos de estabilidade acelerada a 30 ℃ por 2 semanas.

As amostras foram analisadas com relação às espécies de alto peso molecular (HMW) e forma de dímero ativo [resultados são mostrados na Tabela 12] usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e também verificadas com relação à mudança no pH [Tabela 13] e inspeção visual [Tabela 14]. Tabela 11: Composições de várias formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 Nome da Composição do tampão de Composição de formulação após TFF Amostra formulação durante TFF Aba-SC-9 20 mM de tampão de fosfato 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de fosfato, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato e 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 10 75 mg/ml de sacarose fosfato, 170 mg/ml de sacarose, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato e 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 11 75 mg/ml de sacarose fosfato, 100 mg/ml de sacarose, 10 mg/ml de lisina, 0,58 mg/ml de NaCl, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato, 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 12 75 mg/ml de manitol fosfato, 75 mg/ml de manitol, 6,6 mg/ml de sulfato de amônio, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato, 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 13 75 mg/ml de manitol fosfato, 100 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de glicina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

21 / 23 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 14 75 mg/ml de manitol, 10 fosfato, 75 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 15 75 mg/ml de manitol, 15 fosfato, 75 mg/ml de manitol, 15 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 16 75 mg/ml de manitol, 10 fosfato, 75 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 5 mg/ml de glicina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 17 75 mg/ml de manitol, 15 fosfato, 75 mg/ml de manitol, 15 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 5 mg/ml de glicina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 18 85 mg/ml de manitol, 10 fosfato, 85 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 19 85 mg/ml de manitol, 10 fosfato, 85 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 5 mg/ml de glicina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato; 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 20 85 mg/ml de manitol, 15 fosfato, 85 mg/ml de manitol, 15 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC- 20 mM de tampão de fosfato, 125 mg/ml de abatacept, 20 mM de tampão de 21 75 mg/ml de manitol, 10 fosfato, 75 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de mg/ml de histidina histidina, 10 mg/ml de prolina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2

Tabela 12: Dados de SEC de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 Nome da Amostra Teor de dímero a 30°C Espécies de alto peso Espécies de baixo molecular a 30°C peso molecular a 30°C 0W 2W 0W 2W 0W 2W Aba-SC-9 98,6 59,7 1,4 37,6 0 2,7 Aba-SC-10 98,6 87,6 1,4 12,4 0 0 Aba-SC-11 98,7 75,8 1,3 24,2 0 0 Aba-SC-12 98,2 87,3 1,8 12,6 0 0,1 Aba-SC-13 98,9 88,2 1,2 11,9 0 0 Aba-SC-14 98,8 91,2 1,2 8,8 0 0 Aba-SC-15 98,9 92,0 1,1 8,1 0 0 Aba-SC-16 98,8 91,7 1,2 8,3 0 0 Aba-SC-17 98,9 92,4 1,1 7,6 0 0 Aba-SC-18 98,9 91,7 1,1 8,3 0 0 Aba-SC-19 98,9 92,0 1,1 8,0 0 0 Aba-SC-20 98,8 92,3 1,2 7,7 0 0 Aba-SC-21 99,0 87,5 1,0 12,5 0 0

22 / 23 Tabela 13: Dados de pH de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 Nome da Amostra pH a 30°C 0W 2W ∆ pH a 2 W Aba-SC-9 6,9 6,1 -0,8 Aba-SC-10 7,0 6,9 -0,1 Aba-SC-11 6,8 6,8 0 Aba-SC-12 7,0 7,1 0,1 Aba-SC-13 NT NT NA Aba-SC-14 7,0 6,9 -0,1 Aba-SC-15 7,0 7,1 0,1 Aba-SC-16 7,1 7,2 0,1 Aba-SC-17 7,0 7,1 0,1 Aba-SC-18 7,1 7,2 0,1 Aba-SC-19 7,0 7,1 0,1 Aba-SC-20 7,0 7,1 0,1 Aba-SC-21 7,1 7,2 0,1 W-indica-semanas, NT-Não testado por causa de restrição de amostra; NA-não aplicável Tabela 14: Dados de inspeção visual de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 Nome da Inspeção visual a 30°C Amostra 0W 2W Aba-SC-9 Clara Túrbido Aba-SC-10 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-11 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-12 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-13 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-14 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-15 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-16 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-17 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-18 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-19 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-20 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível Aba-SC-21 Clara, incolor, nenhuma partícula visível Clara, incolor, nenhuma partícula visível

[0074] A viscosidade de algumas das formulações de abatacept (Aba- SC-14 e Aba-SC-18) preparadas como pelo exemplo 3 foi medida usando

23 / 23 viscosímetro m-VROC® e a viscosidade das formulações (Aba-SC-14 e Aba- SC-18) foi considerada 9,0 mPa(s). Exemplo 4: Estabilidade coloidal de formulações de abatacept de alta concentração de proteína

[0075] Abatacept, formulações contendo açúcar e aminoácido foram submetidos a dispersão de luz dinâmica (DLS) para medir o coeficiente de difusão, diâmetro hidrodinâmico que é indicativo de solubilidade de abatacept. As medições de DLS por sua vez dão informação a respeito de estabilidade coloidal de uma molécula de proteína. Resultados das mesmas são representados na Tabela-15. Tabela 15: Dados de dispersão de luz dinâmica (DLS) de formulações de abatacept de alta concentração preparadas como pelo exemplo 3 Nome da Composição Raios Coeficiente de difusão Amostra hidrodinâmico (Cm2(s)) (Rh) (nm) 0W 4 W a 0W [0076] 30 ℃ W a3 30 ℃ Aba-SC-14 125 mg/ml de abatacept, 5,7 5,9 4,34E-07 4,20E-07 20 mM de tampão de fosfato, 75 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC-18 125 mg/ml de abatacept, 5,6 5,4 4,37E-07 4,60E-07 20 mM de tampão de fosfato, 85 mg/ml de manitol, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero, pH 7,2 Aba-SC-22 125 mg/ml de abatacept, 10,0 12,7 2,49E-07 2,00E-07 20 mM de tampão de fosfato, 100 mg/ml de sacarose, 10 mg/ml de histidina, 8 mg/ml de polaxâmero

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação farmacêutica estável de uma proteína de fusão CTLA4-Ig, caracterizada pelo fato de que compreende um tampão, poliol, aminoácido e tensoativo, e em que a formulação é desprovida de sacarose.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão de proteína de fusão CTLA4-Ig para poliol é 1:0,7 ou menos, a razão de proteína de fusão CTLA4-Ig para aminoácido é 1:0,1 ou menos.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração de formulação de proteína de fusão CTLA4- Ig é de cerca de 20 mg/ml a cerca de 200 mg/ml.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da formulação é de 6,0 a 8,0, preferivelmente 6,5 a 7,5.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a viscosidade da formulação é menor que 15 cp, preferivelmente menor que 10 cp.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão em formulação é estável a 30°C por pelo menos duas semanas e contém menos que cerca de 10% de molécula de proteína de fusão em forma agregada, e preferivelmente menos que 7,5% de proteína de fusão em forma agregada.

7. Formulação estável de proteína de fusão CTLA4-Ig, caracterizada pelo fato de que compreende tampão de fosfato, manitol, histidina e tensoativo, e em que a formulação é desprovida de sacarose.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a concentração de manitol é cerca de 80 mg/ml e a concentração de histidina é entre 10 mg/ml a 15 mg/ml.

9. Método para obter uma formulação estável de proteína de fusão CTLA4-Ig, caracterizado pelo fato de que compreende adição de tampão, poliol, histidina e tensoativo, e em que histidina e poliol são também adicionados às etapas de processo de pré-formulação de ultrafiltração e diafiltração.

10. Método para aumentar a estabilidade de proteína de fusão CTLA4-Ig, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de expressão e purificação de proteína de fusão CTLA4-Ig; concentração e/ou troca de tampão da proteína por ultrafiltração e diafiltração (UF – DF), em que o tampão usado na(s) etapa(s) de UF e/ou DF inclui histidina e poliol; seguido por formulação da proteína em um tampão compreendendo histidina, poliol e tensoativo; em que a estabilidade da proteína é aumentada comparada à formulação da proteína que foi processada pelas etapas de UF-DF sem a inclusão de histidina e poliol em seu tampão.