BR112020001363A2

BR112020001363A2 - formulações de hemopexina

Info

Publication number: BR112020001363A2
Application number: BR112020001363-3A
Authority: BR
Inventors: Thomas GENTINETTA; Nathan Brinkman; David BOEREMA; Bo An; Kyle MINER
Original assignee: Csl Behring Ag
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2020-08-11
Also published as: IL272167B1; US20200237652A1; SG11202000210UA; IL272167B2; AU2018314767B2; AU2018314767A1; IL272167A; WO2019030262A1; ZA202000807B; EP3664893A1; CA3071930A1; KR20200038507A; CN111432880A; JP2020530027A; JP2023100902A

Abstract

A presente invenção refere-se, em geral, a uma formulação líquida estável de hemopexina purificada, compreendendo: (a) um teor de hemopexina de pelo menos 50 mg/mL; (b) pelo menos 15 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 5,8 a 8; e (d) pelo menos 50 mM de cloreto de sódio; e aos seus usos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES DE HEMOPEXINA".

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se, em geral, a uma formulação líquida estável de hemopexina e seus usos.

ANTECEDENTES

[002] A hemólise é caracterizada pela destruição dos glóbulos vermelhos e é uma marca registrada de distúrbios anêmicos associados a anormalidades nos glóbulos vermelhos, como defeitos enzimáticos, hemoglobinopatias, esferocitose hereditária, hemoglobinúria paroxística noturna e anemia de acantócitos, assim como fatores extrínsecos, como esplenomegalia, distúrbios autoimunes (por exemplo, Doença hemolítica do recém-nascido), distúrbios genéticos (por exemplo, Doença da célula falciforme ou deficiência de G6PD), hemólise microangiopática, infecção bacteriana Gram-positiva (por exemplo, Streptococcus, Enterococcus e Staphylococcus), infecção por parasitas (por exemplo, Plasmodium), toxinas e trauma (por exemplo, queimaduras). A hemólise também é um distúrbio comum das transfusões sanguíneas, particularmente as transfusões sanguíneas maciças e em pacientes que utilizam um suporte cardiopulmonar extracorpóreo.

[003] Os efeitos adversos observados em pacientes com condições associadas à hemólise são amplamente atribuídos à liberação de ferro e de compostos contendo ferro, como a hemoglobina (Hb) e a heme, dos glóbulos vermelhos. Sob condições fisiológicas, a hemoglobina liberada é ligada por proteínas solúveis, como a haptoglobina, e transportada para os macrófagos e os hepatócitos. No entanto, onde a incidência de hemólise for acelerada e se tornar de natureza patológica, a capacidade de tamponamento da haptoglobina é oprimida. Como resultado, a hemoglobina é rapidamente oxidada para ferri-hemoglobina que, por sua vez, libera a heme livre (compreendendo protoporfirina IX e ferro). Embora a heme desempenhe um papel crítico em vários processos biológicos (por exemplo, como parte de proteínas essenciais, como a hemoglobina e a mioglobina), a heme livre é altamente tóxica. A heme livre é uma fonte de ferro ativo na redox, que produz espécies de oxigênio reativas (ROS) altamente tóxicas que danificam as membranas lipídicas, as proteínas e os ácidos nucleicos. A toxicidade da heme é ainda mais exacerbada por sua capacidade de se intercalar nas membranas lipídicas, onde causa oxidação dos componentes da membrana e promove a lise e a morte das células.

[004] A pressão evolutiva da exposição extracelular de baixo nível contínua da Hb/heme levou a mecanismos compensatórios que controlam os efeitos adversos da Hb/heme livre, sob condições fisiológicas em estado estacionário e durante a hemólise leve. Esses sistemas incluem a liberação de um grupo de proteínas plasmáticas que ligam a Hb ou a heme, incluindo a haptoglobina (Hp) removedora de Hb e as proteínas removedoras de heme hemopexina (Hpx) e α1- microglobulina.

[005] A hemopexina é uma β-1B-glicoproteína plasmática de 61kDa, composta de uma única cadeia peptídica de 439 aminoácidos de comprimento, que é formada por dois domínios de hélice β com quatro pás, sendo parecidos com dois discos grossos que se prendem em um ângulo de 90° e são unidos por um peptídeo ligador entre os domínios, como mostrado na Figura 1 (Mauk, 2011; Protein Science, Volume 20, pp. 791 - 805). A heme, que é liberada no sangue como resultado da hemólise intra- e extravascular, é ligada entre os dois domínios de hélice β com quatro pás em um saco formado pelo peptídeo ligador entre os domínios. Os resíduos His213 e His266 coordenam o átomo de ferro da heme, proporcionando um complexo de bis-histidial estável, semelhante à hemoglobina.

[006] A hemopexina contém cerca de 20% de carboidratos, incluindo o ácido siálico, a manose, a galactose e a glucosamina. Doze resíduos de cisteína foram encontrados na sequência da proteína, provavelmente explicando as seis pontes de dissulfeto. A hemopexina representa a principal linha de defesa contra a toxicidade da heme, graças à sua capacidade de ligar a heme com alta afinidade (Kd <1 pM) e funcionar como um transportador específico da heme a partir da corrente sanguínea até o fígado. Ela liga a heme em uma razão equimolar, porém não há evidências de que a heme seja covalentemente ligada à proteína.

[007] Além da ligação à heme, também foi relatado que as preparações de hemopexina possuem atividade de serina protease (Lin et al., 2016; Molecular Medicine 22: 22-31,2016) e várias outras funções, como a exibição de atividades anti- e pró-inflamatórias, a inibição da adesão celular e a ligação de certos íons de metais divalentes.

[008] Embora a hemopexina endógena possa controlar os efeitos adversos da heme livre, sob condições fisiológicas no estado estacionário, ela tem pouco efeito na manutenção dos níveis de heme no estado estacionário, sob condições patofisiológicas, como as associadas à hemólise, onde um alto nível de heme leva à depleção de hemopexina endógena, causando danos ao tecido oxidativo mediado pela heme. Estudos têm demonstrado que a infusão de hemopexina alivia a ativação endotelial induzida pela heme, a inflamação e a lesão oxidativa em modelos experimentais de camundongos de distúrbios hemolíticos, como a doença da célula falciforme (SCD) e a β-talassemia. A administração de hemopexina também tem sido demonstrada reduzir significativamente o nível de citocinas pró-inflamatórias e neutralizar a vasoconstrição induzida pela heme em animais hemolíticos. No entanto, embora a hemopexina purificada mostre um potencial terapêutico importante, ela sofre de baixa estabilidade como uma preparação líquida.

[009] A presente divulgação resolve, ou pelo menos minora parcialmente, esse problema proporcionando uma formulação líquida estável de hemopexina que é adequada para uso terapêutico.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0010] Em um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de pelo menos 50 mg/mL; (b) pelo menos 15 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 5,8 a 8; e (d) pelo menos 50 mM de cloreto de sódio.

[0011] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento de uma condição associada à hemólise, o método compreendendo a administração a um paciente que necessita dele da formulação líquida de hemopexina purificada, como divulgada neste documento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0012] A Figura 1 é uma representação esquemática da estrutura do complexo de heme-hemopexina, mostrando o domínio C da hélice β (cinza claro), o domínio N (cinza escuro), a sequência do ligador e a heme. Também são indicados o motivo de ligação do ácido hialurônico [348-358 (cinza escuro)] localizado no domínio C da hélice β, a sequência Arg-Gly-Glu [128-130 (seta)] na interface dos domínios N e C e a localização do epítopo de JEN14.

[0013] A Figura 2 mostra um registro típico da intensidade relativa de fluorescência (RFU) versus temperatura para o desdobramento da proteína na presença de laranja SYPRO. A Tm é determinada pelo ponto médio da curva de fusão (barra horizontal cinza). Hpx formulada em PBS, pH 7,4 (linha tracejada, Tm = 53,0 C) e Hpx formulada em citrato fosfato, pH 7,4 (linha cheia, Tm 60,5°C).

[0014] A Figura 3 mostra a caracterização bioquímica da hemopexina (Hpx) derivada de plasma humano. A: Análise por SDS- PAGE da batelada de Hpx TO290016 (20 - 1,25 µg) sob condições redutoras e não redutoras. O marcador de PM foi carregado no caminho 1 para ambas as condições; as bandas foram visualizadas por Coloração com Coomassie (SimplyBlue; Invitrogen); B: Análise por 2D-PAGE: as amostras de hemopexina (5 μg) foram separadas por tiras de gradientes de pH imobilizadas (pI 3-10, Invitrogen), seguido por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. As manchas foram visualizadas por coloração com azul coloidal (SimplyBlue; Invitrogen), as múltiplas bandas de Hpx estão marcadas dentro da caixa; C: Distribuição do tamanho molecular de 10% de Hpx não tratada (linha cheia) e envelhecida ("envelhecida", 3 meses a 37 °C; linha tracejada), analisada por SEC-HPLC (Coluna: YMC Pack Diol-300, 5 µm, 300 x 8 mm). A massa molar de cada espécie foi determinada em linha com um detector MALS (Dawn HELEOS, Wyatt Technologies) e Rl (Optilab T-rEX, Wyatt Technolgies) (linha cinza claro); D: As diferentes concentrações de hemopexina (formulada em PBS, pH 7,4) e as viscosidades correspondentes foram plotadas e comparadas com uma curva de viscosidade de IgG policlonal (triângulos). As medições da viscosidade foram realizadas em duplicatas sobre um reômetro rotacional a 25°C (HAAKE, ThermoScientific).

[0015] A Figura 4 mostra a avaliação dos dados de DSF. A: Visualização de Tm e dos tipos de tampões correspondentes em um gráfico de dispersão. O tampão Tipo A (PBS, pH 7,4) serve como formulação de referência. As diferentes concentrações de sal (NaCI) nos tampões mais estáveis (círculos tracejados a-c) são destacadas por diferentes tons de cinza, onde os pontos de dados mais baixos dentro dos círculos tracejados são representativos da menor concentração de sal (50-150 mM de NaCI) e os pontos de dados mais altos dentro dos círculos tracejados são representativos da maior concentração de sal (150-250 mM de NaCl); (a) Citrato fosfato, (b) fosfato de sódio, (c) tampão de glicina. B: Visualização da dependência no cloreto de sódio de todas as condições analisadas. A média em cada concentração é mostrada como uma linha. C: Gráfico de densidade de Tm contra o pH; D: Visualização da Tm e das correspondentes concentrações de sal (NaCl) em amostras formuladas com citrato fosfato. A PBS serve como formulação de referência (asterisco) e os 200 mM de citrato fosfato, o NaCI a 150 mM é mostrado como um círculo aberto. As diferentes concentrações do tampão são destacadas por diferentes tons de cinza, com uma diminuição na concentração do tampão de cima para baixo (100 mM - 15 mM de citrato fosfato). Cada condição foi medida pelo menos três vezes; as barras de erro estão indicando o desvio padrão.

[0016] A Figura 5 mostra a estabilidade térmica na presença de diferentes açúcares, por DSF. Visualização da Tm e dos tipos de tampão correspondentes em um gráfico de dispersão. As diferentes concentrações de açúcar nos três tampões diferentes analisados estão em diferentes tons de cinza.

[0017] A Figura 6 mostra a estabilidade térmica na presença de diferentes aminoácidos, por DSF. Visualização da Tm e dos aminoácidos correspondentes em tampão de citrato fosfato, em um gráfico de dispersão. Cada aminoácido foi testado em duas concentrações diferentes (exceto o Ácido glutâmico, onde apenas 50 μΜ foram analisados).

[0018] A Figura 7 mostra os dados da análise por SEC-HPLC sobre a estabilidade induzida por tensão física. A: Hpx formulada em

PBS, pH 7,4, em diferentes concentrações de P80; B: Hpx formulada em citrato fosfato, pH 7,4, em diferentes concentrações de P80. A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0019] A Figura 8 são fotografias de géis de SDS-PAGE para amostras executadas após o tratamento com diferentes tensões físicas induzidas. A: As amostras de Hpx formuladas em PBS, pH 7,4, foram analisadas sob condições redutoras (painel superior, 500 mM de ditiotreitol, DTT) e não redutoras (painel inferior). B: As amostras de Hpx formuladas em citrato fosfato, pH 7,4, foram analisadas sob condições redutoras (painel superior, 500 mM de ditiotreitol, DTT) e não redutoras (inferior). U: não tratada; A: agitada; F/T: Ciclos de congelar/descongelar.

[0020] A Figura 9 mostra a ligação da heme à hemopexina sob tensão física induzida. A: PBS, 140 mM de NaCl, pH 7,4; e B: Hpx formulada em citrato fosfato, pH 7,4, em diferentes concentrações de P80. A ligação da heme é mostrada em porcentagem após os tratamentos, conforme indicado; Não tratada - círculos abertos; Agitada - quadrados pretos; congelar/descongelar - triângulos cinzas.

[0021] A Figura 10 mostra os dados de SEC-HPLC de uma solução de Hpx a 10% formulada na ausência de P80 (sem P80) e com diferentes concentrações de P80 (0,1 - 0,001% v/v) em PBS e analisados por 3 meses. Armazenada em A: 37 °C e B: 25 °C (TA). A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0022] A Figura 11 mostra a capacidade de ligação à heme de uma solução de Hpx a 10% formulada na ausência de P80 (sem, triângulos) e com diferentes concentrações de P80 (0,1 - 0,001% v/v) em PBS e analisada durante 3 meses. Armazenada em A: 37 °C e B: 25°C (TA).

[0023] A Figura 12 mostra os dados de SEC-HPLC de uma solução de Hpx a 10% formulada com diferentes tampões e analisada por 6 meses em armazenamento sob condições aceleradas (37°C) e por até 24 meses em armazenamento na temperatura ambiente (TA) e a 2-8°C. A: 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7,2; B: 200 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, pH 7,2; C: 100 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7,6; D: 100 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, pH 7,6; E: 300 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7,6; F: PBS, 140 mM de NaCl, pH 7,4. Todas as formulações (exceto a PBS) contêm P80 a 0,002% v/v. A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0024] A Figura 13 mostra fotografias de géis de SDS-PAGE com amostras a partir do tempo zero, 6 e 12 meses. A-C: As amostras foram analisadas sob condições redutoras (500 mM de ditiotreitol, DTT). D-F: As amostras foram analisadas sob condições não redutoras. 15 μg de proteína foram carregados para cada caminho. Cada formulação foi analisada no tempo zero, 6 e 12 meses de armazenamento, conforme indicado. O marcador de peso molecular é mostrado no caminho à esquerda, valores de kDa conforme indicados na figura. Caminho 1 - marcador de peso molecular, Caminho 2 - 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,2; Caminho 3 - 200 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,2; Caminho 4 - 100 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,6; Caminho 5 - 100 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,6; Caminho 6 - 300 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,6; Caminho 7 - PBS, pH 7,4.

[0025] A Figura 14 mostra a ligação da heme à hemopexina. A-C: Ligação da heme mostrada em porcentagem em cada ponto de tempo (linha cheia) para as amostras armazenadas a 2-8°C (C), TA (B) e 37°C (A). A porcentagem correspondente de monômeros nos pontos de tempo dados é mostrada na mesma cor para cada formulação (linhas tracejadas); D: Correlação geral entre a ligação da heme e os monômeros de Hpx. N = 144, correlação não paramétrica de Spearman, r = 0,83.

[0026] A Figura 15 mostra os dados de SEC-HPLC de uma solução de Hpx a 10% formulada com diferentes tampões e analisada por 6 meses (armazenada a 37°C) e 24 meses (armazenamento na TA e a 2-8°C). A: 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7,2; B: 15 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, pH 7,2; C: 50 mM de citrato fosfato, 200 mM de NaCl, pH 7,2; D: 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, pH 7,2; E: 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7,2. Todas as formulações contêm P80 a 0,01% v/v. A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0027] A Figura 16 mostra fotografias de géis de SDS-PAGE com amostras a partir do tempo zero, 6 e 12 meses. As amostras foram analisadas sob condições redutoras (500 mM de ditiotreitol, DTT). 15 μg de proteína foram carregados para cada caminho. Cada formulação foi analisada no tempo zero (esquerda superior), armazenamento de 6 e 12 meses, conforme indicado. O marcador de peso molecular é mostrado no caminho à direita, valores de kDa, conforme indicados na figura; Caminho 1 - 15 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 2 - 50 mM de citrato fosfato, 200 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 3 - 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 4 - 30 mM de citrato fosfato, 500 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 5 - 75 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 6 - 100 mM de citrato fosfato, 200 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 7 - 100 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 8 - 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 9 - 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 10 - marcador de peso molecular.

[0028] A Figura 17 mostra fotografias de géis de SDS-PAGE com amostras a partir do tempo zero, 6 e 12 meses. As amostras foram analisadas sob condições não redutoras. 15 μg de proteína foram carregados em cada caminho. Cada formulação foi analisada no tempo zero (esquerda superior), armazenamento de 6 e 12 meses, conforme indicado. O marcador de peso molecular é mostrado no caminho à direita, valores de kDa, conforme indicados na figura; Caminho 1 - 15 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 2 - 50 mM de citrato fosfato, 200 mM de NaCl, P80 a

0,01%, pH 7,2; Caminho 3 - 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 4 - 30 mM de citrato fosfato, 500 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 5 - 75 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 6 - 100 mM de citrato fosfato, 200 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 7 - 100 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 8 - 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 9 - 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Caminho 10 - marcador de peso molecular.

[0029] A Figura 18 mostra a ligação da heme à hemopexina. Ligação da heme mostrada em porcentagem em cada ponto de tempo (linha cheia) para as amostras armazenadas a 37 °C (A), TA (B) e 2- 8°C (C). A porcentagem correspondente de monômeros nos pontos de tempo dados é mostrada na mesma cor para cada formulação (linhas tracejadas).

[0030] A Figura 19 mostra o comportamento da viscosidade em altas concentrações proteicas da hemopexina humana derivada de plasma. As formulações de diferentes concentrações de hemopexina foram preparadas (Formulação 1: 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Formulação 2: 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Formulação 3: 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2; Formulação 4: PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4) e as suas viscosidades foram comparadas a uma curva de viscosidade de IgG policlonal (triângulo). As medições da viscosidade foram realizadas em duplicatas, sobre um reômetro rotacional (HAAKE, ThermoScientific), a 25 °C.

[0031] A Figura 20 mostra a tendência de ΔG usando o sistema de desnaturação química automatizado HUNK. Uma curva de desnaturação de 36 pontos em ureia a 0-8M foi gerada para a Hpx nas concentrações de 0,25, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 250 e 300 mg/mL.

Cada curva representa uma única execução para cada formulação.

[0032] A Figura 21 mostra os dados de SEC-HPLC de diferentes formulações de Hpx concentradas 1 (200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2) e que foram analisadas por 6 meses (A: 300; B: 250; C: 200 e D: 100 g/L). A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0033] A Figura 22 mostra os dados de SEC-HPLC de diferentes formulações de Hpx concentradas 2 (50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2) e que foram analisadas por 6 meses (A: 300; B: 250; C: 200 e D: 100 g/L). A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0034] A Figura 23 mostra os dados de SEC-HPLC de diferentes formulações de Hpx concentradas 3 (15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2) e que foram analisadas por 6 meses (A: 300; B: 250; C: 200 e D: 100 g/L). A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Barras tracejadas - a formulação não pôde ser analisada devido à gelificação após um determinado período. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

[0035] A Figura 24 mostra os dados de SEC-HPLC de diferentes formulações de Hpx concentradas 4 (PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4) e que foram analisadas por 6 meses (A: 300; B: 250; C: 200 e D: 100 g/L). A distribuição do tamanho molecular é apresentada como um gráfico de colunas empilhadas até 100% e cada espécie molecular é mostrada como a respectiva quantidade em porcentagem. Barras tracejadas - a formulação não pôde ser analisada devido à gelificação após um determinado período. Os agregados e os dímeros são destacados na parte inferior de cada coluna (preto e cinza, respectivamente); os fragmentos são mostrados na parte superior de cada coluna (cinza).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0036] Em todo este relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "compreender" ou as variações, como "compreende" ou "compreender", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros mencionado, porém não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.

[0037] A referência neste relatório descritivo a qualquer publicação anterior (ou informação dela derivada), ou a qualquer assunto que seja conhecido, não é, e não deve ser, considerado como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão que a publicação anterior (ou a informação dela derivada) ou o assunto conhecido faça parte do conhecimento geral comum no campo de empenho ao qual este relatório descritivo se refere.

[0038] Deve-se observar que, conforme usadas no relatório descritivo apresentado, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os aspectos plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma condição associada à hemólise" inclui uma única condição, bem como duas ou mais condições; a referência a "um agente" inclui um único agente, bem como dois ou mais agentes; e assim por diante.

[0039] Na ausência de qualquer indicação em contrário, a referência feita a um teor em "%" ao longo deste relatório descritivo deve ser considerada como significando % p/v (peso/volume). Por exemplo, uma formulação líquida compreendendo um teor de hemopexina de pelo menos 10% é considerada significar uma formulação líquida compreendendo um teor de hemopexina de pelo menos 10% p/v (i.e., de pelo menos 100 mg/mL).

[0040] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta dos inventores que certas condições podem ser modificadas para aumentar a estabilidade da hemopexina em uma formulação líquida dela.

[0041] Assim, em um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de pelo menos 50 mg/mL; (b) pelo menos 15 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 5,8 a 8; e (d) pelo menos 50 mM de cloreto de sódio. Hemopexina

[0042] A hemopexina representa a principal linha de defesa contra a toxicidade da heme, atribuída, pelo menos em parte, à sua capacidade de ligar a heme com alta afinidade (Kd <1 pM) e funcionar como uma transportadora específica da heme da corrente sanguínea para o fígado. Também tem sido relatado que a hemopexina possui atividade de serina protease e várias outras funções, como atividades anti e pró-inflamatórias, a capacidade de inibir a adesão celular e a ligação de certos íons de metais divalentes. Algumas das características da hemopexina estão resumidas na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. tamanho [kDa]: ~ 61 ± 2 comprimento: 439 aminoácidos, cadeia polipeptídica única pontes de dissulfeto : 6 teor de carboidratos [%]: 20-22 Estrutura: dobra da hélice β com quatro pás e 2 domínios Saco de ligação à heme: entre os dois domínios, altamente hidrofóbico Afinidade pela heme, Kd : < 1 pM Coeficiente de extinção por UV a 280 1,97 nm [mL/(mg×cm)]: pl teórico: 6,55 Média de hidrofobicidade: -0,43 (sem segmentos hidrofóbicos de alta pontuação)

[0043] O teor de hemopexina da formulação líquida pode depender do uso pretendido. Por exemplo, onde a formulação líquida deva ser administrada a um paciente que necessita dela como uma composição pura (isto é, sem diluição adicional), o teor de hemopexina será tipicamente adequado para a administração direta, levando em consideração, por exemplo, fatores como a dosagem necessária e o volume a ser administrado. Como um exemplo, o teor de hemopexina pode ser otimizado de modo tal que ele seja alto o suficiente para minimizar o volume da formulação líquida a ser administrada ao paciente, tendo em conta a dose terapêutica desejada, e baixo o suficiente para minimizar a viscosidade da formulação líquida para permitir a administração sem diluição adicional. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, o teor de hemopexina é otimizado de modo a minimizar a viscosidade da formulação líquida,

de forma tal que ela seja adequada para a administração sem diluição adicional. As viscosidades adequadas serão conhecidas para os especialistas na técnica e provavelmente dependerão de fatores como a rota e/ou o volume de administração. É observado em W. Du e A. Klibanov, "Hydrophobic Salts Markedly Diminish Viscosity of Concentrated Protein Solutions", Biotechnology and Bioengineering, pp. 632-636, 2011, que o limite para as injeções subcutâneas de formulações contendo proteínas pode ser tão alto quanto 50 mPa*s. Em uma modalidade particular divulgada neste documento, a formulação líquida compreende uma viscosidade de menos do que, ou igual a, 50 mPa*s, a 25°C. Em uma modalidade preferida divulgada neste documento, a formulação líquida compreende uma viscosidade de menos do que, ou igual a, 20 mPa*s, a 25°C.

[0044] Onde a formulação líquida deva ser administrada a um paciente que necessita dela como uma composição pura (isto é, sem diluição adicional), as dosagens adequadas de hemopexina purificada serão conhecidas para os especialistas na técnica e provavelmente dependerão de fatores como a natureza e a gravidade da condição hemolítica a ser tratada (por exemplo, nível de heme livre endógena), a idade, peso e sexo do paciente a ser tratado, a presença de quaisquer outras condições subjacentes e as combinações dos precedentes.

[0045] A referência a "pelo menos 50 mg/mL" inclui 50 mg/mL, 55 mg/mL, 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL, 90 mg/ml, 95 mg/ml, 100 mg/ml, 105 mg/ml, 110 mg/ml, 115 mg/ml, 120 mg/ml, 125 mg/ml, 130 mg/ml, 135 mg/mL, 140 mg/mL, 145 mg/mL, 150 mg/mL, 155 mg/mL, 160 mg/mL, 165 mg/mL, 170 mg/mL, 175 mg/mL, 180 mg/mL, 185 mg/mL, 190 mg/mL, 195 mg/mL, 200 mg/mL, 205 mg/mL, 210 mg/mL, 215 mg/mL, 220 mg/mL, 225 mg/mL, 230 mg/mL, 235 mg/mL, 240 mg/mL, 245 mg/mL, 250 mg/mL,

255 mg/mL, 260 mg/mL, 265 mg/mL, 270 mg/mL, 275 mg/mL, 280 mg/mL, 285 mg/mL, 290 mg/mL, 295 mg/mL, 300 mg/mL, 305 mg/mL, 310 mg/mL, 315 mg/mL, 320 mg/mL, 325 mg/mL, 330 mg/mL, 335 mg/mL, 340 mg/mL, 345 mg/mL, 350 mg/mL, 355 mg/mL, 360 mg/mL, 365 mg/mL, 370 mg/mL, 375 mg/mL, 380 mg/mL, 385 mg/mL, 390 mg/mL, 400 mg/mL, 405 mg/mL e assim por diante.

Assim, nas formas preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende um teor de hemopexina de pelo menos 50 mg/mL, preferivelmente pelo menos 55 mg/mL, preferivelmente pelo menos 60 mg/mL, preferivelmente pelo menos 65 mg/mL, preferivelmente pelo menos 70 mg/mL, preferivelmente pelo menos 75 mg/mL, preferivelmente pelo menos 80 mg/mL, preferivelmente pelo menos 85 mg/mL, preferivelmente pelo menos 90 mg/mL, preferivelmente pelo menos 95 mg/mL, preferivelmente pelo menos 100 mg/mL, preferivelmente pelo menos 105 mg/mL, preferivelmente pelo menos 110 mg/mL, preferivelmente pelo menos 115 mg/mL, preferivelmente pelo menos 120 mg/mL, preferivelmente pelo menos 125 mg/mL, preferivelmente pelo menos 130 mg/mL, preferivelmente pelo menos 135 mg/mL, preferivelmente pelo menos 140 mg/mL, preferivelmente pelo menos 145 mg/mL, preferivelmente pelo menos 150 mg/mL, preferivelmente pelo menos 155 mg/mL, preferivelmente pelo menos 160 mg/mL, preferivelmente pelo menos 165 mg/mL, preferivelmente pelo menos 170 mg/mL, preferivelmente pelo menos 175 mg/mL, preferivelmente pelo menos 180 mg/mL, preferivelmente pelo menos 185 mg/mL, preferivelmente pelo menos 190 mg/mL, preferivelmente pelo menos 195 mg/mL, preferivelmente pelo menos 200 mg/mL, preferivelmente pelo menos 205 mg/mL, preferivelmente pelo menos 210 mg/mL, preferivelmente pelo menos 215 mg/mL, preferivelmente pelo menos 220 mg/mL, preferivelmente pelo menos 225 mg/mL, preferivelmente pelo menos 230 mg/mL, preferivelmente pelo menos 235 mg/mL,

preferivelmente pelo menos 240 mg/mL, preferivelmente pelo menos 245 mg/mL, preferivelmente pelo menos 250 mg/mL, preferivelmente pelo menos 255 mg/mL, preferivelmente pelo menos 260 mg/mL, preferivelmente pelo menos 265 mg/mL, preferivelmente pelo menos 270 mg/mL, preferivelmente pelo menos 275 mg/mL, preferivelmente pelo menos 280 mg/mL, preferivelmente pelo menos 285 mg/mL, preferivelmente pelo menos 290 mg/mL, preferivelmente pelo menos 295 mg/mL, preferivelmente pelo menos 300 mg/mL, preferivelmente pelo menos 305 mg/mL, preferivelmente pelo menos 310 mg/mL, preferivelmente pelo menos 315 mg/mL, preferivelmente pelo menos 320 mg/mL, preferivelmente pelo menos 325 mg/mL, preferivelmente pelo menos 330 mg/mL, preferivelmente pelo menos 335 mg/mL, preferivelmente pelo menos 340 mg/mL, preferivelmente pelo menos 345 mg/mL, preferivelmente pelo menos 350 mg/mL, preferivelmente pelo menos 355 mg/mL, preferivelmente pelo menos 360 mg/mL, preferivelmente pelo menos 365 mg/mL, preferivelmente pelo menos 370 mg/mL, preferivelmente pelo menos 375 mg/mL, preferivelmente pelo menos 380 mg/mL, preferivelmente pelo menos 385 mg/mL, preferivelmente pelo menos 390 mg/mL, preferivelmente pelo menos 400 mg/mL, preferivelmente pelo menos 405 mg/mL, e assim por diante.

[0046] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 75 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 75 mg/mL a 250 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 75 mg/mL a 200 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 75 mg/mL a 150 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 100 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 150 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 200 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 250 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 100 mg/mL a 200 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 300 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 250 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 200 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 100 mg/mL a 200 mg/mL de hemopexina. Ainda em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende cerca de 100 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 100 mg/mL de hemopexina.

[0047] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida da presente invenção tem um volume de pelo menos 5 mL e compreende pelo menos 75 mg/mL de hemopexina. Em outra modalidade, a formulação líquida tem um volume de pelo menos 5 mL e compreende pelo menos 100 mg/mL ou pelo menos 200 mg/mL de hemopexina. Em modalidades particulares, a formulação líquida tem um volume de pelo menos 5 mL e compreende hemopexina em uma concentração de cerca de 100 mg/mL, cerca de 125 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 225 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 275 mg/mL, cerca de 300 mg/mL, cerca de 325 mg/mL, cerca de 350 mg/mL, cerca de 375 mg/mL ou cerca de 400 mg/mL. Em outro aspecto, é proporcionado um vaso contendo pelo menos 5 mL de uma formulação líquida estável de hemopexina purificada, em que a concentração de hemopexina é pelo menos 100 mg/mL ou pelo menos 200 mg/mL ou pelo menos 250 mg/mL ou pelo menos 300 mg/mL. Em outro aspecto, é proporcionado um vaso contendo pelo menos 5 mL de uma formulação líquida estável de hemopexina purificada, em que a concentração de hemopexina é 100 mg/mL ou 200 mg/mL ou 250 mg/mL ou 300 mg/mL.

[0048] Em outras modalidades, a formulação líquida pode ser preparada como um concentrado de hemopexina, em que o concentrado deve ser diluído para a administração. Uma das vantagens de preparar a formulação líquida como um concentrado de hemopexina é que ele minimiza o volume para armazenamento. O concentrado pode ser diluído antes ou durante a administração ao paciente, conforme desejado. As concentrações adequadas de hemopexina purificada que podem ser preparadas como um concentrado serão conhecidas para os especialistas na técnica. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende um teor de hemopexina de pelo menos 250 mg/mL.

[0049] A referência a "pelo menos 250 mg/mL" inclui 250 mg/mL, 260 mg/mL, 270 mg/mL, 280 mg/mL, 290 mg/mL, 300 mg/mL, 305 mg/mL, 310 mg/mL, 315 mg/mL, 320 mg/mL, 325 mg/mL, 330 mg/mL, 335 mg/mL, 340 mg/mL, 345 mg/mL, 350 mg/mL, 355 mg/mL, 360 mg/mL, 365 mg/mL, 370 mg/mL, 375 mg/mL, 380 mg/mL, 385 mg/mL, 390 mg/mL, 400 mg/mL, 405 mg/mL e assim por diante. Assim, nas formas preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende um teor de hemopexina de pelo menos 300 mg/mL, preferivelmente pelo menos 305 mg/mL, preferivelmente pelo menos

310 mg/mL, preferivelmente pelo menos 315 mg/mL, preferivelmente pelo menos 320 mg/mL, preferivelmente pelo menos 325 mg/mL, preferivelmente pelo menos 330 mg/mL, preferivelmente pelo menos 335 mg/mL, preferivelmente pelo menos 340 mg/mL, preferivelmente pelo menos 345 mg/mL, preferivelmente pelo menos 350 mg/mL, preferivelmente pelo menos 355 mg/mL, preferivelmente pelo menos 360 mg/mL, preferivelmente pelo menos 365 mg/mL, preferivelmente pelo menos 370 mg/mL, preferivelmente pelo menos 375 mg/mL, preferivelmente pelo menos 380 mg/mL, preferivelmente pelo menos 385 mg/mL, preferivelmente pelo menos 390 mg/mL, preferivelmente pelo menos 400 mg/mL, preferivelmente pelo menos 405 mg/mL, e assim por diante. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende um teor de hemopexina de pelo menos 300 mg/mL.

[0050] Em uma modalidade, o teor de hemopexina é medido por espectroscopia de absorbância de UV. Em uma modalidade alternativa, a hemopexina é medida por imunonefelometria. Os exemplos ilustrativos de espectroscopia de absorbância de UV e imunonefelometria são descritos em outras partes deste documento.

[0051] Como utilizado neste documento, o termo "hemopexina" pretende significar uma proteína hemopexina que tenha sido isolada ou, de outra forma, pelo menos parcialmente purificada de uma fonte natural (por exemplo, plasma) ou uma proteína hemopexina produzida de forma recombinante, que compreende os, consiste nos, ou consiste essencialmente nos, resíduos de aminoácidos 24-462 de SEQ ID NO:1, ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60% de identidade de sequência com ela. A hemopexina pode incluir variantes humanas e não humanas. Onde a formulação líquida se destinar à administração a um paciente humano, é em geral preferível que a hemopexina seja uma hemopexina humana. No entanto, deve ser entendido que uma isoforma não humana de hemopexina pode ser usada onde o paciente pretendido for um ser humano, desde que a isoforma não humana de hemopexina mantenha a capacidade de se ligar à heme humana.

[0052] De modo inverso, onde a formulação líquida se destinar à administração a um paciente não humano, em geral é preferível que a hemopexina seja derivada das espécies às quais ela deve ser administrada, embora também deva ser entendido que uma isoforma humana de hemopexina pode ser usada onde o paciente pretendido for um paciente não humano, desde que a isoforma humana de hemopexina mantenha a capacidade de se ligar à heme do ou no paciente não humano pretendido. Como utilizado neste documento, o termo "derivada de" destina-se a incluir a hemopexina que é isolada ou, de outra forma, pelo menos parcialmente purificada de sua fonte natural, bem como a hemopexina produzida de forma recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica ou substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos da hemopexina derivada dessa espécie. Os exemplos ilustrativos de isoformas não humanas de hemopexina serão conhecidos para os especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos incluindo a hemopexina derivada de bovino, equino ou porcino.

[0053] Em uma modalidade divulgada neste documento, a hemopexina é uma hemopexina humana. Isso pode incluir uma hemopexina pelo menos parcialmente purificada, recuperada do plasma humano, ou uma hemopexina produzida de forma recombinante. Os métodos adequados de purificar a hemopexina do plasma serão conhecidos para os especialistas na técnica, um exemplo ilustrativo sendo descrito no WO2014/055552, cujo conteúdo inteiro é incorporado neste documento por referência. Em modalidades particulares, a formulação líquida de hemopexina purificada da presente invenção é fabricada em escala comercial, a partir de uma fração de plasma ou de uma matéria-prima recombinante. Como um exemplo ilustrativo, ao usar as frações de plasmas como um material de partida, a fabricação em escala comercial envolve o uso de uma fração de plasma derivada de pelo menos cerca de 500 kg de plasma. De preferência, a fração de plasma de partida é derivada de pelo menos cerca de 2.000 kg, 3.000 kg, 4.000 kg, 5.000 kg, 7.500 kg,

10.000 kg e/ou 15.000 kg de plasma por batelada.

[0054] Onde a formulação líquida compreender uma hemopexina que tenha sido purificada a partir de matéria-prima, como plasma sanguíneo, e deva ser usada para aplicações clínicas ou veterinárias (por exemplo, para a administração a um paciente com uma condição associada à hemólise), os especialistas na técnica entenderão que pode ser desejável reduzir o nível de teor de vírus ativo (título do vírus) e outros agentes infecciosos potenciais (por exemplo, príons) na solução. Isto pode ser particularmente desejável onde a matéria-prima compreendendo hemopexina (isto é,o material de partida) for derivada do plasma sanguíneo. Os métodos de reduzir o título do vírus em uma solução serão conhecidos pelos especialistas na técnica. Os exemplos incluem a pasteurização (por exemplo, incubação da solução a 60 °C, por 10 horas, na presença de altas concentrações de estabilizadores, como a glicina (por exemplo, 2,75 M) e a sacarose (por exemplo, 50%) e/ou outros excipientes ou sais selecionados), o tratamento térmico a seco, a filtração do vírus (passando a solução através de um nanofiltro; por exemplo, corte de 20 nm) e/ou a sujeição da solução a um tratamento com um solvente orgânico e detergente adequados, por um período e sob condições para inativar o vírus na solução. O detergente/solvente tem sido usado há mais de 20 anos para inativar as cápsulas de vírus, particularmente em produtos derivados do plasma. Assim, pode ser realizado utilizando vários reagentes e métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a US4540573 e a US4764369, que são incorporadas pelo presente por referência na sua totalidade). Os solventes adequados incluem o fosfato de tri-n-butila (TnBP) e o éter. Em algumas modalidades, o solvente é cerca de 0,3% e, de preferência, o TnBP. Os detergentes adequados incluem os detergentes não iônicos, tais como o polissorbato (Tween) 80, o polissorbato (Tween) 20, o Triton X-100, o octil glicosídeo (OPG) (tipicamente em torno de 1%). A seleção das condições de tratamento, incluindo as concentrações de solvente e detergente, depende em parte das características da matéria-prima, com as matérias-primas menos puras, em geral, requerendo concentrações mais altas de reagentes e condições de reação mais extremas. Um detergente preferido é o polissorbato 80 e uma combinação particularmente preferida é o polissorbato 80 e o TnBP. Um detergente preferido é o polissorbato 20 e uma combinação particularmente preferida é o polissorbato 20 e o TnBP. Um detergente preferido é o OPG e uma combinação particularmente preferida é o OPG e o TnBP. A matéria- prima pode ser agitada com os reagentes de solvente e detergente, em uma temperatura e por um tempo suficiente para inativar quaisquer cápsulas de vírus que possam estar presentes. Por exemplo, o tratamento com detergente/solvente pode ser realizado durante cerca de 4 horas, a 25 °C. Os produtos químicos detergentes/solventes são subsequentemente removidos através de, por exemplo, adsorção sobre meios cromatográficos, como as resinas hidrofóbicas C-18, ou por sua eluição na fração de queda das resinas de troca iônica, sob condições que adsorvam a proteína de interesse.

[0055] A etapa de inativação do vírus pode ser realizada em qualquer estágio adequado do processo de purificação. Em uma modalidade divulgada neste documento, a etapa de inativação viral compreende a pasteurização ou o tratamento com um solvente orgânico e detergente. Em outra modalidade divulgada neste documento, a etapa de inativação do vírus compreende a filtração do vírus. Onde a filtração do vírus for usada, a adição de um aminoácido livre (por exemplo, arginina) antes da etapa de filtração pode melhorar significativamente a taxa de fluxo e a recuperação da hemopexina através do filtro. Em uma modalidade divulgada neste documento, a matéria-prima ou a solução compreendendo a hemopexina é submetida a uma etapa de inativação viral antes da purificação da hemopexina. Uma vantagem de empregar uma etapa de inativação de vírus, como o tratamento com solvente/detergente, antes da purificação é que ela permite a remoção do solvente orgânico e do detergente da solução tratada utilizando condições que promovem a ligação da hemopexina a uma resina e a remoção do solvente orgânico e do detergente com a fração de fluxo passante (queda).

[0056] Em algumas modalidades, as formulações líquidas de hemopexina purificada, como divulgadas neste documento, estão substancialmente livres de outros componentes aos quais elas estão normalmente associadas (por exemplo, outras proteínas derivadas do plasma). Assim, em uma modalidade, a formulação líquida compreenderá menos do que 20% de proteína total, preferivelmente menos do que 10% de proteína total e mais preferivelmente menos do que 5% de proteína total de outros componentes aos quais eles estão normalmente associados (isto é, impurezas). O perito na técnica compreenderá que o nível de impurezas presentes na formulação líquida da presente invenção pode depender do uso pretendido das composições. Por exemplo, onde as composições devam ser administradas a um paciente humano que dela necessite (isto é, para uso clínico), seria desejável que a composição compreendesse menos do que 5% de impurezas (de proteína total). De modo inverso, onde as proteínas devam ser utilizadas in vitro, pode ser aceitável se a composição compreender mais do que 5% de impurezas (de proteína total). Em uma modalidade, a formulação líquida compreenderá um teor de hemopexina de pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98%, preferivelmente pelo menos 99% ou mais preferivelmente pelo menos 99,5% em peso de proteína total. Em modalidades particulares, o nível de pureza da hemopexina na formulação líquida é determinado usando imunonefelometria. Os métodos adequados de realizar a imunonefelometria serão conhecidos para os especialistas na técnica. O nível de pureza da hemopexina na formulação líquida pode ser determinado medindo o teor de hemopexina por imunonefelometria em um instrumento BNII (Siemens Healthcare, Malvern, PA, EUA) ou similar. O teor total de proteínas da formulação líquida pode ser determinado pelo método de Bradford ou por espectrometria de UV a 280 nm. Então, a porcentagem de pureza da hemopexina pode ser calculada dividindo o teor de hemopexina pelo teor total de proteínas e multiplicando por 100. A porcentagem de pureza de outras proteínas residuais contidas nas formulações líquidas estáveis de hemopexina purificada pode ser determinada de maneira análoga. Onde a hemopexina tiver sido purificada a partir do plasma humano, os exemplos ilustrativos de proteínas residuais que podem estar presentes na formulação líquida incluem a albumina, a alfa-1-ácido glicoproteína, a alfa-1-antitripsina, a alfa-2-macroglobulina, a apolipoproteína A-l, a antitrombina-11, a ceruloplasmina, a haptoglobina, a imunoglobulina A (IgA), a imunoglobulina G (IgG) e a transferrina.

[0057] Uma hemopexina recombinante pode ser preparada por metodologias recombinantes conhecidas dos especialistas na técnica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína hemopexina (ou um precursor dela) pode ser transfectada para uma célula hospedeira adequada, capaz de expressar a referida sequência de ácidos nucleicos, incubar a referida célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão da referida sequência de ácidos nucleicos e recuperar a referida proteína. Os métodos adequados para preparar uma molécula de ácido nucleico que codifica a hemopexina recombinante também serão conhecidos dos especialistas na técnica, com base no conhecimento do código genético, possivelmente incluindo a otimização de códons com base na natureza da célula hospedeira (por exemplo, micro-organismo) a ser usada para expressar e/ou secretar a proteína hemopexina recombinante. As células hospedeiras adequadas também serão conhecidas dos especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos incluindo as células procarióticas (por exemplo, E. coli) e as células eucarióticas (por exemplo, P. pastoris, linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO) CHO-K1 e CHO-S, como descrito em WO2016/054072; células de hibridoma NS0 e células HEK293, como descrito em WO2012/050874). É feita referência a "Short Protocols in Molecular Biology, 5th Edition, 2 Volume Set: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology” (bpory Frederick M. Ausubel (autor, editor), Roger Brent (editor), Robert E. Kingston (editor), David D. Moore (editor), J. G. Seidman (editor), John A. Smith (editor), Kevin Struhl (editor), J Wiley & Sons, Londres). Um exemplo ilustrativo de hemopexina recombinante é descrito no WO2016/054072, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência.

[0058] Em uma modalidade divulgada neste documento, a hemopexina compreende os, consiste ou consiste essencialmente nos, resíduos de aminoácidos 24-462 da Sequência de Referência do NCBI NP_000604.1 (SEQ ID NO:1, abaixo) ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,

90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com eles. Deve-se notar que os resíduos de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:1 (texto sublinhado abaixo) codificam uma sequência de sinal: Precursor de hemopexina humana (SEQ ID NO:1)

[0059] Em outra modalidade, a hemopexina é uma hemopexina humana compreendendo os, consistindo nos, ou consistindo essencialmente nos, resíduos de aminoácidos 24-462 de SEQ ID NO:1, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com eles.

[0060] A referência a "pelo menos 60%" inclui 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência, por exemplo, após alinhamento ideal ou análise por best fit. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, a hemopexina compreende, consiste ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou preferivelmente pelo menos 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 24-

462 de SEQ ID NO:1.

[0061] O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, EUA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, resultando na mais alta porcentagem de homologia sobre a janela de comparação) gerado por quaisquer dos vários métodos selecionados. Também pode ser feita referência à família de programas BLAST, como, por exemplo, divulgado por Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389. Uma discussão detalhada da análise da sequência pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.

[0062] O termo "identidade de sequência", conforme utilizado neste documento, refere-se à extensão que as sequências são idênticas ou estruturalmente semelhantes sobre uma base de nucleotídeo por nucleotídeo ou uma base de aminoácido por aminoácido sobre uma janela de comparação. Assim, uma "porcentagem de identidade de sequência", por exemplo, é calculada comparando duas sequências idealmente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para dar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência. Por exemplo, a "identidade de sequência" é a "porcentagem de correspondência" calculada pelo programa de computador DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível da Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califórnia, EUA), utilizando valores padrão como usados no manual de referência que acompanha o software.

[0063] O termo "identidade de sequência", como utilizado neste documento, inclui a identidade exata entre sequências comparadas no nível de nucleotídeo ou aminoácido. Este termo também é usado neste documento para incluir a identidade não exata (isto é, similaridade) no nível de nucleotídeos ou aminoácidos, onde qualquer(quaisquer) diferença(s) entre as sequências é(são) em relação aos aminoácidos (ou no contexto de nucleotídeos, aminoácidos codificados pelos ditos nucleotídeos) que, no entanto, estão relacionados entre si nos níveis estruturais, funcionais, bioquímicos e/ou conformacionais. Por exemplo, onde não houver identidade (similaridade) no nível de aminoácidos, a "similaridade" inclui os aminoácidos que, no entanto, estão relacionados entre si nos níveis estruturais, funcionais, bioquímicos e/ou conformacionais. Em uma modalidade, as comparações de nucleotídeos e sequências são feitas no nível de identidade e não similaridade. Por exemplo, a leucina pode ser substituída por um resíduo de isoleucina ou valina. Isso pode ser referido como uma substituição conservadora. Em uma modalidade, as sequências de aminoácidos podem ser modificadas por meio de substituição conservadora de quaisquer dos resíduos de aminoácidos nelas contidos, de modo tal que a modificação não tenha nenhum efeito ou tenha um efeito insignificante sobre a especificidade de ligação ou a atividade funcional do polipeptídeo modificado, quando comparado ao polipeptídeo não modificado.

[0064] A identidade de sequência em relação à hemopexina, como descrito neste documento, refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos da sequência peptídica correspondente, após o alinhamento das sequências e a introdução de gaps, se necessário, para obter a porcentagem de homologia máxima, e não considerando nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequência. Nem as extensões de N ou C terminais, nem as inserções devem ser interpretadas como redutoras da identidade ou da homologia de sequência.

[0065] As variantes de hemopexina também são consideradas neste documento. Como usada neste documento, uma "variante" de hemopexina é uma molécula que compartilha pelo menos alguma identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de uma isoforma nativa (que ocorre naturalmente) de hemopexina (humana ou não humana) ou uma parte dela, porém ainda mantém a capacidade de se ligar à heme. Em algumas modalidades, a variante compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou preferivelmente pelo menos 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 24-462 de SEQ ID NO: 1.

[0066] Em uma modalidade divulgada neste documento, a variante é um fragmento de ligação à heme de hemopexina nativa. Um fragmento de ligação à heme de hemopexina, também referido de forma intercambiável neste documento como um "fragmento de ligação" ou "fragmento de ligação à heme", é uma parte da molécula de hemopexina nativa (humana ou não humana) que conserva pelo menos parte da atividade funcional da molécula de origem para se ligar à heme. Como observado em outras partes deste documento, a ligação da heme pode ser prontamente determinada usando métodos conhecidos dos especialistas na técnica, um exemplo ilustrativo sendo o método descrito por Lipiski et al. (2013, Antioxidants & Redox Signaling, 19(14), pp. 1619-1633), cujo conteúdo inteiro é incorporado neste documento por referência. Também podem ser usadas pequenas modificações no método de Lipiski et al. (2013), como descrito em outras partes deste documento.

[0067] Em uma modalidade, o fragmento de hemopexina compreende um domínio de ligação à heme intacto entre os dois domínios de hélice β com quatro pás, incluindo os resíduos de aminoácidos His213 e His266, que foram descritos como coordenando o átomo de ferro da heme, dando origem a um complexo de bis- histidila estável.

[0068] Seria entendido por pessoas versadas na técnica que a afinidade de ligação da hemopexina (incluindo as suas variantes) pela heme pode variar dependendo da sequência de aminoácidos da hemopexina (incluindo uma variante dela). Em uma modalidade, a hemopexina, ou o seu fragmento de ligação à heme, liga-se à heme com uma afinidade de ligação tendo uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 1x10-12 ou menos.

[0069] Também são consideradas neste documento as proteínas de fusão compreendendo hemopexina, ou um fragmento de ligação à heme. Um exemplo ilustrativo de uma proteína de fusão adequada compreendendo hemopexina é descrito no WO2006/018428, cujo conteúdo inteiro é incorporado neste documento por referência.

[0070] Os termos "pelo menos parcialmente purificada", "isolada", "purificada" e similares são usados neste documento para significar que a hemopexina é proporcionada em uma forma isolada e/ou purificada; isto é, separada, isolada ou purificada de seu ambiente natural e é proporcionada em uma forma substancialmente pura ou homogênea. Tais proteínas tipicamente estarão livres ou substancialmente livres de material ao qual elas são naturalmente associadas, como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais elas são encontradas em seu ambiente natural ou no ambiente no qual elas são preparadas (por exemplo, cultura de células), quando tal preparação for por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Por exemplo, uma hemopexina pelo menos parcialmente purificada pode compreender não mais do que 50% de impurezas (de proteína total). Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, a hemopexina purificada compreende, consiste ou consiste essencialmente em não mais do que 50%, preferivelmente não mais do que 45%, preferivelmente não mais do que 40%, preferivelmente não mais do que 35%, preferivelmente não mais do que 30%, preferivelmente não mais do que 25%, preferivelmente não mais do que 20%, preferivelmente não mais do que 15%, preferivelmente não mais do que 10% ou preferivelmente não mais do que 5% de impurezas (de proteína total) ou preferivelmente não mais do que 1% de impurezas (de proteína total).

[0071] Em outra modalidade divulgada neste documento, a hemopexina é proporcionada em uma forma isolada e/ou purificada que é enriquecida, concentrada ou, de outra maneira, tem uma atividade, quantidade ou concentração específica que é maior do que a atividade, a quantidade ou a concentração da hemopexina no material de partida a partir do qual ela é derivada. Em uma modalidade, a formulação líquida de hemopexina purificada é derivada do plasma. Cloreto de sódio

[0072] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que a quantidade de cloreto de sódio que é incorporada em uma formulação líquida de hemopexina purificada está diretamente correlacionada com a estabilidade da hemopexina nela.

[0073] A referência a "pelo menos 50 mM" inclui 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM e assim por diante. Desse modo, nas modalidades preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende pelo menos 50 mM de cloreto de sódio, pelo menos 100 mM de cloreto de sódio, pelo menos 150 mM de cloreto de sódio, pelo menos 200 mM de cloreto de sódio, pelo menos 250 mM de cloreto de sódio, pelo menos 300 mM de cloreto de sódio, pelo menos 350 mM de cloreto de sódio, pelo menos 400 mM de cloreto de sódio, pelo menos 450 mM de cloreto de sódio, pelo menos 500 mM de cloreto de sódio, pelo menos 550 mM de cloreto de sódio, pelo menos 600 mM de cloreto de sódio, pelo menos 650 mM de cloreto de sódio e assim por diante, incluindo uma faixa destes.

[0074] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de cerca de 50 mM a cerca de 600 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade, a formulação líquida compreende de cerca de 150 mM a cerca de 400 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade, a formulação líquida compreende de cerca de 150 mM a cerca de 250 mM de cloreto de sódio.

[0075] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 150 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade, a formulação líquida compreende 400 mM de cloreto de sódio. Tampão de fosfato

[0076] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que o tipo e a quantidade de tampão de fosfato que é incorporado em uma formulação líquida de hemopexina purificada também têm um impacto sobre a estabilidade da hemopexina.

[0077] Os tampões de fosfato adequados serão conhecidos para os especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos incluindo o fosfato de sódio, o fosfato de potássio e o citrato fosfato. Os presentes inventores descobriram inesperadamente que os tampões de citrato fosfato e fosfato de sódio desempenham melhor do que o tampão de fosfato de potássio, o tampão de glicina e os tampões de Tris (Tris(hidroximetil)-aminometano) na estabilização da hemopexina em solução. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, o tampão de fosfato é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de sódio, fosfato de potássio e citrato fosfato. Em uma outra modalidade divulgada neste documento, o tampão de fosfato é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de sódio e citrato fosfato.

[0078] Em uma modalidade, o tampão de fosfato é o fosfato de sódio. Em uma modalidade, o tampão de fosfato de sódio compreende o fosfato de sódio monobásico e o fosfato de sódio dibásico.

[0079] Os presentes inventores descobriram inesperadamente que o citrato fosfato desempenha melhor do que um tampão de fosfato de sódio na estabilização da hemopexina em solução. Assim, em outra modalidade, o tampão de fosfato é um citrato fosfato. Em uma modalidade, o tampão de citrato fosfato compreende ácido cítrico e fosfato de sódio dibásico.

[0080] A referência a "pelo menos 15 mM" inclui 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 400 mM e assim por diante. Assim, nas modalidades preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 35 mM, pelo menos 40 mM, pelo menos 45 mM, pelo menos 50 mM, pelo menos 55 mM, pelo menos 60 mM, pelo menos 65 mM, pelo menos 70 mM, pelo menos 75 mM, pelo menos 80 mM, pelo menos 85 mM, pelo menos 90 mM, pelo menos 100 mM, pelo menos 150 mM, pelo menos 200 mM, pelo menos 250 mM, pelo menos 300 mM, pelo menos 350 mM, pelo menos 400 mM, pelo menos 400 mM de tampão de fosfato e assim por diante, incluindo uma faixa destes.

[0081] Embora os presentes inventores tenham mostrado que uma faixa de concentrações de tampão de fosfato e cloreto de sódio são úteis para melhorar a estabilidade da hemopexina em solução, eles também descobriram inesperadamente que certas concentrações de tampão de fosfato e certas concentrações de cloreto de sódio, quando combinadas, proporcionam ótima estabilidade. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 15 mM a 200 mM de citrato fosfato e de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade, a formulação líquida compreende de 15 mM a 200 mM de citrato fosfato e de 150 mM a 250 mM de cloreto de sódio.

[0082] Em outra modalidade, a formulação líquida compreende 200 mM de citrato fosfato e 150 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade, a formulação líquida compreende 50 mM de citrato fosfato e 400 mM de cloreto de sódio. Ainda em outra modalidade, a formulação líquida compreende 15 mM de citrato fosfato e 150 mM de cloreto de sódio.

[0083] Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 50 mM a 200 mM de fosfato de sódio e de 50 mM a 400 mM de cloreto de sódio. Em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende de 50 mM a 200 mM de fosfato de sódio e de 150 mM a 250 mM de cloreto de sódio. Ainda em outra modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende 200 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio. pH

[0084] Os presentes inventores também descobriram que o pH também desempenha um papel na manutenção da estabilidade da hemopexina em solução.

[0085] A referência a "pH de 5,8 a 8" inclui 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 e 8,0. Assim, nas modalidades preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende um pH de 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8,0.

[0086] Em uma modalidade divulgada neste documento, o pH da formulação líquida é de 6,5 a 8,0. Em uma modalidade divulgada neste documento, o pH da formulação líquida é de 7,0 a 7,6. Em outra modalidade divulgada neste documento, o pH da formulação líquida é 7,2.

[0087] Os métodos adequados de determinar e, quando necessário, ajustar o pH da formulação líquida serão conhecidos para os especialistas na técnica. De preferência, o pH será medido na temperatura ambiente. Condutividade

[0088] Os presentes inventores também descobriram que a condutividade pode contribuir, pelo menos em parte, para a estabilidade da hemopexina em solução. Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida de hemopexina purificada compreende uma condutividade de pelo menos 10 mS/cm. Por "pelo menos 10 mS/cm" significa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mS/cm e assim por diante. Em outra modalidade, a formulação líquida de hemopexina purificada compreende uma condutividade de 10 a 45 mS/cm.

[0089] A referência a uma condutividade "de 10 a 45 mS/cm" inclui 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 e 45 mS/cm.

[0090] Em outra modalidade divulgada neste documento, a condutividade da formulação líquida é de 10 a 25 mS/cm. Ainda em outra modalidade divulgada neste documento, a condutividade da formulação líquida é de 15 a 25mS/cm. Ainda em outra modalidade divulgada neste documento, a condutividade da formulação líquida é de 10 a 15 mS/cm. Em uma outra modalidade divulgada neste documento, a condutividade da formulação líquida é de pelo menos 30 mS/cm.

[0091] Os métodos adequados de determinar e, onde necessário, ajustar a condutividade da formulação líquida serão conhecidos para os especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos sendo descritos em outras partes deste documento. De preferência, a condutividade é medida na temperatura ambiente. Estabilizadores

[0092] Em algumas modalidades, as formulações líquidas podem ainda compreender um estabilizador. Os estabilizadores adequados serão conhecidos dos especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos incluindo os aminoácidos, os carboidratos, os sais e/ou os detergentes (por exemplo, detergente não iônico). Em algumas modalidades, o estabilizador compreende uma mistura de um álcool de açúcar e um aminoácido. O estabilizador pode compreender uma mistura de um açúcar (por exemplo, sacarose ou trealose), um álcool de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol) e um aminoácido (por exemplo, prolina, glicina e arginina). Em uma modalidade preferida, a formulação compreende um aminoácido, tal como a arginina. Em outras modalidades, a formulação compreende íons de metais divalentes em uma concentração até 100 mM e um agente complexante conforme descrito na US7045601.

[0093] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende ainda um detergente não iônico. Os detergentes não iônicos adequados serão conhecidos para os especialistas na técnica, um exemplo ilustrativo incluindo o polissorbato 80 (Mono-oleato de polioxietileno (20) sorbitano). Os presentes inventores descobriram que a presença de polissorbato 80 na formulação líquida de hemopexina purificada melhorou a estabilidade da hemopexina nela. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, o detergente não iônico é o polissorbato

80.

[0094] Em uma modalidade, o detergente não iônico está presente em uma quantidade de pelo menos 0,0005% v/v. A referência a "pelo menos 0,0005% v/v" inclui 0,0005%, 0,0006%, 0,0007%, 0,0008%, 0,0009%, 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,05%, 0,10%, 0,15% v/v e assim por diante. Desse modo, nas modalidades preferidas da presente invenção, a formulação líquida compreende pelo menos 0,001% v/v, preferivelmente pelo menos 0,002% v/v, preferivelmente pelo menos 0,005% v/v, preferivelmente pelo menos 0,01% v/v, preferivelmente pelo menos 0,015% v/v, preferivelmente pelo menos 0,02% v/v, preferivelmente pelo menos 0,05% v/v, preferivelmente pelo menos 0,10% v/v, preferivelmente pelo menos 0,15% v/v e assim por diante.

[0095] Em uma modalidade divulgada neste documento, o detergente não iônico está presente em uma quantidade de menos do que 0,01% v/v.

[0096] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 6,5 a 8,0; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) opcionalmente um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[0097] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[0098] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[0099] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 6,5 a 8,0; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[00100] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00101] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00102] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de citrato fosfato; (c) um pH de 6,5 a 8,0; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) opcionalmente um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[00103] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00104] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25 °C.

[00105] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de citrato fosfato; (c) um pH de 6,5 a 8,0; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[00106] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00107] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00108] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de citrato fosfato; (c) um pH de 7,0 a 7,6; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) opcionalmente um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[00109] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00110] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25 °C.

[00111] Em modalidades particulares da presente invenção, é proporcionada uma formulação líquida estável de hemopexina purificada que compreende: (a) um teor de hemopexina de 100 a 300 mg/mL; (b) de 15 mM a 200 mM de tampão de citrato fosfato; (c) um pH de 7,0 a 7,6; (d) de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio; e (e) um detergente não iônico em uma quantidade de menos do que 0,02% v/v.

[00112] Em uma modalidade preferida, a formulação líquida estável tem uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C.

[00113] Em outra modalidade preferida, a formulação líquida estável tem um teor de hemopexina de 100 a 250 mg/mL e uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25 °C.

Estabilidade

[00114] Como observado em outra parte deste documento, a hemopexina purificada é inerentemente instável em soluções tampão padrão, como a PBS. Isso introduz problemas significativos, em particular com o armazenamento das formulações ao longo do tempo. Por exemplo, como observado pelos próprios dados dos inventores divulgados neste documento, a hemopexina purificada que é formulada em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 10 mM de fosfato de sódio, 1,8 mM de fosfato de potássio, 137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI; pH 7,4) é relativamente instável, conforme determinado por Fluorometria de Varredura Diferencial (DSF). Em contraste com a PBS, os inventores identificaram uma mudança inesperada e significativa para uma Tm mais alta quando a hemopexina foi formulada em cloreto de sódio e um tampão de fosfato alternativo, como o citrato fosfato, o fosfato de sódio ou o fosfato de potássio. Essa mudança para uma Tm mais alta é indicativa de efeito estabilizador sobre a hemopexina.

[00115] Da mesma forma, os inventores descobriram que, quando a hemopexina purificada foi formulada em PBS, houve uma degradação significativa da hemopexina em solução ao longo do tempo, como evidenciada por um aumento na quantidade de agregados de hemopexina (incluindo os dímeros de hemopexina) e fragmentos de hemopexina. Por exemplo, após armazenamento a 37 °C por 3 meses, uma formulação líquida de hemopexina em PBS (pH 7,4) continha 54,6% p/p de agregados, 3,1% p/p de dímeros e 9,8% fragmentos de hemopexina, com apenas 32,5% p/p de monômeros de hemopexina permanecendo. Isso também se refletiu por uma perda da atividade de ligação à heme. Em contraste, quando a hemopexina purificada foi formulada em uma solução de NaCl em combinação com um tampão de fosfato alternativo de pelo menos 15 mM (por exemplo, tal como citrato fosfato ou fosfato de sódio) e armazenada a 37 °C pelo mesmo período, houve uma redução significativa na proporção de agregados e fragmentos de hemopexina na solução, com mais do que 50% de monômeros de hemopexina permanecendo na solução. Isso também se refletiu na conservação da ligação à heme, significando um efeito estabilizador significativo sobre a hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a concentração de hemopexina monomérica em soluções compreendendo NaCl e tampão de fosfato é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% em peso de proteína total, conforme medida através de HPLC por exclusão de tamanho.

[00116] De preferência, a formulação líquida divulgada neste documento manterá substancialmente as suas características de estabilidade originais por pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 24, 36 ou mais meses. Por exemplo, as formulações líquidas armazenadas a 2-8°C ou 25°C manterão típica e substancialmente a mesma distribuição de tamanho molecular conforme medida por HPLC-SEC, ou manterão substancialmente o mesmo teor de monômero de hemopexina quando armazenadas por 1 mês ou mais. As modalidades particulares da formulação líquida podem ser estáveis e adequadas para uso farmacêutico comercial por pelo menos 3 meses ou até mais tempo, quando armazenadas a 2-8°C e/ou na temperatura ambiente de 25°C.

[00117] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 70% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 1 mês.

[00118] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 50% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 2 meses.

[00119] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 50% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 3 meses.

[00120] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 80% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 1 mês.

[00121] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 70% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 2 meses.

[00122] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 60% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37 °C por 3 meses.

[00123] As formulações líquidas divulgadas neste documento podem ser formuladas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos, os diluentes e/ou os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são conhecidos dos especialistas na técnica. Os exemplos incluem os solventes, os meios de dispersão, os agentes antifúngicos e antibacterianos, os tensoativos, os agentes isotônicos e de absorção e similares.

[00124] A formulação também pode ser esterilizada por filtração antes da distribuição e do armazenamento de longo período. As composições descritas neste documento podem ser formuladas em quaisquer das muitas formas de dosagem possíveis, tais como as formulações injetáveis. As formulações e a sua administração (dosagem) subsequente estão dentro da habilidade dos especialistas na matéria. A dosagem é dependente da capacidade de resposta do paciente ao tratamento, porém invariavelmente durará enquanto o efeito desejável (por exemplo, uma redução no nível de heme) for desejado. As pessoas de habilidade comum podem facilmente determinar as dosagens ideais, as metodologias de dosagem e as taxas de repetição.

[00125] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para determinar a atividade de ligação à heme da hemopexina em uma formulação líquida, o método compreendendo: (a) proporcionar um complexo de heme e uma molécula transportadora de heme; (b) misturar o complexo de (a) com uma formulação líquida compreendendo hemopexina e incubar a mistura por um período para permitir que a heme transfira da molécula transportadora para a hemopexina; e (c) medir a absorbância da mistura de (b) em dois ou mais comprimentos de onda selecionados a partir da faixa de 450 nm a 700 nm, em que a diferença entre os valores de absorbância nos dois ou mais comprimentos de onda, conforme medidos em (c), é indicativa da atividade de ligação à heme da hemopexina na formulação líquida.

[00126] Este aspecto da presente divulgação é baseado nas descobertas dos inventores que as diferentes características espectrais da heme quando ela estiver ligada à albumina ou à hemopexina podem ser usadas para determinar a concentração do complexo de heme-hemopexina na solução e, portanto, a atividade de ligação à heme da hemopexina. Em uma modalidade, um excesso molar de um complexo de heme-molécula portadora é misturado com uma formulação líquida compreendendo hemopexina (diluída em uma solução tamponada apropriada, como uma solução salina tamponada com fosfato, se necessário) e a mistura é incubada por um período, para permitir a transferência da heme a partir da heme-proteína transportadora para a hemopexina. A absorbância da mistura é então medida em um mínimo de dois comprimentos de onda no espectro visível. A Lei de Beer pode então ser usada com coeficientes de extinção para a heme ligada à molécula transportadora e à hemopexina e os valores de absorbância medidos para calcular a concentração do complexo de heme-hemopexina resultante. Esta concentração é tipicamente corrigida para quaisquer diluições da solução original de hemopexina realizadas durante o ensaio, e a concentração resultante corresponde à quantidade de hemopexina ativa na formulação líquida original. A molécula transportadora de heme tipicamente ligará a heme com uma afinidade menor do que a hemopexina e em geral é capaz de ligar a heme em um ambiente aquoso. Os exemplos adequados de moléculas transportadoras de heme serão conhecidos para os especialistas na técnica, os seus exemplos ilustrativos incluindo a hemoglobina e a albumina. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, a molécula transportadora de heme é selecionada a partir do grupo que consiste em hemoglobina e albumina. Seria entendido pelas pessoas versadas na técnica que a molécula transportadora de heme pode ser uma molécula que ocorre naturalmente (por exemplo, uma transportadora de heme derivada do soro, como a hemoglobina ou a albumina) ou ela pode ser de ocorrência não natural (por exemplo, uma molécula transportadora produzida de forma recombinante, como a albumina recombinante humana). Em uma modalidade, a proteína transportadora de heme é a albumina. Mais preferivelmente, a proteína transportadora de heme é a albumina humana. As vantagens do uso da albumina incluem: (i) está prontamente disponível; (ii) é uma transportadora de heme fisiologicamente relevante no plasma; (iii) é conhecida por transferir a heme para a hemopexina; e (iv) forma um complexo definido 1:1 com a heme (ver Ascenzi & Fasano, 2009, Life, 61(12) 1118-1122).

[00127] É necessário um mínimo de dois comprimentos de onda que exibam uma mudança de absorbância quando a heme for transferida da molécula transportadora para a hemopexina. Em uma modalidade, os dois ou mais comprimentos de onda são selecionados de modo tal que a absorbância em um comprimento de onda aumente e a absorbância no outro comprimento de onda diminua. Espera-se que quanto maior a magnitude da mudança de absorbâncias entre os dois ou mais comprimentos de onda, maior a sensibilidade do método na determinação da atividade de ligação à heme. Os comprimentos de onda próximos a um pico ou vale no espectro da mistura, e não sobre uma inclinação íngrime, são preferidos e podem tornar o método mais tolerante a erros na calibração do espectrofotômetro. A referência neste documento a "450 nm a 700 nm" inclui 450 nm, 460 nm, 470 nm, 480 nm, 490 nm, 500 nm, 510 nm, 520 nm, 530 nm, 540 nm, 550 nm, 560 nm, 570 nm, 580 nm, 590 nm, 600 nm, 610 nm, 620 nm, 630 nm, 640 nm, 650 nm, 660 nm, 670 nm, 680 nm, 690 nm e 700 nm. No espectro visível, a heme ligada à albumina tem picos de absorbância em torno de 500 nm, 533 nm e 622 nm, enquanto a heme ligada à hemopexina tem picos de absorbância em torno de 533 nm e 565 nm. Assim, em uma modalidade divulgada neste documento, os dois ou mais comprimentos de onda são selecionados a partir da faixa de 500 nm a 630 nm. Em uma modalidade preferida, os dois ou mais comprimentos de onda são selecionados a partir do grupo que consiste em 500 nm, 533 nm e 622 nm. Em uma modalidade adicional, os dois ou mais comprimentos de onda são 533 nm e 622 nm. A absorbância a 622 nm tem a vantagem sobre 500 nm (ambas exibindo a mesma direção de mudança) devido à maior magnitude da mudança na absorbância, à medida que a heme é transferida da albumina para a hemopexina.

[00128] Com base na absorbância da mistura de transferência de heme e nos coeficientes de extinção de heme-albumina e heme- hemopexina nesses comprimentos de onda, pode-se calcular a concentração do complexo de heme-hemopexina. A quantidade de heme-hemopexina determinada na mistura final representa a quantidade de hemopexina biologicamente ativa. O tempo e a temperatura de incubação são tipicamente escolhidos para permitir a transferência da heme da molécula de ligação à heme para a hemopexina na solução. O método é tipicamente realizado para que haja um excesso significativo de heme-albumina em relação à hemopexina (aproximadamente 2,5x) para garantir que haja heme suficiente para saturar completamente todas as moléculas ativas de hemopexina. Em uma modalidade divulgada neste documento, a incubação é conduzida a 20-25°C ou 37°C por cerca de 5 a 60 minutos. Em uma modalidade preferida, a incubação é conduzida a 37°C por 10 a 20 minutos. O pH e a concentração de tampão da mistura são tipicamente selecionados para permitir que a molécula transportadora de heme transfira a heme para a hemopexina. Em uma modalidade preferida, o pH é próximo das condições fisiológicas; isto é, de aproximadamente pH 6,5 a 7,5. Em uma modalidade, o pH é 7,0. A concentração da molécula de ligação à heme e da hemopexina é selecionada de modo tal que a absorbância total nos dois ou mais comprimentos de onda esteja na faixa linear do espectrofotômetro. O método pode ser configurado de modo tal que exista uma quantidade em excesso significativa de molécula transportadora de heme em relação à hemopexina (por exemplo, cerca de 2,5 vezes) para garantir que haja heme suficiente para saturar completamente todas as moléculas ativas de hemopexina na mistura.

[00129] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 90% de hemopexina com atividade de ligação à heme, quando armazenada a 2-8 °C por 6 meses.

[00130] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 90% de monômeros de hemopexina, quando armazenada na temperatura ambiente (por exemplo, 25°C) por 6 meses.

[00131] Em uma modalidade divulgada neste documento, a formulação líquida compreende pelo menos 50% de monômeros de hemopexina, quando armazenada a 37 °C por 6 meses. Métodos de tratamento

[00132] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento de uma condição associada à hemólise, o método compreendendo a administração a um paciente que necessita dele de uma composição compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na formulação líquida estável de hemopexina purificada, como divulgada neste documento em.

[00133] O termo "paciente", como utilizado neste documento, refere-se a um animal que inclui um primata (por exemplo, um primata inferior ou superior). Um primata superior inclui o ser humano. Embora a presente invenção tenha aplicação particular às condições de direcionamento em seres humanos, seria entendido pelos especialistas na técnica que os animais não humanos também podem se beneficiar das composições e dos métodos divulgados neste documento. Assim, será apreciado pelos especialistas na técnica que a presente invenção tem aplicações tanto humanas quanto veterinárias. Por conveniência, um "animal" inclui os animais de fazenda e os animais de estimação, como gado, cavalos, ovelhas, porcos, camelídeos, cabras, burros, cães e gatos. No que diz respeito aos cavalos, estes incluem os cavalos utilizados na indústria das corridas, bem como os utilizados recreativamente ou na indústria pecuária.

[00134] As composições ou as formulações da presente invenção podem ser administradas ao paciente de várias maneiras. Os exemplos de rotas de administração adequadas incluem a intravenosa, a subcutânea, a intra-arterial ou por infusão. Em uma modalidade, as composições ou as formulações são administradas intravenosamente. Em outra modalidade, as composições ou as formulações são administradas de modo subcutâneo.

[00135] Onde necessário, os métodos da presente invenção podem compreender ainda a administração de um segundo agente terapêutico. O segundo composto terapêutico pode ser coadministrado ao paciente sequencialmente (antes ou após a administração das composições ou formulações divulgadas neste documento) ou simultaneamente. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é um agente quelante de ferro (por exemplo, deferoxamina ou deferiprona).

[00136] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado o uso das composições ou formulações da presente invenção, como divulgadas neste documento, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição associada à hemólise. Tais composições ou formulações são preferivelmente adequadas para uso em pacientes humanos.

[00137] Em outro aspecto da presente invenção, são proporcionadas as composições ou as formulações da presente invenção, como divulgadas neste documento, para uso no tratamento de uma condição associada à hemólise em um paciente que delas necessite.

[00138] As condições associadas à hemólise e que estão em risco de toxicidade mediada por hemoglobina/heme são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, a condição é selecionada a partir de uma condição hemolítica aguda e/ou uma condição hemolítica crônica. Em uma modalidade, a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em anemia hemolítica, crise aplástica, crise hiper-hemolítica,

hemólise induzida por transfusão, síndrome hemolítica urêmica, infartos do miocárdio, síndrome aguda do peito, hipertensão pulmonar, úlceras nas pernas, retardo do crescimento, infartos ósseos, pré- eclâmpsia, insuficiência renal, lesão renal aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), acidente vascular cerebral incluindo acidente vascular cerebral hemorrágico, hemorragia intracraniana (HIC), sequestro esplênico, infartos esplênicos, uma doença autoimune (por exemplo, anemia hemolítica autoimune), infecção microbiana ou suscetibilidade aumentada à infecção (por exemplo, infecção por malária), trauma, uma condição relacionada ao transplante, cirurgia cardíaca aberta usando ponte cardiopulmonar, e queimaduras, incluindo no tratamento de hemoglobinemia ou hemoglobinúria acompanhada de hemólise após a queimadura.

[00139] Em uma modalidade, a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em anemia de células falciformes, esferocitose hereditária, eliptocitose hereditária, talassemia, anemia diseritropoética congênita e hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), lúpus eritematoso sistêmico e leucemia linfocítica crônica.

[00140] Em uma modalidade, a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral hemorrágico e hemorragia intra-craniana (ICH).

[00141] Em uma modalidade, a condição é uma doença ou distúrbio genético ou hereditário que causa hemólise e inflamação.

[00142] Em uma modalidade, a condição é a SDRA.

[00143] Os especialistas na técnica perceberão que a invenção descrita neste documento é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações que incidem no espírito e no escopo. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e toda e qualquer combinação de quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.

[00144] Certas modalidades da invenção serão agora descritas com referência aos exemplos a seguir, os quais são apenas para o propósito de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da generalidade descrita mais acima.

EXEMPLOS Material e Métodos A. Preparação da amostra

[00145] Para o desenvolvimento da formulação descrita, a hemopexina (Hpx) foi purificada do plasma humano (Fração Kistler- Cohn IV) em Kankakee. Os detalhes do processo de purificação foram baseados nos processos descritos anteriormente no WO2014/055552, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência na sua totalidade. A Hpx purificada foi proporcionada em PBS, pH 7,4, em uma concentração de proteína de 3-4%.

[00146] A concentração de proteína das formulações foi determinada medindo a absorbância por UV a 280 nm com um espectrofotômetro Cary60 (Agilent). Resumidamente, a solução proteica foi diluída em NaCl a 0,9% para uma concentração que estivesse dentro da faixa exata do instrumento (< 1,5 mg/mL) e colocada em uma cubeta descartável de UV-Vis (comprimento do caminho: 1 cm). A absorção medida foi convertida de acordo com a lei de Beer-Lambert usando um coeficiente de extinção de 1,971: A = ε x c x I, onde c é a concentração, I é o comprimento do caminho da cubeta (cm), ε é o coeficiente de extinção (0,1% a 280 nm; comprimento do caminho de 1 cm) e A é a absorbância em um dado comprimento de onda. A concentração de proteína foi expressa como mg/mL médio de duas medições independentes.

[00147] Para as experiências com DSF, a Hpx foi diluída nos tampões/excipientes de investigação até uma concentração final de 0,1 mg/mL.

As formulações de Hpx mais concentradas (até 35%) para os estudos de estabilidade induzida por tensão foram obtidas por diafiltração com um dispositivo de fluxo Äkta (GE Healthcare), usando um cassete de filtração de corte de PM de 10 kDa (PES, 50 cm2, PALL Life Sciences). B.

Estudos da estabilidade Tabela 1a.

Visão geral dos testes de estabilidade descritos neste relatório Estudo da Batelada Condições de Excipientes Proteína g/L Estabilidade de Hpx armazenamento analisados Estudos da estabilidade induzida por tensão térmica e física Rampa de Exame do I TO271228 0,1 g/L Temperatura (DSF) tampão I Rampa de Exame do II TO271228 0,1 g/L Temperatura (DSF) tampão II Rampa de III TO271228 0,1 g/L Açúcares Temperatura (DSF) Rampa de IV TO271228 0,1 g/L Sal (NaCl) Temperatura (DSF) TO271228 Rampa de Concentração V 0,1 g/L TO294063 Temperatura (DSF) iônica TO271228 Rampa de VI 0,1 g/L citrato fosfato TO294063 Temperatura (DSF) Agitação e ciclos de VII TO271228 100 g/L Polissorbato 80 congelar/descongelar Estudos da Estabilidade (Acelerados) (3 - 24 meses) vários tampões, 1 TO271204 37 °C, TA, 2-8°C 100 g/L 150 mM de NaCl 2 TO271228 37 °C, TA 100 g/L Polissorbato 80 vários tampões, diferentes 3 TO294063 37 °C, TA, 2-8°C 100 g/L concentrações de NaCl 4 TO294063 37 °C, TA 100 g/L Polissorbato 80

200 mM de TO29010/ tampão de TO294001 citrato, pH 7,2, 5 37 °C, TA, 2-8°C 100 g/L + diferentes TO294023 concentrações de NaCl Diferentes TO294267 combinações de 7 + 37 °C, TA, 2-8°C 100 g/L tampão de TO318001 citrato fosfato e NaCl C. Fluorometria de varredura diferencial (DSF)

[00148] A fluorometria de varredura diferencial (DSF) é um método rápido para investigar a estabilidade térmica de proteínas purificadas, na presença de diferentes estabilizadores e excipientes. A temperatura na qual uma proteína se desdobra é medida por um aumento na fluorescência de um corante com afinidade pelas partes hidrofóbicas da proteína, que são expostas à medida que a proteína se desdobra. Um protocolo de ensaio de Niesen et al. (Niesen, 2007) foi adaptado e modificado apropriadamente. Resumidamente, a Hpx purificada (aproximadamente 4%) foi diluída nos tampões desejados, na presença de diferentes excipientes, até uma concentração final de proteína de 0,1 mg/mL. As amostras foram distribuídas nos poços de uma placa de PCR, adicionando 20 μL de 0,1 mg/mL de proteína e 0,5 μL de SYPRO Orange (pré-diluído 1:400 em PBS). Cada condição foi medida em triplicatas. A placa foi vedada com uma folha óptica e centrifugada rapidamente para coletar toda a solução no fundo dos poços. As rampas de temperatura de 25 a 80 °C (a 0,5 °C/min) foram realizadas em um sistema de PCR em Tempo Real CFX96 (BioRad) e os comprimentos de onda de excitação e emissão foram ajustados para 492 e 610 nm, respectivamente. A coleta de dados foi realizada com o Software CFX Manager® (BioRad). Através do desdobramento da proteína com a temperatura crescente, uma forte luz fluorescente a 610 nm foi emitida pela ligação do corante às camadas hidrofóbicas recentemente expostas. Dessa maneira, foi gerada uma curva de fusão para cada condição, como ilustrado na Figura 2. Após atingir o ponto máximo, a intensidade da fluorescência diminuiu gradualmente, o que é explicado principalmente pela remoção da proteína da solução devida à precipitação e agregação. A curva ascendente sigmoide do pico pode ser descrita por uma transição de dois estados e o ponto de inflexão de cada curva de fusão foi utilizado para a determinação da Tm (1ª derivação). Para identificar as condições de tampão que (des)estabilizam a Hpx, o valor de Tm da proteína sob cada condição do exame foi comparado com a Tm de referência (Hpx em PBS, pH 7,4). D. Ensaio de ligação à heme I

[00149] A ligação à heme foi medida por uma adaptação do método descrito anteriormente por Lipiski (2013; Human Hp1-1 and Hp2-2 Phenotype-Specific Haptoglobin Therapeutics Are Both Effective In Vitro and in Guinea Pigs to Attenuate Haemoglobin Toxicity. Antioxidants & Redox Signalling, 19(14), pp. 1619 - 1633). Resumidamente, a met-Hb (Fe3+) (15 μΜ em PBS) ou a hemina ligada à albumina humana (25 μΜ em PBS) foi incubada com 10 μΜ de Hpx humana. Os espectros de UV-VIS em série foram registrados (350-650 nm) usando um Espectrofotômetro de UV-VIS Cary 60 (Agilent Technologies) para acompanhar a transição de met-Hb/hemina para heme-Hpx ao longo do tempo. Para cada ponto no tempo, as concentrações de met-Hb/hemina e heme-Hpx nas misturas de reação foram resolvidas por deconvolução de todo o espectro aplicando o algoritmo dos Mínimos Quadrados Não Negativos de Lawson-Hanson da SciPy (www.scipy.org). Os roteiros da deconvolução foram proporcionados por UZH (J. Deuel e D. Schaer). Após atingir o platô, pelo menos 15 pontos de dados tiveram a média calculada e foram expressos como quantidade de heme transferida em μM. A atividade da Hpx foi expressa em porcentagem como a quantidade de Hpx de ligação à heme/hemina em comparação com a quantidade total de Hpx aplicada inicialmente. E. Ensaio de ligação à heme II

[00150] O que segue é um ensaio alternativo para medir a quantidade de hemopexina ativa em uma solução.

[00151] A hemopexina liga a hemina (também conhecida como ferri-heme, que consiste em protoporfirina IX contendo ferro (lll) com um ligante de cloreto, a forma totalmente oxidada da heme) com a maior afinidade de qualquer proteína conhecida e é capaz de competir pela hemina que está ligada à albumina. A hemina tem uma banda de absorção forte característica na região de Soret, bem como bandas menos intensas na região visível dos espectros. Os máximos de absorbância dessas trocas de bandas dependem do estado de oxidação e ligação ao ligante da hemina em solução. A hemina livre tem um máximo de absorbância a 385 nm, que pode ser usado para a determinação da concentração exata da hemina livre em solução. Na faixa do visível, o espectro de hemina ligada à albumina tem picos com máximos a 500 nm, 533 nm e 622 nm, enquanto o espectro de hemina ligada à hemopexina tem máximos de picos a 533 nm e 565 nm. Neste método, a hemopexina purificada é adicionada a quantidades em excesso de um complexo de heme-albumina e a espectrofotometria é usada para medir a alteração da absorbância durante a transferência da hemina da albumina para a hemopexina a 533 nm e 622 nm. Com base na absorbância da mistura de transferência de hemina e nos coeficientes de extinção de heme-albumina e heme-hemopexina nos comprimentos de onda acima mencionados, pode-se calcular a concentração do complexo de heme-hemopexina. A quantidade de heme-hemopexina determinada na mistura final corresponde à quantidade de hemopexina ativa. Abreviações:

CV Coeficiente de Variação Hpx Hemopexina PBS Solução salina tamponada com fosfato PVDF Poli(fluoreto de vinilideno) Q.S.

Quantum satis POP Procedimento de operação padrão UV Ultravioleta Vis Visível Materiais e equipamento:  Hemina: Frontier Scientific H651-9.  Albumina humana purificada: i.e., CSLB Albuminar 25% ou AlbuRx 25%.  Controle de hemopexina e amostras para teste.  PBS pH 7,4: ThermoFisher 28348 20x concentrado ou equivalente.  Ácido fosfórico: Fisher A260-500, 85% em peso (é igual a 14,62 M).  Água: Fisher W5-4, grau de qualidade para HPLC ou melhor.  Cubeta de UV descartável: 1,5 mL, semimicro (12,5 × 12,5 × 45 mm) Nº do Cat .: 7591 65, BRAND GmbH, comprimento do caminho de 1 cm.  Filtros de seringa de PVDF de 0,22 μm (Millipore SLGV033RS, Durapore de baixa ligação às proteínas ou equivalente).  Espectrofotômetro de UV-Vis equipado com trocador de múltiplas células com termostato (ou equivalente).  Pipetas ajustáveis calibradas.  Medidor de pH calibrado.

Procedimento i) Preparação do tampão

[00152] Solução de ácido fosfórico a 5 M: adicione lentamente 3,42 mL de ácido fosfórico a 85% em peso a 2,5 mL de água desionizada. 1 × PBS: Dilua 20× o concentrado de PBS em água desionizada para 1× PBS. ii) Preparação do complexo de heme-albumina

[00153] Aproximadamente 66 mg de hemina foram dissolvidos e Q.S. para 10 mL em um frasco volumétrico usando 0,1 M de NaOH, incubados a 37°C por 3 minutos e ajustados para uma concentração final de cerca de 10 mM. Para determinar a concentração da solução concentrada de hemina, diluições em série de 10× foram realizadas três vezes, adicionando 500 µL de solução de hemina em 4500 µL de 5 mM de NaOH, de modo tal que o fator de diluição final fosse 1000 com uma concentração de hemina de cerca de 10 µM. O espectrofotômetro de UV-Vis foi zerado com 5 mM de NaOH e a absorbância da solução diluída foi lida em A385 e a concentração real (mM) para o concentrado de hemina foi calculada usando a Equação 1, abaixo. O coeficiente de extinção da hemina em 5 mM de NaOH é 58400 M-1 cm-1 (Kirschner-Zilber et al., 1982; Biochimica et Biophysica Acta 690:20-30). Equação 1 Chemina concentrada da Etapa (ii) acima = A385 + 58400 × 106

[00154] Aproximadamente 2,5 mL da solução de hemina concentrada foram diluídos para 10 mL (diluição de 4×, aproximadamente 2,5 mM) usando 0,1 M de NaOH. Foram misturados 8 mL de albumina a 25%, 2 mL de água de grau de qualidade para HPLC e 10 mL de 2,5 mM de hemina em solução de 0,1 M de NaOH e depois incubou-se a 37°C por 1 hora. O pH foi ajustado para 7,4 com 5 M de ácido fosfórico (foram necessários ~80-100 μL). Em um frasco volumétrico, a solução diluída foi Q.S. para 25 mL usando água de grau de qualidade para HPLC ou melhor, depois passada através de um filtro de 0,22 μm e dividida em alíquotas de 0,5 mL para o armazenamento subsequente a -80°C, conforme necessário. A concentração final de albumina era aproximadamente de 1,21 mM (com base em 66 kDa, 80 mg/mL). A concentração final do complexo de heme-albumina é igual à concentração de hemina concentrada calculada da Equação 1, acima, dividida pelo fator de diluição total de

10. (iii) Diluição da amostra de teste de hemopexina

[00155] As soluções de hemopexina foram diluídas, usando pipetas ajustáveis calibradas, para aproximadamente 10 mg/mL de hemopexina em PBS. (iv) Controle de ensaio de hemopexina

[00156] Um controle de ensaio de hemopexina é uma amostra de hemopexina com uma atividade funcional estabelecida (conhecida). Ao analisar as amostras de teste de hemopexina, o controle de ensaio é incluído em cada ensaio. Para estabelecer o valor da atividade de uma amostra de controle de hemopexina, o ensaio de transferência de heme descrito acima pode ser realizado pelo menos três vezes, em dias diferentes, sobre a amostra de controle. A % de CV de diferentes repetições estará idealmente dentro de 10%, caso contrário, repita o ensaio com tampão e reagente recentemente preparados. (v) Transferência da heme da albumina para a hemopexina

[00157] Em uma cubeta de plástico, foram misturados 250 μL de solução de heme-albumina com 600 μL de 10 mg/mL de amostra de teste de hemopexina ou controle de ensaio e 1150 μL de PBS. As misturas para cada amostra foram então preparadas em triplicata usando uma única diluição de hemopexina, como resumido acima. As misturas foram incubadas a 37°C por 10-20 minutos e os valores de absorbância no espectrofotômetro de UV-Vis foram medidos usando o Modo de Leituras Avançadas e o suporte de 18 células. O espectrofotômetro foi zerado com PBS antes da medição. As seguintes definições foram usadas:  Comprimentos de onda: 533 nm, 622 nm e 700 nm. Tempo médio: 1 s. Temperatura da cubeta: 37 °C. vi) Cálculo, análise de dados e critérios de aceitação

[00158] Os valores de absorbância a 700 nm são tipicamente mantidos abaixo de 0,1 AU para garantir a mínima interferência na dispersão da luz das leituras. A concentração de heme-hemopexina (i.e., hemopexina ativa total) foi então calculada para cada reação de transferência usando a Equação 2, abaixo. As concentrações calculadas de hemopexina são descritas em unidades de μΜ e as cubetas tinham um comprimento de caminho (ℓ) de 1 cm: Equação 2 CHx = (99,19) A533 _ (143,0) A622 ℓ ℓ

[00159] O resultado foi então multiplicado pelo fator de diluição, para determinar a concentração de hemopexina ativa na solução original. As triplicatas de cada amostra tiveram então a média calculada. A concentração média de hemopexina ativa para o controle de ensaio deve estar tipicamente dentro de 10% do valor previamente estabelecido para essa batelada de controle de ensaio. F. Métodos para avaliação da estabilidade e caracterização indicativa da proteína

[00160] A Tabela 2 resume todos os outros ensaios e procedimentos, os quais foram utilizados para uma investigação adicional da estabilidade da Hpx e caracterização da proteína. Tabela 2. Ensaios para avaliar a Estabilidade e a Caracterização da hemopexina

Ensaio Unidade Métodos Procedimento (SOP) Análoga ao BRN-TEI-0000165 Distribuição do % SEC-HPLC Coluna: Diol 300, Fluxo 0,5-1,0 tamanho molecular mL/min IEF e distribuição - 2D PAGE protocolo de laboratório do tamanho Distribuição de - SDS-PAGE Análoga a BRN-TEI-0000274 proteínas Proteína g/L Biureto BRN-TEI-0000265 Proteína g/L A280 protocolo de laboratório Viscosidade mPa*s Reômetro protocolo de laboratório Dispersão da luz - DLS protocolo de laboratório dinâmica Dispersão da luz - SEC-MALS protocolo de laboratório estática Exemplo 1. Caracterização bioquímica da Hemopexina humana purificada (formulada em PBS)

[00161] Em uma primeira abordagem, a Hpx purificada, formulada em PBS foi analisada por vários métodos bioquímicos, para definir os referenciais analíticos (valores de referência). Os dados de SDS- PAGE e SEC-HPLC demonstraram uma pureza de proteína de > 98% para a Hpx purificada (Figura 3). Como mostrado anteriormente por outros (Mauk, 2011), a Hpx exibiu um peso molecular aumentado sob condições redutoras (aprox. 65 - 70 kDa) em comparação com as não redutoras (aprox. 60 kDa) (Figura 3A). A distribuição do tamanho molecular por SEC-HPLC revelou um pico principal, que corresponde à Hpx monomérica com uma massa molar de 57 kDa (confirmada por medição com SLS, Figura 3C). Nas amostras envelhecidas e submetidas à tensão térmica, dois picos de fragmentos distintos puderam ser identificados (32-35 kDa e 17-20 kDa) e dois picos correspondendo a espécies de maior peso molecular, uma das quais foi identificada como um dímero de Hpx (130-138 kDa). O segundo pico correspondeu a um peso molecular ainda maior, refletindo os polímeros ou os agregados maiores.

[00162] Além disso, por focagem isoelétrica isoelétrico, o ponto isoelétrico teórico em pH 6,55 pode ser confirmado (aprox. pH 6), como mostrado na Figura 3B, e as múltiplas bandas de Hpx puderam ser atribuídas à variabilidade dos carboidratos, especialmente o grau de sialilação, como descrito por Mauk, 2011. A análise por 2D-PAGE revelou apenas uma quantidade menor de impurezas.

[00163] Finalmente, a hemopexina humana foi concentrada (formulada em PBS, pH 7,4) até 350 g/L (35%) e as amostras foram obtidas intermitentemente, para analisar a viscosidade da solução na concentração de proteína correspondente (Figura 3D). Como mostrado abaixo, até uma concentração de 300 g/L, a viscosidade permaneceu abaixo de 20 mPa*s, o que é considerado como uma viscosidade permissiva para qualquer sistema de liberação (Du, 2011; Biotechnology and Bioengineering, pp. 632-636). Exemplo 2. Triagem do tampão

[00164] Vários candidatos a tampão foram definidos e o exame quanto às condições ótimas de tampão em termos de estabilidade térmica foi realizado por DSF. Foi mostrado que esse método de alto rendimento se correlaciona muito bem com os dados da DSC (calorimetria de varredura diferencial), porém tem a vantagem que diversas condições podem ser analisadas simultaneamente. Em um primeiro exame, todos os tampões foram analisados na presença e na ausência de 150 mM de cloreto de sódio e em incrementos de pH de pelo menos 0,5, dentro da faixa de capacidade de tampão dos tampões correspondentes. Na Tabela 3, abaixo, estão resumidas todas as condições analisadas. Além disso, os ambientes de tampão mais promissores para a Hpx (D, G e K) foram analisados adicionalmente em relação às diferentes concentrações de tampão (15-300 mM) e à adição de diferentes concentrações de cloreto de sódio (50-600 mM), como mostrado na Tabela 3, abaixo. Tabela 3. Visão geral dos tampões analisados. faixa de Concentração N° Tampão NaCl [mM] pHs iônica [mM] A PBS* 7,4 10 140 B Acetato de sódio 3,7-5,6 100 0; 150 C Citrato 3,0-6,2 100 0; 150 D Citrato fosfato (a) 2,6-7,6 15-200 0; 50-600 E Histidina 5,5-7,4 100 0; 150 F Imidazol 6,2-7,8 100 0; 150 G Fosfato de sódio (b) 5,7-8,0 25-300 0; 50-300 H Fosfato de potássio 5,8-8,0 100 0; 150 Tris I 7,2-9,0 100 0; 50-250 (Tris(hidroximetil)aminometano) J Arginina 8,0-12,0 100 150 K Glicina (c) 8,8-10,6 25-200 150 L Carbonato de sódio 9,2-10,8 100 0; 150 * A Hpx formulada em PBS (10 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCl, pH 7,4) serviu como uma referência.

[00165] Para cada condição, o valor de Tm correspondente foi determinado e comparado com a Hpx em PBS, pH 7,4, que serviu como Tm de referência. Os resultados foram expressos como a Tm absoluta ou como delta Tm em relação à referência (Tm de Hpx diluída em PBS). Como mostrado na Figura 4A, três tampões (a, b e c; citrato fosfato, fosfato de sódio e glicina) induziram um deslocamento térmico em direção a uma Tm claramente mais alta de Hpx, o que implicou um efeito estabilizador sobre a proteína. Além disso, na ausência de cloreto de sódio, todos os três tampões mostraram um início prematuro de fusão das proteínas (dados mostrados no Apêndice A; exame I), demonstrando a necessidade de cloreto de sódio como estabilizador. Esta observação foi ainda analisada suplementando os três tampões estabilizadores com diferentes concentrações de cloreto de sódio (50-250 mM). Como mostrado nas Figuras 4A e B, com as concentrações crescentes de cloreto de sódio, uma estabilidade térmica aumentada pode ser atingida em uma maneira dependente da dose. Uma ampla faixa de pHs pode ser coberta com todos os tampões testados, no entanto, de acordo com a Figura 4C, um pH entre 7,0 e 7,6 pareceu ser a condição ideal.

[00166] A Hpx formulada em tampão de citrato fosfato (200 mM) e na presença de 150 mM de NaCl, em pH 7,2, resultou em uma estabilidade térmica bem boa (Tm: 7°C), porém a osmolaridade resultante foi desfavoravelmente alta (aprox. 880 mOsm/L). Portanto, várias combinações de concentrações de citrato fosfato e concentrações de cloreto de sódio foram analisadas, como mostrado na Figura 4D. Para manter uma estabilidade térmica semelhante em concentrações mais baixas de citrato fosfato, precisa ser aplicada uma concentração mais alta de cloreto de sódio, que não tenha ou tenha um impacto mesmo crescente sobre a osmolaridade geral da solução. Uma osmolaridade mais baixa só pode ser atingida diminuindo ambos, o tampão e o cloreto de sódio, porém isso também causa estabilidade térmica reduzida.

[00167] Em resumo, um sistema tampão compreendendo citrato ou fosfato de sódio em pH neutro e em combinação com cloreto de sódio (> 150 mM) pode ser uma formulação apropriada para hemopexina derivada do plasma humano, pelo menos em termos de estabilidade térmica. A hemopexina foi subsequentemente diafiltrada em diferentes sistemas tampão dos sais mencionados acima e em diferentes combinações de concentrações, conforme descrito nas seções a seguir.

[00168] Os conjuntos de dados completos de todas as combinações analisadas estão resumidos no Apêndice A.

Exemplo 3. Exames dos excipientes

3.1 Açúcares

[00169] O impacto dos açúcares sobre a estabilidade térmica foi explorado. Os tampões previamente definidos, que produziram uma estabilidade térmica da proteína aumentada, foram suplementados com diferentes açúcares, em diferentes concentrações. Resumidamente, a sacarose, a trealose ou o manitol, em concentrações de 2,5%, 5%, 7,5% e 10%, foram adicionados na presença de 150 mM de NaCl nos tampões correspondentes, como mostrado na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Visão geral dos açúcares analisados Concentração Osmolaridade Tampão pH Açúcar [%] [mOsm/L] 200 mM de Citrato 7,2 Sacarose 2,5, 5, 7,5, 10 908-1127 fosfato 200 mM de Citrato 7,2 Trealose 2,5, 5, 7,5, 10 901-1099 fosfato 200 mM de Citrato 7,2 Manitol 2,5, 5, 7,5, 10 972-1384 fosfato 100 mM de Fosfato de 7,8 Sacarose 2,5, 5, 7,5, 10 665-884 sódio 100 mM de Fosfato de 7,8 Trealose 2,5, 5, 7,5, 10 658-856 sódio 100 mM de Fosfato de 7,8 Manitol 2,5, 5, 7,5, 10 729-1141 sódio 100 mM de Tampão de 9,6 Sacarose 2,5, 5, 7,5, 10 473-692 glicina 100 mM de Tampão de 9,6 Trealose 2,5, 5, 7,5, 10 466-664 glicina 100 mM de Tampão de 9,6 Manitol 2,5, 5, 7,5, 10 537-949 glicina

[00170] A estabilidade térmica foi avaliada com as mesmas definições como descritas acima e os resultados foram expressos como a Tm absoluta ou como delta Tm em relação à Tm de Hpx diluída em PBS. Como mostrado na Figura 5, não há nenhum aumento ou há apenas um aumento sem grande importância da estabilidade térmica, o qual está limitado às maiores concentrações de açúcar. Por definição, é necessário um efeito significativo sobre a estabilidade térmica para representar uma alteração de pelo menos um grau (marcado nas figuras como linhas tracejadas); todas as alterações abaixo disso estão mais provavelmente dentro do erro de medição.

[00171] Para a Hpx formulada com citrato fosfato, todos os açúcares testados não tiveram efeito aditivo sobre a estabilidade térmica, uma vez que a Tm já estava elevada (aprox. 60 °C) em comparação com a formulação de referência (PBS; Tm: 53 °C). No caso da Hpx formulada com fosfato de sódio, houve um claro aumento dependente da dose após a adição dos três açúcares, porém novamente um aumento significativo foi atingido apenas com as concentrações mais altas. Na Hpx formulada com glicina, houve também um aumento da Tm dependente da dose de açúcar, porém a estabilidade térmica atingida ainda era ainda muito menor do que com a formulação de citrato fosfato.

3.2 Aminoácidos

[00172] Para completar o exame por DSF, os aminoácidos como excipientes foram analisados quanto à sua capacidade de estabilizar a Hpx. Os aminoácidos foram selecionados de acordo com os seus potenciais efeitos estabilizadores, com base nas publicações relatadas. Cada subtipo, isto é, aminoácido polar, carregado e hidrofóbico, foi representado. Um resumo de todas as condições analisadas é mostrado na Tabela 5 abaixo. Tabela 5. Visão geral dos aminoácidos

Concentração Osmolaridade Tampão pH Aminoácido [mM] [mOsm/L] 200 mM de citrato 7,2 L-arginina 50, 100 885-935 fosfato 200 mM de citrato 7,2 L-prolina 50, 100 885-935 fosfato 200 mM de citrato ácido L- 7,2 50 885 fosfato glutâmico 200 mM de citrato 7,2 L-serina 50, 100 885-935 fosfato 200 mM de citrato 7,2 L-glicina 50, 100 885-935 fosfato 200 mM de citrato 7,2 L-isoleucina 50, 100 885-935 fosfato 200 mM de citrato 7,2 L-valina 50, 100 885-935 fosfato

[00173] Cada aminoácido foi analisado na presença de 200 mM de tampão de citrato fosfato, em pH 7,2, em duas concentrações diferentes (50 μΜ e 100 μΜ). Devido à insolubilidade a 100 μΜ, o ácido glutâmico foi analisado apenas a 50 μΜ. Os dados são apresentados na Figura 6 e, de maneira semelhante aos resultados obtidos com os açúcares, apenas aumentos sem grande importância na estabilidade térmica foram atingidos pela adição de aminoácido, a mais alta margem vista com arginina e prolina. Com base nesses resultados, a contribuição dos aminoácidos para a estabilidade da hemopexina em solução parece ser insignificante.

3.3 Detergentes não iônicos: Polissorbato 80 (P80)

[00174] Os tensoativos não iônicos podem ser usados em formulações de proteínas para inibir a agregação de proteínas devida à agitação ou sacudida. A capacidade de estabilizar proteínas é atribuída principalmente à sua capacidade de superar competitivamente as moléculas de proteínas pelas superfícies hidrofóbicas, como as interfaces ar-água, pelo que impedindo que as proteínas se desdobrem nessas interfaces hidrofóbicas. Neste estudo, foram investigados os potenciais efeitos estabilizadores do polissorbato 80 (P80) sobre a hemopexina em solução. Como o corante fluorescente usado para as análises de DSF se liga à cauda hidrofóbica do P80, foram utilizados ensaios de estabilidade alternativos para avaliar a influência do P80 nas formulações de Hpx. Resumidamente, a Hpx foi concentrada até uma concentração final de proteína de 10% (100 mg/mL) e diafiltrada contra (i) 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7,2 ou (ii) PBS, pH 7,4, como mostrado na Tabela 6, abaixo. O polissorbato 80 foi introduzido nas soluções de Hpx formuladas por último em concentrações a partir de 0,001% até 0,1%. Uma amostra não enriquecida serviu como controle. Tabela 6. Visão geral das formulações contendo polissorbato 80 Tampão pH NaCl [mM] concentrações [%] 200 mM de citrato 7,2 150 0,1, (0,02,) 0,01, (0,002,) 0,001, sem fosfato PBS 7,4 140 0,1, (0,02,) 0,01, (0,002,) 0,001, sem

[00175] As formulações com o P80 introduzido foram expostas a condições de tensão variadas, incluindo agitação e ciclos de congelar/degelar, conforme mostrado na Tabela 7, abaixo, para avaliar as suas estabilidades relativas durante um período de armazenamento de três meses, na temperatura ambiente (TA) e a 37°C. Tabela 7. Condições de tensão e pontos de tempo Tensão Condições Ponto de tempo de estabilidade (meses) agitação 1000 rpm a 25°C por 4 h 0 ciclos de -70°C até a temperatura ambiente, 5 0 congelar/descongelar ciclos consecutivos temperatura 25°C e 37°C 0, 1, 2 e 3

[00176] Em uma primeira série de experimentos, cada formulação de Hpx foi submetida a uma agitação constante para entender a estabilidade do produto sob tensão de cisalhamento, para determinar se o tensoativo não iônico seria benéfico ou não, em relação à estabilidade da proteína. As amostras foram agitadas sobre um termociclador de topo de bancada a 1000 rpm, por 4 horas, a 25 °C. Um conjunto idêntico de amostras sem agitação serviu como controle. Após o período de agitação, as amostras foram analisadas por SEC- HPLC, como mostrado na Figura 7. As formulações agitadas não demonstraram grande agregação por tensão, bem como nenhuma alteração na formação de dímero ou fragmento. Além disso, todas as 8 formulações foram submetidas a 5 ciclos consecutivos de congelar/descongelar, a partir de -70°C até a temperatura ambiente, para avaliar a estabilidade física; novamente um conjunto de formulações idênticas sem ser submetido aos ciclos de congelar/descongelar foi usado como controle. A SEC-HPLC, como mostrado na Figura 7, revelou que, após 5 ciclos consecutivos de congelar/descongelar, a quantidade de agregados aumentou ligeiramente em comparação com o grupo de controle não tratado. Esta observação foi feita em todas as 8 formulações, independente de uma concentração específica de P80. Curiosamente, as formulações que foram submetidas aos ciclos de congelar/descongelar não apresentaram fragmentos.

[00177] Embora a SEC-HPLC revelasse um ligeiro aumento nos agregados após os ciclos consecutivos de congelar/descongelar, embora independente de uma concentração específica de P80, nenhuma diferença foi observada após todas as amostras serem analisadas por SDS-PAGE (reduzidas e não reduzidas), como mostrado na Figura 8. Além disso, a capacidade da Hpx de ligar a heme, que foi demonstrada pelo ensaio de ligação à heme (Figura 9), não foi afetada pela presença de diferentes concentrações de P80. As diferenças na capacidade de ligação à heme entre as várias concentrações de P80 estão dentro da variabilidade do ensaio (<5 %). Portanto, o P80 não prejudica a ligação à heme em qualquer concentração e tratamento testados.

[00178] Como descrito acima, todas as formulações foram armazenadas sob condições aceleradas (37 °C) e na TA por pelo menos 3 meses e as amostras foram analisadas após cada mês de armazenamento (ver o Exemplo 4, abaixo). Exemplo 4. Estudos de estabilidade sob diversas condições

4.1. Preparação da Formulação

[00179] As condições previamente preferidas, baseadas na DSF, como descrito acima, foram investigadas ainda mais através da realização de estudos de estabilidade sob diferentes condições de armazenamento (prazos curto e longo). Resumidamente, a Hpx formulada em PBS foi concentrada até 10% de Hpx e diafiltrada nas composições de tampão e excipiente desejadas, como mostrado na Tabela 8, abaixo. Os ajustes de pH foram realizados titulando cuidadosamente 0,2 M de HCl ou 0,2 M de NaOH, se necessário. Posteriormente, cada formulação foi filtrada estéril, inserida em frascos pequenos de vidro estéreis e armazenada em diferentes temperaturas, para a análise subsequente nos pontos de tempo 0, 1, 2 e 3 meses ou conforme indicado de outra forma. Tabela 8. NaCl P80 osmolaridade viscosidade N° Tampão pH Tm [°C] [mM] [%] [mOsm/L] [mPa*s] Estudo de estabilidade de curto prazo com P80 (estudo de estabilidade da Hpx 2 e 4) I PBS 140 7,4 0,1 307 n/d 2,9 II PBS 140 7,4 0,02 307 n/d 2,8 III PBS 140 7,4 0,01 307 n/d 3,0 IV PBS 140 7,4 0,002 307 n/d 2,7 V PBS 140 7,4 0,001 307 n/d 3,3 VI PBS 140 7,4 - 307 n/d 3,2

Tabela 8 (continuação) NaCl P80 osmolaridade viscosidade N° Tampão pH Tm [°C] [mM] [%] [mOsm/L] [mPa*s] Estudo de estabilidade: formulações principais 200 mM de a 150 7,2 0,002 876 60,3 ± 0,5 2,2 citrato fosfato 200 mM de b 300 7,2 0,002 1176 63,4 ± 0,2 3,4 citrato fosfato 100 mM de c fosfato de 150 7,6 0,002 587 57,2 ± 0,2 2,5 sódio 100 mM de d fosfato de 300 7,6 0,002 887 59,7 ± 0,5 3,0 sódio 300 mM de e fosfato de 150 7,6 0,002 1161 64,3 ± 0,5 3,1 sódio f PBS 140 7,4 - 307 53,1 ± 0,5 3,2 Estudo de estabilidade: formulação principal com fosfato reduzido e osmolaridade reduzida 15 mM de (1) 150 7,2 0,01 343 53,7 ± 0,1 2,8 citrato fosfato 15 mM de (2) 300 7,2 0,01 643 56,1 ± 0,4 2,7 citrato fosfato 50 mM de (3) 200 7,2 0,01 544 57,3 ± 0,2 2,8 citrato fosfato 50 mM de (4) 400 7,2 0,01 944 59,8 ± 0,2 2,6 citrato fosfato 200 mM de (5) 150 7,2 0,01 876 60,3 ± 0,5 3,2 citrato fosfato

4.2 Estudo de estabilidade de curto prazo com diferentes concentrações de polissorbato 80 em PBS

[00180] A Hpx formulada em PBS foi concentrada para 10% e subsequentemente enriquecida com diferentes concentrações de P80, como mostrado na Tabela 8 (l-VI).

[00181] Todas as formulações foram armazenadas por 3 meses, protegidas da luz, na temperatura ambiente e 37 °C. Em cada ponto de tempo, as amostras foram analisadas por SEC-HPLC para monitorar a geração potencial de oligômeros e fragmentos. Os resultados da distribuição do tamanho molecular para cada concentração de P80 após 3 meses são mostrados na Figura 10.

[00182] Após armazenamento a 37 °C, cada uma das formulações de Hpx mostrou um aumento significativo em agregados (após 3 meses, 63-70%), em comparação com as formulações armazenadas por 3 meses na TA (aumento de < 1% em agregados). Os resultados da porcentagem de área do pico a partir da análise por SEC-HPLC das amostras de controle e contendo P80, após armazenamento a 37 °C por 3 meses, são mostrados na Tabela 9, abaixo. Os resultados completos de SEC-HPLC a partir dos pontos de tempo zero, um, dois e três meses, para ambas as condições de armazenamento, são mostrados no Apêndice A. Tabela 9. Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 37°C por 3 meses. N° Formulação Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos [%] [%] [%] [%] I PBS, P80 a 0,1%, pH 7,2 69,6 0,0 20,7 9,7 II PBS, P80 a 0,02%, pH 7,2 66,8 0,0 23,3 10,0 III PBS, P80 a 0,01%, pH 7,2 66,4 0,0 23,5 10,1 IV PBS, P80 a 0,002%, pH 7,2 64,5 1,0 24,3 10,2 V PBS, P80 a 0,001%, pH 7,2 64,3 1,1 24,5 10,1 VI PBS, pH 7,4 63,8 1,2 24,9 10,2

[00183] Além disso, a capacidade de ligação à heme da hemopexina foi avaliada em cada ponto de tempo, durante um período de três meses, e os dados (Figura 11) revelaram um quadro semelhante ao observada após a análise de dados por SEC-HPLC. A ligação à heme foi altamente reduzida de 95% para aprox. 20-25% após armazenamento a 37°C, por 3 meses, o que se correlaciona muito bem com a quantidade de monômeros de Hpx naquele ponto de tempo (Tabela 9). Novamente, não foram observadas diferenças entre as concentrações de P80, exceto a maior concentração de P80 (0,1%, curva preta), que mostrou menor atividade de ligação à heme em comparação com as outras concentrações.

[00184] As amostras armazenadas na TA, por três meses, mostraram uma correlação semelhante entre a atividade e o teor de monômero de Hpx. No entanto, a diferença entre a amostra contendo P80 a 0,1% e todas as outras amostras foi menos pronunciada na TA do que a 37 °C (Figura 11B).

[00185] Em resumo, as concentrações de P80 de 0,02% e abaixo não prejudicaram a estabilidade em relação à distribuição do tamanho molecular e à atividade de ligação à heme. Verificou-se também que a Hpx formulada em PBS, independentemente da concentração de P80, exibiu uma forte redução do teor de monômero de proteína e da atividade de ligação à heme ao longo de 3 meses, a 37 °C. Portanto, a formulação de PBS não está proporcionando a estabilidade necessária da Hpx em temperaturas de aceleração.

4.3. Estudo de estabilidade: formulações principais

[00186] Foram produzidas Hpx formuladas em diferentes tampões e concentrações de sal, conforme resumido na Tabela 8 (a-f). Todas as formulações foram enriquecidas com P80 para atingir uma concentração final de P80 de 0,002% (exceto em PBS) e foram armazenadas por pelo menos 6 meses, protegidas da luz, a 2-8°C, TA (25°C) ou 37°C. Em cada ponto de tempo, as amostras foram coletadas e submetidas à análise por SEC-HPLC para medir a quantidade de monômeros, oligômeros e fragmentos de Hpx (Tabela 10). Os resultados da distribuição do tamanho molecular são mostrados na Figura 12. Não foram observadas alterações significativas em agregados e fragmentos entre as diferentes formulações e a Hpx monomérica (> 94%) permaneceu estável durante todo o período do estudo (24 meses), se armazenada a 2-8°C. Da mesma forma, as formulações armazenadas na TA (24 meses) permaneceram praticamente inalteradas, exceto por um ligeiro aumento nos fragmentos ao longo do tempo, o qual foi observado independentemente da formulação. Após armazenamento a 37°C, cada uma das formulações de Hpx mostrou um aumento em agregados e fragmentos, ao passo que a Hpx formulada com citrato fosfato pareceu ser a formulação mais estável. A estabilidade na formulação de citrato fosfato foi melhorada ainda mais por uma concentração aumentada de cloreto de sódio (formulações A e B), como mostrado pelo teor de monômero de Hpx de 63,3% (150 mM de NaCl) e 68,9% (300 mM de NaCI) após 6 meses sob condições aceleradas (37°C).

[00187] As formulações compreendendo tampão de fosfato de sódio eram menos estáveis e exibiram um aumento de agregados de até 36% após 6 meses (com melhor resultado na presença de concentrações de sal maiores ou concentrações de tampão aumentadas). O teor de fragmentos permaneceu muito baixo na TA e a 2-8°C, ao passo que cerca de 20% de fragmentos foram gerados ao longo do tempo, a 37°C.

[00188] Esses dados se correlacionam muito bem com os dados de estabilidade térmica derivados por DSF. Portanto, a Tm de Hpx em uma formulação específica pode ser usada como um indicador para o resultado de um estudo de estabilidade de curto prazo em concentrações mais altas de proteína. Tabela 10. Dados de SEC-HPLC após armazenamento conforme indicado.

N° Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos Formulação [%] [%] [%] [%]

Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 37°C por 6 meses 200 mM de citrato fosfato, a 150 mM de NaCl, P80 a 14,2 1,8 63,3 20,8 0,002%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, b 300 mM de NaCl, P80 a 8,5 2,0 69,0 20,6 0,002%, pH 7,2 100 mM de fosfato de sódio, c 150 mM de NaCl, P80 a 36,7 1,9 41,6 19,7 0,002%, pH 7,6 100 mM de fosfato de sódio, d 300 mM de NaCl, P80 a 18,6 2,3 57,5 21,6 0,002%, pH 7,6 300 mM de fosfato de sódio, e 150 mM de NaCl, P80 a 19,1 1,9 55,6 23,4 0,002%, pH 7,6 f PBS, pH 7,4 68,3 1,5 15,3 14,8 Tabela 10 (continuação) Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos N° Formulação [%] [%] [%] [%] Dados de SEC-HPLC após armazenamento na temperatura ambiente por 12 meses 200 mM de citrato a fosfato, 150 mM de NaCl, 1,4 2,6 85,3 10,6 P80 a 0,002%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, b 300 mM de NaCl, P80 a 1,1 2,7 85,9 10,3 0,002%, pH 7,2 100 mM de fosfato de sódio, c 150 mM de NaCl, P80 a 4,5 4,4 80,3 10,9 0,002%, pH 7,6 100 mM de fosfato de sódio, d 300 mM de NaCl, P80 a 2,2 3,3 83,8 10,7 0,002%, pH 7,6 300 mM de fosfato de sódio, e 150 mM de NaCl, P80 a 2,2 3,8 82,1 11,85 0,002%, pH 7,6 f PBS, pH 7,4 7,5 5,0 78,5 9,0

Tabela 10 (continuação)

N° Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos Formulação [%] [%] [%] [%] Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 2-8 °C por 12 meses 200 mM de citrato fosfato, a 150 mM de NaCl, P80 a 0,8 0,9 96,7 1,6 0,002%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, b 300 mM de NaCl, P80 a 0,8 1,0 96,6 1,6 0,002%, pH 7,2 100 mM de fosfato de c sódio, 150 mM de NaCl, 1,0 2,6 94,7 1,8 P80 a 0,002%, pH 7,6 100 mM de fosfato de d sódio, 300 mM de NaCl, 0,9 1,4 96,1 1,7 P80 a 0,002%, pH 7,6 300 mM de fosfato de e sódio, 150 mM de NaCl, 0,9 1,4 96,0 1,8 P80 a 0,002%, pH 7,6 f PBS, pH 7,4 1,2 2,7 94,5 1,6

Tabela 10 (continuação)

Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos N° Formulação [%] [%] [%] [%]

Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 2-8 °C por 24 meses

200 mM de citrato fosfato, a 150 mM de NaCl, P80 a 0,8 1,5 95,2 2,6 0,002%, pH 7,2

200 mM de citrato fosfato, b 300 mM de NaCl, P80 a 0,8 1,4 95,4 2,4 0,002%, pH 7,2 100 mM de fosfato de c sódio, 150 mM de NaCl, 1,1 4,7 91,7 2,4 P80 a 0,002%, pH 7,6

100 mM de fosfato de d sódio, 300 mM de NaCl, 0,9 2,6 94,2 2,3 P80 a 0,002%, pH 7,6 300 mM de fosfato de e sódio, 150 mM de NaCl, 0,9 2,2 94,4 2,6 P80 a 0,002%, pH 7,6 f PBS, pH 7,4 1,5 4,4 92,2 2,0

[00189] A estabilidade da Hpx nestas formulações também foi analisada por SDS-PAGE. A partir de cada formulação, uma amostra foi coletada no tempo zero e após 3 meses e analisada por SDS- PAGE não reduzida ou reduzida para cada temperatura de armazenamento, conforme ilustrado na Figura 13. Os dados das análises por SDS-PAGE estavam consistentes com os resultados por SEC-HPLC. No armazenamento a 2-8 °C, não foram observadas bandas adicionais ou mudanças significativas na intensidade da banda sob condições reduzidas e não reduzidas. As amostras armazenadas na TA mostraram uma banda de baixa intensidade em aproximadamente 125 kDa, mais provavelmente refletindo a formação de dímeros de Hpx, e várias bandas de baixo peso molecular, mais notavelmente em torno de 30 kDa e 20 kDa. Essas verificações estão de acordo com a determinação do tamanho do fragmento por SLS em amostras "envelhecidas e submetidas à tensão térmica" (ver a Figura 3C). Sob SDS-PAGE não reduzida, as amostras armazenadas a 37 °C exibiram bandas intensas de alto peso molecular acima de 250 kDa, em consequência disso a intensidade para cada formulação correlacionou-se bem com os agregados detectados por SEC-HPLC. Além disso, foi observado um padrão de banda de baixo peso molecular, como visto com as amostras na TA, porém de intensidade aumentada.

[00190] Como um parâmetro funcional, a ligação à heme da Hpx foi avaliada em cada ponto de tempo para cada formulação. Como é mostrado na Figura 14, após incubação a 37 °C, a ligação da hemopexina à heme diminuiu ao longo do tempo e esta diminuição correlacionou-se fortemente com o teor de monômero de Hpx correspondente (conforme determinado por SEC-HPLC).

4.4. Estudo de estabilidade: formulações principais com concentração de fosfato menor e osmolaridade reduzida

[00191] Sob condições aceleradas, as formulações (em uma concentração de proteína de 10%) compreendendo (i) 200 mM de citrato fosfato e 150 mM ou (ii) 300 mM de cloreto de sódio, em pH 7,2, mostraram a maior estabilidade. Embora a sua osmolaridade geral (876 mOsm/L e 1176 mOsm/L, respectivamente) fosse alta, elas ainda são adequadas para administração intravenosa (i.v.), observando que atualmente existem medicamentos licenciados para aplicação i.v. com formulações que tenham uma osmolaridade comparativamente alta (i.e., 12% de Sandoglobulina, 892,3 mOsm/L, devido à alta concentração de sacarose). Além disso, esses medicamentos são infundidos em uma dosagem muito maior (> 100 mL/injeção) do que atualmente estimado para um produto de Hpx (i.e., < 20 - 30 mL/injeção). Os dados por DSF sugerem que existe uma relação direta entre a osmolaridade e a estabilidade térmica, como mostrado na Figura 4. Para manter uma estabilidade térmica igual, uma menor concentração de citrato fosfato pode ser combinada com uma maior concentração de cloreto de sódio e vice-versa. Embora os resultados gerados por DSF e a Tm correspondente para cada formulação sejam considerados preditivos em termos de comportamento em estudos de estabilidade de curto prazo, sob condições aceleradas (37 °C), várias soluções de Hpx formuladas com uma menor concentração de excipiente foram produzidas para os estudos de estabilidade de três meses, conforme mostrado na Tabela 8 (1-5). Todas as formulações foram enriquecidas com P80 para atingir uma concentração final de P80 de 0,01% e foram armazenadas por pelo menos um período de 6 meses, protegidas da luz, a 2-8°C, TA (25 °C) ou 37 °C. Nos pontos de tempo mensais, as amostras foram coletadas do armazenamento em temperatura e analisadas.

[00192] Os resultados da distribuição do tamanho molecular para cada formulação, durante um período de pelo menos 6 meses, são mostrados na Tabela 11 e na Figura 15. A 2-8 °C, o teor de Hpx monomérica (> 93%) permaneceu estável durante todo o período de estudo (24 meses) e existem apenas pequenas diferenças na TA após 24 meses. Na temperatura de aceleração de 37 °C, cada uma das formulações de Hpx mostrou um aumento acentuado de agregados e fragmentos ao longo do tempo. Grandes diferenças entre as formulações foram verificadas em relação ao teor de agregados. As formulações quase isotônicas promoveram agregação, enquanto as formulações hipertônicas pareceram estabilizar a proteína, como predito pelas análises anteriores por DSF. Tabela 11. Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 37°C por 6 meses.

N° Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos Formulação [%] [%] [%] [%] Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 37°C por 6 meses 15 mM de citrato fosfato, (1) 150 mM de NaCl, P80 a 75,5 0,0 9,4 15,1 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, (2) 300 mM de NaCl, P80 a 27,3 2,1 52,1 18,5 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (3) 200 mM de NaCl, P80 a 36,4 1,9 66,0 19,0 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (4) 400 mM de NaCl, P80 a 13,1 1,9 65,3 19,8 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, (5) 150 mM de NaCl, P80 a 18,0 1,6 58,2 22,2 0,01%, pH 7,2 Tabela 11 (continuação) Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos N° Formulação [%] [%] [%] [%] Dados de SEC-HPLC após armazenamento na TA por 9 meses 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a (1) 0,01%, pH 7,2 4,8 3,2 85,1 6,9

15 mM de citrato fosfato, (2) 300 mM de NaCl, P80 a 2,7 2,4 88,4 6,6 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (3) 200 mM de NaCl, P80 a 3,0 2,4 87,4 7,2 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (4) 400 mM de NaCl, P80 a 2,4 2,3 88,4 6,9 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, (5) 150 mM de NaCl, P80 a 2,9 2,5 86,3 8,3 0,01%, pH 7,2

Tabela 11 (continuação) Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos N° Formulação [%] [%] [%] [%]

Dados de SEC-HPLC após armazenagem a 2-8 °C por 9 meses

15 mM de citrato fosfato, (1) 150 mM de NaCl, P80 a 2,9 1,8 94,2 1,1 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, (2) 300 mM de NaCl, P80 a 2,6 1,6 94,8 1,0 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (3) 200 mM de NaCl, P80 a 2,7 1,5 94,7 1,1 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, (4) 400 mM de NaCl, P80 a 2,7 1,6 94,7 1,1 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, (5) 150 mM de NaCl, P80 a 3,0 1,7 93,9 1,3 0,01%, pH 7,2

Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 2-8°C por 24 meses

15 mM de citrato fosfato, (1) 150 mM de NaCl, P80 a 2,2 2,3 93,3 2,2 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, (2) 300 mM de NaCl, P80 a 1,9 2,3 93,9 1,9 0,01%, pH 7,2

(3) 50 mM de citrato fosfato, 2,0 1,8 93,8 2,4

200 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 4) 400 mM de NaCl, P80 a 1,9 1,9 94,2 2,0 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, (5) 150 mM de NaCl, P80 a 2,2 2,0 93,0 2,8 0,01%, pH 7,2

[00193] As formulações de Hpx acima mencionadas também foram analisadas por SDS-PAGE para cada teor de formulação e temperatura de armazenamento. Uma amostra foi coletada no tempo zero e após 3 meses e analisada por SDS-PAGE redutora (Figura 16) e não redutora (Figura 17), respectivamente. Os dados dessas análises estavam consistentes com os resultados de SEC-HPLC. No armazenamento a 2-8 °C, foram observadas pequenas alterações em termos de bandas adicionais, tanto sob condições reduzidas quanto não reduzidas. As amostras armazenadas na TA mostraram uma intensidade fracamente aumentada da banda fraca em aproximadamente 125 kDa, um aumento mais forte de bandas em torno de 50 kDa e várias bandas moleculares baixas adicionais entre 20 kDa e 40 kDa. Finalmente, as amostras armazenadas a 37 °C exibiram bandas pronunciadas de alto peso molecular, cujas intensidades se correlacionaram bem com o teor de agregados como determinado por SEC-HPLC, bem como bandas adicionais de baixo peso molecular (já observadas, embora com menor intensidade de banda, com as amostras armazenadas na TA).

[00194] A capacidade de ligação à heme da Hpx, como um parâmetro funcional, também foi avaliada em cada ponto do tempo para cada condição de temperatura de armazenamento. Como visto anteriormente com as outras formulações, a ligação da hemopexina à heme correlacionou-se bem com o teor correspondente de monômero de Hpx (conforme determinado por SEC-HPLC) e diminuiu acentuadamente durante o armazenamento a 37 °C (Figura 18).

4.5. Estudo de estabilidade de curto prazo - reprodutibilidade

[00195] Para gerar ainda mais um conjunto de dados para a definição de uma formulação principal para a Hpx humana, as duas formulações mais estáveis identificadas foram preparadas com duas novas bateladas de Hpx, conforme descrito acima, para verificar a reprodutibilidade e qualquer variabilidade de batelada para batelada. As amostras foram armazenadas a 37°C e analisadas por SEC-HPLC e ensaios de ligação à heme.

[00196] Como mostrado nas Tabelas 12-14, abaixo, os resultados derivados das duas formulações baseadas em citrato fosfato eram comparáveis em todos os pontos de tempo analisados, demonstrando uma reprodutibilidade analítica forte, bem como uma consistência de batelada para batelada. Tabela 12. Hpx formulada em PBS, pH 7,4. Média dos dados de SEC- HPLC derivados de diferentes bateladas de Hpx (TO294063, TO290102 e TO294001 + TO294023), armazenadas durante um período de três meses, a 37°C. N = 4 ponto de Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos tempo média Desvio média Desvio média Desvio média Desvio [mês] [%] Pad [%] Pad [%] Pad [%] Pad 0 0,8 0,1 0,7 0,1 98,1 0,3 0,4 0,0 1 24,4 1,5 4,1 0,7 67,0 1,2 4,5 0,2 2 50,7 6,6 2,8 0,8 38,9 6,2 7,7 0,4 3 62,3 6,6 2,1 0,9 25,6 6,0 10,0 0,2 ponto de Ligação à heme tempo média Desvio [mês] [%] Pad 0 95,4 1,7 1 63,0 1,5 2 35,6 8,5 3 21,0 8,1

Tabela 13. Hpx formulada em 200 mM de fosfato de citrato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,2. Média dos dados de SEC-HPLC derivados de diferentes bateladas de Hpx (TO294063, TO290102 e TO294001 + TO294023), armazenadas durante um período de três meses, a 37°C.

N = 3 ponto de Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos tempo média Desvio média Desvio média Desvio média Desvio [mês] [%] Pad [%] Pad [%] Pad [%] Pad 0 0,7 0,1 0,7 0,1 98,2 0,2 0,4 0,0 1 1,2 0,2 1,6 0,1 91,6 0,5 5,6 0,6 2 2,1 0,3 2,1 0,2 85,4 0,8 10,4 1,2 3 3,7 0,5 2,2 0,4 80,8 0,3 13,3 0,6 ponto de Ligação à heme tempo média Desvio [mês] [%] Pad 0 94,9 2,6 1 90,3 0,8 2 85,0 1,7 3 78,2 1,7

Tabela 14. Hpx formulada em 200 mM de fosfato de citrato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7,2. Média dos dados de SEC-HPLC derivados de diferentes bateladas de Hpx (TO294063, TO290102 e TO294001 + TO294023), armazenadas durante um período de três meses, a 37°C.

N = 3 ponto de Agregados Dímeros Monômeros Fragmentos tempo média Desvio média Desvio média Desvio média Desvio [mês] [%] Pad [%] Pad [%] Pad [%] Pad 0 0,7 0,1 0,6 0,1 98,2 0,2 0,4 0,0 1 1,5 0,3 1,6 0,1 91,0 0,3 6,0 0,6 2 3,6 0,3 2,0 0,2 83,4 0,7 10,9 1,2 3 6,3 1,1 2,2 0,5 77,6 1,2 14,0 0,5 ponto de Ligação à heme tempo média Desvio [mês] [%] Pad

0 94,3 3,1 1 89,3 0,6 2 82,2 2,3 3 75,2 1,0 Exemplo 5. Estabilidade da Hpx em tampão de TRIS

[00197] Após a purificação da hemopexina, a solução proteica foi concentrada e diafiltrada em PBS, pH 7,5, para armazenamento. Na preparação para uma etapa de cromatografia para a remoção de solvente detergente, a hemopexina foi diafiltrada em tampão de Tris a 50 mM, observando que a presença de sal na PBS poderia ter interferido com a ligação da hemopexina na resina de troca aniônica forte Capto Q que deveria ser usada para remoção de solvente detergente. O Tris a 50 mM, pH 7,4, foi escolhido como o tampão de armazenamento de hemopexina para não interferir com esta etapa de cromatografia.

[00198] Duas bateladas de hemopexina, TO302001 e T0294131, foram preparadas em tampão de Tris a 50 mM, pH 7,5. Após análise por SEC-HPLC, era evidente a agregação proteica significativa nestas bateladas de hemopexina tamponadas com Tris. Um resumo do teor de monômero, conforme determinado através de análise por SEC- HPLC para diversas bateladas de hemopexina em PBS, bem como as duas bateladas em Tris, é mostrado na Tabela 15 abaixo. Como mostrado pelos resultados na Tabela 15, houve uma queda significativa na quantidade de monômero de Hpx nas bateladas de Hpx tamponadas com Tris, quando comparadas às bateladas de Hpx tamponadas com PBS. A redução no teor de monômeros foi associada à presença aumentada de múltiplos picos de alto peso molecular que normalmente não estão presentes nas preparações de Hpx. Tabela 15: Análise por SEC-HPLC dos Concentrados Finais de Hemopexina

Batelada de Data de % de Tampão Hemopexina Produção Monômero TO294001 31-3-15 PBS, pH 7,5 98,78 TO294023 4-4-15 PBS, pH 7,5 98,58 TO294063 1-5-15 PBS, pH 7,5 98,46 TO290235 29-5-15 PBS, pH 7,5 98,00 TO302001 18-6-15 Tris a 50 mM, pH 7,5 65,15 TO294131 31-7-15 Tris a 50 mM, pH 7,5 65,84

[00199] A estabilidade da hemopexina em diferentes tampões foi investigada ainda mais usando diálise e análise por SEC-HPLC para duas bateladas diferentes de Hpx. Uma amostra da batelada de Hpx TO302001, armazenada em Tris a 50 mM, foi dialisada em PBS para determinar se a agregação de proteínas era reversível após armazenamento em tampão de Tris. As amostras da batelada de Hpx TO290235, armazenadas em PBS, foram dialisadas em Tris a 50 mM e também em 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, para determinar se a diálise em PBS, antes da diálise em tampão de Tris ou 20 mM de fosfato de sódio, impediria a agregação de Hpx. Os resultados deste estudo são apresentados na Tabela 16, abaixo. Tabela 16: Estabilidade da hemopexina nos tampões de Tris, PBS e fosfato de sódio Tampão de Batelada de % de Armazenamento Tampão de Diálise Hemopexina Monômero Inicial TO302001 Tris a 50 mM, pH PBS, pH 7,5 68,39 7,5 TO290235 PBS, pH 7,5 Tris a 50 mM, pH 7,5 70,25 TO 290235 PBS, pH 7,5 20 mM de fosfato de 96,92 sódio, pH 7,5

[00200] A diálise de Hpx tamponada com Tris em PBS não pareceu reverter a agregação de proteínas. A diálise de hemopexina tamponada com PBS em tampão de Tris a 50 mM exibiu uma agregação de proteínas semelhante às duas bateladas de Hpx que foram previamente armazenadas em Tris. A diálise de Hpx tamponada com PBS em fosfato de sódio exibiu maior teor de monômero de Hpx. Estes resultados mostram que 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, é uma alternativa adequada de tampão para a Hpx com baixo teor de sal para uso com a resina Capto Q para a remoção de solvente detergente.

[00201] Para determinar se a presença de níquel da coluna de cromatografia de afinidade por metais imobilizados (IMAC), usada para a purificação da Hpx, pode estar atribuindo à agregação de Hpx na presença de tampão de Tris, ou não, várias amostras de Hpx foram incubadas com várias soluções de EDTA (TO303011 e TO303030). A Tabela 17, abaixo, proporciona um resumo dos dados de SEC-HPLC obtidos após as incubações com EDTA. Tabela 17. Teor de monômero da batelada de HPX TO302001 após incubação com EDTA Condição do Tampão % de Monômero TO302001 Não tratada 49,93 10 mM de EDTA, pH 7,4 52,88 20 mM de EDTA, pH 7,4 54,39 30 mM de EDTA, pH 7,4 55,88 40 mM de EDTA, pH 7,4 57,30 50 mM de EDTA, pH 7,4 58,71 100 mM de EDTA, pH 7,4 77,10 200 mM de EDTA, pH 7,4 75,69 100 mM de EDTA/PBS, pH 7,4 81,71 Diálise com 100 mM de EDTA 81,29

[00202] Os resultados mostram que a presença de níquel tem pouco efeito sobre a agregação da Hpx na presença de tampão de

Tris.

[00203] A estabilidade da hemopexina no tampão de Tris foi ainda examinada para determinar se a remoção de níquel, antes da diálise em Tris, resultaria em menos agregação da Hpx. Para este fim, foi implementada uma etapa de diafiltração adicional no processo de purificação da Hpx, para remover o níquel da solução de Hpx utilizando 100 mM de EDTA, pH 7,4. Três amostras a partir da batelada de Hpx T0294179, em várias etapas do processo, foram dialisadas em tampão de Tris a 50 mM, pH 7,5. Os resultados da SEC- HPLC são apresentados na Tabela 18, abaixo. Tabela 18. Estabilidade da hemopexina em Tris a 50 mM de, após diálise com EDTA Amostra de Hemopexina % de Monômero Eluato da IMAC 89,95 Eluato da IMAC – 80,88 após diálise com EDTA Concentrado Final - 58,92 após diálise com EDTA

[00204] Os resultados mostram que todas as três amostras dialisadas em tampão de Tris a 50 mM, pH 7,5, apresentaram agregação da Hpx e houve um aumento na agregação da Hpx após diálise com EDTA. O aumento na agregação da Hpx após a diálise com EDTA não parece ser atribuído à presença de níquel, observando que a ausência de níquel ainda resultou na agregação da Hpx uma vez trocada para o tampão de Tris a 50 mM. Os resultados sugerem que, em alguns casos, o tampão de Tris a 50 mM, pH 7,5, deve ser evitado como um tampão de armazenamento, devido ao potencial para a agregação da Hpx. Estudos de estabilidade adicionais confirmaram uma estabilidade reduzida da Hpx no tampão de Tris, exceto quando altos níveis de NaCl estiverem presentes. Os tampões alternativos podem precisar ser avaliados para minimizar a perda de rendimento e a agregação de Hpx na presença de tampão de Tris. Exemplo 6. Estabilidade da Hpx em concentrações mais altas de proteína

6.1 Preparação da amostra

[00205] Para o desenvolvimento da formulação relatada, a Hpx foi purificada a partir do plasma humano (Fração Kistler-Cohn IV). Os detalhes do processo de purificação são descritos em outras partes

[6]. A Hpx purificada foi proporcionada em PBS, pH 7,4, em uma concentração de proteína de 3-4%. As formulações de Hpx de concentração mais alta (até 30%) para os estudos de estabilidade induzida por tensão foram obtidas por ultra e diafiltração com um dispositivo de fluxo Äkta (GE Healthcare), usando um cassete de filtração de corte de 10 kD de PM (PES, 50 cm2, PALL Life Sciences)

6.2 Métodos para a avaliação da estabilidade e caracterização indicativa da proteína

6.2.1 ΔG e Tendência de ΔG

[00206] A ΔG e a Tendência de ΔG foram medidas usando um HUNK, que é um sistema de desnaturação química da Unchained Laboratories. As amostras foram desnaturadas usando uma curva de desnaturação de 36 pontos, em 0-8 M de ureia. Para calcular a ΔG, os dados foram adaptados usando a razão intrínseca do comprimento de onda da fluorescência da Hpx nativa e totalmente desnaturada. As tendências de Delta G foram determinadas medindo a ΔG em dez concentrações diferentes de Hpx: 0,25, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 250 e 300,0 mg/mL. Os resultados foram expressos em ΔG ou ΔΔG para as tendências.

6.2.2 Outros ensaios para a caracterização

[00207] A Tabela 19 resume todos os outros ensaios e procedimentos usados para uma investigação adicional da estabilidade da Hpx e caracterização da proteína. Tabela 19. Ensaios para avaliar a estabilidade e a caracterização da Hemopexina Ensaio Unidade Métodos Procedimento Distribuição do Coluna: Diol 300, Fluxo 1,0 % SEC-HPLC tamanho molecular mL/min Proteína g/L A280 protocolo de laboratório Viscosidade mPa*s Reômetro protocolo de laboratório

6.3 Estudos de estabilidade em alta concentração de proteínas

6.3.1 Preparação da formulação

[00208] As seguintes formulações principais foram adicionalmente investigadas em concentrações proteicas mais altas de Hpx e subsequentemente analisadas sob condições de armazenamento acelerado (37°C), armazenamento de longo prazo (2-8°C):  Formulação 1: 200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2;  Formulação 2: 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2;  Formulação 3: 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2;  Formulação 4: PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4.

[00209] As formulações foram ainda caracterizadas através da realização de estudos de desnaturação química e investigações da estabilidade térmica. Resumidamente, a Hpx formulada em PBS foi concentrado até 30% de Hpx e diafiltrada nas composições de tampão e excipiente desejadas, como mostrado na Tabela 20. Os ajustes de pH foram realizados titulando cuidadosamente 0,2 M de HCl ou 0,2 M fr NaOH, se necessário. Depois, as diferentes formulações foram diluídas para as concentrações desejadas com tampão de formulação. Finalmente, cada formulação foi filtrada estéril, inserida em frascos pequenos de vidro estéreis e armazenada em diferentes temperaturas para a análise subsequente nos pontos de tempo 0, 1, 2, 3 e 6 meses ou conforme indicado de outro modo.

Tabela 20. Visão geral das diferentes formulações principais de Hpx e suas composições e características NaCl P80 osmolaridade Alvo viscosidade N° Tampão pH [mM] [%] [m Osm/L ]§ g/L [mPa*s] Estudo de estabilidade de curto prazo: formulações principais em concentrações aumentadas de proteínas (Estudo de estabilidade da Hpx 8) 200 mM de 1_1 150 7,2 0,01 876 300 31,4 citrato fosfato 200 mM de 1_2 150 7,2 0,01 876 250 15,5 citrato fosfato 200 mM de 1_3 150 7,2 0,01 876 200 6,9 citrato fosfato 200 mM de 1_4 150 7,2 0,01 876 100 3,2 citrato fosfato 50 mM de 2_1 400 7,2 0,01 944 300 26,1 citrato fosfato 50 mM de 2_2 400 7,2 0,01 944 250 11,9 citrato fosfato 50 mM de 2_3 400 7,2 0,01 944 200 6,4 citrato fosfato 50 mM de 2_4 400 7,2 0,01 944 100 2,9 citrato fosfato 15 mM de 3_1 150 7,2 0,01 343 300 26,2 citrato fosfato 15 mM de 3_2 150 7,2 0,01 343 250 12,2 citrato fosfato 15 mM de 3_3 150 7,2 0,01 343 200 6,9 citrato fosfato 15 mM de 3_4 150 7,2 0,01 343 100 2,9 citrato fosfato 4_1 PBS 150 7,4 0,01 307 300 28,2 4_2 PBS 150 7,4 0,01 307 250 14,9 4_3 PBS 150 7,4 0,01 307 200 7,4 4_3 PBS 150 7,4 0,01 307 100 2,8

6.3.2 Comportamento da viscosidade em alta concentração de proteínas

[00210] O comportamento da viscosidade das formulações de Hpx preparadas foi analisado nas concentrações de proteína a seguir (Tabela 21). Como mostrado na Figura 19, até uma concentração-alvo de 250 g/L, a viscosidade permaneceu abaixo de 20 mPa*s, o que é considerado como uma viscosidade permissiva para qualquer sistema de liberação. W. Du & A. Klibanov, “Hydrophobic Salts Markedly Diminish Viscosity of Concentrated Protein Solutions”, Biotechnology and Bioengineering, pp. 632-636, 2011. Observar que esses autores e outros indicam que o limite para as injeções subcutâneas pode ser tão alto quanto 50 mPa*s. O estudo também demonstrou que cada formulação de Hpx, em qualquer concentração-alvo de proteína dada, exibiu uma viscosidade semelhante. E, como esperado, uma concentração-alvo de proteína aumentada foi acompanhada por uma viscosidade aumentada. Além disso, como a concentração de proteína dessas formulações estava acima dos níveis-alvo (i.e., 100, 200, 250 e 300 mg/mL), as viscosidades resultantes eram relativamente maiores em comparação com as medidas no Exemplo 1 (comparar as Figuras 3D e 19). Finalmente, a osmolaridade aumentada (maior concentração de sal) não influenciou significativamente a viscosidade. Tabela 21. Teor de proteínas e viscosidade (a 25°C) das formulações (Batelada no. C108.01). Formulação A280 Viscosidade [g/L] [mPa*s] 30_PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 321,91 28,20 25_PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 273,22 14,90 20_PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 222,18 7,40 10_PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 110,52 2,80 30_200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 315,87 31,40 0,01%, pH 7,2 25_200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 271,97 15,50 0,01%, pH 7,2

20_200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 205,07 6,90 0,01%, pH 7,2 10_200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 109,02 3,20 0,01%, pH 7,2 30_50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 313,28 26,10 0,01%, pH 7,2 25_50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 261,64 11,90 0,01%, pH 7,2 20_50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 211,27 6,40 0,01%, pH 7,2 10_50 mM de citrato fosfato, 400 mM de NaCl, P80 a 105,42 2,90 0,01%, pH 7,2 30_15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 322,12 26,20 0,01%, pH 7,2 25_15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 270,24 12,20 0,01%, pH 7,2 20_15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 215,99 6,90 0,01%, pH 7,2 10_15 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 103,19 2,90 0,01%, pH 7,2

6.3.3. Estabilidade Química: Determinação de ΔG e ΔΔG Usando o HUNK

[00211] Um aumento pequeno no valor de ΔG de uma proteína pode resultar em um aumento de 10X na estabilidade da proteína (ver tabela 22 abaixo) Tabela 22. Importância de ΔG na desnaturação química ΔG Fração Estabilidade Kcal/mol Desnaturada 9,6 Baixa desnaturação 1/10.000.000 8,2 Baixa desnaturação 1/1.000.000 6,8 Baixa desnaturação 1/100.000 5,5 Desnaturação moderada 1/10.000 4,1 Desnaturação moderada 1/1000 2,7 Alta desnaturação 1/100 13 Alta desnaturação 1/10 0 Alta desnaturação 1/2

[00212] Uma proteína na sua forma mais estável exibirá tipicamente altos valores de ΔG que não são dependentes da concentração (i.e., uma linha plana). Uma tendência de ΔG de dez pontos foi gerada em concentrações de Hpx de 0,25, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 250 e 300 mg/mL, para determinar o estado de estabilidade e agregação em cada formulação (consulte a seção 3.2.2). Os resultados da tendência de ΔG são mostrados na Figura 20.

[00213] Nas Formulações 1 e 2, a Hpx exibiu valores de ΔG maiores do que 6,0 kCal/mol em todas as concentrações analisadas. Isto indicou que a Hpx era muito estável nestas duas formulações, com quantidades muito baixas de proteína desnaturada presente; no entanto, a Hpx na Formulação 2 era ligeiramente menos estável do que em 1 devido à ligeira tendência de ΔG ascendente, indicando a presença de agregação no estado nativo.

[00214] Em contraste com as Formulações 1 e 2, os valores de ΔG nas Formulações 3 e 4 eram muito mais baixos, indicando níveis mais altos de Hpx desnaturada. A Formulação 3 ofereceu mais estabilidade do que a Formulação 4, com apenas níveis moderados de proteína desnaturada para aquela, em comparação com os níveis moderadamente altos para esta. Além disso, a Hpx na formulação 4 exibiu agregação no estado desnaturado com base na tendência de ΔG descendente, enquanto a tendência da Formulação 3 não foi afetada pela concentração. Estes resultados também confirmaram a estabilidade obtida pela inclusão de citrato na formulação.

[00215] Em resumo, as Formulações 1, 2 e 3 estabilizaram efetivamente a Hpx com apenas níveis moderados a baixos de proteína desnaturada presente. Em contraste, a Formulação 4 estabilizou a Hpx o mínimo, com altos níveis de proteína desnaturada presente que se agregou no estado desnaturado. O citrato contribuiu para a estabilidade da Hpx, conforme indicado pela maior estabilidade observada na Formulação 3 em comparação com a Formulação 4.

6.3.4 Distribuição do tamanho molecular ao longo do tempo em alta concentração de proteínas

[00216] As Formulações 1-4 foram adicionalmente armazenadas por pelo menos 6 meses, protegidas da luz, a 37°C e 2-8°C. Em cada ponto de tempo, as amostras foram coletadas e submetidas à análise por SEC-HPLC para monitorar os monômeros, os oligômeros e os fragmentos de Hpx. Os resultados da distribuição do tamanho molecular para cada concentração, após 6 meses, são mostrados nas Figuras 21-24 e nas Tabelas 23 e 24, abaixo.

[00217] Após armazenamento a 37°C, cada uma das formulações de Hpx mostrou um aumento em agregados e fragmentos ao longo do tempo. A Hpx formulada com formulações de alta osmolaridade parecia ser a mais estável e apenas um ligeiro aumento nos agregados de proteína foi observado com a concentração de proteína crescente analisada no mesmo ponto de tempo. Ao contrário, as baixas concentrações de excipiente em alta concentração de proteínas resultaram em forte agregação e até gelificação das proteínas após um certo período de tempo (Formulações 3 e 4). Uma vez que uma temperatura de armazenamento de 2-8°C foi escolhida, com base em dados anteriores, todas as formulações também foram mantidas a 2- 8°C e analisadas após 6 meses. Não foram observadas alterações significativas nos agregados e fragmentos entre as diferentes formulações, se armazenadas a 2-8°C. A Hpx monomérica (> 93%) permaneceu estável durante o período de estudo de 6 meses sob essas condições de armazenamento, o que foi observado independentemente da formulação e da concentração da proteína. Tabela 23. Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 37°C por 6 meses Conc. de Agre- Monô- Frag- Díme- N° Formulação Proteína gados meros mentos ros [%] [g/L] [%] [%] [%] 200 mM de citrato fosfato, 150 mM 1_1 300 26,88 3,50 52,12 17,51 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, 150 mM 1_2 250 32,57 3,90 47,07 16,46 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, 150 mM 1_3 200 28,41 3,52 50,42 17,65 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2

200 mM de citrato fosfato, 150 mM 1_4 100 22,77 3,08 54,64 19,50 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de 2_1 300 29,97 6,11 48,81 15,11 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de 2_2 250 27,13 4,83 51,93 16,11 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de 2_3 200 25,50 4,57 53,10 16,84 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM de 2_4 100 17,38 4,20 59,83 18,59 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de A formulação não pôde ser analisada 300 3_1 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 devido à gelificação após 2 meses 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de A formulação não pôde ser analisada 3_2 250 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 devido à gelificação após 6 meses 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de 3_3 200 71,96 1,31 13,88 12,85 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM de 3_4 100 59,31 2,56 22,86 15,27 NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 A formulação não pôde ser analisada 4_1 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 300 devido à gelificação após 2 meses A formulação não pôde ser analisada 4_2 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 250 devido à gelificação após 6 meses 4_3 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 200 81,22 0,06 6,56 12,15 4_4 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 100 69,42 2,12 14,02 14,44

Tabela 24. Dados de SEC-HPLC após armazenamento a 2-8°C por 6 meses Mo- Frag- Conc. de Agrega- Díme- N° Formulação nôme- mentos Proteína [g/L] dos [%] ros [%] ros [%] [%] 200 mM de citrato fosfato, 150 1_1 300 3,63 2,03 93,09 1,26 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, 150 1_2 250 3,47 1,95 93,30 1,28 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, 150 1_3 200 3,27 1,90 93,56 1,28 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 200 mM de citrato fosfato, 150 1_4 100 2,88 1,81 94,02 1,29 mM de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM 2_1 300 3,54 2,12 93,23 1,12 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM 2_2 250 3,35 2,01 93,50 1,13 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 50 mM de citrato fosfato, 400 mM 2_3 200 3,20 2,05 93,62 1,13 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2

50 mM de citrato fosfato, 400 mM 2_4 100 2,78 1,83 94,22 1,16 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM 300 3,97 2,18 92,77 1,08 3_1 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM 3_2 250 3,72 2,06 93,07 1,15 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM 3_3 200 3,50 2,02 93,36 1,12 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 15 mM de citrato fosfato, 150 mM 3_4 100 2,89 1,94 94,03 1,14 de NaCl, P80 a 0,01%, pH 7,2 4_1 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 300 4,33 2,65 91,53 1,49 4_2 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 250 3,91 2,22 92,75 1,12 4_3 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 200 3,64 2,18 93,07 1,11 4_4 PBS, P80 a 0,01%, pH 7,4 100 3,08 1,85 93,94 1,13

6.3.5 Conclusão

[00218] Os resultados do teste de desnaturação química mostram que a Hpx era mais estável na Formulação 1, seguida pela Formulação 2. A Formulação 3, que continha citrato em osmolaridade quase fisiológica, ofereceu mais estabilidade à Hpx na análise de desnaturação química do que a Formulação 4 (controle de PBS). Esses dados gerados por desnaturação química são consistentes com os dados do estudo de estabilidade avaliados por SEC-HPLC, analisados ao longo do tempo.

[00219] 15 mM de citrato fosfato melhora a estabilidade da Hpx, como evidenciado pelos resultados dos testes de estabilidade térmica, desnaturação química, oligorimerização e fragmentação, resultando em um desempenho superior em comparação à PBS sozinha. Mais importante, a estabilidade não foi significativamente perdida aumentando a concentração de Hpx nas Formulações 1, 2 e 3 de 100 g/L para 300 g/L, conforme evidenciado pelos dados de desnaturação química e pelos dados de SEC-HPLC, mesmo quando as formulações de Hpx foram armazenadas a 2-8°C, durante 6 meses.

APÊNDICE A

1.1. Exame do tampão I Sem NaCl Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Sodium acetate = mM de Acetato de sódio mM Citrate buffer = mM de Tampão de citrato mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato mM Histidine buffer = mM de Tampão de histidina mM Imidazole buffer = mM de Tampão de imidazol mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Potassium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de potássio mM Tris buffer = mM de Tampão de Tris mM Sodium carbonate buffer = mM de Tampão de carbonato de sódio

Com 150 mM de NaCl

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Sodium acetate = mM de Acetato de sódio mM Citrate buffer = mM de Tampão de citrato mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato mM Histidine buffer = mM de Tampão de histidina mM Imidazole buffer = mM de Tampão de imidazol mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Potassium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de potássio mM Tris buffer = mM de Tampão de Tris mM Sodium carbonate buffer = mM de Tampão de carbonato de sódio mM Glycine buffer = mM de Tampão de glicina mM Arginine buffer = mM de Tampão de arginina

1.2. Exame do tampão II Com 150 mM de NaCl

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Potassium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de potássio mM Sodium carbonate buffer = mM de Tampão de carbonato de sódio mM Glycine buffer = mM de Tampão de glicina

1.3. Exame do tampão III - açúcares Com 150 mM de NaCl

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Glycine buffer = mM de Tampão de glicina % Sucrose = % de Sacarose % Trehalose = % de Trealose % Mannitol = % de Manitol Tris buffer = Tampão de Tris

1.4. Exame do tampão IV - Concentração de NaCl1

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato

1concentraçãodo tampão foi mantida constate: 200 mM de citrato fosfato; 100 de fosfato de sódio; 100 mM de Tris; 100 mM de Glicina mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Tris buffer = mM de Tampão de Tris Glycine buffer = Tampão de glicina

1.5. Exame do tampão V - Concentração iônica I

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Sodium phosphate buffer = mM de Tampão de fosfato de sódio mM Glycine buffer = mM de Tampão de glicina / Sodium phosphate buffer = Tampão de fosfato de sódio

1.6. Exame do tampão VI - Concentração iônica II

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM Citrate phosphate = mM de citrato fosfato

Exame do tampão VI - Concentração iônica II (continuação)

Legenda: mM Citrate phosphate buffer = mM de Tampão de citrato fosfato

1.7. Exame do tampão VII - Aminoácidos

Legenda: Tm Shift = Alteração da Tm mM L-Arginine hydrochlorid = mM de Cloridrato de L-arginina mM L-Proline = mM de L-Prolina mM L-Glutamic acid = mM de Ácido L-glutâmico mM L-Serine = mM de L-Serina mM Glycine = mM de Glicina mM L-isoleucine = mM de L-isoleucina mM L-Valine = mM de L-Valina citrate phosphate buffer = tampão de citrato fosfato

APÊNDICE B Dados de Desnaturação Térmica (Tm/Tagg) % de % de % de Poço mg/mL Formulação Tm1 PAD RSD Tm2 PAD RSD Tag PAD RSD A1 300 Form 1-1 B1 300 Form 1-1 50 1,3 2,5 62 1,9 3,1 44 2,0 4,5 C1 300 Form 1-1

D1 250 Form 1-2 E1 250 Form 1-2 50 1,2 2,4 65 1,6 2,5 41 0,5 1,2 F1 250 Form 1-2 G1 200 Form 1-3 H1 200 Form 1-3 53 2,1 4,0 66 2,3 3,4 46 1,1 2,3 I1 200 Form 1-3 J1 100 Form 1-4 K1 100 Form 1-4 49 0,4 0,7 64 0,6 0,9 49 1,1 2,2 L1 100 Form 1-4

M1 300 Form 2-1 N1 300 Form 2-1 55 0,8 1,4 64 0,5 0,7 52 0,4 0,8 O1 300 Form 2-1 P1 250 Form 2-2 A2 250 Form 2-2 55 1,0 1,7 64 0,8 1,2 49 1,5 3,1 B2 250 Form 2-2 C2 200 Form 2-3 D2 200 Form 2-3 54 1,2 2,2 65 1,4 2,2 56 2,8 4,9 E2 200 Form 2-3 F2 100 Form 2-4 G2 100 Form 2-4 54 1,4 2,7 67 0,3 0,4 58 1,8 3,1 H2 100 Form 2-4

I2 300 Form 3-1 J2 300 Form 3-1 61 2,3 3,8 69 2,5 3,6 51 1,4 2,8 K2 300 Form 3-1 L2 250 Form 3-2 M2 250 Form 3-2 56 0,7 1,3 70 1,8 2,6 52 1,7 3,2 N2 250 Form 3-2 O2 200 Form 3-3 P2 200 Form 3-3 56 1,6 2,8 67 0,4 0,6 52 6,1 11,8 A3 200 Form 3-3 B3 100 Form 3-4 C3 100 Form 3-4 55 0,7 1,2 70 0,3 0,4 57 0,7 1,3

D3 100 Form 3-4

E3 300 Form 4-1 F3 300 Form 4-1 57 2,3 4,1 65 2,5 3,8 45 1,5 3,4 G3 300 Form 4-1 H3 250 Form 4-2 I3 250 Form 4-2 52 1,2 2,4 63 2,1 3,3 42 1,7 3,9 J3 250 Form 4-2 K3 200 Form 4-3 L3 200 Form 4-3 61 1,9 3,1 45 0,5 1,0 M3 200 Form 4-3 N3 100 Form 4-4 O3 100 Form 4-4 49 1,4 2,9 66 1,8 2,7 51 0,3 0,6 P3 100 Form 4-4

Dados de Desnaturação Química (ΔG em kCal/mol) Formulações de HPX Tendência de ΔG (mg/mL) da Patente Abr.

Formulação 0,25 1 5 10 25 50 100 200 250 300 Form 200 mM de fosfato 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3 .1 citrato, 150 mM de NaCl, PS80 a 0,01% pH 7,2 Form 50 mM de fosfato 6,0 6,1 6,2 6,2 6,3 6,3 6,3 6,4 6,4 6,4 .2 citrato, 400 mM de NaCl, 0,01% de PS80 pH 7,2 Form 15 mM de fosfato 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 .3 citrato, 150 mM de NaCl, PS80 a 0,01% pH 7,2 Form Solução Salina 3,6 3,6 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,3 .4 Tamponada com Fosfato, PS80 a 0,01% pH 7,4

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação líquida estável de hemopexina purificada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um teor de hemopexina de pelo menos 50 mg/mL; (b) pelo menos 15 mM de tampão de fosfato; (c) um pH de 5,8 a 8; e (d) pelo menos 50 mM de cloreto de sódio.

2. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende de 75 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina.

3. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende de 100 mg/mL a 200 mg/mL de hemopexina.

4. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende de 200 mg/mL a 300 mg/mL de hemopexina.

5. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende 200 mg/mL de hemopexina.

6. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende 250 mg/mL de hemopexina.

7. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende 300 mg/mL de hemopexina.

8. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 150 mM de cloreto de sódio.

9. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o tampão de fosfato é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de sódio, fosfato de potássio e citrato fosfato.

10. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o tampão de fosfato é o citrato fosfato.

11. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende de 15 mM a 200 mM de citrato fosfato e de 150 mM a 400 mM de cloreto de sódio.

12. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende de 15 mM a 200 mM de citrato fosfato e de 150 mM a 250 mM de cloreto de sódio.

13. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende 200 mM de citrato fosfato e 150 mM de cloreto de sódio.

14. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende 50 mM de citrato fosfato e 400 mM de cloreto de sódio.

15. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende 15 mM de citrato fosfato e 150 mM de cloreto de sódio.

16. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o tampão de fosfato é o fosfato de sódio.

17. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende de 50 mM a 200 mM de fosfato de sódio e de 50 mM a 400 mM de cloreto de sódio.

18. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende de 50 mM a 200 mM de fosfato de sódio e de 150 mM a 250 mM de cloreto de sódio.

19. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende 200 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio.

20. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o pH é de 7,0 a 7,6.

21. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o pH é 7,2.

22. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um detergente não iônico.

23. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o detergente não iônico é o polissorbato 80.

24. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 22 ou a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o detergente não iônico está presente em uma quantidade de pelo menos 0,0005% v/v.

25. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o detergente não iônico está presente em uma quantidade de menos do que 0,01% v/v.

26. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende uma viscosidade de menos do que 20 mPa*S, quando medida a 25°C

27. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a hemopexina purificada compreende pelo menos 95% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% em peso de proteína total, conforme determinado pela medição do teor de hemopexina por imunonefelometria e do teor de proteína total pelo método de Bradford ou espectroscopia de UV a 280 nm.

28. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que a hemopexina purificada é derivada do plasma humano ou é selecionada a partir do grupo que consiste em uma hemopexina recombinante, uma variante da hemopexina ou uma proteína de fusão compreendendo hemopexina ou um seu fragmento de ligação à heme.

29. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a hemopexina purificada é recuperada de uma fração plasmática derivada de pelo menos 500 kg de plasma humano.

30. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 70% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37°C por 1 mês.

31. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 50% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37°C por 2 meses.

32. Formulação líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 50% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37°C por 3 meses.

33. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 80% de monômeros de hemopexina quando armazenada a

37°C por 1 mês.

34. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 70% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37°C por 2 meses.

35. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 60% de monômeros de hemopexina quando armazenada a 37°C por 3 meses.

36. Método de tratar uma condição associada à hemólise, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente que necessita dele da formulação líquida estável como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 35.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a condição associada à hemólise é selecionada a partir de uma condição hemolítica aguda e/ou uma condição hemolítica crônica.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em anemia hemolítica, crise aplástica, crise hiper- hemolítica, hemólise induzida por transfusão, síndrome hemolítica urêmica, infartos do miocárdio, síndrome aguda do peito, hipertensão pulmonar, úlceras nas pernas, retardo do crescimento, infartos ósseos, pré-eclâmpsia, insuficiência renal, lesão renal aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), acidente vascular cerebral incluindo acidente vascular cerebral hemorrágico, hemorragia intracraniana (HIC), sequestro esplênico, infartos esplênicos, uma doença autoimune, incluindo a anemia hemolítica autoimune, infecção microbiana ou suscetibilidade aumentada à infecção, infecção por malária, trauma, uma condição relacionada ao transplante, cirurgia cardíaca aberta usando ponte cardiopulmonar, e queimaduras, incluindo no tratamento de hemoglobinemia ou hemoglobinúria acompanhada de hemólise após uma queimadura.

39. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em anemia de células falciformes, esferocitose hereditária, eliptocitose hereditária, talassemia, anemia diseritropoética congênita e hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), lúpus eritematoso sistêmico e leucemia linfocítica crônica.

40. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral hemorrágico e hemorragia intracraniana (HIC). 41 Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a condição é a SDRA.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41, caracterizado pelo fato de que a formulação líquida estável é administrada intravenosamente.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41, caracterizado pelo fato de que a formulação líquida estável é administrada de modo subcutâneo.

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 47/212 Ligador

Motivo de ligação do ácido hialurônico 1/37

Epítopo de JEN14

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 48/212 Hpx em citrato fosfato Agregação Referência: Hpx em PBS de proteínas e dissociação de corantes ponto de fusão 2/37

Temperatura [ºC]

Reduzida Não reduzida

Marcador

Hpx não tratada Monômero Hpx «envelhecida»

Peso molecular

Massa molar (g/mol) Escala relativa

Dímeros Agregados Fragmentos

Tempo de retenção [min] Viscosidade dinâmica [mPa*s]

lgG, 250 mM de Prolina

Concentração de proteína [g/L]

Referência

150 de NaCl [mM]

Tipo de tampão

200 mM de citrato fosfato

50 de citrato fosfato [mM]

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 53/212 Tampão de citrato fosfato, Tampão de fosfato de sódio, Tampão de glicina, 150 mM de NaCl 150 mM de NaCl 150 mM de NaCl 7/37

Sem Manitol Sacarose Trealose Sem Manitol Sacarose Trealose Sem Manitol Sacarose Trealose

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 54/212 8/37 m a o a a a a i na in ic in in in lin Se in r ol âm er lic u c a r g p ut s g e -v -a L- l L- L- ol L L L -g -is o L d Á ci

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 55/212 P80 a 0,1% P80 a 0,01% P80 a 0,001% Sem P80 9/37 a r d a o r a r a o r ad ç ão ela çã ela ad ç ão ela ad çã la t ta t t a ge tra ita ng tra ita ng tra ita ng tra i t n Ag co Ag co Ag co Ag o ão s ão s ão s ão e sc N de N de N de N ar/ ar/ ar/ r/d el el el e la g g g ng c on con con co de de de de os os os os i cl i cl i cl i cl C C C Agregados C Dímeros Monômero de Hpx Fragmentos

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 57/212 Hpx formulada em PBS, pH 7.4 Hpx formulada em citrato fosfato. pH 7.4 P80 a 0,1% P80 a 0,0 1% P80 a 0,001% Sem P80 P80 a 0,1% P80 a 0,0 1% P80 a 0,001% Sem P80

PM PM 11/37

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 58/212 P80 a 0,1% P80 a 0,0 1% P80 a 0,001% Sem P80 P80 a 0,1% P80 a 0,0 1% P80 a 0,001% Sem P80

PM PM 12/37

NÃO REDUTORA

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 59/212 Não tratada Não tratada Agitada Agitada Congelar/descongelar Congelar/descongelar 13/37

Ligação à heme [%] Ligação à heme [%]

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 60/212 P80 a 0,1% P80 a 0,02% P80 a 0,01% P80 a 0,002% P80 a 0,001% Sem P80 14/37

Pontos de tempo em meses

Agregados Dímeros Monômero de Hpx Fragmentos

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 61/212 P80 a 0,1% P80 a 0,02% P80 a 0,01% P80 a 0,002% P80 a 0,001% Sem P80 15/37

Pontos de tempo em meses

Agregados Dímeros Monômero de Hpx Fragmentos

Sem ses ê m 3 t= s e ês m 2 t= ês m 1 t= 0 t= s es ê m 3 t= s es ê m 2 t= ês m 1 t= 0 t=

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: RT Armazenamento: 2-8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

No. do Caminho# Formulação

Marcador de peso molecular

200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

200 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

100 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

100 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

300 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

Armazenada na TA (t = 6 meses) Armazenada a 37ºC (t = 6 meses) Armazenada a 2-8ºC (t = 6 meses)

Armazenada a 2-8ºC (t = 12 meses) Armazenada na TA (t = 12 meses) Armazenada a 37ºC (t = 12 meses)

Não realizada

No. do Caminho# Formulação

Marcador de peso molecular

200 mM de citrato fosfato, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

200 mM de citrato fosfato, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

100 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

100 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

300 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, P80 a 0,002%, pH 7.2

Não realizada

Armazenada a 37ºC

Monômeros Monômeros

Monômeros Monômeros Monômeros

Monômeros 3 ses ês es es t= =0 t= 1m es es t = me t m m 2

6 t=

Armazenada na TA Armazenada a 2-8ºC es 0 es es es es 0 es es es t= t= es es es es es es es es m m m m m m m m

3

12 3

24 6 12

24 6 t= t= t= t= t= t= t= t=

% de monômeros

% de ligação da heme

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: TA Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: TA Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: TA Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses] Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: TA Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: TA Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenada a 2-8ºC (t = 6 meses) Armazenada na TA (t = 6 meses) Armazenada a 37ºC (t = 6 meses)

Não realizada

Armazenada a 37ºC Armazenada na TA Armazenada a 2 - 8ºC

Petição 870200010233, de 22/01/2020, pág. 73/212 27/37

0 ês es 0 ês es es es s 0 ês es es es es es ses m s es s se = s s s es s s t= 1 e es es t = m es es e e e t m e e e m m m 1 m m m m m 1 me me m m m t= =2 =3 6 t == 2 = 3 6 1 2 1 8 = t = =2 3 6 1 2 1 8 t t t= t t t= t= t= t t t= t= t= Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros Monômeros

Formulação de Hpx 1 Viscosidade dinâmica [mP*s]

Formulação de Hpx 2 Formulação de Hpx 3 Formulação de Hpx 4 lgG, 250 mM de Prolina g/L concentração de proteína

Formulação 1 Formulação 3 Formulação 2 Formulação 4 g/L concentração de proteína

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos

Armazenamento: 37ºC Armazenamento: 2 - 8ºC

Ponto de tempo [meses]

Agregados Dímeros Monômeros de Hpx Fragmentos