CN111432880A - 血色素结合蛋白制剂 - Google Patents

Abstract

总的说来本发明涉及纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂及其用途，该制剂包含：(a)含量为至少50mg/mL的血色素结合蛋白；(b)至少15mM磷酸盐缓冲剂；(c)5.8‑8的pH；以及(d)至少50mM氯化钠。

Description

血色素结合蛋白制剂

技术领域

本发明一般涉及血色素结合蛋白的稳定液体制剂及其用途。

背景

溶血以红细胞破坏为特征并且是与红细胞异常相关的贫血病症的标志，所述的红细胞异常例如酶缺陷、血红蛋白病、遗传性球形红细胞增多症、阵发性夜间血红蛋白尿症和刺细胞贫血，以及外源因素例如脾肿大、自身免疫性病症(例如，新生儿溶血病)、遗传性疾病(例如，镰状细胞病或G6PD缺乏)、微血管病性溶血、革兰氏阳性细菌感染(例如，链球菌、肠道球菌和葡萄球菌)、寄生虫感染(例如，疟原虫)、毒素和创伤(例如烧伤)。溶血也是一种常见的输血病症，特别是大量输血和在使用体外心肺维持的患者中。

患有与溶血相关病症的患者中可见的不良反应主要归因于从红细胞释放铁和含铁化合物，例如血红蛋白(Hb)和血红素。在生理条件下，释放的血红蛋白被可溶性蛋白质例如触珠蛋白结合，并转运到巨噬细胞和肝细胞。然而，当溶血发生加快且性质上变成病理性的时，触珠蛋白的缓冲能力被压倒。因此，血红蛋白被快速氧化成铁血红蛋白，其依次释放游离血红素(包含原卟啉IX和铁)。虽然血红素在一些生物进程中起决定作用(例如，作为必需蛋白质例如血红蛋白和肌红蛋白的一部分)，但是游离血红素是高毒性的。游离血红素是氧化还原活性铁的来源，其产生损害类脂膜、蛋白质和核苷酸的高毒性活性氧种类(ROS)。血红素的毒性由于其插入类脂膜的能力而进一步加剧，在类脂膜中血红素引起膜组分氧化且促进细胞溶解和死亡。

连续低水平细胞外Hb/血红素暴露的进化压力已导致补偿机制，该机制可控制在生理稳态条件下和轻度溶血过程中游离Hb/血红素的不良反应。这些系统包括释放一组结合Hb或血红素的血浆蛋白，包括Hb清除剂触珠蛋白(Hp)和血红素清除剂蛋白血色素结合蛋白(Hpx)和α1微球蛋白。

血色素结合蛋白是61kDa血浆β-1B-糖蛋白，其由439个氨基酸长的肽链组成，该链由两个四叶β螺旋结构域组成，类似于两个以90°角彼此锁定在一起的厚圆盘，并且如图1所示通过结构域间接头肽连接(Mauk，2011；Protein Science，第20卷，pp.791-805)。由于血管内和血管外溶血作用而释放到血液中的血红素结合在由结构域间接头肽形成的袋中的两个四叶β螺旋桨结构域之间。残基His213和His266与血红素铁原子配位，得到稳定的双组氨酰基复合物，类似于血红蛋白。

血色素结合蛋白含有约20％的碳水化合物，包括唾液酸、甘露糖、半乳糖和葡萄糖胺。在蛋白质序列中发现了十二个半胱氨酸残基，可能占六个二硫键。血色素结合蛋白代表针对血红素毒性的一线防御，这归因于它以高亲和力(K_d＜1pM)地结合血红素并作为从血流到肝脏的血红素特异性载体起作用的能力。它以等摩尔比结合血红素，但是没有证据表明血红素与该蛋白质共价结合。

除血红素结合外，血色素结合蛋白制剂据报导还具有丝氨酸蛋白酶活性(Lin等人，2016；Molecular Medicine 22：22-31，2016)和其他几种功能，例如抗炎活性和促炎活性、抑制细胞粘附和某些二价金属离子的结合。

尽管内源性血色素结合蛋白可以控制生理性稳态条件下游离血红素的不利影响，但在病理生理条件下(例如与溶血有关的那些条件下)几乎没有维持稳态血红素水平的作用，其中高水平的血红素会导致内源性血色素结合蛋白耗竭，从而引起血红素介导的氧化组织损伤。研究表明，在溶血性疾病(例如镰状细胞病(SCD)和β地中海贫血)的实验小鼠模型中，血红素结合蛋输注可减轻血红素诱导的内皮激活、炎症和氧化损伤。还显示血色素结合蛋白施用可显著降低促炎细胞因子的水平，并抵消溶血动物中血红素诱导的血管收缩。然而，尽管纯化的血色素结合蛋白显示出重要的治疗潜能，但其作为液体制剂的稳定性差。

本公开通过提供适合于治疗用途的稳定血色素结合蛋白液体制剂解决或至少部分缓解了上述问题。

发明概述

在本发明的一方面，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)至少50mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)至少15mM磷酸盐缓冲剂；

(c)5.8-8的pH；以及

(d)至少50mM氯化钠。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗与溶血有关的病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用如本申请中公开的纯化的血色素结合蛋白的液体制剂。

附图简述

图1是血红素-血色素结合蛋白复合物的结构的示意图，其显示了β螺旋桨C结构域(浅灰色)、N结构域(深灰色)、接头序列和血红素。还表明了位于β螺旋桨C结构域的透明质酸结合基元[348-358(深灰色)]、在N结构域和C结构域界面处的Arg-Gly-Glu序列[128-130(箭头)]和JEN14表位的位置。

图2显示了再SYPRO橙存在下蛋白质解折叠的相对荧光强度(RFU)与温度关系的典型记录。T_m由熔解曲线(灰色水平条)的中点确定。显示了在PBS中配制的Hpx pH 7.4(虚线，T_m＝53.0C)和在柠檬酸磷酸盐中配制的Hpx pH 7.4(实线，T_m 60.5℃T_m60.5℃)。

图3显示了人血浆来源的血色素结合蛋白(Hpx)的生化表征。A：在还原和非还原条件下对Hpx批号TO290016(20-1.25μg)的SDS-PAGE分析。在两种条件下，均在泳道1中加载MW标记；通过考马斯染色(SimplyBlue；Invitrogen)观察条带；B：2D-PAGE分析：通过固定的pH梯度条(pI 3-10，Invitrogen)分离血色素结合蛋白样品(5μg)，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过胶体蓝染色(SimplyBlue；Invitrogen)使斑点显现，在盒内标记有多个Hpx带；C：10％未经处理(实线)和老化的Hpx(“老化”，在37℃3个月；虚线)的分子大小分布，通过SEC-HPLC分析(色谱柱：YMC Pack Diol-300，5μm，300 x 8mm)。用MALS(Dawn HELEOS，WyattTechnologies)和RI检测器(Optilab T-rEX，Wyatt Technolgies)(浅灰线)在线测定每个种类的摩尔质量；D：将不同浓度的血色素结合蛋白(在PBS中配制，pH 7.4)和相应的粘度作图，并与多克隆IgG(三角形)的粘度曲线进行比较。在旋转流变仪上(HAAKE，ThermoScientific)在25℃一式两份进行粘度测量。

图4显示了DSF数据评价。A：在散点图中显示T_m和相应的缓冲剂类型的可视化。A型缓冲剂(PBS，pH 7.4)用作参比制剂。大部分稳定缓冲剂中的不同盐(NaCl)浓度(虚线圆圈a-c)以不同的灰色阴影突出显示，其中虚线圆圈内的较低数据点代表较低的盐浓度(50-150mM NaCl)，而虚线圆内较高的数据点代表较高的盐浓度(150-250mM NaCl)；(a)柠檬酸磷酸盐，(b)磷酸钠，(c)甘氨酸缓冲剂。B：分析的所有条件的氯化钠依赖性的可视化。每种浓度下的平均值显示为线。C：T_m相对于pH的密度示意图；D：配制的样品中柠檬酸磷酸盐中T_m及其相应盐浓度的可视化。PBS用作参比制剂(星号)，而200mM柠檬酸磷酸盐、150mM NaCl显示为空心圆圈。不同的缓冲剂强度以不同的灰色阴影突出显示，其中缓冲剂浓度从上到下降低(100mM-15mM柠檬酸磷酸盐)。每个条件至少测量三次；误差条表示标准偏差。

图5显示了使用DSF在不同糖存在下的热稳定性。散点图中T_m和相应缓冲剂类型的可视化。分析的三种不同缓冲剂中的不同糖浓度以不同的灰色阴影表示。

图6显示了使用DSF在不同氨基酸存在下的热稳定性。在散点图中柠檬酸磷酸盐缓冲剂中T_m和相应氨基酸的可视化。以两种不同浓度测试每种氨基酸(除谷氨酸除外，其中仅分析了50μM)。

图7显示了SEC-HPLC分析得出的有关物理应力诱导稳定性的数据。A：在不同浓度的P80下在PBS pH 7.4中配制的Hpx；B：在不同浓度的P80下在柠檬酸磷酸盐pH 7.4中配制的Hpx。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，每种分子种类均以百分比表示。在每个柱形图的底部突出显示聚集体和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图8是用不同的物理诱导应力处理后运行的样品的SDS-PAGE凝胶照片。A：在还原(上图，500mM二硫苏糖醇，DTT)和非还原(下图)条件下分析在pH 7.4的PBS中配制的Hpx样品。B：在还原(上图，500mM二硫苏糖醇，DTT)和非还原(底部)条件下分析在pH 7.4的柠檬酸磷酸盐中配制的Hpx样品。U：未处理；A：搅拌；F/T：冷冻/融化循环。

图9显示了在物理诱导的压力下血红素与血色素结合蛋白结合。A：PBS，140mMNaCl，pH 7.4；以及B：在柠檬酸磷酸盐pH 7.4中在不同浓度的P80下配制的Hpx。在如下所示的处理后以百分比表示显示了血红素结合；未处理-空心圆圈；搅拌-黑色方块；冷冻/融化-灰色三角形。

图10显示了在PBS中在不存在P80(w/o P80)和使用不同浓度P80(0.1-0.001％v/v)下配制并进行3个月分析的10％Hpx溶液的SEC-HPLC数据。储存在A：37℃和B：25℃(RT)下。分子大小分布以100％堆积柱状图表示，每种分子种类均以百分比表示。在每个柱形图的底部突出显示聚集体和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图11显示了在PBS中不存在P80(w/o，三角形)和使用不同P80浓度P80(0.1-0.001％v/v)的情况下配制并进行了3个月的分析的10％Hpx溶液的血红素结合能力。储存在A：37℃和B：25℃(RT)下。

图12显示了使用不同缓冲剂配制并且在加速条件(37℃)下贮存6个月内且直至在室温(RT)和2-8℃贮存后长达24个分析的10％Hpx溶液的SEC-HPLC数据。A：200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.2；B：200mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，pH 7.2；C：100mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.6；D：100mM磷酸钠，300mM NaCl，pH 7.6；E：300mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.6；F：PBS，140mM NaCl，pH 7.4。所有制剂(PBS除外)均含有0.002％v/v P80。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，且每种分子种类均以百分比的相应量表示。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图13显示了使用来自0、6和12个月的样品的SDS-PAGE凝胶的照片。A-C：在还原条件下(500mM二硫苏糖醇，DTT)分析样品。D-F：在非还原条件下分析样品。每个泳道上样15μg蛋白质。如所示，在0、6和12个月的存储时间对每种制剂进行分析。分子量标记在左泳道中显示，kDa值如图所示。泳道1-分子量标记，泳道2-200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.002％P80，pH 7.2；泳道3-200mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.002％P80，pH 7.2；泳道4-100mM磷酸钠，150mM NaCl，0.002％P80，pH 7.6；泳道5-100mM磷酸钠，300mM NaCl，0.002％P80，pH 7.6；通道6-300mM磷酸钠，150mM NaCl，0.002％P80，pH 7.6；泳道7-PBS，pH 7.4。

图14显示了血红素与血色素结合蛋白结合。A-C：在2-8℃(C)、RT(B)和37℃(A)下存储的样品在每个时间点(实线)以百分比显示的血红素结合。对于每种制剂，在给定时间点相应的百分比单体以相同的颜色显示(虚线)；D：血红素结合与Hpx单体之间的整体相关性。N＝144，非参数Spearman相关性，r＝0.83。

图15显示了使用不同缓冲剂配制并且在6个月内(在37℃储存)和24个月内(RT和2-8℃储存)分析的10％Hpx溶液的SEC-HPLC数据。A：15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，pH7.2；B：15mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，pH 7.2；C：50mM柠檬酸磷酸盐，200mM NaCl，pH7.2；D：50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，pH 7.2；E：200mM柠檬酸磷酸盐，150mMNaCl，pH7.2。所有制剂均包含0.01％v/vP80。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，每种分子种类均以百分比的相应量表示。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图16显示了使用来自0、6和12个月的样品的SDS-PAGE凝胶的照片。在还原条件下(500mM二硫苏糖醇，DTT)分析样品。每个泳道上样15μg蛋白质。如所示，在0(左上图)、6和12个月的存储时间对每种制剂进行分析。分子量标记在右泳道中显示，kDa值如图所示。如图所示，分子量标记显示在右泳道，kDa值；泳道1-15mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道2-50mM柠檬酸磷酸盐，200mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道3-50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道4-30mM柠檬酸磷酸盐，500mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道5-75mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道6-100mM柠檬酸磷酸盐，200mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道7-100mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道8-15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道9-200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道10-分子量标记。

图17显示了使用来自0、6和12个月的样品的SDS-PAGE凝胶的照片。在非还原条件下分析样品。每个泳道上样15μg蛋白质。如所示，在0时(左上图)、6个月和12的存储时间对每种制剂进行分析。如所示，分子量标记显示在右泳道，kDa值；泳道1-15mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道2-50mM柠檬酸磷酸盐，200mM NaCl，0.01％P80，pH7.2；泳道3-50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道4-30mM柠檬酸磷酸盐，500mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道5-75mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.01％P80，pH7.2；泳道6-100mM柠檬酸磷酸盐，200mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道7-100mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道8-15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH7.2；泳道9-200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；泳道10-分子量标记。

图18显示了血红素与血色素结合蛋白结合。对于在37℃(A)、RT(B)和2-8℃(C)下存储的样品，在每个时间点以百分比显示的血红素结合(实线)。对于每种制剂，在给定时间点相应的百分比单体以相同的颜色显示(虚线)。

图19显示了血浆来源的人血色素结合蛋白的高蛋白质浓度下的粘度行为。制备了不同浓度的血色素结合蛋白的制剂(制剂1：200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；制剂2：50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；制剂3：15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；制剂4：PBS，0.01％P80，pH 7.4)并且将它们的粘度与多克隆IgG(三角形)的粘度曲线进行比较。在25℃在旋转流变仪(HAAKE，ThermoScientific)上一式两份进行粘度测量。

图20显示了使用HUNK自动化学变性系统的ΔG趋势。对0.25、1、5、10、25、50、100、150、250和300mg/mL浓度的Hpx生成在0-8M脲中36点变性曲线。每条曲线代表每种制剂的单次运行。

图21显示了不同浓度的Hpx制剂1(200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2)并且在6个月内分析的SEC-HPLC数据(A：300；B：250；C：200和D：100g/L)。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，并且每种分子种类均以百分比的相应量表示。虚线条-某时间点后由于凝胶化无法分析制剂。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图22显示了不同浓度的Hpx制剂2(50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH7.2)并且在6个月内分析的SEC-HPLC数据(A：300；B：250；C：200和D：100g/L)。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，并且每种分子种类均以百分比的相应量表示。虚线条-某时间点后由于凝胶化无法分析制剂。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图23显示了不同浓度的Hpx制剂3(15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH7.2)并且在6个月内分析的SEC-HPLC数据(A：300；B：250；C：200和D：100g/L)。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，并且每种分子种类均以百分比的相应量表示。虚线条-某时间点后由于凝胶化无法分析制剂。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

图24显示了对不同浓度的Hpx制剂4(PBS，0.01％P80，pH 7.4)并且在6个月内分析的SEC-HPLC数据(A：300；B：250；C：200和D：100g/L)。分子大小分布以100％堆积柱形图表示，并且每种分子种类均以百分比的相应量表示。虚线条-某时间点后由于凝胶化无法分析制剂。在每个柱形图的底部突出显示聚集物和二聚体(分别为黑色和灰色)；在每个柱形图的顶部显示片段(灰色)。

详细描述

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则措辞“包括”或其变化例如“含有”或“包含”应当理解为意味着包含所述要素或整数或要素组或整数的组，但不排除任何其它要素或整数或要素组或整数的组。

在本说明书中对任何现有出版物(或来源于其中的信息)或其中任何已知或不是已知的主题的参考不应当被视为承认或认可或以任何形式暗示该现有出版物(或来源于其中的信息)或已知主题构成本说明书相关努力领域的公知常识的一部分。

必须指出，除非上下文另有清楚的规定，否则如本说明书中使用的单数形式“一个”、“一种”或“所述”包括复数方面。因此，例如提及“与溶血相关的病症”包括单一病症，以及两种或更多种病症；所涉及的“活性剂”包括单一活性剂，以及两种或更多种活性剂等。

在不存在任何相反指示下，在整个说明书中提及“％”含量应当视为意指％w/v(重量/体积)。例如，包含至少10％血色素结合蛋白含量的液体制剂意指包含至少10％w/v(即至少100mg/mL)的血色素结合蛋白含量的液体制剂。

本发明人令人惊讶的发现，可以改变某些条件以增强血色素结合蛋白其在液体制剂中的稳定性，至少部分基于该发现实现了本发明。

因此，在本发明的一方面，提供了一种纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)至少50mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)至少15mM磷酸盐缓冲剂；

(c)5.8-8的pH；以及

(d)至少50mM氯化钠。

血色素结合蛋白

血色素结合蛋白代表抵抗血红素毒性的一线主要防御，这至少部分归因于其以高亲和力(K_d＜1pM)结合血红素并作为从血流到肝脏的血红素特异性载体起作用的能力。据报道血色素结合蛋白还具有丝氨酸蛋白酶活性和其他一些功能，例如抗炎和促炎活性、抑制细胞粘附和某些二价金属离子结合的能力。下表1概括了血色素结合蛋白的一些特征：

表1.

液体制剂的血色素结合蛋白含量可能取决于预期用途。例如，当将液体制剂作为纯组合物(即，无需进一步稀释)施用于有需要的受试者时，考虑到例如所需剂量和施用体积这样的因素，血色素结合蛋白含量典型地适用于直接施用。作为实例，可以优化血色素结合蛋白含量，使得其足够高以考虑期望的治疗剂量使被施用于受试者的液体制剂的体积最小化，以及足够低以最小化液体制剂的粘度使其无需进一步稀释即可施用。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，对血色素结合蛋白的含量进行优化，以使液体制剂的粘度降至最低，从而适合于无需进一步稀释即可施用。适合的粘度对于本领域技术人员而言是熟悉的，并且可能取决于诸如施用途径和/或体积这样的因素。在W.Du&A.Klibanov，“Hydrophobic Salts Markedly Diminish Viscosity of Concentrated ProteinSolutions”，Biotechnology and Bioengineering，pp.632-636，2011中注意到，皮下注射含蛋白制剂的阈值可以高达50mPa*s。在本申请中公开的特定实施方案中，所述液体制剂包含在25℃小于或等于50mPa*s的粘度。在本申请中公开的优选实施方案中，所述液体制剂包含在25℃小于或等于20mPa*s的粘度。

当将液体制剂作为纯组合物(即，无需进一步稀释)施用于有需要的受试者时，纯化的血色素结合蛋白的适合剂量将为本领域技术人员所熟知，并且可能取决于这样的因素，例如将被治疗的溶血性病症的性质和严重程度(例如，内源性游离血红素的水平)，将被治疗的受试者的年龄、体重和性别，任何其他潜在病症的存在以及前述各项的组合。

关于“至少50mg/mL”，它包括50mg/mL，55mg/mL，60mg/mL，65mg/mL，70mg/mL，75mg/mL，80mg/mL，85mg/mL，90mg/mL，95mg/mL，100mg/mL，105mg/mL，110mg/mL，115mg/mL，120mg/mL，125mg/mL，130mg/mL，135mg/mL，140mg/mL，145mg/mL，150mg/mL，155mg/mL，160mg/mL，165mg/mL，170mg/mL，175mg/mL，180mg/mL，185mg/mL，190mg/mL，195mg/mL，200mg/mL，205mg/mL，210mg/mL，215mg/mL，220mg/mL，225mg/mL，230mg/mL，235mg/mL，240mg/mL，245mg/mL，250mg/mL，255mg/mL，260mg/mL，265mg/mL，270mg/mL，275mg/mL，280mg/mL，285mg/mL，290mg/mL，295mg/mL，300mg/mL，305mg/mL，310mg/mL，315mg/mL，320mg/mL，325mg/mL，330mg/mL，335mg/mL，340mg/mL，345mg/mL，350mg/mL，355mg/mL，360mg/mL，365mg/mL，370mg/mL，375mg/mL，380mg/mL，385mg/mL，390mg/mL，400mg/mL，405mg/mL等。因此，在本发明的优选形式中，所述液体制剂包含至少50mg/mL，优选至少55mg/mL，优选至少60mg/mL，优选至少65mg/mL，优选至少70mg/mL，优选至少75mg/mL，优选至少80mg/mL，优选至少85mg/mL，优选至少90mg/mL，优选至少95mg/mL，优选至少100mg/mL，优选至少105mg/mL，优选至少110mg/mL，优选至少115mg/mL，优选至少120mg/mL，优选至少125mg/mL，优选至少130mg/mL，优选至少135mg/mL，优选至少140mg/mL，优选至少145mg/mL，优选至少150mg/mL，优选至少155mg/mL，优选至少160mg/mL，优选至少165mg/mL，优选至少170mg/mL，优选至少175mg/mL，优选至少180mg/mL，优选至少185mg/mL，优选至少190mg/mL，优选至少195mg/mL，优选至少200mg/mL，优选至少205mg/mL，优选至少210mg/mL，优选至少215mg/mL，优选至少220mg/mL，优选至少225mg/mL，优选至少230mg/mL，优选至少235mg/mL，优选至少240mg/mL，优选至少245mg/mL，优选至少250mg/mL，优选至少255mg/mL，优选至少260mg/mL，优选至少265mg/mL，优选至少270mg/mL，优选至少275mg/mL，优选至少280mg/mL，优选至少285mg/mL，优选至少290mg/mL，优选至少295mg/mL，优选至少300mg/mL，优选至少305mg/mL，优选至少310mg/mL，优选至少315mg/mL，优选至少320mg/mL，优选至少325mg/mL，优选至少330mg/mL，优选至少335mg/mL，优选至少340mg/mL，优选至少345mg/mL，优选至少350mg/mL，优选至少355mg/mL，优选至少360mg/mL，优选至少365mg/mL，优选至少370mg/mL，优选至少375mg/mL，优选至少380mg/mL，优选至少385mg/mL，优选至少390mg/mL，优选至少400mg/mL，优选至少405mg/mL等的血色素结合蛋白含量。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含75mg/mL-300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含75mg/mL-250mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含75mg/mL-200mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含75mg/mL-150mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含100mg/mL-300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含150mg/mL-300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含200mg/mL-300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含250mg/mL-300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含100mg/mL-200mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含300mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含250mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含200mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含100mg/mL-200mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含约100mg/mL血色素结合蛋白。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含100mg/mL血色素结合蛋白。

在本申请中公开的一个实施方案中，本发明的液体制剂具有至少5mL的体积，并且包含至少75mg/mL血色素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述液体制剂具有至少5mL的体积，并且包含至少100mg/mL或至少200mg/mL血色素结合蛋白。在具体的实施方案中，所述液体制剂具有至少5mL的体积，并且包含约100mg/mL，约125mg/mL，约150mg/mL，约175mg/mL，约200mg/mL，约225mg/mL，约250mg/mL，约275mg/mL，约300mg/mL，约325mg/mL，约350mg/mL，约375mg/mL或约400mg/mL浓度的血色素结合蛋白。在另一方面，提供了包含至少5mL的纯化血色素结合蛋白的稳定液体制剂的容器，其中血色素结合蛋白的浓度为至少100mg/mL或至少200mg/mL或至少250mg/mL或至少300mg/mL。在另一方面，提供了包含至少5mL的纯化血色素结合蛋白的稳定液体制剂的容器，其中血色素结合蛋白的浓度为100mg/mL或200mg/mL或250mg/mL或300mg/mL。

在其他实施方案中，可以将液体制剂制备为血色素结合蛋白浓缩物，其中该浓缩物将被稀释用于施用。将液体制剂制备为血色素结合蛋白浓缩物的优点之一在于它使储存体积最小化。根据需要，可以在施用于受试者之前或期间将浓缩物稀释。可以制备成浓缩物的纯化的血色素结合蛋白的适合的浓度是本领域技术人员所熟知的。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含至少250mg/mL的血色素结合蛋白含量。

关于“至少250mg/mL”，它包括250mg/mL，260mg/mL，270mg/mL，280mg/mL，290mg/mL，300mg/mL，305mg/mL，310mg/mL，315mg/mL，320mg/mL，325mg/mL，330mg/mL，335mg/mL，340mg/mL，345mg/mL，350mg/mL，355mg/mL，360mg/mL，365mg/mL，370mg/mL，375mg/mL，380mg/mL，385mg/mL，390mg/mL，400mg/mL，405mg/mL等。因此，在本发明的优选形式中，所述液体制剂包含至少300mg/mL，优选至少305mg/mL，优选至少310mg/mL，优选至少315mg/mL，优选至少320mg/mL，优选至少325mg/mL，优选至少330mg/mL，优选至少335mg/mL，优选至少340mg/mL，优选至少345mg/mL，优选至少350mg/mL，优选至少355mg/mL，优选至少360mg/mL，优选至少365mg/mL，优选至少370mg/mL，优选至少375mg/mL，优选至少380mg/mL，优选至少385mg/mL，优选至少390mg/mL，优选至少400mg/mL，优选至少405mg/mL等的血色素结合蛋白含量。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含至少300mg/mL的血色素结合蛋白含量。

在一个实施方案中，血色素结合蛋白含量通过UV吸收光谱法测定。在一个可选的实施方案中，通过免疫比浊法测量血色素结合蛋白。UV吸收光谱法和免疫比浊法的示例性实例在本申请中的另外的部分中描述。

如本申请中所用，术语“血色素结合蛋白”意指从天然来源(例如血浆)中分离或以其他方式至少部分纯化的血色素结合蛋白或重组产生的血色素结合蛋白，其包含SEQ IDNO：1的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％序列同一性的氨基酸序列、由SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％序列同一性的氨基酸序列组成或基本上由SEQID NO：1的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％序列同一性的氨基酸序列组成。血色素结合蛋白可以包括人和非人的变体。当预期将液体制剂施用于人受试者时，通常优选血色素结合蛋白是人血色素结合蛋白。然而，应当理解，可以使用血色素结合蛋白的非人同种型，其中预期的受试者是人，条件是血色素结合蛋白的非人同种型保留结合的能力。相反，当预期将液体制剂施用于非人受试者时，通常优选血色素结合蛋白来源于其所施用的种类，尽管还应理解，可以使用血色素结合蛋白的人同种型，其中预期的受试者为非人受试者，条件是血色素结合蛋白的人同种型保留与预期的非人受试者的血红素结合的能力。如本申请中所用，术语“来源于”意在包括从其天然来源中分离或以其他方式至少部分纯化的血色素结合蛋白，以及重组产生的包含与来源于所述物种的血色素结合蛋白的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的血色素结合蛋白。血色素结合蛋白的非人同工型的示例性实例是本领域技术人员熟知的，其示例性实例包括来源于牛、马或猪的血色素结合蛋白。

在本申请中公开的一个实施方案中，血色素结合蛋白是人血色素结合蛋白。这可能包括从人血浆中回收的至少部分纯化的血色素结合蛋白或重组产生的血色素结合蛋白。从血浆中纯化血色素结合蛋白的适合的方法是本领域技术人员熟知的，其示例性示例在WO2014/055552中描述，其全部内容通过引用并入本申请。在具体的实施方案中，本发明的纯化的血色素结合蛋白的液体制剂是由血浆级分或重组原料以商业规模生产的。作为示例性实例，当使用血浆级分作为原料时，商业规模的生产涉及使用来源于至少约500kg血浆的血浆级分。优选地，起始血浆级分来源于每批至少约2,000kg，3,000kg，4,000kg，5,000kg，7,500kg，10,000kg和/或15,000kg血浆。

如果液体制剂包含已经从诸如血浆的原料中纯化的血色素结合蛋白，并且将用于临床或兽医应用(例如，用于向患有与溶血有关的疾病的受试者施用)，则本领域技术人员应当理解，可能希望降低溶液中活性病毒含量(病毒滴度)和其他潜在传染因子(例如朊病毒)的水平。当包含血色素结合蛋白的原料(即起始物质)来源于血浆时，这可能是特别理想的。降低溶液中病毒滴度的方法是本领域技术人员已知的。实例包括巴氏灭菌法(例如，在高浓度的稳定剂(例如甘氨酸(例如2.75M)和蔗糖(例如50％)和/或其他选定的赋形剂或盐存在下于60℃温育该溶液10小时，干热处理，病毒过滤(使溶液通过纳米过滤器；例如20nm截止值)和/或将溶液用适合的有机溶剂和洗涤剂处理一段时间，并在一定条件下将溶液中的病毒灭活。溶剂洗涤剂已使用20多年，以灭活包膜病毒，特别是在血浆衍生的产品中。因此，它可以使用本领域已知的各种试剂和方法进行(参见，例如，US4540573和US4764369，其全部内容通过引用并入本申请)。适合的溶剂包括磷酸三正丁酯(TnBP)和乙醚。在一些实施方案中，溶剂约为0.3％且优选TnBP。适合的洗涤剂包括非离子型洗涤剂，例如聚山梨酯(Tween)80、聚山梨酯(Tween)20、Triton X-100、辛基葡萄糖苷(OPG)(典型地在约1％)。包括溶剂和洗涤剂浓度的处理条件的选择部分取决于原料的特性，其中纯度较低的原料通常需要较高的试剂浓度和更极端的反应条件。优选的洗涤剂是聚山梨酯80，特别优选的组合是聚山梨酯80和TnBP。优选的清净剂是聚山梨酯20，且特别优选的组合是聚山梨酯20和TnBP。优选的洗涤剂是OPG，且特别优选的组合是OPG和TnBP。可以在足以灭活可能存在的任何包膜病毒的温度和时间下将原料与溶剂和洗涤剂搅拌。例如，溶剂洗涤剂处理可以在25℃进行约4小时。随后通过例如吸附在色谱介质例如C-18疏水性树脂上或在吸附目标蛋白质的条件下将它们在离子交换树脂的滴通级分中洗脱，除去溶剂洗涤剂化学物质。

病毒灭活步骤可以在纯化过程的任何适合的阶段进行。在本申请中公开的一个实施方案中，病毒灭活步骤包含巴氏灭菌或用有机溶剂和洗涤剂处理。在本申请中公开的另一个实施方案中，病毒灭活步骤包含病毒过滤。在使用病毒过滤的情况下，在过滤步骤之前添加游离氨基酸(例如精氨酸)可以显著提高通量率和通过过滤器的血色素结合蛋白的回收率。在本申请中公开的一个实施方案中，将包含血色素结合蛋白的原料或溶液进行病毒灭活，然后纯化血色素结合蛋白。在纯化前采用病毒灭活步骤(如溶剂洗涤剂处理)的优点在于：它允许通过利用促进血色素结合蛋白与树脂结合和用流通(滴通)级分去除有机溶剂和洗涤剂的条件，从处理过的溶液中去除有机溶剂和洗涤剂。

在一些实施方案中，如本申请中公开的纯化的血色素结合蛋白的液体制剂基本上不含与它们通常结合的其他成分(例如，其他血浆来源的蛋白)。因此，在一个实施方案中，所述液体制剂包含少于总蛋白质的20％，优选少于总蛋白质的10％，且更优选少于总蛋白质的5％的通常与它们结合的其他成分(即杂质)。本领域技术人员将理解，本发明的液体制剂中存在的杂质水平可取决于组合物的预期用途。例如，在将组合物施用于有需要的人受试者(即用于临床用途)时，期望组合物包含少于(总蛋白质的)5％的杂质。相反，在蛋白质要在体外使用的情况下，如果组合物包含(总蛋白质中)超过5％的杂质，则可以接受。在一个实施方案中，所述液体制剂包含占总蛋白质重量至少90％，优选至少95％，优选至少97％，优选或至少98％，优选至少99％或更优选至少99.5％的血色素结合蛋白含量。在具体的实施方案中，使用免疫比浊法测定液体制剂中血色素结合蛋白的纯度。进行免疫比浊法的适合的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过在BNII仪器(Siemens Healthcare，Malvem，PA，USA)或类似仪器上通过免疫比浊法测量血色素结合蛋白的含量来确定液体制剂中血色素结合蛋白的纯度水平。液体制剂的总蛋白质含量可以通过Bradford方法或在280nm处的UV光谱法测定。然后，可以通过将血色素结合蛋白含量除以总蛋白含量并乘以100来计算血色素结合蛋白的纯度百分比。纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂中所含其他微量蛋白的纯度百分比可以以类似的方式确定。如果从人血浆中纯化出血色素结合蛋白，则可能存在于液体制剂中的微量蛋白的示例性实例包括白蛋白，α-1酸糖蛋白，α-1抗胰蛋白酶，α-2巨球蛋白，载脂蛋白AI，抗凝血酶III，铜蓝蛋白，触珠蛋白，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白G(IgG)和转铁蛋白。

重组血色素结合蛋白可以通过本领域技术人员已知的重组方法来制备。例如，可以将包含编码血色素结合蛋白(或其前体)的核酸序列的核酸分子转染到能够表达所述核酸序列的适合宿主细胞中，并在适合于表达所述核酸序列的条件下温育该宿主细胞并回收所述蛋白质。基于遗传密码的知识，用于制备编码重组血色素结合蛋白的核酸分子的适合的方法也将是本领域技术人员已知的，可能包括基于宿主细胞(例如微生物)的性质来优化密码子，所述宿主细胞用于表达和/或分泌重组血色素结合蛋白。适合的宿主细胞也是本领域技术人员已知的，其示例性实例包括原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))和真核细胞(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHO-K1)。如WO2016/054072中所述；NS0杂交瘤细胞和HEK293细胞，如WO2012/050874中所述)。参照“Short Protocols inMolecular Biology，第5版，第2卷章节：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology”(Frederick M.Ausubel(作者，编辑)，Roger Brent(编辑)，Robert E.Kingston(编辑)，David D.Moore(编辑)，J.G.Seidman(编辑)，JohnA.Smith(编辑)，Kevin Struhl(编辑)，J Wiley&Sons，London)。重组血色素结合蛋白的示例性实例描述在WO2016/054072中，其内容通过引用并入本申请。

在本申请中公开的一个实施方案中，血色素结合蛋白包含NCBI参比序列NP_000604.1(SEQ ID NO：1，如下)的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列、由NCBI参比序列NP_000604.1(SEQ ID NO：1，如下)的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成或基本上由NCBI参比序列NP_000604.1(SEQ ID NO：1，如下)的氨基酸残基24-462或与之具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。应当注意，SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-23(下面带下划线的文本)编码信号序列：

人血色素结合蛋白前体(SEQ ID NO：1)

在另一个实施方案中，血色素结合蛋白为人血色素结合蛋白，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；由SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成；或基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

关于“至少60％”，它包括例如在最佳比对或最好拟合分析之后，60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，血色素结合蛋白包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％序列同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成；或基本上由与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。

可以通过计算机的算法实施方式(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575ScienceDrive Madison，WI，USA)，或经任意选择的各种方法生成的通过检查和最佳比对(即在比较窗中获得最高的同源性百分比)来进行用于比对比较窗的序列的最佳比对。还可以参考例如Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25：3389所公开的程序的BLAST家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人(1994-1998)In：Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons Inc.的单元19.3中找到。

如本申请中所用，术语“序列同一性”是指在比较窗中，在核苷酸邻接核苷酸的基础上或氨基酸邻接氨基酸的基础上，序列是相同或在结构上相似的程度。因此，例如，“序列同一性百分比”通过下列步骤计算：在比较窗中比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如A，T，C，G，I，)或相同的氨基酸残基(例如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)出现在这两个序列中的位置数量以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100可得出序列同一性的百分比。例如，“序列同一性”是由DNASIS计算机程序(用于Windows的版本2.5；可从Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.，South SanFrancisco，California，USA获得)使用该软件随附的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。

如本申请中所用，术语“序列同一性”包括在核苷酸或氨基酸水平上比较的序列之间的精确同一性。该术语在本申请中还用于包括在核苷酸或氨基酸水平上的非精确同一性(即相似性)，其中序列之间的任何差异均与氨基酸相关(或在核苷酸的情况下，由所述核苷酸编码的氨基酸相关)，但是这些氨基酸在结构、功能、生化和/或构象水平上仍然彼此相关。例如，在氨基酸水平上存在非同一性(相似性)的情况下，“相似性”包括在结构、功能、生化和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在一个实施方案中，核苷酸和序列的比较在同一性而非相似性的水平上进行。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸残基。这可以称为保守取代。在一个实施方案中，可以通过保守取代其中包含的任何氨基酸残基来修饰氨基酸序列，使得与未修饰的多肽时比较，该修饰对修饰多肽的结合特异性或功能活性没有影响或影响可以忽略不计。

如本申请中所述，关于血色素结合蛋白的序列同一性涉及候选序列中的氨基酸残基的百分比，所述候选序列中的氨基酸残基在比对序列并引入空位(如果必要)之后，与相应的肽序列的残基相同，以便获得最大同源性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分。N-末端或C-末端的延伸或插入均不应解释为减少序列同一性或同源性。

血色素结合蛋白的变体也在本申请中关注。如本申请中所用，血色素结合蛋白的“变体”是与血色素结合蛋白的天然(天然存在)同种型(人或非人)的氨基酸序列共有至少一些序列同一性的分子或其组成部分，但仍保留结合血红素的能力。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成；或基本上由与SEQ ID NO：1的氨基酸残基24-462具有至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少93％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％或优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述变体是天然血色素结合蛋白的血红素结合片段。血色素结合蛋白的血红素结合片段在本申请中也可互换地称为“结合片段”或“血红素结合片段”，其为天然血色素结合蛋白分子(人或非人)的部分，它至少保留母体分子与血红素结合的部分功能活性。如本申请中另外部分所述，血红素结合可以通过使用本领域技术人员已知的方法容易地确定，其示例性实例是Lipiski等人(2013，Antioxidants&Redox Signalling，19(14)，pp.1619-1633)描述的方法，其全部内容通过引用并入本申请。如本申请中其他地方所述，Lipiski等人(2013)的方法稍作修改也可以使用。

在一个实施方案中，血色素结合蛋白的片段在两个四叶β螺旋桨结构域之间包含完整的血红素结合结构域，包括氨基酸残基His213和His266，其已被描述为配位血红素铁原子，得到稳定的双-组氨酰基复合物。

本领域技术人员将理解，血色素结合蛋白(包括其变体)对血红素的结合亲和力可以根据血色素结合蛋白(包括其变体)的氨基酸序列的不同而变化。在一个实施方案中，血色素结合蛋白或其血红素结合片段以平衡-解离常数(K_D)为1x10^-12或更小的结合亲和力与血红素结合。

本申请中还设想了融合蛋白，其包含血色素结合蛋白或其血红素结合片段。包含血色素结合蛋白的适合的融合蛋白的示例性实例描述在WO2006/018428中，其全部内容通过引用并入本申请。

术语“至少部分纯化的”，“分离的”，“纯化的”等在本申请中用于意指以分离和/或纯化的形式提供血色素结合蛋白；即，从其天然环境中分开、分离或纯化的形式并且以基本上纯或均匀制剂的形式提供。这类蛋白质典型地不含或基本上不含与它们天然结合的物质，例如在其天然环境或或当通过体外或体内实施的重组DNA技术进行这类制备时制备它们的环境(例如细胞培养物)中发现的其他多肽或核酸。例如，至少部分纯化的血色素结合蛋白可以包含不超过(总蛋白的)50％的杂质。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，纯化的血色素结合蛋白包含不超过(总蛋白质的)50％，优选不超过45％，优选不超过40％，优选不超过35％，优选不超过30％，优选不超过25％，优选不超过20％，优选不超过15％，优选不超过10％或优选不超过5％杂质或优选不超过(总蛋白质的)1％杂质、由其组成或基本上由其组成。

在本申请中公开的另一个实施方案中，血色素结合蛋白以分离和/或纯化的形式提供，该形式经过富集、浓缩或以其他方式具有比衍生它的原料中血色素结合蛋白的活性、量或浓度更大的比活性、量或浓度。在一个实施方案中，纯化的血色素结合蛋白的液体制剂来源于血浆。

氯化钠

本发明人令人惊奇地发现，掺入纯化的血色素结合蛋白的液体制剂的氯化钠的量与其中血色素结合蛋白的稳定性直接相关。

关于“至少50mM”，它包括50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，300mM，350mM，400mM，450mM，500mM，550mM，600mM，650mM等。因此，在本发明优选的实施方案中，所述液体制剂包含至少50mM氯化钠，至少100mM氯化钠，至少150mM氯化钠，至少200mM氯化钠，至少250mM氯化钠，至少300mM氯化钠，至少350mM氯化钠，至少400mM氯化钠，至少450mM氯化钠，至少500mM氯化钠，至少550mM氯化钠，至少600mM氯化钠，至少650mM氯化钠等，包括其范围。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含约50mM至约600mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含约150mM至约400mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含约150mM至约250mM氯化钠。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含150mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含400mM氯化钠。

磷酸盐缓冲剂

本发明人惊奇地发现，掺在纯化的血色素结合蛋白的液体制剂中的磷酸盐缓冲剂的类型和量也对血色素结合蛋白的稳定性有影响。

适合的磷酸盐缓冲剂为本领域技术人员所熟知，其示例性实例包括磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸磷酸盐。本发明人令人惊奇地发现，柠檬酸磷酸盐和磷酸钠缓冲剂在稳定溶液中的血色素结合蛋白方面优于磷酸钾缓冲剂、甘氨酸缓冲剂和Tris(三(羟基甲基)-氨基甲烷)缓冲剂。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂选自磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸磷酸盐。在本申请中公开的另一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂选自磷酸钠和柠檬酸磷酸盐。

在一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂为磷酸钠。在一个实施方案中，磷酸盐钠缓冲剂包含磷酸一钠和磷酸二钠。

本发明人令人惊奇地发现，柠檬酸磷酸盐在稳定溶液中的血色素结合蛋白方面优于磷酸钠缓冲剂。因此，在另一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂为柠檬酸磷酸盐。在一个实施方案中，柠檬酸磷酸盐缓冲剂包含柠檬酸和磷酸二钠。

关于“至少15mM”，它包括15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，55mM，60mM，65mM，70mM，75mM，80mM，85mM，90mM，100mM，150mM，200mM，250mM，300mM，350mM，400mM，400mM等。因此，在本发明优选的实施方案中，所述液体制剂包含至少15mM，至少20mM，至少25mM，至少30mM，至少35mM，至少40mM，至少45mM，至少50mM，至少55mM，至少60mM，至少65mM，至少70mM，至少75mM，至少80mM，至少85mM，至少90mM，至少100mM，至少150mM，至少200mM，至少250mM，至少300mM，至少350mM，至少400mM，至少400mM磷酸盐缓冲剂等，包括其范围。

尽管本发明人已经表明一定范围的磷酸盐缓冲剂和氯化钠浓度可用于改善溶液中的血色素结合蛋白的稳定性，但是他们还意外地发现某些浓度的磷酸盐缓冲剂和某些浓度的氯化钠在结合使用时可提供最佳的稳定性。在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含15mM-200mM柠檬酸磷酸盐和150mM-400mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含15mM-200mM柠檬酸磷酸盐和150mM-250mM氯化钠。

在另一个实施方案中，所述液体制剂包含200mM柠檬酸磷酸盐和150mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含50mM柠檬酸磷酸盐和400mM氯化钠。在另一个实施方案中，所述液体制剂包含15mM柠檬酸磷酸盐和150mM氯化钠。

在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含50mM-200mM磷酸钠和50mM-400mM氯化钠。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含50mM-200mM磷酸钠和150mM-250mM氯化钠。在本申请中公开的另一个实施方案中，所述液体制剂包含200mM磷酸钠和150mM氯化钠。

pH

本发明人还发现pH在维持溶液中血色素结合蛋白的稳定性中也部分起作用。

关于“pH 5.8-8”，它包括5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0。因此，在本发明优选的实施方案中，所述液体制剂包含5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH。

在本申请中公开的一个实施方案中，液体制剂的pH为6.5-8.0。在本申请中公开的一个实施方案中，液体制剂的pH为7.0-7.6。在本申请中公开的另一个实施方案中，液体制剂的pH为7.2。

确定并在必要时调节液体制剂的pH的方法是本领域技术人员熟悉的。优选地，pH将在室温下测量。确定并在必要时调节液体制剂的pH的适合的方法是本领域技术人员熟知的。优选地，在室温下测量pH。

电导率

本发明人还发现电导率可以至少部分地有助于溶液中血色素结合蛋白的稳定性。在本申请中公开的一个实施方案中，纯化的血色素结合蛋白的液体制剂包含至少10mS/cm的电导率。“至少10mS/cm”是指10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50mS/cm等。在另一个实施方案中，纯化的血色素结合蛋白的液体制剂包含10-45mS/cm的电导率。

关于电导率“10-45mS/cm”，它包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45mS/cm。

在本申请中公开的另一个实施方案中，液体制剂的电导率为10-25mS/cm。在本申请中公开的又一个实施方案中，液体制剂的电导率为15-25mS/cm。在本申请中公开的又一个实施方案中，液体制剂的电导率为10-15mS/cm。在本申请中公开的另一个实施方案中，液体制剂的电导率为至少30mS/cm。

确定并在必要时调节液体制剂的电导率的适合的方法对于本领域技术人员来说是熟知的，其示例性实例在本申请中另外部分描述。优选地，在室温下测量电导率。

稳定剂

在一些实施方案中，液体制剂可以进一步包含稳定剂。适合的稳定剂是本领域技术人员已知的，其示例性实例包括氨基酸，碳水化合物，盐和/或洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂)。在一些实施方案中，稳定剂包含糖醇和氨基酸的混合物。稳定剂可包含糖(例如蔗糖或海藻糖)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨醇)和氨基酸(例如脯氨酸，甘氨酸和精氨酸)的混合物。在一个优选的实施方案中，所述制剂包含氨基酸，例如精氨酸。在其他实施方案中，该制剂包含浓度至多100mM的二价金属离子和如US7045601中所述的络合剂。

在本申请中公开的一个实施方案中，液体制剂还包含非离子型洗涤剂。适合的非离子型洗涤剂是本领域技术人员熟知的，其示例性实例包括聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇酐单油酸酯)。本发明人发现，在纯化的血色素结合蛋白的液体制剂中存在聚山梨酯80改善了其中的血色素结合蛋白的稳定性。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，非离子型洗涤剂是聚山梨酯80。

在一个实施方案中，非离子型洗涤剂的含量为至少0.0005％v/v。关于“至少0.0005％v/v”，它包括0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.015％、0.02％、0.05％、0.10％、0.15％v/v等。因此，在本发明优选的实施方案中，所述液体制剂包含至少0.001％v/v，优选至少0.002％v/v，优选至少0.005％v/v，优选至少0.01％v/v，优选至少0.015％v/v，优选至少0.02％v/v，优选至少0.05％v/v，优选至少0.10％v/v，优选至少0.15％v/v等。

在本申请中公开的一个实施方案中，非离子型洗涤剂的含量低于0.01％v/v。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM磷酸盐缓冲剂；

(c)6.5-8.0的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)任选的含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM磷酸盐缓冲剂；

(c)6.5-8.0的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM柠檬酸磷酸盐缓冲剂；

(c)6.5-8.0的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)任选的含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM柠檬酸磷酸盐缓冲剂；

(c)6.5-8.0的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM柠檬酸磷酸盐缓冲剂；

(c)7.0-7.6的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)任选的含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

在本发明具体的实施方案，提供了纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)100-300mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)15mM-200mM柠檬酸磷酸盐缓冲剂；

(c)7.0-7.6的pH；

(d)150mM-400mM氯化钠；以及

(e)含量低于0.02％v/v的非离子型洗涤剂。

在一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有低于20mPa*S的粘度。

在另一个优选的实施方案中，稳定的液体制剂在25℃测定时具有100-250mg/mL的血色素结合蛋白含量和低于20mPa*S的粘度。

稳定性

如本申请中另外部分所述，纯化的血色素结合蛋白在标准缓冲溶液如PBS中固有地不稳定。这引入了严重的问题，特别是随着时间的推移制剂储存问题。例如，如本申请中公开的发明人自己的数据所指出的，通过差示扫描荧光测定法(DSF)所测定，在磷酸缓冲盐水(PBS；10mM磷酸钠，1.8mM磷酸钾，137mM NaCl，2.7mM KCl；pH 7.4)配制的纯化血色素结合蛋白相对不稳定。与PBS相反，当在氯化钠和可替代的磷酸盐缓冲剂如柠檬酸磷酸盐、磷酸钠或磷酸钾中配制血色素结合蛋白时，本发明人确认了向更高Tm方向出乎意料且显著的位移。向较高Tm位移表明对血色素结合蛋白具有稳定作用。

类似地，本发明人发现，当在PBS中配制纯化的血色素结合蛋白时，溶液中的血色素结合蛋白随时间的推移显著降解，这由血色素结合蛋白聚集物(包括血色素结合蛋白二聚体)和血色素结合蛋白片段的量增加所证实。例如，在37℃储存3个月后，PBS(pH 7.4)中的血色素结合蛋白液体制剂包含54.6％w/w的聚集物、3.1％w/w的二聚体和9.8％的血色素结合蛋白片段，其中仅剩余32.5％w/w的血色素结合蛋白单体。血红素结合活性的丧失也反映了这一点。相反，当将纯化的血色素结合蛋白与至少15mM的可替代的磷酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸磷酸盐或磷酸钠)在NaCl溶液中配制时，在37℃储存同一时间段，溶液中血色素结合蛋白聚集物和片段的比例显著减少，其中溶液中保留了大于50％的血色素结合蛋白单体。这也反映在血红素结合的保持上，表明对血色素结合蛋白具有显著的稳定作用。在本申请中公开的一个实施方案中，通过大小排阻HPLC测定，包含NaCl和磷酸盐缓冲剂的溶液中的单体血色素结合蛋白的浓度为总蛋白重量的至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。

优选地，本申请中公开的液体制剂将在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、24、36或更多个月内基本上保持其原始稳定性特征。例如，储存在2-8℃或25℃的液体制剂典型地会保留与HPLC-SEC测得的基本上相同的分子大小分布，或在储存1个月或更长时间时保留基本相同的血色素结合蛋白单体含量。当在2-8℃和/或25℃的室温下储存时，液体制剂的特定实施方案可以是稳定的且适合于商业制药用途至少3个月或更长时间。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存1个月时包含至少70％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存2个月时包含至少50％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存3个月时包含至少50％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存1个月时包含至少80％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存2个月时包含至少70％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂在37℃储存3个月时包含至少60％血色素结合蛋白单体。

本申请中公开的液体制剂可以与药学上可接受的载体一起配制。适合的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂是本领域技术人员已知的。实例包括溶剂，分散介质，抗真菌剂和抗菌剂，表面活性剂，等渗剂和吸收剂等。

也可以将制剂在分配和长期保存之前通过过滤灭菌。可以将本申请中所述的组合物配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如注射剂。制剂及其随后的施用(给药)在本领域技术人员的能力范围内。给药剂量取决于受试者对治疗的反应性，但是将一直持续只要期望的期望效果(例如血红素水平降低)即可。本领域普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。

在本发明的另一方面，提供了一种确定液体制剂中血色素结合蛋白的血红素结合活性的方法，该方法包括：

(a)提供血红素和血红素载体分子复合物；

(b)混合(a)的复合物与包含血色素结合蛋白的液体制剂，并且将该混合物温育一段时间，以允许血红素从载体分子转移至血色素结合蛋白；以及

(c)在选自450nm-700nm范围的两个或更多个波长处测定(b)的混合物的吸光度，

其中如(c)中确定的两个或更多个波长处的吸光度值之间的差异表示液体制剂中血色素结合蛋白的血红素结合活性。

本公开的这一方面基于发明人的如下发现，即当血红素与白蛋白或血色素结合蛋白结合时，血红素的不同光谱特征可用于确定溶液中血红素-血色素结合蛋白复合物的浓度，因此确定血色素结合蛋白的血红素结合活性。在一个实施方案中，将摩尔过量的血红素-载体分子复合物与包含血红蛋白的液体制剂(如果必要，在适当的缓冲溶液例如磷酸缓冲盐水中稀释)混合，并且将混合物温育一段时间，以使血红素从血红素载体蛋白转移到血色素结合蛋白。然后在可见光谱中的最少两个波长处测量混合物的吸光度。然后可以使用比尔定律，结合与载体分子和血色素结合蛋白结合的血红素的消光系数以及测得的吸光度值来计算所得血红素-血红蛋白复合物的浓度。典型地针对测定期间对原始血色素结合蛋白溶液的任何稀释液校正该浓度，并且所得浓度相当于原始液体制剂中活性血色素结合蛋白的量。血红素载体分子典型地以比血色素结合蛋白低的亲和力结合血红素，并且通常能够在水性环境中结合血红素。血红素载体分子的适合的实例是本领域技术人员熟知的，其示例性实例包括血红蛋白和白蛋白。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，血红素载体分子选自血红蛋白和白蛋白。本领域技术人员将理解，血红素载体分子可以是天然存在的分子(例如，血清来源的血红素载体，例如血红蛋白或白蛋白)，或者可以是非天然存在的(例如，重组产生的载体分子，例如人重组白蛋白)。在一个实施方案中，血红素载体蛋白是白蛋白。更优选地，血红素载体蛋白是人白蛋白。使用白蛋白的优势包括：(i)容易获得；(ii)是血浆中的生理相关血红素载体；(iii)已知它将血红素转移到血色素结合蛋白上；(iv)与血红素形成确定的1∶1复合物(参见Ascenzi&Fasano，2009，Life，61(12)1118-1122)。

当血红素从载体分子转移到血色素结合蛋白时，最少需要两个表现出吸光度变化的波长。在一个实施方案中，选择两个或更多个波长，使得一个波长处的吸光度会增加，并且其他波长的吸光度会降低。预期在两个或更多个波长之间的吸光度变化的幅度越大，则该方法在确定血红素结合活性中的灵敏度越高。优选在混合物光谱中的峰值或谷值附近而不是在陡坡上的波长，这样可使该方法更能容忍分光光度计校准中的误差。本申请中提及的“450nm-700nm”包括450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，540nm，550nm，560nm，570nm，580nm，590nm，600nm，610nm，620nm，630nm，640nm，650nm，660nm，670nm，680nm，690nm和700nm。在可见光谱中，与白蛋白结合的血红素在约500nm、533nm和622nm处具有吸收峰，而与血色素结合蛋白结合的血红素在约533nm和565nm处具有吸收峰。因此，在本申请中公开的一个实施方案中，在从500nm至630nm的范围内选择两个或更多个波长。在一个优选的实施方案中，两个或更多个波长选自500nm、533nm和622nm。在另一个实施方案中，两个或更多个波长为533nm和622nm。由于血红素从白蛋白转移到血色素结合蛋白时，吸光度的变化幅度更大，因此622nm处的吸光度具有超过500nm的优势(两者都显示相同的变化方向)。

基于血红素转移混合物的吸光度以及血红素-白蛋白和血红素-血色素结合蛋白在这些波长下的消光系数，可以计算出血红素-血色素结合蛋白复合物的浓度。在最终混合物中测定的血红素-血色素结合蛋白的量代表具有生物活性的血色素结合蛋白的量。典型地选择温育时间和温度以使血红素从血红素结合分子转移至溶液中的血色素结合蛋白。典型地执行该方法，以使血红素-白蛋白相对于血色素结合蛋白明显过量(约2.5×)，以确保有足够的血红素使所有活性血色素结合蛋白分子完全饱和。在本申请中公开的一个实施方案中，在20-25℃或37℃温育大约5-60分钟。在一个优选的实施方案中，温育在37℃进行10-20分钟。典型地选择混合物的pH和缓冲剂浓度以允许血红素载体分子将血红素转移至血色素结合蛋白。在一个优选的实施方案中，pH接近生理条件；即约pH 6.5-7.5。在一个实施方案中，pH为7.0。选择血红素结合分子和血色素结合蛋白的浓度，以使得在两个或更多个波长处的总吸光度在分光光度计的线性范围内。可以设置该方法使得相对于血色素结合蛋白存在大量过量的血红素载体分子(例如，约2.5-倍)以确保有足够的血红素使得在混合物中所有活性血色素结合蛋白分子完全饱和。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含在2-8℃储存6个月时至少90％的具有血红素结合活性的血色素结合蛋白。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含在室温(例如25℃)储存6个月时至少90％血色素结合蛋白单体。

在本申请中公开的一个实施方案中，所述液体制剂包含在37℃储存6个月时至少50％血色素结合蛋白单体。

治疗方法

在本发明的另一方面，提供一种治疗与溶血相关的病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用如本申请中公开的一种组合物，其包含纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂由其组成或基本上由其组成。

如本申请中使用的术语“受试者”指动物，其包括灵长类(低级或高级灵长类)。高级灵长类包括人。虽然本发明特别地应用于人中的目标病症，但是本领域技术人员应当理解非人动物也可受益于本申请中公开的组合物和方法。因此，技术人员应当理解本发明同时具有人和兽医应用。为方便起见，“动物”包括牲畜和陪伴动物例如牛、马、绵羊、猪、骆驼、山羊、驴、狗和猫。关于马，这些包括赛马业使用的马以及娱乐业使用的马或畜牧业的马。

本发明的组合物或制剂可以以多种途径施用于受试者。合适的施用途径的实例包括静脉内、皮下、动脉内或输注。在一个实施方案中，通过静脉内施用该组或制剂。在另一个实施方案中，通过皮下施用该组合或制剂。

当必要时，本发明的方法可以进一步包括施用第二治疗剂。第二治疗化合物可以依次(在施加用本申请中公开的组合物或制剂之前或之后)或同时共同施用于受试者。在一个实施方案中，第二治疗剂为铁螯合剂(例如去铁敏或去铁酮)。

在本发明的另一方面，提供如本申请中公开的本发明的组合物或制剂在制备用于治疗与溶血相关的病症的药物中的用途。这样的组合物或制剂优选地适用于人患者。

在本发明的另一方面，提供了如本申请中所公开的本发明的组合物或制剂，其用于在有需要的受试者中治疗与溶血有关的病症。

与溶血相关和具有血红蛋白/血红素-介导的毒性风险的病症是本领域已知的。在一个实施方案中，所述病症选自急性溶血病和/或慢性溶血病。在一个实施方案中，所述病症选自溶血性贫血，再生障碍性危象，过度溶血性危象，输血引起的溶血，溶血性尿毒症综合征，心肌梗塞，急性胸腔综合征，肺动脉高压，腿溃疡，生长迟缓，骨梗塞，先兆子痫，肾衰竭，急性肾损伤，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，中风包括出血性中风，颅内出血(ICH)，脾隔离症，脾梗塞，自身免疫性疾病(例如自身免疫性溶血性贫血)，微生物感染或对感染的易感性增加(例如疟疾感染)，创伤，与移植相关的病症，使用心肺旁路手术进行开放式心脏手术和烧伤，包括治疗血红蛋白血症或血红蛋白尿并伴有烧伤后的溶血。

在一个实施方案中，所述病症选自镰状细胞贫血、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞贫血、地中海贫血、先天性红细胞生成不良性贫血和阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、系统性红斑狼疮和慢性淋巴细胞性白血病。

在一个实施方案中，所述病症选自出血性中风和颅内出血(ICH)。

在一个实施方案中，所述病症为导致溶血和炎症的遗传或遗传性疾病或病症。

在一个实施方案中，所述病症为ARDS。

本领域技术人员将理解，本申请中描述的本发明除了具体描述的之外还可以进行变化和变型。应当理解，本发明包括落入本发明的精神和范围内的所有这些变化和变型。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任何两个或更多个的任何和所有组合。

现在将参照以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅用于示例目的，而并不预期限制上述通用性的范围。

实施例

材料和方法

A.样品制备

对于报道的制剂开发，从Kankakee的人血浆(Kistler-Cohn级分IV)纯化血色素结合蛋白(Hpx)。纯化方法的细节是基于先前在WO2014/055552中描述的方法，其内容通过引用整体并入本申请。在pH 7.4的PBS中提供纯化的Hpx，蛋白浓度为3-4％。

通过用Cary60分光光度计(Agilent)测量在280nm处的UV吸光度来确定制剂的蛋白质浓度。简言之，将蛋白质溶液在NaCl 0.9％中稀释至仪器准确范围内的浓度(＜1.5mg/mL)，然后放入UV-Vis一次性比色皿中(路径长度：1cm)。根据Beer-Lambert定律，使用消光系数1.971转换测得的吸收率：A＝ε x c x 1，其中c是浓度，1是比色皿的路径长度(cm)，ε是消光系数(在280nm 0.1％)nm；1cm的路径长度)，A是给定波长下的吸光度。将蛋白质浓度表示为来自两次独立测量的平均值mg/mL。

对于DSF实验，将Hpx稀释到研究的缓冲剂/赋形剂中，使其终浓度为0.1mg/mL。通过使用10kDa MW截止值滤盒(PES，50cm²，PALL Life Sciences)，用

通量装置(GEHealthcare)进行渗滤，可获得用于应力诱导稳定性研究的更高浓度(至多35％)的Hpx制剂。

B.稳定性研究

表1a.本报告中描述的稳定性测试的概述

C.差示扫描荧光测定法(DSF)

差示扫描荧光测定法(DSF)是研究不同稳定剂和赋形剂存在下纯化蛋白的热稳定性的快速方法。蛋白质解折叠的温度通过染料荧光的增加来测量，该染料对蛋白质的疏水部分具有亲和力，而疏水部分随着蛋白质的解折叠而暴露。对Niesen等人(Niesen，2007)的测定方案行了相应的修改和改变。简言之，在不同的赋形剂存在下，将纯化的Hpx(约4％)稀释到期望的缓冲剂中，使最终蛋白质浓度达到0.1mg/mL。通过添加20μL 0.1mg/mL蛋白质和0.5μL SYPRO Orang(在PBS中按1∶400预先稀释)，将样品分配到PCR板的孔中。每种条件一式三份测定。将该板用光学箔片密封并快速旋转以将所有溶液收集在孔的底部。用CFX96实时PCR系统(BioRad)进行从25到80℃(以0.5℃/min)的温度上升，并且将激发和发射波长分别设置为492和610nm。数据收集使用CFX Manager^TM软件(BioRad)进行。通过温度升高使蛋白质解折叠，与新暴露的疏水性贴片结合的染料发射610nm处的强荧光。按照这种方式，生成每种条件的熔解曲线，如图2所示。达到峰值后，荧光强度逐渐降低，这主要是由于沉淀和聚集导致蛋白质从溶液中去除所致。峰的S形上升曲线可以通过二态跃迁来描述，每个熔解曲线的拐点用于确定T_m(一阶导数)。为了确定使Hpx(解)稳定的缓冲剂条件，将每种筛选条件下蛋白质的T_m值与参比T_m(PBS中的Hpx，pH 7.4)进行比较。

D.血红素结合测定I

通过采用Lipiski(2013；Human Hp1-1 and Hp2-2 Phenotype-SpecificHaptoglobin Therapeutics Are Both Effective In Vitro and in Guinea Pigs toAttenuate Haemoglobin Toxicity.Antioxidants&Redox Signalling，19(14)，pp.1619-1633)在先描述的方法测定血红素结合。简言之，将与人白蛋白结合的met-Hb(Fe³⁺)(PBS中15μM)或血红素与在10μM人Hpx一起温育。使用Cary 60 UV-VIS分光光度计(AgilentTechnologies)记录连续的UV-VIS光谱(350-650nm)，以便跟踪met-Hb/血红素转移至血红素-Hpx随时间的变化。对于每个时间点，通过应用SciPy的Lawson-Hanson的非负最小二乘算法(www.scipy.org)对整个光谱进行解卷积，可以解决反应混合物中met-Hb/血红素和血红素-Hpx的浓度。解卷积脚本由UZH(J.Deuel和D.Schaer)提供。达到平稳期后，平均至少15个数据点，并表示为以μM为单位的血红素转移量。将Hpx活性以百分比表示为与最初施加的Hpx的总量相比血红素/血红素结合Hpx的量。

E.血红素结合测定II

以下是用于测量溶液中活性血色素结合蛋白含量的可替代测定方法。

血色素结合蛋白以对任何已知蛋白的最高亲和力结合血红素(也称为亚铁血红素，由含铁(III)的原卟啉IX与氯化物配体组成，血红素的完全氧化制剂)结合，并能竞争与白蛋白结合的血红素。血红素在Soret区域具有特征性的强吸收带，在光谱的可见光区域具有较低强度的带。这些带位移的最大吸光度取决于血红素在溶液中的氧化和配体结合状态。游离血红素在385nm处具有最大吸光度，可用于精确测定溶液中游离血红素的浓度。在可见光范围内，与白蛋白结合的血红素的光谱具有在500nm、533nm和622nm处的最大值的峰，而与血色素结合蛋白结合的血红素在533nm和565nm处具有最大峰值。在这种方法中，将纯化的血色素结合蛋白添加到过量的血红素-白蛋白复合物中，并使用分光光度法测量在533nm和622nm处从白蛋白转移到血色素结合蛋白的血红素期间的吸光度变化。基于血红素转移混合物的吸光度以及血红素-白蛋白和血红素-血色素结合蛋白在上述波长处的消光系数，可以计算出血红素-血色素结合蛋白复合物的浓度。最终混合物中测定的血红素-血色素结合蛋白的量相当于活性血色素结合蛋白的量。

缩写：

CV 变异系数

Hpx 血色素结合蛋白

PBS 磷酸缓冲盐水

PVDF 聚偏二氟乙烯

Q.S. 适量

SOP 标准操作程序

UV 紫外

Vis 可见

材料和设备：

·血红素：Frontier Scientific H651-9。

·纯化的人白蛋白：即CSLB Albuminar 25％或AlbuRx 25％。

·测试用血色素结合蛋白对照和样品。

· PBS pH 7.4：ThermoFisher 28348 20×浓缩物或等效物。

·磷酸：Fisher A260-500，85wt％(等于14.62M).

·水：Fisher W5-4，HPLC级或更优。

·一次性紫外线比色杯：1.5mL，半微型(12.5×12.5×45mm)目录号：759165，BRAND GmbH，1cm路径长度。

· 0.22μm PVDF注射式过滤器(Millipore SLGV033RS，低蛋白结合性Durapore或等效物)。

·配备恒温多池更换器的紫外-可见分光光度计(或等效物)。

·校准的可调移液器。

·校准的pH计。

方法

(i)缓冲剂制备

5M磷酸溶液：缓慢地将3.42mL 85wt％磷酸加入2.5mL去离子水。1×PBS：用1×PBS的去离子水稀释20×PBS浓缩物。

(ii)血红素-白蛋白复合物的制备

在容量瓶中使用0.1M NaOH将大约66mg的血红素溶解并适量至10mL，在37℃温育3分钟，并调节至约10mM的终浓度。为了确定血红素原液的浓度，通过将500μL的血红素溶液添加到4500μL的5mMNaOH中，进行10×连续稀释三次，以使最终的稀释因子为1000，其中血红素的浓度约为10μM。用5mM NaOH将UV-Vis分光光度计调零，并在A385读取稀释溶液的吸光度，并使用下面的等式1计算血红素储备液的实际浓度(mM)。在5mM NaOH中的血红素消光系数为58400M^-1cm^-1(Kirschner-Zilber等人，1982；Biochimica et Biophysica Acta690：20-30)。

等式1

C_{来自上述步骤(ii)的血红素储备液}＝A₃₈₅÷58400×10⁶

使用0.1M NaOH将约2.5mL的血红素储备液稀释至10mL(4×稀释，约2.5mM)。在0.1M NaOH溶液中混合8mL 25％白蛋白、2mL HPLC级水和10mL 2.5mM血红素，然后在37℃温育1小时。用5M磷酸将pH调节至7.4(需要

)。在容量瓶中，使用HPLC级水或更优级水使稀释溶液为适量至25mL，然后通过0.22μm过滤器，等分至0.5mL，然后根据需要在-80℃储存。白蛋白的终浓度约为1.21mM(基于66kDa，80mg/mL)。血红素-白蛋白复合物的终浓度等于根据上述等式1除以总稀释系数10计算得出的储备血红素浓度。

(iii)血色素结合蛋白测试样品稀释

使用校准的可调节移液管将血红结合素蛋白溶液稀释至PBS中约10mg/mL的血色素结合蛋白。

(iv)血色素结合蛋白测定对照

血色素结合蛋白测定对照是具有确定的(已知)功能活性的血色素结合蛋白样品。在分析血色素结合蛋白测试样品时，每次测定中都包含分析对照。为了建立血色素结合蛋白对照样品的活性值，可以在不同天对对照样品进行至少三次上述血红素转移测定。理想情况下，不同重复的％CV将在10％以内，否则，使用新鲜制成的缓冲剂和试剂重复测定。

(v)血红素从白蛋白转移到血色素结合蛋白

在塑料比色杯中，将250μL血红素-白蛋白溶液与600μL 10mg/mL血色素结合蛋白测试样品或测定对照以及1150μL PBS混合。然后如上所述使用单一血色素结合蛋白稀释液一式三份制备每个样品的混合物。将混合物在37℃温育10-20分钟，并使用Advanced ReadsMode和18池固定器测量UV-Vis分光光度计上的吸光度值。在测量前，将分光光度计用PBS调零。使用了以下设置：

波长：533nm，622nm和700nm。平均时间：1秒。比色杯温度：37℃。

(vi)计算、数据分析和验收标准

典型地，将700nm处的吸光度值保持在0.1AU以下，以确保读数的光散射干扰最小。然后使用下面的等式2针对每个转移反应计算血红素-血色素结合蛋白(即总活性血色素结合蛋白)的浓度。血色素结合蛋白的计算浓度以μM为单位报告，并且比色皿具有1cm的路径长度(l)：

等式2

然后将结果乘以稀释倍数以确定原始溶液中的活性血色素结合蛋白浓度。然后将每个样品的一式三份取平均值。测定对照的平均活性血色素结合蛋白浓度典型地应在此前为该批次测定对照建立的值的10％以内。

F.用于稳定性评价和指示性蛋白质表征的方法

表2概括了所有其他测定法和操作，这些测定法和操作用于进一步研究Hpx的稳定性和蛋白质表征。

表2.评价血色素结合蛋白稳定性和表征的测定法

实施例1.纯化的(PBS-配制的)人血色素结合蛋白的生化表征

在第一种方法中，通过几种生化方法分析纯化的PBS配制的Hpx，以设置分析基准(参比值)。SDS-PAGE和SEC-HPLC数据表明，纯化的Hpx(图3)的蛋白质纯度>98％。如以前其他人(Mauk，2011)所显示，与非还原条件(约60kDa)相比，Hpx在还原下表现出分子量增加(约65-70kDa)(图3A)。通过SEC-HPLC的分子大小分布揭示了一个主峰，其相当于摩尔质量为57kDa的单体Hpx(通过SLS测量证实，图3C)。在老化和热应力样品中，可以鉴定两个明显的碎片峰(32-35kDa和17-20kDa)，且两个峰相当于较高分子量的种类，其中之一被鉴定为Hpx-二聚体(130-138kDa)。第二个峰相当于甚至更高的分子量，这反映了更高级的聚合物或聚集物。

此外，通过等电聚焦，可以确认在pH 6.55处的理论等电点(约pH 6)，如图3B所示，并且多个Hpx谱带可归因于碳水化合物的变异性，尤其是唾液酸化程度，如Mauk，2011所述。2D-PAGE分析显示仅有少量杂质。

最后，将人血色素结合蛋白浓缩(在PBS中配制，pH 7.4)至350g/L(35％)，并间歇取样以分析相应蛋白质浓度下的溶液粘度(图3D)。如下所示，至多300g/L的浓度时，粘度保持在20mPa*s以下，这被认为是任何递送系统的允许粘度(Du，2011；Biotechnology andBioengineering，pp.632-636)。

实施例2.缓冲剂筛选

确定了几种候选缓冲剂，并通过DSF对最佳缓冲剂条件进行了热稳定性筛选。这种高通量方法已显示出与DSC数据(差示扫描量热法)非常相关，但具有可以同时分析几种条件的优点。在第一个筛选中，在存在和不存在150mM氯化钠的情况下分析所有缓冲剂，并且在相应缓冲剂的缓冲容量范围内pH步长至少为0.5。在下面的表3中，概括了所有分析的条件。此外，如下表3所示，针对Hpx(D，G和K)最有希望的缓冲环境进行了进一步分析，涉及不同的缓冲浓度(15-300mM)和添加了不同的氯化钠浓度(50-600mM)。

表3.分析的缓冲剂综述。

*PBS(10mM磷酸钠，140mM NaCl，pH 7.4)中配制的Hpx用作参比物。

对于每种条件，确定相应的T_m值，并将其与用作参比T_m的PBS pH 7.4中的Hpx进行比较。结果表示为相对于参比值的绝对T_m或ΔT_m(在PBS中稀释的Hpx的T_m)。如图4A所示，三种缓冲剂(a，b和c；柠檬酸磷酸盐，磷酸钠和甘氨酸)对Hpx的T_m明显升高诱导热转移，这牵涉对蛋白质的稳定作用。此外，在不存在氯化钠的情况下，所有三种缓冲剂均显示出较早的蛋白质解链出现(数据见附录A；筛选I)，表明氯化钠作为稳定剂的必要性。通过在三种稳定缓冲剂中补充不同浓度的氯化钠(50-250mM)进一步分析该观察结果。如图4A和B所示，随着氯化钠浓度的增加，可以以剂量依赖性方式获得增强的热稳定性。所有测试的缓冲剂均可覆盖较宽的pH范围，然而，根据图4C，7.0-7.6之间的pH似乎是最佳条件。

在柠檬酸磷酸盐缓冲剂(200mM)中和在pH 7.2的150mM NaCl存在下配制的Hpx产生了相当好的热稳定性(ΔT_m：7℃)，但是得到的同渗浓度不利地高(约880mOsm/L)。因此，如图4D所示，分析了柠檬酸磷酸盐浓度和氯化钠浓度的几种组合。为了在较低的柠檬酸磷酸盐浓度下保持维持相似的热稳定性，需要使用较高的氯化钠浓度，这对溶液的总同渗浓度没有影响甚或具有增加的影响。较低的同渗浓度只能通过同时降低缓冲剂和氯化钠来实现，但这也会导致热稳定性降低。

总之，至少在热稳定性方面，中性pH值包含柠檬酸盐或磷酸钠以及与氯化钠(>150mM)组合的缓冲系统对于来源于人血浆的血色素结合蛋白而言可能是适合的制剂。随后将血色素结合蛋白渗滤到上述盐的不同缓冲剂系统中并以不同的浓度组合进行渗滤，如下面多个部分中所述。

附录A中汇总了所分析的所有组合的完整数据集。

实施例3.赋形剂筛选

3.1.糖

探索了糖对热稳定性的影响。在产生了增强的热蛋白质稳定性的上述确定的缓冲剂中补充了不同浓度的不同糖。简言之，如下表4中所示，在150mM NaCl存在下，将浓度为2.5％、5％、7.5％和10％的蔗糖、海藻糖或甘露糖醇添加到相应的缓冲剂中。

表4.所分析的糖的简述

使用与如上所述相同的设置评价热稳定性，且结果以相对于在PBS中稀释的Hpx的T_m的绝对T_m或ΔT_m表示。如图5所示，热稳定性没有增加或仅有边缘增加，这仅限于最高糖浓度。根据定义，需要对热稳定性产生显著影响，以描绘至少一度的变化(在图中用虚线标记)；所有低于该变化的变化最可能在测量误差范围内。

对于用柠檬酸磷酸盐配制的Hpx，所有测试的糖对热稳定性均无累加作用，因为与参比制剂(PBS；T_m：53℃)相比，T_m已经升高(约60℃)。在磷酸钠配制的Hpx的情况下，添加三种糖时，存在明显的剂量依赖性增加，但是再次显示只有在最高浓度下才能实现明显的增加。在甘氨酸配制的Hpx中，也存在糖的T_m剂量依赖性增加，但是所获得的热稳定性仍远低于使用柠檬酸磷酸盐配制物。

3.2.氨基酸

为了完成DSF筛选，分析了作为赋形剂的氨基酸稳定Hpx的能力。基于已报道的出版物，根据氨基酸的潜在稳定作用选择氨基酸。代表了每种亚型，即极性氨基酸、带电荷的氨基酸和疏水性氨基酸。下表5中显示了所有分析条件的概述。

表5.氨基酸简述

在pH 7.2的200mM柠檬酸磷酸盐缓冲剂存在下以两种不同浓度(50μM和100μM)分析了每种氨基酸。由于在100μM下不溶，谷氨酸仅在50μM下进行了分析。数据显示在图6中，并且与使用糖获得的结果相似，通过添加氨基酸，仅获得了热稳定性的边缘提高，使用精氨酸和脯氨酸看到了最高边际。基于这些结果，氨基酸对溶液中血色素结合蛋白的稳定性的贡献看起来可以忽略不计。

3.3.非离子型洗涤剂：聚山梨酯80(P80)

非离子表面活性剂可用于蛋白质制剂中以抑制由于搅拌或摇动而引起的蛋白质聚集。稳定蛋白质的能力主要归因于它们在疏水性表面(如空气-水界面)上胜过蛋白质分子的能力，从而防止了蛋白质在这些疏水性界面上解折叠。在本研究中，研究了聚山梨酯80(P80)对溶液中血色素结合蛋白的潜在稳定作用。由于用于DSF分析的荧光染料与P80的疏水尾结合，因此可以使用可替代的稳定性测定法评价P80在Hpx制剂中的影响。简言之，将Hpx浓缩至最终蛋白质浓度为10％(100mg/mL)，并对(i)200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.2或(ii)PBS，pH 7.4进行透析，如下表6所示。将聚山梨酯80掺入最终配制的Hpx溶液中，浓度范围为0.001％-0.1％。未加标样品用作对照。

表6.包含聚山梨酯80的制剂的简述

如下表7中所示，将P80加标制剂暴露于变化的压力条件下，包括搅拌和冷冻/融化循环，以评价其在室温(RT)和37℃三个月的存储期内的相对稳定性。

表7.应力条件和时间点

在第一系列实验中，对每种Hpx制剂进行恒定搅拌，以了解产品在剪切应力下的稳定性，从而确定非离子表面活性剂对蛋白质的稳定性是否有益。将样品在台式热循环仪上在25℃以1000rpm搅拌4小时。一组没有搅拌的相同样品用作对照。搅拌期后，通过SEC-HPLC分析样品，如图7中所示。搅拌的制剂在应力下没有显示出主要聚集，并且二聚体或片段形成没有变化。此外，对所有8种制剂从-70℃到环境温度进行5个连续的冷冻/融化循环，以评价其物理稳定性；此外，将一组未经冷冻/融化循环的相同制剂用作对照。如图7中所示，SEC-HPLC显示，在连续5次冷冻/融化循环后，与未处理的对照组相比，聚集物的量略有增加。在所有8种制剂中均进行了此观察，其与特定的P80浓度无关。有意义的是，经历冷冻/融化循环的制剂没有描绘任何片段。

鉴于SEC-HPLC显示在连续冷冻/融化循环后聚集物略有增加，尽管与特定的P80浓度无关，在通过SDS-PAGE(还原和非还原)分析所有样品后未观察到差异，如图8中所示。此外，通过血红素结合测定法(图9)证明了Hpx结合血红素的能力不受不同P80浓度存在的影响。各种P80浓度之间血红素结合能力的差异在测定变异性范围内(＜5％)。因此，在任何测试浓度和处理下，P80均不损害血红素结合。

如上所述，所有制剂在加速条件(37℃)下和在RT下储存至少3个月，并且在储存每个月后分析样品(参见下面实施例4)。

实施例4.不同条件下的稳定性研究

4.1.制剂制备

通过在不同的存储条件(短期和长期)下进行稳定性研究，进一步研究了如上所述基于DSF的上述优选条件。简言之，将配制在PBS中的Hpx浓缩至10％Hpx，并渗滤到期望的缓冲剂和赋形剂组合物中，如下表8中所示。如果必要，可通过谨慎地滴定0.2M HCl或0.2MNaOH进行pH调节。然后，将每种制剂进行无菌过滤，装入无菌玻璃小瓶中，并保存在不同的温度下，以便在0、1、2和3个月或其他指示的时间点进行后续分析。

表8.

表8(接续)

4.2.在PBS中使用不同浓度的聚山梨酯80的短期稳定性研究

如表8(I-VI)中所示，将配制在PBS中的Hpx浓缩至10％，然后掺入不同浓度的P80。

将所有制剂在室温和37℃避光保存3个月。在每个时间点，通过SEC-HPLC分析样品，以监测寡聚体和片段的潜在生成。3个月后每种P80浓度的分子大小分布结果如图10中所示。

在37℃的储存条件下，与在室温下储存3个月的制剂相比(聚集物增加＜1％)，每种Hpx制剂表现出聚集物的显著增加(3个月后为63-70％)。下表9中展示了对照和含有P80的样品在37℃保存3个月后通过SEC-HPLC分析得到的峰面积百分比结果。附录A中显示了两种存储条件下来自0、1、2和3个月时间点的完整SEC-HPLC结果。

表9.在37℃储存3个月后的SEC-HPLC数据。

此外，在三个月内的每个时间点评价血色素结合蛋白的血红素结合能力，并且数据(图11)显示与SEC-HPLC数据分析后观察到的相似图片。在37℃存储3个月时，血红素结合从95％显著降低至约20-25％，这与该时间点的Hpx单体含量极为相关(表9)。此外，除了最高的P80浓度(0.1％，黑色曲线)外，没有观察到P80浓度之间的差异，与其他浓度相比，最高的P80浓度显示出较低的血红素结合活性。

在室温下储存三个月的样品显示活性与Hpx单体含量之间的相似相关性。然而，包含0.1％P80的样品与所有其他样品之间的差异在RT下不如在37℃时明显(图11B)。

总之，0.02％和低于该值的P80浓度不会损害关于分子大小分布和血红素结合活性的稳定性。还发现在PBS中配制的Hpx，无论P80浓度如何，在37℃3个月内均表现出蛋白质单体含量和血红素结合活性的显著降低。因此，PBS制剂在加速温度下不提供所需的Hpx稳定性。

4.3.稳定性研究：先导制剂

如表8(a-f)中所述，产生了用不同缓冲剂和盐浓度配制的Hpx。所有制剂均掺入P80，以达到0.002％的最终P80浓度(在PBS中除外)，并在2-8℃、RT(25℃)或37℃避光保存至少6个月。在每个时间点，取样并进行SEC-HPLC分析，以测量Hpx的单体、寡聚体和片段的量(表10)。分子大小分布结果如图12中所示。如果在2-8℃储存，则在整个研究期间(24个月)，在不同的制剂之间未观察到聚集物和片段的显著变化，并且单体Hpx(＞94％)仍稳定。类似地，在RT下储存(24个月)的制剂几乎保持不变，但除外随着时间的推移片段会略有增加，观察到这与制剂无关。在37℃储存后，每种Hpx制剂均显示出聚集物和片段的增加，而用柠檬酸磷酸盐配制的Hpx看起来是最稳定的制剂。增加氯化钠浓度(制剂A和B)进一步提高了柠檬酸磷酸盐的稳定性，在加速条件下(37℃)6个月后Hpx单体含量显示为63.3％(150mMNaCl)和68.9％(300mM NaCl)所示。

6个月后，包含磷酸钠缓冲剂的制剂的稳定性较低，并且表现出聚集物增加，至多36％(存在更高盐浓度或缓冲剂浓度增加，结果更好)。在RT和2-8℃，片段含量仍然极低，而在37℃，随着时间的推移，生成了约20％的片段。

这些数据与用DSF衍生的热稳定性数据非常相关。因此，特定制剂中Hpx的T_m可以用作较高蛋白质浓度下短期稳定性研究结果的指标。

表10.如所示储存后的SEC-HPLC数据。

表10(接续)

表10(接续)

表10(接续)

还通过SDS-PAGE分析了Hpx在这些制剂中的稳定性。从每种制剂中，在0时和3个月后取样，并对每种存储温度进行非还原SDS-PAGE或还原SDS-PAGE分析，如图13中所示。来自SDS-PAGE分析的数据与SEC-HPLC结果一致。在2-8℃的储存条件下，在还原和非还原条件下均未观察到其他谱带或谱带强度发生明显变化。储存在RT下的样品在约125kDa处显示出一条低强度带，最有可能反映了Hpx二聚体的形成，以及几个低分子量带，最显著地在30kDa和20kDa附近。这些发现与SLS在“老化和热应力”样品中确定的片段大小一致(见图3C)。在非还原的SDS-PAGE下，在37℃存储的样品显示出高于250kDa的强高分子量谱带，此时每种制剂的强度与通过SEC-HPLC检测到的聚集物充分相关。此外，观察到在RT样品中看到的低分子量带图案，但是其强度增加。

针对每种制剂在每个时间点评价了Hpx的血红素结合，作为功能参数。如图14中所示，在37℃温育后，血色素结合蛋白与血红素的结合随时间下降，并且该下降与相应的Hpx单体含量密切相关(通过SEC-HPLC测定)。

4.4.稳定性盐研究；磷酸盐浓度更低和同渗浓度减小的先导制剂

在加速条件下，包含(i)200mM柠檬酸磷酸盐和150mM或(ii)300mM氯化钠pH 7.2的制剂(蛋白质浓度为10％)表现出最大的稳定性。尽管它们的总同渗浓度(分别为876mOsm/L和1176mOsm/L)很高，但仍适用于静脉内(i.v.)施用，注意，目前有经许可的使用高同渗浓度的制剂i.v.施用(即12％免疫球蛋白冻干粉(Sandoglobulin)，892.3mOsm/L，这归因于高蔗糖浓度)。此外，这些药物产品以比目前估计的Hpx产品(即，＜20-30mL/注射)高得多的剂量(>100mL/注射)输注。DSF数据表明，同渗浓度与热稳定性之间存在直接相关性，如图4中所示。为了维持相等的热稳定性，较低的柠檬酸磷酸盐浓度可以与较高的氯化钠浓度组合，反之亦然。尽管在加速条件下(即37℃)的短期稳定性研究中，DSF产生的结果和每种制剂的相应T_m被视为可预测性的，但对于3个月稳定性研究，生产了具有较低赋形剂浓度配制的几种Hpx溶液，如表8(1-5)中所示。所有制剂均掺入P80，以达到0.01％的最终P80浓度，并在2-8℃、RT(25℃)或37℃避光保存至少6个月的时间期限。在每月时间点，从温度存储中取样并进行分析。

表11和图15中显示了每种制剂在至少6个月的时间期限的分子大小分布结果。在2-8℃，在整个研究期间(24个月)中，单体Hpx的含量(＞93％)保持稳定，并且在24个月后在RT仅存在微小差异。在37℃的加速温度下，每种Hpx制剂均显示出随着时间的推移聚集物和片段的显著增加。发现制剂之间在聚集物含量方面存在很大差异。通过上述DSF分析预测，几乎等渗的制剂促进了聚集，而高渗的制剂似乎使蛋白质稳定。

表11.在37℃储存6个月后的SEC-HPLC数据

表11(接续)

表11(接续)

还通过SDS-PAGE分析了上述Hpx制剂的每种制剂含量和储存温度。在0时和3个月后取样，分别通过还原(图16)和非还原(图17)SDS-PAGE进行分析。来自这些分析的数据与SEC-HPLC结果一致。

在2-8℃的存储条件下，无论在还原条件下还是在非还原条件下，都观察到了其他谱带的轻度变化。储存在RT下的样品在约125kDa处显示出微弱的弱条带强度增加，在50kDa附近具有较强的条带增加，在20kDa与-40kDa之间具有几种其他的低分子带。最终，在37℃储存的样品显示出明显的高分子量谱带，其强度与通过SEC-HPLC测定的聚集物含量密切相关，以及另外的低分子量谱带(已经用在RT储存的样品观察到了，尽管谱带强度较低)。

还针对每个储存温度条件在每个时间点评价了作为功能参数的Hpx的血红素结合能力。如前面用其他制剂所见，血色素结合蛋白与血红素的结合与相应的Hpx单体含量(通过SEC-HPLC测定)具有很好的相关性，并且在37℃储存期间显著降低(图18)。

4.5.短期稳定性研究-再现性

为了进一步生成用于人Hpx的先导制剂定义的数据集，如上所述，使用两种新的Hpx批次制备了所鉴定的两种最稳定制剂，以检查可再现性和任何批与批之间变异性。将样品储存在37℃并通过SEC-HPLC和血红素结合测定法进行分析。

如下表12-14中所示，在所分析的所有时间点来源于两种基于柠檬酸磷酸盐的制剂的结果相当，这证明了可靠的分析再现性以及批与批之间一致性。

表12.在pH 7.4的PBS中配制的Hpx。来源于在37℃储存三个月时间段的不同Hpx批次(TO294063、TO290102和TO294001+TO294023)的SEC-HPLC数据的平均值。N＝4。

表13.在200mM柠檬酸磷酸盐，300mM NaCl，0.002％P80，pH 7.2中配制的Hpx。来源于在37℃储存三个月时间段的不同Hpx批次(TO294063、TO290102和TO294001+TO294023)的SEC-HPLC数据的平均值。N＝3。

表14.在200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.002％P80，pH 7.2中配制的Hpx。来源于在37℃储存三个月时间段的不同Hpx批次(TO294063、TO290102和TO294001+TO294023)的SEC-HPLC数据的平均值。N＝3。

实施例5.Tris缓冲剂中的Hpx稳定性

血色素结合蛋白纯化后，将蛋白溶液浓缩并渗滤至pH 7.5的PBS中进行保存。在准备去除溶剂洗涤剂的色谱步骤时，将血色素结合蛋白渗滤到50mM Tris缓冲剂中，注意到PBS中存在盐可能会干扰用于去除溶剂洗涤剂的Capto Q强阴离子交换树脂中血色素结合蛋白的结合。选择50mM Tris，pH 7.4作为血色素结合蛋白存储缓冲剂，以免干扰该色谱步骤。

在pH 7.5的50mM Tris缓冲剂中制备了两批血色素结合蛋白TO302001和T0294131。在SEC-HPLC分析时，在这些Tris缓冲的血色素结合蛋白批次中，明显的蛋白质聚集是显而易见的。通过SEC-HPLC分析确定的PBS中几个血色素结合蛋白批次以及Tris中的两个批次的单体含量的汇总如下表15中所示。如表15中的结果所示，与PBS缓冲的Hpx批次相比，Tris缓冲的Hpx批次中的Hpx单体数量显著下降。单体含量的减少与Hpx制剂中通常不存在的多个高分子量峰的存在有关。

表15：血色素结合蛋白最终浓缩物的SEC-HPLC分析

血色素结合蛋白批号	生产日期	缓冲剂	％单体
				TO294001	3-31-15	PBS，pH 7.5	98.78
TO294023	4-4-15	PBS，pH 7.5	98.58
				TO294063	5-1-15	PBS，pH 7.5	98.46
TO290235	5-29-15	PBS，pH 7.5	98.00
				TO302001	6-18-15	50mM Tris，pH 7.5	65.15
TO294131	7-31-15	50mM Tris，pH 7.5	65.84

对于两个不同的Hpx批次，使用透析和SEC-HPLC分析进一步研究了不同缓冲剂中的血色素结合蛋白稳定性。将储存在50mM Tris中的Hpx批号TO302001样品透析到PBS中，以确定在Tris缓冲剂中存储后蛋白聚集是否可逆。将储存在PBS中的Hpx批号TO290235的样品透析到50mM Tris中，再透析到pH 7.5的20mM磷酸钠中，以确定在Tris或20mM磷酸钠缓冲剂中透析之前在PBS中透析是否会阻止Hpx聚集。将来自本研究的结果列在下面的表16中。

表16：Tris、PBS和磷酸钠缓冲剂中的血色素结合蛋白稳定性

血色素结合蛋白批号	初始储存缓冲剂	透析缓冲剂	％单体
				TO302001	50mM Tris，pH 7.5	PBS，pH 7.5	68.39
TO290235	PBS，pH 7.5	50mM Tris，pH 7.5	70.25
				TO 290235	PBS，pH 7.5	20mM磷酸钠，pH 7.5	96.92

将Tris缓冲的Hpx透析到PBS中显然没有逆转蛋白质聚集。将PBS缓冲的血色素结合蛋白透析到50mM Tris缓冲剂中展示出的蛋白质聚集类似于上述存储在Tris中的两个Hpx批次。将PBS缓冲的Hpx透析入磷酸钠展示出更高的Hpx单体含量。这些结果表明，pH 7.5的20mM磷酸钠是一种用于Capto Q树脂的溶剂洗涤剂去除的适合的低盐Hpx缓冲剂替代选择。

为了确定在Tris缓冲剂的存在下，用于Hpx纯化的固定金属亲和色谱(IMAC)柱中镍的存在是否可归因于Hpx聚集，将几种Hpx样品与不同EDTA溶液(TO303011和TO303030)一起温育。下表17提供了EDTA温育后获得的SEC-HPLC数据概括。

表17.EDTA温育后HPX批号TO302001的单体含量

缓冲剂条件	％单体
		TO302001未处理	49.93
10mM EDTA，pH 7.4	52.88
		20mM EDTA，pH 7.4	54.39
30mM EDTA，pH 7.4	55.88
		40mM EDTA，pH 7.4	57.30
50mM EDTA，pH 7.4	58.71
		100mM EDTA，pH 7.4	77.10
200mM EDTA，pH 7.4	75.69
		100mM EDTA/PBS，pH 7.4	81.71
100mM EDTA透析	81.29

结果表明，在Tris缓冲剂存在下，镍的存在对Hpx聚集几乎没有影响。

进一步检查了Tris缓冲剂中的血色素结合蛋白稳定性，以确定在Tris中进行透析之前去除镍是否导致更少的Hpx聚集。为此，在Hpx纯化过程中实施了另外的渗滤步骤，以利用pH 7.4的100mM EDTA从Hpx溶液中除去镍。在不同的处理步骤中，将来自Hpx批号TO294179的三个样品透析到pH 7.5的50mM Tris缓冲剂中。SEC-HPLC结果显示在下表18中。

表18.EDTA透析后50mM Tris中的血色素结合蛋白稳定性

血色素结合蛋白样品	％单体
		IMAC洗脱液	89.95
IMAC洗脱液-EDTA透析后	80.88
		最终浓缩物-EDTA透析后	58.92

结果表明，透析到50mM Tris缓冲剂(pH 7.5)中的所有三个样品均显示Hpx聚集，并且在EDTA透析后存在Hpx聚集增加。EDTA透析后Hpx聚集的增加看起来不归因于镍的存在，注意一旦交换到50mM Tris缓冲剂中镍的缺乏仍会导致Hpx聚集。结果表明，在某些情况下，应避免使用pH 7.5的50mM Tris缓冲剂作为存储缓冲剂，因为这可能会导致Hpx聚集。进一步的稳定性研究已经证实，Tris缓冲剂中Hpx的稳定性降低，存在高水平的NaCl时除外。在存在Tris缓冲剂的情况下，可能需要评价备用缓冲剂以使Hpx产量损失和聚集最小化。

实施例6.较高蛋白质浓度下Hpx稳定性

6.1样品制备

对于报道的制剂研发，从人血浆中纯化了Hpx(Kistler-Cohn级分IV)。纯化方法的细节在其他地方有描述[6]。在pH 7.4的PBS中提供纯化的Hpx，蛋白浓度为3-4％。通过使用10kD MW截止值滤盒(PES，50cm2，PALL Life Sciences)的

通量装置(GEHealthcare)进行超滤和渗滤，获得了用于压力诱导的稳定性研究的Hpx制剂的较高浓度(最高30％)。

6.2稳定性评价和指示性蛋白质表征的方法

6.2.1⊿G和ΔG趋势

使用HUNK(来自Unchained Laboratories的化学变性系统)测量ΔG和ΔG趋势。使用36点变性曲线在0-8M脲中对样品进行变性。为了计算ΔG，使用天然和完全变性的Hpx的固有荧光波长比拟合数据。通过在十种不同的Hpx浓度下测量ΔG来确定ΔG趋势：0.25、1、5、10、25、50、100、200、250和300.0mg/mL。对于所述趋势将结果表示ΔG或ΔΔG。

6.2.2用于表征的其他测定法

表19概括了用于进一步研究Hpx稳定性和蛋白质表征的所有另外的测定法和操作。

表19.评价血色素结合蛋白稳定性和表征的测定法

6.3高蛋白质浓度下稳定性研究

6.3.1制剂制备

在较高的Hpx蛋白质浓度下进一步研究了以下先导制剂，随后在加速储存条件(37℃)、长期储存(2-8℃)下进行分析：

·制剂1：200mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；

·制剂2：50mM柠檬酸磷酸盐，400mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；

·制剂3：15mM柠檬酸磷酸盐，150mM NaCl，0.01％P80，pH 7.2；

制剂4：PBS，0.01％P80，pH 7.4。

通过进行化学变性研究和热稳定性研究进一步表征制剂。简言之，将配制在PBS中的Hpx浓缩至30％Hpx，并且渗滤到期望的缓冲剂和赋形剂组合物中，如表20所示。如果必要，可通过谨慎滴定0.2M HCl或0.2M NaOH进行pH调节。此后，将不同的制剂用制剂缓冲剂稀释至期望的浓度。最终，将每种制剂无菌过滤，装入无菌玻璃小瓶中，并储存在不同的温度下，以便在0、1、2、3和6个月或其他时间点进行后续分析。

表20.不同的Hpx先导制剂及其组成和特征概述

6.3.2高蛋白浓度下的粘度行为

在以下蛋白质浓度下(表21)分析了制备的Hpx制剂的粘度行为。如图19所示，最高目标浓度为250g/L时，粘度保持在20mPa*s以下，这被认为是任何递送系统的允许粘度。W.Du&A.Klibanov，“Hydrophobic Salts Markedly Diminish Viscosity ofConcentrated Protein Solutions”，Biotechnology and Bioengineering，pp.632-636，2011。注意，这些作者和其他作者指出，皮下注射的阈值可能高达50mPa*s。该研究还表明，每种Hpx制剂在任何给定的目标蛋白质浓度下均表现出相似的粘度。并且正如预期的，目标蛋白浓度的增加伴随着粘度的增加。此外，由于这些制剂的蛋白质浓度高于目标水平(即100、200、250和300mg/mL)，因此与实施例1中所测量的那些相比，所得粘度相对较高(比较图3D和19)。最终，增加的同渗浓度(较高的盐浓度)不显著影响粘度。

表21.制剂(批号C108.01)的蛋白质含量和粘度(在25℃)。

6.3.3化学稳定性；使用HUNK的ΔG和ΔΔG测定

蛋白质的ΔG值小幅增加可以使蛋白质的稳定性10X提高(请参见下表22)。

表22.化学变性时ΔG的重要性

蛋白质在其最稳定的形式中典型地表现出高ΔG值，而与浓度无关(即，一条扁平线)。在Hpx浓度为0.25、1、5、10、25、50、100、200、250和300mg/mL时产生十点ΔG趋势-确定每种制剂的稳定性和聚集状态(请参见3.2.2节)。ΔG趋势结果如图20所示。

在制剂1和2中，在所有分析的浓度下，Hpx显示出的ΔG值大于6.0kCal/mol。这表明在这两种制剂中Hpx极为稳定，并且变性蛋白的含量极低；然而，制剂2中的Hpx比1中的稳定性稍低，这归因于ΔG趋势略有上升，表明存在天然状态下的聚集。

与制剂1和2相反，制剂3和4中的ΔG值低得多，表明变性的Hpx水平更高。制剂3比制剂4提供了更高的稳定性，前者与中等-高水平的后者相比仅具有中等水平的变性蛋白。另外，基于向下的ΔG趋势，制剂4中的Hpx在变性状态下表现出聚集，而制剂3的趋势不受浓度影响。这些结果也证实了通过在制剂中包括柠檬酸盐而获得的稳定性。

总之，制剂1、2和3有效地稳定了Hpx，仅存在中等至低水平的变性蛋白。相反，制剂4稳定Hpx程度最低，存在高水平的变性蛋白质，其以变性状态聚集。与制剂4相比制剂3中观察到的更大稳定性表明，柠檬酸盐促进了Hpx的稳定性。

6.3.4在高蛋白质浓度下随时间变化的分子大小分布

另外将制剂1-4在37℃和2-8℃避光保存至少6个月。在每个时间点，取样并进行SEC-HPLC分析，以监测Hpx的单体、寡聚体和片段。6个月后每种浓度的分子大小分布结果显示在下面的图21-24和表23和24中。

在37℃储存后，每种Hpx制剂均显示出聚集物和片段随时间增加。用高同渗浓度制剂配制的Hpx看起来更稳定，并且在同一时间点分析随着蛋白质的浓度增加仅观察到蛋白质聚集体的轻度增加。相反，在一段时间后，高蛋白浓度下的低赋形剂浓度会导致强烈的聚集甚至蛋白凝胶化(制剂3和4)。由于基于早期数据选择了2-8℃的储存温度，因此所有制剂也都保持在2-8℃并在6个月后进行分析。如果在2-8℃储存，则在不同制剂之间未观察到聚集物和片段的显著变化。在这些储存条件下的整个6个月研究期间，单体Hpx(＞93％)保持稳定，这是不依赖于制剂和蛋白质浓度观察到的。

表23.在37℃储存6个月后的SEC-HPLC数据

表24.在2-8℃储存6个月后的SEC-HPLC数据

6.3.5结论

化学变性测试的结果表明，制剂1中Hpx最稳定，接着是制剂2。在化学变性分析中，包含接近生理同渗浓度的柠檬酸盐的制剂3比制剂4(PBS对照)对Hpx提供了更大的稳定性。通过化学变性产生的这些数据与随时间分析通过SEC-HPLC评价的稳定性研究数据一致。

热稳定性、化学变性、寡聚化和片段化测试结果证实，15mM柠檬酸磷酸盐提高了Hpx的稳定性，与单独使用PBS相比，导致优异性能表现。重要的是，化学变性数据和SEC-HPLC数据证明，即使当将Hpx制剂在2-8℃储存超过6个月，通过将制剂1、2和3中Hpx的浓度从100g/L增加到300g/L也不会显著失去稳定性。

附录A

1.1.缓冲剂筛选I

不含NaCl

含有150mM NaCl

1.2.缓冲剂筛选II

含有150mM NaCl

1.3.缓冲剂筛选III-糖

含有150mM NaCl

1.4.缓冲剂筛选IV-NaCl浓度¹

1.5缓冲剂筛选V-离子强度I

1.6缓冲剂筛选VI-离子强度II

缓冲剂筛选VI-离子强度II(接续)

1.7缓冲剂筛选VII-氨基酸

附录B

热变性数据)T_m/T_agg)

化学变性数据(以kCal/mol计的ΔG)

序列表

<110> CSL Behring AG

<120> 血色素结合蛋白制剂

<130> 2017_CH002_A272

<160> 1

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 462

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Arg Val Leu Gly Ala Pro Val Ala Leu Gly Leu Trp Ser Leu

1 5 10 15

Cys Trp Ser Leu Ala Ile Ala Thr Pro Leu Pro Pro Thr Ser Ala His

20 25 30

Gly Asn Val Ala Glu Gly Glu Thr Lys Pro Asp Pro Asp Val Thr Glu

35 40 45

Arg Cys Ser Asp Gly Trp Ser Phe Asp Ala Thr Thr Leu Asp Asp Asn

50 55 60

Gly Thr Met Leu Phe Phe Lys Gly Glu Phe Val Trp Lys Ser His Lys

65 70 75 80

Trp Asp Arg Glu Leu Ile Ser Glu Arg Trp Lys Asn Phe Pro Ser Pro

85 90 95

Val Asp Ala Ala Phe Arg Gln Gly His Asn Ser Val Phe Leu Ile Lys

100 105 110

Gly Asp Lys Val Trp Val Tyr Pro Pro Glu Lys Lys Glu Lys Gly Tyr

115 120 125

Pro Lys Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Gly Ile Pro Ser Pro Leu Asp

130 135 140

Ala Ala Val Glu Cys His Arg Gly Glu Cys Gln Ala Glu Gly Val Leu

145 150 155 160

Phe Phe Gln Gly Asp Arg Glu Trp Phe Trp Asp Leu Ala Thr Gly Thr

165 170 175

Met Lys Glu Arg Ser Trp Pro Ala Val Gly Asn Cys Ser Ser Ala Leu

180 185 190

Arg Trp Leu Gly Arg Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Asn Gln Phe Leu Arg

195 200 205

Phe Asp Pro Val Arg Gly Glu Val Pro Pro Arg Tyr Pro Arg Asp Val

210 215 220

Arg Asp Tyr Phe Met Pro Cys Pro Gly Arg Gly His Gly His Arg Asn

225 230 235 240

Gly Thr Gly His Gly Asn Ser Thr His His Gly Pro Glu Tyr Met Arg

245 250 255

Cys Ser Pro His Leu Val Leu Ser Ala Leu Thr Ser Asp Asn His Gly

260 265 270

Ala Thr Tyr Ala Phe Ser Gly Thr His Tyr Trp Arg Leu Asp Thr Ser

275 280 285

Arg Asp Gly Trp His Ser Trp Pro Ile Ala His Gln Trp Pro Gln Gly

290 295 300

Pro Ser Ala Val Asp Ala Ala Phe Ser Trp Glu Glu Lys Leu Tyr Leu

305 310 315 320

Val Gln Gly Thr Gln Val Tyr Val Phe Leu Thr Lys Gly Gly Tyr Thr

325 330 335

Leu Val Ser Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Glu Lys Glu Val Gly Thr Pro

340 345 350

His Gly Ile Ile Leu Asp Ser Val Asp Ala Ala Phe Ile Cys Pro Gly

355 360 365

Ser Ser Arg Leu His Ile Met Ala Gly Arg Arg Leu Trp Trp Leu Asp

370 375 380

Leu Lys Ser Gly Ala Gln Ala Thr Trp Thr Glu Leu Pro Trp Pro His

385 390 395 400

Glu Lys Val Asp Gly Ala Leu Cys Met Glu Lys Ser Leu Gly Pro Asn

405 410 415

Ser Cys Ser Ala Asn Gly Pro Gly Leu Tyr Leu Ile His Gly Pro Asn

420 425 430

Leu Tyr Cys Tyr Ser Asp Val Glu Lys Leu Asn Ala Ala Lys Ala Leu

435 440 445

Pro Gln Pro Gln Asn Val Thr Ser Leu Leu Gly Cys Thr His

450 455 460

Claims (43)

1.纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂，它包含：

(a)至少50mg/mL的血色素结合蛋白含量；

(b)至少15mM磷酸盐缓冲剂；

(c)5.8至8的pH；以及

(d)至少50mM氯化钠。

2.权利要求1的稳定液体制剂，它包含75mg/mL至300mg/mL血色素结合蛋白。

3.权利要求2的稳定液体制剂，它包含100mg/mL至200mg/mL血色素结合蛋白。

4.权利要求2的稳定液体制剂，它包含200mg/mL至300mg/mL血色素结合蛋白。

5.权利要求2的稳定液体制剂，它包含200mg/mL血色素结合蛋白。

6.权利要求2的稳定液体制剂，它包含250mg/mL血色素结合蛋白。

7.权利要求2的稳定液体制剂，它包含300mg/mL血色素结合蛋白。

8.权利要求1-7任一项的稳定液体制剂，它包含至少150mM氯化钠。

9.权利要求1-8任一项的稳定液体制剂，其中所述磷酸盐缓冲剂选自磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸磷酸盐。

10.权利要求9的稳定液体制剂，其中所述磷酸盐缓冲剂为柠檬酸磷酸盐。

11.权利要求10的稳定液体制剂，它包含15mM至200mM柠檬酸磷酸盐和150mM至400mM氯化钠。

12.权利要求11的稳定液体制剂，它包含15mM至200mM柠檬酸磷酸盐和150mM至250mM氯化钠。

13.权利要求11的稳定液体制剂，它包含200mM柠檬酸磷酸盐和150mM氯化钠。

14.权利要求11的稳定液体制剂，它包含50mM柠檬酸磷酸盐和400mM氯化钠。

15.权利要求11的稳定液体制剂，它包含15mM柠檬酸磷酸盐和150mM氯化钠。

16.权利要求9的稳定液体制剂，其中所述磷酸盐缓冲剂为磷酸钠。

17.权利要求16的稳定液体制剂，它包含50mM至200mM磷酸钠和50mM至400mM氯化钠。

18.权利要求17的稳定液体制剂，它包含50mM至200mM磷酸钠和150mM至250mM氯化钠。

19.权利要求18的稳定液体制剂，它包含200mM磷酸钠和150mM氯化钠。

20.权利要求1-19任一项的稳定液体制剂，其中pH为7.0至7.6。

21.权利要求20的稳定液体制剂，其中pH为7.2。

22.权利要求1-21任一项的稳定液体制剂，它还包含非离子型洗涤剂。

23.权利要求22的稳定液体制剂，其中所述非离子型洗涤剂为聚山梨酯80。

24.权利要求22或权利要求23的稳定液体制剂，其中所述非离子型洗涤剂的含量为至少0.0005％v/v。

25.权利要求24的稳定液体制剂，其中所述非离子型洗涤剂的含量低于0.01％v/v。

26.权利要求1-25任一项的稳定液体制剂，它包含在25℃测定时低于20mPa*S的粘度。

27.权利要求1-26任一项的稳定液体制剂，其中通过用免疫比浊法测定血色素结合蛋白含量和用Bradford方法或在280nm的UV光谱法测定总蛋白质含量进行测定，纯化的血色素结合蛋白占总蛋白重量的至少95％或至少97％或至少98％或至少99％或至少99.5％。

28.权利要求1-27任一项的稳定液体制剂，其中纯化的血色素结合蛋白来源于人血浆或选自重组血色素结合蛋白、血色素结合蛋白变体或包含血色素结合蛋白或其血红素结合片段的融合蛋白。

29.权利要求28的稳定液体制剂，其中纯化的血色素结合蛋白从来源于至少500kg人血浆的血浆级分中回收。

30.权利要求1-29任一项的稳定液体制剂，它在37℃储存1个月时包含至少70％血色素结合蛋白单体。

31.权利要求1-29任一项的稳定液体制剂，它在37℃储存2个月时包含至少50％血色素结合蛋白单体。

32.权利要求1-29任一项的稳定液体制剂，它在37℃储存3个月时包含至少50％血色素结合蛋白单体。

33.权利要求30的稳定液体制剂，它在37℃储存1个月时包含至少80％血色素结合蛋白单体。

34.权利要求31的稳定液体制剂，它在37℃储存2个月时包含至少70％血色素结合蛋白单体。

35.权利要求32的稳定液体制剂，它在37℃储存3个月时包含至少60％血色素结合蛋白单体。

36.治疗与溶血相关的病症的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用权利要求1-35任一项的稳定液体制剂。

37.权利要求36的方法，其中与溶血相关的病症选自急性溶血病和/或慢性溶血病。

38.权利要求36的方法，其中所述病症选自溶血性贫血，再生障碍性危象，过度溶血性危象，输血引起的溶血，溶血性尿毒综合征，心肌梗塞，急性胸腔综合征，肺动脉高压，腿溃疡，生长迟缓，骨梗塞，先兆子痫，肾衰竭，急性肾损伤，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，中风包括出血性中风，颅内出血(ICH)，脾隔离症，脾梗塞，自身免疫性疾病包括自身免疫性溶血性贫血，微生物感染或对感染的易感性增加，疟疾感染，创伤，移植相关病症，使用心肺旁路的开放心脏手术和烧伤，包括在烧伤后伴有溶血的血红蛋白血症或血红蛋白尿的治疗中。

39.权利要求36的方法，其中所述病症选自镰状细胞性贫血，遗传性球细胞增多症，遗传性脂细胞增多症，地中海贫血，先天性血小板减少性贫血和阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，系统性红斑狼疮和慢性淋巴细胞性白血病。

40.权利要求36的方法，其中所述病症选自出血性中风和颅内出血(ICH)。

41.权利要求36的方法，其中所述病症为ARDS。

42.权利要求36-41任一项的方法，其中所述稳定的液体制剂通过静脉内施用。

43.权利要求36-41任一项的方法，其中所述稳定的液体制剂通过皮下施用。

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