CZ350098A3

CZ350098A3 - Způsob léčení neoplasie

Info

Publication number: CZ350098A3
Application number: CZ983500A
Authority: CZ
Inventors: Michael R. Jirousek; Louis Vignati; Douglas Kirk Ways; Lloyd P. Aiello; George L. King
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 1999-11-17
Also published as: WO1997040830A1; AU736333B2; EP0915698A1; EA199800969A1; NO985066L; NZ332645A; CA2253608A1; BR9710706A; EA001779B1; CN1233177A; IL126837A0; AU2935597A; NO985066D0; KR20000065171A; US6284751B1; PL329851A1; JP2002504086A; EP0915698A4

Description

Léčba onemocnění souvisejících s VEGF

Oblast techniky „ Předkládaný vynález je obecně zaměřen na způsob pro inhibici růstu endotelových buněk a kapilární permeability, které jsou u asociovány s vaskulárním endotelovým růstovým faktorem (VEGF), například zvýšeného růstu buněk a permeability indukované VEGF, za použití inhibitoru β izoenzymu proteinkinazy C (PKC). Tyto stavy indukované VEGF jsou těsně spojeny s nádory u savců a s dalšími chorobami včetně plicního edemu. Předkládaný vynález je zejména zaměřen na použití inhibitoru β izoenzymu protein kinasy C (PKC) pro léčbu nádorových onemocnění zahrnujících kapilární hemangioblastomy, karcinom prsu, Kaposiho sarkom, glioblastom, angiomatosní choroby, kolorektální karcinom, meduloblastom, karcinom žaludku, adenokarcinomy gastrointestinálního traktu, maligní melanom, karcinom vaječníků, nemalobuněčný karcinom plic, maligní výpotky, perinádorového edemu, například otok mozku a cysty spojené s tumory mozku, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře, Von Hippel - Lindauův syndrom, karcinom ledvin, karcinom kůže, malignity štítné žlázy, karcinom čípku děložního, hepatocelulární m. karcinom, rhabdomyosarkom a leiomyosarkom a některé další onemocnění související s VEGF, jak jsou zde popsány. <-

Dosavadní stav techniky VPF/VEGF je glykosylovaný, multifunkční cytokin. Nadměrná exprese VPF/VEGF je spojena s nádorovými onemocněními a s několika dalšími chorobnými stavy. 2 2 • · · · · * • · ♦ • · • · ·· ·· • · ·· · « « · • I · · · · • · « ·«· · · • · · · · «·· ··· ·· »· VPF/VEGF indukuje proliferaci endotelových buněk, nadměrnou permeabilitu prostřednictvím aktivace vesikulo-vakuolárními organelami zprostředkovaného transportu, migrace a reorganizace aktinu, která je spojena se změnou tvaru a zvlněním membrány. Mění genovou expresi v endotelových buňkách, včetně zvýšené produkce tkáňového faktoru a několika proteas, včetně intersticiální kolagenasy a urokinase podobného a tkáňového plasminogenového aktivátoru. Většina z těchto stejných genů je indukována forbolmyristatacetatem (PMA) stimulovanou aktivací PKC. VPF/VEGF je nadměrně exprivován a secernován ve většině z doposud vyšetřovaných lidských a zvířecích nádorů. VPF/VEGF může přímo ovlivňovat nádorové buňky, například nádorové buňky glioblastomu, stejně jako může mít významnou úlohu v indukci nádorové angiogenese (Claffey et al., Cancer Research 56" 172 -181 (1996) a odkazy zde citované).

Angiogenní potenciál VEGF je pravděpodobně zvýšen synergistickou aktivitou fibroblastového růstového faktoru uvolňovaného při porušení buněk nebo při smrti buněk (Pepper et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824 - 831 (1992); Muthukrishnan et al., J. Cell. Physiol., 148: 1-16 (1991)). Nádorový růst a metastasování těsně souvisejí se zvýšenou expresí VEGF. Chemický signál z nádorových buněk může způsobit přechod klidových endotelových buněk do fáze rychlého růstu. Z dvanácti známých angiogenních proteinů jsou nej častěji nacházeny v nádorech bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF) a vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF), který je také známý jako vaskulární permeabilitní faktor (VPF) (Folkman, J. New 3 • · • · 3 • · • ·

··· · ·· • · · · • · Μ # ··· · · • · * * * · ·

England J. of Medicine, svazek 999 (26): 1757 - 1763 (1995) a odkazy zde uvedené).

Skutečnost, že růst nádoru vyžaduje nové cévy a identifikace chemických faktorů, které zprostředkují neovaskularizaci nebo angiogenesi rozšířily poznání patologických procesů a otevřely nové příležitosti pro léčbu takových onemocnění. V současné době je devět různých inhibitorů angiogenese studováno ve fázích 1 nebo 2 klinických studií jako terapie pro široké spektrum solidních nádorů, včetně karcinomu prsu, tlustého střeva, plic a prostaty, stejně jako Kaposiho sarkomu. (Folkman, J. Tumor Angiogenesis v Mendelsohn J. Howley PM, Israel MA. Liotta LA., Vydavatelé, The Molecular Basis of Cancer, Philadelphia; W.B. Saunders, 1995: 206 - 232). Jeden z těchto léků, TNP-170, synjtetický analog fumagilinu (Denekamp, J., Br. J. Radiol. 66: 181 - 196, 1993) byl schválen FDA pro fázi 1 testování u mnoha pacientů se solidními nádory. Jiné inhibitory angiogenese, které jsou v současné době testovány v klinických pokusech na pacientech s pokročilým karcinomem, zahrnují destičkový faktor 4; karboxyaminotriazol; BB-94 a BB-2516; inhibitory metaloproteinas; sulfatovaný polysacharid tecogalan (DS-152); Thalidomid; interleukin-12; a linomid (Flier et al., The New England Journal of Medicine, svazek 333, str. 1757 - 1763, 1995 a odkazy zde citované).

Inhibitory PKC byly také navrženy pro protinádorovou terapii, viz U.S. 5552396. Nicméně, účinnost inhibitorů β izoenzymu PKC proti jednotlivým nádorovým onemocněním nebyla známa. Na základě znalosti role, kterou má VEGF při vývoji různých nádorových a jiných onemocnění existuje v oboru potřeba identifikace dalších léčiv, které jsou specificky zaměřeny na ovlivnění funkce VEGF. 4 • · · · · · 4 • · · · · · * # « « • · « ♦ · · ·· • · « · « * ··· · · • · « t · · · ···· · ··· ·»· «« «· PQds.tata .vynálezu Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro léčbu nádorových onemocnění.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro léčbu revmatoidní artritidy.

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro léčbu keloidu.

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro léčbu stavů spojených s plicním edemem, jako je syndrom respirační tísně dospělých (ARDS).

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu pro léčbu syndromu karpálního tunelu.

Tyto a další předměty předkládaného vynálezu jsou poskytnuty jedním nebo více provedeními popsanými dále. V jednom provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu nádorových onemocnění, který obsahuje podání terapeuticky účinného množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C uvedeným savcům. V jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu revmatoidní artritidy, ve kterém je uvedeným savcům podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C. *····· · « ·« ·· • · · ♦· ·· « · · f * · · · · ( Μ • · · · ««····« • · · * · · · ···· · ··« ··· «· ·ft 5 V ještě jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu keloidu, ve kterém je uvedeným savcům podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C. V ještě jiném provedení vynálezu je poskytnut způsob pro léčbu plicního edemu, ve kterém je uvedeným savcům podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C. Předkládaný vynález poskytuje znalosti a identitu sloučenin, které jsou profylaktické a účinné v léčbě nádorových onemocnění a jiných onemocnění, která jsou spojena s vaskulárním endotelovým růstovým faktorem (VEGF).

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S)-3,4-(Ν,Ν1-1,1'-((2'1-ethoxy)-3'11(0)-41’(N,N-dimethylamino) butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 2 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC, (S) -3,4- (Ν,Ν1 -l, 1' - ((2" -ethoxy) -3 ' ' ' (0) -4 ' ' ' - (N,N-dimethylamino) butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionu na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Obrázek 3 ukazuje vliv inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF exprivovaného při kultivaci pericytů sítnice za hypoxických podmínek.

Obrázek 4 dále ilustruje inhibiční účinek inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským

6 Φ

• · · · • · · · VEGF.

Objevem předkládaného vynálezu je, že terapeutické použití určité třídy inhibitorů proteinkinasy C, t.j. inhibitorů β-izoenzymu proteinkinasy C, a zejména inhibitorů PKC selektivních pro β-izoenzym, působí proti účinkům VEGF.

Konkrétně, objevem předkládaného vynálezu je, že použití této určité třídy inhibitorů proteinkinasy C působí proti růstu endotelových buněk a permeabilitě kapilár, zejména proti růstu endotelových buněk a proti kapilární permeabilitě stimulované růstovým faktorem VEGF. V důsledku toho mohou být takové sloučeniny použity terapeuticky pro léčbu onemocnění spojených s VEGF, jako jsou nádorová onemocnění a další onemocnění, která jsou spojena s VEGF.

Způsob podle předkládaného vynálezu výhodně využívá ty inhibitory proteinkinasy C, které účinně inhibují β-izoenzym. Jedna vhodná skupina sloučenin je v oboru obecně popsána jako bis-indolylmaleimidy nebo makrocyklické bis-indolylmaleimidy. Bis-indolylmaleimidy, které jsou v oboru dobře známé, zahrnují ty sloučeniny, které jsou popsané v U.S. patentech 5621098, 5552396, 5545636, 5481003, 5491242 a 5057614, které jsou zde všechny uvedeny jako odkaz. Makrocyklické bis-indolylmaleimidy jsou konkrétně representovány sloučeninami podle vzorce I. Tyto sloučeniny, a způsoby pro jejich přípravu, byly popsány v U.S. patentu 5552396, který je zde uveden jako odkaz. Tyto sloučeniny jsou podávány v terapeuticky účinném množství savcům pro inhibici růstu endotelových buněk nebo kapilární permeability spojené s VEGF a pro inhibici účinků VEGF spojených s nádory a jinými chorobnými stavy, jako je například revmatoidní artritida, keloid, syndrom karpálního tunelu a plicní 7 • · · · · · « · t · • · · * « · · edem. Tyto sloučeniny mohou být také podány pacientům s rizikem vzniku onemocnění popsaných výše jako profylaxe.

Jedna výhodná třída sloučenin pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu má vzorec: ©

N N

kde: W je -0-, -S-, -S0-, -S02-, -CO-, C2-C6 alkylen, substituovaný alkylen, C2-Ce alkenylen, -aryl-, -aryl(CH2)toO-, -heterocyklus-(CH2)mO-, -fušovaný, bicyklický-, -fušovaný bicyklický-(CH2)mO-, -NR3-, -NOR3-, -CONH-, nebo -NHCO-; X a Y jsou nezávisle C -C4 alkylen, substituovaný alkylen nebo tvoří X, Y a W dohromady -(CH2)n-AA-; R1 jsou vodíky nebo více než čtyři volitelné substituenty nezávisle vybrané z halogenu, C -C4 alkyl, hydroxy, C -C alkoxy, haloalkyl, nitro, NR4RS, nebo NHCOÍC^-C^ alkyl); R2 je vodík, CH3C0-, NH2 nebo hydroxy; R3 je vodík, CH2)maryl, C^-C^ alkyl, -C00(C1-C4 alkyl), 8 • «· ·· • · ♦ 9 · ♦ «·· · « 9 · · 9 9 · · -COONR4Rs, -(0=ΝΗ)ΝΗ2> -SO(C^-C^alkyl), -S02(NR4R5) nebo -S02(CX-C4 alkyl); R4 a R5 jsou nezávisle vodík, Cx-C4 alkyl, fenyl, benzyl, nebo jsou kombinovány na dusíku, na který jsou navázány za vzniku nasyceného nebo nenasyceného 5 nebo 6 členého kruhu; AA je aminokyselinový zbytek; m je nezávisle 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5, nebo její farmaceuticky přijatelné sole, proléčiva nebo estery. Výhodnější třída sloučenin pro použití v předkládaném vynálezu je představována vzorcem I, ve kterém skupiny -X-W-Y-obsahují 4 až 8 atomů, které mohou být substituované nebo nesubstituované. Nejvýhodněji obsahují skupiny -X-W-Y- 6 atomů.

Jinými výhodnými sloučeninami pro použití v předkládaném vynálezu jsou ty sloučeniny podle vzorce I, ve kterých jsou R1 a R2 vodíky; a W je substituovaný alkylen, -0-, S-, -C0NH-, -NHCO- nebo -NR3-. Zejména výhodné sloučeniny pro použití v předkládaném vynálezu jsou sloučeniny podle vzorce Ia: 9 « · ♦ ·· Η

<fe) kde Z je -(CHJ^- nebo - (CHa)p-0- (<3Ja)jp-; R4 je hydroxy, -SH, C^-C^ alkyl, (CHa)m aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3) , -NH(CF3) nebo -NRSR6; R5 je vodík nebo C^-C^ alkyl; Rs je vodík, C^-C alkyl nebo benzyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce Ia jsou ty, kde Z je CH2; a R4 je -NH2, -NH(CF3) nebo -N(CH3)2, nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, proléčiva nebo estery.

Jinými vhodnými sloučeninami pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých je W ve vzorci I -Ο-, Y je substituovaný alkylen a X je alkylen. Tyto výhodné sloučeniny jsou representovány vzorcem Ib: 10 ·* ·*·· Η • ♦ • ·· · > ·

(Ib) kde Z je - (CH ) R4 je -N(CH ) (CF ), -NH(CF ) nebo -NR5Re; Rs a R6 jsou nezávisle H nebo C^-C^ alkyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, proléčiva nebo estery. Nejvýhodnější sloučeniny podle vzorce Ib jsou ty, kde p je 1; a Rs a Rs jsou methyl.

Jelikož obsahují bazickou skupinou, mohou sloučeniny podle vzorců I, Ia a Ib také existovat jako farmaceuticky přijatelné adiční sole s kyselinou. Kyseliny běžně používané pro tvorbu takových solí zahrnují anorganické kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová a fosforečná, stejně jako organické kyseliny jako je kyselina para-toluensulfonová, methansulfonová, ščavelová, para-bromfenylsulfonová, uhličitá, jantarová, citrónová, benzoová, octová a příbuzné anorganické a organické kyseliny. Takové farmaceuticky přijatelné sole zahrnují sulfát, pyrosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, fosfát, mono-hydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, chlorid, bromid, jodid, octan, propionat, dekanoat, kaprylat, 11 • · · · · · • · ···· akrylat, formát, isobutyrat, heptanoat, propiolat, oxalat, malonat, sukcinat, suberat, sebaceat, fumarat, malat, 2-butyn-l,4-dioat, 3-hexyne-2,5-dioat, benzoat, chlorobenzoat, hydroxybenzoat, methoxybenzoat, ftalat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, citrát, laktat, hippurat, β-hydroxybutýrat, glykolat, malat, vinan, methansulfonat, propansulfonat, naftalen-l-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandlan a podobně. Jsou používány zejména hydrochloridové a mesylatové sole.

Kromě farmaceuticky přijatelných solí mohou také existovat jiné sole. Tyto sole mohou sloužit jako meziprodukty při přečištění sloučenin, při přípravě jiných solí nebo při identifikaci a charakterizaci sloučenin nebo meziproduktů.

Farmaceuticky přijatelné sole sloučenin podle vzorců I, Ia a Ib mohou také existovat jako různé solvaty, jako jsou solvaty s vodou, methanolem, ethanolem, dimethylformamidem, ethylacetatem a podobně. Mohou být také připraveny směsi takových solvatů. Zdroj takového solvatu může být rozpouštědlo pro krystalizaci, vlastní rozpouštědlo pro přípravu nebo krystalizaci nebo přídantné k takovému rozpouštědlu.

Je známo, že mohou existovat různé stereoizomerické formy sloučenin podle vzorce I, Ia a Ib; například, W může obsahovat chirální atom uhlíku v substituované alkylenové skupině. Sloučeniny jsou normálně připraveny jako racemické směsi a mohou být běžně jako takové použity. Alternativně mohou být izolovány oba jednotlivé enantiomery, nebo mohou být syntetizovány běžnými technikami, pokud je to žádoucí. Takové racemické směsi a jednotlivé enantiomery a jejich směsi tvoří 12 • # ♦ · 12 • # ♦ · • · • · « Ι«· část sloučenin použitých ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu také zahrnují farmaceuticky přijatelná proléčiva sloučenin podle vzorce I, Ia a Ib. Proléčivo je léčivo, které bylo chemicky modifikováno a může být biologicky inaktivní v místě svého účinku, ale které může být degradováno nebo modifikováno jedním nebo více enzymatickými nebo jinými in vivo procesy na původní bioaktivní formu. Toto proléčivo bude pravděpodobně mít jiný farmakokinetický profil než původní léčivo, který bude umožňovat lepší absorpci přes slizniční epitel, lepší tvorbu solí a rozpustnost a/nebo zlepšenou systémovou stabilitu (například prodloužený plasmatický poločas). Typicky zahrnují takové chemické modifikace následující: 1) esterové nebo amidové deriváty, které mohou být štěpeny esterasami nebo lipasami; 2) peptidy, které mohou být rozpoznávány specifickými nebo nespecifickými proteasami; nebo 3) deriváty, které jsou akumulovány v místě účinku prostřednictvím membránové selekce proléčiva nebo modifikovaného proléčiva; nebo jakoukoliv kombinaci 1 až 3, výše. Běžné postupy pro výběr a přípravu vhodných derivátů působících jako proléčiva jsou popsány, například, v H. Bundgaard, Design of Prodrugs (1985) .

Syntesa různých bis-indol-N-maleimidových derivátů je popsána v Davis et al., U.S. patent 5057614 a syntesy výhodných 13 ·· ··«♦ « · 13 ·· ··«♦ « · • · ♦ · » · Ψ » I « ··· · • · ·· < sloučenin vhodných pro použití v předkládaném vynálezu jsou popsány v dříve uvedeném U.S. patentu 5552396 a v Faul et al., EP přihláška 0657411 Al, které jsou zde uvedeny jako odkaz.

Jedním zejména výhodným inhibitorem proteinkinasy β podle předkládaného vynálezu je sloučenina popsaná v příkladu 5g ((S)-3,4-(N, N'-1,1'-((2''-ethoxy)-31’'(0)-4> *’ - (N, N-dimethylamino)- butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2, 5-dion hydrochloridová sůl) podle výše uvedeného U.S. patentu 5552396. Tato sloučenina je silným inhibitorem proteinkinasy C. Je selektivní pro proteinkinasu C vzhledem k ostatním kinasam a je vysoce selektivní pro izoenzym, t.j. je selektivní pro beta-1 a beta-2 izoenzymy. Také sole této sloučeniny mohou být výhodně použity, zejména mesylatové sole.

Výhodná mesylatová sůl může být připravena reakcí sloučeniny podle vzorce II

s methansulfonovou kyselinou v nereaktivním organickém rozpouštědle, výhodně ve směsi organické rozpouštědlo/voda, a Μ ♦· 14 Μ ♦· 14 ♦ »·« ··· ♦ ·* *#t ♦ · « t ♦ Μ ·· nejlépe ve směsi voda-aceton. Jiná rozpouštědla jako je methanol, aceton, ethylacetat a jejich směsi mohou být také použita. Poměr rozpouštědla ku vodě není zásadní a obecně je určen rozpustností reagens. Výhodné poměry rozpouštědla k vodě jsou obecně od 0,1:1 do 100:1 podle objemu. Výhodně je poměr 1:1 až 20:1 a nejlépe je 5:1 až 10:1. Optimální poměr závisí na vybraném rozpouštědle a výhodně je to 9 dílů acetonu ku 1 dílu vody.

Reakce obvykle vyžaduje přibližně ekvimolární množství dvou reagens, ačkoliv jiné poměry, zejména takové, kde je převaha kyseliny methansulfonové, mohou být také použity. Rychlost přidání kyseliny methansulfonové není zásadní pro reakci a kyselina může být přidána rychle (za méně než 5 minut) nebo pomalu v průběhu 6 nebo více hodin. Reakce je prováděna při teplotách v rozsahu od 0 °C do refluxu. Reakční směs je míšena do té doby, dokud není tvorba soli dokončena, jak je určeno rentgenovou difrakcí v prášku, což může trvat od 5 minut do 12 hodin.

Sole podle předkládaného vynálezu jsou výhodně a snadno připraveny jako krystalická forma. Trihydratové formy solí mohou být snadno přeměněny na monohydraty sušením nebo expozicí 20 - 60% relativní vlhkosti. Sůl je významně krystalická, když vykazuje definovanou teplotu tání, dvoj lom a charakter rentgenové difrakce. Obecně krystaly obsahují méně než 10% amorfní pevné látky, lépe méně než 5% a nejlépe méně než 1% amorfní pevné látky.

Mesylatová sůl je izolována filtrací nebo jinými technikami separace, které jsou známy v oboru přímo z reakční směsi za zisku v rozmezí od 50% do 100%. Rekrystalizace a jiné techniky 15 15

• · · · I « ·· ·· ·« · · · ι · ♦ • · « · · · • · · · · · · ♦ • · · · · ··· ··· ·· *· přečištění v oboru známé mohou být použity k dalšímu přečištění solí, pokud je to žádoucí.

Endotelové buňky v tkáňové kultuře stimulované růstovými faktory jako je VEGF vykazují vyšší rychlost růstu než je základní rychlost růstu buněk. Pokusy provedené v předkládaném vynálezu ukázaly, že při podání in vitro, v koncentraci od přibližně 0,1 do 100 nM, způsobuje inhibitor proteinkinasy C, (S)-3,4-(N,Ν'-1,1'-((2'*-ethoxy)-3’''(O)-4'''-(N, N-dimethylamino)- butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou, signifikantní inhibici růstovým faktorem (jako například VEGF) stimulovaného non-bazálního růstu buněk. Důležité je, že další testování prokázalo, že normální endotelové buňky kultivované ve tkáňové kultuře nejsou inhibovány touto sloučeninou, jak bylo prokázáno chyběním inhibice růstu endotelových buněk bez stimulace VEGF v normooxickém kondicionovaném mediu. V hypoxickém kondicionovaném mediu se rychlost růstu zvyšuje díky zvýšení obsahu endogenního růstového faktoru, VEGF, který je produkován hypoxickými buňkami. Opět, inhibitor proteinkinasy C, (S)-3, 4- (N,N' -1,1'-((2''-ethoxy)-31''(0)-4'''-(N, N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionová sůl s kyselinou, normalizuje růst buněk indukovaný takovými hypoxickými podmínkami.

Pokusy provedené v předkládaném vynálezu demonstrují, že permeabilita kapilár je také ovlivněna růstovými faktory jako je VEGF. Testování ukázalo, že ve zvířecím modelu VEGF významně zvyšuje permeabilitu kapilár až na trojnásobek. Toto zvýšení permeability kapilár závislé na VEGF je také závislé na dávce. 16 16 • · · · ♦ « • » · · • · • · · • · ···» * ♦ « ·· ·· • * · · · • « « Μ • · * · · · · « · · · ·· ·· ··

Podle in vivo testování na zvířatech, podání inhibitoru proteinkinasy C v koncentraci okolo 25 mg/kg/den před expozicí VEGF významně inhibuje permeabilitu kapilár indukovanou VEGF. Konkréktě se předpokládá použití koncentrací od l nM do 5 mM, a zejména od 1 nM do 500 nM. Inhibice může být více než 80% a obecně je specifická pro permeabilitu kapilár indukovanou růstovým faktorem. Kapilární permeabilita může být měřena flurescenční angiografií.

Inhibitory β-izoenzymu PKC popsané v předkládaném vynálezu mohou být použity pro léčbu onemocnění spojených s růstem endotelových buněk a s permeabilitou kapilár, zejména pro léčbu nádorových onemocnění a pro léčbu dalších onemocnění souvisejících s VEGF.

Plicní edem je také možné léčit za použití sloučenin podle předkládaného vynálezu. Plicní edem je charakterizován zvýšením kapaliny v intersticiu plic, což je způsobeno zvýšením kapilární permeability. Plicní edem může být spojen se závažnými stavy jako je syndrom respirační tísně u dospělých (ARDS). Je pravděpodobné, že primárně je spojen s porušením alveolární-kapilární membrány, což může indukovat hypoxii a následné zvýšení obsahu VEGF. Takové narušení může také aktivovat PKC β. Proto, sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou interferovat se stimulací kapilární permeability růstovými faktory a/nebo PKCB a mohou zmírnit stavy vedoucí k plicnímu edemu. PKC inhibitory podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro léčbu nádorových onemocnění a jiných onemocnění souvisejících s VEGF u savců. Signální dráha VEGF má přímé účinky na nádorové buňky, stejně tak jako zprostředkuje angiogenní 17

17 Μ II • · I • M • Μ · · • · · ·· M

Ml ·· ··*· • · * ♦ t • · • · ···« · aktivity u mnoha nádorových i nenádorových onemocnění. Exprese VEGF byla prokázána u mnoha lidských nádorů, jako jsou kapilární hemangioblastomy, karcinom prsu, Kaposiho sarkom, glioblastom, angiomatosní choroby, kolorektální karcinom, meduloblastom, karcinom žaludku, adenokarcinomy gastrointestinálního traktu, maligní melanom, karcinom vaječníků, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře, Von Hippel - Lindauův syndrom, karcinom ledvin, karcinom kůže, malignity štítné žlázy, karcinom čípku děložního, hepatocelulární karcinom, rhabdomyosarkom a leiomyosarkom. Špatná prognosa nádoru je často spojena se stupněm vaskularizace nádoru, který je spojen s expresí VEGF. Bez cévního zásobení je nádor omezen. Proto může použití antiangiogenních činidel nebo anti-VEGF činidel zabránit dalšímu růstu a může indukovat regresi nádorů prostřednictvím omezení cévního zásobení. Anti-VEGF činidla mohou mít také přímý účinek na nádorové buňky, například, VEGF přímo působí na buňky maligního melanomu.

Exprese VEGF je kontrolována různými mechanismy. Produkce VEGF může být pozitivně ovlivňována hypoxií, určitými onkogeny a různými cytokiny včetně transformujícího růstového faktoru - beta (TGF-β), destičkového faktoru.

Ve výhodném provedení může být PKC-β inhibitor použit v anti-VEGF terapii pro léčbu lidí s nádorovým onemocněním. Jakékoliv nádory, které exprivují VEGF, například nádory uvedené výše, mohou být ovlivněny PKC-β inhibitory podle předkládaného vynálezu. Anti-VEGF terapie je zejména výhodná pro léčbu lidí s neresekovatelnými primárními nádory, primárními nádory, které 18 18 ·· *· • · · » • · ·· • * * · * « « Μ ·· • ·

• · » « · ·· ·· ·§Μ • · * • · « · ···· · jsou nekompletně odstraněny chirurgicky nebo radioterapií, primárními nádory, které byly odpovídajícím způsobem léčeny, ale u kterých existuje vysoké riziko rozvoje vzdálených metastas a pro léčbu pacientů se vzdálenými metastasami. Skupina nádorů majících horší prognosu způsobenou vysokým stupněm vaskularizace, jako je například karcinom prsu, karcinom prostaty, kolorektální karcinom, melanom, nemalobuněčný karcinom plic a karcinomy hlavy a krku, jsou zejména vhodnými kandidáty pro anti-VEGF terapii nebo pro léčbu PKCS inhibitory podle předkládaného vynálezu.

Hemangiom v dětském věku se vyskytuje u 10 - 12% dětí bílé rasy. Obyčejně není život ohrožujícím onemocněním, ale v některých případech může způsobovat významnou morbiditu a mortalitu, buď z důvodů velikosti, nebo z důvodů anatomické lokalizace. Předpokládá se působení VEGF při růstu těchto nádorů. V současné době je pro regresi tohoto nádoru využíván interferon 0!-2a. Vzhledem k angiogennímu charakteru tohoto nádoru by měla být anti-VEGF terapie za použití inhibitoru PKCS účinná stejně jako interferon oí-2a, nebo by mohla být použita jako záchranná terapie po selhání interferonu o;-2a.

Inhibitory PKCE a anti-VEGF terapie může být také použita pro léčbu nádorového ascitu, maligních pleurálních výpotků a perinádorového otoku. Vzhledem ke zvýšení VEGF v kapalině ascitu u žen se syndromem ovariální hyperstimulace po indukci ovulace, může být inhibitor PKCS použit u tohoto stavu. VEGF je faktor indukující vaskulární permeabilitu s vysokou účinností, například 50000-krát vyšší než má histamin. Koncentrace VEGF je zvýšena v tekutině odebrané od pacientů s pleurálním a peritoneálním výpotkem způsobeným malignitou. Intraperitoneální injekce nádorových buněk holým myším vede ke tvorbě ascitu, která koreluje se zvýšením sekrece VEGF do peritoneální dutiny. Perinádorový edem, který se vyskytuje v centrálním nervovém systému při nádorech jako je glioblastom, je spojen s vysokou hladinou VEGF. Anti-VEGF terapie bude redukovat ascites a pleurální výpotek spojený s malignitami a syndromem ovariální hyperstimulace. Taková terapie bude snižovat potřebu opakovaných paracenthes/thorakocenthes a tak bude snižovat morbiditu související s těmito postupy, jako je například infekce, proteinové ztráty, kolaps plic a podobně. Taková terapie je zejména výhodná pro perinádorový otok, který se vyskytuje v uzavřených anatomických oblastech, jako je centrální nervový systém.

Inhibitory PKCE podle předkládaného vynálezu mohou být také použity v anti-VEGF terapii jiných onemocnění spojených s expresí VEGF.

Revmatoidní artritida je charakterizována hyperplastickým synoviálním pannem s vysokým stupněm vaskularizace, který způsobuje invazi a destrukci normální architektury kloubu. Kromě toho, exsudativní charakter synoviální tekutiny ukazuje na zvýšenou kapilární permeabilitu. VEGF může stimulovat expresi kolagenasy a může dále zhoršovat destruktivní proces. Hladiny VEGF jsou signifikantně zvýšeny v synoviální tekutině od pacientů s revmatoidní artritidou ve srovnání s pacienty s osteoartritidou. Produkce VEGF byla také lokalizována v infiltrujících makrofázích. Proto může být revmatoidní artritida léčena podáním inhibitorů PKC£ v anti-VEGF terapii.

Keloid je charakterizován nadměrnou tvorbou granulační tkáně v průběhu hojení rány, což vede ke tvorbě hypertrofické jizvy. Toto onemocnění je typicky pozorováno u černochů a má tendenci k recidivám. Lokální aplikace inhibitorů PKC na hypertrofickou granulační tkáň může redukovat angiogenesi a mírnit následující tvorbu jizvy.

Syndrom karpálního tunelu, který se také nazývá tlaková neuropatie, je charakterizován kompresí nervů, která vede k poruchám sensorického čití, svalovému chabnutí a svalové atrofii Je způsoben tlakem na nervus medianus v místě jeho průchodu prostorem tvořeným zápěstními kůstkami a ligamentum transversum carpae. Syndrom karpálního tunelu se vyskytuje buď v souvislosti s diabetes mellitus, nebo u populace bez diabetů.

Zvýšená hydratace nervu při syndromu karpálního tunelu může být způsobeno zvýšenou hladinou VEGF. Zvýšená hladina VEGF ve tkáni obklopující nerv může způsobit tlak na nerv indukcí cévní permeability a prouděním kapaliny do perineurální tkáně. Alterace syntesy a/nebo degradace kolagenu při syndromu karpálního tunelu mohou být způsobeny vysokou produkcí TGF-β. Zvýšená exprese TGF-β může zvyšovat syntesu extracelulárních proteinů včetně kolagenu a může redukovat jejich degradaci, což může vést ke zvýšené depozici extracelulární matrix ve tkáních obklopujících nerv. Bylo prokázáno, že aktivace PKC indukuje transkripci TGF-β stimulací aktivity aktivátorového proteinu-1. Proto mohou být inhibitory PKCfi podle předkládaného vynálezu použity proti působení VEGF a/nebo TGF-β při syndromu karpálního tunelu.

Odborník v oboru pozná, že terapeuticky účinné množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C podle předkládaného vynálezu je množství dostatečné pro inhibici růstu endotelových 21 • · · « · ·

φ φ φ φ φφ φφ • * φ φ φ φ φ φ

buněk nebo pro vývoj permeability kapilár prostřednictvím inhibice VEGF a že toto množství se liší - mimo jiné - v závislosti na velikosti poškozené tkáně, na koncentraci sloučeniny v terapeutickém přípravku a na tělesné hmotnosti pacienta. Obecně, množství inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C podaného jako terapeutické činidlo pro léčbu nádorových onemocnění a dalších onemocnění souvisejících s VEGF bude určeno případ od případu ošetřujícím lékařem. Při stanovení vhodné dávky by měl být brán v úvahu rozsah neovaskularizace, tělesná hmotnost a věk pacienta.

Obecně, vhodná dávka je taková, která vede ke koncentraci inhibitoru β-izoenzymu proteinkinasy C v léčeném místě v rozmezí od 0,5 nM do 200 μΜ, lépe od 0,5 nM do 200 nM. Očekává se, že sérové koncentrace od 0,5 nM do 100 nM budou dostatečné za většiny okolností.

Pro získání těchto léčebných koncentrací bude pacientovi, který potřebuje léčbu, pravděpodobně podáno mezi přibližně 0,001 mg na den na kg tělesné hmotnosti a 50,0 mg na den na kg. Obvykle by nemělo být potřeba více než přibližně 1,0 až 10,0 mg na den na kg tělesné hmotnosti inhibitoru proteinkinasy C β.

Jak bylo uvedeno výše, množství se bude lišit případ od případu.

Sloučeniny podle vzorce I a výhodné sloučeniny podle vzorce Ia a Ib jsou výhodně formulovány před podáním. Vhodné farmaceutické přípravky jsou připraveny podle známých postupů za použití dobře známých a snadno dostupných přísad. Při výrobě sloučenin vhodných pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu bude aktivní složka obvykle smísena s nosičem, nebo ··· I · 22 bude ředěna v nosiči, nebo bude uzavřena v nosiči, který může být ve formě kapsle, pytlíku, papírku nebo jiného kontaineru. Pokud slouží nosič jako ředidlo, pak to může být soliní, semisolidní nebo kapalný materiál, který účinkuje jako vehikulum, přísada nebo medium pro aktivní složku. Tak může být přípravek ve formě tablet, pilulek, prášku, pastilek, pytlíků, oplatek, elixírů, suspenzí, emulsí, roztoků, sirupů, aerosolu (ve formě pevné látky nebo v kapalném mediu), kapslí z tvrdé a měkké želatiny, čípků, sterilních roztoků pro injekce a sterilně balených prášků pro buď orální, nebo lokální aplikaci. Některé příklady vhodných nosičů, přísad a ředidel zahrnují laktosu, dextrosu, sacharosu, sorbitol, manitol, škroby, akacii, fosforečnany vápenaté, alginat, tragant, želatinu, křemičitan vápenatý, mikrokrystalickou celulosu, polyvinylpyrrolidon, celulosu, vodní sirup, methylcelulosu, methyl a propylhydroxybenzoaty, talek, steran hořečnatý a minerální olej. Přípravek může dále obsahovat zvlhčovači činidla, kluzná činidla, emulsifikační a suspendující činidla, konzervační činidla, sladidla a chučová korigens. Přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován tak, aby umožňoval rychlé, zpomalené nebo oddálené uvolňování aktivní složky po podání pacientovi. Přípravky jsou výhodně formulovány v jednotkové dávkové formě, kdy každá dávka obsahuje od přibližně 0,05 mg do přibližně 3 g, lépe okolo 750 mg aktivní složky. Nicméně je jasné, že podaná terapeutická dávka bude určena lékařem podle okolností včetně závažnosti léčeného stavu, výběru sloučeniny, která je podána a vybraného způsobu podání. Proto nelimitují výše uvedené rozsahy dávek žádným způsobem rozsah předkládaného vynálezu. Termín "jednotková dávková forma" označuje fyzikálně samostatnou jednotku, která 23 ·* · * • I · · • · · · • Ml · « • · · *· «* je vhodná jako jednotková dávka pro lidské pacienty a jiné savce, kdy každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, které je vypočítané tak, aby produkovalo požadovaný terapeutický účinek, spolu s vhodným farmaceutickým nosičem.

Kromě výše uvedených formulací, z nichž většina může být podána orálně, mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu také podány lokálně. Lokální přípravky zahrnují masti, krémy a gely.

Masti jsou obvykle připraveny za použití bud' (1) olejové baze, t.j. baze skládající se z fixovaných olejů nebo uhlovodíků, jako je bílá vazelína nebo minerální olej, nebo (2) absorbentní baze, t.j. baze skládající se z anhydridní substance nebo substancí, které mohou absorbovat vodu, jako je například anhydridní lanolin. Obvykle je po vytvoření baze, at olejové nebo absorbentní, přidána aktivní složka (sloučenina) v množství dostatečném pro vytvoření požadované koncentrace.

Krémy jsou emulse olej/voda. Skládají se z olejové fáze (vnitřní fáze), která typicky obsahuje fixované oleje, uhlovodíky a podobně, jako jsou vosky, vazelína, minerální olej a podobně, a vodnou fázi (souvislou fázi), která obsahuje vodu a jakékoliv substance rozpustné ve vodě, jako jsou přidané sole. Dvě fáze jsou stabilizovány za použití emulsifikačního činidla, například povrchově aktivního činidla, jako je například lauryl síran sodný; hydrofilní koloidy, jako je akaciová koloidní hmota, veegum, a podobně. Při tvorbě emulse je aktivní složka (sloučenina) obvykle přidána v množství dostatečném pro dosažení požadované koncentrace. 24 24 • · · · * » « * Μ ·· Ι· Μ ♦ · · · • · · · ♦ · ·♦ * * » · · · ··· · · » | · · · · · ··«· I ··· ··· ·· #·

Gely obsahují bázi vybranou z olejových baží, vody nebo baze emulse-suspenze. K této bázi je přidáno činidlo způsobující tvorbu gelu, které vytvoří matrici v bázi tím, že zvýší její viskozitu. Příklady činidel způsobujících tvorbu gelu jsou hydroxypropylcelulosa, polymery kyseliny akrylové, a podobně. Obvykle je aktivní složka (sloučenina) přidána do přípravku v požadované koncentraci v době před přidáním činidla způsobujícího tvorbu gelu.

Množství sloučeniny obsažené v přípravku pro lokální podání není zásadní; koncentrace by měla být v rozmezí dostatečném pro umožnění snadné aplikace přípravku na postiženou oblast tkáně v množství, které dodá požadované množství sloučeniny do požadovaného léčeného místa.

Obvyklé množství lokálního přípravku, které je aplikováno na postiženou tkáň závisí na velikosti poškozené tkáně a na koncentraci sloučeniny v přípravku. Obecně, přípravek bude aplikován na postiženou tkáň v množství od přibližně 1 do přibližně 500 ^g sloučeniny na cm2 postižené tkáně. Výhodně bude aplikované množství sloučeniny v rozmezí od přibližně 30 do přibližně 300 pig/cm2, lépe od přibližně 50 do přibližně 200 /xg/cm2, a nejlépe od přibližně 60 do přibližně 100 ^g/cm2. Následující příklady přípravků jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny jako jakékoliv omezení rozsahu předkládaného vynálezu. Přípravek 1

Kapsle z tuhé želatiny jsou připraveny za použití následujících složek: množství (mg/kapsli) Aktivní složka 250 Škrob, sušený 200 Stearan hořečnatý _10 Celkem 460 mg Výše uvedené složky jsou želatiny v množství 460 mg. smíseny a plněny do kapslí z tuhé Přípravek 2

Tableta je připravena za použití následujících složek: množství (mg/kapsli)

Aktivní složka 250

Celulosa, mikrokrystalická 400

Oxid křemičitý, poresní 10

Kyselina stearová 5

Celkem 665 mg

Složky jsou smíseny a stlačeny do formy tablet, kde každá tableta obsahuje 665 mg. 26 26

I • m » ψ φ m · · » · · ··#· · • · · · · ě * φ ·«· · · ι· Přípravek 3

Tablety obsahující 60 mg aktivní složky jsou připraveny následujícím způsobem: množství (mg/tabletu)

Aktivní složka 60 mg Škrob 45 mg

Mikrokrystalická celulosa 35 mg

Polyvinylpyrrolidon 4 mg (jako 10% roztok ve vodě)

Karboxymethyl škrob sodný 4,5 mg

Stearan hořeěnatý 0,5 mg

Talek l_

Celkem 150 mg

Aktivní složka, škrob a celulosa jsou prosety přes U.S. síto 5. 45 a jsou důkladně promíseny. ARoztok polyvinylpyrrolidonu je smí sen s vzniklým práškem, který je potom proset přes U.S. síto č. 14. Takto produkované granule jsou sušeny při 50 °C a jsou prosety přes U.S. síto č. 18. Karboxymethyl škrob sodný, stearan hořeěnatý a talek, předem proseté přes U.S. síto ě. 60, jsou potom přidány ke granulím, které jsou po míšení stlačeny na přístroji pro výrobu tablet za zisku tablet o hmotnosti 150 mg. Příklady provedeni vynálezu Všechny tyto příklady demonstrují použití (S)-3,4-(N,N'-1,1'-((2 ' * -ethoxy) -3 ' ' ' (O) -4' ' ' - (Ν,Ν-dimethylamino) -butan) -bis- (3,3' -indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion hydrochloridové sole pro 27 • ♦ ·#»· * · • ·

* I <?· · # # «·* ··· #· . ·* inhibici růstu endotelových buněk in vitro a pro inhibici zvýšené kapilární permeability, stimulované VEGF, in vivo. Příklad 1 V tomto příkladu byl inhibiční účinek uvedené sloučeniny na růst endotelovych buněk stimulovaný VEGF vyšetřován za použití rekombinantního lidského VEGF.

Hovězí endotelové buňky sítnice byly izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Primární kultury endteových buněk byly kultivovány na fibronetinem (NYBen Reagents, New York Blood Center) potažených plotnách (Costar) obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagovo medium (DMEM) s 5,5 mM glukosy, 10% plasmatickým koňským sérem (Wheaton, Scientific), 50 mg heparinu na litr a 50 jednotek růstového faktoru endotelových buněk na litr (Boehringer Mannheim). Poté, co dosáhly buňky konfluence, bylo medium změněno tak, aby obsahovalo 5% fetální hovězí sérum (HyClone) . Medium bylo měněno každé tři dny. Homogenita endotelových buněk byla potvrzena anti-faktor VIII protilátkami. Účinek uvedeného PKC inhibitoru na působení VEGF in vitro byl hodnocen za použití řídce rozmístěných kultur endotelových buněk hovězí sítnicové mikrovaskulatury, které jsou stimulovány po přidání VEGF. Endotelové buňky hovězí sítnice byly umístěny v nízké koncentraci (asi 2500 buněk na jamku) na 24-jamkové plotně (Costar) a byly inkubovány přes noc v DMEM obsahujícím 10% telecí sérum (GIBCO). Medium bylo vyměněno následující den.

Pro vyšetření vlivu uvedeného inhibitoru PKC na růst 4 28 4 28 • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 ♦ 4 4 4 4 4 4 ··♦ 4 4 4 4 • 4 4 4 · 4 4 • 4 4444 endotelových buněk byla provedena jedna sada pokusů, ve které růst buněk za absence jakéhokoliv aktivního činidla sloužil jako kontrola a pak byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech) , tak za absence VEGF. Po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer). Všechna vyšetření byla provedena nejméně třikrát a pokusy byly opakovány nejméně třikrát. Výsledky jsou pro všechny pokusy vyjádřeny jako průměry ± SD. Analýza in vitro výsledků byla provedena nepárovým Student t testem. Hodnota p < 0,050 byla považována za statisticky významnou.

Obrázek 1 ukazuje výsledky získané za použití rekombinantního VEGF. Jak je vidět ve třech sloupcích na obrázku nejvíce nalevo, přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk nemělo žádný vliv na základní růst buněk (sloupec 1). Rychlost růstu se významně zvýšila po přidání VEGF (čtvrtý sloupec). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání > 0,5 nM uvedeného inhibitoru PKC (čtyři pravé sloupce). Příklad 2

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a dále ilustruje inhibiční činek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a 29 • · ·· * · 29 • · ·· * · « η • Μ Μ» • * · ·· Ů · · * · · Μ Μ kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak v přítomnosti VEGF (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF.

Po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Obrázek 2 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením -VEGF, nemělo přidání uvedeného inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci od 0,01 nM do 100 nM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání s nestimulovánými buňkami (srovnání -VEGF v 0 a +VEGF v 0). Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC (čtyři pravé sloupce pod označením +VEGF). Přesněji, stimulační kapacita VEGF byla mírně redukována za přítomnosti 0,1 nM inhibitoru PKC a byla v podstatě zcela eliminována simultáním přidáním 1 nM a vyšším množství inhibitoru PKC. Příklad 3

Tento příklad vyšetřuje vliv uvedeného inhibitoru PKC na aktivitu endogenního VEGF vyjádřenou při kultivaci pericytů sítnice za hypoxických podmínek.

Endotelové buňky hovězí sítnice a pericyty sítnice byly 30 »· «*

* · · Ψ· ««* • f ««·· * izolovány z čerstvých telecích očí homogenizací a sérií kroků filtrace. Endotelové buňky byly kultivovány a usídleny v nízkých koncentracích na plotnách za použití postupů popsaných v příkladu 1. Za použití podobných technik byly pericyty hovězí sítnice kultivovány v DMEM/5.5 mM glukose s 20% fetálním hovězím sérem.

Hypoxické kondicionované medium pro endogenní VEGF expresi a normoxické kondicionované kontrolní medium byly připraveny v příslušném pořadí podle následujících postupů. Konfluentní monovrstva pericytů sítnice byla vystavena na dobu 24 hodin 2% 02/5% C02/93% N2 za použití Lab-Line Instruments pokročilého počítačem kontrolovaného infračerveného C02 inkubátoru s vodním pláštěm s redukovanou kyslíkovou kontrolou (model 480). Všechny buňky byly udržovány při teplotě 37 °C a nevykazovaly žádné morfologické změny při optické mikroskopii, vylučovaly trypanovou modř (> 98%) a mohly být dále normálně pasážovány. Buňky inkubované za normoxických podmínek (95% vzduch/5% C02) ze stejné vsádky a pasážované byly použity jako kontrola.

Medium bylo potom odebráno a filtrováno (Nagene; 0,22 μπι) před použitím. V tomto příkladu byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk za přítomnosti buď normoxického kondicionovaného media nebo hypoxického kondicionovaného media. Stejně jako to bylo provedeno v předcházejících příkladech, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer). 31 ·« ·«·· ·· { ·· · « · V testech uvedených na obrázku 3 byl uvedený inhibitor PKC použit v koncentraci 10 nM. Jak je ukázáno na obrázku 3, růst endotelových buněk sítnice byl stimulován kondicionovaným mediem z pericytů sítnice kultivovaných za hypoxických podmínek, o kterých je známo, že indukují expresi VEGF (srovnej sloupec 1 ke sloupci 3 na obrázku 3). Tento růst byl potlačen (normalizován) za přítomnosti sole inhibitoru PKC (S) -3,4- (N,N· -1,1' - ((2' ' -ethoxy) -3” ’ (O) -4' ' ' - (N,řídíme thylamino) -butan)-bis-(3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dionu s kyselinou chlorovodíkovou (porovnej sloupec 3 ku sloupci 4). Příklad 4

Tento příklad je podobný práci popsané na obrázku 1 a 2 a dále ilustruje inhibiční činek uvedeného inhibitoru PKC na růst endotelových buněk stimulovaný rekombinantním lidským VEGF.

Za použití postupů podle příkladu 1 byly izolovány a kultivovány endotelové buňky hovězí sítnice; potom byly připraveny kultury s nízkou koncentrací buněk. Opět, za použití postupu podle příkladu 1, byly provedeny pokusy, ve kterých byl vyšetřován vliv přidání uvedeného inhibitoru PKC jak za přítomnosti VEGF (+VEGF) (25 ng/ml; Genetech), tak za absence VEGF (-VEGF). Stejně jako výše, po inkubaci po dobu 4 dní při 37 °C byly buňky lyžovány v 0,1% dodecyl síranu sodném (SDS) a obsah DNA byl měřen za použití Hoechst 33258 barviva a fluorometru (model TKO-100; Hoefer).

Obrázek 4 ukazuje výsledky tohoto pokusu. Jak je ukázáno ve sloupcích pod označením -VEGF, nemělo přidání uvedeného

9 9 ··*· • m

t · «· *·· · « 9 M 32 «#«* *· 9 · inhibitoru PKC ke kultuře endotelových buněk v koncentraci 10 nM v podstatě žádný vliv na základní rychlost růstu buněk. Stimulace endotelových buněk rekombinantním lidským VEGF (25 ng/ml) produkovala významné zvýšení buněčného obsahu DNA po 4 dnech, což ukazuje na zvýšení rychlosti růstu, ve srovnání .. s ne stimul ovánými buňkami (srovnej -VEGF v 0 a +VEGF v 0) . Tato růstová rychlost byla významně snížena po přidání uvedeného inhibitoru PKC v koncentraci 10 nm. Tyto výsledky ukazují, že objevená třída inhibitorů PKC a přesněji, (S)-3,4-(N, Ν'-l,1'-((2»'-ethoxy)-3'''(0)-4>''- (N, N-dimethylamino)-butan)-bis- (3,3'-indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion, brání in vitro stimulaci růstu endotelových buněk sítnice jak exogenním, tak hypoxií indukovaným VEGF. Protože exprese VEGF je těsně spojena s neovaskularizací asociovanou s makulární degenerací, podporují tyto výsledky použití těchto inhibitorů PKC v terapii makulární degenerace.

Principy, výhodná provedení a způsoby podle předkládaného vynálezu byly popsány ve výše uvedené přihlášce. Nicméně, vynález není omezen na určité popsané formy, které které jsou spíše ilustrativní než limitující. Odborníky v oboru mohou být provedeny různé variace a změny, bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu.

Claims

33 • ·· ♦ · · ♦ · • 4 · ·· «β iPaLtento-vé rxáLjroJcy 1. Způsob pro léčbu nádorových onemocnění vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru S izoenzymu proteinkinasy C.
2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že inhibitorem β izoenzymu proteinkinasy C je bis-indolylmaleimid nebo makrocyklický bis-indolylmaleimid.
3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený inhibitor je selektivní pro izoenzym a izoenzymová selektivita je vybrána ze skupiny skládající se z beta-1 a beta-2 izoenzymů.
4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že inhibitor proteinkinasy C má následující vzorec: ω

N N

kde: W je -0-, -S-, -S0-, -S03-, -C0-, C2-C6 alkylen, substituovaný alkylen, C2-C6 alkenylen, -aryl-, -aryl(CHa)m0-, -heterocyklus-,-heterocyklus-(CH2)mO-, -fušovaný bicyklický-, -fušovaný bicyklický-(CH2)mO-, -NR3-, -NOR3-, -CONH-, nebo -NHCO-; X a Y jsou nezávisle C^-C^ alkylen, substituovaný alkylen nebo tvoří X, Y a W dohromady -(CH2) -AA-; R3· jsou vodíky nebo až čtyři volitelné substituenty nezávisle vybrané z halogen, C -C^ alkyl, hydroxy, C^-C alkoxy, haloalkyl, nitro, NR4R1, nebo NHCOCC^-C^ alkyl); Ra je vodík, CH3CO-, NH2 nebo hydroxy; R3 je vodík, (CH2)maryl, C^-C^ alkyl, -COOÍC^-C^ alkyl), -CONR4Rs, -(C=NH)NH2, -S0(-C4alkyl), -S02<NR4R1) nebo -S02(Ci-C4 alkyl); R4 a Rs jsou nezávisle vodík, C -C alkyl, fenyl, benzyl, nebo jsou kombinovány na dusíku, na který jsou navázány, za vzniku nasyceného nebo nenasyceného 5 nebo 6 členného kruhu; AA je aminokyselinový zbytek; m je nezávisle 0, 1, 2 nebo 3; a n je nezávisle 2, 3, 4 nebo 5, nebo jeho farmaceuticky přijatelné sole, proléčiva nebo estery. 1 Způsob podle nároku 4vyznačující se tím

kde Z je -(CH2)p- nebo - (CHJ^-O-R4 je hydroxy, -SH, Cx-C4 alkyl, (CH2)m aryl, -NH(aryl), -N(CH3)(CF3) , -NH(CF3) nebo -NRBR6; Rs je vodík nebo Cx-C4 alkyl; R6 je vodík, Cx-C4 alkyl nebo benzyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo ester.
6. Způsob podle nároku 4vyznačujícísetím/ že inhibitor proteinkinasy C má následující vzorec: H I

36 #« ♦ · • · « ♦ • t ·· #·· · * • · #··· · • · * »· ·· kde Z je -(CHa)p-; R4 je -N(CHa)(CP3), -NH(CF3) nebo -NRSRS; Rs a Re jsou nezávisle H nebo Cx-C4 alkyl; p je 0, 1 nebo 2; a m je nezávisle 2 nebo 3, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, proléčivo nebo ester.
7. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že inhibitor proteinkinasy C obsahuje (S)-3,4-(N,Ν'-1,1'-((2' -ethoxy)-3'''(O)-41'1 -(N,N-dimethylamino)-butan)-bis-(3,3'--indolyl))-1(H)-pyrrol-2,5-dion nebo jeho farmaceuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou.
8. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že nádorové onemocnění je vybráno ze skupiny skládající se z kapilárních hemangioblastomů, karcinomu prsu, Kaposiho sarkomu, glioblastomu, angiomatosní choroby, dětských hemangiomů, kolorektálního karcinomu, meduloblastomu, karcinomu žaludku, adenokarcinomů gastrointestinálního traktu, maligního melanomu, karcinomu vaječníků, nemalobuněěného karcinomu plic, maligních výpotků, perinádorového edemu, karcinomu prostaty, karcinomu močového měchýře, Von Hippel - Lindauova syndromu, karcinomu ledvin, karcinomu kůže, malignit štítné žlázy, karcinomu čípku děložního, hepatocelulárního karcinomu, rhabdomyosarkomu a leiomyosarkomu.
9. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že nádorové onemocnění je vybráno ze skupiny skládající se z kapilárních hemangioblastomů, karcinomu prsu, Kaposiho sarkomu, glioblastomu, angiomatosní choroby, dětských hemangiomů, kolorektálního karcinomu, maligního melanomu, karcinomu vaječníků, nemalobuněčného karcinomu plic, maligních výpotků, perinádorového edemu, karcinomu prostaty, karcinomu močového 37 ·· · · · * • · ···· * ♦ ♦ «« *· • · • · • · • tl ·· ·· • · • • · • ♦ ♦ • * · • · • • » ·· ♦ · měchýře. 10. Způsob pro léčbu revmatoidní artritidy vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C. 11. Způsob pro léčbu plicního edemu vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C. 12. Způsob pro inhibici kapilární permeability stimulované VEGF, která je spojena s plicním edemem, vyznačuj ící se t í m, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C.
13. Způsob pro léčbu keloidu vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C. 14. Způsob pro léčbu syndromu karpálního tunelu vyznačující se tím, že savcům, kteří potřebují takovou léčbu, je podáno terapeuticky účinné množství inhibitoru β izoenzymu proteinkinasy C.