JP2002504086A - Ｖｅｇｆ関連疾患の治療的処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 特に、プロテインキナーゼＣのβアイソザイム選択的阻害剤、（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（（２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩を用いる、例えば腫瘍に関連するようなＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖および、例えば肺浮腫に関連するようなＶＥＧＦ刺激毛細血管透過を抑制する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＶＥＧＦ関連疾患の治療的処置 この出願は１９９６年５月１日出願の米国暫定出願第６０／０１６，６５８号 の優先権の利益を主張する。発明の背景 １．発明の分野 本発明は概括的には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に関連した内皮細胞増殖 及び毛細血管透過、例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のβアイソザイム の阻害剤を用いる（ＶＥＧＦ）によって誘導される細胞増殖と透過との増強を阻 害する方法に関する。このＶＥＧＦ誘導状態は哺乳動物における腫瘍(neoplasia )及び、肺浮腫を含めた他の障害に密接に関連している。 本発明は特に、毛細血管の血管芽腫、乳癌、カポジ肉腫、グリア芽腫、血管腫 疾患、結腸直腸癌、髄芽腫、胃癌、胃腸管の腺癌(adenocarcinoma)、悪性黒色腫 、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、悪性滲出、腫瘍周縁(preitumoral)浮腫、 例えば脳腫瘍に関連した大脳内浮腫と嚢腫、膀胱癌、フォンヒッペル−リンダウ 症候群、腎細胞癌、皮膚癌、甲状腺悪性疾患、子宮頚癌(cervical cancer)、肝 細胞癌、横紋筋肉腫と平滑筋肉腫、及び本明細書に述べるような、ある一定の他 のＶＥＧＦ関連障害を包含する腫瘍疾患を治療するための、プロテインキナーゼ Ｃ（ＰＫＣ）のβアイソザイムの阻害剤の使用に関する。 ２．関連技術の説明 ＶＰＦ／ＶＥＧＦはグリコシル化多機能サイトカインである。ＶＰＥ／ＶＥＧ Ｆの過剰発現は腫瘍及び幾つかの他の疾患状態に関連する。 ＶＰＦ／ＶＥＧＦは内皮細胞増殖、小胞−空胞性オルガネラ仲介輸送の活性化 による過度透過性、遊走、及び形状変化と波打ち運動(ruffling)によるアクチン 認識を誘導する。これは内皮細胞遺伝子発現を変化させて、間質性コラゲナーゼ とウロキナーゼ様及び組織プラスミノーゲンアクチベーターの両方とを含めた、 組織因子及び幾つかのプロテアーゼの産生増加を誘導する。これらの同じ遺伝子 の大部分はＰＫＣのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）刺激活性化に よって誘導される。 ＶＰＦ／ＶＥＧＦは、今までに試験された、大抵のヒト及び動物の腫瘍によっ て豊富に発現され、分泌される。ＶＰＦ／ＶＥＧＦは腫瘍細胞、例えばグリア芽 腫の腫瘍細胞に直接影響を与えるばかりでなく、腫瘍血管新生の誘導に重要な役 割を果たすことができる(Ｃｌａｆｆｅｙ等,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５６，１７２〜１８１（１９９６）とこれに引用された参考文献)。 ＶＥＧＦの血管新生力は、細胞の破壊又は死亡によって遊離される線維芽細胞 増殖因子の相乗作用によって強化されるように思われる(Ｐｅｐｐｅｒ等，Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ.，１８９：８２４〜８３ １(１９９２)；Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏ１ .，１４８：１〜１６(１９９１))。 腫瘍の増殖と転移とはＶＥＧＦ発現の増強と密接に関連する。腫瘍細胞からの 化学的シグナルは休止内皮細胞を急速増殖期にシフトさせることができる。１２ 種類の既知血管新生タンパク質のうち、腫瘍中に最も一般的に見られるものは塩 基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、血管透過因子（ＶＰＦ）としても知ら れる血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）とである(Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ.，９９９巻(２６)：１７５７ 〜１７６３（１９９５）と、これに引用される参考文献)。 腫瘍の増殖が新しい血管を必要とするという認識と、新しい血管形成又は血管 新生を仲介する化学因子の同定とは、これらの疾患の病理学的プロセスの知識を 拡大し、これらの疾患の治療のための新しい道筋を開いた。血管新生の９種類の 異なる阻害剤が、乳癌、結腸癌、肺癌及び前立腺癌並びにカポジ肉腫を含めた、 広範囲スペクトルの充実腫瘍(solid tumor)の治療法として１期又は２期臨床試 験において現在研究されている(Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏ ｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎ Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｊ．Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，Ｉｓ ｒａｅｌ ＭＡ．Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ編集，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａ ｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄ ｅｒｓ，１９９５：２０６〜２３２)。これらの薬物のうち、ＴＮＰ−１７０， フマギリン(fumagillin)の合成類似体（Ｄｅｎｅｋａｍｐ，Ｊ．Ｂｒ Ｊ．Ｒａ ｄｉｏｌ．６６：１８１〜１９６，１９９３）は、充実腫瘍を有する多くの患者 における１期試験に関してＦＤＡによって認可されている。現在、進行した癌を 有する患者において臨床試験中の他の血管新生阻害剤には、血小板因子４；カル ボキシアミノトリアゾール；ＢＢ−９４とＢＢ−２５１６；メタロプロテイナー ゼ阻害剤；硫酸化多糖テコガラン(ＤＳ−１５２)；サリドマイド；インターロイ キン−１２；及びリノマイド(linomide)（Ｆｌｉｅｒ等，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３３巻，１７５７〜 １７６３頁，１９９５と、これに引用される参考文献）が含まれる。 ＰＫＣ阻害剤は癌治療のためにも提案されている(米国特許第５，５５２，３ ９６号を参照のこと)。しかし、特定の腫瘍疾患に対するＰＫＣのβアイソザイ ムの阻害剤の効力は知られていなかった。ＶＥＧＦがある一定の腫瘍及び他の疾 患に果たす役割を考慮するならば、ＶＥＧＦの機能を特異的にターゲットとする 他の薬物を同定することが当該技術分野において必要とされる。発明の概要 腫瘍の治療方法を提供することが、本発明の目的である。 慢性関節リウマチの治療方法を提供することが、本発明のさらに他の目的であ る。 ケロイドの治療方法を提供することが、本発明のさらになお他の目的である。 例えば成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）のような、肺浮腫関連状態の治療方法 を提供することが、本発明のさらになお他の目的である。 手根管症候群の治療方法を提供することが、本発明のさらに他の目的である。 本発明のこれらのそしてその他の目的は、以下で述べる実施態様の１つ以上に よって達成される。 本発明の１実施態様では、プロテインキナーゼＣのβアイソザイムの阻害剤の 治療有効量を前記哺乳動物に投与することを含む腫瘍の治療方法を提供する。 本発明のさらに他の実施態様では、プロテインキナーゼＣのβアイソザイムの 阻害剤の治療有効量を前記哺乳動物に投与することを含む慢性関節リウマチの治 療方法を提供する。 本発明の他の実施態様では、プロテインキナーゼＣのβアイソザイムの阻害剤 の治療有効量を前記哺乳動物に投与することを含むケロイドの治療方法を提供す る。 本発明のさらに他の実施態様では、プロテインキナーゼＣのβアイソザイムの 阻害剤の治療有効量を前記哺乳動物に投与することを含む肺浮腫の治療方法を提 供する。 本発明は、腫瘍及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に関連した他の障害の治 療における予防的及び効果的である化合物の同定法を当該技術分野に提供する。図面の簡単な説明 図１は、組換えヒトＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対するＰＫＣ阻害剤、（Ｓ） −３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（(２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''− （Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１ （Ｈ）−ピロール−２，５−ジオンの阻害効果を説明する。 図２は、組換えヒトＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対するＰＫＣ阻害剤、（Ｓ） −３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（(２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''− （Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１ （Ｈ）−ピロール−２，５−ジオンの阻害効果をさらに説明する。 図３は、低酸素条件下での網膜血管周囲細胞(retinal pericyte)の培養時に発 現される内因性ＶＥＧＦの作用に対するＰＫＣ阻害剤の影響を示す。 図４は、組換えヒトＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対するＰＫＣ阻害剤の阻害効 果をさらに説明する。発明の詳細な説明 特定の種類のプロテインキナーゼＣ阻害剤、即ち、プロテインキナーゼＣのβ アイソザイムの阻害剤、特にＰＫＣのβアイソザイム選択性阻害剤の治療的使用 がＶＥＧＦの効果に反作用することを、本発明では開示する。特に、この特定の 種類のプロテインキナーゼＣ阻害剤の使用は、内皮細胞増殖と毛細血管透過とに 反作用し、特に、増殖因子ＶＥＧＦにより刺激される内皮細胞増殖と毛細血管透 過とに反作用することを、本発明では開示する。したがって、このような化合物 は、例えば腫瘍のような、ＶＥＧＦ関連障害と、ＶＥＧＦに関連する他の疾患状 態とを治療的に処置するために用いることができる。 本発明の方法は好ましくは、βアイソザイムを効果的に阻害するようなプロテ インキナーゼＣ阻害剤を用いる。適当な化合物群の１つは先行技術においてビス −インドリルマレイミド又は大環状ビス−インドリルマレイミドとして一般に述 べられている。先行技術において充分に認められているビス−インドリルマレイ ミドは、米国特許第５６２１０９８号、第５５５２３９６号、第５５４５６３６ 号、第５４８１００３号、第５４９１２４２号及び第５０５７６１４号（これら は全て、本明細書に援用される）に述べられているような化合物を包含する。大 環状ビス−インドリルマレイミドは式Ｉの化合物によって特に示される。これら の化合物とそれらの製造方法とは、米国特許第５，５５２，３９６号に開示され ており、この特許は本明細書に援用される。これらの化合物は、ＶＥＧＦに関連 する内皮細胞増殖又は毛細血管透過を阻害し、腫瘍と、例えば慢性関節リウマチ 、ケロイド、手根管症候群及び肺浮腫のような他の疾患状態とに関連したＶＥＧ Ｆ効果を阻害するために、治療有効量で哺乳動物に投与される。これらの化合物 は上記疾患状態の危険性にある患者に予防薬として投与することもできる。 本発明の方法に用いるための化合物の好ましい種類の１つは、式： ［式中、 Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＣＯ−、Ｃ₂−Ｃ₆アルキレン 、置換アルキレン、Ｃ₂−Ｃ₆アルケニレン、−アリール−、−アリール（ＣＨ₂ ）_mＯ−、−複素環−、−複素環（ＣＨ₂）_mＯ−、−縮合二環−、−縮合二環（ ＣＨ₂）_mＯ−、−ＮＲ³−、−ＮＯＲ³−、−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−であり ； ＸとＹは独立的にＣ₁−Ｃ₄アルキレン、置換アルキレンであるか、又は一緒に Ｘ、Ｙ及びＷは結合して−（ＣＨ₂）_n−ＡＡ−を形成する； Ｒ¹は水素であるか、又はハロ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₄ア ルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、ＮＲ⁴Ｒ⁵又は−ＮＨＣＯ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル ）から独立的に選択される４個までの随意の置換基であり； Ｒ²は水素、ＣＨ₃ＣＯ−、ＮＨ₂又はヒドロキシであり； Ｒ³は水素、（ＣＨ₂）_mアリール、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、−ＣＯＯ(Ｃ₁−Ｃ₄アル キル)、−ＣＯＮＲ⁴Ｒ⁵、−（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ₂、−ＳＯ(Ｃ₁−Ｃ₄アルキル)、− ＳＯ₂（ＮＲ⁴Ｒ⁵）又は−ＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）であり； Ｒ⁴とＲ⁵は独立的に水素、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、フェニル、ベンジルであるか、 又はＲ⁴とＲ⁵は窒素と組合わされ、これらは結合して、飽和又は不飽和五員環又 は六員環を形成する； ＡＡはアミノ酸残基であり； ｍは独立的に０、１、２又は３であり； ｎは独立的に２、３、４又は５である］ で示される化合物、又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しく はエステルである。 本発明の方法に用いるための化合物のより好ましい種類は、式Ｉにおいて部分 −Ｘ−Ｗ−Ｙが４〜８個の原子を含有し、置換形でも非置換形でもよい式Ｉ化合 物によって示される。最も好ましくは、部分−Ｘ−Ｗ−Ｙは６個の原子を含有す る。 本発明の方法に用いるための他の好ましい化合物は、式ＩにおいてＲ¹とＲ²が 水素であり；Ｗは置換アルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ −又は−ＮＲ³−であるような、式Ｉ化合物である。本発明の方法に用いるため の特に好ましい化合物は、式Ｉａ：［式中、Ｚは−（ＣＨ₂）_p−又は−（ＣＨ₂）_p−Ｏ−（ＣＨ₂）_p−であり；Ｒ⁴ はヒドロキシ、−ＳＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、（ＣＨ₂）_mアリール、−ＮＨ(アリ ール)、−Ｎ（ＣＨ₃）(ＣＦ₃)、−ＮＨ（ＣＦ₃）又は−ＮＲ⁵Ｒ⁶であり；Ｒ⁵は 水素又はＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｒ⁶は水素、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル又はベンジル であり；ｐは０、１又は２であり；ｍは独立的に２又は３である］ で示される化合物又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しくは エステルである。最も好ましい式Ｉａ化合物は、式ＩａにおいてＺがＣＨ₂であ り；Ｒ⁴が−ＮＨ₂、−ＮＨ（ＣＦ₃）又は−Ｎ（ＣＨ₃）₂であるような化合物で ある。 本発明の方法に用いるための他の好ましい化合物は、式ＩにおいてＷが−Ｏ− であり、Ｙが置換アルキレンであり、Ｘがアルキレンである化合物である。これ らの好ましい化合物は、式Ｉｂ： ［式中、Ｚは−（ＣＨ₂）_p−であり；Ｒ⁴は−ＮＲ⁵Ｒ⁶、−ＮＨ（ＣＦ₃）又は− Ｎ（ＣＨ₃）(ＣＦ₃)であり；Ｒ⁵とＲ⁶は独立的に水素又はＣ₁−Ｃ₄アルキルであ り；ｐは０、１又は２であり；ｍは独立的に２又は３である］ で示される化合物又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しくは エステルである。最も好ましい式Ｉｂ化合物は、式Ｉｂにおいてｐが１であり； Ｒ⁵とＲ⁶がメチルである化合物である。 式Ｉ、Ｉａ及びＩｂの化合物は、塩基性部分を含有するので、薬剤学的に受容 される酸付加塩として存在することもできる。このような塩を形成するために一 般に用いられる酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸及びリン酸 のような無機酸と、例えばパラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、蓚酸 、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢 酸のような有機酸と、関連無機酸及び有機酸とを包含する。したがって、このよ うな薬剤学的に受容される塩は硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜 硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロ リン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、 カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル 酸塩、蓚酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル 酸塩、マレイン酸塩、２−ブチン−１，４−ジオエート、３−ヘキシン−２，５ −ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキ シ安息香酸塩、フタル酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニル プロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ヒプル酸塩、β−ヒド ロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩 、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−ス ルホン酸塩、マンデル酸塩等を包含する。特に、塩酸塩とメシル酸塩(mesylate salt)とが用いられる。 薬剤学的に受容される塩の他に、他の塩も存在することができる。これらは化 合物の精製、他の塩の製造、又は化合物若しくは中間体の同定と特徴づけにおい て中間体として役立つことができる。 式Ｉ、Ｉａ及びＩｂの化合物の薬剤学的に受容される塩は、例えば水、メタノ ール、エタノール、ジメチルホルムアミド、酢酸エチル等によるような、種々な 溶媒和物としても存在することができる。このような溶媒和物の混合物も製造す ることができる。このような溶媒和物の供給源は結晶化の溶媒に由来するか、又 は製造若しくは結晶化の溶媒に固有であるか、又はこのような溶媒に偶発的であ りうる。式Ｉ、Ｉａ及びＩｂの化合物の種々な立体異性体形が存在することがで き；例えば、Ｗが置換アルキレン部分中にキラル炭素原子を含有することができ ることが認識される。これらの化合物は通常はラセミ体として製造され、このよ うなものとして、便利に用いられることができる。或いは、望まれる場合には、 両方の個々のエナンチオマーを慣用的な方法によって単離する又は合成すること ができる。このようなラセミ体と個々のエナンチオマーとこれらの混合物が、本 発明の方法に用いられる化合物の一部を成す。 本発明に用いられる化合物は、式Ｉ、Ｉａ及びＩｂの化合物の薬剤学的に受容 されるプロドラッグをも包括する。プロドラッグは、化学的に修飾されており、 その作用部位において生物学的に不活性であることができるが、１種類以上の酵 素プロセス又は他のｉｎ ｖｉｖｏプロセスによって分解若しくは修飾されて、 親の生物学的活性形になることができる薬物である。このプロドラッグは親とは 異なる薬物動態学プロフィルを有することができ、粘膜上皮を横切るより容易な 吸収、より良好な塩形成又は溶解、及び／又は改良された全身的な安定性（例え ば、血漿半減期の増加）を可能にすると思われる。典型的に、このような化学的 修飾は下記を包含する： （１）エステラーゼ若しくはリパーゼにより切断することができるエステル若 しくはアミド誘導体；（２）特異的若しくは非特異的プロテアーゼによって認識 されることができるペプチド；又は （３）プロドラッグ形若しくは修飾プロドラッグ形の膜選択によって作用部位 に蓄積する誘導体；又は上記１〜３の任意の組合せ。適当なプロドラッグ誘導体 の選択及び製造のための慣用的方法は、例えばＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｄｅｓ ｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ （１９８５）に述べられている。 種々なビス−インドール−Ｎ−マレイミド誘導体の合成はＤａｖｉｓ等の米国 特許第５，０５７，６１４号に述べられており、本発明に用いるために適した、 好ましい化合物の合成は既述した米国特許第５，５５２，３９６号とＦａｕｌ等 のＥＰ公開第０６５７４１１Ａ１号に述べられており、これらの全ては本明細書 に援用される。 本発明の方法に用いるために特に好ましいプロテインキナーゼＣ阻害剤の１種 類は、上記米国特許第５，５５２，３９６号の実施例５ｇに述べられた化合物［ (Ｓ)−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（(２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４' ''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］ −１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩］である。この化合物は強力なプ ロテインキナーゼＣ阻害剤である。これはプロテインキナーゼＣに対して他のキ ナーゼに比べて選択的であり、非常にアイソザイム−選択性である、即ち、これ はβ−１−アイソザイムとβ−２−アイソザイムに対して選択性である。この化 合物の他の塩も有利であり、特にメシル酸塩が有利である。 好ましいメシル酸塩は式ＩＩ： で示される化合物をメタンスルホン酸と、非反応性の有機溶媒、好ましくは有機 ／水混合物中で、最も好ましくは水−アセトン中で反応させることによって製造 することができる。例えばメタノール、アセトン、酢酸エチル及びこれらの混合 物のような、他の溶媒が使用可能である。溶媒の水に対する比率は決定的ではな く、一般に試薬の溶解性によって決定される。好ましい、溶媒の水に対する比率 は一般に０．１：１から１００：１までの溶媒：水容量比である。好ましくは、 この比率は１：１から２０：１までであり、最も好ましくは、５：１から１０： １までである。最適の比率は選択された溶媒に依存して、アセトンでは好ましく は９：１溶媒：水比である。 この反応は通常は、ほぼ等モル量の２試薬を含むが、他の比率、特に、メタン スルホン酸が過剰であるような比率も使用可能である。メタンスルホン酸の添加 速度は反応に対して決定的ではなく、迅速に（＜５分間）加えることも、６時間 以上にわたってゆっくりと加えることもできる。反応は０℃から還流温度までの 範囲の温度においておこなわれる。Ｘ線粉末回析による測定によって塩の形成が 完了するまで、反応混合物を撹拌し、これは５分間から１２時間までを要する可 能性がある。 本発明の塩は結晶形として好ましくかつ容易に製造される。塩の三水和物形は 乾燥時に又は２０〜６０％相対湿度への暴露時に一水和物形に容易に転化される ことができる。塩は実質的に結晶であり、明確な融点、複屈折、及びＸ線回析図 を示す。一般に、結晶は１０％未満の非晶質固体、好ましくは５％未満、最も好 ましくは１％未満の非晶質固体を含む。 メシル酸塩は反応混合物から直接、濾過又は当該技術分野において察知される 他の分離方法によって、５０％〜１００％の範囲の収率で単離される。再結晶と 、当該技術分野において既知の他の精製方法とを用いて、必要な場合には、塩を さらに精製することができる。 例えばＶＥＧＦのような増殖因子によって刺された組織培養物中の内皮細胞は 、基底細胞増殖速度よりも大きい増殖速度を示す。本発明においておこなった実 験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて約０．１〜１００ｎＭの濃度で投与した場合に 、プロテインキナーゼＣ阻害剤、（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（( ２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン ）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン酸 塩が増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）刺激非基底細胞増殖を有意に阻害することを 実証している。 重要なことには、正常酸素(normoxic)条件培地中でのＶＥＧＦ刺激なしの内皮 細胞増殖の阻害が無いことで示されるように、組織培養物中の正常な内皮細胞増 殖がこの化合物によって阻害されないことを他の試験が実証している。低酸素条 件培地中では、低酸素細胞によって産生される内因性増殖因子、ＶＥＧＦの含量 の増加のために、細胞増殖速度が上昇する。この場合にも、βアイソザイム選択 性プロテインキナーゼＣ阻害剤（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（(２' '−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）− ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン酸塩は 、このような低酸素条件によって誘導される細胞増殖を標準化する。本発明にお いておこなった実験は、毛細血管透過も例えばＶＥＧＦのような増殖因子によっ て影響されることを実証する。試験は、動物モデルにおいてＶＥＧＦが毛細血管 透過を約３倍まで有意に高めることを実証している。このＶＥＧＦ依存性の毛細 血管透過上昇は用量依存性でもある。ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験によると、ＶＥＧ Ｆチャレンジの前に約２５ｍｇ／ｋｇ／日の濃度でプロテインキナーゼＣ阻害剤 を投与すると、ＶＥＧＦによって誘導される毛細血管透過が大きく阻害された。 １ｎＭ〜５ｍＭ、好ましくは１ｎＭ〜５００ｎＭの濃度の使用が特に考えられる 。この阻害は８０％までになることができ、一般には増殖因子誘導毛細血管透過 に特異的である。毛細血管透過はフルオレセイン血管造影によって測定すること ができる。 本発明のＰＫＣ−β阻害剤を用いて、内皮細胞増殖及び毛細血管透過に関連し た疾患状態、特に腫瘍と他のＶＥＧＦ関連疾患を治療することができる。 肺浮腫も本発明の化合物によって治療可能である。肺浮腫は毛細血管透過の増 大による肺の間質液(interstitial liquid)含量の増加を特徴とする。肺浮腫は 成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含めた幾つかの疾患状態に関連する可能性が ある。肺浮腫は、主として、低酸素とその結果のＶＥＧＦ含量増加を誘導する可 能性がある肺胞−毛細血管膜の破壊に関連するように思われる。このような破壊 はＰＫＣβをも活性化する可能性がある。それ故、本発明において同定された化 合物は増殖因子及び／又はＰＫＣβによる毛細血管透過の刺激を妨害して、肺浮 腫に至るような状態を改善することができる。 本発明のＰＫＣ阻害剤は、哺乳動物における腫瘍と他のＶＥＧＦ関連疾患を治 療するためにも用いることができる。ＶＥＧＦのシグナル伝達経路は腫瘍細胞に 直接影響を及ぼし、広範囲な腫瘍性及び非腫瘍性疾患状態における血管新生作用 を仲介する(mediate)。ＶＥＧＦ発現は、例えば、毛細血管の血管芽腫、乳癌、 カポジ肉腫、グリア芽腫、血管腫疾患、結腸直腸癌、髄芽腫、胃癌、胃腸管の腺 癌、悪性黒色腫、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、膀胱癌、フォンヒッペル− リンダウ症候群、腎細胞癌、皮膚癌、甲状腺悪性疾患、子宮頚癌、肝細胞癌、横 紋筋肉腫と平滑筋肉腫のような、多様なヒト腫瘍において実証されている。 腫瘍の不良な予後は、ＶＥＧＦ発現と腫瘍の血管分布度との組合せにしばしば 関連する。血管の供給がなければ、腫瘍増殖は制限される。それ故、抗血管新生 剤又は抗ＶＥＧＦ剤の使用は、血管供給を制限することによって、腫瘍の増殖を さらに防止して、腫瘍の退化を誘導することができる。抗ＶＥＧＦ剤は腫瘍細胞 に直接影響を及ぼすことができ、例えば、ＶＥＧＦは悪性黒色腫細胞に直接影響 を及ぼす。 ＶＥＧＦの発現は複数の機構によって制御される。ＶＥＧＦ産生は低酸素、あ る種の腫瘍形成(oncgenea)及び、トランスフォーミング増殖因子−β(ＴＧＦ− β)、血小板由来増殖(platelet derived growth)を含む種々なサイトカインによ って積極的に調節されうる。 好ましい実施態様では、腫瘍を有するヒトを治療するための抗ＶＥＧＦ療法に 、ＰＫＣ−β阻害剤を用いることができる。ＶＥＧＦを発現する腫瘍増殖のいず れか、例えば上記腫瘍に、本発明のＰＫＣ−β阻害剤によって影響を与えること ができる。切除不能な原発性腫瘍、手術又は放射線療法によって不完全に除去さ れた原発性腫瘍、適切に治療されたが、後に転移疾患を発症する高い危険性にあ る原発性腫瘍を有するヒト及び確立された転移疾患を有するヒトを治療するため に、抗ＶＥＧＦ療法は特に好ましい。高い血管分布度を与えられた、より不良な 予後を伴う腫瘍群、例えば乳癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫癌、非小細胞肺癌及 び頭部／子宮頚癌が、本発明の抗ＶＥＧＦ療法又はＰＫＣ−β阻害剤治療法の特 に良好な候補である。幼児の血管腫は白人幼児の１０〜１２％において生ずる。 一般に、これは生命を脅かす障害ではないが、場合によっては、大きさ又は解剖 学的所在のために、重大な病的状態と致死率を惹起する可能性がある。ＶＥＧＦ はこれらの腫瘍の増殖に関係があるとされている。現在、インターフェロンα− ２ａはこの腫瘍の退化退化を誘導するために用いられている。この腫瘍の血管新 生性を考慮すると、ＰＫＣ−β阻害剤を用いる抗ＶＥＧＦ療法はインターフェロ ンα−２ａと同程度に効果的である筈であるか、又はインターフェロンα−２ａ の欠損であったときに用いるための救助療法(salvage therapv)として評価され ることができる。 ＰＫＣ−β阻害剤又は抗ＶＥＧＦ療法は、腫瘍誘導腹水、悪性胸膜滲出及び腫 瘍周囲浮腫を治療するために用いることもできる。排卵誘導後の卵巣過剰刺激症 候群(ovarian hyperstimulation syndrome)を有する女性の腹水液(acitic fluid )中にＶＥＧＦが増加することを考慮すると、ＰＫＣ−β阻害剤はこの状態に用 いることができる。ＶＥＧＦは高い効力、例えばヒスタミンよりも５０，０００ 倍大きい効力を有する血管透過因子である。悪性疾患による胸膜滲出と腹膜滲出 を有する患者から取り出した流体中で、ＶＥＧＦ濃度が上昇する。ヌードマウス 中への腫瘍細胞の腹腔内注入は腹水の蓄積を生じ、これは腹膜中へのＶＥＧＦの 分泌の増加と時間的に相関する。例えばグリア芽腫のような中枢神経系腫瘍にお いて生ずる腫瘍周囲浮腫はＶＥＧＦの高レベルと関連する。抗ＶＥＧＦ療法は、 悪性疾患と卵巣過剰刺激症候群とに関連した、腹水と胸膜滲出を軽減する。この ような療法は反復水腫穿刺術／胸腔穿刺術の必要性を減じ、これらの処置に関連 した付随病的状態(attendant morbidity)、例えば感染、タンパク質消耗(protei n depletion)、肺虚脱(collapsed lung)等を減ずる。このような療法は特に、例 えば中枢神経系のような、閉鎖された解剖学的領域に生ずる腫瘍周囲浮腫の抑制 のために好ましい。 本発明に用いるＰＫＣ−β阻害剤は、ＶＥＧＦ発現に関連した他の疾患を治療 するための抗ＶＥＧＦ療法に用いることもできる。 慢性関節リウマチは、正常な関節構造を侵襲し、破壊する、高度な血管分布を 有する過形成滑膜パンヌスを特徴とする。さらに、滑液(synovial fluid)の滲出 性は毛細血管透過度の増大を示唆する。ＶＥＧＦはコラゲナーゼ発現を刺激する ことができ、破壊プロセスをさらに悪化させる。骨関節症を有する患者に比べて 、慢性関節リウマチを有する患者からの滑液中ではＶＥＧＦレベルが顕著に上昇 する。ＶＥＧＦ産生はまた浸潤性(infiltrating)マクロファージに局在している 。それ故、慢性関節リウマチは抗ＶＥＧＦ療法においてＰＫＣ−β阻害剤を投与 することによって治療することができる。 ケロイドは、肥厚性瘢痕を生じる創傷治癒中の過増殖性肉芽組織形成を特徴と する。この障害は典型的に黒人患者に見られ、再発性障害である傾向がある。肥 厚性肉芽形成組織へのＰＫＣ阻害剤の局所投与は血管新生を減少させ、その後の 瘢痕形成を軽減することができる。 エントラップメント神経障害(entrapment neuropathy)とも呼ばれる手根管症 候群は、感覚変調(sensory alternation)、筋肉弱化及び筋肉衰弱をもたらしう る神経圧迫(compression of nerves)を特徴とする。手根管症候群は、手根の骨 と横手根靭帯とによって形成される空隙を正中神経が通過するときに正中神経を 加圧することによって惹起される。手根管症候群は、糖尿病関連症候群として又 は非糖尿病集団において発症する。 手根管症候群における強化された神経水化(nerve hydration)は高レベルのＶ ＥＧＦによって惹起されうる。神経を囲む組織中のＶＥＧＦレベルの上昇は、血 管透過と神経周囲組織中への流体流出とを誘導することによって神経エントラッ プメントを惹起する可能性がある。手根管症候群におけるコラーゲンの合成及び ／又は分解の変化は、高レベルのＴＧＦ−β産生によって惹起されうる。ＴＧＦ −β発現の上昇は、コラーゲンを含めた細胞外タンパク質合成を強化することが でき、神経周囲組織中の細胞外マットリックス付着を増強させる、それらの分解 を減じることができる。ＰＫＣ活性化はアクチベータープロテイン−１作用を刺 激することによってＴＧＦ−βの転写を誘導することが判明している。それ故、 本発明のＰＫＣ−β阻害剤は、手根管症候群におけるＶＥＧＦ及び／又はＴＧＦ −β作用に反作用させるために、用いることができる。 当業者は、本発明に従って用いられる治療有効量のプロテインキナーゼＣ−β 阻害剤がＶＥＧＦを阻害することによって内皮細胞増殖又は毛細血管透過の発展 を阻害するために充分な量であること、及びこの量が特に、罹患組織サイズ、治 療製剤中の化合物濃度及び患者の体重に依存して変化することを認識するであろ う。一般に、腫瘍及び他の上記ＶＥＧＦ関連疾患を治療するための治療剤として 投与されるべきプロテインキナーゼＣ阻害剤の量は症例毎に主治医によって決定 される。ガイドラインとして、適当な投与量を設定するときに、血管新生の程度 、患者の体重と年齢が考慮される。 一般に、適当な投与量は治療部位における０．５ｎＭ〜２００μＭ、より通常 には０．５ｎＭ〜２００ｎＭの範囲内のプロテインキナーゼＣ阻害剤の濃度であ る。大抵の状況では、０．５ｎＭ〜１００ｎＭの血清濃度で充分であると予想さ れる。 これらの治療濃度を得るために、治療を必要とする患者には恐らく約０．００ １ｍｇ／日／体重ｋｇ〜５０．０ｍｇ／日／ｋｇが投与されると考えられる。通 常は、約１．０〜１０．０ｍｇ／日／体重ｋｇ以下のプロテインキナーゼＣ−β 阻害剤が必要とされる筈である。上述したように、上記量は症例毎に基づいて変 化しうる。 式Ｉ化合物と、式ＩａとＩｂの好ましい化合物とは好ましくは投与前に製剤化 される。周知の、容易に入手可能な成分を用いる既知の方法により、適当な薬剤 製剤を製造する。本発明の方法に用いるために適した組成物の製造では、有効成 分を通常、キャリヤーと混合するか、又はキャリヤーによって希釈するか、又は カプセル、サシェット(sachet)、ペーパー若しくは他の容器の形状であるキャリ ヤー中に封入する。キャリヤーが希釈剤として役立つ場合には、キャリヤーはビ ヒクル、賦形剤又は活性成分としての媒質として作用する、固体、半固体又は液 体物質であることができる。したがって、組成物は錠剤、ピル、粉末、薬用ドロ ップ、サシェット、カシェ(cachet)、エリキシール、懸濁液、エマルジョン、溶 液、シロップ、エーロゾル(固体として又は液体媒質中)、軟質若しくは硬質ゼラ チンカプセル、座薬、滅菌注射可能溶液、及び経口若しくは局所用途の滅菌パッ ケージ化粉末の形状であることができる。 適当なキャリヤー、賦形剤及び希釈剤の幾つかの例は、ラクトース、デキスト ロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン 酸カルシウム、アルギネート、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム 、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ(water s yrup)、メチルセルロース、メチル及びプロピルヒドロキシベンゾエート、タル ク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油を包含する。製剤は付加的に滑沢剤、湿 潤剤、乳化剤と懸濁化剤、保存料、甘味剤又はフレーバー剤を含むことができる 。本発明の組成物は、患者への投与後に有効成分の迅速放出、持続放出又は遅延 放出を生じるように製剤化することができる。組成物は好ましくは単位投与量形 で製剤 化され、各投与量は約０．０５ｍｇ〜約３ｇ、より通常は、約７５０ｍｇの有効 成分を含有する。しかし、治療投与量が治療されるべき状態の重症度、投与され る化合物の選択、及び選択された投与経路を含めた関連状況を考慮して医師によ って決定されることは理解されるであろう。それ故、上記投与量範囲は本発明の 範囲を限定することを全く意図しない。“単位投与量形”なる用語はヒト対象及 び他の哺乳動物に対する単回投与量として適した物理的な個別投与量を意味し、 各単位は所望の治療効果を生じるように算出された有効物質の予め決定された量 を、適当な薬剤学的キャリヤーと共に含有する。 殆どが経口投与されうる上記製剤の他に、本発明の方法に用いる化合物は局所 投与することもできる。局所製剤は軟膏、クリーム及びゲルを包含する。 軟膏は一般に、（１）油脂性基剤、即ち、固定油(fixed oil)又は、例えば白 色ワセリン(white petroleum)若しくは鉱油のような炭水化物から成る基剤、又 は（２）吸水性基剤、即ち、水を吸収することができる無水物質(単数又は複数 種類)、例えば無水ラノリンから成る基剤のいずれかを用いて製造される。通常 、油脂性であれ、吸水性であれ、基剤の製造後に、有効成分（化合物）を所望の 濃度を与える量まで加える。 クリームは油／水エマルジョンである。クリームは、典型的に固定油、炭水化 物等、例えばワックス、ワセリン、鉱油等を含む油相（内部相）と、水及び任意 の水溶性物質、例えば添加塩を含む水相（連続相）とから成る。これらの２相は 乳化剤、例えば界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、親水性コロイド (例えば、アラビアゴム コロイド状粘土(acacia colloidal clays))、ヴィーガ ム(veegum)等を用いることによって安定化される。エマルジョンの形成時に、有 効成分（化合物）を通常、所望の濃度を得るための量で加える。 ゲルは油脂性基剤、水又はエマルジョン−懸濁液基剤から選択された基剤を含 む。基剤に、基剤中でマトリックスを形成して、その粘度を上昇させるゲル化剤 を加える。ゲル化剤の例はヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマー 等である。通常、有効成分（化合物）は、ゲル化剤の添加の前の時点で所望の濃 度で製剤に加えられる。 局所製剤に加えられる化合物の量は決定的ではなく；所望の治療部位に所望の 量の化合物を与えるような量で罹患組織部分に容易に施用することを可能にする ために充分な範囲内であるべきである。 罹患組織に施用される局所製剤の慣習的な量は罹患組織の大きさと製剤中の化 合物の濃度とに依存する。一般に、製剤は罹患組織に１ｃｍ²の罹患組織当たり に約１〜約１５０μｇの化合物を与える量で施用される。好ましくは、化合物の 施用量は約３０〜約３００μｇ／ｃｍ²、より好ましくは約５０〜約２００μｇ ／ｃｍ²、最も好ましくは約６０〜約１００ｇ／ｃｍ²の範囲である。 下記製剤例は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定することを全く意図しない。 製剤１ 下記成分を用いて、硬質ゼラチンカプセルを製造する： 量（ｍｇ／カプセル） 活性剤 ２５０ 澱粉、乾燥 ２００ ステアリン酸マグネシウム １０ 合計 ４６０ｍｇ 上記成分を混合して、硬質ゼラチンカプセル中に４６０ｍｇ量で充填する。 製剤２ 下記成分を用いて、錠剤を製造する： 量（ｍｇ／カプセル） 活性剤 ２５０ セルロース、微結晶 ４００ 二酸化ケイ素、ヒュームド １０ ステアリン酸 ５ 合計 ６６５ｍｇ 成分をブレンドし、圧縮成形して、各々６６５ｍｇ重量を有する錠剤を形成す る。製剤３ 各々６０ｍｇの有効成分を含有する錠剤を次のように製造する： 量（ｍｇ／錠剤） 活性剤 ６０ｍｇ 澱粉 ４５ｍｇ 微結晶セルロース ３５ｍｇ ポリビニルピロリドン （水中１０％溶液として） ４ｍｇ ナトリウムカルボキシメチル澱粉 ４．５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ０．５ｍｇ タルク １ｍｇ 合計 １５０ｍｇ 有効成分、澱粉及びセルロースをＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．シーブに通して 、完全に混合する。得られた粉末にポリビニルピロリドンの溶液を混合して、次 にＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。このようにして製造された顆粒を ５０℃において乾燥させ、Ｎｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。Ｎｏ．６ ０メッシュＵ．Ｓ．シーブに予め通した、ナトリウムカルボキシメチル澱粉、ス テアリン酸マグネシウム及びタルクを次に顆粒に加えて、混合後に、錠剤製造機 で圧縮成形して、各々１５０ｍｇ重量を有する錠剤を得る。実施例 これらの実施例は全て、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮細胞増殖と、ＶＥＧＦによって 刺激される毛細血管透過のｉｎ ｖｉｖｏ上昇とを阻害するための（Ｓ）−３， ４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（(２”−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ， Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ） −ピロール−２，５−ジオン塩酸塩の使用を実証する。実施例１ この実施例では、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対する上記化合物の阻害効果を 、組換えヒトＶＥＧＦを用いて試験した。 ウシ網膜内皮細胞を新鮮な子ウシの眼からホモジナイゼーションと一連の濾過 工程とによって単離した。初代内皮細胞培養物を、５．５ｍＭグルコースと、１ ０％血漿由来ウマ血清（Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、５０ｍｇ ／リットルのヘパリンと、５０単位／リットルの内皮細胞増殖因子（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地 （ＤＭＥＭ）を含有するフィブロネクチン（ＮＹＢｅｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｎ ｅｗＹｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）被覆ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ）中 で増殖させた。細胞が集密に達した後に、培地を５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏ ｎｃ）を含有するように交換した。培地は３日毎に交換した。内皮細胞均質性(h omogeneiy)は、抗ＶＩＩＩ体によって確認した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ作用に対する上記ＰＫＣ阻害剤の効果を、 ＶＥＧＦの添加時に増殖刺激を受けたウシ網膜微細血管内皮細胞の希薄平板培養 した(sparsely plated)培養物を用いて評価した。ウシ網膜内皮細胞を２４穴デ ィッシュ（Ｃｏｓｔａｒ）中で希薄に（〜２５００細胞／穴）平板培養し、１０ ％子ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。 培地は翌日交換した。 内皮細胞増殖に対する上記ＰＫＣ阻害剤の影響を調べるために、１組の実験を おこない、活性剤の不存在下での細胞増殖を対照として用い、ＶＥＧＦ（２５ｎ ｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の存在下とＶＥＧＦの不存在下の両方における 上記ＰＫＣ阻害剤の添加の影響を試験した。３７℃における４日間のインキュベ ーション後に、細胞を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で溶解させ 、ＤＮＡ含量をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料と蛍光計（モデルＴＫＯ−１００ ；Ｈｏｅｆｅｒ）とを用いて測定した。 全ての測定は少なくとも３通りにおこない、実験は少なくとも３回繰り返した 。結果は全ての実験に関して平均値±ＳＤとして表す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果の 分析はノン−ペアード(non-paired)スチューデント検定によっておこなった。Ｐ 値＜０．０５０は統計的に有意と考えられた。 図１は組換えＶＥＧＦを用いて得られた結果を示す。この図の一番左から３カ ラムによって示されるように、内皮細胞培養物への上記ＰＫＣ阻害剤の添加は基 底増殖速度（カラム１）に本質的に影響を及ぼさなかった。ＶＥＧＦの添加時に 増殖速度は実質的に上昇した(第４カラム)。この増殖速度は＞０．５ｎＭの上記 ＰＫＣ阻害剤の添加時に（一番右からの４カラム）有意に低下した。実施例２ この実施例は図１に報告した実験と同じであり、組換えヒトＶＥＧＦを用いて 、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対する上記ＰＫＣ阻害剤の阻害効果をさらに示す 。 実施例１の方法を用いて、ウシ網膜内皮細胞を単離して、増殖させ；次に、希 薄に平板培養した培養物を調製した。この場合にも、実施例１の方法を用いて、 実験をおこない、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の存在下と ＶＥＧＦの不存在下の両方における内皮細胞増殖に対する上記ＰＫＣ阻害剤の影 響を試験した。３７℃における４日間のインキュベーション後に、細胞を０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で溶解させ、ＤＮＡ含量をＨｏｅｃｈｓ ｔ３３２５８染料と蛍光計（モデルＴＫＯ−１００；Ｈｏｅｆｅｒ）とを用いて 測定した。 図２はこの実験の結果を示す。表示−ＶＥＧＦの上方のカラムによって示され るように、内皮細胞培養物への０．１ｎＭ〜１００ｎＭでの上記ＰＫＣ阻害剤の 添加は細胞の基底増殖速度に本質的に影響を及ぼさなかった。組換えヒトＶＥＧ Ｆ（２５ｎｇ／ｍｌ）による内皮細胞の刺激は、非刺激細胞に比べて(０におけ る−ＶＥＧＦを０における＋ＶＥＧＦと比較する)、４日間後に細胞ＤＮＡ含量 の顕著な増加を生じ、増殖速度の上昇を示唆した。この増殖速度は上記ＰＫＣ阻 害剤を添加すると、顕著に低下した(表示＋ＶＥＧＦ上の一番右から４カラム)。 特に、ＶＥＧＦ刺激能力は０．１ｎＭのＰＫＣ阻害剤の存在下ではやや低下し、 １ｎＭ以上のＰＫＣ阻害剤を同時に添加することによって本質的に完全に除去さ れた。実施例３ この実施例は、低酸素条件下で網膜血管周囲細胞(retinal pericyte)を培養し たときに発現される内因性ＶＥＧＦの作用に対する上記ＰＫＣ阻害剤の影響を試 験する。 ウシ網膜内皮細胞と網膜血管周囲細胞とを新鮮な子ウシ眼からホモジナイゼー ションと一連の濾過工程とによって単離した。内皮細胞は、実施例１の方法を用 いて、増殖させ、希薄に平板培養した。同様な方法を用いて、ウシ網膜血管周囲 細胞を、２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／５．５ｍＭグルコース中で培養し た。 内因性ＶＥＧＦ発現のための低酸素条件培地と、正常酸素条件対照培地とをそ れぞれ下記方法によって調製した。低酸素制御装置(reduced oxygen control)を 備えたＬａｂ−Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ高機能コンピューター制御赤外 ウォータージャケット付きＣＯ₂インキュベーター（モデル４８０）を用いて、 集密網膜血管周囲細胞単層を２％Ｏ₂／５％ＣＯ₂／９３％Ｎ₂に２４時間暴露さ せた。全ての細胞を３７℃に維持したところ、光学顕微鏡によって形態的変化を 示さず、トリパンブルー染料を排除し(＞９８％)、その後、正常に継代培養され ることができた。同じバッチ及び継代(passage)からの正常酸素条件（９５％空 気／５％ＣＯ₂）下でインキュベートした細胞を対照として用いた。その後、培 地を回収して、使用前に濾過した(Ｎａｌｇｅｎｅ；０．２２μｍ)。 この実施例では、正常酸素条件培地又は低酸素条件培地のいずれかの存在下で 内皮細胞増殖に対する上記ＰＫＣ阻害剤の影響を調べる実験を、おこなった。先 行実施例でおこなったように、３７℃における４日間のインキュベーション後に 、細胞を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で溶解させ、ＤＮＡ含量 をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料と蛍光計(モデルＴＫＯ−１００；Ｈｏｅｆｅ ｒ)とを用いて測定した。 図３に報告する試験では、上記ＰＫＣ阻害剤を１０ｎＭの濃度で用いた。図３ に示すように、ＶＥＧＦ発現を誘導することが知られた低酸素条件下で培養され た網膜血管周囲細胞から得られた条件培地によって、網膜内皮細胞増殖は刺激さ れた(図３においてカラム１をカラム３に比較)。この増殖刺激はＰＫＣ阻害剤の （Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（２''−エトキシ）−３'''（Ｏ）− ４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル )］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオンの塩酸塩の存在下で抑制された（正 常化した）(カラム３をカラム４に比較)。実施例４ この実施例は、図１と２に報告した実験と同様であり、組換えヒトＶＥＧＦを 用いたＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対する上記ＰＫＣ阻害剤の阻害効果をさらに 説明する。 実施例１の方法を用いて、ウシ網膜内皮細胞を単離して、増殖させた；次に、 希薄に平板培養した培養物を調製した。この場合にも、実施例１の方法を用いて 、ＶＥＧＦの存在下（＋ＶＥＧＦ）（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と ＶＥＧＦの不存在下（−ＶＥＧＦ）の両方における内皮細胞増殖に対する上記Ｐ ＫＣ阻害剤の影響を試験する実験をおこなった。上記と同様に、３７℃における ４日間のインキュベーション後に、細胞を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）中で溶解させ、ＤＮＡ含量をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料と蛍光計（モ デルＴＫＯ−１００；Ｈｏｅｆｅｒ）とを用いて測定した。 図４はこの実験の結果を示す。表示−ＶＥＧＦの上方のカラムによって示され るように、内皮細胞培養物への１０ｎＭの濃度での上記ＰＫＣ阻害剤の添加は細 胞の基底増殖速度に本質的な影響を与えなかった。組換えヒトＶＥＧＦ（２５ｎ ｇ／ｍｌ）による内皮細胞の刺激は、非刺激細胞に比べて、細胞ＤＮＡ含量の顕 著な増加を生じ、増殖速度の上昇を示唆した(−ＶＥＧＦ対照を＋ＶＥＧＦ対照 と比較)。上記ＰＫＣ阻害剤を１０ｎＭの濃度で添加すると、増殖速度は顕著に 低下した。 これらの結果は、開示した種類のＰＫＣ阻害剤、特に（Ｓ）−３，４−［Ｎ， Ｎ’−１，１’−（２''−エトキシ）−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチ ルアミノ）−ブタン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ）−ピロール −２，５−ジオンが外因性ＶＥＧＦと低酸素誘導ＶＥＧＦの両方による網膜内皮 細胞増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を防止することを実証する。ＶＥＧＦ発現は、 黄斑変性に関連する血管新生に密接に関係づけられているので、これらの結果は 、黄斑変性を治療するための療法としてのこれらのＰＫＣ阻害剤の使用を支持す る。 本発明の原理、好ましい実施態様及び作用形式を上記明細書で説明した。しか し、開示した特定の形は制限ではなく例示と見なされるべきであるため、本明細 書において保護されるように意図される発明は、開示した特定の形に限定される と解釈されるべきではない。本発明の要旨から逸脱せずに、改変及び変更を当業 者がおこなうことが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウェイズ，ダグラス・カーク アメリカ合衆国インディアナ州46205，イ ンディアナポリス，ノース・パーク・アベ ニュー 4565 (72)発明者 エイエロ，ロイド・ピー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02178, ベルモント，ブレッドウッド・ロード 43 (72)発明者 キング，ジョージ・エル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02030, ドーバー，センター・ストリート 101

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．腫瘍の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、プ ロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤の治療有効量を投与することを含む 上記治療方法。 ２．プロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤がビス−インドリルマレ イミド又は大環状ビス−インドリルマレイミドである、請求項１記載の方法。 ３．阻害剤がアイソザイム選択性であり、アイソザイム選択性がβ−１及び β−２アイソザイムから成る群から選択される、請求項１記載の方法。 ４．プロテインキナーゼＣ阻害剤が 次式： ［式中、 Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＣＯ−、Ｃ₂−Ｃ₆アルキレン 、置換アルキレン、Ｃ₂−Ｃ₆アルケニレン、−アリール−、−アリール（ＣＨ₂ ）_mＯ−、−複素環−、−複素環（ＣＨ₂）_mＯ−、−縮合二環−、−縮合二環（ ＣＨ₂）_mＯ−、−ＮＲ³−、−ＮＯＲ³−、−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−であり ； ＸとＹは独立的にＣ₁−Ｃ₄アルキレン、置換アルキレンであるか、又は一緒に Ｘ、Ｙ及びＷは結合して−（ＣＨ₂）_n−ＡＡ−を形成する； Ｒ¹は水素であるか、又はハロ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₄ア ルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、ＮＲ⁴Ｒ⁵又は−ＮＨＣＯ（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル ）から独立的に選択される４個までの任意の置換基であり； Ｒ²は水素、ＣＨ₃ＣＯ−、ＮＨ₂又はヒドロキシであり； Ｒ³は水素、（ＣＨ₂）_mアリール、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、−ＣＯＯ(Ｃ₁−Ｃ₄アル キル)、−ＣＯＮＲ⁴Ｒ⁵、−（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ₂、−ＳＯ(Ｃ₁−Ｃ₄アルキル)、− ＳＯ₂（ＮＲ⁴Ｒ⁵）又は−ＳＯ₂（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）であり； Ｒ⁴とＲ⁵は独立的に水素、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、フェニル、ベンジルであるか、 又はＲ⁴とＲ⁵はそれらが結合する窒素と一緒になって、飽和又は不飽和五員環又 は六員環を形成する； ＡＡはアミノ酸残基であり； ｍは独立的に０、１、２又は３であり； ｎは独立的に２、３、４又は５である］ で示される化合物、又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しく はエステルである、請求項３記載の方法。 ５．プロテインキナーゼＣ阻害剤が 次式： ［式中、Ｚは−（ＣＨ₂）_p−又は−（ＣＨ₂）_p−Ｏ−（ＣＨ₂）_p−であり；Ｒ⁴ はヒドロキシ、−ＳＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、（ＣＨ₂）_mアリール、−ＮＨ(アリ ール)、−Ｎ（ＣＨ₃）(ＣＦ₃)、−ＮＨ（ＣＦ₃）又は−ＮＲ⁵Ｒ⁶であり；Ｒ⁵は 水素又はＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｒ⁶は である］ で示される化合物又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しくは エステルである、請求項４記載の方法。 ６．プロテインキナーゼＣ阻害剤が 次式： ［式中、Ｚは−（ＣＨ₂）_p−であり；Ｒ⁴は−ＮＲ⁵Ｒ⁶、−ＮＨ（ＣＦ₃）又は− Ｎ（ＣＨ₃）(ＣＦ₃)であり；Ｒ⁵とＲ⁶は独立的に水素又はＣ₁−Ｃ₄アルキルであ り；ｐは０、１又は２であり；ｍは独立的に２又は３である］ で示される化合物又はそれらの薬剤学的に受容される塩、プロドラッグ若しくは エステルである、請求項４記載の方法。 ７．プロテインキナーゼＣ阻害剤が（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’ −（(２''−エトキシ)−３'''（Ｏ）−４'''−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブ タン）−ビス−(３，３’−インドリル)］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオ ン又はその薬剤学的に受容される酸塩を含む、請求項５記載の方法。 ８．腫瘍が、毛細血管の血管芽腫、乳癌、カポジ肉腫、グリア芽腫、血管腫 疾患、幼児の血管腫、結腸直腸癌、髄芽腫、胃癌、胃腸管の腺癌、悪性黒色腫、 卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、悪性滲出、腫瘍周囲浮腫、膀胱癌、フォンヒ ッペル−リンダウ症候群、腎細胞癌、皮膚癌、甲状腺悪性疾患、頚部癌、肝細胞 癌、横紋筋肉腫及び平滑筋肉腫から成る群から選択される、請求項１記載の方法 。 ９．腫瘍が、毛細血管の血管芽腫、乳癌、カポジ肉腫、グリア芽腫、血管腫 疾患、幼児の血管腫、結腸直腸癌、悪性黒色腫、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺 癌、悪性滲出、腫瘍周囲浮腫、膀胱癌から成る群から選択される、請求項１０記 載の方法。 １０．慢性関節リウマチの治療方法であって、このような治療を必要とする 哺乳動物に、プロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤の治療有効量を投与 することを含む上記治療方法。 １１．肺浮腫の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に 、プロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤の治療有効量を投与することを 含む上記治療方法。 １２．肺浮腫に関連したＶＥＧＦ刺激毛細血管透過性を抑制する方法であっ て、このような治療を必要とする哺乳動物に、プロテインキナーゼＣのβアイソ ザイム阻害剤の治療有効量を投与することを含む上記方法。 １３．ケロイドの治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物 に、プロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤の治療有効量を投与すること を含む上記治療方法。 １４．手根管症候群の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳 動物に、プロテインキナーゼＣのβアイソザイム阻害剤の治療有効量を投与する ことを含む上記治療方法。