KR102113310B1

KR102113310B1 - 암 세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 분리 방법

Info

Publication number: KR102113310B1
Application number: KR1020130105695A
Authority: KR
Inventors: 김연정; 한경연; 김유선; 문희성; 박동현; 박종면
Original assignee: 아주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2020-05-20
Also published as: KR20150026612A; US20150064721A1

Abstract

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 조성물 및 키트, 및 생물학적 시료 중 암 줄기 세포, 순환 종양 세포를 분리하는 방법, 및 전이성 암의 진단 방법이 제공된다. 이를 이용하면 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리를 효율적으로 분리 또는 검출하고, 전이성 암을 정확도와 민감도가 높게 진단할 수 있다.

Description

암 세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 분리 방법{Composition and kit for cancer cell, and method for separating cancer cell using the same}

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 조성물, 및 키트, 이를 이용한 생물학적 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 방법 및 전이성 암의 진단 방법에 관한 것이다.

종양의 전이는 고형암을 가진 환자에서 종양의 일부분이 떨어져 나와 혈액을 통해 체내의 다른 부분으로 이동하는 현상으로 암과 관련된 사망에서 중요한 부분을 차지하고 있다.

순환 종양 세포(Circulating Tumor cell: CTC)은 종양 침습(tumor invasion) 과정을 거쳐 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양세포를 말하고, 순환 종양 세포는 암의 전이 및 재발에 관여하는 인자로 알려져 있다. 특히, 순환 종양 세포는 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함하고 있을 가능성이 제기되고 있다.

순환 종양 세포 또는 다른 장기에 임상적으로 발견되지 않는 채로 존재하는 산재성 종양 세포(disseminated tumor cell: DTC)를 분리 또는 검출하여 전이성 암을 정확하고 신속하게 진단할 수 있다. 또한, CTC의 존재 유무에 따라 선별적인 항암제의 투여, 또는 CTC의 분자적 특성에 따른 맞춤형 약물 투여를 통해 약물 효능(efficacy)의 증진이 가능하다.

하지만, 이러한 혈중 종양 세포는 혈액 내에서 그 양이 매우 적고 세포 자체가 연약하여 이를 감지하고 그 수를 파악하기가 매우 어렵다. 따라서, 환자의 체내에 존재하는 혈중 종양 세포 또는 암 줄기 세포를 효율적으로 분리 또는 검출하고, 전이성 암을 정확도와 민감도가 높게 진단하는 방법이 필요하다.

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 조성물을 제공한다.

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 키트를 제공한다.

생물학적 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 방법을 제공한다.

전이성 암의 진단 방법을 제공한다.

디스코이딘 도메인 수용체(Discoidin domain receptor: DDR) 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암 줄기 세포(Cancer stem cell: CSC) 또는 순환 종양 세포(Circulating Tumor cell: CTC) 분리용 조성물이 제공된다.

상기 DDR 1 또는 그의 단편은 인간 또는 마우스의 DDR 1 또는 그의 단편일 수 있다. DDR 1은 세포외 도메인에 디스코이딘 I 모티프, 긴 세포막성 죽스타멤브레인(Juxtamembrane: JM) 영역, 및 NGF 수용체의 키나제 도메인과 약 45% 상동성이 있는 키나제 도메인을 포함하는 티로신 키나제 단백질이다. DDR 1은 CD167a로도 알려져 있다. DDR 1은 다양한 유형의 콜라겐에 의해 활성화되는 수용체 티로신 키나제이고, 세포 부착, 이동, 생존, 및 증식에 역할을 할 수 있다. 예를 들면, DDR 1은 GenBank Accession No. NP_001945의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, DDR 1은 GenBank Accession No. NM_001954의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다. DDR 1 유전자의 선택적(alternative) 스플라이싱에 의한 DDR 1 변이체가 알려져 있다.

상기 DDR 1의 단편은 DDR 1의 연속된 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말한다.

상기 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-DDR 1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱타머 또는 콜라겐일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체는 전장 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것이다. 예를 들면, 항원 결합 단편은 단일-사슬 가변 단편(single-chain variable fragment: scFv), (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다. 앱타머는 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩티드이다. 콜라겐은 동물의 뼈, 피부, 혈관, 치아, 근육 등에 존재하는 단백질로서, 결합 조직의 주요 성분이다. 콜라겐은 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 상기 콜라겐 V일 수 있다. 예를 들면, DDR 1은 콜라겐 I, III, IV, 또는 V와 결합할 수 있다.

상기 암 줄기 세포(Cancer stem cell: CSC)는 정상 줄기 세포의 특성, 예를 들면 자기-재생(self-renewal) 및 분화 능력을 갖는 암 세포이다. 암 줄기 세포는 종양 또는 혈액암(hematological cancer)에서 발견될 수 있다.

상기 순환 종양 세포(Circulating Tumor cell: CTC)는 종양 침윤(tumor invasion) 과정을 거쳐 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양세포이다. 순환 종양 세포는 암의 전이 및 재발에 관여하는 인자로 알려져 있다.

상기 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포는 상피-간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition: EMT)된 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포일 수 있다. 상피-간엽 전환은 상피 세포가 세포 극성 및 세포간 부착을 상실하고 간엽 세포로 전환되어 이동성 및 침윤성 세포가 되는 과정이다. 상피-간엽 전환은 중배엽 형성 및 신경관 형성을 포함하는 많은 발달 과정에 필수적인 과정이고, 상처 치료, 장기 섬유증(organ fibrosis), 및 암 진행 중 전이의 개시에 일어나는 것으로 알려져 있다.

상기 조성물은 상피 세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule: EpCAM) 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 더 포함할 수 있다. EpCAM은 상피에서 Ca² ⁺ 의존성 동형(homotypic) 세포간 부착을 매개하는 막관통 당단백질이다. EpCAM은 세포 신호 전달, 이동, 증식, 및 분화에 관련된 것으로 알려져 있다. EpCAM은 인간 또는 마우스 EpCAM일 수 있다. 예를 들면, EpCAM은 GenBank Accession No. NP_002345의 아미노산 서열(서열번호 3)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, EpCAM은 GenBank Accession No. NM_002354의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다. EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-EpCAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 전술한 바와 같다.

상기 조성물은 분리된 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 검출하는데 필요한 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 물질은 항체 또는 항원 결합 단편, 세포 염색 시약 등일 수 있다.

DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 키트가 제공된다.

DDR 1, DDR 1의 단편, DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질, 암 줄기 세포, 순환 종양 세포는 전술한 바와 같다.

상기 키트는 분리된 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 검출하는데 필요한 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 물질은 항체 또는 항원 결합 단편, 세포 염색 시약 등일 수 있다.

개체로부터 분리된 생물학적 시료와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포에 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계; 및

반응 혼합물로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 방법이 제공된다.

상기 DDR 1, DDR 1의 단편, 암 줄기 세포, 및 순환 종양 세포는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포에 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계를 포함한다.

상기 개체는 예를 들면 인간을 포함한 포유 동물일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-DDR 1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱타머 또는 콜라겐일 수 있다. 항-DDR 1 항체, 그의 항원 결합 단편, 앱타머 및 콜라겐은 전술한 바와 같다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 지지체에 고정화된 것일 수 있다. 지지체는 고체 지지체일 수 있다. 고체 지지체는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 인큐베이션은 상온 또는 4℃에서 수행될 수 있다. 인큐베이션은 표적 세포와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질이 충분히 결합할 수 있는 시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들면, 10분 내지 밤새 인큐베이션될 수 있다.

상기 방법은 반응 혼합물로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 반응 혼합물은 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 복합체가 포함된 것일 수 있다.

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포의 분리는 생물학적 시료로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 복합체를 분리하는 것을 포함한다. 또한, 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포의 분리는 상기 복합체로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 것을 포함한다. 상기 분리는 미세여과, 원심분리, 미세유동, 면역염색(immunostaining), 면역침강(immunoprecipitation), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 유세포 분석(flow cytometry), FACS(fluorescense activated cell sorting), 또는 이들의 조합을 포함한다.

상기 방법은 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 복합체를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포와, DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질이 결합한 복합체로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 떼어내는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포에 EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개체, 생물학적 시료, EpCAM, EpCAM의 단편, EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질, 인큐베이션, 암 줄기 세포, 및 순환 종양 세포는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 분리된 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 검출 방법은 전자 현미경 관찰, 미세여과, 원심분리, 미세유동, 면역분석, 면역염색, 면역침강, ELISA, 유세포 분석, 크로마토그래피, FACS 또는 이들의 조합을 포함한다. 검출 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 전기 영동, 노던 블로팅, 웨스턴 블로팅, 또는 이들의 조합일 수 있다.

개체로부터 분리된 생물학적 시료와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포에 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계;

반응 혼합물로부터 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포를 분리하는 단계; 및

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포가 검출된 경우 상기 개체를 전이성 암에 걸렸거나 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암의 진단 방법이 제공된다.

전이성 암은 암이 발병한 하나의 기관에서 림프절을 포함한 다른 기관으로 암이 전이되는 암이다. 상기 암은 암이 발병한 기관에 존재하는 암은 원발암(primary cancer)이다. 전이는 전이되는 조직에 따라 뇌 전이, 뼈 전이, 간 전이, 또는 폐 전이일 수 있다. 전이성 암은 악성 종양일 수 있다. 악성 종양은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 피부암, 또는 이들의 조합일 수 있다.

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포가 검출된 경우 상기 개체를 전이성 암에 걸렸거나 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리용 조성물 및 키트, 및 생물학적 시료 중 암 줄기 세포, 순환 종양 세포를 분리하는 방법, 및 전이성 암의 진단 방법을 이용하면 암 줄기 세포 또는 순환 종양 세포 분리를 효율적으로 분리 또는 검출하고, 전이성 암을 정확도와 민감도가 높게 진단할 수 있다.

도 1은 세포주 MCF7, MDA-MB231, 및 MCF7와 MDA-MB231의 혼합에 대한 비드 결합 효율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 상피-간엽 전환을 유도한 암세포의 마이크로어레이 결과를 보여준다.
도 3a 내지 도 3c은 각각 상피-간엽 전환을 유도한 유방암 세포, 폐암 세포, 및 전립선암 세포의 웨스턴 블로팅 결과를 보여주는 사진이다.
도 4a 및 4b는 각각 비드 결합 효율 및 유방암 세포의 회수율의 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유방암 세포주와 항- EpCAM 항체가 접합된 비드의 결합 효율 확인

1-1. 항- EpCAM 항체가 접합된 비드의 준비

직경 1 또는 3 ㎛의 COOH 멜라민 비드(Sigma)를 EDC(N-히드록시숙신이미드)/NHS(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드)로 처리한 후, 비드를 PBS 버퍼에 첨가하였다. 반응물에 250 ㎍/㎖의 항-EpCAM 항체(R&D system) 또는 항-DDR1 항체(Abcam)를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 상온에서 천천히 흔들면서 인큐베이션시켰다. 반응물을 PBS 버퍼로 상온에서 세척하고 2%(w/v) BSA에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 항-EpCAM 항체 또는 항-DDR1 항체가 접합된 비드를 준비하였다.

1-2. 유방암 세포주 MCF7 또는 MDA - MB231 과 항- EpCAM 항체가 결합된 비드의 결합 효율 확인

EpCAM이 고발현되는 유방암 세포주 MCF7(ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입) 또는 EpCAM이 저발현되는 유방암 세포주 MDA-MB231(ATCC)와, 항-EpCAM 항체가 결합된 비드의 결합 효율을 확인하였다.

1x10⁵개의 유방암 세포주 MCF7 및 DMDA-MB231을 각각 에오신(Sigma) 및 플루오로세인(Sigma)과 인큐베이션시켜, 세포주 MCF7 및 DMDA-MB231을 각각 빨간색 및 녹색 형광으로 염색하였다.

염색된 세포주 MCF7 및 DMDA-MB231을 DMEM 배지에 가하여 부유시키고, 실시예 1-1에서 제조한 20 ㎕의 항-EpCAM 항체가 접합된 비드를 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 형광 현미경(Olympus IX-81)을 사용하여 비드와 세포의 결합와 결합된 이미지를 30장 얻고, Image J(NIH) 프로그램을 이용하여 전체세포 표면에서 비드가 붙은 영역을 계산하여 비드와 세포주의 결합 효율을 산출하였다. 빨간색 형광을 띄는 MCF7은 다량의 EpCAM이 발현되어 있으나, 녹색 형광을 띄는 MDA-MB231에는 EpCAM이 발현하지 않으므로 항 EpCAM 비드와의 효율을 대비됨을 그림을 통해 확인할 수 있었다. 이를 통해 세포주 MCF7, MDA-MB231, 및 MCF7와 MDA-MB231의 혼합에 대한 비드 결합 효율을 나타낸 그래프를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, MCF7 세포주와 항-EpCAM 항체가 접합된 비드의 결합 효율은 약 93%였고, MDA-MB231 세포주와 항-EpCAM 항체가 결합된 비드의 결합 효율은 약 0%였다. 따라서, EpCAM 저발현 세포를 포함하는 이질적인 세포의 집단을 검출 또는 분리하기 위해, 항-EpCAM 항체 외에 다른 마커에 특이적으로 결합하는 항체가 필요함을 확인하였다.

실시예 2. 유방암, 폐암, 또는 전립선암 세포주에 인위적인 상피- 간엽 전환의 유도 및 상피- 간엽 전환된 암세포주에서 DDR1 의 발현 확인

2-1. 유방암, 폐암, 또는 전립선암 세포주에 인위적인 상피- 간엽 전환의 유도

혈액 세포 HL60, THP-1, 및 U937, 폐암 세포주 HCC827 및 H1650, 및 전립선암 세포주 Du145를 10%(v/v) FBS가 포함된 RPMI1640 배지에, 유방암 세포주 MCF7은 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지에 배양하였다. 유방암 세포주 MCF7, 폐암 세포주 HCC827 및 H1650, 및 전립선암 세포주 Du145 및 PC3에 상피-간엽 전환을 유도하기 위하여, DMEM 및 10% FBS의 존재하에서 배양하는 기존의 부착(attachment) 배양 방법을 사용하지 않고, 하기의 3차원 배양(mommosphere culture) 방법을 이용하였다.　배양 배지는 DMEM-F12, 1x B27, 20 ng/㎖의 FGF, 20 ng/㎖의 EGF, 및 5 ㎍/㎖의 인슐린을 포함하는 배지를 사용하였다. 100 ㎜ 배양 접시에 2x10⁵ 개의세포를 접종한 후, 37℃에서 24시간 내지 3주일 배양하였다.

2-2. 상피- 간엽 전환 유도의 확인 및 상피- 간엽 전환된 세포주에서 DDR1 의 발현 확인

실시예 2-1에서 배양된 세포로부터 mRNA를 분리하여 역전사시킨 후, 마이크로 어레이를 수행하였다. Illumina^®TotalPrep™ RNA amplification kit(Ambion Inc)를 사용하여 샘플당 500 ng의 총 RNA를 cRNA로 전환시키고 human HT12-v4 IlluminaBeadchip gene expression array(Illumina)에 혼성화시켰다. Illumina Bead Array Reader (Illumina)를 사용하여 형광 신호를 스캔하고 분석하였다. 마이크로어레이 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, snail 유전자, twist 유전자, fibronectin 유전자, 및 DDR1 유전자의 발현이 증가된 것을 확인하였다. snail 유전자, twist 유전자, fibronectin 유전자는 상피-간엽 전환 유도시 발현이 증가한다고 알려진 마커이므로 상기 세포주들이 상피-간엽 전환되었음을 확인하였고, 또한 상피-간엽 전환된 세포에서 DDR1 유전자의 발현이 증가한다는 것을 확인하였다.

한편, 실시예 2-1에서 배양된 세포로부터 단백질을 분리하여 전기영동시켰다. 전기영동된 겔을 막으로 트랜스퍼시키고, 항-Snail 항체(abcam), 항-ALDH1 항체(abcam), 항-DDR1 항체(abcam), 항-튜불린 항체(abcam), 항-Slug 항체(abcam), 및 항-액틴 항체(Cell signaling)을 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 웨스턴 블로팅 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, 상피-간엽 전환 유도된 폐암 세포에서 Snail 단백질, ALDH1 단백질, 및 DDR1 단백질의 양이 증가하였고, 상피-간엽 전환 유도된 유방암 세포 및 전립선암 세포에서 DDR1 단백질의 양이 증가하였다. Snail 단백질은 상피-간엽 전환의 마커이고 ALDH1 단백질은 암 줄기 세포의 마커로 알려져 있으므로, 상피-간엽 전환된 암세포와 암 줄기 세포에서 DDR1 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다.

도 2, 및 도 3a 내지 도 3c의 결과를 통해, 상피-간엽 전환된 암세포 또는 암 줄기 세포를 분리하는데 DDR1 단백질을 분리용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 항- DDR1 항체가 접합된 비드를 사용한 혈액 중 상피-간엽 전환된 유방암 세포의 분리

3-1. 항- DDR1 항체가 접합된 비드의 제조

실시예 1-1에 기재된 비드의 제작 방법을 사용하여, 항-DDR1 항체(abcam)이 접합된 비드를 제작하였다.

3-2. 혈액 중 상피- 간엽 전환된 유방암 세포의 분리

5 ㎖의 건강한 사람의 혈액에 100개의 상피-간엽 전환시키지 않은 유방암 세포 또는 실시예 2-1에서 제조된 상피-간엽 전환된 유방암 세포를 혼합하였다.

한편, 실시예 1-1에서 제조한 항-EpCAM 항체가 접합된 비드 및 실시예 3-1에서 제조한 항-DDR1 항체가 접합된 비드를 준비하였다.

유방암 세포가 포함된 혈액을 세 그룹으로 나누고, 각 그룹에 각각 100개의 세포를 넣고, 1x10⁷개의 항-EpCAM 항체가 접합된 비드, 1x10⁷개의 항-DDR1 항체가 접합된 비드, 및 0.5x10⁷개의 항-EpCAM 항체가 접합된 비드 및 0.5x10⁷개의 항-DDR1 항체가 접합된 비드를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 반응물을 세척하였다. 실시예 1-2에 기재된 방법에 따라, 각 그룹의 비드 결합 효율 및 유방암 세포의 회수율을 산출하고, 그 결과를 각각 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 상피 간엽 전환시킨 유방암 세포는 항-EpCAM 항체가 접합된 비드 또는 항-DDR1 항체가 접합된 비드의 결합 효율이 각각 약 50% 이상이었고, 항-EpCAM 항체가 접합된 비드 및 항-DDR1 항체가 접합된 비드를 혼합하여 사용한 경우 결합 효율이 약 70%였다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상피 간엽 전환되지 않은 유방암 세포는 회수율이 낮으나, 상피 간엽 전환 유도된 유방암 세포는 항-DDR1 항체가 접합된 비드가 결합하여 회수율이 증가하였다.

도 4a 및 4b의 결과를 통해, 항-EpCAM 항체와 항-DDR1 항체를 병행사용하는 경우 비드 결합 효율의 증가와 함께 혈액 중 암 세포의 회수율도 현저히 증가함을 확인하였고, DDR1의 분리용 마커로서의 이용가능성을 확인하였다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Composition and kit for cancer cell, and method for separating cancer cell using the same <130> PN101770 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 876 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of DDR1 <400> 1 Met Gly Pro Glu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 Ser Gly Asp Ala Asp Met Lys Gly His Phe Asp Pro Ala Lys Cys Arg 20 25 30 Tyr Ala Leu Gly Met Gln Asp Arg Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ile Ser 35 40 45 Ala Ser Ser Ser Trp Ser Asp Ser Thr Ala Ala Arg His Ser Arg Leu 50 55 60 Glu Ser Ser Asp Gly Asp Gly Ala Trp Cys Pro Ala Gly Ser Val Phe 65 70 75 80 Pro Lys Glu Glu Glu Tyr Leu Gln Val Asp Leu Gln Arg Leu His Leu 85 90 95 Val Ala Leu Val Gly Thr Gln Gly Arg His Ala Gly Gly Leu Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Arg Ser Tyr Arg Leu Arg Tyr Ser Arg Asp Gly Arg Arg 115 120 125 Trp Met Gly Trp Lys Asp Arg Trp Gly Gln Glu Val Ile Ser Gly Asn 130 135 140 Glu Asp Pro Glu Gly Val Val Leu Lys Asp Leu Gly Pro Pro Met Val 145 150 155 160 Ala Arg Leu Val Arg Phe Tyr Pro Arg Ala Asp Arg Val Met Ser Val 165 170 175 Cys Leu Arg Val Glu Leu Tyr Gly Cys Leu Trp Arg Asp Gly Leu Leu 180 185 190 Ser Tyr Thr Ala Pro Val Gly Gln Thr Met Tyr Leu Ser Glu Ala Val 195 200 205 Tyr Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Asp Gly His Thr Val Gly Gly Leu Gln 210 215 220 Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Leu Ala Asp Gly Val Val Gly Leu Asp Asp 225 230 235 240 Phe Arg Lys Ser Gln Glu Leu Arg Val Trp Pro Gly Tyr Asp Tyr Val 245 250 255 Gly Trp Ser Asn His Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Val Glu Met Glu Phe 260 265 270 Glu Phe Asp Arg Leu Arg Ala Phe Gln Ala Met Gln Val His Cys Asn 275 280 285 Asn Met His Thr Leu Gly Ala Arg Leu Pro Gly Gly Val Glu Cys Arg 290 295 300 Phe Arg Arg Gly Pro Ala Met Ala Trp Glu Gly Glu Pro Met Arg His 305 310 315 320 Asn Leu Gly Gly Asn Leu Gly Asp Pro Arg Ala Arg Ala Val Ser Val 325 330 335 Pro Leu Gly Gly Arg Val Ala Arg Phe Leu Gln Cys Arg Phe Leu Phe 340 345 350 Ala Gly Pro Trp Leu Leu Phe Ser Glu Ile Ser Phe Ile Ser Asp Val 355 360 365 Val Asn Asn Ser Ser Pro Ala Leu Gly Gly Thr Phe Pro Pro Ala Pro 370 375 380 Trp Trp Pro Pro Gly Pro Pro Pro Thr Asn Phe Ser Ser Leu Glu Leu 385 390 395 400 Glu Pro Arg Gly Gln Gln Pro Val Ala Lys Ala Glu Gly Ser Pro Thr 405 410 415 Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Val Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Leu 420 425 430 Ile Ile Ala Leu Met Leu Trp Arg Leu His Trp Arg Arg Leu Leu Ser 435 440 445 Lys Ala Glu Arg Arg Val Leu Glu Glu Glu Leu Thr Val His Leu Ser 450 455 460 Val Pro Gly Asp Thr Ile Leu Ile Asn Asn Arg Pro Gly Pro Arg Glu 465 470 475 480 Pro Pro Pro Tyr Gln Glu Pro Arg Pro Arg Gly Asn Pro Pro His Ser 485 490 495 Ala Pro Cys Val Pro Asn Gly Ser Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Met Glu 500 505 510 Pro Glu Lys Pro Gly Ala Pro Leu Leu Pro Pro Pro Pro Gln Asn Ser 515 520 525 Val Pro His Tyr Ala Glu Ala Asp Ile Val Thr Leu Gln Gly Val Thr 530 535 540 Gly Gly Asn Thr Tyr Ala Val Pro Ala Leu Pro Pro Gly Ala Val Gly 545 550 555 560 Asp Gly Pro Pro Arg Val Asp Phe Pro Arg Ser Arg Leu Arg Phe Lys 565 570 575 Glu Lys Leu Gly Glu Gly Gln Phe Gly Glu Val His Leu Cys Glu Val 580 585 590 Asp Ser Pro Gln Asp Leu Val Ser Leu Asp Phe Pro Leu Asn Val Arg 595 600 605 Lys Gly His Pro Leu Leu Val Ala Val Lys Ile Leu Arg Pro Asp Ala 610 615 620 Thr Lys Asn Ala Arg Asn Asp Phe Leu Lys Glu Val Lys Ile Met Ser 625 630 635 640 Arg Leu Lys Asp Pro Asn Ile Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys Val Gln 645 650 655 Asp Asp Pro Leu Cys Met Ile Thr Asp Tyr Met Glu Asn Gly Asp Leu 660 665 670 Asn Gln Phe Leu Ser Ala His Gln Leu Glu Asp Lys Ala Ala Glu Gly 675 680 685 Ala Pro Gly Asp Gly Gln Ala Ala Gln Gly Pro Thr Ile Ser Tyr Pro 690 695 700 Met Leu Leu His Val Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Ala Thr Leu Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu 725 730 735 Val Gly Glu Asn Phe Thr Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Ser Arg 740 745 750 Asn Leu Tyr Ala Gly Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Gly Arg Ala Val Leu 755 760 765 Pro Ile Arg Trp Met Ala Trp Glu Cys Ile Leu Met Gly Lys Phe Thr 770 775 780 Thr Ala Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Leu Trp Glu Val Leu 785 790 795 800 Met Leu Cys Arg Ala Gln Pro Phe Gly Gln Leu Thr Asp Glu Gln Val 805 810 815 Ile Glu Asn Ala Gly Glu Phe Phe Arg Asp Gln Gly Arg Gln Val Tyr 820 825 830 Leu Ser Arg Pro Pro Ala Cys Pro Gln Gly Leu Tyr Glu Leu Met Leu 835 840 845 Arg Cys Trp Ser Arg Glu Ser Glu Gln Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu 850 855 860 His Arg Phe Leu Ala Glu Asp Ala Leu Asn Thr Val 865 870 875 <210> 2 <211> 3840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding DDR1 <400> 2 gtcttcccct cgtgggccct gagcgggact gcagccagcc ccctggggcg ccagctttgg 60 aggcccccga cagctgctct cgggagccgc ctcccgacac ccgagccccg ccggcgcctc 120 ccgctcccgg ctcccggctc ctggctccct ccgcctcccc cgcccctcgc cccgccgccg 180 aagaggcccc gctcccgggt cggacgcctg ggtctgccgg gaagagcgat gagaggtgtc 240 tgaaggtggc tattcactga gcgatggggt tggacttgaa ggaatgccaa gagatgctgc 300 ccccaccccc ttaggcccga gggatcagga gctatgggac cagaggccct gtcatcttta 360 ctgctgctgc tcttggtggc aagtggagat gctgacatga agggacattt tgatcctgcc 420 aagtgccgct atgccctggg catgcaggac cggaccatcc cagacagtga catctctgct 480 tccagctcct ggtcagattc cactgccgcc cgccacagca ggttggagag cagtgacggg 540 gatggggcct ggtgccccgc agggtcggtg tttcccaagg aggaggagta cttgcaggtg 600 gatctacaac gactgcacct ggtggctctg gtgggcaccc agggacggca tgccgggggc 660 ctgggcaagg agttctcccg gagctaccgg ctgcgttact cccgggatgg tcgccgctgg 720 atgggctgga aggaccgctg gggtcaggag gtgatctcag gcaatgagga ccctgaggga 780 gtggtgctga aggaccttgg gccccccatg gttgcccgac tggttcgctt ctacccccgg 840 gctgaccggg tcatgagcgt ctgtctgcgg gtagagctct atggctgcct ctggagggat 900 ggactcctgt cttacaccgc ccctgtgggg cagacaatgt atttatctga ggccgtgtac 960 ctcaacgact ccacctatga cggacatacc gtgggcggac tgcagtatgg gggtctgggc 1020 cagctggcag atggtgtggt ggggctggat gactttagga agagtcagga gctgcgggtc 1080 tggccaggct atgactatgt gggatggagc aaccacagct tctccagtgg ctatgtggag 1140 atggagtttg agtttgaccg gctgagggcc ttccaggcta tgcaggtcca ctgtaacaac 1200 atgcacacgc tgggagcccg tctgcctggc ggggtggaat gtcgcttccg gcgtggccct 1260 gccatggcct gggaggggga gcccatgcgc cacaacctag ggggcaacct gggggacccc 1320 agagcccggg ctgtctcagt gccccttggc ggccgtgtgg ctcgctttct gcagtgccgc 1380 ttcctctttg cggggccctg gttactcttc agcgaaatct ccttcatctc tgatgtggtg 1440 aacaattcct ctccggcact gggaggcacc ttcccgccag ccccctggtg gccgcctggc 1500 ccacctccca ccaacttcag cagcttggag ctggagccca gaggccagca gcccgtggcc 1560 aaggccgagg ggagcccgac cgccatcctc atcggctgcc tggtggccat catcctgctc 1620 ctgctgctca tcattgccct catgctctgg cggctgcact ggcgcaggct cctcagcaag 1680 gctgaacgga gggtgttgga agaggagctg acggttcacc tctctgtccc tggggacact 1740 atcctcatca acaaccgccc aggtcctaga gagccacccc cgtaccagga gccccggcct 1800 cgtgggaatc cgccccactc cgctccctgt gtccccaatg gctctgccta cagtggggac 1860 tatatggagc ctgagaagcc aggcgccccg cttctgcccc cacctcccca gaacagcgtc 1920 ccccattatg ccgaggctga cattgttacc ctgcagggcg tcaccggggg caacacctat 1980 gctgtgcctg cactgccccc aggggcagtc ggggatgggc cccccagagt ggatttccct 2040 cgatctcgac tccgcttcaa ggagaagctt ggcgagggcc agtttgggga ggtgcacctg 2100 tgtgaggtcg acagccctca agatctggtt agtcttgatt tcccccttaa tgtgcgtaag 2160 ggacaccctt tgctggtagc tgtcaagatc ttacggccag atgccaccaa gaatgccagg 2220 aatgatttcc tgaaagaggt gaagatcatg tcgaggctca aggacccaaa catcattcgg 2280 ctgctgggcg tgtgtgtgca ggacgacccc ctctgcatga ttactgacta catggagaac 2340 ggcgacctca accagttcct cagtgcccac cagctggagg acaaggcagc cgagggggcc 2400 cctggggacg ggcaggctgc gcaggggccc accatcagct acccaatgct gctgcatgtg 2460 gcagcccaga tcgcctccgg catgcgctat ctggccacac tcaactttgt acatcgggac 2520 ctggccacgc ggaactgcct agttggggaa aatttcacca tcaaaatcgc agactttggc 2580 atgagccgga acctctatgc tggggactat taccgtgtgc agggccgggc agtgctgccc 2640 atccgctgga tggcctggga gtgcatcctc atggggaagt tcacgactgc gagtgacgtg 2700 tgggcctttg gtgtgaccct gtgggaggtg ctgatgctct gtagggccca gccctttggg 2760 cagctcaccg acgagcaggt catcgagaac gcgggggagt tcttccggga ccagggccgg 2820 caggtgtacc tgtcccggcc gcctgcctgc ccgcagggcc tatatgagct gatgcttcgg 2880 tgctggagcc gggagtctga gcagcgacca cccttttccc agctgcatcg gttcctggca 2940 gaggatgcac tcaacacggt gtgaatcaca catccagctg cccctccctc agggagcgat 3000 ccaggggaag ccagtgacac taaaacaaga ggacacaatg gcacctctgc ccttcccctc 3060 ccgacagccc atcacctcta atagaggcag tgagactgca ggtgggctgg gcccacccag 3120 ggagctgatg ccccttctcc ccttcctgga cacactctca tgtccccttc ctgttcttcc 3180 ttcctagaag cccctgtcgc ccacccagct ggtcctgtgg atgggatcct ctccaccctc 3240 ctctagccat cccttgggga agggtgggga gaaatatagg atagacactg gacatggccc 3300 attggagcac ctgggcccca ctggacaaca ctgattcctg gagaggtggc tgcgccccca 3360 gcttctctct ccctgtcaca cactggaccc cactggctga gaatctgggg gtgaggagga 3420 caagaaggag aggaaaatgt ttccttgtgc ctgctcctgt acttgtcctc agcttgggct 3480 tcttcctcct ccatcacctg aaacactgga cctgggggta gccccgcccc agccctcagt 3540 cacccccact tcccacttgc agtcttgtag ctagaacttc tctaagccta tacgtttctg 3600 tggagtaaat attgggattg gggggaaaga gggagcaacg gcccatagcc ttggggttgg 3660 acatctctag tgtagctgcc acattgattt ttctataatc acttggggtt tgtacatttt 3720 tggggggaga gacacagatt tttacactaa tatatggacc tagcttgagg caattttaat 3780 cccctgcact aggcaggtaa taataaaggt tgagttttcc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 3840 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of EpCAM <400> 3 Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr 20 25 30 Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys 35 40 45 Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala 50 55 60 Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg 65 70 75 80 Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 85 90 95 Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly 100 105 110 Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp 115 120 125 Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile 130 135 140 Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys 145 150 155 160 Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu 165 170 175 Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr 180 185 190 Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp 195 200 205 Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu 225 230 235 240 Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala 245 250 255 Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile 260 265 270 Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile 275 280 285 Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu 290 295 300 Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310 <210> 4 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding EpCAM <400> 4 aactgcagcg ccggggctgg gggaggggag cctactcact cccccaactc ccgggcggtg 60 actcatcaac gagcaccagc ggccagaggt gagcagtccc gggaaggggc cgagaggcgg 120 ggccgccagg tcgggcaggt gtgcgctccg ccccgccgcg cgcacagagc gctagtcctt 180 cggcgagcga gcaccttcga cgcggtccgg ggaccccctc gtcgctgtcc tcccgacgcg 240 gacccgcgtg ccccaggcct cgcgctgccc ggccggctcc tcgtgtccca ctcccggcgc 300 acgccctccc gcgagtcccg ggcccctccc gcgcccctct tctcggcgcg cgcgcagcat 360 ggcgcccccg caggtcctcg cgttcgggct tctgcttgcc gcggcgacgg cgacttttgc 420 cgcagctcag gaagaatgtg tctgtgaaaa ctacaagctg gccgtaaact gctttgtgaa 480 taataatcgt caatgccagt gtacttcagt tggtgcacaa aatactgtca tttgctcaaa 540 gctggctgcc aaatgtttgg tgatgaaggc agaaatgaat ggctcaaaac ttgggagaag 600 agcaaaacct gaaggggccc tccagaacaa tgatgggctt tatgatcctg actgcgatga 660 gagcgggctc tttaaggcca agcagtgcaa cggcacctcc atgtgctggt gtgtgaacac 720 tgctggggtc agaagaacag acaaggacac tgaaataacc tgctctgagc gagtgagaac 780 ctactggatc atcattgaac taaaacacaa agcaagagaa aaaccttatg atagtaaaag 840 tttgcggact gcacttcaga aggagatcac aacgcgttat caactggatc caaaatttat 900 cacgagtatt ttgtatgaga ataatgttat cactattgat ctggttcaaa attcttctca 960 aaaaactcag aatgatgtgg acatagctga tgtggcttat tattttgaaa aagatgttaa 1020 aggtgaatcc ttgtttcatt ctaagaaaat ggacctgaca gtaaatgggg aacaactgga 1080 tctggatcct ggtcaaactt taatttatta tgttgatgaa aaagcacctg aattctcaat 1140 gcagggtcta aaagctggtg ttattgctgt tattgtggtt gtggtgatag cagttgttgc 1200 tggaattgtt gtgctggtta tttccagaaa gaagagaatg gcaaagtatg agaaggctga 1260 gataaaggag atgggtgaga tgcataggga actcaatgca taactatata atttgaagat 1320 tatagaagaa gggaaatagc aaatggacac aaattacaaa tgtgtgtgcg tgggacgaag 1380 acatctttga aggtcatgag tttgttagtt taacatcata tatttgtaat agtgaaacct 1440 gtactcaaaa tataagcagc ttgaaactgg ctttaccaat cttgaaattt gaccacaagt 1500 gtcttatata tgcagatcta atgtaaaatc cagaacttgg actccatcgt taaaattatt 1560 tatgtgtaac attcaaatgt gtgcattaaa tatgcttcca cagtaaaatc tgaaaaactg 1620 atttgtgatt gaaagctgcc tttctattta cttgagtctt gtacatacat acttttttat 1680 gagctatgaa ataaaacatt ttaaactgaa tttcttaaaa aaaaaaaaaa a 1731

Claims

디스코이딘 도메인 수용체(Discoidin domain receptor: DDR) 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 상피-간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition: EMT)된 순환 종양 세포(Circulating Tumor cell: CTC) 분리용 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-DDR 1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱타머 또는 콜라겐인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 상피 세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule: EpCAM) 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 더 포함하는 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-EpCAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 조성물.
DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는, 상피-간엽 전환된 순환 종양 세포 분리용 키트.
개체로부터 분리된 생물학적 시료와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 순환 종양 세포에 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계; 및
반응 혼합물로부터 순환 종양 세포를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 중 순환 종양 세포를 분리하는 방법으로,
상기 순환 종양 세포는 상피-간엽 전환된 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 항-DDR 1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱타머 또는 콜라겐인 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 지지체에 고정화된 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 순환 종양 세포에 EpCAM 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
삭제
개체로부터 분리된 생물학적 시료와 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 인큐베이션하여, 시료 중 순환 종양 세포에 DDR 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 결합시키는 단계;
반응 혼합물로부터 순환 종양 세포를 분리하는 단계; 및
순환 종양 세포가 검출된 경우 상기 개체를 전이성 암에 걸렸거나 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로,
상기 순환 종양 세포는 상피-간엽 전환된 것인 방법.