JPH11507529A

JPH11507529A - サイトカインの高親和性核酸リガンド

Info

Publication number: JPH11507529A
Application number: JP9501840A
Authority: JP
Inventors: タセット，ダイアン; パグラティス，ニコス; ジャヤセナ，スメドハ; ゴールド，ラリー
Original assignee: ネクスターファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-07-06
Also published as: EP0830367A4; EP0830367A1; CA2223003A1; WO1996040717A1

Abstract

(57)【要約】サイトカインに対する高親和性核酸リガンドの同定および製造方法、ならびにそれによって得られるリガンドが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】サイトカインの高親和性核酸リガンド発明の分野本明細書には、サイトカインに対する高親和性核酸リガンドの同定および製造方法が記載される。このような核酸リガンドの同定に本発明で用いられる方法はＳＥＬＥＸ（セレックス）と呼ばれ、これは指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化：Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment の頭文字による造語である。本発明はとくに以下のサイトカイン：ＩＦＮ-γ，ＩＬ-４，ＩＬ-10，ＴＮＦαおよびＲＡＮＴＥＳの高親和性核酸リガンドの同定のための方法を包含する。さらに、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-４，ＩＬ-10 およびＴＮＦαのＲＮＡリガンドが開示される。またＲＡＮＴＥＳのＤＮＡリガンドも開示される。ピリミジンの2'- 位置が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドの特定の例が提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは医薬または診断薬として有用である。発明の背景サイトカインは、細胞シグナリング／細胞相互作用を誘発する小タンパク質の多様なグループである。これらは、標的細胞の表面に発現されるその特異的な受容体を介して生物学的機能を発揮する。サイトカインはイムノ／ヘマトポイエチン、インターフェロン、腫瘍壊死因子 (ＴＮＦ)-関連分子、およびケモカインを包含する数グループに亜分類できる。代表的なイムノ／ヘマトポイエチンにはエリスロポイエチン（ＥＰＯ），顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），白血病阻止因子（ＬＩＦ），オンコスタチン−Ｍ（ＯＳＭ），絨毛性神経栄養因子（ＣＮＴＦ），成長ホルモン（ＧＨ），プロラクチン（ＰＲＬ），インターロイキン（ＩＬ）-2，ＩＬ-3，ＩＬ-4，ＩＬ-5，ＩＬ-6，ＩＬ-7 ，ＩＬ-9，ＩＬ-10 およびＩＬ-12 がある。代表的なインターフェロン（ＩＦＮ）にはＩＦＮα，ＩＦＮβおよびＩＦＮ-γが包含される。代表的なＴＮＦファミリーメンバーにはＴＮＦα，インターフェロン（ＩＦＮ）β，ｇｐ³⁹（ＣＤ40- Ｌ），ＣＤ27-Ｌ，ＣＤ30-Ｌ，および神経成長因子（ＮＧＦ）が包含される。代表的ケモカインは血小板因子（ＰＦ）４，血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ），ｇｒｏα，ＭＩＧ，ＥＮＡ-78，マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）１ α，ＭＩＰ１β，単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）-１，Ｉ-309，ＨＣ14，Ｃ10 ，Regulated on Activation，Normal T-cell Expressed，and Secreted（ＲＡＮＴＥＳ），およびＩＬ-8 である。ＩＮＦ−γ ＩＮＦ−γは、30年前に抗ウイルス剤としてはじめて記載された（Wheelock， 1965）。それ以来、このタンパク質は、実際に、免疫および炎症応答のすべての相の調節に重要な役割を果たす著しく多面的なサイトカインであることが明らかにされてきた。マウスＩＮＦ-γ（Gray & Goeddel，1983）およびヒトＩＮＦ-γ （Gray & Goeddel，1982）のｃＤＮＡがクローン化され、配列決定され、特性が解明されている。ＩＮＦ-γは、細胞をウイルス感染から保護する能力によって関連するタンパク質のファミリーのメンバーである。このファミリーは様々な基準によって３つの異なるクラスに分割されてきた。すなわちＩＦＮ-α（最初はＩ型ＩＦＮまたは白血球ＩＦＮと呼ばれた），ＩＦＮ-β（最初同じくＩ型ＩＦＮまたは線維芽細胞ＩＦＮと呼ばれた）およびＩＦＮ-γ（最初はII型ＩＦＮまたは免疫ＩＦＮと呼ばれた）である。ＩＦＮ-γはＩ型インターフェロンとは遺伝子およびタンパク質の両レベルで類似しない（Grayら，1982）。ヒトおよびマウスＩＦＮ-γ タンパク質は、ヒトおよびマウス細胞に対する結合および活性化能力において厳格な種特異性を発揮する。これは、少なくとも一部は、ｃＤＮＡおよびアミノ酸の両レベルでのそれらのあまり高くないホモロジー（それぞれ60％および40％）によるものである。ＩＮＦ-γは刺激の独特なセットにより、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によってのみ産生される。ＩＮＦ-γのヒトおよびマウス遺伝子はサイズ 6 kb で、それぞれ４個のエキソンと３個のイントロンを含有する。これらの遺伝子はヒト染色体12（12q24.1）およびマウス染色体10に局在する。ヒト遺伝子が活性化されると、166 アミノ酸のポリペプチドをコードする 1.2 kb のｍＲＮＡの転写が誘導される（Derynckら，1982）。ヒトタンパク質は 23 残基のアミノ末端疎水性シグナル配列を含有し、これは蛋白分解的に除去されて推定分子量 17 kDa の陽性に荷電した 143 残基成熟ポリペプチドを与える。陽性に荷電したカルボキシ末端の翻訳後酵素分解の多様性（Rinderknechtら，1984）が完全な成熟分子の荷電不均一性の原因である。６種の異なるカルボキシ末端を有するタンパク質が天然にも、また組換え型ＩＮＦ-γにも検出されている。２つのポリペプチドが自己会合して見掛けの分子量 34 kDa のホモダイマーを形成する（Scahillら，1983）。ホモダイマーがこのタンパク質の生物活性型である。成熟ヒトＩＮＦ-γはシステイン残基を含まないので、ホモダイマーは完全な非共有結合力により互いに保持されている。ネイティブなタンパク質のこの四次元構造がその極端な熱（タンパク質は56℃以上で変性する）ならびにｐＨ（ｐＨ値 4.0 以下および 9.0 以上では活性は急速に消失する）に対する特徴的感受性を説明するものである（Mulkerrin & Wetzel，1989）。ＩＮＦ-γの著しい多面的作用は単一型のＩＮＦ-γ受容体への結合を介して誘導される。マウスおよびヒトＩＮＦ-γ受容体の構造および機能が報告されている（Schreiberら，1992）。これらの受容体タンパク質はほとんどすべての細胞（赤血球を除く）および血小板で発現される（Andersonら，1982）。受容体は高い親和性（Ｋ_d＝10^-9〜10^-10 Ｍ）でリガンドを結合し、大部分の細胞において中等度のレベル（200〜25,000 部位/細胞）で発現する。細胞表面の受容体にＩＮＦ-γが結合すると、受容体の細胞内ドメインは、セリンおよびスレオニン残基で、リン酸化される（Hershey ら，1990）。ＩＮＦ-γの主要な生理学的役割の一つは、免疫応答誘導の調節物質としての役割、とくに免疫学的に重要な様々の細胞型におけるクラスＩおよびII主要組織適合（ＭＨＣ）抗原の発現を調節するその能力である（Trinchieri & Perussia ，1985）。機能的に、ＭＨＣ遺伝子発現のＩＮＦ-γ依存性上方調整は免疫応答の誘導相において抗原提示を促進する重要な工程であり、ＩＮＦ-γの抗腫瘍活性にある役割を果たす可能性が考えられる（Buchmeier & Schreiber，1985）。ＩＮＦ-γの他の主要な生理学的役割はヒトマクロファージの細胞毒性を活性化する能力である（Schreiber & Celada．1985）。したがってＩＮＦ-γは多様な細胞内および細胞外寄生体ならびに新生物細胞に対する宿主防御の非特異的細胞仲介機構を誘導する役割をもつ一次サイトカインである（Bancroft，1987）。この活性化はＩＮＦ-γの数種の異なる機能の結果である。ＩＮＦ-γは、未成熟の骨髄性前駆細胞の成熟単球への分化を行うことが明らかにされている（Adams & Hamilton，1984）。ＩＮＦ-γは上述のようにＭＨＣクラスIIの発現の誘導によりマクロファージにおける抗原提示を促進するが、同時に抗原の処理に重要な数種の細胞内酵素のレベルも上昇させる（Allen & Unanue，1987）。ＩＣＡＭ- １のようなマクロファージ細胞表面タンパク質はＩＮＦ-γによって上方調整され、したがって抗原提示時のマクロファージとＴ細胞の相互作用の機能的結果を増強させる（Mantovani & Dejana，1989）。ＩＮＦ−γはマクロファージ由来の細胞破壊性化合物たとえば反応性酸素- および反応性窒素-中間体および腫瘍壊死因子-ａ（ＴＮＦ−ａ）の産生を活性化する（Dingら，1988）。ＩＮＦ-γはまたマクロファージ集団の微生物感染に対する感受性を低下させる（Bancroftら， 1989）。微生物病原体のクリアランスにおけるＩＮＦ-γの役割が動物モデルを用い検討されている。マウスに様々な微生物病原体の亜致死量を感染させる前にＩＮＦ-γに対する中和モノクローナル抗体を注射した。これらのマウスにおいては Listeria monocytogenes（Buchmeier & Schreiber，1085），Toxoplasma g ondii（Suzukiら，1988）または Leishmania major（Greenら，1990）によって開始される感染を消失させる能力が失われていた。これらの非特異的細胞誘導細胞破壊活性に加えＩＮＦ-γは他のマクロファージ免疫応答エフェクター機能も増大させる。ＩＮＦ-γは単球／マクロファージ上のＦｃ受容体（ＦcgＲＩ）の発現を上方調整し、したがってマクロファージの抗体依存性細胞殺滅能を増強する（Erbeら，1990）。ＩＮＦ-γはまた、補体の活性の増強を介して体液性免疫を促進する。これは、ｉ）マクロファージおよび線維芽細胞による様々な補体タンパク質（すなわち、Ｃ2，Ｃ4，およびＢ因子）の合成の促進、ならびにii）単核食食細胞形質膜上の補体受容体の発現の調節、の２つの方法で行われる（Strunkら，1985）。ＩＮＦ-γは免疫系の他の細胞にもその作用を発揮する。それは、Ｂ細胞上の免疫グロブリンのイソタイプのスイッチを調節する（Snapper & Paul，1987）。ＩＮＦ-γは、ＣＤ8⁺細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発生に陽性の役割を果たし（Landolfoら，1985），ＮＫ細胞の活性を増大させる。最近、ＣＤ4⁺Ｔ細胞は、均一な細胞クラスを構成しないことが明確に確立された。実際、リンホカインの生物学とＣＤ4⁺Ｔ細胞の機能のパラディグマ、いわゆるＴｈ1/Ｔｈ2 のパラディグマが生じている（総説として Paul & Seder，1994参照）。Ｔ_H1クローンは、ＩＮＦ-γのそれらの産生を介して、上に詳述したようにマクロファージにおける殺微生物および抗腫瘍活性の増強の誘導に適し（細胞性免疫の増強）、一方、Ｔｈ2 クローンは、よく適合された産物（ＩＬ-4，ＩＬ-5，ＩＬ-6，ＩＬ-10，ＩＬ-13）を、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を支援するように作用させる（体液性免疫の増強）。Ｔ細胞のエフェクター機能の、この重大なネクサスにおいてＩＮＦ-γが果たす役割は、免疫応答の成功または失敗の基盤になる。ＩＮＦ-γは、そのＴＮＦ-α産生の増強能を介して、直接的および間接的の両者で炎症応答の促進に主要な役割を果たしている。炎症応答時には、細胞は循環を離れて感染の部位に移動する。この過程において、それらはまず血管内皮に結合し、ついで内皮を通過して浸潤する。ＩＮＦ-γ，ＴＮＦ-αの両者は、この過程に重要な役割を果たす細胞接着分子の重複セット（ＩＣＡＭ-1，Ｅ-セレクチンおよびその他）の発現を促進できる（Poberら，1986；Thornhillら，1991）。実際、実験により、これらの２つのサイトカインはインビボにおいて細胞接着分子の上方調整に相乗作用を発揮することが示されている（Munroら,1989）。免疫応答が発生した時点で微生物が既に蔓延しているか、あるいは応答が宿主から感染原を速やかに駆逐しない微生物感染を想像すればよい。この場合には、連続的なＴ細胞の活性化を生じ、局所的な炎症および組織傷害が誘発され、引き続いて正常な機能が喪失する。実際感染原が内在性の病原性をほとんどもたない場合、その感染により誘発される疾患は大部分このような応答の結果の反映である。過剰なＩＮＦ-γの産生が自己免疫疾患にある役割を果たしている可能性がある（総説は Paul & Seder．1994 および Steinman，1993 参照）。この機構にはクラスＩおよびクラスIIＭＨＣ分子の発現の異常もしくは増大または過剰なＴ_H1 細胞性応答の役割による過剰な組織傷害の関与が考えられる。ＩＮＦ-γの役割およびＴ_H1様細胞により誘発される免疫応答の組織傷害作用が自己免疫疾患たとえば慢性関節リウマチ（Feldman，1989），若年性糖尿病（Rapportら，1993），重症筋無力症（Guら，1993），重症の炎症性腸疾患（Kuhnら，1993）および多発性硬化症（Traugott，1988）において示唆されている。ＩＬ-4 インターロイキン-4（ＩＬ−4）は、1992年にＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）として最初に同定された著しく多面的なサイトカインである（Howardら，1982）。その同じ年、ＩＬ-4 はＩｇＧ１促進因子として同定された（Isaksonら，1982）。ＩＬ-4 がＢ細胞に対して示す作用により、それは最初ＢＣＧＦ-1 と呼ばれ、その後ＢＳＦ-1（Ｂ細胞刺激因子-１）と呼ばれ、1986年にＩＬ-4 の名称が与えられた。マウスＩＬ-4（Nomaら，1986；Leeら，1986）およびヒトＩＬ-4（Yokot aら，1986）のｃＤＮＡがクローン化され、配列決定され、特性が解明された。ＩＬ-4 は「ＩＬ-4 ファミリー」と命名される免疫認識誘導性リンホカインのファミリーのプロト型メンバーと考えることができる（総説として Paul，1991 参照）。このファミリーは、ＩＬ-4，ＩＬ-5，ＩＬ-3，および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）から構成される。これらのタンパク質に共通する性質によりこのグループ化が行われ、それには、ｉ）ファミリーのメンバーの遺伝子の連鎖（van Leeuwenら，1989），ii）ファミリーの各メンバーのリンパ球に対する作用に加えて造血細胞増殖因子としての作用，iii）これらのタンパク質に対する受容体は、すべて、ヘマトポイエチンファミリーの受容体のメンバーである（Bazan，1990a）および、iv）クローン化ＣＤ4⁺Ｔ細胞（いわゆるＴ_H2細胞）の亜集団（Mosmannら，1989）およびマスト細胞（Plautら，1989 ）によるこれらの因子の共発現がある。ＩＬ-4 の著しく多面的な作用は細胞表面の受容体（ＩＬ-4Ｒ）への結合を介して誘導される。マウスＩＬ-4Ｒ（Moselyら，1989；Haradaら，1990）およびヒトＩＬ-4Ｒ（Idzerdaら，1990；Galizziら，1990）がクローン化され、配列決定され、特性が解明されている。ＩＬ-4Ｒは様々な造血（Parkら，1987）および非造血（Lowenthalら，1988）細胞に存在する。ヒトおよびマウスの休止期ＴおよびＢ細胞のいずれもＩＬ-4Ｒの数は少なく（＜400）、サイトカインおよび他の因子によって調節されている。受容体は高い親和性（Kd＝ 10^-10Ｍ）でＩＬ-4 と結合する。免疫調節および造血性サイトカインの受容体は大部分クローン化されていることから、これらの受容体の大多数が大きなファミリー内に含まれることが明らかである。この造血性サイトカイン受容体スーパーファミリーには、リンパ系を調節するＩＬ-4，ＩＬ-2（ｂおよびｇ鎖），ＩＬ-7，ＩＬ-9，およびＩＬ-13 受容体；ならびに，造血系を調節するエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ），ＧＭ-ＣＳＦ，ＩＬ-3 およびＩＬ-5 の受容体が包含される。このスーパーファミリーには、正常時は免疫および造血系の外部で機能していると考えられる因子の受容体たとえば成長ホルモン（ＧＨ），プロラクチン、白血病阻止因子（ＬＩＦ），ＩＬ-6，ＩＬ-11 および絨毛性神経影響因子（ＣＮＦ）の受容体も包含される（総説は Kishimotoら，1994 参照）。免疫および造血サイトカインのシグナリング過程における一般的な最初の工程は、受容体成分の細胞質領域の相互作用によるリガンド誘導性の二量体化が下方へのシグナリンカスケードを開始することと考えられる。ＩＬ-4 受容体は長い細胞内トメイン候補（マウスでは 553 アミノ酸、ヒトでは 569 アミノ酸）を有し、キナーゼ活性またはヌクレオチド結合領域のコンセンサス配列は知られていない。ＩＬ-4 のその受容体への結合によって誘導されるシグナルの生化学的本質はまだ解明されていない。受容体の細胞質ゾルドメインがそのシグナリング機能に必須であるように思われる（Moselyら，1989）。ＩＬ-4 受容体のリガンド誘導二量体化はＩＬ-4 誘導シグナル伝達の重要な第一工程と考えられる。ＩＬ-4 の主要な生理学的役割の一つはＢリンパ球活性化および分化因子としての作用である（Rabinら，1985；Oliverら，1985）。このタンパク質は最初この活性に基づき単離された。この関連でＩＬ-4 はＩｇＧ１の産生を活性化する（Vitettaら，1985）が、ＩｇＧからＩｇＥ免疫グロブリン産生へのＢ細胞のイソタイプスイッチにも関与する（Coffmanら，1986；Lebman & Coffman，1988；D el Preteら，1988）。ＩｇＥのインビボ調節に対するＩＬ-4 の作用は明瞭に証明されている。モノクローナル抗-ＩＬ-4 抗体（Finkelmanら，1986）もしくはＩＬ-4 受容体に対するモノクローナル抗体（Finkelmanら，1990）での処置によるＩＬ-4 の中和は、ＩｇＥ応答を遮断する。組換え可溶性ＩＬ-4 受容体はインビボにおいて、85％までＩｇＥの産生を阻害することが示されている（Satoら， 1993）。マウス胚幹細胞におけるジーンターゲッティングにより作成したＩＬ-4 欠損マウスは正常なＢおよびＴ細胞の発生を示したが、ＩｇＧ１およびＩｇＥの血清レベルは著しく低下していた（Kuhnら，1991）。ＩＬ-4 によって増強されるＩｇＥの産生は、アトピー状態（アレルギー／喘息）を招来する（Finkelma nら，1989；Katonaら，1991）。ＩＬ-4 誘導ＩｇＧ１の上方調整は、炎症カスケードにある役割を果たしている。ＩｇＧ１は、最近、免疫グロブリンのＦｃドメインの細胞受容体（ＦｃＲ）に結合する免疫複合体を形成し、炎症応答を導くことが示された（Sylvestre & Ravetch，1994；Ravetch，1994）。ＩＬ-4 を過剰発現するＩＬ-4 トランスジェニックマウスが作成されている（Tepperら，1990）。これらのマウスでは、血清ＩｇＧ１ならびにＩｇＥレベルが高く、それらはアレルギー性炎症疾患を発症する。これらの所見は体液性免疫においてＩＬ-4 が重要な役割を果たすことを証明するものである。ＩＬ-4 の他の主要な生理学的役割はＴリンパ球増殖因子としての役割である（Hu-Liら，1987；Spitsら，1987）。ＩＬ-4 は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の前駆細胞の増殖およびそれらの活性ＣＤ8⁺ＣＴＬへの分化を亢進させる（Widmer & Grabstein，1987；Trenn，1988）。ＩＬ-4 はＩＬ-2 によって駆動されるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の誘導を増強し（Higuchiら，1989）、これは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の制限を受けることなく多様な腫瘍細胞標的を溶解することが示されている。Ｔ細胞エフェクター機能のこの重大なネクサスにおいてＩＬ-4 が果たす役割は、免疫応答の成功または失敗の基盤になる。ＩＬ-4 は、多様な様式で非骨髄性造血細胞に影響することが明らかにされている。ＩＬ-4 は、単球／マクロファージの増殖を調節し（McInnes & Rennick， 1988；Jansenら，1989）、一方、それらの分化およびある種の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を増強する（Crawfordら，1987；Te Veldeら，1988）。ＩＬ-4 はまたマスト細胞増殖スティミュラントとしての活性を有し（Mosmannら，1986；B rownら，1987）、好酸球の産生および供給を増大させる（Tepperら，1989）。ＩＬ-4 は単独または他のサイトカインと連携して多様な細胞型における多様な細胞表面分子の発現を促進することが可能で、疾患と多様に関連する。とくにＩＬ-4 は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と相互作用して、炎症部位におけるＴ細胞の浸潤に寄与する血管細胞接着分子-1（ＶＣＡＭ-1）の発現を選択的に増大させることができる（Briscoeら，1992）。ＩＬ-4 は単独またはＴＨＦもしくはＩＮＦ -γと共同して、ＭＨＣ抗原および腫瘍関連抗原の両者の様々な新生物細胞における発現を増大させることが示されている（Hoonら，1991）。上に詳述したように、ＩｇＧ１免疫複合体は免疫グロブリンのＦｃドメインに対する細胞受容体（ＦｃＲ）に結合し、炎症応答を導く。ＩＬ-4 の阻害およびその結果としてのＩＬ-4 誘導ＩｇＧ１発現の低下は、免疫複合体炎症疾患状態に対して有効な可能性がある。実際、ＩＬ-4 に対する阻害性リガンドは、ＩＬ- 4 によって誘導されるＶＣＡＭ-1の過剰発現も防止し、したがってＴ細胞の炎症部位における浸潤能を緩和するものと考えられる。ＩＬ-4 活性のモノクローナル抗体、組換え可溶性ＩＬ-4 受容体、または遺伝子ノックアウトによる阻害は、血清ＩｇＥレベルの低下を生じる。ＩＬ-4 に対する阻害性オリゴヌクレオチドリガンドにはアレルギーおよびアレルギー性喘息に対する臨床的な効果が期待できる。最近の報告によれば、ｌｃｋ遺伝子のリンパ球特異的近位プロモーターの支配下にＩＬ-4 を不適切に発現するトランスジェニックマウスで骨ホメオスタシスの障害が認められるという（Lewisら，1993）。これらのマウスにおける骨疾患は骨芽細胞による骨形成の著しい低下によって生じたもので、ヒトの骨粗鬆症に見出されるのと同じ特徴を示した。ＩＬ-4 によって誘導される骨芽細胞活性の低下の阻害は骨粗鬆症に対して有益な可能性がある。移植片体宿主病（ＧＶＨＤ）はヒト組織移植の主要な合併症である。ＧＶＨＤは単一の臨床的表出として存在するものではなく、免疫不全から全身性自己免疫状態までの範囲の免疫学的異常の関与が考えられる（Ferraraら，1991）。これらの全身性自己免疫状態はヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の臨床および血清学的表出を包含する。ＳＬＥの数種のマウスモデルが開発され（Gleichmann ら，1982；van Rappard-van Der Veenら，1982）、マウスでの全身性ＧＶＨＤの誘発が報告されている（Viaら，1988）。最近の２つの研究は、これらのマウスモデル系においてＩＬ-4 に対するマウスモノクローナル抗体がＧＶＨＤおよびＳＬＥの防止にインビボで有効なことを示した（Umlandら，1992；Ushiyamaら， 1995）。これらの観察はヒトＩＬ-4 の阻害剤が、慢性的な全身性自己免疫状態たとえばＳＬＥおよびＧＶＤＨの処置に有効である可能性を示唆する。様々な微生物感染は、細胞性免疫応答の低下、しかしながら体液性免疫応答の上昇によって特徴づけられていて、これは感染に対するＴ_H2型の応答を示唆するものである。このＴ_H2の表現型は上に詳述したように、ＩＬ-4 のＴ細胞分泌を特徴とする。ＩＬ-4 は Leishmania major 感染と戦うＩＮＦ-γ活性化マクロファージの殺微生物活性をブロックする（Liewら，1989；Lealら，1993）。ＩＬ-4 の阻害は免疫応答のＴ_H1エフェクターという武器を増強し、これが細胞性免疫を増強し感染の消散を招来する。インビボにおけるＩＬ-4 の中和はそうでなければ Leishmania major 感染に感受性のマウスに、この寄生体を撃退し、感染を解消することを可能にする（Heinzelら，1989）。いくつかの啓蒙的な研究が感染マウスにおけるＴ_H1/Ｔ_H2表現型の差異に注目し、Ｔ_H1が優位を占める応答が、微生物感染との戦闘に最も有効であることを示唆している（総説として、Sher & Coffman，1992 参照）。ＩＬ-10 ＩＬ-10 はＴｈ2 細胞によって産生され、Ｔｈ1 細胞によっては産生されないサイトカインであり、Ｔｈ1 細胞によって産生されＴｈ2 細胞によっては産生されない大部分のサイトカインの合成を阻害する（Mosmannら，1991）。Ｔｈ1 表現型のＣＤ4⁺細胞に対する作用に加えて、ＩＬ-10 は「Ｔｈ1-様」表現型をもつＣＤ8⁺Ｔ細胞をも阻害する。ＩＬ-10 はマクロファージ活性化の強力なサプレッサーである。ＩＬ-10 はＴＮＦα，ＩＬ-1，ＩＬ-6，ＩＬ-8およびＩＮＦ−γを含めて前炎症サイトカインの産生を抑制することができる。全体的にこれらの結果はＩＬ-10 が強力なマクロファージの脱活性化物質であり、有効な抗炎症剤であることを示唆している。さらに、ＩＬ-10 は一酸化窒素のＩＮＦ-γ誘導性の合成を防止し、細胞内寄生体に対する抵抗性の低下を惹起する（Gazzinelliら， 1992）。ヒトおよびマウス（それぞれｈＩＬ-10 およびｍＩＬ-10）はクローン化され発現されている（Mooreら，1990；Vieiraら，1991）。この２つのｃＤＮＡは全体を通して高度のヌクレオチド配列ホモロジー（＞80％）を示し、極めて類似したオープンリーディングフレームをコードする（73％アミノ酸ホモロジー）。いずれのタンパク質も、酸に不安定な非共有結合性ホモダイマーとして発現される（Mooreら，1993）。モノマーも等しく生物活性を有するかどうかはまだ明瞭でない。一次構造に基づき、ＩＬ-10 はサイトカインの４a-ヘリックス束状ファミリーに分類されていた（Ｓhanafeltら，1991）。多分、高度の配列ホモロジーおよび類似構造によりｈＩＬ-10 はマウスの細胞にも活性であることが示されている（Mooreら，1993）が、その逆では活性はない。ｈＩＬ-10 は 18 kDa ポリペプチドであり、炭水化物は検出されないが、ｍＩＬ-10 には１個のＮ-連結グリコシル化がある。組換えｈＩＬ-10 はＣＨＯ細胞、ＣＯＳ7 細胞、マウス骨髄腫細胞、バキュロウイルス発現系および大腸菌内で発現されている。これらの系で発現されたｒＩＬ-10 は識別不能の生物学的挙動を示す（Mooreら，1993）。寄生体の感染は保護または感受性を誘導できるＴｈ1 またはＴｈ2 いずれかの型の分極化した免疫応答を導くことが多い。寄生体感染の帰結は寄生体および宿主の性質に依存する。最もよく了解されている例はマウスにおける Leishmania major 感染である。L.major はマクロファージ内に細胞内感染を確立する原生動物寄生体であり、これは主として食胞に局在する。活性化されたマクロファージは細胞内寄生体を効果的に破壊することができ、したがって寄生体からの保護はマクロファージの活性化によって達成される。非活性化マクロファージはこれらの生物体を殺滅しない。期待されるように、ＩＮＦ-γ処置時のマクロファージの活性化は保護を促進し、一方、ＩＬ-4 およびＩＬ-10 はＩＮＦ-γによって誘導された殺微生物活性の上昇を遮断する（Liewら，1989）。大部分の近交株（たとえば、Ｃ57/ＢＬ6）の L．major による皮膚感染は自然治癒を伴う局在性感染を誘導し、再感染に対する抵抗性を付与する。しかしながら、ＢＡＬＢ/ｃマウスでは、L．major 感染はＩＬ-4 を産生することにより非保護的免疫応答を誘導する。ＩＬ-4 により誘導される抗体応答は無効で死を招く（Howardら,1980）。治癒株では強力なＴｈ1 応答が高レベルのＩＮＦ-γとともに注目される一方、感受性のＢＡＬＢ/ｃマウスでは非生産的なＴｈ2 応答と有意なＩＬ-4レベルの上昇が見出されている（Heinzelら，1991）。さらにモノクローナル抗-ＩＮＦ- γ抗体の１回注射が抵抗性マウスを感受性マウスに変換できることが示されている（Belosevicら，1989）。期待されるように、ＢＡＬＢ/ｃマウスの抗-ＩＬ-4 抗体による処置ではＴｈ1 応答の発生および治癒を招来した（Sher & Coffman， 1992）。すなわち、病原体の本質に依存して、免疫応答を保護的表現型を有するＴ細胞サブセットへ変化させると疾患状態への治療的介入を導くことができる。サイトカインによって誘導されるＴｈ1 およびＴｈ2 の表現型の間の調節を理解すれば、治療におけるサイトカイン-アンタゴニストの設計の助けになるものと思われる。ＩＬ-10 の産生は様々な病原体たとえば Leisnmania major．Schisto soma mansoni，Trypanosoma cruzi ならびに Mycobacteium Leprae で感染したマウスにおいて著しく増大する（Sherら，1992；Salgameら，1991；Heinzelら， 1991）。病原体に対する防御機構の正しい武器の設置を促進する免疫療法を設計する場合は、この２つの武器の間のバランスを維持することが重要である。細胞内感染原への応答時にＴｈ1 細胞によって誘発される組織傷害の制御にはＴｈ2 型応答が重要な可能性もある。Ｔｈ2 が優位な環境において機能するＴｈ1 細胞をある程度維持することは、ＩＬ-10 およびＩＬ-4 の分泌によるＴｈ1 の傷害作用の除去を支援することができる。Ｔｈ1/Ｔｈ2 のスペクトルの極端な例の一つは、ＩＬ-10 遺伝子欠損トランスジェニックマウスに反映される（Kuhnら，1993）。ＩＬ-10 欠損マウスはそのＴおよびＢ細胞サブセットの発生に関しては正常である。しかしながら、これらのマウスは、ＴＮＦαおよびＩＮＦ−γのようなサイトカインの連続的な過剰産生（Ｔｈ1 応答）を介する慢性的炎症により、慢性腸炎（または炎症性腸疾患）を発症する。ＩＬ-12 もＴｈ1 サブセットの発生を誘導できる。細胞内グラム陽性細菌である Lysteria monocytogen 感染をモデルとして抗体Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウスに用いることにより、ＩＬ-10 はマクロファージからのＩＬ-12 の産生をブロックできることが示された（Hsiehら，1993）。すなわちＩＬ-10 アンタゴニストは、１．Ｔｈ1 サイトカインの産生の阻害を防止する、２．Ｔｈ1 サブセットの発生を誘導するサイトカインの産生を可能にする、ことによりＴｈ2 が優位な環境のＴｈ1/Ｔｈ2 集団を逆転させることになる。手元の実験的証拠から、ＡＩＤＳに対する抵抗性および／または進行性は個体のＴｈ1/Ｔｈ2 ステージに依存することが提唱されている（Clerici & Shearer ，1993）。この仮説は、ＡＩＤＳに対する進行性はＩＬ-2 とＩＮＦ-γ産生の消失（Ｔｈ1 応答の消失）およびＩＬ-10 とＩＬ-4 の増加（Ｔｈ2 応答の獲得）を特徴とするとの所見に基づいている。多くの血清陰性者（ＨＩＶに暴露された個体）は強力なＴｈ1 型応答を発生する。血清変換後ＩＬ-4 およびＩＬ-10の両レベルのＩＬ-4 およびＩＮＦ-γを犠牲にした上昇に注目することが重要である。しかしながら、完全発症ＡＩＤＳ患者では、Ｔｈ2 応答は高レベルのＩＬ-10 によって誘導されるように思われ、ＩＬ-4 によってではなくそのレベルはこれらの患者では正常まで低下している。抗-ＩＬ-10 試薬は、ＡＩＤＳ患者に保護を提供するＴｈ2 応答のＴｈ1 へのシフトにより、治療剤として働く可能性が考えられる。ＴＮＦα ＴＮＦαは細胞外サイトカインであり、免疫および炎症応答の中心的なメディエーターである（Beutlerら，1989；Vassalli，1992）。それはホモトリマーであり（Smithら，1987；Eckら，1988）、サブユニットサイズは 17 kD である。健康な個体では 5 pg/ml 未満の濃度で循環し（Dinarelloら，1993）、敗血症症状のある患者では 1000 pg/ml 程度の高値まで上昇することがある（Claseyら， 1993）。ヒトＴＮＦαはグリコシル化されていないが、一部の他の種（とくにマウス）では成熟タンパク質の１個のＮ-連結部位にグリコシル化がある。しかしながら、糖残基は生物活性に必須ではない（Beutlerら，1989）。ヒトＴＮＦα はｐＨ 5.3 の酸性である（Aggarwalら，1985）。各ＴＮＦαサブユニットはアンチパラレルβサンドイッチから構成され、それがβシートのエッジ対フェースパッキングによってトリマーの形成に関与している。ＴＮＦαトリマーの構造はウイルスのコートタンパク質の「ジェリーロール」構造モチーフの特徴に類似する（Jonesら，1989）。ＴＮＦαは比較的安定な分子で、カオトロッピク剤たとえば尿素、ＳＤＳ，または塩酸グアニジンに暴露されても、再生されて初期の生物活性の50％程度が回収される。ＴＮＦαの再生性は構造の維持に必要な限られた数の内部ジスルフィド結合（モノマーあたり１個）を反映するものと考えられる（Beutlerら，1989）。他の関連分子、ＴＮＦβは、ＴＮＦαと同一の生物活性を有する。ＴＮＦαおよびＴＮＦβファミリー内の種間配列同一性は、それぞれ71％および61％である（Beutlerら，1989）。ｈＴＮＦαとｈＴＮＦβの間の配列同一性は29％にすぎない（Beutlerら，1989）。類似性が低いにもかかわらず、ｈＴＮＦαおよびｈＴＮＦβの両者は同一の受容体に、匹敵する親和性で結合する。ＴＮＦαは細胞表面の受容体への結合を介しその生物活性を誘導する。ＴＮＦ αの受容体は実際に、試験したすべての体細胞の表面に見出された（Vassalli， 1992）。２つの異なるＴＮＦαの受容体、見掛けの分子量 55 kD（ｐ55 ＴＮＦ α-Ｒ１）および 75 kD（ｐ75 ＴＮＦα-Ｒ２）が解明されている（Hohmannら， 1989；Brockhausら，1990；Loetscherら，1991）。いずれの受容体も高い親和性（Ｋd＝0.3〜0.6ｎＭ）で、ＴＮＦαおよびＴＮＦβを結合する（Loetscherら， 1990；Schallら，1990；Pennicaら，1992）。ＴＮＦαは多様な活性を有し、したがって、以下のようにいくつかの疾患に関与している。敗血症ショック：敗血症の発症はこの60年間増加を続けていて、米国における集中治療室で最も多い死因である（Parrillo，1991）。敗血症ショックの死亡率は、集中的な抗生物質の標準的な使用および心脈管系の維持にもかかわらず、過去10年約50％のままである（Parrillo，1991）。敗血症にＴＮＦαが関与している証拠は以下の通りである。マウスまたはヒヒをＴＮＦαに対するモノクローナル抗体により前処置すると、致死量の大腸菌ＬＰＳから保護される（Beutlerら，1985）。抗-ＴＮＦα抗体は霊長類を致命的エンドトキシン敗血症および致命的S．aureus-誘発ショックから保護する（Fiedlerら，1992；Hinshawら，1992）。可溶性ＴＮＦα受容体（ｐ55）-ＩｇＧ-Ｆｃ融合体（ＴＮＦα受容体免疫接着）は、エンドトキシン注入の１時間後に投与してもマウスをエンドトキシンショックから保護することが見出された。同じ免疫接着がマウスのリステリア症に対しても有効であった（Haak-Frendschoら，1994）。ｐ25受容体に基づく他の免疫接着も致命的なエンドトキシン血症に有効であり、それはＴＮＦαキャリアーおよびＴＮＦαアンタゴニストの両者として同時に機能することが示された（Mohler ら，1993）。カヘキシー：マウスにおけるＴＮＦαのインビボ投与はカヘキシーを惹起した（Oliffら，1987）。したがってＴＮＦαのアンタゴニストは癌またはＡＩＤＳ感染患者をカヘキシーから保護する可能性がある。脳マラリア：高レベルのＴＮＦαが脳マラリア小児患者の予後不良に関連し、ＴＮＦαに対する抗体がマウスを Plasmodium berghei 感染の脳障害から保護する（Grauら，1987）。関節炎：ＴＮＦαに対する抗体は滑膜細胞内の炎症性サイトカインＩＬ-2 の産生を低下させる（Brennanら，1989）。ＴＮＦαは慢性関節リウマチにおける主要な破壊的プロテアーゼ、コラーゲナーゼのインデューサーである（Brennan ら，1989）。抗-ＴＮＦα抗体は、マウスのコラーゲナーゼ誘導関節炎における関節病変を緩和させることが見出された（Williamsら，1992）。ｈＴＮＦα遺伝子をもつトランスジェニックマウスは関節炎を発症し、これはｈＴＮＦαに対するモノクローナル抗体のインビボ投与により防止できる（Kefferら，1991）。移植片拒絶反応および移植片対宿主病（ＧＶＨＲ）：ＴＮＦαは、移植片対宿主病の急性相および腎臓同種移植拒絶反応における関与が明らかにされている。ＴＮＦαのアンタゴニストはこれら致命的状態を防止できる。抗-ＴＮＦα抗体は、実験動物で、移植片拒絶反応を遅延させることが見出されている（Piguet， 1992）。また、ＧＶＨＲの急性相における抗-ＴＮＦα抗体の注射は、死亡率ならびに腸、上皮および肺胞の病変の重篤度を低下させた（Piguet，1992）。ヒト骨髄移植における抗-ＴＮＦα抗体の効果の臨床試験が実施されている。ＡＩＤＳ：細胞内シグナル伝達経路の研究により、ＴＮＦαはｋＢ様エンハンサーエレメントに結合し、したがってＮＦ-ｋＢ誘導性遺伝子の制御に一部関与することが明らかにされた（Leonardら，1989；Lowenthalら，1989；Osbornら， 1989）。ＴＮＦαの抗ウイルス活性の少なくとも一部はＮＦ-ｋＢのβ-インターフェロン遺伝子におけるウイルス誘導性エレメントとの相互作用により誘導されるものである（Goldfeldら，1989；Visvanthanら，1989）。類似の機構によってＴＮＦαは、ヒト免疫不全ウイルスＩ型を活性化するものと思われる（Ｄuhら， 1989；Folksら，1989）。したがって、ＴＮＦαのアンタゴニストはＡＩＤＳウイルスの活性化を遅延させるのに有用であり、ＡＩＤＳの治療における他の処置と併用して有効に働く可能性が考えられる。パーキンソン病：最近、パーキンソン病患者の脳および脳脊髄液中でＴＮＦα レベルの上昇が見出されている（Mogiら，1994）。この報告では、ＴＮＦαレベルの上昇がこの疾患に伴う神経変性に関連する可能性が推論されている。ＲＡＮＴＥＳＲＡＮＴＥＳは、小さい（ＭＷ 8-kＤ）高度に塩基性の（ｐＩ約9.5）ＣＣグループに属するケモカインである（Schallら，1991；Baggioliniら，1994）。グリコシル化はないようで（Schallら，1991）、単球（Schallら，1990；Wangら， 1993；Wiedermannら，1993），好塩基球（Bischoffら，1993；Kunaら，1993），好酸球（Rotら，1992）および記憶Ｔ細胞機能に関与する前刺激またはプライムされたヘルパーＴ細胞と考えられるＣＤ4⁺／ＵＣＨＬ⁺Ｔリンパ球（Schallら，1 990）の走化性促進因子である。ＲＡＮＴＥＳは走化性因子であるのみでなく、細胞からのそれらのエフェクターを放出させて組織傷害を招来する。たとえば、ＲＡＮＴＥＳは好塩基球からヒスタミンを放出させる（Kunaら，1992；Kunaら， 1993；Alamら，1993）。それはまた、好酸球の塩基性ペプチドの分泌（Alamら， 1993）ならびに好酸球による酸素フリーラジカルの産生を生じさせる（Rotら，1 992）。最初、ＲＡＮＴＥＳは活性化Ｔ細胞によって合成されると考えられていたが、最近、他の細胞も、刺激に応じて極めて速やかにそれを合成することが見出された。ＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡは休止期Ｔ細胞の活性化後に遅れて（３〜５日後）発現するが、一方、線維芽細胞、腎臓上皮および糸球体脈管膜細胞ではＴＮＦα の刺激によって、ＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡは速やかに上方調整される（Nelsonら，1993）。ＲＡＮＴＥＳの受容体も同定されている。すべてのケモカインをＫd＝５ｎＭで結合する無差別な受容体が、赤血球の表面にある（Horukら，1993；Neoteら， 1993）。この受容体は、ケモカインの走化性勾配の確立を助けるシンクと考えられる。シグナル伝達受容体も同定され、クローン化されている（Gaoら，1993；N eoteら，1993；Van-Riperら，1993；Wangら，1993）。単球はＲＡＮＴＥＳを推定Ｋd＝400ｐＭで結合するＧ-蛋白共役受容体をもつが、これにはＭＣＡＦおよびＭＩＰ-1ａも低い親和性（推定Ｋdはそれぞれ 6および 1.6ｎＭ）で結合する（Wangら，1993）。受容体分子は約 50ｎＭの低い親和性でＲＡＮＴＥＳを結合できる好中球からクローン化された（Gaoら，1993）。疾患状態：ＲＡＮＴＥＳのアゴニストは、炎症に治療的適用をもつ可能性がある。ＲＡＮＴＥＳの走化性作用およびエフェクター細胞活性化作用の遮断は局所的炎症および組織傷害をブロックすることが期待される。ＲＡＮＴＥＳのアゴニストの作用機構はＲＡＮＴＥＳの細胞表面受容体への結合の阻害であろう。ＲＡＮＴＥＳは、単球、好塩基球、好酸球および記憶リンパ球の走化性因子である。好塩基球は、ヒスタミンおよびペプチド-ロイコトリエンのようなメディエーターの主要な起源であり、過敏性疾患でのアレルゲンに対する遅延型反応の必須エレメントである。これらの細胞は他の炎症病理、たとえばある種の自己免疫反応、寄生体感染および炎症性腸疾患にも関与している。これらの状態において好塩基球の供給および活性化はＩｇＥとは無関係である。この数年、機能的に「ヒスタミン放出因子」と呼ばれる確認し難い一群の刺激因子の作用を記載した論文が多数蓄積している。これらの確認し難い刺激因子の大部分にＲＡＮＴＥＳが寄与している可能性がある。好酸球もアレルギー性炎症に重要で、リンパ球とともに、喘息患者の気管支粘膜に著しい浸潤を形成する。それらは上皮の傷害および特徴的な気道過敏性の原因と考えられる。遅延相の反応部位へ好酸球と共遊走するＴｈ2 型のリンパ球の供給は好酸球を刺激する他の走化性サイトカインおよび増殖因子の重要な起源である。ＲＡＮＴＥＳは単球、好塩基球、好酸球およびリンパ球に対する作用により、エフェクター細胞の蓄積ならびに慢性炎症性疾患とくにアレルギー性炎症の強力なスティミュレーターであると考えられる。炎症性細胞の供給システムには、その構築にある種の重複性がある。しかしながら、ＲＡＮＴＥＳは独特の性質をもっている。それはＭＣＰ-1 およびＭＣＰ- 1ａよりも強力な走化性因子であり、一方、ＭＣＰ-1 は好塩基球からのヒスタミン放出においてより強力なスティミュレーターである（Baggioliniら，1994）。ＲＡＮＴＥＳは好酸球による酸素ラジカルの産生を惹起させるが、ＭＣＰ-１にはこの作用はない（Rotら，1992）。ＲＡＮＴＥＳは好酸球の供給の点でＣ5ａと同様に強力であるが、好酸球の酸化バーストのトリガーとしてはそれ程強力ではない（Rotら，1992）。Ｃ5ａは極めて強力な走化性因子である。しかしながら、ＲＡＮＴＥＳの特異性はもっていない。Ｃ5ａは好塩基球および好酸球のみでなく、好中球も誘引する。ある種の炎症状態、たとえばアレルゲン誘発性遅延型反応および喘息の病態生理に重要なのは好中球ではなくて好酸球であることから、ＲＡＮＴＥＳのような特異的な走化性因子の関与が期待される。インシトゥハイブリダイゼーションを用い、ＲＡＮＴＥＳの発現が、拒絶反応を受けているヒト腎臓移植片の間質単核細胞および近位尿細管上皮細胞に見出されている。抗体染色により、ＲＡＮＴＥＳの存在が、間質浸潤や腎尿細管上皮細胞内のみならず、炎症内皮にも豊富に認められた（Wiedermannら，1993）。これらの結果に基づき、走触性機構が想定されている。走触性は表面結合勾配によって誘導される細胞の遊走と定義される。走触性機構はインビトロの実験によって支持され、抗-ＲＡＮＴＥＳ抗体はそのインビトロ走触性を防止することが見出されている。ヒト慢性関節リウマチの滑膜線維芽細胞は、ＴＮＦαおよびＩＬ-１βによる刺激後、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ-8 のｍＲＮＡを発現する（Rathanaswamiら，1 993）。ＩＬ-8 およびＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡの発現には、差別調節が存在する。シクロヘキシミドはＩＬ-１βによる刺激後のＩＬ-8 およびＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡレベルを上昇させたが、ＴＮＦαによる刺激後ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡのレベルを低下させた。また、ＴＮＦαおよびＩＬ-１β誘導性のＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡの上昇をＩＬ-4 は下方調整し、ＩＦＮ-γは増強したが、一方、ＩＬ-8ｍＲＮＡのＴＮＦαまたはＩＬ-１βによる誘導はＩＦＮ-γによって阻害され、ＩＬ-4によって増強された。しかも、ＴＮＦαとＩＬ-１βの組合せはＩＬ-8 のｍＲＮＡのレベルを相乗的に上昇させたが、同じ条件下において、ＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡのレベルはＴＮＦα単独により誘導されるたレベルより低かった。これらの研究は、滑膜線維芽細胞が慢性関節リウマチの進行中の炎症過程に関与していること、そしてＲＡＮＴＥＳがそれに関与するエフェクターの一つである可能性を示唆する。観察されたＩＬ-8 とＲＡＮＴＥＳの差別調節は細胞浸潤のタイプおよび炎症性疾患の進行は刺激性および阻害性サイトカインの相対的レベルに依存するらしいことを示している。ＲＡＮＴＥＳにはまた、動脈硬化および多分、血管形成術後の再狭窄への関与が考えられている（Schall，1991）。動脈硬化におけるＭＩＰ-1 の関与はさらに詳細に検討されてきた。最近、ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ-1ａおよびＭＩＰ-1βのｍＲＮＡが正常な頸動脈プラークおよび心臓移植片動脈硬化にインシトゥで検出された。ＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡはＭＩＰ-1ａおよびＭＩＰ-1βを発現している同じ細胞には検出されないが、通常内腔により近いリンパ球およびマクロファージに発現している。これらのデータはＣＣケモカインの陽性フィードバック機構および動脈疾患の進行の様々な段階におけるこれらのケモカインの差別発現の可能性を支持している。最後に、ＲＡＮＴＥＳレベルの上昇は子宮内膜増多症と相関する（Khorramら，1993）。ＲＡＮＴＥＳのレベルは子宮内膜増多症の女性からの骨盤液中で上昇していて、これらのレベルは疾患の重篤度と相関する。ヒトおよび動物のタンパク質ホモロジー：マウスのＲＡＮＴＥＳがクローン化されている（Schallら，1992）。配列分析からヒトとマウスのタンパク質の間には85％のアミノ酸同一性が明らかにされた。ヒトとマウスのＲＡＮＴＥＳには免疫交叉性がある。ボイデンチェンバー走化能実験により、単球の走化能は種特異性を欠くことが明らかにされ、組換えｍｕＲＡＮＴＥＳはインビトロで用量依存性にヒト単球を誘引する。また、ｈＲＡＮＴＥＳのマウス腫瘍細胞系へのトランスフェクションは、インビボにおいて、その腫瘍によるｈＲＡＮＴＥＳの分泌がマウス単球の浸潤の増大と相関する腫瘍を生じる（Schallら，1992）。セレックス標的分子に対し高度に特異的結合性を有する核酸分子のインビトロ発生方法が開発されている。この方法，Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）はＳＥＬＥＸ（セレックス）と呼ばれ、現在は放棄された米国特許出願一連番号第07/536,428号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）、1 991年06月10日付で出願された米国特許出願一連番号第07/714,131号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、1992年08月17日付で出願された米国特許出願一連番号第07/931,473号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、現在は米国特許第 5,270,163号（ＰＣＴ/ＵＳ第91/04078号も参照）に記載されている。これらはいずれも引用により本明細書にとくに導入される。本明細書において包括的にセレックス特許出願と呼ばれるこれらの各出願には、任意所望の標的分子に対する核酸リガンドを作成する基本的に新規な方法が記載されている。セレックス法は、実際に任意所望の基準の結合親和性および選択性を達成するために同一の一般的選択スキームを用いる候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分配および増幅の段階的反復を包含する。核酸の混合物好ましくは無作為化された配列のセグメントからなる混合物に出発し、セレックス法は、混合物を標的と、結合に有利な条件下に接触させ、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分配し、核酸-標的複合体を解離させ、核酸-標的複合体から解離させた核酸を増幅させ、リガンドが濃縮された核酸の混合物を得て、ついで結合、分配、解離および増幅の工程を所望の回数再反復して、標的分子に対し高度に特異的な高度に親和性の核酸リガンドを得る工程を包含する。基本セレックス法は多くの特定の目的を達成するために改良されてきた。たとえば、1992年10月14日に出願された米国特許出願一連番号第07/960,093号（発明の名称：Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure）には特異的な構造特性を有する核酸分子たとえばベントＤＮＡを選択するためのゲル電気泳動と組合わせたセレックスの使用が記載されている。1993年09月17日に出願された米国特許出願一連番号第08/123,935号（発明の名称：Photoselection of Nucleic Acid Ligands）には、標的分子に対する結合および／または光架橋および／または光不活性化を可能にする光反応基を含有する核酸リガンドを選択するセレックスに基づく方法が記載されている。1993年10月07日に出願された米国特許出願一連番号第08/134,028号（発明の名称：High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffein）には、きわめて類似した分子間の識別が可能な高度に特異的な核酸リガンドを同定する、カウンターセレックス（Counter-SELEX）と呼ばれる方法が記載されている。1993年1 0月25日出願の米国特許出願一連番号第08/143,564号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX）には、標的分子に対して高親和性および低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分配を達成するセレックスに基づく方法が記載されている。1992年10 月21日付出願の米国特許出願一連番号第07/964,624号（発明の名称：Methods of Producing Nucleic Acid Ligands）には、セレックスの実施後に改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。1995年03月08日付で出願された米国特許出願一連番号第08/400,440号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligand s by EXponential Enrichment: Chemi-SELEX）には、リガンドをその標的に共有結合させる方法が記載されている。セレックス法は、リガンドに対して改良された特性、たとえばインビボ安定性の改良または送達特性の改良を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置の化学的置換が包含される。修飾ヌクレオチドを含有し、セレックスで同定される核酸リカンドは、1993年09月08日出願の米国特許出願一連番号第08/117,991号（発明の名称：High Affinity Nucleic Acid Ligands Containig Modified Nucleotides）にピリミジンの 5-および 2'-位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許出願一連番号第08/134,028号には 2'-アミノ（2'-ＮＨ₂）， 2'-フルオロ（2'-Ｆ）および／または2'-Ｏ-メチル（2'-ＯＭｅ）により修飾された１もしくは２個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。1994年06月22日出願の米国特許出願一連番号第08/264,029号（発明の名称：Novel Method of Preparation of 2'Modified Pyrimidine Intra molecular Nucleophilic Displacement）には様々な 2'-修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。セレックス法は、1994年08月02日出願の米国特許出願一連番号第08/284,063号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX）ならびに1994年04月28日に出願された米国特許出願一連番号第 08/234,997号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX）にそれぞれ記載されているように、選ばれたオリゴヌクレオチドの、他の選ばれたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能性単位との結合を包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の性質、ならびに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の望ましい性質と組合わせることを可能にする。基本的セレックス操作の修飾を記述する上記特許出願はそれぞれ引用によりそれらの全体が本明細書にとくに導入される。発明の簡単な概要本発明はサイトカイン対する核酸リガンドの同定および製造方法、ならびにそのようにして同定および製造された核酸リガンドを包含する。とくに、ＩＦＮ- γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，およびＴＮＦαに対して特異的に結合できるＲＮＡ配列が提供される。さらに、ＲＡＮＴＥＳに特異的に結合できるＤＮＡ配列が提供される。本発明にはとくに、表３，４，７，８，10，および12示したＲＮＡリガンド配列（配列番号：７〜73；79〜185；189〜205；209〜255）が包含される。本発明はさらにサイトカインに対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法において、（ａ）核酸の候補混合物を調製し、（ｂ）サイトカインと核酸の候補混合物を接触させ、（ｃ）サイトカインに対する親和性に基づいて上記候補混合物の間の分配を行い、ついで（ｄ）選択された分子を増幅させて、サイトカインに比較的に高い親和性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得る工程からなる方法を包含する。本発明はさらにＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，ＴＮＦα，およびＲＡＮＴＥＳからなる群より選択されるサイトカインに対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法において、（ａ）核酸の候補混合物を調製し、（ｂ）上記サイトカインと核酸の候補混合物を接触させ、（ｃ）上記サイトカインに対する親和性に基づいて上記候補混合物のメンバー間の分配を行い、ついで（ｄ）選択された分子を増幅して、上記サイトカインに対して比較的に高い親和性で結合する核酸配列に富む核酸混合物を得る工程からなる方法を包含する。さらに詳しくは、本発明は上述の方法により同定されたＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，およびＴＮＦαに対するＲＮＡリガンド、たとえば、表３，４，７，８，10，および12示したリガンド（配列番号：７〜73；79〜185；189〜205；209 〜255）を包含する。また、与えられたリガンドのいずれかと実質的に相同であって、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，およびＴＮＦαに結合する実質的に同一の結合能を有し、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，およびＴＮＦαの機能を阻害するＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，およびＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドを包含する。さらに本発明には、本明細書に提示されたリガンドと実質的に同一の構造を有し、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに結合する実質的に同一の結合能を有し、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαの機能を阻害するＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対する核酸リガンドを包含する。本発明はまた、ここに同定された核酸リガンドに基づき修飾されたヌクレオチド配列およびそれらの混合物を包含する。発明の詳細な説明本出願は、セレックスとして知られる方法によって同定される、サイトカインに対して高親和性の核酸リガンドを記述する。セレックスは、現在は放棄された米国特許出願一連番号第07/536,428号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）、1991年06月10日に出願された米国特許出願一連番号第07/714,131号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、1992年08 月17日出願の米国特許出願一連番号第07/931,473号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、現在米国特許第5,270,136号（ＰＣＴ/ＵＳ91/04078号も参照）に記載されている。これらの出願はそれぞれ引用により本明細書にとくに導入され、包括的にセレックス特許出願と呼ばれる。その最も基本的な形態において、セレックス法は以下の一連の工程により定義することができる。１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は一般に、固定された配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一の位置に同一の配列を含有する）および無作為化された配列の領域を包含する。固定配列の領域は、（ａ）以下に記載する増幅工程を補助するため、（ｂ）標的に結合することが既知の配列に類似させるため、または（ｃ）候補混合物中の核酸の与えられた構造アレンジメントの濃度を増大させるためのいずれかで選択される。無作為化配列は完全に無作為化されていても（すなわち任意の位置におけるある塩基の存在確率は1/4である）または一部のみ無作為化されていてもよい（すなわち任意の位置におけるある塩基の存在確率は0〜100％の任意のレベルに選択できる）。２）候補混合物は選択された標的と、標的と候補混合物のメンバーの間の結合に好都合な条件下に接触させる。このような環境下には標的と候補混合物の核酸の間の相互作用は、標的とその標的に最高の親和性を有する核酸との間の核酸- 標的ペアを形成すると考えることができる。３）標的に対して最高の親和性を有する核酸を、標的に対する親和性がより低い核酸から分配する。最高の親和性核酸に相当する配列は、候補混合物中には極めて少数（多分、核酸１分子のみ）しか存在しないので、一般には、候補混合物中の有意な量の核酸（約５〜50％）が分配時に残存するように分配基準をセットすることが望ましい。４）標的に対して比較的に高い親和性を有するとして分配時に選択された核酸をついで増幅し、標的に対して比較的に高い親和性を有する核酸が濃縮された新たな候補混合物が創成される。５）上述の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補混合物に含まれるユニークな配列の数は漸次減少し、標的に対する核酸の平均的親和性の程度は一般に上昇する。極端な場合を考えると、セレックス法では標的分子に最高の親和性を有する最初の候補混合物からの核酸である１種または少数種のユニークな核酸を含有する候補混合物が得られることになる。セレックス特許出願には、この方法に関して詳細に記述され、精密化が行われている。この方法に使用できる標的、候補混合物内での核酸の分配方法および分配された核酸を増幅して濃縮された候補混合物を発生させる方法が包含されている。セレックス特許出願にはまた、タンパク質が核酸結合タンパク質である場合および核酸結合タンパク質でない場合の両タンパク質標的を含めて、多くの標的種に対して得られたリガンドも記載されている。ここに記載される核酸リガンドは親油性化合物（たとえば、コレステロール）と複合体化することが可能であり、また親油性成分に結合または封入することもできる（たとえば、リポソーム）。複合体化した核酸リガンドは、その核酸リガンドを細胞内標的に送達するための細胞による核酸リガンドの細胞性取り込みを増大させることができる。1995年05月04日付で出願された米国特許出願一連番号第08/434,465号（発明の名称：Nucleic Acid Ligand Complexes）には、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の調製方法が記載されている。この記載はその全体が本明細書に導入される。本明細書に記載された方法およびその方法によって同定された核酸リガンドは治療用および診断用の両目的で有用である。治療的使用にはヒト患者における疾患または医学的状態の処置または防止が包含される。診断的使用には、インビボおよびインビトロにおける両診断的適用が包含される。セレックス法は一般的にまた本出願に特定して教示され請求されるセレックスの特定の適用において、とくに診断的適用に適している。セレックスは、標的に、高い親和性および驚くべき特異性をもって結合できる核酸リガンドを同定する。これらの特性はもちろん診断用リガンドに本技術分野の熟練者が求めている望ましい性質である。本発明の核酸リガンドは、本技術分野の熟練者によって採用される多くの技術によって定常的に診断の目的に適用することが可能である。診断薬は、利用者に与えられた標的の特定の場所、特定の濃度での存在の確認を可能にすることのみが要求される。単純に標的と結合対を形成し診断の目的に陽性のシグナルを誘発するだけで十分である。本技術分野の熟練者には、このようなリガンドの存在を追跡するために標識タグを導入する本技術分野で既知の操作によって、核酸リガンドを適用することも可能であろう。このようなタグが多くの診断操作に使用できる。本明細書に記述するサイトカインに対する核酸リガンドはサイトカインタンパク質の同定に特異的に使用できる。セレックス法は標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは核酸研究分野には前例のない卓絶した業績である。本発明は、セレックス操作を特異的な標的に適用するものである。以下の実施例の項には、サイトカインに対する核酸リガンドの単離および同定に用いられる実験パラメーターを記述する。医薬としての使用が望ましい核酸リガンドの製造のためには、核酸リガンドは（１）標的に対して所望の作用を達成できる様式で標的に結合する、（２）所望の作用を得る目的で可能な限り小さい、（３）可能な限り安定である、（４）選択された標識に対して特異的なリガンドである、ことが好ましい。大部分の場合で核酸リガンドは標的に対して可能な最高の親和性を有することが好ましい。 1992年10月21日に出願された、係属中の共通して譲渡された米国特許出願一連番号第07/964,624号（'624）には、セレックスを実施したのち改良された核酸リガンドを得るための方法が記載されている。発明の名称：Methods of Producing Nucleic Acid Ligands のこの '624 出願は引用によりとくに本明細書に導入される。本発明は、サイトカインの核酸リガンドを同定するためのセレックス法を包含する。サイトカインは、細胞シグナリング／細胞間相互作用を誘発する多様なグループの小タンパク質である。サイトカインにはイムノ／ヘマトポイエチン（たとえば，ＥＰＯ，ＧＭ-ＣＳＦ，Ｇ-ＣＳＦ，ＬＩＦ，ＯＳＭ，ＣＮＴＦ，ＧＨ，ＰＲＬ，ＩＬ-2，ＩＬ-3，ＩＬ-4，ＩＬ-5，ＩＬ-6，ＩＬ-7，ＩＬ-9，ＩＬ-10 ，ＩＬ-12），インターフェロン（たとえば，ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＦＮ−γ ），ＴＮＦ-関連分子（たとえば，ＴＮＦα，ＩＦＮβ，ｇｐ³⁹（ＣＤ40-Ｌ），ＣＤ27-Ｌ，ＣＤ30-Ｌ，ＮＧＦ），およびケモカイン（たとえば，ＰＦ４，ＰＢＰ，ｇｒｏα，ＭＩＧ，ＥＮＡ-78，ＭＩＰ１α，ＭＩＰ１β，ＭＣＰ-1，Ｉ-30 9，ＨＣ14，Ｃ10，ＲＡＮＴＥＳ，ＩＬ-8．ＭＩＰ-1）が包含される。一実施態様においては、サイトカインはＴ-リンパ球から誘導される。本発明においては、セレックス実験は、サイトカイン，ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，ｈＴＮＦα，およびＲＡＮＴＥＳに特異的な高親和性を有するＲＮＡを同定するために、30または40ランダム位置（ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＲＡＮＴＥＳについては40Ｎ；ｈＴＮＦαについては30Ｎ）を含有する縮重ライブラリーから実施された（表１，５，９，11および16）。本発明は、実施例１，３，５，７および12に記載の方法によって同定される表３，４，７，８，10 および12に示すＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対する特異的なＲＮＡリガンド（配列番号：７〜73，79〜185，189〜205，209〜255）を包含する。本発明はさらに、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαの機能を阻害するＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドを包含する。本発明にはさらに、ＲＡＮＴＥＳの機能を阻害するＲＡＮＴＥＳに対するＤＮＡリガンドが包含される。本発明によってカバーされるリガンドの範囲は、セレックス操作に従って同定される修飾または非修飾の、ＩＦＮ-γ，ＩＬ- 4，ＩＬ-10 ，ＴＮＦαおよびＲＡＮＴＥＳの核酸リガンドすべてに拡張されるものである。さらに特定すれば、本発明は表３，４，７，８，10および12に示すリガンド（配列番号：７〜73，79〜185，189〜205，209〜255）に実質的に相同の核酸配列を包含する。実質的に相同とは、一次配列ホモロジーの程度が70％以上、とくに好ましくは80％以上であることを意味する。表３，４，７，８，10，および12に示すＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対するリガンド（配列番号：７〜73，79〜185，189〜205，209〜255）の配列ホモロジーの検査では、一次ホモロシーをほとんどまたは全くもたない配列が、ＩＦＮ-γ，ＩＬ- 4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対して実質的に同一の結合能力を有する場合があることを示している。これらの理由から、本発明はまた、表３，４，７，８，10 および12に示した核酸リガンド（配列番号：７〜73，79〜185，189〜205，209〜 255）と実質的に同一の構造ならびにＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦ αに対する同一の結合能を有する核酸リガンドも包含する。ＩＦＮ-γ，ＩＬ-4 ，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対して実質的に同一の結合能力とは、本明細書に記載のリガンドの親和性の大きさから１または２オーダー以内の親和性を意味する。本明細書にとくに記載された配列と実質的に相同の与えられた配列が、ＩＦＮ -γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10 およびＴＮＦαに対して実質的に同一の結合能力を有するか否かの決定は十分に、本技術分野の通常の熟練者の技術の範囲内にある。本発明はまた、上述のリガンドにおいて、リガンドのインビボ安定性の増大またはリガンドの送達を増強または誘発するために、ある種の化学修飾が行われたリガンドを包含する。このような修飾の例には与えられた核酸配列の糖および／またはホスフェートおよび／または塩基位置での化学的置換が包含される。たとえば、1993年09月09日付出願の米国特許出願一連番号第08/117,991号（発明の名称：High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides）を参照されたい。この出願は引用により本明細書にとくに導入される。他の修飾は本技術分野の通常の熟練者には周知の通りである。このような修飾はポスト- セレックスによって（予め同定された非修飾リガンドの修飾）またはセレックス過程への導入によって行うことができる。上述のようにＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，ｈＴＮＦαおよびにＲＡＮＴＥＳに選択的に結合するそれらの能力によって、本明細書に記載されたＩＦＮ-γ，ＩＬ-4，ＩＬ-10，ＴＮＦαおよびにＲＡＮＴＥＳに対する核酸リガンドは医薬として有用である。したがって、本発明はまた、サイトカインに結合できる核酸リガンドを投与することによるサイトカイン機能の阻害方法を包含する。核酸リガンドの治療用組成物は、非経口的に注射によって投与することができるが、他の有効な投与形態、たとえば動脈内注射、吸入用のミスト、経口的に活性な処方、経皮的イオントホレーシスまたは坐剤も意図される。好ましい担体の一つは生理的食塩溶液であるが、他の医薬的に許容される担体も使用できる。好ましい一実施態様においては、担体とリガンドを生理的に適合性の徐放製剤に構成することも意図される。このような担体における一次溶媒は水性または本質において非水性の溶媒とすることができる。さらに担体は、製剤のｐＨ，浸透圧、粘度、澄明度、色度、滅菌性、安定性、溶解速度または臭気を改良または維持するために薬理学的に許容される他の賦形剤を含有していてもよい。同様に、担体にはさらに、リガンドの安定性、溶解速度、放出または吸収を改良または維持するために薬理学的に許容される賦形剤を含有させることができる。このような賦形剤は単位用量または多重用量形態の非経口投与用の剤形の製剤化に常用または慣用される物質である。治療用組成物が製剤化されたならば、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存することができる。このような製剤は、そのまま使用できる形態または投与直前に再構築が必要な形態で保存できる。核酸リガンドを含有する全身送達用の製剤の投与様式には、皮下、筋肉内、静脈内、経鼻、または膣もしくは直腸坐剤を介する様式がある。以下の実施例は、本発明の説明および例示のために提供されるものであって、本発明の限定を意図するものではない。実施例１．ＩＦＮ-γに対する 2'-ＮＨ₂および 2'-Ｆ-修飾リガンドのための実験操作この実施例は、ＩＦＮ-γに対する核酸リガンドの発生のために実施例２において追跡され導入される一般的操作を説明する。Ａ．オリゴヌクレオチド 2'Ｆ修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは Piekenら，1991 の方法に従って調製された。 2'ＮＨ₂修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは、1994年06月22日出願の McGee らの米国特許出願08/264,029号に従い調製した。この記載は引用により本明細書に導入される（McGeeら，1995 も参照）。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは Operon Technologies （Alameda，CA）によって合成された。Ｂ．セレックスセレックス操作は米国特許第 5,270,163号に詳細に記載されている（Tuerk & Gold，1990；Goldら，1993 も参照）。ＩＦＮ-γに対する高親和性リガンドの発生には３つのセレックス操作が実施された。各セレックス操作には以下のように 2'位置で修飾したピリミジンを含有するＲＮＡプールを使用した。１）2'Ｆと表示する2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'Ｆ-ＵＴＰ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂と表示する2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ，ならびに３）2'ＮＨ₂と表示する2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび2 'ＮＨ₂-ＵＴＰである。各セレックスのために、固定配列の5'および3'領域によって隣接される40ランダムヌクレオチドを含有するＤＮＡ鋳型40Ｎ7 を設計した（表１；配列番号：１）。固定領域はＰＣＲおよびｃＤＮＡ合成のためのＤＮＡプライマ−アニーリング部位ならびにインビトロ転写を可能にするコンセンサスＴ７プロモーター領域を包含する。一本鎖ＤＮＡプライマーおよび鋳型は合成し、ＰＣＲによって二本鎖の転写可能な鋳型に増幅した。ＲＮＡ分子の最初のプールの調製には 1000 pmole の一本鎖鋳型（表１；配列番号：１），および 2500 pmole の5'-（5Ｐ７；配列番号：１）と3'-（3Ｐ７；配列番号：２）の両プライマーのＰＣＲ増幅が包含された。これらを、50ｍＭＫＣl，10ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.3），3ｍＭＭgＣl2，0.5 ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する反応混合物中でインキュベートした。ＴaqＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Foster City CA）を 0.1Ｕ/μl で添加し、反応混合物を97℃で３分間インキュベートして、鋳型およびプライマーを変性した。最初の変性工程ののちに、反応を、93℃で30 秒，53℃で30秒ついで72℃で１分間にて10サイクル行い、プライマーおよび鋳型をそれぞれ変性、アニーリングおよび伸長した。最初のラウンドのセレックスのための二本鎖ＰＣＲ産物の正確な濃度を得るために、ＰＣＲ産物をＱＩＡquick- spinＰＣＲ精製カラム（QIAGEN Inc.,Chatsworth CA）を用い、製造業者の説明に従って精製した。修飾ヌクレオチドを用いるインビトロ転写には、二本鎖ＤＮＡ鋳型 200 pmole （終濃度１μＭ）を、40ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.0），12ｍＭＭgＣl₂，5ｍＭＤＴＴ，１ｍＭのスペルミジン，0.002％Ｔriton Ｘ-100，４％ＰＥＧ8000，0.5 μＭ α-³²Ｐ-ＡＴＰ，５Ｕ/μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Davanlooら，1984 ），および他のヌクレオチドを以下の濃度含有する反応混合物中でインキュベートした。１）2'Ｆセレックスには１ｍＭＡＴＰおよびＧＴＰ，３ｍＭ 2'Ｆ-ＣＴＰおよび 2'Ｆ-ＵＴＰ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂セレックスには、１ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰならびに３ｍＭ 2'Ｆ-ＣＴＰ，３）2'ＮＨ₂セレックスには、１ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰ，2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰを用いた。これらのインキュベーションは37℃のインキュベーター中で６時間〜１夜実施した。通常、ＲＮＡはゲル精製および溶出によって精製した。この方法を手早く行うためには、ラウンド11，12，および14〜17でＲＮＡを，Ｂio-Ｓpin 6 クロマトグラフィーカラム（Bio-Rad Laboratories，Hercules CA）を製造業者の説明書に従って用い精製した。バックグランドを下げるためには、1，2，4，6， 14，および 16 ラウンドを除くセレックスの全ラウンドの前にＲＮＡを前ろ過した。前ろ過工程は、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）を１ｍＭＭｇ²⁺イオンを含有するよう改良した（138ｍＭＮａＣｌ，2.7ｍＭＫＣｌ，8.1ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，1.1ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ 7.4）ｍＰＢＳ中，ＲＮＡを 200μｌまでとし、このＲＮＡ溶液を３個の予めｍＰＢＳで湿潤したフィルターディスク（0.45μm，ニトロセルロース／酢酸セルロース，Millipore Corpora tion，Bedford MA）を通してろ過した。最初の結合には、1000 pmole のＲＮＡを結合緩衝液［ｍＰＢＳ＋0.01％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）］中でヒトＩＦＮ-γタンパク質と 37℃で 5〜10分インキュベートして結合を生じさせた。このセレックス操作に使用したヒト組換えＩＦＮ-γは２つの異なるソースから購入した。2'Ｆおよび2'Ｆ/ＮＨ₂セレックス両者の最初の３ラウンドは Upstate Biotechnology，Lake Placid NY から入手したタンパク質を用いて行った。これらの２つのセレックス操作の以後のラウンドならびに2'ＮＨ₂セレックスの全ラウンドは Genzyme Inc.，Cambridge MA から入手したタンパク質を用いて実施した。セレックスの各ラウンドについて、ＲＮＡおよびタンパク質の濃度は至適の緊縮条件を与えるように注意深く選択した。セレックスの８〜13ラウンドでは、結合緩衝液にＮａＣｌを加えて最終塩素イオン濃度を 250ｎＭまでにして緊縮度を上昇させた。予備実験でＩＦＮ-γは高いタンパク質濃度では凝集する傾向を示した。この凝集したＩＦＮ-γに対して親和性を有するＲＮＡ種が発生するのを防止するため、セレックスのラウンド４の始めおよびセレックス操作の以後のすべてのラウンドで、結合混合物をニトロセルロースフィルター分配の前にエッペンドルフ遠心管中 16,000×g で３分間遠心分離した。ＩＦＮ-γ／ＲＮＡ複合体は、以下に述べるようにニトロセルロースフィルター分配によって非結合ＲＮＡから分離した。ニトロセルロース分配には、2'Ｆおよび2'Ｆ/ＮＨ₂セレックス操作の最初の２ラウンドでは 0.2μm 孔径の純粋なニトロセルロースフィルター（Scleicher & Schuell，Keene NH）を用いた。これらの２つのセレックス操作の以後の全ラウンドならびに2'ＮＨ₂セレックスの全ラウンドでは、0.45μm 孔径のニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックスフィルター（Millipore Corporation ，Bedford MA）で実施した。フィルターディスクを真空マニホールドにつなぎ、５ml のｍＰＢＳ緩衝液で湿潤させた。ＩＦＮ-γ／ＲＮＡ結合混合物をフィルターディスクを通して吸引し、これらを直ちに 5 ml のｍＰＢＳ緩衝液で洗浄した。緊縮度をさらに上昇させてバックグランドを下げるために、ラウンド 8〜13 および 15 においてはこの洗浄工程を改良し、0.5 Ｍ尿素 15 ml ついでｍＰＢＳ緩衝液 20 ml でのフィルターディスクの洗浄を包含させた。結合ＲＮＡはフィルターから、300 mlの７Ｍ尿素中 400 ml のフェノール（Ｔris-Ｃl，ｐＨ 8. 0 中に平衡化）の溶液（新たに調製）で抽出して単離した。フィルターはフェノール／尿素溶液に室温で30分間および95℃で２分間浸漬した。ＲＮＡはフェノール／クロロホルム抽出し、20 mg のｔＲＮＡとともにエタノール沈殿させた。ＲＮＡは、50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 8.3），60ｍＭのＮａＣｌ，６ｍＭＭｇ (０Ａc)₂，10ｍＭＤＴＴを含有する緩衝液中 50 pmole のＤＮＡプライマー，0 .4ｍＭの各ｄＮＴＰ，ならびに１Ｕ/μl のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶＲＴ）（ Life Sciences，Inc.，St．Petersburg FL）を加えてｃＤＮＡに逆転写した。反応混合物は、単離されたＲＮＡ中に存在する二次構造の融解を保証するため、37 ℃で30分間ついで70℃で10分間インキュベートした。セレックスの新ラウンドを開始するためには、 250 pmole の 5'（5Ｐ7；配列番号：２）および 3'（3Ｐ7；配列番号：３）の両プライマーを添加して上述したのと同じ反応条件下に、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡの増幅に必要なＰＣＲのサイクル数は次のラウンドのセレックスが 250 pmole の二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて開始されるようにセレックスの各ラウンドで注意深く計算した。Ｃ．平衡解離定数（Ｋd）ＲＮＡプールについての平衡解離定数（Ｋd）の測定は、各セレックスの進行をモニターするために、ラウンド５，８，12，および17に続いて実施した。マウスＩＦＮ-γ（Genzyme Inc.，Cambridge MA）についてのＲＮＡプールのＫd もラウンド８および17ののちに測定した。Ｋd は個々のリガンドについて、ＲＮＡプールのクローニングおよび配列決定後、ならびに末端切断後（下記参照）にも測定した。Ｋd の測定にはニトロセルロースフィルター結合を以下のように使用した。フィルターディスクを真空マニホールドにつなぎ、5 ml のｍＰＢＳ緩衝液で湿潤させた。³²Ｐ-標識ＲＮＡを結合緩衝液中ＩＦＮ-γの希釈系列と37℃で５〜10分間インキュベートして結合を生じさせた。結合混合物を上述のように遠心分離して凝集物を除去し、フィルターディスクを通して吸引し、ついで直ちに 5 ml のｍＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。フィルターディスクを乾燥し、液体シンチレーションカウンター（Beckmann Instruments，Palo Alto，CA）中でカウントした。平衡解離定数は、Kaleidagraph（登録商標）グラフィックスプログラム（Svnergy Software，Reading PA）を用いてデータ点の最小自乗フィッティングにより決定した。多くのリガンドおよび発生したＲＮＡプールで二相性の結合曲線が得られた。二相性の結合は平衡にない２つの親和性種の結合として説明することができる。二相性結合定数は標準操作に従い計算した。Ｋdは Kaleidagraph （登録商標）グラフィックスプログラムを用いてデータ点の最小自乗フィッティングにより決定した。Ｄ．クローニングおよび配列決定第17ラウンドのセレックス後に、ＲＮＡ分子をｃＤＮＡに逆転写して、制限エンドヌクレアーゼＨindIII（表１；5'プライマー 5Ｐ7Ｈ；配列番号：４）およびＢamＨＩ（表１；3'プライマー 3Ｐ7Ｈ；配列番号：５）に対する認識部位を含有するプライマーでのＰＣＲ増幅によって二本鎖を作成した。これらの制限部位を用いＤＮＡ配列を直接ｐＵＣ19ベクターに挿入した。これらの組換えプラスミドを Epicurian coli ＪＭ109 コンピテント細胞（Stratagene，La Jolla，CA ）にトランスフォームした。プラスミドＤＮＡはＰＥＲＦＥＣＴ_prep（登録商標）プラスミドＤＮＡキット（５プライム→３プライム，Boulder CO）により調製した。プラスミドクローンはＰＣＲ配列決定プライマーｐＵＣ19Ｆ30（配列番号：６）を用いて、ＰＣＲ配列決定プロトコール（Adamsら，1991）により、配列を決定した。Ｅ．リガンドの末端切断境界実験は、末端標識ＲＮＡを用い、ＩＦＮ-γに対するＲＮＡリガンドの高親和性結合に必要な最少配列を決定するために実施した。末端標識の前に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたＲＮＡをＵＶシャドーイングによってゲル精製した。各ＲＮＡ 20 pmole の 5'末端を 20ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.0），10 ｍＭＭgＣl₂，0.1Ｕ/μl のエビアルカリホスファターゼ（SAP；United States Biochemical，Cleveland，OH）を含む反応混合物中37℃で30分間インキュベートして脱リン酸化した。70℃で30分間インキュベートしてアルカリホスファターゼの活性を破壊した。ついで 50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 7.5），10ｍＭＭgＣｌ₂ ，5ｍＭのＤＴＴ，0.1ｍＭＥＤＴＡ，0.1ｍＭのスペルミジン，0.75ｍＭ g-³² Ｐ-ＡＴＰおよび１Ｕ/μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biola bs，Beverly MA）を含有する反応混合物中ＲＮＡを37℃で30分間インキュベートして 5'-末端標識した。各ＲＮＡ 20 pmole の 3'末端の標識には、50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 7.8）， 10ｍＭのＭgＣｌ₂，10ｍＭのβ-メルカプトエタノール，1ｍＭＡＴＰ，0.9ｍＭ (5'-³²Ｐ)ｐＣｐおよび１Ｕ/μl のＴ４ＲＮＡリガーゼ（New England Biolabs ，Beverly MA）を含有する反応混合物中４℃で18時間インキュベートを実施した。5'- および 3'-末端標識ＲＮＡは、12％，８Ｍ尿素、ポリアクリルアミドゲル上ゲルバンド精製した。終濃度50ｍＭになるようにＮａ₂ＣＯ₃を加えて沸騰水浴中で３分間インキュベートして末端標識ＲＮＡを部分アルカリ加水分解したのち、放射標識ＲＮＡリガンドをＩＦＮ-γと３種の異なるタンパク質濃度、１）おおよそのＫd値の５分の１，２）ほぼＫd値および３）おおよそのＫd値の５倍でインキュベートした。タンパク質結合ＲＮＡをニトロセルロース分配により分離した。末端切断ＲＮＡを高分解能変性12％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。配列を配向させるために、Ｇ-残基で終わる放射標識リガンドのラダーを末端標識ＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって発生させた。Ｔ１消化は、７Ｍ尿素， 20ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ 5.0），１ｍＭＥＤＴＡならびに５単位のＲＮアーゼＴ１（Boehringer Mannheim，Indianapolis IN）を含有する反応混合物中50℃で５分間インキュベートして行った。Ｔ７プロモーターの配列（5'-ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ-3'；配列番号：２のフラグメント）を含む相補性一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと末端切断リガンドの配列をアニーリングして、各末端切断リガンドの転写のための二本鎖鋳型を形成させた。Ｆ．受容体結合コンペティションヒト肺癌細胞（Ａ549；ＡＴＣＣ）を、ＲＰＭＩ1640および10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中 24-ウエルプレートに 5×10⁵細胞/ウエルの密度でプレーティングし、一夜またはコンフルーエントになるまでインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。生育培地を、200μl のＲＰＭＩ1640＋0.2％ヒト血清アルブミン／0.02％ナトリウムアジド／20ｍＭＨepes，ｐＨ 7.4 に置換し、それと同時に過剰（200倍）の非標識ＩＦＮ-γの存在下または不存在下に、¹²⁵Ｉ-ＩＦＮ- γ（New England Nuclear）の量を増大させていった（20 pg/ml〜100 ng/ml）。インキュベーションは振盪しなが４℃で２時間行った。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄して遊離のＩＮＦを除去し、0.5％ＳＤＳで解離させた。解離した細胞の放射能をガンマカウンターで測定して細胞に会合した¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ-γを測定した。データは非特異的結合で補正し、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ-γの親和性を結合データのスキャッチャード分析によって求めた。スキャッチャード分析から、高親和性結合部位（Ｋd＝20ｐＭ）と低親和性結合部位（Ｋd＝0.5ｎＭ）の存在が示唆される。オリゴヌクレオチドとのコンペティションには、細胞を 30ｐＭの¹²⁵Ｉ-ＩＦＮ- γおよびコンペティターオリゴヌクレオチドを、後者の濃度を上昇させていって（1.01〜500ｎＭ）上述のように４℃で２時間インキュベートした。細胞に会合した¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ-γを上述のように測定した。実施例２．ＩＦＮ-γに対する 2'-ＮＨ₂および 2'-Ｆ修飾ＲＮＡリガンドＡ．セレックスピリミジンの2'位置にて修飾されたＲＮＡの３つのライブラリー，１）2'Ｆ- ＣＴＰおよび2'Ｆ-ＵＴＰ導入2'Ｆ，２）2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ導入 2'Ｆ/ＮＨ₂，および３）2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ導入2'ＮＨ₂を、同時セレックスプロトコールにおいて使用し、ヒトＩＦＮ-γに対する高親和性修飾ＲＮＡリガンドの多様なセットを発生させた。これらの各ライブラリーには 40ヌクレオチドの可変領域を有する分子10¹³〜10¹⁴個が含有された。セレックスに使用した鋳型およびプライマーならびにセレックスの条件は実施例１に記載した通りで、それぞれ表１および２にまとめる。Ｂ．ＲＮＡ配列および解離定数ランダム修飾ＲＮＡプールはヒトＩＦＮ-γを、0.7μＭ以上のおおよそのＫd 値で結合した。17ラウンドのセレックス後、進化したプールのおおよそのＫd 値は、１）2'Ｆセレックスで 70ｎＭ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂セレックスで 115ｎＭ，３）2'ＮＨ₂セレックスで20ｎＭに改善された。マウスＩＦＮ-γについては、17ラウンドのセレックス後のＲＮＡプールのおおよそＫd 値は、１）2'Ｆセレックスで410ｎＭ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂セレックスで 175ｎＭ，３）2'ＮＨ₂セレックスで 8 5 ｎＭであった。以後のラウンドでこれらのＫd 値がさらにシフトすることはなかった。進化したプールが依然としてランダムである程度を測定するために、セレックスの最終ラウンドからのＰＣＲ産物の配列を上に詳述したように決定したところランダムではなかった。17回目のラウンドからのＲＮＡを逆転写し、増幅し、クローン化した。2'Ｆの32個、2'ＮＨ₂の40個および2'Ｆ/ＮＨ₂の11個の各クローンの配列を決定した（表３；配列番号：７〜65）。配列を保存された配列について解析し、この基準によりアラインした（表３）。2'Ｆ配列は２つのグループに分かれ、９個のオーファン配列があった。2'ＦＲＮＡのグループ１は最も多く、32中18配列が含まれ、一方、2'ＦＲＮＡのグループ２には32中５配列が含まれた。2'ＮＨ₂配列は２つのグループに分かれ、40の2'ＮＨ₂ ＲＮＡ中25がグループ１に、40の2'ＮＨ₂ＲＮＡ中15がグループ２に包含された。2'Ｆ/ＮＨ₂配列は単一のグループから構成された。各グループ内の個々のＲＮＡのＫd 値を上述のように、ニトロセルロースフィルター結合によって測定した。Ｋd 値はデータの一相性または二相性最小自乗フィッティングを用いて決定した。最善のクローンの高親和性結合に必要な最少の配列を上述の 5'および 3'境界実験によって決定した。末端切断ＲＮＡはＴ７プロモーターと末端切断配列を含有する二本鎖鋳型から転写した。転写が成功したものについて、末端切断リガンドのＫd 値を測定した。末端切断リガンドの配列ならびに完全長および末端切断（測定した場合）リガンド両者のＫd 値を表４に示す（配列番号：66〜73）。Ｃ．受容体コンペティション完全長 2'ＮＨ₂（2'ＮＨ₂-random，2'ＮＨ₂-17，2'ＮＨ₂-30）および2'Ｆ（2' Ｆ-random，2'Ｆ-28）オリゴヌクレオチドの両者についてそれらの受容体結合阻害能を試験した。このコンペティションは 30ｐＭの濃度の¹²⁵Ｉ-ＩＦＮ-γを用い、主として高親和性結合成分を標的とした。この濃度で 2'ＮＨ₂または 2'Ｆのランダムオリゴはいずれも阻害を示さなかったが、試験した４つのクローンでは様々な程度の阻害が観察された。2'ＮＨ₂リガンド #30（配列番号：72）は最高の阻害剤で、10ｎＭで50％阻害を示した。実施例３．ＩＬ-4 に対する 2'-ＮＨ₂および 2'-Ｆ修飾ＲＮＡリガンドのための実験操作この実施例は、ＩＬ-4 に対する核酸リガンドの発生のために実施例４において追跡され導入される一般的操作を提供する。Ａ．オリゴヌクレオチド 2'Ｆ修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは Piekenら，1991 の方法に従って調製された。 2'ＮＨ₂修飾ＣＴＰおよびＵＴＰは、1994年06月22日出願の McGee らの米国特許出願08/264,029号の方法に従い調製した。この記載は引用により本明細書に導入する（McGeeら，1995 についても参照）。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは Operon Technologies（Alameda，CA）によって合成された。Ｂ．セレックスセレックス操作は米国特許第 5,270,163号に詳細に記載されている（Tuerk & Gold，1990；Goldら，1993 も参照）。ＩＬ-4 に対する高親和性リガンドの発生には３つのセレックス操作が実施された。各セレックス操作には、以下のように 2'位置で修飾したピリミジンを含有するＲＮＡプールを使用した。１）2'Ｆと表示する2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'Ｆ-ＵＴＰ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂と表示する2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ，ならびに３）2'ＮＨ₂と表示する2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび2 'ＮＨ₂-ＵＴＰである。各セレックスのために、固定配列の5'および3'領域によって隣接される40ランダムヌクレオチドを含有するＤＮＡ鋳型40Ｎ8 を設計した（表５；配列番号：74）。固定領域はＰＣＲおよびｃＤＮＡ合成のためのＤＮＡプライマーアニーリング部位ならびにインビトロ転写を可能にするコンセンサスＴ７プロモーター領域を包含する。一本鎖ＤＮＡプライマーおよび鋳型は合成し、ＰＣＲによって二本鎖の転写可能な鋳型に増幅した。ＲＮＡ分子の最初のプールの調製には 1000 pmole の一本鎖鋳型（表５；配列番号：74），および 2500 pmole の 5'-（5Ｐ8；配列番号： 75）と 3'-（3Ｐ8；配列番号：76）の両プライマーのＰＣＲ増幅が包含された。これらを、50ｍＭＫＣl，10ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.3），3ｍＭＭgＣl₂，0.5 ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する反応混合物中でインキュベートした。ＴaqＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Foster City ，CA）を 0.1Ｕ/μl で添加し、反応混合物を 97℃で３分間インキュベートして、鋳型およびプライマーを変性した。最初の変性工程ののちに、反応を、93℃で 30 秒，53℃で30秒ついで72℃で１分間で７回サイクルし、プライマーならびに鋳型をそれぞれ変性、アニーリングおよび伸長した。最初のラウンドのセレックスのための二本鎖ＰＣＲ産物の正確な濃度を得るために、ＰＣＲ産物をＱＩＡquick- spinＰＣＲ精製カラム（QIAGEN Inc.，Chatsworth CA）を用い、製造業者の説明に従って精製した。修飾ヌクレオチドを用いるインビトロ転写には、二本鎖ＤＮＡ鋳型 200 pmole （終濃度１μＭ）を、40ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.0）．12ｍＭＭgＣl₂，5ｍＭＤＴＴ，１ｍＭのスペルミジン，0.002％Ｔriton Ｘ-100，４％ＰＥＧ8000，0.5 μＭ α-³²Ｐ 2'ＯＨＡＴＰ，5Ｕ/μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Davanlooら， 1984），および他のヌクレオチドを以下の濃度で含有する反応混合物中でインキュベートした。１）2'Ｆセレックスには１ｍＭＡＴＰおよびＧＴＰ，３ｍＭ 2' Ｆ-ＣＴＰおよび 2'Ｆ-ＵＴＰ，２）2'Ｆ/ＮＨ₂セレックスについては、１ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰと 2'ＮＨ₂-ＵＴＰならびに３ｍＭ 2'Ｆ-ＣＴＰ，３）2'ＮＨ₂セレックスについては、１ｍＭＡＴＰ，ＧＴＰ，2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび 2'ＮＨ₂- ＵＴＰを用いた。これらのインキュベーションは、37℃のインキュベーター中で６時間〜１夜実施した。通常、ＲＮＡはゲル精製および溶出によって精製した。この方法を手早く行うために、ラウンド11，12，および14〜17でＲＮＡをＢio- Ｓpin 6 クロマトグラフィーカラム（Bio-Rad Laboratories，Hercules CA）を製造業者の説明書に従って用い精製した。バックグランドを下げるためには、1 ，2，4，6，14，および 16 ラウンドを除くセレックスの全ラウンドの前にＲＮＡを前ろ過した。前ろ過工程は、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）を１ｍＭＭｇ² ⁺ イオンを含有するよう改良したｍＰＢＳ（138ｍＭＮａＣｌ，2.7ｍＭＫＣｌ，8.1ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，1.1ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ 7.4）中にＲＮＡを 200μl として、このＲＮＡ溶液を３個の予めｍＰＢＳで湿潤させたフィルターディスク（0.45μm，ニトロセルロース／酢酸セルロース，Millipo re Corporation，Bedford MA）を通してろ過した。最初の結合には、1000 pmole のＲＮＡを結合緩衝液［ｍＰＢＳ＋0.01％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）］中でヒトＩＬ-4 と37℃で 5〜10分インキュベートして結合を生じさせた。このセレックス操作に使用したヒト組換えＩＬ-4 については R & D Systems，Minneapolis MN から購入した。セレックスの各ラウンドについて、ＲＮＡおよびタンパク質の濃度は至適の緊縮条件を与えるように注意深く選択した。予備実験でＩＬ-4 は高いタンパク質濃度では凝集する傾向を示した。この凝集したＩＬ-4 に対して親和性を有するＲＮＡ種が発生するのを防止するため、セレックスのラウンド４の始めおよびセレックス操作の以後のすべてのラウンドで、結合混合物をニトロセルロースフィルター分配の前にエッペンドルフ遠心管中 16,000×g で３分間遠心分離した。ＩＬ-4／ＲＮＡ複合体は以下に述べるようにニトロセルロースフィルター分配によって非結合ＲＮＡから分離した。ニトロセルロース分配には、2'Ｆおよび2'Ｆ/ＮＨ₂セレックス操作の最初の２ラウンドでは 0.2μm 孔径の純粋なニトロセルロースフィルター（Scleicher & Schuell，Keene，NH）を用いた。これらの２つのセレックス操作の以後のラウンドならびに2'ＮＨ₂セレックスの全ラウンドでは 0.45μm 孔径のニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックスフィルター（Millipore Corporation，Bed ford，MA）を使用した。フィルターディスクを真空マニホールドにつなぎ、5 ml のｍＰＢＳ緩衝液で湿潤させた。ＩＬ-4／ＲＮＡ結合混合物をフィルターディスクを通して吸引し、ディスクを直ちに 5 ml のｍＰＢＳ緩衝液で洗浄した。緊縮度をさらに上昇させてバックグランドを下げるために、ラウンド 8〜13，および 15 においてはこの洗浄工程を改良し、0.5 Ｍ尿素 15 ml ついでｍＰＢＳ緩衝液 20 ml でのフィルターディスクの洗浄を包含させた。結合ＲＮＡはフィルターから、300μl の７Ｍ尿素中 400μl のフェノール（Ｔris-Ｃl，ｐＨ 8.0 中に平衡化）の溶液（新たに調製）で抽出して単離した。フィルターはフェノール／尿素溶液に室温で30分間および95℃で２分間浸漬した。ＲＮＡはフェノール／クロロホルム抽出し、20μｇのｔＲＮＡとともにエタノール沈殿させた。ＲＮＡは、50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 8.3）．60ｍＭのＮａＣｌ，６ｍＭＭｇ(０Ａc)₂，10ｍＭＤＴＴを含有する緩衝液中 50 pmole のＤＮＡプライマー，0.4ｍＭの各ｄＮＴＰ，ならびに１Ｕ/μl のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶＲＴ）（Life Sciences，Inc.，St．Petersburg FL）を加えてｃＤＮＡに逆転写した。反応混合物は、単離されたＲＮＡ中に存在する二次構造の融解を保証するため、 37℃で30分間ついで70℃で10分間インキュベートした。セレックスの新ラウンドを開始するためには、 250 pmole の 5'（5Ｐ8；配列番号：75）および 3'（3Ｐ8；配列番号：76）の両プライマーを添加して上述したのと同じ反応条件下に、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡの増幅に必要なＰＣＲのサイクル数は次のラウンドのセレックスが 250 pmole の二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて開始されるようにセレックスの各ラウンドで注意深く計算した。Ｃ．平衡解離定数（Ｋd）ＲＮＡプールについての平衡解離定数（Ｋd）の測定は、各セレックスの進行をモニターするために、ラウンド５，８，12，および17に続いて実施した。マウスＩＬ-4（R & D Systems，Minneapolis，MN）についてのＲＮＡプールのＫd もラウンド８ののちに測定した。Ｋd は個々のリガンドについて、ＲＮＡプールのクローニングおよび配列決定後ならびに末端切断後（下記参照）にも測定した。Ｋd の測定にはニトロセルロースフィルター結合を以下のように使用した。フィルターディスクを真空マニホールドにつなぎ、5 ml のｍＰＢＳ緩衝液で湿潤させた。³²Ｐ-標識ＲＮＡを結合緩衝液中ＩＬ-4 の希釈系列と37℃で５〜10分間インキュベートして結合を生じさせた。結合混合物を、上述のように遠心分離して凝集物を除去し、フィルターディスクを通して吸引し、ついで、直ちに 5 ml のｍＰＢＳ緩衝液にて洗浄した。フィルターディスクを乾燥し、液体シンチレーションカウンター（Beckmann Instruments，Palo Alto，CA）中でカウントした。平衡解離定数は Kaleidagraph（登録商標）グラフィックスプログラム（Synergy Software，Reading PA）を用いてデータ点の最小自乗フィッティングにより決定した。多くのリガンドおよび発生したＲＮＡプールで二相性の結合曲線が得られた。二相性の結合は平衡にない２つの親和性種の結合として説明できる。二相性結合定数は標準操作に従い計算した。Ｋdは Kaleidagraph（登録商標）グラフィックスプログラムを用いデータ点の最小自乗フィッティングにより決定した。Ｄ．クローニングおよび配列決定第17ラウンドのセレックス後に、ＲＮＡ分子をｃＤＮＡに逆転写して、制限エンドヌクレアーゼＨindIII（表５；5'プライマー 5Ｐ8Ｈ；配列番号：77）およびＢamＨＩ（表５；3'プライマー 3Ｐ8Ｈ；配列番号：78）に対する認識部位を含有するプライマーでのＰＣＲ増幅によって二本鎖を作成した。これらの制限部位を用いＤＮＡ配列を直接ｐＵＣ19ベクターに挿入した。これらの組換えプラスミドを Epicurian coli ＪＭ109 コンピテント細胞（Stratagene，La Jolla，CA）にトランスフォームした。プラスミドＤＮＡはＰＥＲＦＥＣＴ_prep（登録商標）プラスミドＤＮＡキット（５プライム→３プライム，Boulder CO）により調製した。プラスミドクローンはＰＣＲ配列決定プライマーｐＵＣ19Ｆ30（配列番号：６）を用い、ＰＣＲ配列決定プロトコール（Adamsら，1991）によって配列を決定した。Ｅ．リガンドの末端切断境界実験は、末端標識ＲＮＡを用い、ＩＬ-4 に対するＲＮＡリガンドの高親和性結合に必要な最少配列を決定するため実施した。末端標識の前にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写したＲＮＡをＵＶシャドーイングによってゲル精製した。各ＲＮＡ 20 pmole の 5'末端を、20ｍＭＴris-Ｃl（ｐＨ 8.0），10ｍＭＭgＣl₂および 0.1U/μl のエビアルカリホスファターゼ（SAP；United States Biochemical，Cleveland，OH）を含有する反応混合物中37℃で30分間インキュベートして脱リン酸化した。70℃で30分間インキュベートして、アルカリホスファターゼの活性を破壊した。ついで、50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 7.5），10ｍＭのＭgＣl₂，5ｍＭのＤＴＴ，0.1ｍＭＥＤＴＡ．0.1ｍＭスペルミジン，0.75ｍＭ g-³²Ｐ-ＡＴＰ，および１Ｕ/μl Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs，Beverly MA）を含有する反応混合物中ＲＮＡを37℃で30分間インキュベートして 5'-末端標識した。各ＲＮＡ 20 pmole の 3'末端標識には、50ｍＭのＴris-Ｃl（ｐＨ 7.8），10 ｍＭのＭgＣl₂，10ｍＭのβ-メルカプトエタノール，1ｍＭのＡＴＰ，0.9ｍＭの (5'-³²Ｐ)ｐＣｐおよび１Ｕ/μl のＴ４ＲＮＡリガーゼ（New England Biolabs ，Beverly MA）を含有する反応混合物中４℃で18時間のインキュベーションを実施した。5'- および 3'-末端標識ＲＮＡは、12％，８Ｍ尿素、ポリアクリルアミドゲル上ゲルバンド精製した。終濃度50ｍＭになるようにＮａ₂ＣＯ₃を加えて沸騰水浴中３分間インキュベートして末端標識ＲＮＡを部分アルカリ加水分解したのち、放射標識ＲＮＡリガンドをＩＬ-4 と３種の異なるタンパク質濃度、１）おおよそのＫd 値の５分の１，２）ほぼＫd 値および３）おおよそのＫd 値の５倍でインキュベートした。タンパク質結合ＲＮＡをニトロセルロース分配により分離した。末端切断ＲＮＡを高分解能変性12％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。配列を配向させるために、Ｇ-残基で終わる放射標識リガンドのラダーを末端標識ＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって発生させた。Ｔ１消化は７Ｍ尿素， 20ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ 5.0），１ｍＭＥＤＴＡ，および５単位のＲＮアーゼＴ１（Boehringer Mannheim，Indianapolis IN）を含有する反応混合物中 50℃で５分間インキュベートして行った。Ｔ７プロモーターの配列（5'-ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ-3'；配列番号：75のフラグメント）を含む相補性一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと末端切断リガンドの配列をアニーリングして、各末端切断リガンドの転写のための二本鎖鋳型を形成させた。Ｆ．受容体結合コンペティションヒトＴ細胞リンパ腫細胞（Ｈ−９；ＡＴＣＣ）を、ＲＰＭＩ1640＋10％ＦＢＳ中に懸濁して培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、1.5 ml ポリプロピレンチューブ（Eppendorf，W．Germany）中、ＲＰＭＩ1640＋0.02％ヒト血清アルブミン／0.2％ナトリウムアジド／20ｍＭＨepes，ｐＨ 7.4 を含有する培地 200μl に再懸濁し（5×10⁵細胞）、200倍過剰の非標識サイトカインの存在下または不存在下に，¹²⁵Ｉ−ｒＩＬ-4 の様々な量と４℃で２時インキュベートした。インキュベーション後、チューブを遠心分離し（150×g，５分４℃）、上清を吸引した。細胞ペレットを 200μl のＲＰＭＩ-ＨＳＡに再懸濁した。100μl のアリコートを等容量のフタレートオイル（ジブチル／ジオクチル，1:1 v/v）のクッションにより遠心分離した。チューブを直ちにドライアイス／エタノール中で凍結し、細胞ペレットを含有するチップを切り取りバイアル中に取ってガンマーカウンターで計測した。データは非特異的結合で補正し，¹²⁵Ｉ−ＩＬ-4 の親和性をスキャッチャード分析によって決定した。オリゴヌクレオチドもしくは中和抗体（R & D Systems）とのコンペティションには、細胞を上述のように、0.7ｎＭの¹²⁵ Ｉ−ＩＬ-4 およびコンペティターオリゴヌクレオチドを後者の濃度を上昇させていって（1.01〜500ｎＭ）４℃で２時間インキュベートした。細胞に会合した¹²⁵Ｉ−ＩＬ-4 を上述のように測定した。実施例４．ＩＬ-4 に対する 2'-ＮＨ₂および 2'-Ｆ修飾ＲＮＡリガンドＡ．セレックスピリミジンの 2'位置にて修飾されたＲＮＡの３つのライブラリー，１）2'Ｆ- ＣＴＰおよび2'Ｆ-ＵＴＰ導入2'Ｆ，２）2'Ｆ-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ導入 2'Ｆ/ＮＨ₂，および３）2'ＮＨ₂-ＣＴＰおよび2'ＮＨ₂-ＵＴＰ導入 2'ＮＨ₂を、同時セレックスプロトコールによって使用し、ヒトＩＬ-4 に対する高親和性修飾ＲＮＡリガンドの多様なセットを発生させた。これらの各ライブラリーは40ヌクレオチドの可変領域を有する分子10¹³〜10¹⁴個を含有した。セレックスに使用した鋳型およびプライマーならびにセレックスの条件は実施例３に記載した通りで、それぞれ表５および６にまとめる。Ｂ．ＲＮＡ配列および解離定数ランダム修飾ＲＮＡプールはヒトＩＬ-4 を、20μＭ以上のおおよそのＫd値で結合した。17ラウンドのセレックス後、進化したプールのおおよそのＫd 値は、１）2'Ｆセレックスで30ｎＭおよび２）2'Ｆ/ＮＨ₂セレックスで55ｎＭに改善された。より初期のラウンドからの2'ＮＨ₂ＲＮＡについて実施した結合曲線はおおよそのＫd値 100ｎＭを示したが、このセレックスではバックグランドの低下が困難で、17ラウンド後の見掛けのＫd 値は１μＭであった。バックグランドによるこの「マースキング」にもかかわらず、17ラウンド後のプールにはなお高親和性のユニークな配列の2'ＮＨ₂ＲＮＡが存在したものと感じられた。以後のラウンドでこれらのＫd 値がさらにシフトすることはなかった。８ラウンドのセレックス後のＲＮＡプールはマウスＩＬ-4 に結合しなかったが、８ラウンド後にはヒトタンパク質に対する結合に、有意な改善が認められた（データは示していない）。進化したプールが依然としてランダムである程度を測定するために、セレックスの最終ラウンドからのＰＣＲ産物の配列を上に詳述したように決定したところランダムではなかった。第17回目のラウンドからのＲＮＡを逆転写し、増幅し、クローン化した。2'Ｆの41個、2'ＮＨ₂の57個、および2'Ｆ/ＮＨ₂の30個の各クローンの配列を決定した（表７；配列番号：79〜177）。配列を保存された配列について解析し、この基準によりアラインした（表７）。2'Ｆ配列は41配列中29 個からなる単一のグループが存在した。残りの12のクローンは、主要グループともまた相互にも配列ホモロジーを欠くことにより、オーファン配列として分類された。2'ＮＨ₂配列は２つの配列の異なるグループに分かれた。57配列中 21のグループ１が、ＩＬ-4 に結合を示した。57配列中35の他のグループはニトロセルロースフィルターに結合を示した。このような多数のニトロセルロースフィルター結合ＲＮＡの存在は、これらの配列が高いバックグランドを有するプールからクローン化されたことから驚くべきことではなかった。これらニトロセルロースフィルター結合ＲＮＡは配列ＧＧＡＧＧの直接リピートの存在によって同定された。単一のオーファン 2'ＮＨ₂配列も見出された。2'Ｆ/ＮＨ₂配列はさらに不均一で、配列は３つのグループに分かれた。グループ１および２のＲＮＡはＩＬ-4 に結合したが、第三のグループはニトロセルロースフィルターに結合した。ニトロセルロースフィルター結合グループも配列ＧＧＡＧＧの単独配列またはリピートを含有した。この配列は 3'-固定領域にも見出されたことを留意すべきである（表７中に下線を付す）。各グループ内の個々のＲＮＡのＫd 値を実施例３に上述したように、ニトロセルロースフィルター結合によって測定した。Ｋd 値はデータの一相性最小自乗フィッティングを用いて決定した。最善のクローンの高親和性結合に必要な最少の配列を実施例３に上述したように、5'および3'境界実験によって決定した。末端切断ＲＮＡはＴ７プロモーターと末端切断配列を含有する二本鎮鋳型から転写した。転写が成功したものについて、末端切断リガンドのＫd 値を求めた。末端切断リガンドの配列ならびに完全長および末端切断（測定した場合には）リガンド両者のＫd 値を表８に示す（配列番号：178〜185）。Ｃ．受容体コンペティション完全長2'ＮＨ₂（2'ＮＨ₂random，2'ＮＨ₂-29），2'Ｆ（2'Ｆrandom，2'Ｆ-9）および 2'Ｆ/ＮＨ₂（2'Ｆ/ＮＨ₂random，2'Ｆ/ＮＨ₂-9 および 2'Ｆ/ＮＨ₂-28）オリゴヌクレオチドについてそれらの受容体結合阻害能を試験した。このＩＬ-4 濃度では 2'ＮＨ₂，2'Ｆまたは 2'Ｆ/ＮＨ₂のランダムオリゴはいずれも阻害を示さなかったが、試験したクローンでは様々な程度の阻害が観察された。ＩＬ-4 濃度 0.7ｎＭで 2'Ｆ/ＮＨ₂-9 は受容体結合の最善のコンペティターであり約40 ｎＭで50％阻害を示した。このオリゴヌクレオチドによるコンペティションは、ＩＬ-4 に対する中和抗体により観察されるコンペティションと類似していた。実施例５．ＩＬ-10 に対する 2'-Ｆ修飾リガンドのための実験操作この実施例は、ＩＬ-10 に対する核酸リガンドの発生のために実施例６において追跡され導入される一般的操作を提供する。Ａ．材料ＤＮＡ配列は標準固相化学によってシアノエチルホスホルアミダイトを用いて合成された。2'ＦＣＴＰおよび2'ＦＵＴＰは United States Biochemicals から購入した。ヒトＩＬ-10 は Bachem もしくは R & D Systems から購入した。中和抗-ヒトＩＬ-10 モノクローナル抗体、マウスＩＬ-10，およびヒトＩＬ-10 ＥＬＩＳＡ検出キットは R & D Systems から購入した。Ｂ．セレックス８％ポリアクリルアミドゲル上で変性条件下に精製された合成ＤＮＡ 5 pmole を４サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、それぞれ２ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ，それぞれ３ｍＭの 2'Ｆ-ＣＴＰおよび 2'Ｆ-ＵＴＰ，40ｍＭＴris-ＨＣl（ｐＨ 8.0），12ｍＭＭgＣl₂，１ｍＭのスペルミジン，5ｍＭＤＴＴ，0.002％Ｔriton Ｘ-100，ならびに４％ポリエチレングリコール（v/v）を含有する反応混合物 1 mL 中Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（1000Ｕ）により12時間インビトロ転写した。完全長転写産物（配列番号：186 ）を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で精製し、ＴＢＳ緩衝液［100ｍＭＴri s-ＨＣl（ｐＨ 7.5），150ｍＭＮａＣｌ）］（結合緩衝液）に懸濁し 70℃に加熱し、氷上で冷却しついでＩＬ-10 と37℃で10分間インキュベートした。ＲＮＡ -タンパク質混合物を予め湿潤させたニトロセルロースフィルターでろ過し、ついで 5 mL の結合緩衝液で洗浄した。結合したＲＮＡをフィルターから溶出させ、エタノール沈殿で回収した。ＲＮＡをニワトリ骨髄芽球性白血病ウイルス逆転写酵素（Life Sciences）により、5'-ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ-3'プライマー（表９；配列番号：188）を使用して48℃で逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲ［5'および3'プライマー（配列番号：187および188］によって増幅し、得られたＤＮＡ鋳型を転写し次の選択ラウンドのためのＲＮＡを得た。セレックスの経過時に、ＩＬ-10 の濃度を５μＭから500μＭに徐々に低下させて選択圧を漸次上昇させた。選択過程は、濃縮されたＲＮＡのＩＬ-10 に対する親和性が実質的に増大するまで反復した。その時点で、ｃＤＮＡを 5'および 3' 末端にそれぞれＢamＨＩおよびＨindIII制限部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＢamＨＩおよびＨindIIIで消化し、同じ酵素で消化したｐＵＣ18にクローン化した。個々のクローンについて標準方法でスクリーニングし配列を決定した。Ｃ．平衡解離定数（Ｋd）の測定内部標識ＲＮＡ転写体をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写反応に［α-³²Ｐ］ＡＴＰを包含させて調製した。完全長転写体を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で精製して、サイズの均一性を保証した。ゲル精製ＲＮＡをＴＥＭ緩衝液に約５ｎＭの濃度に希釈し、80℃に加熱し、ついで氷上で冷却して二次構造の形成を促進した。ＲＮＡ濃度は結合反応中、100ｐＭ以下に維持した。簡略に述べれば、等量のＲＮＡをＴＥＭ緩衝液 50μL 中様々な量のＩＬ-10 と37℃で10分間インキュベートした。ＲＮＡ-タンパク質混合物を予め湿潤させたニトロセルロースフィルター（0.2μ）に通し、直ちに 5 mL の結合緩衝液で洗浄した。フィルター上に残留した放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。タンパク質の不存在下にフィルターに結合するＲＮＡの量を測定し、バックグランド補正に使用した。各フィルター上に残留したＲＮＡの添加ＲＮＡに対する百分率を、相当する対数タンパク質濃度に対してプロットした。非線形最小自乗法により解離定数（Ｋd）を求めた。Ｄ．サンドイッチＥＬＩＳＡｈＩＬ-10 の定量的測定用の市販のＥＬＩＳＡキット（R & D Systems）を使用してサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。様々な量のＲＮＡ43，ランダムプールＲＮＡおよび抗-ｈＩＬ-10 モノクローナル抗体（R & D Systems）を 125 pg/ mL のｈＩＬ-10 と室温で10分間インキュベートしたのち、マイクロタイターウエルに加えた。実施例６．ＩＬ-10 に対する 2'-Ｆ修飾ＲＮＡリガンドニトロセルロースフィルター結合条件下に、セレックス実験の開始に使用したランダム配列プールは、５μＭ濃度までのＩＬ-10 には検知される結合を示さなかった。しかしながら、12ラウンドの親和性選択後に、濃縮されたプールは親和性の改善を示し、12回目のラウンド以後さらに選択を行ってもＩＬ-10 に対する親和性の上昇効果はなかった。表10（配列番号：189〜205）には第12回目のラウンドのプールから同定された配列を示す。配列は配列の類似性に基づいて３つのクラスにグループ化される。クラスＩの大部分の配列の可変性40ヌクレオチド領域における 5'部分はその 3'部分と相補性の配列を有し、このような配列はステムループ構造へのフォールディングが可能であることを示唆している。個々のクローンは最初に、250ｎＭ濃度においてＩＬ-10 に結合するそれらの能力についてスクリーニングした。結果は、添加した個々のＲＮＡの20〜40％が 250ｎＭ濃度においてＩＬ-10 に結合を示した。予備スクリーニングに基づき、配列43（配列番号：189）を以下のセクションＢを実施するための代表的リガンドとして選択した。ＩＬ-10 に対する結合についての配列43のＫdは 213ｎＭである。このリガンド43は他方、他のサイトカイン、たとえばインターフェロンγおよびＩＬ-4 には結合せず、セレックス由来ＲＮＡ配列の特異性を指示している。ヒトＩＬ-10 （ｈＩＬ-10）およびマウスＩＬ-10（ｍＩＬ-10）はｃＤＮＡおよびアミノ酸のレベルで高度の配列ホモロジー（73％アミノ酸ホモロジー）を有し、ｈＩＬ-10 はマウス細胞にも活性であることが示されている。しかしながら、リガンド43はｍＩＬ-10に高い親和性では結合しない。Ｂ．ＩＬ-10 ＥＬＩＳＡにおけるＲＮＡ受容体結合を中和する抗-ＩＬ-10 モノクローナル抗体は市販品を入手することができる。R & D Systems の Quantikine イムノアッセイキットはｈＩＬ-10 を捕獲するための中和抗体で被覆された 96ウエルマイクロタイタープレートである。ＲＮＡがＩＬ-10 の中和抗体結合部位またはその付近に結合するかどうかを検討するためＥＬＩＳＡを使用した。ＲＮＡ43はランダムプールＲＮＡ（対照として使用）と同様、プレート上の抗-ＩＬ-10 抗体へのＩＬ-10 の結合を全く阻害しないことが示された（データは示していない）。これらのデータは進化したＲＮＡリガンドが中和抗体によって認識される部位またはその付近に結合しないことを示唆している。アッセイに対照として用いた可溶性抗-ＩＬ-10 は期待されたように挙動し、固相上の同一の抗体との結合に競合した。実施例７．ｈＴＮＦαに対するリガンドのための実験操作この実施例は、ｈＴＮＦαに対する核酸リガンドの発生のために実施例８〜11 において追跡され導入される一般的操作を提供する。Ａ．材料組換えヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）は Genzyme（Cambridge，MA）または R & D Systems（Minneapolis，MN）から、組換えマウスＴＮＦα（ｍＴＮＦα），組換えヒトＴＮＦβ（ｈＴＮＦβ）および可溶性ヒトＴＮＦ受容体２（ｓＴＮＦ- Ｒ２）は R & D Systems から購入した。アセチル化、およびヌクレアーゼを含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），リガーゼおよび制限酵素は New England Biolabs（Beverly，MA）から入手した。ＡＭＶ逆転写酵素は Life Sciences（S t.Petersburg，FL）から入手した。ＲＮasin リボヌクレアーゼ阻害剤およびＴa q ＤＮＡポリメラーゼは Promega（Madison，WI）から入手した。超純粋のヌクレオチドトリホスフェートは Pharmacia（Piscataway，NJ）から入手した。¹²⁵ Ｉ-ＴＮＦα，α-³²Ｐ-ＡＴＰとγ-³²Ｐ-ＡＴＰは DuPont NEN Research Produc ts（Boston，MA）から入手した。Ｕ937 細胞はＡＴＣＣから入手した（カタログ番号ＣＲＬ1593）から入手した。オリゴヌクレオチドは Operon，Inc．（Alamed a，CA）から入手した。ニトロセルロース/酢酸セルロース混合マトリックス（ＨＡ）0.45μmフィルターは Millipore（Bedford，MA）から入手した。化学薬品は少なくとも特級品を市販経路で購入した。Ｂ．セレックスセレックス操作は、セレックス特許出願中に記載されている（Tuerk & Gold， 1990；Goldら，1993 も参照）。出発ＲＮＡはｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅用プライマ−アニーリング部位のための 5'および 3'固定領域によって隣接される 30ランダムヌクレオチドを含有した（表11；配列番号：206）。一本鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲ増幅により二本鎖に変換した。ＰＣＲ条件は、50ｍＭＫＣl，10ｍＭＴris-ＨＣl（ｐＨ 9），0.1％Ｔriton Ｘ-100，3ｍＭのＭgＣl₂，0.5ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ，0.1単位/μlのＴaqＤＮＡポリメラーゼならびに各１ｎＭの 5'および 3'プライマーとした。転写反応は、約５ μＭＤＮＡ鋳型，５単位／μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ，40ｍＭＴris-ＨＣｌ（ｐＨ 8），12ｍＭＭgＣl₂，5ｍＭＤＴＴ，１ｍＭのスペルミジン，0.002％Ｔriton Ｘ-100，４％ＰＥＧ8000，各２〜４ｍＭの 2'ＯＨＮＴＰおよび 0.25 μＭ α-³²Ｐ-ＡＴＰ（800Ｃi/mmole）で実施した。2'Ｆ修飾転写体については2 'Ｆ-ＣＴＰおよび 2'Ｆ-ＵＴＰを 2'ＯＨ-ＣＴＰおよび 2'ＯＨ-ＵＴＰの代わりに使用した。２つの異なるセレックス実験を行った。第一のセレックス実験、セレックスＡにおいては、タンパク質はニトロセルロースフィルター上に固定化し、ＲＮＡリガンドは固定化タンパク質への捕獲により分配した。略述すれば、ｈＴＮＦαをニトロセルロースフィルター（Millipore，ＨＡ 0.45μm）にスポットし、ろ紙上で５分間風乾したのち、ニトロセルロースフィルターを 24-ウエルマイクロタイタープレート内で、500μlの結合緩衝液（ＢＢ＝10ｍＭのＴris-ＨＣl，ｐＨ 7.5，150ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，0.02％のアセチル化ＢＳＡ，0.02％フィコール，および 0.02％ＰＶＰ）中，1〜2×10^-6Ｍ放射標識ＲＮＡと室温で30分間インキュベートした。フィルターをついで、ＢＳＡを含まないＢＢ 1.5 ml 中で３回それぞれ10分間洗浄した。結合および洗浄は激しく攪拌しながら行った。固定化タンパク質に結合したＲＮＡをフェノール／尿素抽出によって回収し、ついでＡＭＶ逆転写酵素によって 50ｍＭのＴris-ＨＣl，ｐＨ 8 .3，60ｍＭＮａＣｌ，6ｍＭＭｇ（０Ａc)₂，10ｍＭＤＴＴ，50 pmol ＤＮＡプライマー１（表11；配列番号：206〜208），各 0.4ｍＭのｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ，ならびに１Ｕ/μl のＡＭＶＲＴ中、48℃において 60分間ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡはついで上述のようにＰＣＲ増幅し、次のセレックスサイクルを開始するために用いた。第二のセレックス実験、セレクッスＢでは、結合緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝食塩溶液（ＤＰＢＳ；Life Technologies，Gaithersburg，MD，Cat.N o.21300-25）として、タンパク質-ＲＮＡ複合体は、ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス，0.45μm 孔径フィルターディスク（Millipore，Co. ， Bedford，MA）を通すろ過によって分配した。ニトロセルロースフィルターに結合したＲＮＡをフェノール／尿素抽出によって回収した。分配されたＲＮＡをついで上述のように逆転写し、次のセレックスサイクルの開始に使用した。Ｃ．平衡解離定数の測定タンパク質-ＲＮＡ複合体を分配するためには、結合反応混合物をニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス，0.45μm 孔径のフィルターディスク（Millipore，Co.，Bedford，MA）を通してろ過した。ろ過は、フィルターを真空マニフォールドにつなぎ、5 ml ＤＰＢＳを吸引して湿潤させた。結合反応混合物をフィルターを通して吸引し、ついで5 ml の洗浄液を吸引し、フィルターをシンチレーションカウンター（Beckmann）でカウントした。ニトロセルロース分配はセレックスおよびＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドの平衡解離定数の測定に使用した。ＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドは一相性に結合した。ＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドの平衡解離定数を得るため、結合反応式：（式中、Ｒ＝ＲＮＡ，Ｐ＝タンパク質，Ｋ_D＝解離定数である）を平衡時の結合ＲＮＡの分画についての式： q=(f/2R_T)(P_T+R_T+K_D-((P_T+R_T+K_D)²-4P_TR_T)^1/2) （式中、ｑ＝結合ＲＮＡの分画，Ｐ_T＝総タンパク質濃度，Ｒ_T＝総ＲＮＡ濃度，ｆ＝ＲＮＡ-タンパク質複合体の保持効率である）に変換する。ニトロセルロースフィルター上におけるＲＮＡ-ＴＮＦα複合体の平均保持効率は 0.1〜0.2 である。Ｋ_Dは、ソフトウエア Kaleidagraph（Synergy Software，Reading，PA）を用いてデータ点の最小自乗フィッティングにより決定した。Ｄ．クローニングおよび配列決定セレックスの最終ラウンドからのＲＴ-ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡを、ＭＣ1061大腸菌（Casadabanら，1980，J.Mol.Biol．138: 179-207）中のｐＵＣ18プラスミド（Vieiraら，1982，Gene 19: 259-268）のＢamＨＩおよびＨindIII制限部位の間にクローン化した。配列の決定は、ＰＣＲ産物を鋳型として用い、市販のキット（Promega，Madison WI）によって行った。Ｅ．受容体結合コンペティションアッセイ受容体結合コンペティションアッセイをＲＮＡリガンドの生物活性測定のために用いた。¹²⁵Ｉ標識ｈＴＮＦαを 50μl の結合緩衝液（0.5ｍＭＭｇ⁺⁺，0.2 ％ＢＳＡ，0.02％ナトリウムアジド，１Ｕ/μl ＲＮasin 含有ＰＢＳ）中、0.1 ｎＭで、10^-4〜10^-11Ｍのコンペティター希釈系列ならびに１×10⁴/μl のＵ937 細胞と４℃で２時間インキュベートした。ついでアリコートを二重に採取して、 2:1 ジブチルフタレート：ジオクチルフタレート混合物を介して遠心分離し、遊離および結合¹²⁵Ｉ標識ｈＴＮＦαを分離し、ペレット中の放射能をガンマーカウンターで測定した。非特異的結合は 200倍モル過剰の非標識ＴＮＦを加えて測定した。ＲＮＡリガンドの阻害定数（Ｋi）は標準方法を用いてデータの非線形回帰分析によって測定した。Ｋi 値を得るためにＴＮＦ受容体の濃度を 3.4×10^-11Ｍ，ＴＮＦα-ＴＮＦＲの相互作用のＫ_Dを 0.1Ｍと仮定した。Ｆ．境界の決定 3'境界の決定には、６ＡＲＮＡリガンドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ-³²Ｐ-ＡＴＰで 5'末端標識した。5'境界は、3'末端標識リガンドをα-³² Ｐ-ｐＣｐおよびＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて確立された。部分アルカリ加水分解後、放射標識ＲＮＡリガンドをｈＴＮＦαと濃度 5，25，および 125ｎＭにおいてインキュベートし、タンパク質結合ＲＮＡをニトロセルロース分配により単離した。末端切断ＲＮＡは高分解能変性ポリアクリルアミドゲル上において分析した。アルカリ加水分解ラダー、およびＧ-残基で終わる放射標識リガンドのラダーを部分ＲＮアーゼＴ１消化によって発生させてマーカーとして用いた。実施例８．ｈＴＮＦαに対するＲＮＡリガンドＡ．プレセレックス特性ニトロセルロースフィルター結合では高タンパク質濃度でもｈＴＮＦαとランダムＲＮＡには相互作用は検出できなかった。結合曲線は、10μＭｈＴＮＦα まででも、ＲＮＡを１μＭまで上げても、完全に平坦で、推定解離定数（Ｋ_D）は10^-3以上である。ｈＴＮＦαとランダムＲＮＡの相互作用を改善するような緩衝条件は見出されなかった。ｈＴＮＦαがともかくＲＮＡに結合したかどうかを決定するため、本発明者らはノーザンプロービングに類似の感度のもっとよい方法（Bowenら，1980）を使用した。この方法はタンパク質と核酸の相互作用の様々な研究に用いられ、様々なＤＮＡ結合タンパク質のクローニングを助けてきた（Singhら，1988）。この実験では、一部のランダムＲＮＡはｈＴＮＦαに結合できることが明瞭に示された。ＲＮＡの結合はフィルターに予めｈＴＮＦαをスポットし、ついで乾燥した場合にのみ起こり、フィルターにｈＴＮＦαをスポットしたのちインキュベーションチェンバー内で湿らせると結合は起こらなかった。ＲＮＡはｈＴＮＦαを有するフィルター上でのみ結合し、ＢＳＡが存在するフィルター上では結合しなかった。これは多分、フィルター上に十分なＢＳＡが固定化されているかまたはインキュベーション混合物中にＢＳＡがあると、存在するＢＳＡに特異的なＲＮＡリガンドと競合して結合が起こらなかったものと考えられる。Ｂ．セレックス約10¹⁴のユニークな分子を含有する無作為化ＲＮＡのプールで、２つの独立したセレックス実験（ＡおよびＢ）を開始した。出発のＲＮＡおよびＰＣＲプライマー配列は表11に示す。Ａ-セレックスにおいては、タンパク質をニトロセルロースフィルターに乾燥して固定化した。タンパク質含有フィルターをＢＢ（実施例７参照）中で、標識ＲＮＡとインキュベートし、ついで洗浄し、オートラジオグラフに付し、結合したＲＮＡをフェノール-尿素抽出によって回収した。Ａ-セレックスの第１ラウンドには、約 1000 pmole のｈＴＮＦαモノマーを用い、ＲＮＡ濃度は 2×10-⁶Ｍとした。以後の14ラウンドでは約 500 および 100 pmole のｈＴＮＦαモノマーを含有する２つの異なるフィルターを前ラウンドからの増幅ＲＮＡを約 2×10^-6 Ｍで含有する同じチェンバー内でインキュベートした。高タンパク質フィルターからのＲＮＡのみを次のラウンドに続けた。シグナル対ノイズ比の緩徐な上昇が認められ、15ラウンドでは、500 および 100 pmole タンパク質フィルター上に維持されたシグナルはそれぞれバックグランドの 170 および 35倍であった。比較すると、第１ラウンドでは、シグナルはバックグランドの約３倍にすぎなかった。ラウンド15からのＲＮＡはｈＴＮＦαに高い親和性を有し、Ｋd は 5×10^-5 Ｍと推定され、ランダムＲＮＡに比べてほぼ 100倍の改善を示した。選択の緊縮度を上げるために、約10および 1 pmole のｈＴＮＦαを有するフィルターを用いてさらに８ラウンドを実施した。以後のこれらの全ラウンドでは、ラウンド20 を除いて、1 pmole のｈＴＮＦαフィルターからのＲＮＡを次のラウンドに続けた。ラウンド20においては、高いバックグランドのためラウンド 19の 10 pmole ｈＴＮＦαフィルターからのＲＮＡを使用した。これらの以後のラウンドでのシグナル対ノイズ比は各ラウンド毎に悪化したが、発生したＲＮＡの親和性は改善を続け、最終の推定Ｋd は 7×10^-7Ｍに達し、これはさらに２オーダーの大きさの改善を示している。最終ラウンドでは、シグナルは 10分の１の短い暴露時間で、フィルター上のｈＴＮＦαは 100分の１で検出することができた。Ａ-セレックスの緊縮相と平行して、Ａ-セレックスのラウンド15のＲＮＡをさらに６ラウンドのＢ-セレックス条件（下記参照）を用いて進化させた。本発明者らはこれをＣ-セレックスと命名した。Ｃ-セレックスの終了時において進化した集団の親和性はＡ-セレックスのラウンド23の集団の場合に類似し、おおよそのＫd 値は 4×10^-7Ｍであった。ラウンド23から進化したＲＮＡはｈＴＮＦαに対する親和性が改善されたのみでなく特異的であった（表13）。結合はｈＴＮＦαとのみ検出可能であった。Ｂ-セレックス実験では、結合反応を 25〜50μl にセットし、10分間37℃でインキュベートしたのち、0.45μm ＨＡニトロセルロースフィルターを通してろ過した。Ｂ-セレックスの第１ラウンドでは、ＲＮＡおよびタンパク質はそれぞれ約 4×10^-5Ｍであった。これらの条件下では、添加したＲＮＡのわずか 0.1％しかフィルター上に保持されなかった。これは、ｈＴＮＦα-ranndom-ＲＮＡの相互作用が極めて弱く、Ｋd 値は高すぎて測定不能であり、多分10^-3Ｍの範囲と思われることから、驚くべきことではない。以後のラウンドは第１ラウンドと同様にセットした。ラウンド８までは、ニトロセルロースフィルターへのＲＮＡのバックグランド結合は極めて高かった。Ｃ．ＲＮＡ配列および親和性Ａ-セレックスのラウンド23とＣ-セレックスのラウンド６から、ＲＴ-ＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡを、実施例７に記載したようにクローン化し、配列を決定した。Ａ-セレックスからの37のクローンおよびＣ-セレックスからの36のクローンの配列を決定した。計73の配列からの48がユニークな配列であった（表12；配列番号：209〜225）。ユニークな配列とは他のすべての配列から３個以上のヌクレオチドが異なる配列と定義される。47のユニークなクローンからの18のクローンが１μＭより優れたＫd 値でｈＴＮＦαに結合することができた（表12）。最善のリカンド 25Ａ（配列番号：233）は解離定数約40ｎＭの親和性で結合した。ランダムＲＮＡは解離定数10^-3Ｍ以上で結合すると仮定すると、25Ａの親和性は開始プールより少なくとも４〜５オーダーの大きさで優れていることになる。配列アラインメントおよび予測される保存二次構造を用いると、ｈＴＮＦαを結合する18クローン中17は２つのクラスに帰属できた。クラスIIのメンバーは、内部の張り出しと非対称ループを有するステムループ構造にフォールディングすることが可能である。線状の配列アラインメントからは有意な保存配列は見出されなかった。Ｄ．ＴＮＦに対するＲＮＡリガンドの特異性Ａ-セレックスのラウンド23の進化したプールのヒトＴＮＦα，ヒトＴＮＦβ およびマウスＴＮＦαに対する特異性を試験した。進化したプールはヒトＴＮＦ αに対して高度に特異的である。特異性比を表13に示す。実施例９．細胞表面受容体へのｈＴＮＦα結合の阻害ＴＮＦαリガンドが、ｈＴＮＦαのその細胞表面受容体への結合を競合的に阻害する能力を試験するため、Ｕ937 細胞を用いて数種のＴＮＦαリガンドをスクリーニングした。観察されたＫi 値を表14に掲げる。これらのデータは数種のリガンドがｈＴＮＦαのその細胞表面受容体への結合を競合的に阻害できること、一方、ランダムＲＮＡは阻害できないことを示している。リガンド25Ａは、Ｋi 値21ｎＭで、最高の効力を有す。このＫi 値は同じ実験条件下にｓＴＮＦ-Ｒ２で観察されたＫi 値より６倍劣るにすぎない。実施例10．ｈＴＮＦαリガンドの結合および阻害活性に対する2'Ｆピリミジン修飾の影響 2'Ｆ修飾ピリミジンを含有する転写体はＲＮアーゼ分解に抵抗性を有する。安定性が改善されたリガンドを得るために、数種のｈＴＮＦαリガンドの結合および阻害活性に対する2'Ｆピリミジン修飾の影響を試験した。表15にまとめた結果は一部のリガンドが2'Ｆピリミジンで修飾された場合も結合活性を維持したが、一般的には修飾リガンドの結合は非修飾の対応リガンドに比べて劣っている。クラスIIのリガンドは一般に、2'Ｆピリミジン修飾に対する耐容性が高い。2'Ｆピリミジン修飾後も結合性を維持しているリガンドの大部分はそれらの阻害活性を失っている。最も豊富なリガンド 6Ａの2'Ｆピリミジン修飾のみが結合および阻害活性に影響しなかった。実施例11．ＲＡＮＴＥＳに対するＤＮＡリガンドのための実験操作この実施例は、ＲＡＮＴＥＳに対する核酸リガンドの発生のために実施例12において追跡され導入される一般的操作を提供する。Ａ．材料組換えヒトＲＡＮＴＥＳは、Genzyme（Cambridge，CA）から購入された。Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼは Perkin Elmer（Norwalk，CT）から、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは New England Biolabs（Beverly，MA）から、超純粋ヌクレオチドトリホスフェートは Pharmacia（Piscataway，NJ）から、親和性精製ストレプトアビジン（Cat.No.21122）はPierce（Rockford，IL）から購入した。オリゴヌクレオチドは Operon，Inc．（Alameda）から、ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス（ＨＡ）0.45μm フィルターは，Millipore（Bedford，MA）から購入した。化学試薬は少なくとも試薬特級を、市販経路から購入した。Ｂ．セレックスセレックス操作はセレックス特許出願に詳細に記載されている。ＤＮＡ鋳型はＰＣＲのプライマーアニーリング部位のための、5'および 3'固定領域によって隣接される40ランダムヌクレオチドを含有した（表16；配列番号：256〜258）。プライマー 3Ｇ7（配列番号：258）は一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）の精製の補助にその 5'末端に４個のビオチン残基を含有する。第１ラウンドには、合成 40Ｎ7 ssＤＮＡ 105 pmole をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、70ｍＭＴris- ＨＣl，ｐＨ 7.6，10ｍＭＭgＣl₂，5ｍＭＤＴＴ，39.5 pmole g-³²Ｐ-ＡＴＰ（3000Ｃi/mmol）および16単位のキナーゼを含有する反応混合物 25μl 中 37℃ で１時間 5'末端標識した。キナーゼ処理されたＤＮＡをついで８％ポリアクリルアミド、７％尿素、変性ゲル上で精製し、ついでゲル精製非標識 40Ｎ7と混合して、比活性約 5,000 pcm/pmole とした。結合反応の準備として、ＤＮＡ分子をカルシウムおよびマグネシウムを含有しないハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Life Technologies，Gaithersburg，MD，Cat.No.14175）に 0.01％ヒト血清アルブミンを加えた溶液中、組換えＲＡＮＴＥＳとインキュベートした。２つのセレックス実験を実施し、一つは正常塩濃度、他方は 300ｍＭＮａＣｌとした。高塩濃度はＨＢＳＳにさらにＮａＣｌを加えて作成した。室温で30分間インキュベートしたのち、タンパク質-ＤＮＡ複合体をＨＡニトロセルロース 0.45μm を通してろ過し、非結合ＤＮＡから分配した。ニトロセルロースフィルターに結合したＤＮＡは、フェノール／尿素抽出によって回収した。分配されたＤＮＡを、 50ｍＭＫＣｌ，10ｍＭＴris-ＨＣl，ｐＨ 9.0，0.1％Ｔriton Ｘ-100，3ｍＭＭgＣl₂，各１ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰ中、0.1 単位/μｌのＴaqＤＮＡポリメラーゼにより増幅した。3Ｇ7 および 5Ｇ7 プライマーは２μＭ存在させた。5Ｇ7 プライマーは使用前に上述のように 5'-末端標識した。ssＤＮＡの精製には、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、ついで親和性精製ストレプトアビジンと、10ｍＭＴris-ＨＣｌ，ｐＨ 7.5，50ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，0.05％ナトリウムアジド中1:10 ＤＮＡ対ストレプトアビジンのモル比で反応させた。室温で30分間インキュベートしたのち、等容量の100％ホルムアミドのトラッキング染料を加え、85℃で 1.5分間インキュベートして鎖を変性させた。変性した鎖をついで８％ポリアクリルアミド７％尿素ゲル中にて電気泳動し、シフトしないバンドを切り出し、つぶしたゲルから精製した。精製したssＤＮＡをついで次のセレックスサイクルに使用した。実施例12．ＲＡＮＴＥＳに対するＤＮＡリガンドＲＡＮＴＥＳに対するＤＮＡリガンドを発生させるために、２つのセレックス実験を、一つは 150ｍＭ，他は 300ｍＭＮａＣｌで実施した。高塩濃度は、低い塩濃度で起こるＲＡＮＴＥＳ-ＤＮＡ複合体の沈殿を回避するために使用した。300ｍＭ塩濃度でのセレックスは高いバックグランドのために、早期に中止した。150ｍＭ塩濃度セレックスの各ラウンドのセレックス条件ならびに結果を表1 7にまとめる。出発プールは、150ｍＭ塩濃度セレックスの場合、1.8×10¹⁵（2,940p mole）のＤＮＡを含有した。ランダムＤＮＡの開始時のＫＤ値は 3×10^-6であった。19ラウンドのセレックス後、進化したプールは 20ｎＭのＫdで結合した。これは約150倍の改善である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パグラティス，ニコスアメリカ合衆国 80301 コロラド州ボウルダー，ノースオーチャードクリークサークル 5813 (72)発明者ジャヤセナ，スメドハアメリカ合衆国 80301 コロラド州ボウルダー，ノースオーチャードクリーク 5875 (72)発明者ゴールド，ラリーアメリカ合衆国 80301 コロラド州ボウルダー，フィフスストリート 1033

Claims

【特許請求の範囲】１．サイトカインに対する核酸リカンドを同定する方法において、ａ）核酸の候補混合物に比較してサイトカインに対する親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配できるように、核酸の候補混合物を上記サイトカインと接触させ、ｂ）候補混合物の残部から親和性の高い核酸を分配し、ｃ）サイトカインの核酸リガンドが同定できるように、親和性の高い核酸を増幅し、サイトカインに対して比較的に高い親和性および特異性で結合する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を生成させる工程からなる方法。２．さらに、ｄ）工程ａ），ｂ）およびｃ）を反復する工程からなる「請求項１」記載の方法。３．核酸の候補混合物は一本鎖核酸からなる「請求項１」記載の方法。４．一本鎖核酸はリボ核酸である「請求項３」記載の方法。５．核酸は修飾された核酸である「請求項４」記載の方法。６．核酸は 2'-アミノ（2'-ＮＨ₂）修飾リボ核酸である「請求項５」記載の方法。７．核酸は 2'-フルオロ（2'-Ｆ）修飾リボ核酸である「請求項５」記載の方法。８．一本鎖核酸はデオキシリボ核酸である「請求項３」記載の方法。９．サイトカインは、ＩＦＮ-γ，ＩＬ-10，ＩＬ-４，ＴＮＦα，およびＲＡＮＴＥＳからなる群より選ばれる「請求項１」記載の方法。 10．サイトカインはＩＦＮ-γである「請求項１」記載の方法。 11．サイトカインはＩＬ-10である「請求項１」記載の方法。 12．サイトカインはＩＬ-４である「請求項１」記載の方法。 13．サイトカインはＴＮＦαである「請求項１」記載の方法。 14．サイトカインはＲＡＮＴＥＳである「請求項１」記載の方法。 15．サイトカイン誘発疾患の処置方法において、サイトカインの核酸リガンドの医薬的有効量を投与することからなる方法。 16．サイトカインの核酸リガンドは「請求項１」記載の方法によって同定される「請求項15」記載の方法。 17．サイトカインはＩＦＮ-γである「請求項15」記載の方法。 18．リガンドは表３および４のリガンド（配列番号：７〜73）の一つから選択される「請求項17」記載の方法。 19．サイトカインはＩＬ-４である「請求項16」記載の方法。 20．リガンドは表７および８のリガンド（配列番号：100〜185）の一つから選択される「請求項17」記載の方法。 21．サイトカインはＩＬ-10 である「請求項16」記載の方法。 22．リガンドは表10のリガンド（配列番号：189〜205）の一つから選択される「請求項21」記載の方法。 23．サイトカインはＴＮＦαである「請求項16」記載の方法。 24．リガンドは表12のリガンド（配列番号：209〜255）の一つから選択される「請求項23」記載の方法。 25．サイトカインに対する天然に存在しない精製および単離核酸リガンド。 26．核酸は一本鎖である「請求項25」記載の天然に存在しない精製および単離核酸リガンド。 27．核酸はリボ核酸である「請求項26」記載の天然に存在しない精製および単離核酸リガンド。 28．核酸はデオキシリボ核酸である「請求項26」記載の天然に存在しない精製および単離核酸リガンド。 29．ａ）核酸の候補混合物に比較してサイトカインに対する親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配できるように、核酸の候補混合物を上記サイトカインと接触させ、ｂ）候補混合物の残部から親和性の高い核酸を分配し、ｃ）サイトカインの核酸リガンドが同定できるように、親和性の高い核酸を増幅し、サイトカインに対して比較的に高い親和性および特異性で結合する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を生成させる工程からなる方法によって同定されるサイトカインに対する核酸リガンド。 30．リガンドはＩＦＮ-γである「請求項27」記載の天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 31．リガンドは表３および４に掲げた配列（配列番号：７〜73）からなる群より選択される「請求項30」記載のＩＦＮ-γに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 32．リカンドは表３および４に掲げた配列（配列番号：７〜73）からなる群より選択されるリガンドと実質的に相同であり、実質的に同一のＩＦＮ-γに対する結合能を有する「請求項30」記載のＩＦＮ-γに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 33．リガンドは表３および４に掲げた配列（配列番号：７〜73）からなる群より選択されるリガンドと実質的に同一の構造を有し、実質的に同一のＩＦＮ-γ に対する結合能を有する「請求項30」記載のＩＦＮ-γに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 34．リガンドはＩＬ-４である「請求項27」記載の天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 35．リガンドは表７および８に掲げた配列（配列番号：79〜185）からなる群より選択される「請求項34」記載のＩＬ-４に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 36．リガンドは表７および８に掲げた配列（配列番号：79〜185）からなる群より選択されるリガンドと実質的に相同であり、実質的に同一のＩＬ-４に対する結合能を有する「請求項34」記載のＩＬ-４に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 37．リガンドは表７および８に掲げた配列（配列番号：79〜185）からなる群より選択されるリガンドと実質的に同一の構造を有し、実質的に同一のＩＬ-４に対する結合能を有する「請求項34」記載のＩＬ-４に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 38．リガンドはＩＬ-10 である「請求項27」記載の天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 39．リカンドは表10に掲げた配列（配列番号：189〜205）からなる群より選択される「請求項38」記載のＩＬ-10 に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 40．リガンドは表10に掲げた配列（配列番号：189〜205）からなる群より選択されるリガンドと実質的に相同であり、実質的に同一のＩＬ-10 に対する結合能を有する「請求項38」記載のＩＬ-10 に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 41．リガンドは表10に掲げた配列（配列番号：189〜205）からなる群より選択されるリガンドと実質的に同一の構造を有し、実質的に同一のＩＬ-10 に対する結合能を有する「請求項38」記載のＩＬ-10 に対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 42．リガンドはＴＮＦαである「請求項27」記載の天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 43．リガンドは表12に掲げた配列（配列番号：209〜255）からなる群より選択される「請求項42」記載のＴＮＦαに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 44．リガンドは表12に掲げた配列（配列番号：209〜255）からなる群より選択されるリガンドと実質的に相同であり、実質的に同一のＴＮＦαに対する結合能を有する「請求項42」記載のＴＮＦαに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 45．リガンドは表12に掲げた配列（配列番号：209〜255）からなる群より選択されるリガンドと実質的に同一の構造を有し、実質的に同一のＴＮＦαに対する結合能を有する「請求項42」記載のＴＮＦαに対する天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。 46．リガンドはＲＡＮＴＥＳである「請求項25」記載の天然に存在しない精製および単離リボ核酸リガンド。