JP2004511250A - 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド - Google Patents

Abstract

前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の核酸リガンドを作成する方法を提供する。本発明方法は核酸リガンド単離のためにＳＥＬＥＸ法を用いる。本発明にはＰＳＭＡに対する核酸リガンド、ならびにこれらの核酸リガンドを用いて疾病を処置および診断するための方法および組成物も含まれる。

Description

【０００１】
発明の分野
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する高親和性核酸リガンドを本明細書に記載する。本明細書にはＰＳＭＡに対する高親和性核酸リガンドを同定および調製する方法も記載する。そのような核酸リガンドを同定するために本発明に用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの頭字語である。さらに、ＰＳＭＡに対するＲＮＡリガンドをも開示する。ピリミジンの２’位において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドも含まれる。さらに、２’−Ｆ修飾を含む、ＰＳＭＡに対するＲＮＡリガンドを開示する。本発明には、ＰＳＭＡの高親和性核酸リガンド阻害薬も含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬および／または療法薬として有用である。
【０００２】
発明の背景
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、７５０アミノ酸のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＳＭＡは前立腺上皮細胞により発現し、前立腺外発現が脳、腎臓、唾液腺および十二指腸において検出されている（たとえば下記を参照：Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２７（１）：２３−７；Ｔｒｏｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２（５）：５５２−８；Ｉｓｒａｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４（７）：１８０７−１１；Ｉｓｒａｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３（２）：２２７−３０）。ＰＳＭＡは、Ｎ−アセチル−ａｓｐ−ｇｌｕを開裂するカルボキシペプチダーゼである。ＰＳＭＡは３つのドメインをもつ：１９アミノ酸の細胞質ドメイン、２４アミノ酸の膜貫通ドメイン、および７０７アミノ酸の細胞外ドメイン。細胞質ドメインに特異的なモノクローナル抗体７Ｅ１１．Ｃ５は、インジウム−１１１で放射性標識することにより前立腺癌のｉｎ　ｖｉｖｏ造影に利用されている（Ｅｌｇａｍａｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３７（４）：２６１−９；Ｌａｍｂ　ａｎｄ　Ｆａｕｌｄｓ（１９９８）Ｄｒｕｇｓ　Ａｇｉｎｇ，１２（４）：２９３−３０４）。
【０００３】
ＰＳＭＡは１９８７年の発見（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．７：９２７−３５）以来、卓越した前立腺腫瘍細胞マーカーと考えられている。ＰＳＭＡの発現は主に前立腺特異的であり、脳、唾液腺および小腸にかろうじて検出できるレベルでみられる（Ｉｓｒａｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１８０７−１１）。さらに、ＰＳＭＡ発現は悪性前立腺細胞に高く、アンドロゲン耐性細胞ではアンドロゲンによる負の調節のため発現が最大となる（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｕｒｏｌｏｇｙ，４８：３２６−３４）。さらにＰＳＭＡはオルタナティブスプライシングされ、正常な前立腺細胞はＰＳＭ’と呼ばれる細胞質ゾル形を主に発現し、悪性細胞は特徴的な全長膜結合形を発現する（Ｓｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：１４４１−３）。この全長ＰＳＭＡはＩＩ型膜糖タンパク質であり、大部分のタンパク質が細胞外にあって診断薬および療法薬のターゲットとして利用できる。これらの特性から、ＰＳＭＡは下記の理想的ターゲットとなっている：前立腺癌免疫療法（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３９：５４−９）；モノクローナル抗体造影（Ｓｏｄｅｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３７：１４０−８）；および療法（ＭｃＤｅｖｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．６０：６０９５−１００）。最初の抗ＰＳＭＡ抗体は直ちに改良されて造影剤になり（Ｌｏｐｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５０：６４２３−６４２９）、現在では転移性前立腺腫瘍の診断のために臨床的に用いられている。さらに、ＰＳＭＡは多様な癌の新生血管上皮細胞により発現し（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５：２６７４−８１；Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：３６２９−３４）、このため腫瘍血管造影および抗血管新生療法のための候補ターゲットとなっている。
【０００４】
ＰＳＭＡの細胞外ドメインを認識するアプタマーは、ＰＳＭＡ酵素活性の阻害による療法薬として、ｉｎ　ｖｉｖｏ造影剤として、さらに細胞毒性化学物質および放射性核種を療法送達するためのターゲティング剤として有用となる可能性がある。薬物および試薬としてのタンパク質の使用は、プロテアーゼ活性、タンパク質のサイズ、輸送、および生物がそのタンパク質に対する抗体を産生する能力により制限されることが多い。これらの制限の多くは、ヌクレアーゼ活性に対して安定化された合成ＲＮＡからなるアプタマーの使用により回避できる。抗体と対比してアプタマーは小型で（７〜２０ｋＤａ）、血液からきわめて速やかに消失し、かつ化学合成される。血液からの速やかな消失は、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断造影に重要である；この場合、映像を隠蔽するバックグラウンドの主な決定因子が血中濃度である。血液からの速やかな消失は療法にも重要であり、この場合は血中濃度が毒性に関与する。ＳＥＬＥＸ法によりアプタマーを迅速に単離でき、化学合成によりアプタマーを容易かつ部位特異的に多様な不活性分子および生物活性分子に結合させることができる。したがってＰＳＭＡに対するアプタマーは、腫瘍療法またはｉｎ　ｖｉｖｏもしくはｅｘ　ｖｉｖｏ診断造影に有用であり、および／またはＰＳＭＡを発現する疾病状態の処置のためにＰＳＭＡ核酸リガンドと複合体形成した多様な療法薬を送達するのに有用である。
【０００５】
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法の開発により他の新規なヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドが得られ、これらはほぼすべてのリガンドに緊密かつ特異的に結合するように選択できる（Ｔｕｅｒｋ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−２２；Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：５２２９−３４；Ｇｏｌｄ（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３５８１−４）；たとえば有機色素、抗体、アミノ酸および細胞に結合する（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−２２；Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｒａｎｄｏ（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：２８１−９０；Ｃｏｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒｔｙ，３２：５４９７−５０２；Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：２９０２−７）。”ＲＮＡアプタマー”と呼ばれるこれらの合成オリゴヌクレオチド配列は、１００を超えるターゲットリガンドに結合するように作られ、療法薬、造影および診断薬において抗体と対抗する新たなクラスの分子として台頭しつつある（Ｈｉｃｋｅ　ａｎｄ　Ｓｔｅｐｈｅｎｓ（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：９２３−８；Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８−５０）。
【０００６】
ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット分子に高特異的に結合する核酸分子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ進化のための方法であり、下記に記載されている：米国特許出願Ｎｏ．０７／５３６，４２８（１９９０年６月１１日出願）、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”（現在は放棄）；ＵＳＰ５，４７５，０９６、表題”核酸リガンド”；およびＵＳＰ５，２７０，１６３（ＷＯ９１／１９８１３も参照）、表題”核酸リガンドを同定する方法”；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。これらの出願（本明細書においてはまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）それぞれに、目的とするあらゆるターゲット分子に対する核酸リガンドを作成するための根本的に新規な方法が記載されている。
【０００７】
ＳＥＬＥＸ法は、核酸リガンドまたはアプタマーと呼ばれる一群の生成物を提供する；これらはそれぞれユニーク配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。ＳＥＬＥＸ同定された各ＳＥＬＥＸ核酸リガンドは、そのターゲット化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が多様な二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力をもち、かつそれらのモノマーには実質的にいかなる化合物に対しても（モノマーまたはポリマーのいずれに対しても）リガンドとして作用する（特異的な結合対を形成する）のに十分な化学的万能性があるという独特な洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分子もターゲットとして利用できる。高親和性結合の適用に用いるＳＥＬＥＸ法は、同じ全般的選択方式を用いて混合物から候補オリゴヌクレオチドを選択し、結合、分配および増幅の段階的反復を行って、実質的にあらゆる目的基準の結合親和性および選択性を達成する。ＳＥＬＥＸ法は、核酸の混合物（好ましくはランダム化配列のセグメントを含む）から出発し、結合に好ましい条件下で混合物とターゲットを接触させ、ターゲット分子に特異的に結合した核酸から結合していない核酸を分配し、核酸−ターゲット複合体を解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅してリガンドに富む核酸混合物にする工程を含み、次いでターゲット分子に対する高特異的な高親和性核酸リガンドを得るのに必要な回数だけこれらの結合、分配、解離および増幅の工程を再反復する。
【０００８】
本発明者らは、化学物質としての核酸が広範な形状、サイズおよび構造を形成しうること、かつ生物系における核酸が示すものよりはるかに幅広い結合その他の機能をもちうることをＳＥＬＥＸ法が証明すると認識している。
【０００９】
基本的ＳＥＬＥＸ法は多数の具体的目的を達成するように改変されている。たとえば米国特許出願Ｎｏ．０７／９６０，０９３（１９９２年１０月１４日出願）（現在は放棄）、およびＵＳＰ５，７０７，７９６、両方とも表題”構造に基づく核酸選択方法”には、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択するために、ＳＥＬＥＸ法をゲル電気泳動と併用することが記載されている。米国特許出願Ｎｏ．０８／１２３，９３５（１９９３年９月１７日出願）、表題”核酸リガンドの光選択”（現在は放棄）；ＵＳＰ５，７６３，１７７およびＵＳＰ６，０１１，５７７、両方とも表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ”には、ターゲット分子の結合および／または光架橋および／または光不活性化が可能な光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸベースの方法が記載されている。ＵＳＰ５，５８０，７３７、表題”テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”には、近縁分子（非ペプチドでもよい）を識別できる高特異性核酸リガンドの同定方法が記載されている；これは対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる。ＵＳＰ５，５６７，５８８、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：溶液ＳＥＬＥＸ”には、ターゲット分子に対する親和性の高いオリゴヌクレオチドと低いオリゴヌクレオチドのきわめて効率の高い分配を達成する、ＳＥＬＥＸベースの方法が記載されている。
【００１０】
ＳＥＬＥＸ法には、改良された特性、たとえば改良されたｉｎ　ｖｉｖｏ安定性または改良された送達特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む、高親和性核酸リガンドの同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基部分における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法同定による修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドは、ＵＳＰ５，６６０，９８５、表題”修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド”に記載され、これにはピリミジンの５−および２’−位が化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。前記ＵＳＰ５，５８０，７３７には、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含む高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願Ｎｏ．０８／２４６，０２９（１９９４年６月２２日出願）、表題”分子内求核置換による既知および新規２’修飾ヌクレオチドの新規な製造方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００１１】
ＳＥＬＥＸ法には、選択したオリゴヌクレオチドと他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能単位とを組み合わせることが含まれる：それぞれＵＳＰ５，６３７，４５９、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：キメラＳＥＬＥＸ”、およびＵＳＰ５，６８３，８６７、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載。これらを適用すると、オリゴヌクレオチドがもつ形状その他の広範な特性ならびに効率的な増幅および複製特性と他の分子がもつ望ましい特性とを組み合わせることができる。
【００１２】
ＳＥＬＥＸ法にはさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを診断用または療法用複合体において組み合わせることが含まれる：ＵＳＰ６，０１１，０２０、表題”核酸リガンド複合体”に記載。基本的ＳＥＬＥＸ法の改変を記載した前記特許出願それぞれの全体を本明細書に援用する。
【００１３】
リガンド結合剤としてのＲＮＡアプタマーの最初の発見（Ｔｕｅｒｋ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−２２）以来、多数の多様なターゲット分子が同定された（Ｆａｍｕｌｏｋ　ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３３：５９１−９）。アプタマーライブラリーに多様な構造を用いることにより、単一アミノ酸程度の簡単なターゲット（Ｃｏｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒｔｙ，３２：５４９７−５０２）から、赤血球のような複雑なターゲット（Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：２９０２−７）にまで、緊密に結合するＲＮＡリガンドが得られる。しかしこの方法が有効であるにもかかわらず、膜結合腫瘍抗原に対するＲＮＡアプタマーは報告されていない。したがって、周知の前立腺腫瘍細胞表面抗原ＰＳＭＡに結合してその酵素活性を阻害するヌクレアーゼ安定性ＲＮＡアプタマーを同定および調製する可能性を探索した。
【００１４】
本発明の目的は、高い特異性および親和性でＰＳＭＡに結合する核酸リガンドの同定に使用できる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、結合するとＰＳＭＡの活性を阻害する、ＰＳＭＡに対する核酸リガンドを得ることである。
【００１５】
本発明の他の目的は、１以上のＰＳＭＡ核酸リガンドおよび１以上のマーカーを含む、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏ診断に使用するための複合体を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＰＳＭＡマーカーを発現する疾病状態の治療または予防のための療法薬を送達する方法を提供することである。
発明の概要
本発明には、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する核酸リガンドを同定および調製する方法、ならびにこうして同定および調製された核酸リガンドが含まれる。この方法は、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いる。特に、ＰＳＭＡの細胞外部分に特異的に結合しうる新規なヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ配列が、バキュロウイルス−精製ＰＳＭＡ融合タンパク質をターゲットタンパク質として用いて得られる。本明細書に記載した方法は、ＳＥＬＥＸ法を初めて膜腫瘍抗原に適用したものである。ピリミジンの２’−位が修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドも含まれる。具体的には、表３に示すＲＮＡリガンド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３〜２７）が本発明に含まれる。これらのユニークアプタマー配列のうちの２つ：ｘＰＳＭ−Ａ９およびｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５および１５）は天然ＰＳＭＡ　Ｎ−アセチル−α結合−酸性ペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性を阻害する能力をもつことにより、ＰＳＭＡに対するこれらの配列の高親和性が証明された。これらのアプタマーはＰＳＭＡの細胞外部分に結合し、ナノモルという低いＫ_ｉで天然ＰＳＭＡの酵素活性を阻害する。本発明の核酸リガンドを臨床的に用いてＰＳＭＡ酵素活性を阻害することができ、あるいは修飾して、造影のための薬剤を運搬させ、または療法薬を前立腺癌細胞へ送達させることができる。
【００１７】
発明の詳細な記述
ＰＳＭＡに対する核酸リガンドを同定するために本発明に用いる主要な方法はＳＥＬＥＸ法と呼ばれる。これはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの頭字語である。ＳＥＬＥＸ法は下記を伴う：ａ）核酸の候補混合物をＰＳＭＡまたはＰＳＭＡに対応する発現ドメインもしくはペプチドと接触させ；ｂ）ＰＳＭＡに対する親和性に基づいて候補混合物のメンバーを分配し；そしてｃ）選択した分子を増幅して、ＰＳＭＡに対する結合親和性が相対的に高い核酸配列に富む核酸混合物を得る。
【００１８】
本発明には、ＰＳＭＡに対するＲＮＡリガンドが含まれる。本発明にはさらに、表３に示すＰＳＭＡに対する特異的ＲＮＡリガンド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３〜２７）が含まれる。より具体的には、本発明には表３に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じＰＳＭＡ結合能をもつ核酸配列が含まれる。実質的に相同とは、７０％を超える、きわめて好ましくは８０％を超える、さらに好ましくは、９０％、９５％または９９％を超える一次配列相同度を意味するものとする。本明細書に記載する相同性％は、２配列のうち小さい方にあるヌクレオチドのうち比較される配列中の同一ヌクレオチド残基とアラインするヌクレオチドの％として計算される；その際、そのアラインメントを補助するために長さ１０ヌクレオチドのギャップ１つを導入することができる。実質的に同じＰＳＭＡ結合能とは、その親和性が本明細書に記載するリガンドの親和性から１または２桁の範囲内にあることを意味する。ある配列−−本明細書に具体的に記載したものと実質的に相同−−が同じＰＳＭＡ結合能をもつかという判定は、当業者が容易になしうる。
【００１９】
表３に示すＰＳＭＡ核酸リガンドの配列相同性をみると、一次相同性をほとんどまたは全くもたない配列が実質的に同じＰＳＭＡ結合能をもつ可能性があることが分かる。このため本発明には、表３に示す核酸リガンドと実質的に同じ想定構造または構造モチーフをもちかつ実質的に同じＰＳＭＡ結合能をもつ核酸リガンドも含まれる。実質的に同じ構造または構造モチーフは、Ｚｕｃｋｅｒｆｏｌｄプログラム（Ｚｕｃｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４８−５２参照）を用いる配列アラインメントにより想定できる。当技術分野で知られているように、二次構造および構造モチーフを予想するために他のコンピュータープログラムも使用できる。溶液中または結合構造体としての核酸リガンドの実質的に同じ構造または構造モチーフは、ＮＭＲまたは当技術分野で既知の他の手法を用いて想定することもできる。
【００２０】
本発明には、疾病を含む可能性のある生物組織においてＰＳＭＡを発現する疾病の存在を下記の方法で検出する方法が含まれる：（ａ）下記を含む方法で核酸の候補混合物からＰＳＭＡのリガンドである核酸リガンドを同定する：（ｉ）候補混合物と対比して高いＰＳＭＡ親和性を有する核酸を候補混合物の残りのものから分配できるように、核酸の候補混合物とＰＳＭＡを接触させ；（ｉｉ）高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配し；（ｉｉｉ）高親和性核酸を増幅してＰＳＭＡに対する結合の親和性および特異性が相対的に高い核酸に富む核酸混合物にし、これによりＰＳＭＡの核酸リガンドを同定する；（ｂ）ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏ診断に使用できるマーカーを、工程（ｉｉｉ）で同定した核酸リガンドに結合させて、マーカー−核酸リガンド複合体を形成する；（ｃ）前記疾病を含む可能性のある組織をこのマーカー−核酸リガンド複合体に曝露する；そして（ｄ）その組織におけるマーカー−核酸リガンド複合体の存在を検出し、これによりＰＳＭＡ発現疾病を同定する。
【００２１】
さらに本発明には、１以上のＰＳＭＡ核酸リガンドおよび１以上のマーカーを含む、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏ診断に使用できる複合体が含まれる。さらに本発明には、ＰＳＭＡを発現する疾病状態の治療または予防のための療法薬を送達する方法が含まれる。
【００２２】
定義
本発明の態様を説明するために種々の用語を本明細書中で用いる。本発明の構成要素の記述を明瞭にするために、下記の定義を施す。
【００２３】
本明細書中で用いる”核酸リガンド”は、ターゲットに対する望ましい作用をもつ天然に存在しない核酸である。核酸リガンドはしばしば”アプタマー”と呼ばれる。望ましい作用には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ターゲットの結合、触媒作用によるターゲットの変化、ターゲットまたはターゲットの機能活性を改変／変更するようなターゲットとの反応、自殺阻害薬の場合のようなターゲットへの共有結合、ターゲットと他の分子との反応の促進。好ましい態様において、この作用はターゲット分子に対する特異的結合親和性であり、それらのターゲット分子は、主にワトソン／クリック塩基対合または三重らせん結合に依存する機序で核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造のものである；この場合、その核酸リガンドはそのターゲット分子が結合するという生理学的機能をもつことが知られていない。本発明において、ターゲットはＰＳＭＡまたはその領域である。核酸リガンドには、核酸の候補混合物から下記の方法で同定された核酸であって、そのターゲットのリガンドであるものが含まれる：ａ）候補混合物と対比して高いターゲット親和性を有する核酸を候補混合物の残りのものから分配できるように、核酸の候補混合物とターゲットを接触させ；ｂ）高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配し；そしてｃ）高親和性核酸を増幅してリガンドに富む核酸混合物を得る。
【００２４】
本明細書中で用いる”候補混合物”は、目的リガンドをそれから選択するための、異なる配列をもつ核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然核酸もしくはそのフラグメント、化学合成した核酸、酵素合成した核酸、またはこれらの手法の組合わせにより作成した核酸であってよい。好ましい態様においてそれぞれの核酸は、ランダム化領域を囲む増幅プロセス促進のための固定配列をもつ。
【００２５】
本明細書中で用いる”核酸”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およびそのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、さらに電荷、分極性、水素結合、静電相互作用およびフラックス性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込ませる他の基を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付与するものが含まれるが、これらに限定されない。そのような修飾には、糖の２’位修飾、ピリミジンの５位修飾、プリンの８位修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジン置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシル置換；主鎖の修飾、メチル化、異例の塩基対組合わせ、たとえばイソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には３’および５’修飾、たとえばキャッピングも含まれる。
【００２６】
”ＳＥＬＥＸ”法は、目的様式でターゲットと相互作用する（たとえばタンパク質と結合する）核酸リガンドの選択と選択したこれらの核酸の増幅との組合わせを伴う。この選択／増幅工程を任意に反復循環することにより、きわめて多数の核酸を含有するプールからターゲットと最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸を選択できる。選択した目標が達成されるまで選択／増幅操作の循環を続ける。本発明においては、ＳＥＬＥＸ法を用いてＰＳＭＡに対する核酸リガンドを得る。
【００２７】
ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に記載されている。
”ＳＥＬＥＸターゲット”または”ターゲット”は、それに対するリガンドを得ることを目的とする当該化合物または分子を意味する。ターゲットはタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似体、補因子、阻害薬、薬物、色素、栄養素、増殖因子などであってよく、制限はない。本発明において、ＳＥＬＥＸターゲットはＰＳＭＡである。特に本発明におけるＳＥＬＥＸターゲットには、精製ＰＳＭＡおよびそのフラグメント、ならびにＰＳＭＡを含む短いペプチドまたは発現タンパク質ドメインが含まれる。
【００２８】
本明細書中で用いる”固体支持体”は、それに分子が共有結合または非共有結合により結合しうるいずれかの表面であると定義される。これには、膜、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、荷電紙、ナイロン、ラングミュア・ブロジェット膜、機能性ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、金および銀が含まれるが、これらに限定されない。その表面に官能基（たとえばアミノ、カルボキシル、チオールまたはヒドロキシル）を取り込むことができる、当技術分野で既知の他のいずれかの材料も考慮される。これにはいかなる形状の表面も含まれ、球状表面および溝付き表面が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で用いる”複合体”は、１以上のＰＳＭＡ核酸リガンドと１以上のマーカーが共有結合することにより形成される分子形態を意味する。本発明のある態様においては、複合体をＡ−Ｂ−Ｙと表わす；ここでＡはマーカーであり；Ｂは任意であってリンカーを含み；ＹはＰＳＭＡ核酸リガンドである。
【００３０】
本明細書中で用いる”マーカー”は、直接またはリンカー（１以上）もしくはスペーサー（１以上）を介してＰＳＭＡ核酸リガンドと複合体形成した場合に、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏ設定で視覚的または化学的手段による複合体の検出を可能にする分子形態（１以上）である。マーカーの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：放射性核種：Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｆ−１８、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^１８６Ｒｅ、^１１１Ｉｎを含む；すべての発蛍光団：フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドを含む；上記発蛍光団の誘導体：ローダミン−レッド−Ｘを含む；磁性化合物；およびビオチン。
【００３１】
本明細書中で用いる”リンカー”は、２以上の分子形態を共有結合または非共有相互作用により結合し、１以上の分子形態の機能特性を保存した形でそれらの分子形態を空間的に分離しうる分子形態（１以上）である。リンカーはスペーサーとしても知られる。リンカーの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_６およびヘキシルアミン構造体：米国特許出願Ｎｏ．０９／３６４，９０２（１９９９年７月２９日出願）、表題”テネイシン−Ｃ核酸リガンド”の図２に示される；その全体を本明細書に援用する。
【００３２】
本明細書中で用いる”療法”には、治療および／または予防が含まれる。これを用いる場合、療法はヒトおよび他の動物に関する。
”共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。
【００３３】
”非共有相互作用”は、共有結合以外の相互作用により分子形態を互いに保持する手段であり、イオン性相互作用および水素結合が含まれる。
本明細書中で用いる”ＰＳＭＡ”は、精製タンパク質、該タンパク質の細胞外ドメイン（ｘＰＳＭを含む）、細胞質ドメインもしくは細胞内ドメイン、またはそのいずれかの対立遺伝子バリアントを表わす。本明細書中で用いる”ＰＳＭＡ”には、ヒト以外の種から単離されたタンパク質も含まれる。
【００３４】
本明細書全体を通じて種々の引用文献を提示したことを留意されたい。各引用文献の全体を特に本明細書に引用する。
好ましい態様において、本発明の核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法で得られる。ＳＥＬＥＸ法は、米国特許出願Ｎｏ．０７／５３６，４２８、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”（現在は放棄）；ＵＳＰ５，４７５，０９６、表題”核酸リガンド”；およびＵＳＰ５，２７０，１６３（ＷＯ９１／１９８１３も参照）、表題”核酸リガンドを同定する方法”に記載されている。これらの出願それぞれの全体を特に本明細書に援用し、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。
【００３５】
ＳＥＬＥＸ法は、核酸分子である一群の生成物を提供する；これらはそれぞれユニーク配列をもち、かつそれぞれ目的ターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。ターゲット分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子も含めることができる。ＳＥＬＥＸ法は、生物構造体（たとえば細胞表面またはウイルス）の一体部分である分子との特異的相互作用により、それらの生物構造体をターゲティングするのにも使用できる。
【００３６】
ＳＥＬＥＸ法は、最も基本的な形では下記の一連の工程により定義できる：
１．種々の配列をもつ核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に固定配列領域（すなわち候補混合物の各メンバーが同じ位置に同じ配列を含む）およびランダム化配列領域を含む。固定配列領域は下記のいずれかの目的で選択される：（ａ）下記の増殖工程を助成する；（ｂ）ターゲットに結合することが知られている配列を模倣する；または（ｃ）候補混合物中の核酸の特定構造配列の濃度を高める。ランダム化配列は完全ランダム化（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率は４中１である）または部分ランダム化のみ（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率を０〜１００％の範囲で任意に選択できる）であってよい；
２．ターゲットと候補混合物のメンバーを結合させるのに好ましい条件下で、候補混合物と選択したターゲットを接触させる。これらの場合、ターゲットと候補混合物の核酸との相互作用は、ターゲットとターゲットに対する強い親和性をもつ核酸との核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる；
３．ターゲットに対する最大親和性をもつ核酸をターゲットに対する親和性がより低い核酸から分配する。ターゲットに対する最大親和性をもつ核酸に対応する配列は候補混合物中にごく少数（わずか１分子の核酸の可能性もある）存在するにすぎないので、候補混合物中の有意量（約５〜５０％）の核酸が分配中に保持されるように分配基準を設定することが一般に望ましい；
４．次いで、分配に際しターゲットに対する親和性が相対的に高いものとして選択した核酸を増幅して、ターゲットに対する親和性が相対的に高い核酸に富む新たな候補混合物を調製する；
５．前記の分配工程と増幅工程を繰り返すことにより、新たに形成された候補混合物が含有するユニーク配列の数は次第に少なくなり、ターゲットに対する核酸の平均親和度は一般に高まる。極端には、ＳＥＬＥＸ法によれば、原候補混合物からターゲット分子に対する最大親和性をもつ核酸である１つまたは少数のユニーク核酸を含有する候補混合物が得られるであろう。
【００３７】
基本的ＳＥＬＥＸ法は多数の具体的目的を達成するように改変されている。たとえば米国特許出願Ｎｏ．０７／９６０，０９３（１９９２年１０月１４日出願）（現在は放棄）、およびＵＳＰ５，７０７，７９６、両方とも表題”構造に基づく核酸選択方法”には、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択するために、ＳＥＬＥＸ法をゲル電気泳動と併用することが記載されている。米国特許出願Ｎｏ．０８／１２３，９３５（１９９３年９月１７日出願）、表題”核酸リガンドの光選択”（現在は放棄）；ＵＳＰ５，７６３，１７７およびＵＳＰ６，０１１，５７７、両方とも表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ”にはすべて、ターゲット分子の結合および／または光架橋および／または光不活性化が可能な光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸベースの方法が記載されている。ＵＳＰ５，５８０，７３７、表題”テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”には、近縁分子を識別できる高特異性核酸リガンドの同定方法が記載されている；これは対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる。ＵＳＰ５，５６７，５８８、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：溶液ＳＥＬＥＸ”には、ターゲット分子に対する親和性の高いオリゴヌクレオチドと低いオリゴヌクレオチドのきわめて効率の高い分離を達成する、ＳＥＬＥＸベースの方法が記載されている。ＵＳＰ５，４９６，９３８、表題”ＨＩＶ−ＲＴおよびＨＩＶ−１　Ｒｅｖに対する核酸リガンド”には、改良された核酸リガンドをＳＥＬＥＸの実施により得る方法が記載されている。ＵＳＰ５，７０５，３３７、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：化学ＳＥＬＥＸ”には、リガンドをそのターゲットに共有結合させる方法が記載されている。
【００３８】
ＳＥＬＥＸ法には、改良された特性、たとえば改良されたｉｎ　ｖｉｖｏ安定性または改良された送達特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む、高親和性核酸リガンドの同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基部分における化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ法同定による核酸リガンドは、ＵＳＰ５，６６０，９８５、表題”修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド”に記載され、これにはピリミジンの５−および２’−位が化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。前記ＵＳＰ５，６３７，４５９には、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含む高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願Ｎｏ．０８／２４６，０２９（１９９４年６月２２日出願）、表題”分子内求核置換による既知および新規２’修飾ヌクレオチドの新規な製造方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００３９】
ＳＥＬＥＸ法には、選択したオリゴヌクレオチドと他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能単位とを組み合わせることが含まれる：それぞれＵＳＰ５，６３７，４５９、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：キメラＳＥＬＥＸ”、およびＵＳＰ５，６８３，８６７、表題”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載。これらを適用すると、オリゴヌクレオチドがもつ形状その他の広範な特性ならびに効率的な増幅および複製特性と他の分子がもつ望ましい特性とを組み合わせることができる。
【００４０】
ＵＳＰ５，４９６，９３８には、改良された核酸リガンドをＳＥＬＥＸの実施により得る方法が記載されている。”ＨＩＶ−ＲＴおよびＨＩＶ−１　Ｒｅｖに対する核酸リガンド”と題するこの特許の全体を特に本明細書に援用する
核酸を診断に用いる際に遭遇する可能性のある問題のひとつは、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオチドが目的とする効果を達成する前に体液中で細胞内および細胞外酵素（たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）によって急速に分解される可能性があることである。核酸リガンドに特定の化学修飾を施して、核酸リガンドのｉｎ　ｖｉｖｏ安定性を高め、または核酸リガンドの送達を高めもしくは仲介することができる。たとえば下記を参照：米国特許出願Ｎｏ．０８／１１７，９９１（１９９３年９月８日出願）（現在は放棄）およびＵＳＰ５，６６０，９８５、両方とも表題”修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド”、ならびに米国特許出願Ｎｏ．０９／３６２，５７８（１９９９年７月２８日出願）、表題”無転写ＳＥＬＥＸ”；これらそれぞれの全体を特に本明細書に援用する。本発明において考慮される核酸リガンド修飾には、さらに電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用およびフラックス性を取り込ませる他の基を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付与するものが含まれるが、これらに限定されない。そのような修飾には、糖の２’位修飾、ピリミジンの５位修飾、プリンの８位修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジン置換、５−ブロモもしくは５−ヨード−ウラシル置換；主鎖の修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェートの修飾、メチル化、異例の塩基対組合わせ、たとえばイソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には３’および５’修飾、たとえばキャッピングも含まれる。本発明の好ましい態様において、核酸リガンドはピリミジン残基の糖部分が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されたＲＮＡ分子である。
【００４１】
修飾はＳＥＬＥＸプロセス前またはプロセス後修飾であってよい。ＳＥＬＥＸプロセス前修飾では、それらのＳＥＬＥＸターゲットに対する特異性と改良されたｉｎ　ｖｉｖｏ安定性を共に備えた核酸リガンドが得られる。２’−ＯＨ核酸リガンドに対して行ったＳＥＬＥＸプロセス後修飾では、核酸リガンドの結合能に不都合な影響を与えることなく改良されたｉｎ　ｖｉｖｏ安定性が得られる。
【００４２】
他の修飾は当業者に既知である。そのような修飾はＳＥＬＥＸプロセス後に（予め同定した非修飾リガンドを修飾する）、またはＳＥＬＥＸプロセスに組み込んで実施できる。
【００４３】
本発明の核酸リガンドは前記に概説したＳＥＬＥＸ法により製造される；これは、本明細書にその全体を援用するＳＥＬＥＸ特許出願により十分に実施できる。
【００４４】
好ましい態様においてこのＳＥＬＥＸ法は、疎水性相互作用により磁性ビーズに結合したＰＳＭＡフラグメントを用いて実施される。次いで遠心管内で一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合物を磁性ビーズと接触させる。予め定めた時間、選択した温度でインキュベートした後、ビーズを磁界により遠心管の側面に保持し、遠心管を洗浄して結合していない候補核酸リガンドを除去する。次いでＲＮＡに結合している核酸リガンドを遠心管の溶液中へ放出させ、次いで逆転写酵素により逆転写し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。次いで、増幅した候補混合物を用いて次のラウンドのＳＥＬＥＸプロセスを開始する。
【００４５】
本発明の特定の態様において、本明細書に記載するＰＳＭＡに対する核酸リガンドは診断用として有用であり、病的状態の造影（たとえばヒト腫瘍の造影）に使用できる。診断のほか、ＰＳＭＡ核酸リガンドは、ＰＳＭＡを発現する疾病状態の予後および監視に有用である。
【００４６】
診断薬は、使用者が特定の部位のターゲットの存在または濃度を同定できさえすればよい。診断用としては、陽性信号を発するためにターゲットと対を形成する能力だけで十分である。当業者は、核酸リガンドの存在を追跡するためにマーカーを取り込ませる既知技術により、ＰＳＭＡ核酸リガンドを利用できるであろう。そのようなマーカーを多くの診断操作、たとえば原発性および転移性腫瘍の検出に使用できる。１態様において標識用マーカーはテクネチウム−９９ｍであるが、他のマーカー、たとえば他の放射性核種、磁性化合物、発蛍光団、ビオチンなども、ＰＳＭＡを発現する疾病状態のｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏ設定での造影のために、ＰＳＭＡ核酸リガンドに結合させることができる。マーカーをＰＳＭＡ核酸リガンドの多様な位置、たとえばＰＳＭＡ核酸リガンドの塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸のヒドロキシル基、または５’もしくは３’末端のヒドロキシルその他の基に共有結合させることができる。マーカーがテクネチウム−９９ｍである態様においては、好ましくはこれをその５’もしくは３’のリン酸基のヒドロキシル、または修飾ピリミジンの５位に結合させる。最も好ましい態様においては、マーカーを核酸リガンドの５’のリン酸基のヒドロキシルに、リンカーにより、またはリンカーなしに結合させる。他の態様においては、５位に第一級アミンを含むピリミジンを取り込ませ、このアミンをマーカーとの結合に利用することにより、マーカーを核酸リガンドに結合させる。マーカーの結合は、直接またはリンカーを用いて行うことができる。テクネチウム−９９ｍをマーカーとして用いる態様において、好ましいリンカーはヘキシルアミンリンカーである。
【００４７】
他の態様において、ＰＳＭＡ核酸リガンドは療法化合物（細胞毒性化合物、免疫増強物質および療法用放射性核種が含まれるが、これらに限定されない）をＰＳＭＡ発現組織または臓器へ送達するのに有用である。ＰＳＭＡを発現する可能性のある疾病状態には癌が含まれる。当業者は、療法化合物を複合体に取り込ませる既知技術により、ＰＳＭＡ核酸リガンドを利用できるであろう。療法化合物はＰＳＭＡ核酸リガンドの多様な位置、たとえばＰＳＭＡ核酸リガンドの塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸のヒドロキシル基、または５’もしくは３’末端のヒドロキシルその他の基に共有結合させることができる。好ましい態様においては、療法薬を核酸リガンドの５’アミンに結合させる。療法薬の結合は、直接またはリンカーを用いて行うことができる。ターゲティングする疾病が癌である態様においては、癌に対して有効であることが知られている５−フルオロデオキシウラシルまたは他のヌクレオチド類似体を、ＰＳＭＡ核酸リガンド内の既存のＵ内へ取り込ませるか、または内部に付加するか、またはいずれかの末端に直接もしくはリンカーにより結合させることができる。さらに、ピリミジン類似体２’，２’−ジフルオロシチジンおよびプリン類似体（デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ））の両方を取り込ませてもよい。さらに、米国特許出願Ｎｏ．０８／９９３，７６５（１９９７年１２月１８日出願）、表題”ヌクレオチドベースのプロドラッグ”（その全体を本明細書に援用する）には、特に化学放射線増感剤ならびに放射線増感剤および放射性核種ならびに他の放射線療法薬を腫瘍に正確に局在化させるための、腫瘍細胞に指向する核酸リガンドを含むヌクレオチドベースのプロドラッグが記載されている。
【００４８】
マーカーおよび療法薬の両方をＰＳＭＡ核酸リガンドと結合させ、これにより疾病状態の検出と療法薬の送達を１つのアプタマーにおいて、または同じアプタマーの２以上の異なる修飾形の混合物として、一緒に行うことも考慮される。マーカーおよび／または療法薬の一方または両方を非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物、たとえばリポソームと結合させることも考慮される。診断用または療法用複合体において核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性化合物を結合させる方法は、ＵＳＰ６，０１１，０２０（１９９５年５月４日出願）、表題”核酸リガンド複合体”に記載されている；その全体を本明細書に援用する。
【００４９】
核酸リガンドの療法用組成物を注射により非経口投与できるが、他の効果的な投与方式、たとえば関節内注射、吸入剤ミスト、経口製剤、経皮イオン浸透療法または坐剤も考慮される。好ましいキャリヤーのひとつは生理食塩水であるが、医薬的に許容できる他のキャリヤーも使用できると考えられる。好ましい態様のひとつにおいては、キャリヤーおよびリガンドが生理的に適合性の徐放性製剤を構成することが考慮される。そのようなキャリヤーにおける主な溶剤は水性または非水性であってよい。さらにキャリヤーは、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭いを改良または保持するために、薬理薬的に許容できる他の賦形剤を含有してもよい。またキャリヤーは、リガンドの安定性、溶解、放出または吸収の速度を改良または保持するために、薬理薬的に許容できるさらに他の賦形剤を含有してもよい。そのような賦形剤は、１回量または複数回量の剤形の非経口投与製剤を配合するために通常慣用される物質である。
【００５０】
療法用組成物を調製した後、それを無菌バイアル中に、液剤、懸濁液剤、ゲル剤、乳剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存できる。そのような製剤をそのまま使用できる形で、または投与直前に再構成する必要のある形で保存できる。核酸リガンドを含有する全身送達製剤の投与様式は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内経路によるもの、または膣もしくは直腸坐剤である。
【００５１】
後記実施例は本発明を説明および例示するためのものであり、本発明の限定ととるべきではない。
実施例１にはＰＳＭＡに対するＲＮＡリガンドの作成に用いる材料および実験法を記載する。アプタマーのｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択には精製したＰＳＭＡタンパク質が必要であった。これらのアプタマーの最終用途はｉｎ　ｖｉｖｏで前立腺癌細胞を結合することであるので、ＰＳＭＡの細胞外部分のみで十分なターゲットであると考えられる。したがって、除去可能なアフィニティータグ付きのＰＳＭＡ細胞外部分のみを発現するベクターを設計した。
【００５２】
ＰＳＭＡの細胞外部分（ｘＰＳＭと呼ぶ）のみをコードするバキュロウイルス発現ベクターを、実施例１の記載に従って設計した。これを図１に模式的に示す。図１を参照すると、ＰＳＭＡ　ｃＤＮＡのフラグメント（全長ＰＳＭＡの細胞外アミノ酸７０６個のみをコードする）を、バキュロウイルス伝達ベクターｐＢＡＣｇｕｓ−１０の多重クローニング部位へクローニングした。このベクターは増殖培地中で高レベルの融合タンパク質を生成するように設計された。このタンパク質をアフィニティータグにより精製し、エンテロキナーゼ開裂により放出させることができる。得られた伝達プラスミドｐＢＡＣｇｕｓ−ＰＳＭを配列決定して、コード枠の適正および配列統合性を確認した。ｐＢＡＣｇｕｓ−ＰＳＭとＢＡＣ　Ｖｅｃｔｏｒ−３０００線状ＤＮＡの両方をＳｆ−９細胞へ同時トランスフェクションし、得られた組換えウイルスプラークを精製し、Ｔａｇ−ｘＰＳＭの発現によりスクリーニングした。次いで、大規模感染のために単一組換えバキュロウイルスを無血清条件下で用いた。
【００５３】
感染細胞培地を感染の７２〜８０時間後に収穫し、Ｓ−プロテインアガロースと共にインキュベートしてＴａｇ−ｘＰＳＭを捕獲した。次いで組換えエンテロキナーゼを用いてｘＰＳＭを遊離させた。消化後、エンテロキナーゼをアフィニティー樹脂により捕獲すると、純粋なｘＰＳＭのみが上清中に残った。タンパク質の純度を銀染色により測定した。エンテロキナーゼ無添加対照にはＴａｇ−ｘＰＳＭがみられなかった（図２）。精製ｘＰＳＭのサイズは約９０ｋＤと計算され、予想した７９．５ｋＤの生成物がグリコシル化されたことを示唆する。
【００５４】
次いでｘＰＳＭ融合タンパク質の酵素活性を試験して、天然タンパク質コンホメーションであることを確認した。これは、天然タンパク質ではなく不適正フォールディング融合タンパク質を認識するアプタマーの進化を避けるために重要である。精製ｘＰＳＭタンパク質は、図３に描いたように、Ｋ_ｍ１６．１ｎＭおよびＶ_ｍａｘ１３ｍｍｏｌ／ｍｇ^＊分の予想したＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を示した。選択に際して結合ＲＮＡアプタマーを分配する手段として、精製タンパク質を磁性ビーズに固定した。ｘＰＳＭ画分はビーズに結合した状態でＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を維持した。
【００５５】
生理的条件下で使用できるアプタマーを同定するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択方式を設計した。ヌクレアーゼ安定性を保証するために、２’−Ｆ修飾ピリミジンをすべての転写に用いた。フルオロピリミジンＲＮＡアプタマーは血清中で数時間は安定であると報告されている（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：５２２９−３４）。さらに、アプタマーを３７℃、ｐＨ７．４でターゲットにのみ結合させた。
【００５６】
ランダム配列合成鋳型の転写により、約６×１０^１４の異なるヌクレアーゼ安定性ＲＮＡ分子のライブラリーを作成した。このアプタマーライブラリー鋳型は、Ｔ７プロモーター、ＰＣＲ増幅のための２つの末端固定領域、および４０ヌクレオチドの内部ランダム領域からなっていた（図４）。選択の前に、ターゲットタンパク質を磁性ビーズに結合させた。ビーズ上でターゲットタンパク質は酵素活性を維持していた。ランダム配列ライブラリーをｘＰＳＭ−磁性ビーズと共に３０分間インキュベートして結合させた。タンパク質結合集団を磁気分離により分配し、逆転写および定量ＰＣＲにより増幅した。得られた鋳型が転写されて、次のサイクルの選択に用いる２’−Ｆ修飾ＲＮＡが生成した。
【００５７】
表１に示すように６回の反復選択を実施し、定量した。結合に利用できるｘＰＳＭ−磁性ビーズの量を減らすことにより、またはＲＮＡの量を減らすことにより、選択の緊縮度を調節した。Ｓ−Ｎ比は選択ラウンド６において５７００倍でピークに達し、合計９ラウンドの選択までそれ以上の改善を示さなかった。表１に示すＳ−Ｎ比は、ｘＰＳＭビーズに結合したＲＮＡとビーズ単独の比較により判定された。
【００５８】
酵素アッセイにより、酵素リガンド相互作用を同定および定量するための高感度法が得られる。したがって、実施例１に記載するように、特定ラウンドの２’−Ｆ修飾ＲＮＡがｘＰＳＭ　ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を阻害する能力を試験した。特異性の対照配列として原ランダム配列ライブラリーを試験したが、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性に対する影響はなかった；選択したＲＮＡ集団では、ラウンド３で既にマイクロモル濃度のアプタマー阻害がみられた（図５）。ラウンド６のＲＮＡアプタマー集団はｘＰＳＭに対し最大親和性を示し、したがってこれを個々のアプタマークローンの単離および配列決定に用いた。
【００５９】
ラウンド６のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、クローニングした。ランダムに採取した６０のプラスミドクローンを配列決定した。配列決定した６０クローンのうち９５％がわずか２つの配列で表わされた。ｘＰＳＭ−Ａ９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）と命名したこれらの同定配列（図６）はユニークであり、共有するコンセンサス配列はない。
【００６０】
ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性阻害能に基づいて、各アプタマーの親和性を試験した。アプタマーｘＰＳＭ−Ａ９はＫ_ｉ１．１ｎＭで非競合阻害を示す（図７Ｂ）。一方、アプタマーｘＰＳＭ−Ａ１０はＫ_ｉ１１．９ｎＭで競合阻害を示す（図７Ａ）。これら２つの別個の様式の阻害は、各アプタマーがＰＳＭＡの細胞外ユニークエピトープを同定することを示唆する。両アプタマーとも、ＬＮＣａＰ細胞由来の天然ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を同様な親和性で阻害する。
【００６１】
図９および１０は、アプタマーがＬＮＣａＰ細胞表面の天然ＰＳＭＡに結合することを証明する。前記の各図のデータはアプタマーがバキュロウイルスにより精製された合成ＰＳＭＡであるｘＰＳＭに結合することを証明しているので、これは重要である。図９に示したＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイは実施例１の記載に従って実施され、ただしＬＮＣａＰからの膜抽出物を精製ｘＰＳＭの代わりに用いた。この方法はＣａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（２）：７４９−５３に記載されている。既知マイクロモル濃度のＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害薬キスカル酸を標準対照として含有させる。これにより、既知ＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害薬と比較した前記アプタマーの力価が証明される。
【００６２】
これらのアプタマーがＰＳＭＡ発現細胞を特異的に結合しうるか判定するために、最小アプタマーＡ１０−３を蛍光標識した。Ａ１０−３配列のランダムスクランブリングにより、陰性標準対照Ａ１０−３−ｒｎｄｍを開発した。蛍光顕微鏡検査により結合特異性を証明したところ、アプタマーＡ１０−３はＰＳＭＡを発現するＬＮＣａＰ細胞を特異的に結合したが、陰性対照ＰＣ−３細胞を結合しなかった（図１０）。図１０にみられるように、スクランブルＡ１０−３配列（Ａ１０−３−ｒｎｄｍ）はいずれの細胞系に対しても特異性を示さない。
【００６３】
実施例２には、２つの選択した核酸リガンドがｘＰＳＭに高親和性結合するのに必要な最小サイズの判定を記載する。アプタマーｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）がＰＳＭＡ活性を阻害する能力を保持したまま、５６ヌクレオチド、すなわち１８．５ｋＤにトランケートするのに成功した（図８）。これらのアプタマーを阻害薬として使用でき、あるいは造影または療法処置のための薬剤を運搬するために修飾することができる。
【００６４】
実施例
実施例１．ＰＳＭＡに対する核酸リガンドを得るためのＳＥＬＥＸの使用
材料および方法
ＬＮＣａＰからのＰＳＭＡ　ｃＤＮＡのクローニング．２μｇの全ＬＮＣａＰ　ＲＮＡから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。全長ＰＳＭＡコード領域をフランキングするＰＳＭＡ　ｃＤＮＡ塩基１３４〜１５２および２５５１〜２５６７に相同なプライマーを、ＰＣＲ増幅に用いた。高忠実度Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて増幅を実施した。単離した生成物をｐＣＲ−２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中へライゲートさせた。有効なクローンｐＦＵＬＰＳＭ−１を配列決定し、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９９４８７と同一であることが認められた。このクローンは全長ＰＳＭＡタンパク質のコード領域である。
【００６５】
組換えＰＳＭＡ発現バキュロウイルスの作成．ＰＳＭＡの細胞外部分全体と連結グリシンを含むように、制限酵素切断部位を含有するプライマーを設計した（具体的には、塩基３９５〜４２２および２４９１〜２５０３）。ＰＣＲ生成物を、ポリヘドロンプロモーターの制御下にｐＢＡＣｇｕｓ−１０伝達プラスミド（Ｎｏｎａｇｅｎ社、ウィスコンシン州マディソン）中へライゲートさせた。得られたプラスミドｐＢＡＣｇｕｓ−ＰＳＭを配列決定して、配列統合性を確認した。Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ）をｐＢＡＣｇｕｓ−ＰＳＭおよび線状高効率Ｂａｃ　Ｖｅｃｔｏｒ−３０００　Ｔｒｉｐｌｅ　ＣｕｔウイルスＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により、１０％ウシ胎仔血清を補充したＧｒａｃｅの昆虫培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で同時トランスフェクションした。個々の組換えウイルスプラークを採取し、組換えタンパク質発現をＳ−タグアッセイ法およびＳ−タグウェスタン法（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により、製造業者の指示に従ってアッセイした。ＰＳＭＡの細胞外部分全体を発現する単一の陽性クローン（ｘＰＳＭと命名）を２００ｍＬの懸濁培養により、高力価（≧１０^８ＰＦＵ／ｍＬ）に増幅させた。
【００６６】
大規模ｘＰＳＭ発現および精製．Ｓｆ−９細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＳｆ−９００ＩＩ無血清培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に単層として接種し、組換えウイルスをＭ．Ｏ．Ｉ．５で感染させた。感染の７２〜８０時間後に感染細胞培地を収穫し、ｔａｇ−ＰＳＭレベルをＳ−タグアッセイ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により定量した。融合タンパク質をＳ−プロテインアガロースに結合させ、洗浄し、製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の指示に従って組換えエンテロキナーゼ（ｒＥＫ）によりｘＰＳＭを放出させた。最後に、ｒＥＫをＥＫａｐｔｕｒｅアガロースビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に結合させ、精製されたｘＰＳＭタンパク質をＵｌｔｒａ−Ｆｒｅｅ１５、ＭＷＣＯ　５０ｋＤ濃縮遠心カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州ベッドフォード）により濃縮した。ｘＰＳＭ濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）により測定した。タンパク質純度を銀染色分析により確認した。
【００６７】
銀染色．約１００〜５００ｎｇの精製ＰＳＭＡタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎ　Ｐｌｕｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュレス）により染色した。すべての精製ｘＰＳＭのサイズおよび純度を銀染色ゲルにより調べた。
【００６８】
ＰＳＭＡ　ＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイ．本質的にＲｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１４４９８−５０６の記載に従って、ＮＡＡＧ加水分解を実施した。５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の存在下での超音波処理により、ＬＮＣａＰ細胞抽出物を調製した。細胞溶解物または精製ｘＰＳＭを、放射性標識基質Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−［３，４−^３Ｈ］グルタメート（ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチュセッツ州ボストン）の存在下に３７℃で１０〜１５分間インキュベートした。等体積の氷冷した１００ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭ　ＥＤＴＡにより、反応を停止した。無傷基質からアニオン交換クロマトグラフィーにより生成物を分離し、シンチレーション計数により定量した。一般に８ｎＭの基質の存在下でアプタマーのＩＣ５０を判定した。基質の系列希釈液中５〜３０ｎＭのアプタマーを用いて、アプタマーのＫ_ｉを判定した。すべての場合、基質の開裂は２０％未満であった。
【００６９】
ＰＳＭＡアプタマーのｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択．ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に詳述されている。要約すると、４０Ｎ７ａ　ｓｓＤＮＡ：
【００７０】
【化１】

【００７１】
を、５Ｎ７プライマー：
【００７２】
【化２】

【００７３】
（Ｔ７ポリメラーゼプロモーター（下線部）を含む）を用いてクレノーフラグメント延長することにより、二本鎖転写鋳型を作成した。先にＦｉｔｚｗａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｐｏｌｉｓｋｙ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２７５−３０１（その全体を本明細書に援用する）に記載されたように、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを調製した。転写反応はすべて、糖部分を２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾したピリミジンヌクレオチドの存在下で実施された。この置換により、ホスホジエステル結合の開裂に２’−ヒドロキシル部分を利用するリボヌクレアーゼに対する耐性が高まる。具体的には、転写混合物はそれぞれ３．３ｍＭ　２’−Ｆ　ＵＴＰおよび３．３ｍＭ　２’−Ｆ　ＣＴＰを、１ｍＭ　ＧＴＰおよびＡＴＰと一緒に含有していた。こうして調製した原ランダム化ＲＮＡライブラリーは６×１０^１４分子を含有していた（１ナノモルのＲＮＡ）。
【００７４】
後記のように９ラウンドのＳＥＬＥＸプロセスを実施し、ＰＳＭＡ酵素活性阻害能に基づいてラウンド６をクローニング用に選択した。
ターゲットビーズの調製．常磁性ポリスチレンビーズをＤｙｎａｌ社から購入した：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−４５０、コーティングなし、４．５μｍ、２．４％ｗ／ｖ。０．５ｍＬミクロ遠心管中でＤｙｎａｌ　ＭＰＣ−Ｅ分離器により、選択および磁気分離を実施した。使用前にビーズ（１００μＬ）をリン酸カリウム（１００ｍＭ、３×５００μＬ、ｐＨ８．０）、３×５００μＬヘペス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）、ＣａＣｌ_２（１ｍＭ）（ＨＢＳＭＣ）で洗浄した。次いで、１０μｇのターゲットタンパク質を含有するＨＢＳＭＣ（１００μＬ）にビーズを再懸濁し、４℃で一夜回転させた。次いでビーズをＨＢＳＭＣ（３×５００μＬ）で洗浄し、ＨＢＳＭＣ（４００μＬ）に再懸濁し、３×５００μＬのＨＢＳＭＣ、ＨＳＡ（０．０１％）およびＴｗｅｅｎ　２０（０．０５％）（ＨＢＳＭＣＨＴ）で洗浄した。次いでビーズをＨＢＳＭＣＨＩＴ（”Ｉ”はＩ−ブロックを表わす）（３００μＬ、固形分０．６％ｗ／ｖ）に再懸濁し、４℃に保存した。
【００７５】
選択および分配．ターゲットビーズ（５０μＬ）をＨＢＳＭＣＨＩＴ中、３７℃で３０分間、プレブロックした。次いでターゲットビーズ（５０μＬ）をＨＢＳＭＣＨＩＴ（１００μＬ）緩衝液中でアプタマープール（１ナノモルのＲＮＡ）と混和し、混合物を３７℃で３０分間回転させた。ＲＮＡおよびビーズの実際量はラウンド毎に異なり、後の選択ラウンドになるほど少なかった。次いでビーズを３７℃のＨＢＳＭＣＨＴ（５×５００μＬ）で洗浄し、新たな試験管に移し、最終洗液（５００μＬ）を除去した。
【００７６】
溶離および逆転写．洗浄ビーズを３’−プライマー（２０μＬ、５μＭ）に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートし、徐々に室温に冷却した。５×ＲＴマスターミックス（５μＬ）を添加し、混合物を４８℃で３０分間インキュベートした。反応混合物をビーズから分離し、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）反応ミックスを添加した。反応混合物を表２にまとめる。
【００７７】
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および転写．ｃＤＮＡ（２５μＬ）をＱＰＣＲマスターミックス（７５μＬ）に添加した。定量標準ｃＤＮＡおよび無鋳型対照も、各ラウンドに含めた。ＰＣＲを下記に従って実施した：ＱＰＣ機（ＡＢＩ７７００）により３５サイクルの９５℃１５秒、５５℃１０秒、７２℃３０秒、続いて９５℃で３分間の初回インキュベーション。次いでＰＣＲ生成物（５０μＬ）を転写マスターミックス（１５０μＬ）に添加し、混合物を３７℃で４〜１６時間インキュベートし、続いて１０分間のＤＮＡｓｅ処理を行い、最後に全長ＲＮＡ転写体をゲル精製した。
【００７８】
クローニングおよび配列決定．増幅した第６ラウンドのオリゴヌクレオチドプールを８％ポリアクリルアミドゲル精製し、逆転写してｓｓＤＮＡにし、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーを用いてこのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲフラグメントを標準法に従ってクローニングし、プラスミドを調製し、配列分析を行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、３　ｖｏｌ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー）。ＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ−ターミネーターサイクル配列決定プレミックスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）およびＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７シークエンサーを用いてプラスミドを配列決定した。
【００７９】
蛍光染色．５’−Ｈｅｘａｌ−アミンアプタマーＡ１０−３およびＡ１０−３−スクランブル（ｃａｇｇｃａｕｇｃｃｕａｇｃｕａａｇｃａｇｃｃｃａｕｇｇｃｕｕａｕｇｃｇｃｇｇａａｕａｕｕｇｇｃｕｕｃｃｇｕｕｃ）２’ＦＹ−アプタマーを、デオキシ−Ｔ３’キャップ付きで合成した。アプタマーをローダミン−レッド−Ｘスクシンイミジルエステル^＊５異性体^＊（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）により、製造業者の指示に従って末端標識した。全長ローダミン標識アプタマーをゲル精製し、定量した。ウェル当たり５×１０４のＬＮＣａＰ親細胞およびＰＣ−３細胞を４チャンバースライドガラス（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レークス）に接種した。接種の２４時間後、スライドを１０％緩衝ホルマリン中、室温でで８〜１６時間固定し、マグネシウムまたはカルシウムを含有しないＰＢＳ中に４℃で保存した。各ウェルを、マグネシウムまたはカルシウムを含有しないＰＢＳ中５０ｎＭの標識アプタマー中、室温で１０〜１５分間インキュベートした。次いでスライドをＰＢＳ中で数回すすぎ、カバーガラスをかけ、シールした。ショートアーク水銀灯照明付き蛍光顕微鏡（Ｚａｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｋｏｐ　ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｃａｒｌ　Ｚａｉｓｓ社、ニューヨーク州ソーンウッド）および冷却したＣＣＤカメラ（Ｍｉｃｒｏ　ＭＡＸデジタルカメラ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニュージャージー州トレントン）によりスライドを映像化した。Ａｄｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｂｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ワシントン州シアトル）で映像を同様に処理した。結果を図１０に示す。
【００８０】
実施例２．アプタマーＡ１０およびＡ９の最小サイズの判定
最小アプタマー配列を判定するために、一連の３’および５’トランケート体のＩＣ_５０を調べた。アプタマーｘＰＳＭ−Ａ９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）の３’末端から活性を保持した状態で５ヌクレオチドを除くことができ、これによりアプタマーＡ９−１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）が得られる。アプタマーｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）の３’末端から活性を保持した状態で少なくとも１５ヌクレオチドを欠失しうることが認められ、これによりアプタマーＡ１０−３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）が得られる。この１８．５ｋＤアプタマーは、Ｋ_ｉ＝２０．５ｎＭでｘＰＳＭ　ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性阻害能を保持する（図８）。この短いＡ１０−３は５’−トランケーションでは活性を保持できなかった。
【００８１】
【表１】

【００８２】
【表２】

【００８３】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【図１】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択ターゲットであるＰＳＭＡ細胞外部分の設計を示す。融合タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスは、Ｔａｇ−ｘＰＳＭをｇｐ６４分泌シグナルにより分泌する。この融合タンパク質を培地から、セルロースカラムまたはＳ−プロテインアガロースビーズにより精製する。ＰＳＭＡの細胞外部分のみを含むタンパク質（ｘＰＳＭ）がエンテロキナーゼ開裂により放出される。
【図２】
精製ｘＰＳＭタンパク質の銀染色を示す。ｘＰＭＳの純度が銀染色により明らかになる。陰性対照は、エンテロキナーゼが存在しないとタンパク質が放出されないことを示す。精製ｘＰＭＳのサイズは約９０ｋＤと計算され、発現した７９．５ｋＤの生成物がグリコシル化されたことを示唆する。
【図３】
ｘＰＭＳ融合タンパク質のＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を示す。精製ｘＰＭＳは、Ｋ_ｍ１６．１ｎＭおよびＶ_ｍａｘ１３ｍｍｏｌ／ｍｇ^＊分の天然ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を示す。
【図４】
実施例１に記載したｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択を模式的に示す。使用したＲＮＡアプタマーライブラリー鋳型は、Ｔ７プロモーターを含む５’末端固定領域、４０連続ヌクレオチドの内部ランダム領域、続いて最終固定プライマー領域からなる。典型的な選択ラウンドは、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ピリミジンを含むＲＮＡライブラリーの転写、続いてリガンド結合したＲＮＡをリガンド結合していないＲＮＡから分離する分配工程を伴う。次いで、結合したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により増幅する。ターゲットリガンドに対するＲＮＡアプタマープールの親和性が最大に達するまで数ラウンドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択を終了する。次いで得られたｄｓＤＮＡをプラスミドベクター中へクローニングし、配列決定する。次いで各アプタマーをターゲットリガンドに対する親和性について試験する。
【図５】
ＳＥＬＥＸ−ＲＮＡプールによるｘＰＭＳ活性阻害を示す。図５に示すように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ選択ラウンドはＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を阻害し、これに対し原プールは阻害を示さない。ラウンド６のｘＰＭＳ結合選択が、それ以前および以後のラウンドの選択と比較して最良のＩＣ５０を示す。原ランダムＲＮＡは、これらの範囲ではＮＡＡＬＡＤａｓｅに対し効果がない。（〇）ランダムＲＮＡ；（黒四角）ラウンド３；（▲）ラウンド６；（◆）ラウンド８；（＊）ラウンド９。
【図６】
ラウンド６からの個々のアプタマー配列を示す。約１０^１４の多様な原ＲＮＡ配列を選択して本質的に２つのアプタマー配列ｘＰＳＭ−Ａ９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）を得た。
【図７】
図７ＡおよびＢは、２つのアプタマーｘＰＳＭ−Ａ９およびｘＰＳＭ−Ａ１０が別個のタイプの阻害性をもつことをグラフで示す。これは、２つの別個のエピトープであることを表わす。図７Ａでは、３０ｎＭのアプタマーｘＰＳＭ−Ａ１０が計算値Ｋ_ｉ１１．９ｎＭで競合阻害を示す。あるいは図７Ｂでは、１ｎＭのアプタマーｘＰＳＭ−Ａ９が計算値Ｋ_ｉ１．１ｎＭで非競合阻害を示す。両方のグラフにおいて：（黒四角）はｘＰＳＭ、（〇）はｘＰＭＳ＋アプタマー阻害薬である。Ｒ^２値はＡ：ｘＰＭＳ　０．７９３２、Ａ：ｘＰＭＳ−Ａ１０　０．８８７、Ｂ：ｘＰＭＳ　０．８１５５、Ｂ：ｘＰＭＳ−Ａ９　０．７２４８。
【図８】
５６ヌクレオチドのｘＰＳＭ−Ａ１０トランケート体によるＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害をグラフで示す。アプタマーｘＰＳＭ−Ａ１０−３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）は、ｘＰＳＭ−Ａ１０の１５ヌクレオチドトランケート体である。この比較的短いヌクレオチドは競合阻害を示し、Ｖ_ｍａｘには影響を与えずにＫ_ｍを高める。平均Ｋ_ｉ＝２０．４６±７．８ｎＭ。Ｒ^２値：ｘＰＭＳ　０．８７４８、ｘＰＳＭ−Ａ１０−３　０．７８６１。
【図９】
アプタマーｘＰＳＭ−Ａ９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびｘＰＳＭ−Ａ１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）による天然ＰＳＭＡのＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害をグラフで示す。
【図１０】
アプタマーＡ１０−３が細胞表面に発現した天然ＰＳＭＡに特異的に結合する能力を示す。蛍光標識したＡ１０−３（５０ｎＭ）またはＡ１０−３−ｒｎｄｍ（スクランブルＡ１０−３配列）をホルマリン固定ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ陽性）およびＰＣ−３細胞（ＰＳＭＡ陰性）と共に１２分間インキュベートし、洗浄し、蛍光顕微鏡検査により視覚化した。

Claims (15)

1. 下記の工程を含む方法に従って同定された、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する核酸リガンド：
   ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；
   ｂ）候補混合物と対比して高いＰＳＭＡ親和性を有する核酸を候補混合物の残りのものから分配できるように、核酸の候補混合物とＰＳＭＡを接触させる工程；
   ｃ）高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する工程；そして
   ｄ）ＰＳＭＡに対する結合の親和性および特異性が相対的に高い核酸に富む核酸混合物にするために、高親和性核酸を増幅する工程であって、これによりＰＳＭＡの核酸リガンドを同定する。
2. 核酸の候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１に記載の核酸リガンド。
3. 一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項２に記載の核酸リガンド。
4. 一本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項２に記載の核酸リガンド。
5. 核酸の候補混合物が２’−Ｆ（２’−フルオロ）修飾リボ核酸を含む、請求項３に記載の核酸リガンド。
6. ＰＳＭＡに対する精製および単離された非天然核酸リガンド。
7. 核酸リガンドが一本鎖である、請求項６に記載の精製および単離された非天然核酸リガンド。
8. 核酸リガンドがＲＮＡである、請求項７に記載の精製および単離された非天然核酸リガンド。
9. リガンドが２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の精製および単離された非天然ＲＮＡリガンド。
10. リガンドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３〜２７よりなる群から選択される、ＰＳＭＡに対する精製された非天然ＲＮＡリガンド。
11. 下記の工程を含む、ＰＳＭＡに対する核酸リガンドの同定方法：
    ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；
    ｂ）候補混合物と対比して高いＰＳＭＡ親和性を有する核酸を候補混合物の残りのものから分配できるように、核酸の候補混合物とＰＳＭＡを接触させる工程；
    ｃ）高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する工程；そして
    ｄ）ＰＳＭＡに対する結合の親和性および特異性が相対的に高い核酸に富む核酸混合物にするために、高親和性核酸を増幅する工程であって、これによりＰＳＭＡの核酸リガンドを同定する。
12. 候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 一本鎖核酸がリボ核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
14. ＰＳＭＡが疎水性相互作用により固体支持体と結合しており、工程ｂ）〜ｃ）が該固体支持体の表面で行われる、請求項１に記載の核酸リガンド。
15. 固体支持体がビーズである、請求項１４に記載の核酸リガンド。

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