ES2851924T3 - Estructura artificial de aptámero - Google Patents

Abstract

Un aptámero que se une específicamente a CD133, que comprende la secuencia 5' - X - ACGUAUACUAU- Y -3' (SEQ ID NO: 1), en donde la secuencia de X e Y son complementarias para poder aparear las bases y en donde X comprende al menos CGCG o GCGC capaz de un apareamiento de bases con GCGC o CGCG comprendida en Y para formar 4 nucleótidos CG apareados suficientes para permitir una intercalación de al menos un resto entre ellos, en donde dichos nucleótidos CG cuando se aparean comprenden la región del tallo del aptámero y en donde el resto es un colorante de ADN o una molécula utilizada en un tratamiento quimioterapéutico.

Description

DESCRIPCIÓN

Estructura artificial de aptámero

Campo de la descripción

La presente descripción se refiere a aptámeros y a usos de los mismos, en particular, a aptámeros que se unen específicamente a CD133 y que son particularmente útiles en el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer.

Antecedentes

CD133, también conocida como Prominina-1, es una glicoproteína de membrana pentapaso, altamente glicosilada, que está asociada con el colesterol en la membrana plasmática. Aunque se sabe que esta proteína define una amplia población de células, incluidas las células madre somáticas y progenitoras, y se expresa en diversas células diferenciadas y epiteliales en desarrollo, su función exacta aún está siendo aclarada. Sin embargo, se ha relacionado con la vía de señalización de Notch, que es fundamental para el destino celular binario, la diferenciación del epitelio intestinal y la linfopoyesis (Ulasov et al. 2011. Mol Med 17:103-12). Se ha mostrado más interés hacia esta molécula en los últimos años debido a que se cree que es un marcador de las células madre cancerosas (CSCs) en varios tipos de cáncer. De hecho, una evidencia creciente ha mostrado que CD133 se expresa en CSCs en varios cánceres, y existe un potencial tumorigénico incrementado de las células CD133+ frente a sus homólogas negativas en ratones inmunodeficientes (Dittfeld et al. 2009. Radiother Oncol 92:353-61).

La inmunoterapia ha tenido un gran impacto sobre el tratamiento del cáncer en los últimos años. Sin embargo, el uso de anticuerpos, incluso de anticuerpos humanizados, puede provocar efectos secundarios adversos que pueden ser fatales (Hansel et al. 2010. Nat Rev Drug Discov 9:325-38). Esto ha llevado a la búsqueda de opciones “mayores y mejores”. Se han realizado varios intentos de utilizar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos, aunque se han obtenido resultados decepcionantes, sobre todo por el hecho de que esos ácidos nucleicos no penetran en la célula (Shigdar et al. 2011. Br J Haematol 155:3-13).

Shigdar et al. 2013 se refieren a la interacción entre un aptámero y CD133 y describen un aptámero de ARN con la secuencia 5'-X-ACGUAUACUAU-Y-3', en donde la secuencia de X e Y son complementarias para poder aparear las bases, y en donde X e Y comprenden individualmente una longitud de nucleótidos CG apareados que es suficiente para permitir la fijación de al menos un resto a los mismos.

Los anticuerpos químicos, denominados aptámeros, se han utilizado cada vez más para aplicaciones clínicas en los últimos veinte años. De hecho, un aptámero, pegaptanib (un aptámero anti-VEGF) ha sido aprobado por la FDA y algunos más están en ensayos clínicos. El mayor interés por el uso de aptámeros para la terapia se debe a varias razones, incluyendo el hecho de que no muestran inmunogenicidad, poca variación entre lotes debido a la síntesis química, y que son más estables que los anticuerpos convencionales. Debido a su pequeño tamaño, también muestran una penetración tumoral superior. Sin embargo, su característica más importante es la capacidad de fijar estos aptámeros a nanopartículas, fármacos, agentes de formación de imágenes u otros agentes terapéuticos de ácido nucleico sin pérdida de función (Meng et al. 2012. PLoS One 7:e33434). Esa funcionalización está conduciendo a terapias nuevas y más específicas, con menos efectos secundarios que las modalidades de tratamiento actuales (Meng et al. 2012 supra). Cuando se comparan con un tratamiento convencional, que es en gran parte un procedimiento pasivo, los sistemas de administración dirigidos son mucho más eficaces. Para que un aptámero sea un agente eficaz de administración de fármacos, el aptámero debe unirse a su diana en la superficie celular y ser internalizado en un corto periodo de tiempo. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de aptámeros con características de unión y penetración tumoral mejoradas.

Compendio

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Recientemente se ha apreciado que las células madre cancerosas son responsables de la formación y el crecimiento de tejido neoplásico y son naturalmente resistentes a la quimioterapia, lo que explica por qué las quimioterapias tradicionales pueden reducir inicialmente un tumor pero no erradicarlo por completo, lo que da lugar a una recidiva eventual. De acuerdo con la hipótesis de las células madre cancerosas, las células positivas para CD133 (CD 133+) determinan el crecimiento tumoral a largo plazo y, por lo tanto, se sospecha que influyen en el resultado clínico. Recientemente se ha descubierto que tanto la proporción de células positivas para CD133 como su organización topológica en grupos, eran factores de pronóstico significativos para una supervivencia sin progresión adversa y una supervivencia general, independientemente del grado del tumor, el grado de resección o la edad del paciente.

Las técnicas actuales para el direccionamiento hacia células madre cancerosas positivas para CD133, utilizan sistemas convencionales basados en anticuerpos, pero carecen de sensibilidad debido al tamaño de los anticuerpos anti-CD133 disponibles y su relativa incapacidad para penetrar en los tejidos.

Por consiguiente, la generación de aptámeros para células CD133+ sería ventajosa en la erradicación del cáncer. Esto ha sido abordado por el presente inventor que ha generado aptámeros específicos para CD133 que se internalizan rápidamente y muestran una penetración tumoral superior. En particular, los aptámeros de la presente descripción son agentes teranósticos particularmente eficaces.

La presente descripción proporciona un aptámero que se une específicamente a CD133. En un ejemplo, el aptámero es un oligonucleótido. En un ejemplo, el oligonucleótido puede ser ARN, ADN o un aptámero híbrido de ARN/ADN y/o puede comprender nucleótidos distintos de adenina, citosina, guanina, timina y uracilo.

La presente descripción también proporciona un aptámero que comprende la secuencia 5'- X -ACGUAUACUAU- Y -3' (SEQ ID NO: 1), en donde las secuencias de X e Y son complementarias para poder aparear las bases y en donde X e Y comprenden individualmente una longitud de nucleótidos CG apareados que es suficiente para permitir la fijación de al menos un resto a los mismos.

Según el aptámero de la presente descripción, X e Y pueden comprender individualmente al menos 4 nucleótidos CG apareados (4 pares de CG). En otro ejemplo, X e Y pueden comprender individualmente al menos 5 nucleótidos CG apareados, o al menos 6 nucleótidos CG apareados, o al menos 7 nucleótidos CG apareados, o al menos 8 nucleótidos CG apareados, o al menos 9 nucleótidos CG apareados, o al menos 10 nucleótidos CG apareados, o al menos 11 nucleótidos CG apareados, o al menos 12 nucleótidos CG apareados, o al menos 13 nucleótidos CG apareados, o al menos 14 nucleótidos CG apareados, o al menos 15 nucleótidos CG apareados.

En otro ejemplo, el aptámero puede comprender entre 4 y 15 nucleótidos CG apareados (4-15 pares de CG). En otro ejemplo, el aptámero puede comprender entre 2 y 12 nucleótidos CG apareados. En otro ejemplo, el aptámero puede comprender entre 2 y 10 nucleótidos apareados, entre 2 y 8 nucleótidos apareados o entre 2 y 6 nucleótidos apareados.

Los expertos en la técnica apreciarán que los nucleótidos CG apareados comprenden la región del tallo del aptámero.

En un ejemplo, el aptámero muestra una constante de disociación en equilibrio (K^d ) para CD133 de aproximadamente 24 nM o menos. En otro ejemplo, el aptámero muestra una constante de disociación (K^d ) para CD133 de aproximadamente 24 nM. En otro ejemplo, el aptámero muestra una constante de disociación (K^d ) para CD133 de 24 nM. En otro ejemplo, la constante de disociación se determina midiendo la unión del aptámero a CD133 expresada en células HT29.

En un ejemplo, el aptámero es un híbrido de ARN/ADN. En otro ejemplo, el aptámero es un aptámero aislado. En otro ejemplo, el aptámero se sintetiza de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, SELEX).

En un ejemplo, el aptámero de acuerdo con la presente descripción se une específicamente a CD133. En otro ejemplo, el aptámero de acuerdo con la presente descripción se une selectivamente a CD133.

En un ejemplo, el aptámero comprende la secuencia 5' - CGCGCGCCGCACGUAUACUAUGCGGCGCGCG- 3' (SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el aptámero comprende la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia comprende 10 nucleótidos g C apareados que son ADN. En todavía un ejemplo adicional, el aptámero comprende la secuencia 5' -ACGUAUACUAU- 3' (SEQ ID NO: 3) que es ARN. En otro ejemplo adicional, el aptámero comprende la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 3, en donde SEQ ID NO: 3 es ARN y la secuencia restante es ADN. En un ejemplo, la región del tallo es la de la estructura bidimensional prevista del aptámero que se muestra en la Figura 1.

En un ejemplo, el aptámero consiste esencialmente en la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2. El aptámero puede consistir alternativamente en la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2. El aptámero de acuerdo con la presente descripción o de acuerdo con SEQ ID NO: 2, puede incluir secuencias adicionales. El aptámero de acuerdo con la presente descripción puede comprender una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 2, o al menos un 90% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 85% de identidad, al menos un 80% de identidad, al menos un 75% de identidad, o al menos un 70% de identidad.

En un ejemplo, la fijación del resto se realiza mediante intercalación. En otro ejemplo, la fijación es mediante conjugación. En otro ejemplo, la fijación se realiza mediante unión electrostática. En otro ejemplo, la fijación es a través de un enlazador.

El resto de acuerdo con la presente descripción puede ser un colorante de ADN o una molécula usada en el tratamiento quimioterapéutico o una molécula que es capaz de realizar ambas funciones. Ejemplos de moléculas adecuadas que son capaces de intercalarse en el aptámero de acuerdo con la presente descripción, se pueden seleccionar a partir de doxorrubicina, adriamicina, berberina, provflavina, mitoxantrona, daunorrubicina, talidomida, dactinomicina, danomicina, actinomicina D, 9-aminoacridina, amrubicina, amsacrina, antramicina, berbina, bleomicina, eliplicina, epirrubicina, idarrubicina, metpirilo, mitramicina, mitomicina, mitomicina C, mitoxantrona, mitoxantrona, pirarrubicina, pixantrona, plicamicina, proflavina, prodigiosina, talidomida, voreloxina, valrubicina, zorrubicina. clorfeniramina, prodisiosina, metapirilino, mitomicina, distamicina, dantinomicina, distamicina, carboplatino, cisplatino y otros derivados del platino, Hoechst 33258, berenilo, DAPI o agentes carcinogénicos (que incluyen el epóxido exo 8,9 de aflatoxina B1, acridinas tales como proflavina o quinacrina o bromuro de etidio). Otros agentes que se intercalan entre GC serán conocidos para los expertos en la técnica de la presente descripción y se entiende que están incluidos dentro del alcance de la presente descripción. En un ejemplo preferido, la molécula es doxorrubicina (DOX).

Las secuencias de X e Y son capaces de formar un par de bases proporcionando de este modo la región del tallo del aptámero. Sin desear estar ligado a una teoría, el resto es capaz preferiblemente de fijarse al aptámero de la presente descripción, intercalándose entre sitios CpG en las secuencias de ADN de X e Y con bases apareadas. Con respecto a DOX, como promedio hay aproximadamente 2,5 moléculas de DOX por cada sitio CpG o dicho de otra manera, aproximadamente 2,5 moléculas de DOX son capaces de intercalarse en la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2.

La longitud total del aptámero puede estar entre 19 y 101 nucleótidos, entre 21 y 85 nucleótidos, entre 25 y 75 nucleótidos, entre 31 y 65 nucleótidos, entre 41 y 55 nucleótidos o entre 31 y 41 nucleótidos. Los expertos en la técnica apreciarán que, si bien la presente descripción describe aptámeros que comprenden al menos 15 nucleótidos CG apareados, la secuencia del tallo restante puede comprender una secuencia de ARN o ADN distinta de nucleótidos CG apareados de forma alterna.

El aptámero de la presente descripción puede comprender además una o varias sustituciones de nucleótidos dentro de la secuencia que mantiene el bucle de unión del aptámero. En un ejemplo, la secuencia comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones dentro de la región del tallo del aptámero descrito en esta memoria o dentro de la secuencia del aptámero de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Se apreciará que el número de sustituciones dependerá de la longitud del aptámero y se tolerará en la medida en que el aptámero todavía sea capaz de permitir la fijación de una molécula tal como doxorrubicina.

En un ejemplo, el aptámero comprende además una o varias modificaciones que mejoran la estabilidad del aptámero (in vitro y/o in vivo). En un ejemplo, las bases de nucleótidos de pirimidina (C y/o U) en la región del bucle están modificadas con 2'-fluoro (2'-F). Para evitar dudas, la región del bucle es la secuencia 5' -ACGUAUACUAU- 3' (SEQ ID NO: 3). En un ejemplo adicional, la base C en la región del tallo del aptámero (desoxicitidina, dC) se modifica a una 5-metil desoxicitidina (5-metil dC). Cuando una dC se sustituye por una 5-metil dC, la Tm del aptámero puede aumentar hasta 0,5°C por inserción. Sin desear estar ligado a una teoría, la presencia de 5-metil dC en los motivos CpG puede prevenir o limitar respuestas inmunes injustificadas que de otro modo ocurrirían cuando se administran oligonucleótidos in vivo, lo que es de particular importancia para los diagnósticos y agentes terapéuticos in vivo. En otro ejemplo, el extremo 3' del aptámero se puede modificar para protegerlo de la digestión con nucleasas. En otro ejemplo, el aptámero se modifica modificando el extremo 3' con un grupo fosfato, un éster fosfato o una dT invertida (invdT-3'). En otro ejemplo, el extremo 5' se puede acoplar a un colorante tal como biotina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), cianina (Cy3 o Cy5). Unas modificaciones adicionales resultarán familiares para los expertos en la técnica y se considera que están incluidas en la presente descripción.

En un ejemplo, la presente descripción proporciona un aptámero híbrido de ARN/ADN que comprende la secuencia 5' - X - A(2'fC)G(2'-fU)A(2'fU)A(2'fC)(2'fU)A(2'fU)- Y-(inv dT) -3' (SEQ ID NO: 4), en donde X e Y son complementarios para poder aparear los pares de bases y en donde X e Y comprenden individualmente una longitud de nucleótidos CG apareados, f = 2'-fluoro e inv dT = una dT invertida (enlace inverso) y en donde la longitud de X e Y es suficiente para permitir la fijación de al menos un resto a las mismas. En un ejemplo particular, X e Y son ADN.

En un ejemplo, la presente descripción proporciona un aptámero híbrido de ARN/ADN que comprende la secuencia 5' -mCGmCGmCGmCmCGmCA(2'fC)G(2'-fU)A(2'fU)A(2'fC)(2'fU)A(2'fU)GmCGGmCGmCGmCG-(inv dT)- 3' (SEQ ID NO: 5), en donde C = 5-metil dC, f = 2'-fluoro e inv dT = una dT invertida (enlace inverso). Según este ejemplo, el aptámero comprende una G 3' terminal que está invertida.

En otro ejemplo, el aptámero híbrido de ARN/ADN consiste esencialmente en la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otro ejemplo, el aptámero híbrido de ARN/ADN consiste en la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

El aptámero de acuerdo con la presente descripción puede comprender una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 4 o 5, o al menos un 90% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 85% de identidad, al menos un 80% de identidad, al menos un 75% de identidad o al menos un 70% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 4 o 5.

El aptámero puede comprender además un colorante 3' o 5' tal como Cy3 o Cy5.

Se conocen en la técnica métodos para preparar bases de ARN modificadas con 2'-fluoro. En un ejemplo, las bases modificadas con 2'-fluoro se incorporan directamente durante la síntesis de un transcrito de ARN.

La presente descripción también proporciona un aptámero que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a CD133 que la de un aptámero que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En un ejemplo, el aptámero de acuerdo con la presente descripción se une específicamente a célula(s) CD133+. En otro ejemplo, el aptámero de acuerdo con la presente descripción se une selectivamente a célula(s) CD133+. La o las células CD133+ pueden ser células madre. La célula madre puede ser una célula madre purificada o aislada y, en un ejemplo, puede ser una célula madre cancerosa. En un ejemplo, la o las células madre cancerosas se caracterizan porque (i) expresan CD133, (ii) son tumorigénicas, (iii) son capaces de autorrenovarse, (iv) son capaces de diferenciarse y (v) son resistentes a la apoptosis con una terapia convencional.

Las células madre cancerosas se pueden describir alternativamente como aisladas, enriquecidas o purificadas a partir de una fuente, tal como una muestra biológica. En otro ejemplo, la o las células madre cancerosas representan una población de células enriquecidas basándose en la expresión de CD133+. En otro ejemplo, la población de células comprende al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de células madre cancerosas.

En un ejemplo, las células que expresan CD133 y/o las células madre cancerosas están in vivo. En otro ejemplo, las células que expresan CD133 y/o las células madre cancerosas están in vitro. En un ejemplo adicional, las células que expresan C133 y/o las células madre cancerosas están presentes en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto. La unión del aptámero se puede detectar de cualquier manera conveniente, por ejemplo, detectando un marcador asociado con el aptámero, mediante la formación de imágenes del aptámero o determinando la cantidad de aptámero unido. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en el documento WO 2004/081574.

En otro ejemplo, las células que expresan CD133 y/o las células madre cancerosas de la presente descripción pueden expresar uno o varios marcadores seleccionados individual o colectivamente a partir del grupo que consiste en CD44, ABCG2, p-catenina, CD117, ALDH, VLA-2, CD166, CD201, IGFR, EpCAM y EGF1R.

Por "individualmente" se entiende que la descripción incluye los marcadores o grupos de marcadores enumerados por separado, y que, a pesar de que los marcadores individuales o grupos de marcadores no se pueden indicar de forma separada en esta memoria, las reivindicaciones adjuntas pueden definir ese marcador o grupos de marcadores de forma independiente y divisible entre sí.

Por "colectivamente" se entiende que la descripción incluye cualquier cantidad o combinación de los marcadores o grupos de péptidos enumerados y que, a pesar de que tales cantidades o combinaciones de marcadores o grupos de marcadores pueden no estar indicadas específicamente en esta memoria, las reivindicaciones adjuntas pueden definir esas combinaciones o subcombinaciones de forma independiente y divisible de cualquier otra combinación de marcadores o grupos de marcadores.

En otro ejemplo, la célula madre cancerosa de acuerdo con la presente descripción es una célula madre de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de cerebro metastásica, una célula madre de cáncer de mama, una célula madre de cáncer de próstata, una célula madre de cáncer de páncreas, una célula madre de cáncer de colon, una célula madre de cáncer de hígado, una célula madre de cáncer de pulmón, una célula madre de cáncer de ovario, una célula madre de cáncer de piel o una célula madre de melanoma.

El aptámero de la presente descripción se puede usar en un tratamiento o diagnóstico. Además, debido a que DOX es fluorescente de forma natural, se puede usar simultáneamente para terapia y diagnóstico (es decir, como teranóstico).

La presente descripción también proporciona un agente de diagnóstico o teranóstico que comprende un aptámero de acuerdo con la presente descripción. En un ejemplo, el aptámero es el aptámero de acuerdo con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otro ejemplo, el agente de diagnóstico comprende el aptámero de la presente descripción acoplado a un marcador detectable. En un ejemplo, el agente de diagnóstico se usa para detectar células madre cancerosas que expresan CD133 in vivo o in vitro. En un ejemplo, el agente teranóstico es un conjugado de aptámero-Dox.

La presente descripción también proporciona un método para identificar o detectar una célula o células que expresan CD133 y/o una célula o células madre cancerosas en un sujeto o una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene cáncer, en donde el método comprende poner en contacto la o las células con un agente de diagnóstico o un agente teranóstico tal y como se describe en esta memoria.

En un ejemplo, el agente diagnóstico o teranóstico de la presente descripción se puede usar para detectar la presencia de células que expresan CD133 y/o células madre cancerosas en un sujeto o en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que tiene un tumor o se sospecha que tiene un tumor. Si es necesario, la detección se puede facilitar acoplando el aptámero con un marcador detectable. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, marcadores densos en electrones, marcadores para RMI y materiales radiactivos.

La presente descripción también proporciona el aptámero tal y como se describe en esta memoria o el agente de diagnóstico tal y como se describe en esta memoria, para uso en un examen histológico de muestras biológicas. Los métodos para preparar muestras histológicas serán conocidos por los expertos en la técnica.

El aptámero de la presente descripción se puede acoplar además a un resto que puede ser un resto activo. El resto puede ser un ligando, tal como un aptámero adicional o un ligando alternativo. El resto puede ser una inmunoglobulina, un fragmento o una porción de una inmunoglobulina, un agente terapéutico, otro fármaco o un agente bioactivo, una toxina o un radionucleido. Alternativamente, el resto puede incluir ARNip, ADNzimas o ribozimas. También se incluyen en la presente descripción combinaciones de cualquiera de los restos anteriores.

La presente descripción también proporciona un vector de expresión que codifica el aptámero tal y como se describe en esta memoria. También se proporcionan secuencias de nucleótidos complementarias a una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5, en particular complementarias a una cualquiera de Se Q ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5.

La presente descripción también proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende proporcionar a un sujeto el aptámero o el agente teranóstico tal y como se describe en esta memoria. El sujeto que está siendo tratado normalmente es uno que se beneficiará del tratamiento con el aptámero o el agente teranóstico de la presente descripción. En un ejemplo, al sujeto se le diagnostica cáncer. Alternativamente, el sujeto es uno del que se sospecha que tiene cáncer, en cuyo caso puede ser apropiado administrar el agente teranóstico al sujeto. El aptámero de la presente descripción que está acoplado con un resto tal y como se describe en esta memoria, o el agente teranóstico tal y como se describe en esta memoria, se puede administrar al sujeto durante un período de semanas, meses o años para controlar y/o tratar al sujeto.

El sujeto de acuerdo con la presente descripción puede ser uno que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer seleccionado a partir de cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de piel, melanoma o cualquier otro cáncer en el que estén presentes células CD133+. En un ejemplo, el cáncer es cualquier cáncer en el que están presentes o se sospecha que están presentes células que expresan CD133 y/o células madre cancerosas.

La presente descripción también proporciona el uso de un aptámero tal y como se describe en esta memoria, en la producción de un reactivo de diagnóstico para la detección o el diagnóstico de cáncer.

La presente descripción también proporciona el uso de un aptámero de acuerdo con la presente descripción o el agente teranóstico de acuerdo con la presente descripción, en la producción de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto.

La presente descripción también proporciona el uso en medicina de un aptámero de acuerdo con la presente descripción o el agente teranóstico de acuerdo con la presente descripción.

La presente descripción también proporciona el uso de un aptámero de acuerdo con la presente descripción o el agente teranóstico de acuerdo con la presente descripción, para tratar el cáncer en un sujeto.

La presente descripción también proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero, o un agente teranóstico de acuerdo con la presente descripción, junto con un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, la composición es una composición farmacéutica.

El aptámero, el agente teranóstico o la composición tal y como se describen en esta memoria, se pueden usar solos o en combinación con otras modalidades de tratamiento. Por ejemplo, el aptámero o la composición farmacéutica se pueden utilizar en combinación con radioterapia u otros agentes quimioterapéuticos. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se postula que los agentes radioterapéuticos y/o quimioterapéuticos se pueden usar para reducir tumores, dirigiéndose principalmente a células que se dividen rápidamente que son típicamente las células de la progenie de las células madre cancerosas. El aptámero, el agente teranóstico o la composición descritos en esta memoria se pueden administrar después en el sitio del tumor para agotar específicamente las células madre cancerosas. Por consiguiente, el aptámero, el agente teranóstico o la composición descritos en esta memoria se puede usar junto con una radioterapia o quimioterapia o después de un tratamiento de quimioterapia o radioterapia. Además, el aptámero, el agente teranóstico o la composición descritos en esta memoria se pueden usar después de una resección quirúrgica del tumor para eliminar cualquier célula cancerosa remanente que pueda haber quedado después de la cirugía.

En otro ejemplo, el aptámero se proporciona en la superficie de un liposoma. El liposoma puede contener un fármaco. Ejemplos de fármacos adecuados incluyen agentes quimioterapéuticos, inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1), antibióticos, inmunoglobulinas o anticuerpos, esteroides o analgésicos.

El aptámero o la composición que comprende el aptámero se puede administrar al sujeto mediante métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, el aptámero o la composición se administra por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular, hipodérmica o local.

También se contempla que el aptámero, el agente teranóstico o la composición descritos en esta memoria se puedan combinar con uno o varios aptámeros adicionales que se dirigen a un antígeno presente en una célula madre cancerosa.

Cada ejemplo de la descripción se tomará para aplicar, con los cambios necesarios, a un método para tratar, prevenir o mejorar el cáncer en un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Diagrama esquemático de una intercalación prevista de DOX en un aptámero para CD133 modificado. (A) La estructura secundaria del aptámero determinada a través del programa informático VIENNA (izquierda) y la estructura molecular de la doxorrubicina (derecha). (B) Representación de una posible intercalación entre el aptámero y DOX debido a la alta afinidad de los fármacos hacia el apareamiento bicatenario de G-C.

Figura 2. Diagrama esquemático de la intercalación prevista de DOX en un aptámero para CD133 híbrido de ARN-ADN. (A) La estructura secundaria del aptámero (izquierda) determinada mediante el programa informático VIENNA y la estructura de la molécula de doxorrubicina (derecha). (B) Representación de la posible intercalación entre el aptámero y DOX debido a la alta afinidad de los fármacos hacia el apareamiento bicatenario de G-C.

Figura 3. Para determinar la relación entre la intensidad de la fluorescencia y la concentración de DOX. Se utilizaron varias concentraciones de DOX para medir la intensidad de la fluorescencia. Los datos mostrados son la media ± EE, n = 3.

Figura 4. Curva de extinción de la fluorescencia después de la intercalación de DOX en el aptámero para CD133. Después de la conjugación, se purificó el conjugado de aptámero-Dox. La fluorescencia de DOX se determinó mediante absorción de UV a una longitud de onda de 495 nm. Los datos mostrados son la media ± EE, n = 3.

Figura 5. Liberación de DOX desde el conjugado durante tres días en PBS. La absorbancia (eje Y) se correlaciona con la intensidad fluorescente de DOX dentro del casete de diálisis. Cuanto mayor es la intensidad, más DOX se libera desde el conjugado. Los datos mostrados son la media ± EE, n = 3.

Figura 6. Determinación de la constante de disociación para conjugados de aptámero para CD133-Dox en células HEK2932 negativas para CD133 y células HT29 positivas para CD133. La unión se estudió usando un aptámero para CD133 y conjugados de aptámero para CD133-Dox marcados con fluorescencia con concentraciones que variaban de 0 a 200 nM. (A) Línea celular HEK293T tratada con conjugado de aptámero para CD133 positivo-Dox, (B) HEK2932 tratada con conjugado de aptámero control negativo-Dox, (C) HT29 tratada con aptámero para CD133 positivo (no conjugado) y (D) células HT29 tratadas con conjugado de aptámero para CD133 positivo-Dox. Los datos mostrados son la media ± EE, n = 3.

Figura 7. Aptámeros para CD133 utilizados para la determinación de la constante de disociación para conjugados de aptámero para CD133-Dox. (A) Conjugado de aptámero para CD133 positivo-Dox, (B) el conjugado de aptámero para CD133 control negativo-Dox tiene una secuencia de ácido nucleico idéntica a la del aptámero positivo con la excepción de una modificación con 2'-O-metilo en lugar de una modificación química con 2'-fluoro lo que da como resultado una estructura tridimensional alterada que impide su unión a CD133, y (C) aptámero para CD133 positivo sin conjugar.

Figura 8. Microscopía confocal de DOX internalizada y aptámero. (A-C) Línea celular HT29 positiva para CD133. (A) Aptámero para CD133. (B) Conjugado de aptámero para CD133-Dox. (C) Conjugado de aptámero control negativo-Dox. (D) Línea celular HEK293T de control negativo incubada con conjugado de aptámero para CD133-Dox. (E) Línea celular HT29 incubada con DOX libre. Barra de escala = 20 pm.

Figura 9. Tratamientos para la evaluación mediante microscopía confocal de la internalización de DOX y el aptámero: (a) aptámero para CD133, (b) conjugado de aptámero para CD133-Dox, y (c) control negativo incubado con DOX libre.

Figura 10. Tamaño de las esferas tumorales. Se tomaron medidas de esferas procedentes de 500 células en placas de 96 pocillos. Las células se acondicionaron en medio de control de esferas, DOX libre y conjugado de aptámero-Dox. Se observó una disminución en el tamaño de las esferas con las tres concentraciones entre control y conjugado (P <0,01). Los datos mostrados son la media ± EE, n = 3.

Figura 11. La formación de esferas se midió por el número de esferas formadas con diferentes concentraciones celulares en diferentes condiciones. Con 1 pM no se mostraban cambios con 50 células, pero con 10 células una clara diferencia en la formación del control y del conjugado (P <0,01). El aumento de la concentración del fármaco convencional y el nuevo da como resultado una mayor inhibición de la formación de esferas entre el control y el conjugado (P <0,001). Este efecto se observó con 50 células cuando la concentración aumentaba a 2 pM (P <0,001). En todos, el conjugado de aptámero para CD133-Dox tiene una diferencia significativa en la inhibición tumoral en comparación con DOX libre (P <0,01).

Figura 12. Visualización de esferas tumorales utilizando una placa de fijación ultrabaja de 6 pocillos.

Leyendas para la lista de secuencias

SEQ ID NO: 1: es la secuencia de nucleótidos central para la región del bucle de un aptámero para CD133 que está flanqueado en los extremos 5' y 3' por una longitud de nucleótidos CG apareados de forma alterna.

SEQ ID NO: 2: es la secuencia de un aptámero para CD133 que se puede conjugar con DOX.

SEQ ID NO: 3: es la secuencia de nucleótidos central para la región del bucle de un aptámero para CD133.

SEQ ID NO: 4: es la secuencia de un aptámero para CD133 híbrido de ARN-ADN flanqueado en 5' y 3' por una longitud de nucleótidos CG de forma alterna y contiene una dT invertida en 3'.

SEQ ID NO: 5: es la secuencia de un aptámero para CD133 híbrido de ARN-ADN.

Descripción detallada

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Técnicas generales y definiciones seleccionadas

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" debe entenderse que significa "X e Y" o "X o Y" y se debe considerar que respalda explícitamente ambos significados o cualquiera de los dos.

Cualquier análisis de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente memoria descriptiva no se debe considerar como una admisión de que cualquiera o todos esos asuntos forman parte de la base de la técnica anterior o eran del conocimiento general común en el campo relevante para la presente descripción, tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, o el contexto lo requiera de otro modo, se debe considerar que la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia, englobarán uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

Cada ejemplo descrito en esta memoria se aplicará mutatis mutandis a todos y a cada uno de los demás ejemplos de la descripción, a menos que se indique específicamente de otro modo.

Los expertos en la técnica apreciarán que la descripción es susceptible a variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la descripción incluye todas esas variaciones y modificaciones. La descripción también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

La presente descripción se realiza sin una experimentación indebida utilizando, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, tecnología de ADN recombinante, biología celular e inmunología. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, segunda edición (1989), la totalidad de los vol. I, II, y III; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I y II (D. N. Glover, compilador, 1985), IRL Press, Oxford, la totalidad del texto; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, compilador, 1984) IRL Press, Oxford, la totalidad del texto, y particularmente los artículos en el mismo de Gait, págs. l-22; Atkinson et al., págs. 35-81; Sproat et al., págs. 83­ 115; y Wu et al., págs. 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, compiladores, 1985) IRL Press, Oxford, la totalidad del texto; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, la totalidad del texto; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, compiladores, Academic Press, lnc.), la totalidad de la serie, Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. compiladores), vol. 2, págs. 1-284, Academic Press, Nueva York. 12. Wunsch, E., compilador (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miiler, E., compilador), vol. 15, 4a ed., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) lnt. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, compiladores, 1986, Blackwell Scientific Publications); y Animal Cell Culture: Practical Approach, tercera edición (John R. W. Masters, compilador, 2000), ISBN 0199637970, la totalidad del texto.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de una etapa o elemento o número entero o grupo de etapas o elementos o números enteros indicados, pero sin la exclusión de ningún otra etapa o elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

La expresión "consiste en" o "que consiste en" debe entenderse que significa que un método, un procedimiento o una composición de materia (por ejemplo, una secuencia de aptámero) tiene las etapas y/o los componentes indicados y no etapas o componentes adicionales.

La expresión "consiste esencialmente en" o "que consiste esencialmente en" en el contexto de una secuencia de ácido nucleico, tal y como se usa en esta memoria, se debe interpretar de manera no exhaustiva y se entiende que significa una secuencia de nucleótidos en la que pueden estar presentes bases de nucleótidos adicionales, en donde dichas bases adicionales constituyen no más de aproximadamente el 10% de la secuencia total de nucleótidos.

El término "aproximadamente", tal y como se usa en esta memoria cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de peso, tiempo, dosis, etc., se entiende que incluye variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente ±5%, incluso más preferiblemente ±1%, y aún más preferiblemente ±0,1% de la cantidad especificada.

El término "aptámero" o "aptámero de oligonucleótidos" tal y como se usa en esta memoria, se refiere en general a un oligonucleótido con una secuencia única definida o una mezcla de dichos oligonucleótidos, en donde la mezcla conserva las propiedades de unión específica a CD133. Tal y como se usa en esta memoria, "aptámero" se refiere a un ácido nucleico monocatenario. Estructuralmente, los aptámeros de la presente descripción se unen específicamente a oligonucleótidos. Los aptámeros pueden comprender ARN, ^{a D n} o tanto ARN como ADN. El aptámero se puede producir sintéticamente usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, el aptámero se puede producir de forma recombinante.

El término "oligonucleótido", tal y como se usa en esta memoria, es genérico para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2'-desoxi-D-ribosa o formas modificadas de la misma), es decir, ADN, para polirribonucleótidos (que contienen D ribosa o formas modificadas de la misma), es decir, ARN, y para cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N-glicósido o C-glicósido de una base púrica o pirimidínica, o una base púrica o pirimidínica modificada o nucleótidos abásicos. De acuerdo con la presente descripción, el término "oligonucleótido" incluye no solo aquellos con bases convencionales, residuos de azúcar y enlaces internucleotídicos, sino también aquellos que contienen modificaciones de cualquiera o de todos estos tres restos.

Se entiende que la expresión "nucleótidos CG apareados", tal y como se usa en esta memoria, se refiere al apareamiento de bases de nucleótidos C y G complementarias cuando están presentes en una configuración bicatenaria. Por ejemplo, un solo nucleótido CG apareado correspondería a una C en una base de una hebra apareada con una G en la hebra complementaria. Cuatro nucleótidos CG apareados se refiere a una configuración en la que CGCG o GCGC está presente en una secuencia lineal en una hebra y tienen un apareamiento de bases con la secuencia complementaria GCGC o CGCG en la hebra complementaria.

La expresión "sitio CpG", tal y como se usa en esta memoria, se entiende que se refiere a una región de ADN en la que un nucleótido de citosina aparece junto a un nucleótido de guanina en la secuencia lineal de bases a lo largo de su longitud. El término CpG es la abreviatura de C-fosfato-G, es decir, citosina y guanina separados por un solo fosfato. La abreviatura CpG se usa para distinguir la secuencia lineal del apareamiento de bases ^{C g} de citosina y guanina.

La expresión "aptámero híbrido de ARN-ADN", tal y como se usa en esta memoria, es un aptámero que comprende unidades de ribonucleósido y unidades o bases de desoxirribonucleósido.

El término "pirimidina", tal y como se usa en esta memoria, se refiere a bases de citosina (C), timina (T) o uracilo (U). La timina (T) se encuentra generalmente en el ADN, pero puede aparecer en el ARN. La citosina se encuentra tanto en el ARN como en el ADN y el uracilo generalmente se encuentra en el ARN, pero puede aparecer en el ADN.

Tal y como se usa en esta memoria, la expresión "afinidad de la unión" se entiende que hace referencia a la tendencia de un aptámero para unirse o no a una diana y describe la medida de la fuerza de la unión o de la afinidad del aptámero para unirse con la diana. Las energías de dichas interacciones son significativas en la "afinidad de la unión" porque definen las concentraciones necesarias de los ligandos que interaccionan, las tasas con las que esos ligandos son capaces de asociarse y las concentraciones relativas de moléculas unidas y libres en una solución. Las energías se caracterizan en esta memoria, entre otras formas, mediante la determinación de una constante de disociación, Kd. Como se conoce en la técnica, una constante de disociación baja indica una unión y afinidad más fuertes de las moléculas entre sí.

Tal y como se usa en esta memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a una célula o una población de células o una cantidad de tejido o fluido de un sujeto. Muy a menudo, la muestra se ha extraído de un sujeto, pero la expresión "muestra biológica" también se puede referir a células o tejido analizados in vivo, es decir, sin extraer del sujeto. A menudo, una "muestra biológica" contendrá células del sujeto. En la presente descripción, la "muestra biológica" incluirá células que expresan CD133. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, biopsias de tejido, biopsias con aguja, raspaduras (p. ej., raspaduras bucales), sangre total, plasma, suero, linfa, médula ósea, orina, saliva, esputo, cultivo celular, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido ascítico o líquido cefalorraquídeo. Las muestras biológicas también incluyen biopsias de tejidos y cultivos celulares. Una muestra biológica o una muestra de tejido se puede referir a una muestra de tejido o un líquido aislado de un individuo, que incluye, entre otros, sangre, plasma, suero, biopsia de tumor, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células (incluyendo, pero no limitadas a, células sanguíneas), tumores, órganos y también muestras de un constituyente de un cultivo celular in vitro. En algunas realizaciones de la presente descripción, la muestra proviene de una resección, biopsia broncoscópica o biopsia con aguja gruesa de un tumor primario o metastásico, o un bloque de células del líquido pleural. Además, se pueden utilizar muestras de aspiración con aguja fina. Las muestras pueden ser tejido congelado o embebido en parafina. La muestra se puede obtener extrayendo una muestra de células de un sujeto.

La expresión "suficiente para permitir la fijación de al menos un resto al mismo" debe recibir una interpretación amplia. La expresión incluye una fijación o conexión directa o una fijación o conexión no directa (por ejemplo, enlace covalente o interacción electrostática), o una inclusión o inserción reversible (por ejemplo, intercalación). En otro ejemplo, la fijación se realiza mediante conjugación o mediante el uso de un enlazador.

La expresión "acoplado con" tal y como se usa en esta memoria, se entiende que incluye cualquier construcción en donde el aptámero está enlazado, fijado o unido a un agente terminal 3' o 5', tal y como se describe en esta memoria (por ejemplo, invdT) o a un resto tal y como se describe en esta memoria.

Se entiende que la expresión "que tiene sustancialmente la misma capacidad" significa un aptámero que es capaz de inhibir competitivamente la unión del aptámero de la presente descripción a un epítopo sobre CD133. Los métodos para determinar si un aptámero es capaz de inhibir competitivamente la unión a CD133 del aptámero de la presente descripción, pueden implicar ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica.

El término "aislado" tal y como se usa en esta memoria, se entiende que hace referencia al aptámero purificado a partir de otros componentes o productos químicos que pueden estar presentes durante el proceso de generación y purificación del aptámero (por ejemplo, usando el método SELEX). En el contexto de las células, el término también se refiere a células que se pueden aislar o purificar a partir de otros componentes en el entorno en el que puede ocurrir de forma natural. La célula aislada se puede purificar hasta cualquier grado con respecto a su estado obtenible de forma natural.

La expresión "fragmento de una inmunoglobulina" se puede usar indistintamente con "fragmento que se une a antígeno" y se entiende que se refiere a una o varias regiones variables de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Tal y como se usa en esta memoria, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" debe entenderse como una cantidad suficiente de aptámero o de composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción, para reducir el número de células madre cancerosas que expresan CD133 y/o uno o varios síntomas de cáncer. El experto en la materia sabrá que esa cantidad variará dependiendo, por ejemplo, del sujeto particular y/o del tipo o la gravedad o el nivel de enfermedad. No se debe interpretar que la expresión limita la presente descripción a una cantidad específica de aptámero.

Tal y como se usa en esta memoria, el término "tratar" o "tratamiento" o "tratando" se entenderá que significa administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de aptámero o de composición farmacéutica tal y como se describe en esta memoria, y reducir al menos un síntoma de una afección clínica asociada o causada por el cáncer.

Tal y como se usa en esta memoria, la expresión "se une específicamente" debe entenderse en el sentido de que el aptámero reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia en particular, que con células o sustancias alternativas. Por ejemplo, un aptámero que se une específicamente a una proteína diana, se une a esa proteína o a un epítopo o fragmento inmunogénico de la misma con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que como se une a proteínas no relacionadas y/o epítopos o fragmentos inmunogénicos de las mismas. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un aptámero que se une específicamente a una primera diana, se puede unir o no específicamente a una segunda diana. Como tal, una "unión específica" no requiere necesariamente una unión exclusiva o una unión no detectable de otra diana, esto está incluido por la expresión "unión selectiva". Generalmente, pero no de forma necesaria, la referencia a unión significa unión específica. La especificidad de la unión se define en términos de las constantes de disociación comparativa (Kd) del aptámero para la diana, en comparación con la constante de disociación con respecto al aptámero y otros materiales en el entorno o con moléculas no relacionadas en general. Normalmente, la Kd para el aptámero con respecto a la diana será 2, 5 o 10 veces menor que la Kd con respecto a la diana y el material no relacionado o el material acompañante en el entorno. Incluso más preferiblemente, la Kd será 50 veces, 100 veces o 200 veces menor.

La expresión "unión selectiva" debe entenderse como unión exclusiva o unión no detectable del aptámero con un marcador o un antígeno expresado sobre una célula, en donde el marcador o el antígeno es distinto de CD133.

El término "CD133+" o "célula que expresa CD133" tal y como se usa en esta memoria, se puede usar indistintamente. El término incluye la expresión en la superficie celular del antígeno CD133 que se puede detectar a través de cualquier medio adecuado. En un ejemplo, la referencia a una célula que es positiva para un marcador dado, significa que puede expresar de forma baja (baja o tenue) o de forma elevada (brillante, bri) ese marcador, dependiendo del grado en el que el marcador está presente en la superficie celular, cuando los términos se refieren a la intensidad de la fluorescencia.

Tal y como se usa en esta memoria, el término "teranóstico" o "agente teranóstico" se entiende que significa un aptámero que incorpora funcionalidades tanto de diagnóstico como terapéuticas. Esas entidades se pueden usar para una administración y liberación simultánea de fármacos dirigidos y para diagnóstico, incluyendo una monitorización de la progresión de la enfermedad y la respuesta a una terapia. Más particularmente, el agente teranóstico de acuerdo con la presente descripción, es uno en el que una molécula quimioterapéutica, p. ej., doxorrubicina, se conjuga con el aptámero para formar un conjugado de aptámero-Dox. Se entiende que la expresión "conjugado de aptámero-Dox" se refiere a un aptámero para CD133 de la presente descripción en el que una o varias moléculas de doxorrubicina están intercaladas en la secuencia del tallo del aptámero, como se muestra en la Figura 1.

Tal y como se emplea en esta memoria, el término "sujeto" debe entenderse como cualquier sujeto, incluido un sujeto humano o no humano. El sujeto no humano puede incluir primates no humanos, ungulados (bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, equinos, búfalos y bisontes), caninos, felinos, lagomorfos (conejos, liebres y liebres silvadoras), roedores (ratones, ratas, cobayas, hámster y jerbo), aves y peces. En un ejemplo, el sujeto es un ser humano.

Aptámeros

Varias propiedades únicas de los aptámeros los convierten en herramientas atractivas para su uso en una amplia gama de aplicaciones en biología molecular y como posibles agentes farmacéuticos. En primer lugar, la mayoría de los aptámeros se unen a dianas con alta afinidad, demostrando constantes de disociación típicas en el intervalo de pico a nanomolar. Los sitios de unión para los aptámeros incluyen hendiduras y surcos de moléculas diana, lo que da lugar a una actividad antagonista muy similar a muchos agentes farmacéuticos actualmente disponibles. En segundo lugar, los aptámeros son estructuralmente estables en un amplio intervalo de temperaturas y condiciones de almacenamiento, conservando la capacidad de formar sus estructuras terciarias únicas. En tercer lugar, los aptámeros se pueden sintetizar químicamente, en contraste con los sistemas biológicos costosos y laboriosos que son necesarios para producir anticuerpos monoclonales.

Sin desear ceñirse a una teoría, muchos grupos prefieren generalmente los aptámeros de ARN debido a la afinidad teóricamente más alta de los aptámeros de a Rn hacia sus proteínas diana, así como a la mayor estabilidad plasmática del ARN modificado que del ARN no modificado.

En esta memoria se describen moléculas de aptámero que se unen específicamente al antígeno CD133 que se pueden utilizar para una administración intracelular eficaz de agentes, tales como moléculas de quimioterapia para tratar el cáncer. Esas moléculas de aptámero de la presente descripción son particularmente útiles como agentes terapéuticos, de diagnóstico y teranósticos.

Los aptámeros son oligonucleótidos monocatenarios o análogos de oligonucleótidos que se unen a una molécula diana particular, tal como una proteína o una molécula pequeña. Por tanto, los aptámeros son la analogía oligonucleotídica frente a los anticuerpos. En general, los aptámeros comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos y más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos, ya que los oligonucleótidos de una longitud que está incluida dentro de esos intervalos, se pueden preparar mediante técnicas convencionales.

La unión de un aptámero depende en gran medida de la estructura secundaria formada por el oligonucleótido del aptámero. Se conocen aptámeros tanto de ARN como de ADN monocatenario (o análogos). Véanse, por ejemplo, Burke et al. (1996). J. Mol. Biol. 264:650-666; Ellington y Szostak (1990). Nature 346:818-22; Hirao et al. (1998). Mol Divers. 4:75-89; Jaeger et al. (1998). EMBO Journal 17:4535; Kensch et al. (2000). J. Biol. Chem 275:18271-8; Schneider et al. (1995). Biochemistry 34:9599-9610; y los documentos US 5773598; US6028186; US 6110900; US6127119; y US 6171795

Los aptámeros de la presente descripción incluyen aptámeros híbridos de ARN/ADN en los que la región de unión (es decir, el bucle) del aptámero es ARN y la región del tallo es ADN. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la región del tallo de ADN proporciona sitios para intercalar moléculas tales como la doxorrubicina, debido a la alta afinidad de la molécula hacia el apareamiento CG del ADN bicatenario.

Generación de aptámeros

Diversos métodos para preparar aptámeros de acuerdo con la presente descripción serán conocidos por los expertos en la técnica. Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial, "SELEX™, del inglés Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" es un método para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier diana deseada, tal y como se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 5.475.096 y 5.270.163 y WO9119813.

La tecnología SELEX™ se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos tienen suficiente capacidad para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales, y suficiente versatilidad química disponible dentro de sus monómeros, para actuar como ligandos (es decir, formar parejas de unión específicas) con prácticamente cualquier compuesto químico, ya sea de tamaño grande o pequeño.

El método implica una selección a partir de una mezcla de candidatos y reiteraciones escalonadas de mejora estructural, utilizando el mismo objetivo de selección general, para lograr prácticamente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de la unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que preferiblemente comprende un segmento de secuencia aleatorizada, el método SELEX™ incluye etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a las moléculas diana, disociar las parejas de ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de las parejas de ácido nucleico-diana para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, luego reiterando los etapas de unión, partición, disociación y amplificación a lo largo de tantos ciclos como se desee.

Dentro de una mezcla de ácidos nucleicos que contiene un gran número de posibles secuencias y estructuras, existe una amplia gama de afinidades de unión hacia una diana determinada. Una mezcla de ácidos nucleicos que comprende, por ejemplo, un segmento aleatorizado de 20 nucleótidos, puede tener 420 posibilidades de candidatos. Aquellos que tienen las constantes de afinidad más altas hacia la diana, tienen más probabilidades de unirse a la diana. Después de la partición, la disociación y la amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida en candidatos con mayor afinidad de unión. Rondas adicionales de selección favorecen progresivamente a los mejores ligandos hasta que la mezcla de ácidos nucleicos resultante estará compuesta predominantemente por solo una o unas pocas secuencias. A continuación, estas se pueden clonar, secuenciare y someter a ensayo individualmente para determinar la afinidad de la unión como ligandos puros.

Los ciclos de selección y amplificación se repiten hasta que se alcanza el objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación continúa hasta que no se logra una mejora significativa en la fuerza de la unión al repetir el ciclo. El método se puede emplear para muestrear hasta aproximadamente 1018 especies diferentes de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la mezcla de la prueba incluyen preferiblemente una porción de secuencia aleatorizada, así como secuencias conservadas, necesarias para una amplificación eficaz. Se pueden producir variantes de la secuencia de ácido nucleico de varias formas, incluyendo la síntesis de secuencias de ácido nucleico aleatorizadas y la selección por tamaño a partir de ácidos nucleicos celulares escindidos al azar. La porción de secuencia variable puede contener una secuencia total o parcialmente aleatoria; también puede contener subporciones de una secuencia conservada, incorporadas con una secuencia aleatorizada. Se puede introducir o aumentar una variación de la secuencia en los ácidos nucleicos de la prueba mediante mutagénesis, antes o durante las repeticiones de la selección/amplificación.

Se puede realizar un seguimiento del enriquecimiento de los candidatos a aptámeros durante la selección, usando polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y citometría de flujo, tal y como se describe en Shigdar S et al. (2013) Cancer Letters 330:84-95.

Afinidad de la unión de los aptámeros

La afinidad de la unión describe la medida de la fuerza de la unión o la afinidad de las moléculas entre sí. La afinidad de la unión del aptámero de la presente memoria con respecto a dianas y otras moléculas se define en términos de Kd. La constante de disociación se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica y se puede calcular incluso para mezclas complejas mediante métodos como los que, por ejemplo, se establecen en Caceci, M. et al., Byte (1984) 9:340-362. Ejemplos de medición de las constantes de disociación se describen, por ejemplo, en el documento US 7602495 que describe un análisis por resonancia de plasmón superficial y en los documentos US 6562627 y US 2012/00445849. En otro ejemplo, la Kd se establece usando un ensayo de unión con filtro de nitrocelulosa de doble filtro, tal como el descrito por Wong y Lohman, (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432. Los métodos para determinar la afinidad de la unión de los aptámeros también se describen, por ejemplo, en Stoltenburg R et al. (2005) Anal Bioanal Chem 383:83-91, Tran DT et al. (2010) Molecules 15, 1127-1140, y Cho M et al. (2013) PNAS 110(46):18460-18465.

Sin embargo, se ha observado que para algunos oligonucleótidos pequeños, la determinación directa de la Kd es difícil y puede conducir a resultados engañosamente altos. En esas circunstancias, se puede realizar un ensayo de unión competitiva con la molécula diana u otra sustancia candidata, con respecto a sustancias que se sabe que se unen a la diana o al candidato. El valor de la concentración con la que se produce un 50% de inhibición (Ki) es, en condiciones ideales, equivalente a la Kd. Sin embargo, en ningún caso una Ki será menor que la Kd. Por tanto, la determinación de la Ki, como alternativa, establece un valor máximo para el valor de la Kd. En aquellas circunstancias en las que las dificultades técnicas impiden una medición precisa de la Kd, la medición de la Ki puede sustituirla convenientemente para proporcionar un límite superior para la Kd. También se puede usar un valor de la Ki para confirmar que un aptámero de la presente descripción se une a CD133.

Mejora de la estabilidad de aptámeros

Un problema potencial encontrado en el uso de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos es que los oligonucleótidos en su forma de fosfodiéster se pueden degradar rápidamente en los fluidos corporales a través de enzimas intracelulares y extracelulares, tales como endonucleasas y exonucleasas, antes de que se manifieste el efecto deseado. La presente descripción también incluye análogos tal y como se describen en esta memoria y/o modificaciones adicionales diseñadas para mejorar una o varias características de los aptámeros, tales como la protección frente a una digestión con nucleasas.

Las modificaciones de aptámeros de oligonucleótidos contempladas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando de ácido nucleico en su conjunto.

Las modificaciones para generar aptámeros oligonucleotídicos que son resistentes frente a las nucleasas también pueden incluir uno o varios enlaces internucleotídicos sustitutos, azúcares alterados, bases alteradas o combinaciones de los mismos. Tales modificaciones incluyen modificaciones del azúcar en posición 2', modificaciones de la pirimidina en posición 5, modificaciones de la purina en posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución con 4-tiouridina, sustitución con 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones con fosforotioato o alquilfosfato, metilaciones y combinaciones de apareamientos de bases inusuales tales como las isobases isocitidina e isoguanosina; modificaciones en 3' y 5' tales como protección; conjugación con un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular; conjugación con un compuesto lipofílico; y modificación de la cadena principal de fosfato.

En un ejemplo, el compuesto no inmunogénico de alto peso molecular, conjugado con el aptámero de la presente descripción es polialquilenglicol, preferiblemente polietilenglicol. En un ejemplo, la modificación de la cadena principal comprende la incorporación de uno o varios fosforotioatos en la estructura principal de fosfato. En otro ejemplo, el aptámero de la presente descripción comprende la incorporación de menos de 10, menos de 6 o menos de 3 fosforotioatos en la cadena principal de fosfato.

Cuando sea apropiado, una modificación adicional puede incluir al menos uno de los siguientes, 2'-desoxi, 2'-halo (incluido 2'-fluoro), 2'-amino (preferiblemente no sustituido o mono o disustituido), 2'-mono-, di- o tri-halometilo, 2'-O-alquilo, 2'-O-alquilo sustituido con halo, 2'-alquilo, azido, fosforotioato, sulfhidrilo, metilfosfonato, fluoresceína, rodamina, pireno, biotina, xantina, hipoxantina, 2,6-diamino purina, 2-hidroxi-6-mercaptopurina y bases de pirimidina sustituidas en la posición 6 con azufre o en la posición 5 con grupos halo o alquilo C15, enlazadores abásicos, 3'-desoxi-adenosina, así como otros análogos disponibles de "terminador de cadena" o "no extensible" (en el extremo 3' del ARN), o marcadores tales como 32P, 33P y similares. Todos los anteriores se pueden incorporar en un aptámero usando técnicas de síntesis convencionales descritas en esta memoria.

Utilidad de los aptámeros

Las moléculas de aptámero de la presente descripción se pueden usar como ligandos de afinidad para separar y purificar moléculas diana (por ejemplo, células madre cancerosas portadoras de CD133), como sondas para rastrear, monitorear, detectar y cuantificar moléculas diana (por ejemplo, células madre cancerosas que son portadoras de CD133), o para bloquear, permitir, activar o catalizar reacciones que son fisiológicamente relevantes para lograr un efecto terapéutico. Pueden actuar como agentes farmacéuticos, unirse a una diana específica y dirigir moléculas específicas a un sitio deseado.

Las moléculas de aptámero de la presente descripción se pueden usar en procesos in vitro, por ejemplo, mezclas de purificación por afinidad para purificar moléculas diana (por ejemplo, células madre cancerosas que son portadoras de CD133). Los aptámeros son ideales para separaciones cromatográficas de moléculas diana (p. ej., células madre cancerosas que son portadoras de CD133) de contaminantes y para purificar moléculas diana a partir de cultivos celulares o extractos celulares.

En un ejemplo, las moléculas de aptámero de la presente descripción se pueden usar como un agente de captura para unir o inmovilizar una diana (por ejemplo, células madre cancerosas que son portadoras de CD133) sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede estar compuesto por sustratos que tienen la estructura y composición comúnmente asociadas con filtros, obleas, chips de obleas, membranas y películas delgadas. Sin embargo, se contempla que el soporte sólido puede estar compuesto por sustratos que incluyen, pero no se limitan a resinas, resinas de afinidad, perlas magnéticas o poliméricas, o cualquier reactivo de detección para diagnóstico, para capturar o inmovilizar reactivos para estudios de diagnóstico, detección o cuantitativos.

Los soportes sólidos pueden comprender cualquier material dependiendo del uso deseado, incluyendo pero sin limitarse a, vidrio, superficies metálicas y materiales tales como acero, cerámica o materiales poliméricos tales como polietileno, polipropileno, poliamida y polivinilidenfluoruro, etc. o combinaciones de los mismos.

Antígeno CD133

CD133, originalmente conocido como AC133, es una glicoproteína (también conocida como Prominina 1). Es un miembro de las glicoproteínas transmembranales pentapaso que se localizan específicamente en protuberancias celulares. CD133 se expresa en células madre hematopoyéticas, células progenitoras endoteliales, glioblastoma, células madre neuronales y gliales, tumores cerebrales pediátricos cariados, así como en riñón adulto, glándulas mamarias, tráquea, glándulas salivales, placenta, tracto digestivo, testículos y otros tipos de células.

Unión a células madre cancerosas que expresan CD133

El ejemplo mejor conocido de renovación de células adultas mediante la diferenciación de células madre, es el sistema hematopoyético. Los precursores inmaduros en desarrollo, tales como las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras, responden a señales moleculares para formar gradualmente los diferentes tipos de células sanguíneas y linfoides. Las células madre también se encuentran en otros tejidos, incluidos los tejidos epiteliales y los tejidos mesenquimáticos. Las células madre cancerosas pueden surgir a partir de cualquiera de estos tipos de células, por ejemplo, como resultado de un daño genético en las células madre normales o mediante la proliferación mal regulada de células madre y/o células diferenciadas.

Las células madre cancerosas se pueden obtener a partir de cualquier cáncer que comprenda células madre tumorigénicas, es decir, células que tienen la capacidad de proliferar de forma extensa o indefinidamente y que dan lugar a la mayoría de las células cancerosas. Dentro de un tumor establecido, la mayoría de las células han perdido la capacidad de proliferar de forma extensa y de formar nuevos tumores, y un pequeño subconjunto de células madre cancerosas prolifera para regenerar de este modo las células madre cancerosas y dar lugar a células tumorales que carecen de potencial tumorigénico. Las células madre cancerosas se pueden dividir de forma asimétrica y simétrica y pueden mostrar tasas variables de proliferación. Una célula madre cancerosa puede incluir células amplificadoras en tránsito o células progenitoras que han vuelto a adquirir propiedades de células madre.

Los cánceres representativos a partir de los cuales se pueden aislar células madre incluyen cánceres caracterizados por tumores sólidos, que incluyen, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, sinovioma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma bronquiogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

Los cánceres representativos adicionales a partir de los que se pueden aislar o enriquecer las células madre de acuerdo con la presente descripción, incluyen neoplasias malignas hematopoyéticas, tales como linfomas de linfocitos B y leucemias, que incluyen linfoma no Hodgkin (LNH) de grado bajo/folicular, LNH linfocítico pequeño (SL), LNH de grado intermedio/folicular, LNH difuso de grado intermedio, LNH inmunoblástico de grado alto, LNH de células pequeñas no escindidas de grado alto, LNH de enfermedad voluminosa y macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia leucocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia monocítica, leucemia mielógena y leucemia promielocítica.

Las células madre cancerosas que son portadoras de CD133 se pueden seleccionar usando las moléculas de aptámero tal y como se describe en esta memoria. Por ejemplo, los aptámeros que se acoplan a colorantes fluorescentes se pueden usar para la selección positiva de células madre cancerosas. También se sabe que CD133 se expresa en algunas células normales. Sin embargo, se cree que la expresión de CD133 está regulada al alza en las células madre cancerosas. Los marcadores de células madre cancerosas se expresan típicamente a un nivel que es al menos aproximadamente 5 veces mayor que el de las células diferenciadas del mismo origen o de las células no tumorigénicas, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 veces mayor, o al menos aproximadamente 15 veces mayor, o al menos aproximadamente 20 veces mayor, o al menos aproximadamente 50 veces mayor, o al menos aproximadamente 100 veces mayor. El procedimiento de selección también puede incluir marcadores de selección negativos que se pueden usar para la eliminación de aquellas células cancerosas en la población que no son células madre cancerosas.

Se entenderá que al realizar la presente descripción, la separación de células que son portadoras de CD133 se puede efectuar mediante una diversidad de métodos diferentes. Por ejemplo, el aptámero de la presente descripción se puede fijar a un soporte sólido para permitir una separación sin purificación. Se pueden emplear varias técnicas con diferente eficacia, dependiendo de la eficacia de la separación, la citotoxicidad asociada, la facilidad y la tasa de ejecución y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidad técnica. Los procedimientos para el aislamiento o la purificación pueden incluir, pero no se limitan a, separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas de aptámero, cromatografía de afinidad y "cribado" con aptámero fijado a una matriz sólida. Las técnicas que proporcionan un aislamiento o purificación precisos incluyen, pero no se limitan a, FACS. Los métodos para preparar FACS serán evidentes para el experto en la técnica.

Enriquecimiento de células madre cancerosas que expresan CD133

Los aptámeros de la presente descripción se pueden usar para enriquecer células madre cancerosas procedentes de una muestra biológica obtenida de un sujeto. Normalmente, el sujeto será uno que tiene un tumor o se sospeche que tiene un tumor que contiene células madre cancerosas. El término "enriquecido" o "enriquecimiento" o variaciones del mismo se utilizan en esta memoria para describir una población de células en la que la proporción de un tipo de célula particular (es decir, células madre cancerosas) se incrementa en comparación con una población de células no tratada (p. ej., las células en la muestra).

En un ejemplo, una población enriquecida en células madre cancerosas comprende al menos aproximadamente 0,1% o 0,5% o 1% o 2% o 5% o 10% o 15% o 20% o 25% o 30% o 50% o 75% o 80% o 85% o 90% o 95% de células madre cancerosas portadoras (positivas) de CD133. A este respecto, la expresión "población de células enriquecidas que comprende células madre cancerosas" se interpretará para proporcionar un apoyo explícito a la expresión "población de células que comprende un % X de células madre cancerosas", en donde el % X es un porcentaje tal y como se indica en esta memoria.

En un ejemplo, la población de células se enriquece a partir de una preparación celular que comprende células CD133+ en una forma seleccionable. A este respecto, se entenderá que la expresión "forma seleccionable" significa que las células expresan un marcador (por ejemplo, un marcador de la superficie celular) que permite la selección de las células portadoras de CD133.

Diagnóstico/detección de cáncer empleando moléculas de aptámeros

Los aptámeros de la presente descripción se pueden usar in vitro con fines de diagnóstico y/o detección para determinar la presencia de células madre cancerosas en tejido maligno. El método implica examinar una muestra biológica para detectar la presencia de células madre cancerosas CD133+. Por ejemplo, la muestra biológica se puede poner en contacto con un aptámero marcado de la presente descripción o un aptámero-Dox de la presente descripción y se determina la capacidad del aptámero para unirse específicamente a las células en la muestra. Una unión indica la presencia de una célula madre cancerosa portadora de CD133. El aptámero de la presente descripción también se puede utilizar para localizar un tumor in vivo, administrando a un sujeto un aptámero de la presente descripción que está marcado con un grupo indicador que proporciona una señal detectable. Alternativa o adicionalmente, debido a que la doxorrubicina tiene una actividad fluorescente inherente (en particular en la longitud de onda del infrarrojo lejano), esta característica se puede aprovechar para el diagnóstico. Los aptámeros unidos se pueden detectar usando citometría de flujo, microscopía, gammagrafía externa, tomografía de emisión, formación de imágenes ópticas o barrido radionuclear. El método se puede emplear para estadificar un cáncer en un sujeto con respecto a la extensión de la enfermedad y para realizar un seguimiento de los cambios como respuesta a una terapia.

La detección de células madre cancerosas se puede facilitar acoplando el aptámero con un marcador detectable. Ejemplos de marcadores detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, marcadores densos en electrones, marcadores para RMI y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa o acetilcolinesterasa. Ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelifona, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, disclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol. Ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S, 18F, 64Cu, 94mTc, 124I, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 86Y, 82Rb o 3H.

Marcar el extremo 3' del aptámero se puede lograr, por ejemplo, mediante una extensión con molde usando la polimerasa de Klenow, mediante ligación mediada por ligasa de T4 y mediante desoxinucleotidil transferasa terminal. Marcar el extremo 5' se puede lograr mediante la complementación de la mezcla de transcripción in vitro con un exceso de GTP-p-S, cuyo tiol se puede usar más adelante para fijar la biotina. Además, se puede usar una conjugación química directa de un grupo o grupos adecuados con el extremo 5' o 3' para marcar los aptámeros.

Uso de los aptámeros en el tratamiento del cáncer y como agente teranóstico

Los aptámeros de la presente descripción se pueden acoplar con un resto y emplear para dirigir el resto a las células CD133+, preferiblemente células madre cancerosas. Ejemplos de restos incluyen toxinas, radionucleidos o agentes quimioterapéuticos que se pueden usar para destruir células madre cancerosas.

El aptámero se puede fusionar con el resto, p. ej., la toxina, ya sea gracias a que el resto y el aptámero se sintetizan químicamente, o mediante conjugación, p. ej., un enlace covalente no peptídico, p. ej., un enlace no amida, que se usa para unir el aptámero producido por separado y el resto. Alternativamente, el aptámero y el resto se pueden unir gracias a un péptido enlazador adecuado.

Las moléculas de toxina útiles incluyen toxinas peptídicas, que son significativamente citotóxicas cuando están presentes intracelularmente. Ejemplos de toxinas incluyen citotoxinas, alteradores metabólicos (inhibidores y activadores) que alteran la actividad enzimática y por lo tanto destruyen las células madre cancerosas, y moléculas radiactivas que destruyen todas las células dentro de un radio definido de la porción efectora. Un alterador metabólico es una molécula, p. ej., una enzima o una citocina que cambia el metabolismo de una célula de manera que se altera su función normal. En términos generales, el término toxina incluye cualquier efector que causa la muerte de una célula tumoral.

Muchas toxinas peptídicas tienen un dominio que se une a un receptor eucariota generalizado; en esos casos, la toxina se debe modificar para evitar la destrucción de células que no son portadoras de CD133 (por ejemplo, para evitar la destrucción de células que no son portadoras de CD133 pero que tienen un receptor para la toxina sin modificar). Tales modificaciones se deben realizar de manera que se conserve la función citotóxica de la molécula. Las toxinas potencialmente útiles incluyen, pero no se limitan a, toxina diftérica, toxina del cólera, ricina, toxina similar a 0-Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertussis, toxina del tétanos, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saponina, modecina y gelanina. Otras toxinas incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) y la linfotoxina (LT). Otra toxina que tiene actividad antitumoral es la calicheamicina gamma 1, un antibiótico antitumoral que contiene enediina con una potencia considerable contra los tumores (Zein N et al. (1988). Science 240:1198-201).

A modo de ejemplo, la toxina diftérica (cuya secuencia se conoce) se puede conjugar con los aptámeros de la presente descripción. La molécula de toxina diftérica natural secretada por Corynebacterium diptheriae consiste en varios dominios funcionales que se pueden caracterizar, comenzando por el extremo amino terminal de la molécula, como fragmento A (AA 1 -193) enzimáticamente activo y fragmento B ^{( A a} 194-535) que incluye un dominio de translocación y un dominio de unión celular generalizado (AA 475-535).

El aptámero y el resto de toxina se pueden unir de diversas formas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un método para conjugar un aptámero con una toxina (gelonina) se describe en Chu TC et al. (2006) Cancer Res 6(12) 5989-5992.

El resto también puede ser un modulador del sistema inmune que activa o inhibe el sistema inmune corporal a nivel local. Por ejemplo, citocinas, p. ej., las linfocinas, tales como IL-2, administradas a un tumor pueden provocar la proliferación de linfocitos T citotóxicos o células asesinas naturales en las proximidades del tumor.

El resto o el grupo indicador también puede ser una molécula radiactiva, p. ej., un radionucleótido, o un llamado sensibilizador, p. ej., una molécula precursora que se vuelve radiactiva en condiciones específicas, p. ej., boro cuando se expone a un haz de neutrones de baja energía, en la denominada "terapia de captura de neutrones de boro" (BNCT) tal y como se describe en Barth et al. (1990). Scientific American, octubre de 1990:100-107. Los compuestos con esas porciones efectoras radiactivas se pueden usar tanto para inhibir la proliferación de células madre cancerosas en el tumor, como para marcar las células madre cancerosas con fines de formación de imágenes.

Los radionucleótidos son moléculas radiactivas de un solo átomo que pueden emitir partículas a, p o ^{y .} Se prefieren los emisores de partículas alfa a los emisores de partículas p o ^{y ,} porque liberan emisiones de energía mucho más elevada a una distancia más corta y, por lo tanto, son eficaces sin penetrar significativamente ni dañar los tejidos normales. Los radionucleidos emisores de partículas a adecuados incluyen 211At, 212Pb y 212Bi.

La molécula radiactiva puede estar ligada estrechamente al aptámero ya sea directamente o a través de un quelato bifuncional. Ese quelato no debe permitir la elución y, por tanto, una liberación prematura de la molécula radiactiva in vivo. Waldmann, Science, 252:1657-62 (1991). A modo de ejemplo, para adaptar una BNCT a la presente descripción, se puede seleccionar un isótopo estable de boro, por ejemplo, boro 10, como el resto antitumoral o la porción efectora del compuesto. El boro se administrará y se concentrará en las células tumorales o sobre las mismas, mediante la unión específica del aptámero a la célula madre cancerosa. Después de un tiempo que permite que se acumule una cantidad suficiente de boro, se pueden obtener imágenes del tumor e irradiarlo con un haz de neutrones de baja energía, que tiene una energía de aproximadamente 0,025 eV. Si bien esa radiación de neutrones, por sí sola, causa poco daño al tejido sano que rodea al tumor o al tumor mismo, el boro 10 (p. ej., en la superficie de una célula tumoral) capturará los neutrones, formando de este modo un isótopo inestable, el boro 11. El boro 11 se fisiona instantáneamente produciendo núcleos de litio 7 y partículas a energéticas, de aproximadamente 2,79 millones eV. Esas partículas pesadas son una forma de radiación altamente letal, pero muy localizada, porque las partículas tienen una longitud de trayectoria de solo aproximadamente el diámetro de una célula (10 micrómetros).

Los agentes quimioterapéuticos adecuados que se pueden fijar al aptámero de la presente descripción se pueden seleccionar a partir de doxorrubicina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicicina, doxorrubicina, daunorrubicina dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6 tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, descarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarcazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tales como carboplatino), antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)).

Alternativamente, el resto es una molécula quimioterapéutica u otra molécula que es capaz de intercalarse en la secuencia de la región del tallo del aptámero. Por ejemplo, cuando la molécula quimioterapéutica es doxorrubicina, la molécula es capaz de intercalarse en sitios CpG en el ADN del tallo del aptámero. Los agentes quimioterapéuticos tales como la doxorrubicina son intrínsecamente fluorescentes, lo que los hace convenientes para rastrear y visualizar su ubicación con diversas tecnologías de formación de imagen. Las capacidades terapéuticas y de formación de imagen combinadas en una molécula de DOX la hacen adecuada para uso como agente teranóstico. Por consiguiente, los aptámeros de la presente descripción se pueden utilizar como agentes teranósticos para administrar doxorrubicina a células madre cancerosas. Con el fin de aumentar la solubilidad en agua, el grupo amino del azúcar en la doxorrubicina se puede protonar formando un clorhidrato de DOX.

Los restos que son capaces de intercalarse en los aptámeros de la presente descripción incluyen, doxorrubicina, adriamicina, berberina, provflavina, mitoxantrona, daunorrubicina, talidomida, dactinomicina, danomicina, actinomicina D, 9-aminoacridina, amrubicina, amsacrina, antramicina, berbina, bleomicina, eliplicina, epirrubicina, idarrubicina, metpirilo, mitramicina, mitomicina, mitomicina C, mitoxantrona, mitoxantrona, pirarrubicina, pixantrona, plicamicina, proflavina, prodigiosina, talidomida, voreloxina, valrubicina, zorrubicina. clorfeniramina, prodisiosina, metapirilino, mitomicina, distamicina, dantinomicina, distamicina, carboplatino, cisplatino y otros derivados del platino, Hoechst 33258, berenilo, DAPI o agentes carcinógenos (incluido el epóxido exo 8,9 de aflatoxina B1, acridinas tales como proflavina o quinacrina o bromuro de etidio). Otros agentes intercalantes de GC serán conocidos por los expertos en la técnica de la presente descripción y se entiende que están incluidos dentro del alcance de la presente descripción.

El aptámero de la presente descripción también se puede usar para administrar ARNip, ribozima o ADNzima en las células.

Ejemplos adecuados de ARNip, ribozima o un agente terapéutico dependerán de las circunstancias. Los ejemplos de ARNip o ribozimas que son adecuados para uso de acuerdo con la presente descripción, incluyen aquellos que se dirigen a transportadores de membrana con casete de unión a ATP, genes de pluripotencialidad (Bmi-1, Notch 1, Sox 2, Oct-4, Nanog, p-catenina, Smo, nestina, ABCG2, Wnt2 y SCF, etc.), GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) y survivina.

A modo de ejemplo, esto se ha demostrado en la técnica anterior utilizando un aptámero anti-PSMA. Basándose en el conocimiento de que PSMA se internaliza a través de fosas recubiertas con clatrina hasta el endosoma, se postuló que el aptámero anti-PSMA llevaría el ARNip fijado a las células que expresan PSMA, y el aptámero-ARNip unido a la proteína PSMA podría acceder a la célula a través de una internalización. A continuación, la porción de ARNip sería procesada por el complejo Dicer y se suministraría a la vía de silenciamiento génico mediada por el Complejo Silenciador Inducido por ARN (RISC). Tres grupos han utilizado diferentes estrategias para lograr esto. Chu et al. (2006) Nucleic Acids Res 34, e73 describen un método de conjugación mediada por un puente de biotinaestreptavidina para ensamblar el aptámero anti-PSMA y el ARNip. McNamara et al. (2006) Nat Biotechnol 24, 1005­ 1015 utilizaban un enfoque de quimera de aptámero-ARNip de "solo ARN" para unir el aptámero y el ARNip. En un estudio posterior de Wullner et al. (2008). Curr. Cancer Drug Targets 8:554-565, los autores utilizaron el aptámero anti-PSMA para administrar el ARNip del factor 2 de elongación eucariota (EEF2) a células de cáncer de próstata positivas para PSMA. Para este fin, se utilizaron aptámeros de PSMA bivalentes. Los autores demostraron que, en comparación con la quimera monovalente anti-PSMA-ARNip la potencia para anular el gen de la estructura artificial de aptámero bivalente, era superior.

Los aptámeros de la presente descripción también se pueden usar para administrar una carga a células madre cancerosas CD133+ en una variedad de tumores sólidos. La gelonina es una toxina ribosómica que puede inhibir el proceso de síntesis de proteínas y es citotóxica. Sin embargo, es impermeable a la membrana y necesita un guía para su entrada celular. Por tanto, los aptámeros de la presente descripción se pueden utilizar para suministrar una carga útil tóxica impermeable a la membrana, a las células madre cancerosas. En otra realización de la presente descripción, los aptámeros de la presente descripción se pueden usar para administrar doxorrubicina (DOX), un agente quimioterapéutico que se intercala en el ADN, que es incapaz de dirigirse a las células madre cancerosas por sí solo, a células madre cancerosas CD133+.

La resistencia del tumor a los agentes quimioterapéuticos citotóxicos se debe en parte a una entrega y captación insuficientes y, lo que es más importante, al flujo de salida desde las células cancerosas. Se utilizaron nanopartículas biodegradables (NP) obtenidas a partir de PLGA, poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico), para abordar este problema tal y como se describe en Dhar et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:17356-17361. Brevemente, el cisplatino se convirtió en su profármaco, el compuesto Pt(IV), mediante la introducción de dos cadenas de alquilo. Esto aumentó la hidrofobicidad del compuesto y facilitó el proceso de introducirlo dentro del núcleo hidrofóbico de las NP. Se utilizó polietilenglicol (PEG) como copolímero durante la etapa de nanoprecipitación para sintetizar nanopartículas de PLGA-PEG. La superficie de PLGA-PEG-NP se dotó con un aptámero de PSMA (antígeno de membrana específico de la próstata). Las NP experimentaban una endocitosis cuando se incubaban con células LNCaP y el profármaco alquilado se convertía en cisplatino mediante el proceso de reducción citosólica.

La presente descripción también se extiende al uso de las moléculas de aptámero como agentes simultáneos para la formación de imágenes y administración de fármacos (teranósticos). Esto se puede lograr conjugando el aptámero con la superficie de un punto cuántico fluorescente (QD). A continuación, el conjugado de QD-aptámero se incuba con Dox para formar la nanopartícula de QD-aptámero-Dox. Tanto Dox como Qd son moléculas fluorescentes. Sin embargo, debido a su proximidad en la nanopartícula de QD-aptámero-Dox, extinguen entre sí la fluorescencia del otro mediante un mecanismo de transferencia de energía por resonancia de bi-fluorescencia (FRET). Por tanto, la nanopartícula de QD-aptámero-Dox no es fluorescente. Sin embargo, la internalización de la nanopartícula de QD-aptámero-Dox a través de una endocitosis mediada por PSMA en células de cáncer de próstata, provoca la liberación de Dox desde las nanopartículas de QD-aptámero-Dox, lo que da como resultado la recuperación de la fluorescencia tanto a través de Dox como de QD.

Composiciones farmacéuticas

La presente descripción proporciona además una composición farmacéutica que comprende el aptámero, el agente de diagnóstico o el agente teranóstico tal y como se describe en esta memoria. Una composición farmacéutica de la presente descripción incluye una composición preparada para el almacenamiento o la administración que incluye una cantidad farmacéuticamente eficaz del aptámero en un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. La elección del excipiente u otros elementos de la composición se puede adaptar de acuerdo con la vía y el dispositivo usados para la administración.

Los términos "vehículo" y "excipiente" se refieren a composiciones de materia que se usan convencionalmente en la técnica para facilitar el almacenamiento, la administración y/o la actividad biológica de un compuesto activo (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Mac Publishing Company (1980)). Un vehículo también puede reducir cualquiera de los efectos secundarios indeseables del compuesto activo. Un vehículo adecuado es, por ejemplo, estable, por ejemplo, incapaz de reaccionar con otros ingredientes en el vehículo. En un ejemplo, el vehículo no produce un efecto adverso local o sistémico significativo en los receptores con las dosificaciones y concentraciones empleadas para el tratamiento.

Los vehículos adecuados para la presente descripción incluyen los usados convencionalmente, p. ej., agua, solución salina, dextrosa acuosa, lactosa, solución de Ringer una solución tamponada, hialuronano y glicoles son vehículos líquidos ejemplares, particularmente (cuando son isotónicos) para soluciones. Los vehículos y excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

Se pueden añadir otros aditivos generales, tales como agente antioxidante, solución tampón, agente bacteriostático, etc. Para preparar soluciones inyectables, píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos, se pueden añadir adicionalmente diluyentes, agentes dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y lubricantes.

Los aptámeros de la descripción y las formulaciones de los mismos se pueden administrar directa o tópicamente (por ejemplo, localmente) al paciente o al tejido u órgano diana, tal y como se conoce generalmente en la técnica. Por ejemplo, una composición puede comprender un vehículo de administración, incluyendo liposomas, para la administración a un sujeto. Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar a las células mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, sin limitarse a, la encapsulación en liposomas, mediante iontoforesis o mediante una incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas, poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteináceos.

Los sistemas de administración que se pueden emplear con los aptámeros de la presente descripción incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, pomadas, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos de hidrocarburos y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, potenciadores de la permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos) y polímeros hidrofílicos (por ejemplo, policarbofilo y polivinilpirrolidona). En una realización de la presente descripción, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico.

Una composición farmacéutica de la descripción se encuentra en una forma adecuada para administración, por ejemplo, una administración sistémica o local, en una célula o un sujeto, incluyendo, por ejemplo, un ser humano. Las formas adecuadas dependen, en parte, del uso o de la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica o mediante inyección. Se conocen otros factores en la técnica e incluyen consideraciones tales como la toxicidad y las formas que impiden que la composición ejerza su efecto.

El aptámero o la composición que comprende el aptámero de la presente descripción se puede administrar por vía parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, hipodérmica, local o peritoneal). La dosificación eficaz del aptámero se puede determinar según el peso, la edad, el sexo, el estado de salud, la dieta, la frecuencia de administración, el método de administración, la excreción y la gravedad de una enfermedad. En un ejemplo, el aptámero o el agente teranóstico tal y como se describe en esta memoria, contiene el aptámero en un 10-95% en peso. En otro ejemplo, el aptámero o el agente teranóstico contiene el aptámero en un 25-75% en peso.

Generalmente, se administra una cantidad entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de ingredientes activos.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen el aptámero en una mezcla con excipientes adecuados para la producción de suspensiones acuosas. Esos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietilenado, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o varios conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o varios agentes colorantes, uno o varios agentes aromatizantes y uno o varios agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el aptámero en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes y aromatizantes para proporcionar preparaciones orales agradables al paladar. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante como el ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables, adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua, proporcionan el aptámero mezclado por adición con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o varios conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes o agentes de suspensión adecuados se ejemplifican con los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales obtenidos a partir de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, tal como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y una solución salina isotónica que contiene cloruro de sodio y potasio. Además, como disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites fijos estériles. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluyendo los mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables.

Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto en particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad en particular sometida a terapia. La frecuencia de administración puede ser de una a varias veces al día, semanal o mensual.

Combinaciones de aptámeros

La molécula o las moléculas de aptámero de la presente descripción se pueden usar solas o en combinación con uno o varios aptámeros adicionales de acuerdo con cualquier método descrito en esta memoria. En un ejemplo, la molécula o las moléculas de aptámero de la presente descripción se pueden combinar con un aptámero que facilita la detección, purificación o enriquecimiento de células madre cancerosas. En un ejemplo, el aptámero adicional comprende la secuencia EpDT3 5' -GCGACUGGUUACCCGGUCG- 3' tal y como se describe en Shigdar S et al. (2011). Cancer Sci 102(5):991-998. En otro ejemplo, el aptámero adicional se une a una diana diferente, p. ej., EpCAM.

La presente descripción también incluye aptámeros que pueden estar alineados en su extremo 5' y/o 3' con otro aptámero a través de un enlazador. Los enlazadores adecuados son conocidos en la técnica y pueden incluir polímeros tales como PEG.

Kits

La presente descripción también proporciona kits de diagnóstico para llevar a cabo los métodos descritos en esta memoria. En un ejemplo, el kit de diagnóstico incluye el aptámero o el agente de diagnóstico, tal y como se describe en esta memoria, para detectar células que expresan CD133 (por ejemplo, células madre cancerosas).

El kit también puede incluir agentes auxiliares tales como agentes tamponadores y agentes estabilizantes. El kit de diagnóstico puede incluir además agentes para reducir la interferencia de fondo, reactivos de control y un aparato para realizar una prueba. Por lo general, también se incluyen instrucciones sobre cómo usar el kit de diagnóstico.

Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar numerosas variaciones y/o modificaciones de las realizaciones descritas anteriormente, sin apartarse del amplio alcance general de la presente descripción. Las presentes realizaciones, por lo tanto, se deben considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Ejemplos

Los ejemplos que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.

Métodos

Líneas celulares y cultivo celular

HT-29 (células de cáncer colorrectal humano) y HEK293T (células de riñón embrionario humano) adquiridas en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) se mantuvieron en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Victoria, Australia) y se complementaron con suero bovino fetal al 10% (FCS, Hyclone, EE.UU). Las células se incubaron en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2 a 37°C.

Generación del aptámero para CD133

La generación del aptámero para CD133 inicial fue tal y como se ha descrito en Shigdar S et al. (2013) Cancer Letters 330:84-95. La secuencia de la región del tallo del aptámero se reemplazó con un tallo de ADN como se muestra en la Figura 1.

Desarrollo del conjugado de aptámero-Dox

La estructura 2D del aptámero para CD133 se predijo utilizando el programa informático VIENNA (http://rna.tbi.univie.ac.at/). Esa estructura guiaba una preparación más precisa y eficiente para la caracterización del conjugado de aptámero-fármaco. El aptámero para CD133 diseñado para una conjugación con el agente quimioterapéutico doxorrubicina (DOX) (SIGMA-ALDRICH) fue sintetizado por IBA (Alemania) y se almacenó a -80°C. Antes de la conjugación, el aptámero se plegó calentando a 85°C durante 5 min, enfriando lentamente a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de incubación a 37°C durante 15 min. A continuación, DOX se mezcló bien con el aptámero en tampón de conjugación que contenía NaCl 50 mM y MgCl2 2,5 mM y se incubó a 37°C en una mezcladora/incubadora orbital (RATEK) durante 2 horas a 75 r.p.m. A continuación, el conjugado se hizo pasar a través de una columna Sephadex® G-50 (SIGMA-ALDRICH) para separar el conjugado de aptámero-Dox de la DOX libre. El conjugado de aptámero-DOX contiene de este modo una o varias moléculas de DOX que están intercaladas en la secuencia de ADN de la región del tallo del aptámero.

Determinación de la relación molar entre la DOX y el aptámero

La fluorescencia natural de DOX y su subsiguiente extinción después de intercalarse en el aptámero para CD133, se utilizó para medir el grado de conjugación y estabilidad de DOX mediante espectroscopia ultravioleta (UV-Spec). El procedimiento de conjugación se estudió utilizando diferentes relaciones molares entre aptámero-Dox (0, 0,01, 0,04, 0,08, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 y 0,6) y se analizó utilizando UV-Spec o un lector de placas fluorescentes basado en una curva estándar de DOX libre.

Evaluación de la eficacia de la carga de DOX mediante HPLC

La eficacia de la carga de DOX con diferentes relaciones molares entre aptámero/DOX se determinó extrayendo la DOX en el conjugado con acetonitrilo, seguido de la cuantificación de DOX usando HPLC. Brevemente, se diluyeron treinta microlitros de conjugado de aptámero-Dox eluidos desde una columna Sephadex G-50 con 90 pL de acetonitrilo y se agitaron en vórtex durante 1 min. A continuación, esa solución se centrifugó durante 5 min a 21000 x g y se diluyeron 50 pL del material sobrenadante en 150 pL de PBS y se mezclaron bien antes de otra centrifugación durante 5 min a 21000 x g. Se extrajeron cien microlitros de material sobrenadante y se sometieron a cromatografía de fase inversa para la determinación de las concentraciones de DOX mediante una columna C-18 usando HPLC. La DOX se cuantificó usando un detector UV en línea en la HPLC. Se preparó una curva estándar de calibración con la solución estándar de DOX en las mismas condiciones. La eficacia de la carga de fármaco (DLE) se calculó mediante la fórmula:

DOX cargada en el conjugado

DLE (% ) = x 100%

DOX añadida

Análisis de la liberación de fármacos de los aptámeros

La liberación de DOX in vitro a partir del conjugado de aptámero-DOX se determinó usando un método de diálisis con un casete de diálisis Slide-A-Lyzer (peso molecular de corte de 3,5 kDa, Thermo SCIENTIFIC, n° de cat.: 66333). Se añadieron al casete conjugados de aptámero-Dox (400 pL, 1 pg/mL de DOX). El casete de diálisis se dializó frente a PBS y PBS con FCS al 10% a pH 8, 7,4 o 5,0 a 37°C, con agitación suave en la oscuridad. En varios puntos de tiempo (10 min, 0,5 h, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h y 48 h), se retiraron partes alícuotas de treinta microlitros del medio a partir del tampón externo para el análisis de la cinética de liberación y se reemplazaron con 30 pL de medio de nuevo aporte. La concentración de DOX se determinó usando un lector de placas de fluorescencia (PerkinElmer Life and Analytical Sciences) convirtiendo la intensidad de la fluorescencia en masa de DOX, de acuerdo con una curva estándar de la concentración de DOX frente a su intensidad fluorescente. La liberación acumulada de DOX a partir del aptámero-Dox se expresaba como un porcentaje de la DOX liberada y se representaba como una función del tiempo.

Determinación de la disociación en equilibrio entre el conjugado de aptámero-Dox y sus células diana

Para minimizar la unión no específica, primero se incubaron 1 x 105 células HT29 o HEK293T con tampón de bloqueo (PBS con FCS al 10%, BSA al 1% y ARNt al 1%) durante 20 min. Después, las células se lavaron dos veces con tampón de lavado (PBS que contenía FBS al 5% y MgCl22,5 mM) y se incubaron sobre hielo durante 1 h con aptámero para CD133, aptámero control negativo, conjugado de aptámero para CD133-Dox o conjugado de aptámero control negativo-Dox, todos marcados con Cy5 en tampón de conjugación (NaCl 50 mM y MgCl22,5 mM).

Antes del análisis mediante citometría de flujo, las células se lavaron de nuevo dos veces con tampón de lavado y luego se suspendieron en 150 pL de tampón de lavado. A continuación se recogieron los datos usando el citómetro de flujo (FACS CANTOII, Becton Dickerson) para medir la intensidad de la fluorescencia del aptámero y se determinó la afinidad de la unión, normalizando la intensidad de la fluorescencia con el fondo fluorescente del aptámero control negativo y luego se derivó usando el programa informático Graph Pad Prism.

Internalización del conjugado de aptámero-Dox

Tanto HT29 como HEK293T se sembraron con 8 x 105 células por pocillo en un portaobjetos con 8 cámaras, durante 24 h, en una preparación para microscopía confocal. Las células se incubaron con tampón de bloqueo (PBS con FCS al 10%, 1 mg/mL de BSA, 0,1 mg/mL de ARNt) durante 20 minutos, seguido de un lavado doble con tampón de lavado (PBS que contenía FBS al 5%, MgCl22,5 mM y NaCl 5 mM) antes de la incubación con aptámero 200 nM, aptámero control negativo, conjugado de aptámero-Dox o conjugado de aptámero control negativo-Dox, en tampón de conjugación durante 30 min a 37°C. Se añadió bisbenzimida Hoechst 33342 (3 mg/mL) (Sigma) a las células durante los últimos 15 minutos de incubación. La solución de aptámero se retiró y las células se lavaron tres veces durante 5 min cada vez en PBS, antes de la visualización usando un microscopio confocal de barrido láser FluoView FV10i (Olympus).

Análisis de la frecuencia de CSC in vitro

Las células se recogieron con un 80% de confluencia mediante digestión con tripsina y se resuspendieron como células individuales en medio sin suero DMEM/F12 después de una centrifugación (1000 x g durante 5 min). Las células se sembraron en placas de fijación ultrabajas de 96 pocillos, con una densidad de 5, 10, 50, 100, 500 y 1000 células por pocillo, o con 4000 células/pocillo en placas de fijación ultrabajas de 6 pocillos para la formación de esferas tumorales. Se utilizaron tres grupos de experimentos: control con medio tumoral para esferas tumorales, tratamiento con DOX libre (1, 1,5 y 2 pM) y tratamiento con aptámero-Dox (1, 1,5 y 2 pM equivalente a la misma concentración de DOX libre). Después de una incubación durante 24 h a 37°C, se eliminó el material sobrenadante y se reemplazó con un volumen igual de medio CSC de nuevo aporte. Una esfera tumoral se definió como un agregado celular con un diámetro superior a 50 pm con bordes bien definidos. La frecuencia y el tamaño de la formación de las esferas tumorales se registraron 3 días después de la siembra. La frecuencia de CSCs se calculó utilizando el sitio web de ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html. La frecuencia de la formación de esferas tumorales con incubación en 6 pocillos, se calculó de acuerdo con la fórmula F = Número de esferas tumorales que se forman / Número de células individuales extendidas en las placas (F es la frecuencia de formación de esferas tumorales).

Análisis de los datos

Los datos y los resultados se indicaron como la media y la desviación estándar (media ± DE) a menos que se indique lo contrario. Las diferencias en los valores medios entre los diferentes grupos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) usando el programa SPSS 13.0. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Ejemplo 1: Conjugación de DOX con aptámero para CD133

Un problema importante para las terapias actuales contra el cáncer es la incapacidad de un direccionamiento a las células madre cancerosas (CSCs). Para desarrollar nuevos agentes que se dirigen a las CSCs, DOX, un fármaco quimioterapéutico de uso común que no se puede dirigir a las CSCs por sí solo, se conjugó con un aptámero contra el marcador de la superficie celular CD133. La capacidad del aptámero conjugado para mantener la funcionalidad se sometió a ensayo evaluando la afinidad y la especificidad de la unión del aptámero, así como la citotoxicidad del fármaco.

La estructura secundaria del aptámero para CD133 se predijo utilizando el programa informático VIENNA (http://rna.tbi.univie.ac.at/) (Figura 1). El inventor había establecido previamente que la interacción entre CD133 y el aptámero se produce a través del bucle del aptámero (Shigdar S et al. (2013) Cancer Letters 330:84-95). Además, se sabe que la doxorrubicina (DOX) se intercala en el apareamiento de las bases G-C en el ADN (Figura 1B). Por lo tanto, el tallo de ARN en el aptámero para CD133 se reemplazó por un tallo de ADN de 10 pb para proporcionar una plataforma para la carga de DOX. Con el fin de aumentar la estabilidad tanto de la parte que se une a la diana del aptámero como del conjugado DOX-ADN, se usó una 5'metil-dC en el tallo de ADN, proporcionando un apareamiento de bases más fuerte que su homólogo natural.

La relación molar óptima para la carga de DOX en el aptámero se determinó mediante un ensayo de conjugación con aumentos secuenciales de la relación molar entre aptámero y DOX. Para realizar este análisis semicuantitativo, primero se determinó una valoración cuantitativa de la fluorescencia de DOX con diversas concentraciones, utilizando UV-Spec y HPLC (Figura 2). Esto proporciona una correlación entre la intensidad fluorescente medida y la concentración real de DOX libre. La intercalación de DOX en el aptámero para CD133 se controló mediante UV-Spec y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La Figura 3 muestra la fluorescencia natural de DOX y su posterior extinción máxima tras la intercalación con una relación molar entre aptámero para CD133 y DOX de 0,4:1. La carga de DOX en el aptámero aumentaba con el incremento de las concentraciones de aptámero utilizado y alcanzaba una meseta en 0,4. Estos datos, junto con el valor inicial de DOX libre dentro de una curva estándar, permitieron realizar un seguimiento de la conjugación de DOX con el aptámero como un porcentaje de extinción (Figura 3).

Ejemplo 2: Estabilidad in vitro de los conjugados de DOX-aptámero

La liberación controlada y sostenida de un fármaco es importante para los sistemas de administración de fármacos. El inventor ha mostrado previamente que los aptámeros se internalizan mediante endocitosis, posiblemente en los compartimentos del endosoma y lisosoma que tienen un pH de 6,0 a 5,09 Shigdar S et al. (2011) Cancer science 102: 991-998. Por lo tanto, se investigó el perfil de liberación in vitro de DOX a partir del conjugado de aptámero-Dox en un intervalo de pH, en PBS y en PBS con suero de ternero fetal (FCS). Como se muestra en la Figura 4 y 5, la liberación de DOX in vitro a partir del aptámero-Dox era dependiente del pH y mostraba un patrón de liberación constante y continuo con una pequeña liberación inicial por ráfagas. A pH 7,4 (el pH fisiológico encontrado en el sistema circulatorio), se detectó una liberación mínima de la DOX intercalada desde el aptámero después de 48 h en PBS. De manera similar, la liberación de DOX del aptámero-Dox era mucho menor a pH 8,0. Sin embargo, a pH 5,0, la liberación de DOX aumentaba drásticamente en PBS. Con el fin de imitar las condiciones de la circulación, se midió la liberación de DOX en PBS complementado con FCS (Figura 5) y se encontró que era consistente con la Figura 4, con respecto a la liberación de DOX a diferentes pH. Este comportamiento de liberación dependiente del pH es deseable, ya que DOX debe permanecer conjugada con el aptámero en el entorno neutro de la circulación sistémica in vivo y ser liberada en el entorno ácido del endosoma/lisosoma posterior, después de la internalización en las células tumorales.

Ejemplo 3: Determinación de la constante de disociación en equilibrio de los conjugados de aptámero

Para determinar si la conjugación de DOX impide la afinidad de la unión y la especificidad del aptámero hacia a CD133, se incubó el conjugado de aptámero-Dox marcado con Cy5 de forma fluorescente con células de cáncer colorrectal HT29 y se determinó la constante de disociación en equilibrio (K^d ) mediante un análisis de citometría de flujo (Figura 6). Los aptámeros para CD133 utilizados en el estudio de la constante de disociación se presentan en la Figura 7.

Se seleccionaron dos líneas celulares, HT29 y HEK293T, para el estudio. HT29 expresa niveles elevados de CD133, mientras que la línea celular HEK293 no expresa CD133 y se usó como control negativo para la especificidad de la unión a CD133. Como se muestra en la Figura 6A, el conjugado de aptámero-Dox tenía una afinidad insignificante hacia las células del control negativo (HEK293T) ya que mostraba una K^d de >1000 nM. Para determinar que el aptámero para CD133 se une a CD133 mediante una interacción molecular específica en lugar de una unión no específica entre un ácido nucleico y CD133, los experimentos se repitieron con un conjugado de aptámero control negativo-Dox (Figura 6B). Este aptámero control negativo tiene la secuencia de ácido nucleico idéntica a la del aptámero positivo, con la excepción de una modificación con 2'-0-metilo en lugar de una modificación química con 2'-fluoro.

Por lo tanto, tiene una estructura tridimensional alterada que anula su unión a CD133. El aptámero control negativo-Dox tampoco mostraba una unión a la línea celular HT29 con una disociación en equilibrio de K^d >1000 nM. Por el contrario, el aptámero para CD133 (Figura 6C) y el conjugado de aptámero para CD133-Dox (Figura 6D) se unían a las células HT29 con afinidad elevada, con 84,81 nM y 23,89 nM respectivamente, lo que sugiere tanto una retención de la afinidad como una mejora de la afinidad con DOX intercalada en el tallo.

Ejemplo 4: Internalización celular del conjugado de aptámero-Dox.

La expresión elevada de los transportadores ABC presentes en la membrana plasmática que expulsan fármacos libres que se difunden pasivamente en las células, es uno de los mecanismos clave subyacentes a la quimiorresistencia en las CSCs. Una forma de superar tales defensas es administrar los fármacos citotóxicos a través de endocitosis, evitando de este modo las bombas de expulsión de fármacos basadas en la membrana plasmática. Para evaluar la capacidad del conjugado de aptámero para CD133-Dox para administrar eficazmente el fármaco de forma intracelular, se analizó cualitativamente la internalización del conjugado mediante microscopía confocal (Figura 8). Los tratamientos con aptámero y DOX utilizados para la evaluación de la internalización se presentan en la Figura 9.

La longitud de onda de excitación y emisión de DOX es de 480 y 580 nm respectivamente, mientras que el aptámero se marcó con Cy5 con una longitud de onda de emisión y excitación de 645/664 nm. Esto era para que DOX y el aptámero dentro del conjugado se pudieran identificar claramente a través de diferentes canales fluorescentes para los análisis por citometría de flujo confocal. Las células HT29 se incubaron primero con aptámero para CD133 marcado con Cy5 y se mostró que se internalizaba con éxito después de 1 hora de incubación (Figura 8A). A continuación, para determinar si la intercalación de DOX podía afectar a la internalización, se repitió el experimento con el conjugado de aptámero-Dox (Figura 8B). Tal y como se muestra en la Figura 8A y B, el conjugado mostraba un nivel similar de internalización que su homólogo solo con aptámero para CD133. Un aptámero control negativo y una línea celular (293T) también confirmaron que la especificidad del conjugado era similar a los resultados de la afinidad (Figura 8C-D.) Además, el nivel de fluorescencia intracelular para DOX, medido utilizando el canal TRITC, era mucho más alto, en comparación con el de DOX libre mostrado en la Figura 8E.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un aptámero que se une específicamente a CD133, que comprende la secuencia 5' - X - ACGUAUACUAU- Y -3' (SEQ ID NO: 1), en donde la secuencia de X e Y son complementarias para poder aparear las bases y en donde X comprende al menos CGCG o GCGC capaz de un apareamiento de bases con GCGC o CGCG comprendida en Y para formar 4 nucleótidos CG apareados suficientes para permitir una intercalación de al menos un resto entre ellos, en donde dichos nucleótidos CG cuando se aparean comprenden la región del tallo del aptámero y en donde el resto es un colorante de ADN o una molécula utilizada en un tratamiento quimioterapéutico.

2. El aptámero según la reivindicación 1, en donde X e Y comprenden individualmente entre 4 y 15 nucleótidos CG apareados.

3. El aptámero según cualquier reivindicación precedente:

(i) que comprende la secuencia 5' -CGCGCGCCGCACGUAUACUAUGCGGCGCGCG- 3' (SEQ ID NO: 2); (ii) que consiste esencialmente en la secuencia según SEQ ID NO: 2; o

(iii) que consiste en la secuencia según SEQ ID NO: 2.

4. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, que muestra una constante de disociación (KD) para CD133 de aproximadamente 24 nM o menor.

5. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, en donde el resto se selecciona a partir del grupo que consiste en doxorrubicina, adriamicina, berberina, provflavina, mitoxantrona, daunorrubicina, talidomida, dactinomicina, danomicina, actinomicina D, 9-aminoacridina, amrubicina, amsacrina, antramina, berbina, bleomicina, eliplicina, epirrubicina, idarrubicina, metpirilo, mitramicina, mitomicina, mitomicina C, mitoxantrona, mitoxantrona, pirarrubicina, pixantrona, plicamicina, proflavina, prodigiosina, talidomida, voreloxina, valrubicina, zorrubicina, clorfeniramina, prodisiosina, metapirilino, mitomicina, distamicina, dantinomicina, distamicina, carboplatino, cisplatino y otros derivados de platino, Hoechst 33258, berenilo, DAPI o bromuro de etidio.

6. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, que comprende una o varias modificaciones que incrementan la estabilidad del aptámero.

7. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, en donde las bases de nucleótidos de pirimidina (C y/o U) en la región del bucle están modificadas con 2'-fluoro (2'-F), en donde la secuencia de la región del bucle es 5' ACGUAUACUAU 3' (SEQ ID NO: 3)

8. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, en donde:

(i) el extremo 3' está acoplado con un grupo fosfato, un éster fosfato o una dT invertida (invdT-3') y/o

(ii) el extremo 5' está acoplado con un colorante.

9. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia 5' - X - A(2'fC)G(2'-fU)A(2'flJ)A(2'fC)(2'fU)A(2'fU)- Y-(inv dT) - 3' ^{( S e Q} ID NO: 4), en donde X e Y son complementarias de modo que son capaces de un apareamiento de bases y en donde X e Y comprenden individualmente una longitud de al menos 4 nucleótidos CG apareados de forma alterna, en donde C es 5-metil dC, f = 2-fluoro e inv dT = una dT invertida y en donde la longitud de X e Y es suficiente para permitir la intercalación de al menos un resto.

10. El aptámero según la reivindicación 9, que comprende la secuencia 5' - mCGmCGmCGmCmCGmCA(2'fC)G(2'-fU)A(2'fU)A(2'fC)(2'fU)A(2'fU)GmCGGmCGmCGmCG-(invdT) - 3' (SEQ ID NO:5), en donde C = 5-metil dC, f = 2-fluoro e inv dT = una dT invertida.

11. El aptámero según cualquier reivindicación precedente, que se une específicamente a célula(s) madre cancerosa(s) CD133+.

12. Un agente de diagnóstico o teranóstico que comprende un aptámero según cualquier reivindicación precedente.

13. Un método in vitro para identificar una o unas células que expresan CD133 y/o una o unas células madre cancerosas en un sujeto o una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene cáncer, en donde el método comprende poner en contacto la o las células con un agente de diagnóstico o un agente teranóstico según la reivindicación 12.

14. Un aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, acoplado adicionalmente con un resto activo seleccionado a partir del grupo que consiste en una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, un fármaco o un agente bioactivo, toxina, radionucleido, ARNip, ADNzima o ribozima o una combinación de cualquiera de los anteriores.

15. El aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el agente teranóstico según la reivindicación 12, para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita.

16. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o un agente teranóstico según la reivindicación 12, junto con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.