KR102494646B1 - 안정화된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자 - Google Patents

안정화된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자 Download PDF

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Abstract

본원에서 표적에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS) 도메인을 포함하는 단백질, 예를 들어 10Fn3 분자가 제공되고, 여기서 FBS 도메인은 PmXn으로 이루어진 영역에 그의 C-말단에서 연결되고, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, m은 적어도 1의 정수이고, PmXn 모이어티는 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 단백질에 비해 향상된 특징, 예를 들어, 향상된 열안정성을 FBS 도메인에 제공한다.

Description

안정화된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자{STABILIZED FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD MOLECULES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 내용 전부가 본원에 참고로 구체적으로 포함된, 2014년 3월 20일에 출원된 미국 특허 가출원 61/955,975 및 2014년 11월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 62/084,270을 기초로 한 우선권을 주장한다.
애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III 제10 도메인 (10Fn3)으로부터 유래된 고-친화도 및 특이적 표적 결합 특성을 갖는 치료 단백질의 한 클래스이다. 야생형 10Fn3은 극히 안정하고 가용성인 반면, 야생형 서열로부터 대략 4-31개의 돌연변이를 포함하는 10Fn3의 표적 결합 변이체는 안정성 및 용해도가 크게 상이하다. 즉, 야생형 10Fn3 서열로부터의 임의의 돌연변이는 표적 결합을 위해 필요하긴 하지만, 단백질의 안정성을 감소시킬 위험을 갖는다. 따라서, 바람직하게는 그의 치료 표적에 대한 애드넥틴 결합을 매개하는 잔기의 종류와 무관하게, 그 서열을 안정화할, 야생형 10Fn3 서열에 대해 이루어질 수 있는 변형을 확인하는 것이 바람직할 것이다.
본원에서 아미노산 서열 PmXn으로 이루어진 모이어티에 그의 C-말단에서 연결된 안정화된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS) 단백질, 예를 들어, Fn3, 예컨대 10Fn3 분자 (예를 들어, 인간 10Fn3 분자)가 제공되고, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1의 정수이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, PmXn 모이어티는 FBS 단백질의 적어도 하나의 특징, 예를 들어, 열안정성을 향상시킨다.
도 1은 인간 10Fn3 도메인 (PDB ID: 1FNA)의 결정 구조 및 이 구조에서 볼 수 있는 폴리펩티드의 단백질 서열을 보여준다. 구조에서 규정되는 마지막 2개의 잔기, 즉 관심 서열 내의 "EI"는 C-말단 베타 가닥, G의 바로 하류에 위치하는 검정 구체로 제시된다.
정의
"아미노산 잔기"는 펩티드 결합의 형성시에 물 분자 (질소 측의 H+ 및 카르복실 측의 OH-)이 상실된 후 잔류하는 아미노산 부분이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "10Fn3 도메인" 또는 "10Fn3 모이어티" 또는 "10Fn3 분자"는 야생형 10Fn3 및 그의 생물학상 활성 변이체, 예를 들어, 표적, 예컨대 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학상 활성 변이체를 의미한다. 야생형 인간 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 1-8에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다. 야생형 인간 10Fn3 도메인의 생물학상 활성 변이체는 서열식별번호: 1-8 중 임의의 하나를 포함하는 10Fn3 도메인에 비해 적어도, 최대 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 또는 45개의 아미노산 변화, 즉, 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다. 또한, 야생형 10Fn3 도메인의 생물학상 활성 변이체는 서열식별번호: 1-8 중 임의의 하나를 포함하는 10Fn3 도메인에 비해 1-3, 1-5, 1-10, 1-15, 1-10, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40 또는 1-45개의 아미노산 변화를 포함하거나 상기 변화를 최대로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 야생형 10Fn3 도메인의 생물학상 활성 변이체는 서열식별번호: 1-8 중 임의의 하나를 포함하는 10Fn3 도메인에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 또는 45개 초과의 아미노산 변화, 즉, 치환, 부가 또는 결실을 포함하지 않는다. 아미노산 변화는 루프 영역 내에, 가닥 내에 또는 N-말단 또는 C-말단 영역 내에 존재할 수 있다. 루프 영역 내의 아미노산 변화를 허용하는 예시적인 축중성 10Fn3 아미노산 서열은 여기서 서열식별번호: 9-16으로서 제시된다.
"폴리펩티드"는 길이, 번역후 변형 또는 기능과 상관없이 2 이상의 아미노산의 임의의 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산, 예컨대 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,559,126에 기재된 것을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 임의의 다양한 표준 화학적 방법으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 아미노산은 보호기로 변형될 수 있거나; 카르복시-말단 아미노산은 말단 아미드 기로 제조될 수 있거나; 아미노-말단 잔기는 예를 들어 친지성을 향상시키기 위한 기를 사용하여 변형될 수 있거나; 또는 폴리펩티드는 화학적으로 글리코실화되거나 또는 안정성 또는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 다른 방식으로 변형될 수 있다). 폴리펩티드 변형은 또 다른 구조, 예컨대 시클릭 화합물 또는 다른 분자의 폴리펩티드에 대한 부착을 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 아미노산을 변경된 입체형태 (즉, R 또는 S; 또는 L 또는 D)로 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
10Fn3 도메인 (또는 모이어티 또는 분자)의 "영역"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 루프 (AB, BC, CD, DE, EF 및 FG), β-가닥 (A, B, C, D, E, F 및 G), N-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1-7에 대응), 또는 C-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 93-94에 대응)을 의미한다.
10Fn3 도메인 (또는 모이어티)의 "노스 폴 루프"는 10Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 어느 하나를 의미한다.
10Fn3 도메인 (또는 모이어티)의 "사우스 폴 루프"는 10Fn3 도메인의 AB, CD 및 EF 루프 중 어느 하나를 의미한다.
"스캐폴드 영역"은 인간 10Fn3 도메인의 임의의 비-루프 영역을 의미한다. 스캐폴드 영역은 A, B, C, D, E, F 및 G β-가닥 및 N-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 1-7에 대응하는 아미노산) 및 C-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 93-94에 대응하는 아미노산)을 포함한다.
"아미노산 서열 동일성 비율 (%)"은 본원에서, 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술 분야의 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLASTSM, BLASTSM-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (Megalign) (DNASTAR®) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 비교할 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 문구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
X/Y x 100
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램, 예컨대 BLASTSM, BLASTSM-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (DNASTAR®)의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기는 (1) 측쇄 또는 주쇄의 잔기의 임의의 비-수소 원자가, 복합체의 실험에 의해 결정된 3차원 구조를 기초로 하여 결합 표적의 임의의 원자의 5 옹스트롬 내에 존재하는 것으로 밝혀지고/지거나, (2) 잔기의 야생형 10Fn3 (예를 들어, 서열식별번호: 1) 내의 그의 동등물로의, 알라닌으로의, 또는 해당 잔기와 크기가 유사하거나 더 작은 측쇄를 갖는 잔기로의 돌연변이가, 표적에 대한 평형 해리 상수의 측정치 증가 (예를 들어, kon의 증가)를 유발할 경우, 표적에 대한 "결합에 기여"하는 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 혈청 또는 혈장 "반감기"는 일반적으로 예를 들어 폴리펩티드의 분해 및/또는 천연 메카니즘에 의한 폴리펩티드의 클리어런스 또는 제거에 의해 폴리펩티드의 혈청 농도를 생체 내에서 50% 감소시키는데 소요되는 시간으로 정의될 수 있다. 반감기는 그 자체로 공지된 임의의 방식, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이고, 예를 들어, 일반적으로 적합한 용량의 폴리펩티드를 영장류에게 투여하고; 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 상기 영장류로부터 규칙적인 간격으로 수거하고; 상기 혈액 샘플 내의 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 결정하고; 이와 같이 얻은 데이타 (데이타의 플롯)으로부터, 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 투여시 초기 수준에 비해 50% 감소할 때까지의 시간을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 반감기를 결정하는 방법은 예를 들어 문헌 [Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists (1986)]; [Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]; 및 [Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, Second Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)]에서 볼 수 있다.
혈청 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타와 같은 파라미터 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. "반감기의 증가"는 이들 파라미터 중 임의의 1개, 이들 파라미터 중 임의의 2개, 또는 이들 3개의 파라미터 전부의 증가를 의미한다. 특정 실시양태에서, 반감기의 증가는 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 모두의 증가를 보이거나 보이지 않으면서 t1/2-베타가 증가하는 것을 의미한다.
의약품, 예를 들어, FBS 모이어티 및 HSA 모이어티를 포함하는 단백질의 "저장 수명"은 제품이 분해가 발생하기 전까지 보관되는 시간의 길이이다. 예를 들어, 저장 수명은 제품의 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 또는 10%의 분해에 대한 시간으로서 규정될 수 있다.
개요
본원에서 표적에 특이적으로 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS) 도메인, 예를 들어, Fn3, 예컨대 10Fn3 분자를 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서 FBS 도메인은 PmXn으로 이루어진 영역에 그의 C-말단에서 연결되고, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, m은 적어도 1의 정수이다. 그 적용은 적어도 부분적으로는, 10Fn3 분자의 C-말단에 프롤린 및 임의로 하나 이상의 아미노산의 부가가 비변형된 10Fn3 분자에 비해 10Fn3 분자의 적어도 하나의 특징, 예를 들어, 그의 열안정성 또는 용해도를 증가시킨다는 발견을 기초로 한다.
본원에서 설명되는 10Fn3 분자는 임의의 관심 표적에 결합하도록 설계될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 표적은 관심 항원, 폴리펩티드 또는 치료 단백질 표적이다. 예시적인 치료상 바람직한 표적은 예를 들어, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파), VEGFR2, PCSK9, IL-23, EGFR 및 IGF1R을 포함한다.
피브로넥틴 기반 스캐폴드
본원에서 사용되는 바와 같이, "피브로넥틴 기반 스캐폴드" 또는 "FBS" 단백질 또는 모이어티는 피브로넥틴 유형 III ("Fn3") 반복체를 기초로 한 단백질 또는 모이어티를 의미한다. Fn3은 이뮤노글로불린 (Ig) 폴드의 구조 (즉, 7개의 β-가닥 및 6개의 루프로 이루어진 Ig-유사 β-샌드위치 구조)를 갖는 작은 (약 10 kDa) 도메인이다. 피브로넥틴은 18개의 Fn3 반복체를 갖고, 반복체 사이의 서열 상동성은 낮지만, 이들은 모두 3차 구조에서 높은 유사성을 공유한다. 또한, Fn3 도메인은 피브로넥틴 이외의 다른 많은 단백질, 예컨대 부착 분자, 세포 표면 분자, 예를 들어, 시토카인 수용체, 및 탄수화물 결합 도메인에도 존재한다. 검토를 위해, 문헌 [Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992)]; [Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994)]; [Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994)]; [Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994)]을 참고한다. 용어 "FBS" 단백질 또는 모이어티는 상기 다른 단백질 (즉, 비 피브로넥틴 분자)로부터의 Fn3 도메인을 기초로 한 스캐폴드를 포함하는 것으로 의도된다.
Fn3 도메인은 소형이며, 단량체이고, 가용성이며, 안정하다. 이것은 디술피드 결합이 결여되어 있고, 따라서 환원 조건 하에서 안정하다. Fn3 도메인은 N-말단으로부터 C-말단의 순서로 베타 또는 베타-유사 가닥 A; 루프 AB; 베타 또는 베타-유사 가닥 B; 루프 BC; 베타 또는 베타-유사 가닥 C; 루프 CD; 베타 또는 베타-유사 가닥 D; 루프 DE; 베타 또는 베타-유사 가닥 E; 루프 EF; 베타 또는 베타-유사 가닥 F; 루프 FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥 G를 포함한다. 7개의 역평행인 β-가닥들이 안정한 코어를 형성하는 2개의 베타 시트로 배열되면서, 베타 또는 베타-유사 가닥들을 연결하는 루프로 구성되는 2개의 "전면부"를 생성시킨다. 루프 AB, CD, 및 EF가 하나의 전면부 ("사우스 폴")에 위치하고, 루프 BC, DE, 및 FG가 반대편 전면부 ("노스 폴")에 위치한다.
Fn3 분자 내의 루프는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)과 구조적으로 유사하고, 변경될 때, 표적, 예를 들어, 표적 단백질에 대한 Fn3 분자의 결합에 관여할 수 있다. Fn3 분자의 다른 영역, 예컨대 베타 또는 베타-유사 가닥 및 N-말단 또는 C-말단 영역은 변경될 때, 또한 표적에 대한 결합에 관여할 수 있다. 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 중 임의의 것 또는 전부가 표적에 대한 결합에 참여할 수 있다. 임의의 베타 또는 베타-유사 가닥이 표적에 대한 결합에 관여할 수 있다. Fn3 도메인은 또한 하나 이상의 루프 및 하나 이상의 베타 또는 베타-유사 가닥을 통해 표적에 결합할 수 있다. 결합은 또한 N-말단 또는 C-말단 영역을 필요로 할 수 있다. 단백질에 사용하기 위한 FBS 도메인은 모든 루프, 모든 베타 또는 베타-유사 가닥, 또는 이들 중 단지 일부만을 포함할 수 있고, 여기서 특정 루프 및/또는 베타 또는 베타-유사 가닥 및/또는 N- 또는 C-말단 영역은, FBS 도메인이 바람직하게는 표적에 특이적으로 결합하는 한 변형 (또는 변경)된다. 예를 들어, FBS 도메인은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 루프, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 베타 가닥, 및 임의로 N- 말단 및/또는 C-말단 영역을 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 루프, 하나 이상의 베타 가닥, N-말단 영역 및/또는 C-말단 영역은 야생형 FBS 도메인에 비해 변형된다.
예시적인 실시양태에서, 본원에서 설명되는 리간드 (또는 표적) 결합 FBS 모이어티는 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인, 즉, Fn3의 제10 모듈 (10Fn3)을 기초로 한다. 야생형 인간 10Fn3 모이어티의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112016100173788-pct00001
(서열식별번호: 1)
(AB, CD 및 EF 루프는 밑줄로 표시하고; BC, FG, 및 DE 루프는 굵게 표시하여 강조되고; β-가닥은 각각의 루프 영역 사이에 또는 루프 영역에 인접하여 위치하고; N-말단 영역은 이탤랙체로 제시됨). 서열식별번호: 1의 마지막 2개의 아미노산 잔기는 C-말단 영역의 일부이다.
야생형 인간 10Fn3 분자는 또한 N-말단 영역 또는 그의 일부가 결여된 것을 포함한다. 예를 들어, 야생형 10Fn3 분자는 아미노산 잔기 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 또는 1-7이 결실된 서열식별번호: 1을 포함할 수 있다 (각각 서열식별번호: 2-8). 표 1은 상기 야생형 인간 10Fn3 모이어티의 아미노산 서열을 보여준다:
<표 1>
다양한 N-말단 영역을 갖는 야생형 인간 10Fn3 분자의 아미노산 서열
Figure 112016100173788-pct00002
일부 실시양태에서, AB 루프는 서열식별번호: 1의 잔기 14-17에 대응하고, BC 루프는 잔기 23-31에 대응하고, CD 루프는 잔기 37-47에 대응하고, DE 루프는 잔기 51-56에 대응하고, EF 루프는 잔기 63-67에 대응하고, FG 루프는 잔기 75-87에 대응한다. BC, DE 및 FG 루프는 분자의 한 전면부, 즉, "노스 폴"을 따라 정렬하고, AB, CD 및 EF 루프는 분자의 반대쪽 전면부, 즉, "사우스 폴"을 따라 정렬한다. 서열식별번호: 1에서, β-가닥 A는 잔기 8-13에 대응하고, β-가닥 B는 잔기 18-22에 대응하고, β-가닥 C는 잔기 32-36에 대응하고, 베타 가닥 D는 잔기 48-50에 대응하고, β-가닥 E는 잔기 57-62에 대응하고, β-가닥 F는 잔기 68-74에 대응하고, β-가닥 G는 잔기 88-92에 대응한다. β-가닥은 대응하는 루프를 통해 서로 연결되고, 예를 들어, 가닥 A 및 B는 β-가닥 A, 루프 AB, β-가닥 B의 형태로 루프 AB를 통해 연결된다.
인간 10Fn3 도메인을 기초로 한 FBS 단백질의 예는 애드넥틴 (브리스톨-마이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb)의 전액 출자 자회사인 애드넥서스 (Adnexus))이다. 애드넥틴은 10Fn3 도메인의 CDR-유사 루프 영역, β-가닥, N-말단 및/또는 C-말단 영역이 관심 화합물에 결합할 수 있는 단백질을 생성하도록 변형된 10Fn3 분자이다. 예를 들어, U.S. 특허 7,115,396에는 BC, DE, 및 FG 루프에 대한 변경에 의해 고친화도 TNFα 바인더가 생성되는 10Fn3 도메인 단백질이 기재되어 있다. U.S. 특허 7,858,739에는 BC, DE, 및 FG 루프에 대한 변경에 의해 고친화도 VEGFR2 바인더가 생성되는 Fn3 도메인 단백질이 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티는 일반적으로 다음 축중성 서열 (서열식별번호: 9)에 의해, 또는 각각 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 N-말단 아미노산이 결여된 것을 제외하고 서열식별번호: 9와 동일한 서열식별번호: 10-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 의해 규정되는 10Fn3 도메인을 포함한다:
Figure 112016100173788-pct00003
(서열식별번호: 9)
표 2는 상기 축중성 인간 10Fn3 분자의 아미노산 서열을 보여준다.
<표 2>
다양한 N-말단 영역을 갖는 야생형 인간 10Fn3 분자의 아미노산 서열
Figure 112016100173788-pct00004
서열식별번호: 25-32 및 50에서, AB 루프는 (X)u로 표시되고, BC 루프는 (X)v로 표시되고, CD 루프는 (X)w로 표시되고, DE 루프는 (X)x로 표시되고, EF 루프는 (X)y로 표시되고, FG 루프는 Xz로 표시된다. X는 임의의 아미노산을 나타내고, X 다음의 아래첨자는 아미노산의 수를 나타내는 정수이다. 특히, u, v, w, x, y 및 z는 각각 독립적으로 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, 또는 6-7개의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 베타 가닥의 서열 (서열식별번호: 9에 밑줄로 표시됨)은 서열식별번호: 9-16에 제시된 대응하는 아미노산에 비해 모든 7개의 스캐폴드 영역에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 베타 가닥의 서열은 서열식별번호: 9-16에 제시된 대응하는 아미노산에 비해 모든 7개의 스캐폴드 영역에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 소수성 코어 아미노산 잔기 (상기 서열식별번호: 9의 굵게 표시된 잔기)는 고정되고, 임의의 치환, 보존적 치환, 결실 또는 부가가 소수성 코어 아미노산 잔기 이외의 다른 잔기에서 발생한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 제시되는 폴리펩티드의 소수성 코어 잔기는 야생형 인간 10Fn3 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 1)에 비해 변형되지 않는다.
일부 실시양태에서, FBS 모이어티는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 10Fn3 도메인은 루프, AB; 루프, BC; 루프, CD; 루프, DE; 루프, EF; 및 루프, FG를 포함하고; 야생형 인간 10Fn3 도메인의 대응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로부터 선택되는 적어도 하나의 루프를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, 최대 2개의 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, 최대 3개의 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, BC, DE 및/또는 FG 루프가 변경된다. 특정 실시양태에서, AB, CD 및 EF 루프가 변경된다. 특정 실시양태에서, FG 루프는 변경되는 유일한 루프이다. 특정 실시양태에서, CD 루프는 변경되는 유일한 루프이다. 다른 실시양태에서, CD 및 FG 루프 둘 모두가 변경되고, 임의로 다른 루프는 변경되지 않는다. 특정 실시양태에서, CD 및 EF 루프 둘 모두가 변경되고, 임의로 다른 루프는 변경되지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특정 스캐폴드 변경은 하나 이상의 루프 변경과 조합된다. "변경된"은 주형 서열 (즉, 대응하는 야생형 인간 피브로넥틴 도메인)에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변경을 의미하고, 아미노산 부가, 결실, 및 치환을 포함한다. 변경된 루프 및/또는 스캐폴드 영역 (예를 들어, 베타 가닥, N-말단 영역 및 C-말단 영역)의 특정 조합을 포함하는 예시적인 10Fn3 분자가 본원에서 추가로 개시된다.
요구되는 표적에 대한 강한 친화도를 갖는 10Fn3 결합 도메인을 달성하기 위해 루프 영역 내의 모든 잔기가 변형될 필요가 있는 것은 아님이 이해되어야 한다. 추가로, 고친화도 10Fn3 결합 도메인을 계속 생산하면서 루프 영역 내의 삽입 및 결실이 또한 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로부터 선택되는 하나 이상의 루프는 야생형 인간 10Fn3 내의 대응하는 루프에 비해 길이가 연장되거나 단축될 수 있다. 임의의 제시된 폴리펩티드에서, 하나 이상의 루프는 길이가 연장될 수 있거나, 하나 이상의 루프는 길이가 감소될 수 있거나, 또는 이들이 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제시된 루프의 길이는 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 또는 10-15개 아미노산이 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제시된 루프의 길이는 1-15, 1-11, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2, 2-10, 또는 2-5개 아미노산이 감소될 수 있다. 특히, 10Fn3의 FG 루프의 길이는 13개 잔기인 반면, 항체 중쇄 내의 대응하는 루프는 4-28개의 잔기를 갖는다. 따라서, 표적 결합을 위해 FG에 의존하는 폴리펩티드에서 항원 결합을 최적화하기 위해, 10Fn3의 FG 루프의 길이는 표적 결합시에 가장 큰 가능한 가요성 및 친화도를 얻기 위해 길이뿐만 아니라 서열에서도 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, FBS 모이어티는 비-루프 영역이 서열식별번호: 1의 비-루프 영역에 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프가 변경된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, AB 루프는 4개 이하의 아미노산 치환, 10개 이하의 아미노산 삽입, 3개 이하의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합을 가질 수 있고/있거나; BC 루프는 10개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 결실, 10개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 가질 수 있고/있거나; CD 루프는 6개 이하의 아미노산 치환, 10개 이하의 아미노산 삽입, 4개 이하의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합을 가질 수 있고/있거나; DE 루프는 6개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 결실, 13개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 가질 수 있고/있거나; EF 루프는 5개 이하의 아미노산 치환, 10개 이하의 아미노산 삽입, 3개 이하의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합을 가질 수 있고/있거나; FG 루프는 12개 이하의 아미노산 치환, 11개 이하의 아미노산 결실, 25개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, FBS 모이어티는 서열 식별 번호: 1-16을 포함하는 서열의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 인간 10Fn3 도메인에 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 동일성을 갖는 10Fn3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제시되는 FBS 모이어티는 서열 식별 번호: 1-16을 포함하는 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 50%의 동일성을 갖는다. 다른 실시양태에서, FBS 모이어티는 서열 식별 번호: 1-16을 포함하는 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 65%의 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 루프는 야생형 서열의 대응하는 루프의 서열에 비해 변형되지 않고/않거나 하나 이상의 β-가닥은 야생형 서열의 대응하는 β-가닥의 서열에 비해 변형되지 않고/않거나 N-말단 또는 C-말단 영역은 변형되지 않을 것이다. 특정 실시양태에서, FBS 모이어티 내의 10Fn3 도메인의 각각의 베타 또는 베타-유사 가닥은 서열 식별 번호: 1의 대응하는 베타 또는 베타-유사 가닥의 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, β-가닥 영역 내의 변이는 생리학적 조건에서 폴리펩티드의 안정성을 붕괴시키지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인의 비-루프 영역은 하나 이상의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있다. 10Fn3 도메인 내의 5%, 10%, 20% 또는 심지어 30% 또는 그 초과의 많은 아미노산이, 리간드에 대한 10Fn3의 친화도를 실질적으로 변경하지 않으면서 보존적 치환에 의해 변경될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-루프 영역, 예를 들어 β-가닥은 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 5-15, 또는 5-10개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 스캐폴드 변형은 리간드에 대한 10Fn3 바인더의 결합 친화도를 100배, 50배, 25배, 10배, 5배, 또는 2배 감소시킬 수 있다. 상기 변화는 생체 내에서 10Fn3의 면역원성을 변경할 수 있고, 면역원성이 감소되는 경우, 상기 변화가 바람직할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"은 대응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기이다. 즉, 보존적 치환 및 그의 참조 잔기는 유사한 크기, 형태, 전하, 공유 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함하는 화학적 특성 등을 갖는다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 (1978 and Supp.)]에서 허용된 점 돌연변이에 대해 규정된 기준을 충족하는 것을 포함한다. 보존적 치환의 예는 다음 군 내의 치환을 포함한다: (a) 발린, 글리신; (b) 글리신, 알라닌; (c) 발린, 이소류신, 류신; (d) 아스파르트산, 글루탐산; (e) 아스파라긴, 글루타민; (f) 세린, 트레오닌; (g) 라이신, 아르기닌, 메티오닌; 및 (h) 페닐알라닌, 티로신.
또한 루프 및 스캐폴드 변형의 조합을 갖는 10Fn3 도메인이 본원에서 제시된다. 접합체는 (i) 적어도 하나의 루프 AB, BC, CD, DE, EF, 또는 FG의 아미노산 서열 내의 변형, 및 (ii) 적어도 하나의 스캐폴드 영역 내의 변형 (즉, 적어도 하나의 β-가닥, N-말단 영역, 및/또는 C-말단 영역 내의 변형)을 포함하는 10Fn3, 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 변형된 루프(들) 및 변형된 스캐폴드 영역(들) 둘 모두는 동일한 표적에 대한 결합에 기여한다. 예시적인 실시양태에서, 스캐폴드 영역 변형은 루프 영역 내의 변형에 인접하여 위치하고, 예를 들어, AB 루프가 변형될 경우, 스캐폴드 돌연변이는 10Fn3 도메인의 선형 서열 내의 AB 루프에 인접한 β-가닥 A 및/또는 β-가닥 B에 위치하는 경향을 보일 수 있다. 다른 실시양태에서, 일군의 변형은 Fn3 도메인의 선형 서열 내에 서로 인접하는 루프 및 스캐폴드 영역에서 함께 발견될 수 있다. 예를 들어, 루프 및 스캐폴드 변형을 모두 갖는 Fn3 바인더는 Fn3 도메인의 선형 서열 내에 서로 인접하는 루프 및 스캐폴드 영역의 다음 조합의 아미노산 변형의 집단을 가질 수 있다: β-가닥/루프/β-가닥, 루프/β-가닥/루프, 루프/β-가닥/루프/β-가닥, 말단 영역/β-가닥/루프, 또는 루프/β-가닥/말단 영역 등. 예를 들어, 루프 및 스캐폴드 변형의 신규한 조합을 갖는 Fn3 도메인은 20개의 연속적인 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 15개의 아미노산이 야생형에 비해 변형되도록 하는 변형 집단을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 연속적인 스트레치 내의 적어도 20개의 잔기 중 17개, 20개의 잔기 중 18개, 25개의 잔기 중 17개, 25개의 잔기 중 20개, 또는 30개의 잔기 중 25개가 대응하는 아미노산 스트레치에 걸쳐 야생형 Fn3 도메인 서열에 비해 변형된다. 특정 실시양태에서, 제시된 Fn3 도메인은 비변형된 (즉, 야생형) 서열의 스트레치에 의해 분리된 2 또는 3개의 변형 집단을 가질 수 있다. 변형된 임의의 제시된 영역 (즉, 루프, β-가닥 또는 말단 영역)에 대해, 모든 또는 단지 일부의 영역이 야생형 서열에 비해 변형될 수 있다. β-가닥 영역이 변형될 경우, 바람직하게는 소수성 코어 잔기는 비변형된 상태 (즉, 야생형)로 유지되고, β-가닥 내의 하나 이상의 비-코어 잔기가 변형된다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 분자의 "서측 (west-side)"을 따라 결합면 ("서측 바인더" 또는 "WS 바인더")을 포함한다. WS 바인더는 서열 식별 번호: 1에 제시된 대응하는 CD 및 FG 루프 서열에 비해 변형된 CD 루프 및 변형된 FG 루프를 포함할 수 있다. CD 루프 및 FG 루프 둘 모두는 동일한 표적에 대한 결합에 기여한다. 특정 실시양태에서, WS 바인더는 Fn3 도메인 내의 하나 이상의 영역에 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, WS 바인더는 CD 및/또는 FG 루프에 인접한 하나 이상의 β-가닥 영역에 스캐폴드 변형을 포함할 수 있다. 특히, WS 바인더는 하나 이상의 β-가닥 C, β-가닥 D, β-가닥 F, 및/또는 β-가닥 G에 서열 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 스캐폴드 변형은 서열식별번호: 1의 아미노산 위치: 33, 35, 49, 69, 71, 73, 89 및/또는 91에 대응하는 하나 이상의 스캐폴드 영역 위치에서의 변형을 포함한다. WS 바인더는 또한 BC 루프, 특히 BC 루프의 C-말단 부분에서의 변형을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, BC 루프의 마지막 2개의 잔기 (즉, 야생형 10Fn3 도메인 내의 아미노산 30 및 31에 대응하는)가 야생형 서열에 비해 변형된다. 추가의 루프 및 스캐폴드 변형의 모든 또는 일부는 변형된 CD 및 FG 루프와 함께 표적에 대한 결합에 기여할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 코어 잔기는 야생형 서열에 비해 변형되지 않는다.
예시적인 WS 바인더는 위치 30, 31, 33, 35, 37, 38, 46, 47, 49, 50, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 84, 85, 86, 87, 89 또는 91에 야생형 또는 돌연변이된 아미노산을 갖는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 CD, DE, 및, 일부 경우에 EF 루프 내에 변형을 포함하고, 여기서 루프 변형은 모두 표적 결합에 기여한다. 상기 폴리펩티드는 "전면 바인더"로 언급된다. 전면 바인더는 추가로 하나 이상의 스캐폴드 영역, 특히 변형된 루프 영역의 측면에 접하거나 인접하는 스캐폴드 영역 내에 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전면 바인더는 야생형 Fn3 도메인, 예를 들어, 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1)의 대응하는 β-가닥의 서열에 비해 하나 이상의 β-가닥 C, β-가닥 D, 및/또는 β-가닥 E 내의 스캐폴드 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 코어 잔기는 야생형 서열에 비해 변형되지 않는다. 전면 바인더에 존재할 수 있는 예시적인 스캐폴드 변형은 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 36, 49, 58 및/또는 50에 대응하는 하나 이상의 위치에 변형을 포함한다. 상기 스캐폴드 변형은 변형된 루프와 함께 표적에 대한 결합에 기여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 전면 바인더는 Fn3, 예를 들어, 10Fn3, 도메인의 몇 개의 루프 및 가닥 영역에 걸치는 일군의 변형을 포함할 수 있다. 특히, 전면 바인더는 야생형 Fn3, 예를 들어, 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1)의 잔기 36 내지 66에 대응하는 아미노산 사이의 31개의 잔기 중 적어도 15, 20, 24, 25, 또는 27개의 변형을 포함할 수 있다. 루프 및/또는 가닥 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, CD 루프는 Fn3, 예를 들어, 야생형 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1)의 CD 루프에 비해 길이가 연장되거나 감소된다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 EF 및 FG 루프 내에 변형을 포함하고, 여기서 루프 변형은 동일한 표적에 대한 결합에 기여한다. 상기 폴리펩티드는 본원에서 "후면 바인더"로 언급된다. 후면 바인더는 다른 루프 및/또는 스캐폴드 영역에 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 후면 바인더는 AB 루프의 적어도 일부, 바람직하게는 AB 루프의 N-말단 부분 내에 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, AB 루프의 처음 2개의 아미노산 (즉, 야생형 10Fn3 도메인의 아미노산 잔기 14 및 15에 대응하는)이 야생형 서열에 비해 변형된다. 특정 실시양태에서, 후면 바인더는 또한 하나 이상의 스캐폴드 변형, 특히 변형된 루프 영역에 인접한 하나 이상의 스캐폴드 영역 내의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 후면 바인더는 하나 이상의 β-가닥 A, β-가닥 G, N-말단 영역, 및/또는 C-말단 영역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소수성 코어 잔기는 야생형 서열에 비해 변형되지 않는다. 예시적인 스캐폴드 변형은 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 1-7, 9-13, 89, 91, 93 및/또는 94에 대응하는 하나 이상의 위치에 변형을 포함한다. 하나 이상의 추가의 루프 및/또는 스캐폴드 변형은 변형된 EF 및 FG 루프와 함께 표적에 대한 결합에 기여할 수 있다. 적합한 루프 및/또는 스캐폴드 영역 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, FG 루프의 아미노산 서열은 야생형 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1)의 FG 루프에 비해 길이가 연장되거나 감소된다.
특정 실시양태에서, 후면 바인더는 10Fn3 도메인 내의 몇몇 영역의 연속적인 범위에 걸쳐 일군의 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fn3, 예를 들어, 10Fn3 도메인의 처음 15개의 아미노산 잔기 중 적어도 14개가 야생형 Fn3, 예를 들어 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1) 내의 대응하는 잔기에 비해 변형될 수 있고/있거나, 야생형 Fn3, 예를 들어, 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1 또는 23)의 잔기 80 내지 97 (또는 94)에 대응하는 아미노산 사이의 18개의 잔기 중 적어도 15개가 야생형 서열 내의 대응하는 잔기에 비해 변형될 수 있다. 10Fn3 분자에서 94 잔기의 C-말단에 존재하는 위치의 아미노산을 언급할 때, 이것은 Fn3 도메인의 제10과 제11 반복체 사이의 가요성 링커, 즉, EIDKPSQ를 포함하여 101개 아미노산 길이의 단백질을 형성하는 10Fn3 분자의 맥락을 기초로 한 것이다 (따라서, 그의 C-말단에서 EIDKPSQ에 연결된 서열식별번호: 1은 서열식별번호: 23으로 표시된다).
Figure 112016100173788-pct00005
(서열식별번호: 23)
특정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 야생형 서열의 대응하는 영역의 서열에 비해 β-가닥 A, 루프 AB, β-가닥 B, 루프 CD, β-가닥 E, 루프 EF, 및 β-가닥 F의 아미노산 서열에 변형을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 본원에서 "사우스 폴 바인더" 또는 "SP 바인더"로 언급된다. 변형된 루프 및 가닥은 동일한 표적에 대한 결합에 기여한다. CD 루프의 아미노산 서열은 야생형 Fn3, 예를 들어, 인간 10Fn3 도메인 (서열식별번호: 1 또는 23)의 CD 루프에 비해 길이가 연장되거나 감소될 수 있다. 사우스 폴 바인더는 야생형 서열의 대응하는 영역의 서열에 비해 β-가닥 G 및/또는 C-말단 영역에 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 사우스 폴 바인더는 야생형 서열의 위치 11, 12, 19, 60, 61, 69, 91, 93 및 95-97에 대응하는 아미노산에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 식별 번호: 1 또는 23에 제시된 대응하는 BC, DE 및 FG 루프 서열에 비해 변형된 BC, DE 및 FG 루프, 및 하나 이상의 β-가닥 C, β-가닥 D, β-가닥 F 및 β-가닥 G 가닥 잔기 내의 추가의 변형을 포함한다. β-가닥 및 루프 영역 변형은 함께 표적에 대한 결합에 기여한다. 상기 단백질은 본원에서 "북서측 바인더", 또는 "NW 바인더"로 언급된다. 예시적인 실시양태에서, NW 바인더는 서열식별번호: 1 또는 23의 스캐폴드 영역 위치 R33, T49, Y73 및 S89에 대응하는 아미노산 위치 중 어느 하나 또는 조합에 하나 이상의 스캐폴드 변형을 포함한다. 루프 및 스캐폴드 영역 내의 적합한 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 BC, DE 및 FG 루프는 야생형 서열에 비해 길이가 연장되거나, 감소되거나, 또는 이 둘이 조합된다. 한 실시양태에서, 각각의 BC, DE 및 FG 루프는 야생형 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 23)에 비해 길이가 연장되거나 감소되거나, 또는 이 둘이 조합된다. 특정 실시양태에서, 단지 BC 루프의 일부, 특히 C-말단 부분이 야생형 서열에 비해 변형된다. 예를 들어, BC 루프는 야생형 BC 루프의 아미노산 27-31에 대응하는 아미노산 잔기에서만 변형되고, BC 루프의 나머지 (즉, 야생형 루프의 잔기 23-26에 대응하는)는 비변형된 상태로 유지된다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 변형된 BC, DE 및 FG 루프, 및 N-말단 영역, β-가닥 A, β-가닥 B 및/또는 β-가닥 E 중 임의의 하나 또는 이들의 조합 내의 하나 이상의 추가의 변형을 포함한다. 상기 단백질은 본원에서 "북동측 바인더", 또는 "NE 바인더"로 언급된다. 예시적인 실시양태에서, NE 바인더는 야생형 서열 (서열식별번호: 1 또는 23)의 스캐폴드 영역 위치 1-7, E9, L19, S21 및/또는 T58에 대응하는 아미노산 중 임의의 하나 또는 이들의 조합에서 변형된다. 변형된 루프 및 스캐폴드 영역의 조합은 표적에 대한 결합에 기여한다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 하나 이상의 AB, CD, DE 및 EF 루프 내의 변형, 및 하나 이상의 β-가닥 B, β-가닥 D 및/또는 β-가닥 E 내의 추가의 변형을 포함한다. 상기 단백질은 본원에서 "남측 전면 바인더"로 언급된다. 변형된 루프 및 가닥 잔기의 조합은 표적에 대한 결합에 기여한다. 예시적인 실시양태에서, 남측 전면 바인더는 서열식별번호: 1 또는 23의 스캐폴드 영역 위치 L19, T49, T58, S60, 및/또는 G61에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 및/또는 서열식별번호: 1 또는 23의 루프 영역 위치 T14-S17, P51, T56, G40-E47, 및/또는 K63-G65에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 남측 전면 바인더는 야생형 서열의 잔기 18 및 20에 대응하는 아미노산 사이의 AB 루프, 및/또는 CD 루프의 길이가 연장되거나 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 1 또는 23의 대응하는 가닥에 비해 변형된 β-가닥 A 및 β-가닥 G를 포함한다. 상기 단백질은 본원에서 "AG 바인더" 또는 "AG 가닥" 바인더로 언급된다. 특정 실시양태에서, AG 가닥 바인더는 Fn3, 예를 들어, 10Fn3 도메인의 N-말단 및 C-말단 부분에 일군의 변형을 포함하는 반면, Fn3의 중앙 부분은 비변형된 상태로 유지된다. 예를 들어, AG 가닥 바인더는 10Fn3 도메인의 처음 19개의 아미노산 (즉, 서열식별번호: 1 또는 23의 아미노산 위치 1-19에 대응하는)의 19개 중 16개에서의 변형 및 10Fn3 도메인의 마지막 18개의 아미노산 (즉, 서열식별번호: 9의 아미노산 위치 84-101에 대응하는)의 18개 중 13-17개에서의 또는 10Fn3 도메인의 마지막 22개의 아미노산 (즉, 서열식별번호: 9의 아미노산 위치 80-101에 대응하는)의 22개 중 14-18개에서의 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, AG 바인더는 서열식별번호: 9의 위치 1-7, 9, 11-17, 19, 84-89 및 91-97에 대응하는 하나 이상의 위치에 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, AG 바인더 내의 변형된 영역은 동일한 표적에 대한 결합에 기여한다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 변형된 CD 및 EF 루프, 및 서열식별번호: 1 또는 23의 위치 69 또는 91-97에 대응하는 잔기 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합 내의 추가의 변형을 포함한다. 이들 단백질은 본원에서 "남서측 바인더", 또는 "SW 바인더"로 언급된다. 변형된 루프 및 스캐폴드 영역은 표적에 대한 결합에 기여한다.
특정 실시양태에서, 단백질은 감소된 면역원성을 갖는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 BC 루프의 일부는 야생형으로 유지된다. 바람직하게는 상기 폴리펩티드는 BC 루프의 보다 큰 부분에 변형을 갖는 동등한 폴리펩티드에 비해 더 낮은 면역원성을 갖는다. 예시적인 실시양태에서, BC 루프의 N-말단 부분은 야생형으로 유지된다. 예를 들어, BC 루프의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5개의 잔기는 야생형으로 유지되는 반면, BC 루프의 나머지 C-말단 잔기는 변형될 수 있다. 야생형으로서 BC 루프의 적어도 일부의 N-말단 영역을 갖는 Fn3 설계에서, β-가닥 B 및/또는 β-가닥 C의 전부 또는 일부, 특히 BC 루프에 인접한 β-가닥 B 및/또는 β-가닥 C의 일부 (즉, β-가닥 B의 C-말단 부분 및/또는 β-가닥 C의 N-말단 부분)가 또한 야생형 서열에 비해 비변형되는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, BC 루프의 N-말단 부분에 야생형 서열을 및 감소된 면역원성을 갖는 Fn3 도메인은 N-말단 영역, β-가닥 A, AB 루프, 및 β-가닥 B에 임의의 변형을 갖지 않을 수 있다. 야생형으로서 BC 루프의 일부를 갖는 Fn3 설계에서, BC 루프의 변형된 부분은 10Fn3 도메인의 다른 영역 내의 변형과 함께 표적 결합에 기여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질은 감소된 면역원성을 갖는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 β-가닥 B/BC 루프/β-가닥 C의 영역 내의 강력한 HLA 앵커 ("BC 앵커")는 제거되거나 파괴되었다 (예를 들어, 하나 이상의 HLA 수용체에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방식으로 야생형 서열에 비해 변형된다). 예를 들어, BC 앵커는 Fn3, 예를 들어, 10Fn3 도메인을 서열식별번호: 1의 위치 L19, S21, R33 및/또는 T35에 대응하는 하나 이상의 위치에서 변형함으로써 제거되거나 파괴될 수 있다. BC 앵커가 제거되거나 파괴될 때, BC 영역의 면역원성 잠재력을 유의하게 증가시키지 않으면서 BC 루프의 서열을 변형하는 것이 가능하다. 따라서, 많은 상기 Fn3 설계는 β-가닥 B 및/또는 β-가닥 C 내의 변형에 추가로 BC 루프 내의 변형을 갖는다. BC 루프는 임의로 Fn3 도메인의 다른 영역 내의 변형과 조합하여 표적에 대한 결합에 기여할 수 있다. β-가닥 B 및/또는 β-가닥 C 내의 변형은 표적 결합에 기여하거나 기여하지 않을 수 있다.
예시적인 실시양태에서, FBS, 예를 들어, 10Fn3 도메인은 요구되는 표적에 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM 또는 그 미만의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, FBS, 예를 들어, 10Fn3 도메인은 요구되는 표적에 1 pM 내지 1 μM, 100 pM 내지 500 nM, 1 nM 내지 500 nM, 또는 1 nM 내지 100 nM의 Kd로 결합한다. 예시적인 실시양태에서, 10Fn3 모이어티는 야생형 10Fn3 도메인, 특히 예를 들어 서열식별번호: 1-8을 갖는 야생형 인간 10Fn3 도메인에 의해 결합되지 않은 표적에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티는 서열식별번호: 1-16로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, FBS는 표적에, 예를 들어, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM 미만 또는 그 이하의 Kd로 특이적으로 결합한다. FBS 모이어티는 하나 이상의 루프 및 하나 이상의 스캐폴드 영역에 아미노산 변화 (또는 변경)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인테그린-결합 모티프 "아르기닌-글라이신-아스파르트산" (RGD) (서열식별번호: 1의 아미노산 78-80)의 하나 이상의 잔기는 인테그린 결합을 붕괴시키기 위해 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드의 FG 루프는 RGD 인테그린 결합 부위를 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, RGD 서열은 극성 아미노산-중성 아미노산-산성 아미노산 서열에 의해 교체된다 (N-말단에서 C-말단 방향으로). 특정 실시양태에서, RGD 서열은 SGE 또는 RGE로 교체된다.
일부 실시양태에서, FBS 모이어티의 N-말단 및/또는 C-말단 영역의 아미노산 서열은 예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 10Fn3 도메인의 대응하는 영역의 아미노산 서열에 비해 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형된다.
특정 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 잔기의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1을 갖는 야생형 인간 10Fn3 도메인 내의 대응하는 아미노산의 서열에 비해 본원에서 제시되는 폴리펩티드에서 변형되거나 결실될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 서열식별번호: 1-16 중 임의의 하나의 아미노산 1-7, 8 또는 9에 대응하는 아미노산은 길이가 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1개의 아미노산인 대체 N-말단 영역으로 교체된다. 예시적인 대체 N-말단 영역은 (단일 문자 아미노산 코드로 제시되는) M, MG, G, MGVSDVPRDL (서열식별번호: 24) 및 GVSDVPRDL (서열식별번호: 25), 또는 서열식별번호: 24 또는 25 중 임의의 하나의 N-말단 절단체를 포함한다. 다른 적합한 대체 N-말단 영역은 예를 들어, XnSDVPRDL (서열식별번호: 26), XnDVPRDL (서열식별번호: 27), XnVPRDL (서열식별번호: 28), XnPRDL (서열식별번호: 29), XnRDL (서열식별번호: 30), XnDL (서열식별번호: 31), 또는 XnL을 포함하고, 여기서 n = 0, 1 또는 2개의 아미노산이고, n = 1일 때, X는 Met 또는 Gly이고, n = 2일 때, X는 Met-Gly이다. Met-Gly 서열이 10Fn3 도메인의 N-말단에 부가될 때, M은 대체로 절단되어, N-말단에 G가 존재할 것이다. 다른 실시양태에서, 대체 N-말단 영역은 아미노산 서열 MASTSG (서열식별번호: 32)를 포함한다.
추가로 본원에서 설명되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 처음 7 또는 8개의 잔기 (즉, 잔기 1-7 또는 1-8)는 결실되어, 예를 들어, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 10Fn3 도메인을 생성한다. 또한, 추가의 서열이 서열식별번호: 1-16 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 10Fn3 도메인의 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, N-말단 연장은 M, MG, 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 예를 들어, 서열식별번호: 1-16 중 임의의 하나에는 M, MG, 또는 G가 선행될 수 있다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티는 피브로넥틴 이외의 다른 Fn3 반복체, 예를 들어, 인간 피브로넥틴의 유형 III 도메인의 제10 반복체를 기초로 한다. 예를 들어, FBS 모이어티는 다른 피브로넥틴 유형 III 반복체, 예를 들어, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 및 제18 Fn3 반복체와 유사할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, FBS 모이어티는 피브로넥틴 이외의 다른 분자로부터 유래될 수 있다. 예시적인 FBS 모이어티는 피브로넥틴에서 발견되는, 서로 유사한 서열 유사성을 갖는 15개의 Fn3 도메인으로 이루어진 단백질인 테나신으로부터 유래될 수 있다. 상기 반복체는 예를 들어 문헌 [Jacobs et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25:107 (2012)]에 기재되어 있다. 피브로넥틴 분자 내의 반복체의 상동성 및 테나신 분자 내의 상동성을 기초로 하여, 상기 상동성을 기초로 한 인공 분자가 생성되었다. 피브로넥틴 분자 내의 도메인의 상동을 기초로 한 컨센서스 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 핍콘 (Fibcon) 및 핍콘B (FibconB)로서 언급되고 (WO 2010/093627 및 [Jacobs et al. (2012) 상기 문헌]), 테나신 분자 내의 도메인의 상동성을 기초로 한 것은 텐콘 (Tencon)으로 언급된다. 예시적인 핍콘 아미노산 서열은 다음 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112016100173788-pct00006
(핍콘B; 서열식별번호: 33).
여기서, 루프 AB는 아미노산 13-16 (TPSS; 서열식별번호: 34)로 이루어지고, 루프 BC는 아미노산 22-28 (TPPRVQI; 서열식별번호: 35)로 이루어지고, 루프 CD는 아미노산 38-43 (VGSDGR; 서열식별번호: 36)로 이루어지고, 루프 DE는 아미노산 51-54 (PSVS; 서열식별번호: 37)로 이루어지고, 루프 EF는 아미노산 60-64 (GLKPG; 서열식별번호: 38)로 이루어지고, 루프 FG는 아미노산 75-81 (KDNQESEP; 서열식별번호: 39)로 이루어진다. 또 다른 핍콘 아미노산 서열은 다음 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112016100173788-pct00007
(서열식별번호: 40; [Jacobs et al., 상기 문헌]).
테나신 유래 Fn3 단백질은 텐콘을 포함한다 (본원에 참고로 구체적으로 포함된 WO 2010/051274, WO 2010/051310 및 WO 2011/137319). 예시적인 텐콘 단백질은 다음 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112016100173788-pct00008
(서열식별번호: 41; [Jacobs et al., 상기 문헌], 및 WO 2011/137319).
여기서, 루프 AB는 아미노산 13-16 (TEDS; 서열식별번호: 42)로 이루어지고, 루프 BC는 아미노산 22-28 (TAPDAAF; 서열식별번호: 43)로 이루어지고, 루프 CD는 아미노산 38-43 (SEKVGE; 서열식별번호: 44)로 이루어지고, 루프 DE는 아미노산 51-54 (GSER; 서열식별번호: 45)로 이루어지고, 루프 EF는 아미노산 60-64 (GLKPG; 서열식별번호: 46)로 이루어지고, 루프 FG는 아미노산 75-81 (KGGHRSN; 서열식별번호: 47)로 이루어진다.
핍콘, 핍콘B 또는 텐콘 모이어티, 또는 그의 표적 결합 변이체는 그 단독으로 또는 이종 모이어티에 연결된 상태로, 본원에서 설명되는 바와 같이 융합될 수 있다. 다른 단백질, 예를 들어, 세포 표면 호르몬 및 시토카인 수용체, 샤페로닌, 및 탄수화물-결합 도메인으로부터의 Fn3 도메인이 본원에서 설명되는 바와 같이 접합될 수 있다.
FBS 단백질 또는 모이어티는 예를 들어 WO 2010/093627, WO 2011/130324, WO 2009/083804, WO 2009/133208, WO 02/04523, WO 2012/016245, WO 2009/023184, WO 2010/051310, WO 2011/020033, WO 2011/051333, WO 2011/051466, WO 2011/092233, WO 2011/100700, WO 2011/130324, WO 2011/130328, WO 2011/137319, WO 2010/051274, WO 2009/086116, WO 09/058379, WO 2013/067029 WO 2012/016245, WO 2014/120891 및 WO 2014/043344 (이 모두는 본원에 구체적으로 참고로 포함된다)에 기재되어 있고: 상기 특허 공개에 기재된 임의의 FBS 단백질 또는 모이어티가 본원에서 설명되는 바와 같이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질은 적어도 2개의 FBS 모이어티를 포함하고, 예를 들어, 단백질은 다가 FBS 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 다가 FBS는 공유 회합된 2, 3 또는 그 초과의 FBS 모이어티, 예를 들어 10Fn3 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, FBS 모이어티는 2개의 10Fn3 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 이량체 단백질이다.
다가 단백질 내의 FBS 모이어티, 예를 들어 10Fn3 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 링커는 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 10Fn3 도메인을 연결하기 위한 적합한 링커는 별개의 도메인이 서로 독립적으로 폴딩하여 표적 분자에 대한 고친화도 결합을 허용하는 3차원 구조를 서로 형성하도록 허용하는 것이다. 적합한 링커의 구체적인 예는 글라이신-세린 기반 링커, 글라이신-프롤린 기반 링커, 프롤린-알라닌 기반 링커 및 본원에서 설명되는 임의의 다른 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글라이신-프롤린 기반 링커이다. 상기 링커는 글리신 및 프롤린 잔기를 포함하고, 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 링커의 예는 GPG, GPGPGPG (서열식별번호: 48) 및 GPGPGPGPGPG (서열식별번호: 49)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 프롤린-알라닌 기반 링커이다. 상기 링커는 프롤린 및 알라닌 잔기를 포함하고, 3 내지 30, 10 내지 30, 3 내지 20 및 6 내지 18개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 링커의 예는 PAPAPA (서열식별번호: 50), PAPAPAPAPAPA (서열식별번호: 51) 및 PAPAPAPAPAPAPAPAPA (서열식별번호: 52)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 기반 링커이다. 이들 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하고, 8 내지 50, 10 내지 30, 및 10 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 링커의 예는 GSGSGSGSGS ((GS)5; 서열식별번호: 53), GSGSGSGSGSGS ((GS)6; 서열식별번호: 54), GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS ((GS)10; 서열식별번호: 55), GGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)4; 서열식별번호: 56), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)5; 서열식별번호: 57), 및 GGGGSGGGGSGGGSG (서열식별번호: 58)를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 임의의 Asp-Lys (DK) 쌍을 포함하지 않는다.
PmXn 모이어티, 예를 들어, 안정화 모이어티
특정 실시양태에서, FBS, 예를 들어, 10Fn3 모이어티는 PmXn (여기서, P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1의 정수이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, P는 X에 대해 N-말단이다)으로 이루어진 모이어티에 그의 C-말단에서 연결된다. PmXn 모이어티는 10Fn3 모이어티의 C-말단 아미노산, 예를 들어 그의 제94 아미노산 (서열식별번호: 1의 아미노산 넘버링을 기초로 하여)에 직접 연결될 수 있다. PmXn 모이어티는 10Fn3 모이어티의 제94 아미노산에 펩티드 결합을 통해 연결될 수 있다. PmXn 모이어티는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 상동성이거나 표 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 10Fn3 모이어티에 연결될 수 있다. 서열식별번호: 1의 말단의 단일 프롤린 잔기는 "95Pro" 또는 "Pro95" 또는 "P95" 또는 "95P"로 언급된다.
PmXn 모이어티에 연결된 예시적인 10Fn3 모이어티는 다음을 포함한다:
Figure 112016100173788-pct00009
(서열식별번호: 59)
Figure 112016100173788-pct00010
(서열식별번호: 60)
PmXn에서, m은 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있다. 예를 들어, m은 1-3일 수 있거나 또는 m은 1-2일 수 있다. "n"은 0, 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있고, 예를 들어, n은 1-3 또는 1-2일 수 있다.
추가로 본원에서 설명되는 바와 같이, 상기 10Fn3 모이어티는 하나 이상의 루프 및/또는 하나 이상의 β-가닥의 아미노산 서열을 변형함으로써 표적에 결합하도록 (및 FBS 모이어티를 형성하도록) 변형될 수 있다. PmXn에 연결된 FBS 모이어티는 본원에서 "변형된 FBS 모이어티"로 언급된다. 따라서, 서열식별번호: 59 또는 60에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FBS 모이어티를 포함하는 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 단백질은 PmXn을 포함하고, FBS는 표적에 특이적으로 결합한다 (RGD 도메인 이외의 다른 도메인을 통해).
PmXn에서, n은 0일 수 있고, 이 경우, 단백질의 C-말단 아미노산은 Pm, 예를 들어, P이다. 특정 실시양태에서, n은 0이 아니고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, n은 0-10, 0-5, 0-3, 1-10, 1-5, 1-3 또는 1-2일 수 있다. 그러나, 10개 초과의 아미노산이 프롤린에 연결될 수 있다. 예를 들어, 탠덤 FBS 모이어티 또는 또 다른 폴리펩티드에 융합된 FBS 모이어티에서, FBS 모이어티의 C-말단 아미노산은 하나 이상의 프롤린에 연결될 수 있고, 마지막 프롤린은 제2 FBS 모이어티 또는 이종 모이어티에 연결된다. 따라서, 특정 실시양태에서, n은 0-100, 0-200, 0-300, 0-400, 0-500 또는 그 초과의 정수일 수 있다.
특정 실시양태에서, PmXn은 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 프롤린 다음의 처음 아미노산은 시스테인일 수 있고, 시스테인은 분자 내의 마지막 아미노산일 수 있거나 또는 시스테인 다음에 하나 이상의 아미노산이 존재할 수 있다. 시스테인의 존재는 FBS 모이어티, 예를 들어, 화학적 모이어티, 예를 들어, PEG에 대한 이종 모이어티의 접합을 허용한다. 시스테인을 포함하는 예시적인 PmXn 모이어티는 PmCXn을 포함하고, 여기서 C는 시스테인이다. 또 다른 예는 PmXn1CXn2이고, 여기서 n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1의 정수이다. 예를 들어, n1은 1일 수 있고, n2는 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있다.
예시적인 PmXn 모이어티는 표 3에 제시된 것을 포함한다.
<표 3>
예시적인 PmXn 모이어티
Figure 112016100173788-pct00011
임의의 PmXn 모이어티, 예를 들어, 표 3에 제시된 것 다음에 히스티딘 꼬리, 예를 들어, 6xHis 태그, 또는 다른 태그가 존재할 수 있다. 이것은 히스티딘 꼬리가 PmXn에 포함될 수 있는 것을 배제하지 않는다.
FBS 모이어티에 대한 PmXn 모이어티의 부가는 FBS 모이어티의 하나 이상의 특징을 향상시킨다. 예를 들어, 실시예에서 제시되는 바와 같이, 이것은 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 모이어티에 비해 10Fn3 모이어티의 열안정성을 향상시킨다. 열안정성의 향상은 다른 바람직한 특성, 예컨대 용해도, 적절한 폴딩 및 발현 수준을 개선할 것으로 예상된다. 예를 들어, 실시예에서 제시되는 바와 같이, FBS의 C-말단에 PmXn 모이어티의 존재는 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 FBS에 비해 FBS의 용해도를 향상시킨다.
따라서, 특정 실시양태에서, FBS, 예를 들어, 10Fn3 모이어티의 Tm은 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 FBS 모이어티에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15℃ 향상된다. 예를 들어, Tm은 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 FBS 모이어티에 비해 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 또는 1-5℃로부터 증가될 수 있다. Tm은 예를 들어 다음과 같이 열 주사 형광 (TSF)에 의해 측정될 수 있다. 단백질 샘플, 예를 들어, HTPP 샘플을 PBS 내에 0.2 mg/ml로 정규화한다. PBS로 1:40으로 희석된 1 ㎕의 시프로® 오렌지 염료를 25 ㎕의 각각의 샘플에 첨가하고, 플레이트를 투명한 96-웰 마이크로플레이트 접착 밀봉제로 밀봉한다. 온도를 분당 2도의 속도로 25℃-95℃로 증가시킴으로써 바이오라드 (BioRad) RT-PCR 기기를 사용하여 샘플을 스캐닝한다. 데이타를 바이오라드 CFX 매니저 2.0 소프트웨어를 사용하여 분석한다. Tm은 또한 다음과 같이 시차 주사 열량 분석 (DSC)에 의해 측정될 수 있다. 0.5 mg/ml 용액을 온도를 70 p.s.i의 압력 하에 1분당 1도의 속도로 15℃로부터 110℃로 증가시킴으로써 VP-모세관 시차 주사 열량계 (지이 마이크로칼 (GE Microcal))로 스캐닝한다. 데이타는 오리진 (Origin) 소프트웨어 (오리진랩 코퍼레이션 (OriginLab Corp))를 사용하여 최적 맞춤을 사용하여 적합한 완충제의 대조 실행과 비교하여 분석한다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티의 용해도는 이를 PmXn 모이어티에 연결함으로써 향상된다. 상기 분자는 적어도 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
PKE 모이어티
FBS 모이어티는 FBS 모이어티의 반감기를 연장하기 위해 PKE 모이어티에 연결될 수 있다. 예시적인 PKE 모이어티는 인간 혈청 알부민; 인간 혈청 알부민에 결합하는 단백질 (예를 들어, HSA 또는 ABD에 결합하는 FBS); Fc; 또는 그의 임의의 부분 또는 변이체; 및 PEG를 포함한다. 상기 모이어티는 PmXn 모이어티 및/또는 FBS의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다.
시스테인 접합된 표지 및 치료
특정 실시양태에서, PmXn 모이어티에 연결된 FBS 모이어티 ("변형된 FBS 모이어티"로 언급됨) (여기서, 적어도 하나 이상의 아미노산 "X"는 시스테인임)는 하나 이상의 시스테인을 통해 이종 모이어티, 예컨대 표지 모이어티, 생물학상 활성 모이어티 (예를 들어, 치료제) 또는 결합 모이어티에 연결된다.
본원에서 설명되는 FBS 모이어티는 C-말단 시스테인을 통해 치료제에 접합되어 면역접합체, 예컨대 FBS-약물 접합체 (FBS-DC; 또한 "애드넥틴-약물 접합체")를 형성할 수 있다.
FBS-DC에서, FBS는 약물에 접합되고, 여기서 FBS는 FBS-DC를 그의 항원을 발현하는 표적 세포, 예컨대 암 세포로 유도하기 위한 표적화제로서 기능한다. 바람직하게는, 항원은 종양 연관 항원, 즉, 암 세포에서 특유하게 발현되거나 과다발현되는 것이다. 약물은 표적 세포 내 또는 그 주변에서 방출되어 치료제로서 작용한다. 예를 들어 암 요법에서 항체와 함께 사용되는 약물 접합체의 작용 메카니즘 및 용도의 검토를 위해, 문헌 [Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc., 5:147 (2006)]을 참고한다.
약물 접합체에 사용하기 적합한 치료제는 항대사체, 알킬화제, DNA 작은 홈 바인더, DNA 삽입제, DNA 가교결합제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 외수송 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 충격 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제, 및 항-유사분열제를 포함한다. FBS-DC에서, FBS 및 치료제는 바람직하게는 절단가능한 링커, 예컨대 펩티딜, 디술피드, 또는 히드라존 링커에 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 펩티딜 링커, 예컨대 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 89), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu이다. FBS-DC는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공개 2006/0024317; 2006/0004081; 및 2006/0247295에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다. 링커는 그 자체가 PmXn 모이어티의 시스테인에, 예를 들어 말레이미드 화학을 사용하여, 예를 들어 공유 연결될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 X는 시스테인이다. 예를 들어, 링커는 FBS-PmXn (여기서, 적어도 하나의 X는 시스테인이다)에 공유 연결될 수 있다. 예를 들어, 링커는 FBS-PmCn에 연결될 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고, C는 시스테인이고, m 및 n은 적어도 1의 정수, 예를 들어, 1-3이다. 시스테인에 대한 라이게이션은 말레이미드 화학을 사용하여 관련 기술 분야에 알려진 바와 같이 수행될 수 있다 (예를 들어, [Imperiali, B. et al., Protein Engineering: Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 22, pp. 65-96, Gross, H.J., ed. (2009)]). 링커를 FBS 상의 시스테인에 부착하기 위해, 링커는 예를 들어 시스테인과 반응하여 공유 결합을 형성하는 말레이미도 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스테인 주위의 아미노산은 화학 반응을 용이하게 하기 위해 최적화된다. 예를 들어, 시스테인은 양하전 아미노산의 스트레치에 의해 둘러싸인 시스테인에 비해 더 빠른 반응을 위해 음하전 아미노산에 의해 둘러싸일 수 있다 (EP 1074563).
암 치료를 위해, 약물은 바람직하게는 표적 암 세포의 사멸을 유발하는 세포독성 약물이다. FBS-DC에 사용되는 세포독성 약물은 다음 종류의 화합물 및 그의 유사체 및 유도체를 포함한다:
(a) 엔다이인 (enediyne), 예컨대 칼리케아미신 (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Am. Chem. Soc., 109:3464, 3466 (1987)] 참조) 및 운시알라마이신 (예를 들어, 데이비스 (Davies) 등의 WO 2007/038868 A2 (2007) 및 쵸우다리 (Chowdari) 등의 U.S. 특허 8,709,431 B2 (2012) 참조);
(b) 투불리신 (예를 들어, 돔링 (Domling) 등의 U.S. 특허 7,778,814 B2 (2010); 쳉 (Cheng) 등의 U.S. 특허 8,394,922 B2 (2013); 및 콩 (Cong) 등의 U.S. 특허 공개 2014/0227295 A1 참조);
(c) CC-1065 및 듀오카르마이신 (예를 들어, 보거 (Boger)의 U.S. 특허 6,5458,530 B1 (2003); 수피 (Sufi) 등의 U.S. 특허 8,461,117 B2 (2013); 및 장 (Zhang) 등의 U.S. 특허 공개 2012/0301490 A1 (2012) 참조);
(d) 에포틸론 (예를 들어, 바이트 (Vite) 등의 U.S. 특허 공개 2007/0275904 A1 (2007) 및 U.S. 특허 RE42,930 E (2011) 참조);
(e) 오리스타틴 (예를 들어, 센터 (Senter) 등의 U.S. 특허 6,844,869 B2 (2005) 및 도로니나 (Doronina) 등의 U.S. 특허 7,498,298 B2 (2009) 참조);
(f) 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 이량체 (예를 들어, 하워드 (Howard) 등의 U.S. 특허 공개 2013/0059800 A1 (2013) 및 2013/0028919 A1 (2013); 및 WO 2013/041606 A1 (2013) 참조); 및
(g) 메이탄시노이드, 예컨대 DM1 및 DM4 (예를 들어, 카리 (Chari) 등의 U.S. 특허 5,208,020 (1993) 및 암플렛 (Amphlett) 등의 U.S. 특허 7,374,762 B2 (2008) 참조).
특정 실시양태에서, FBS-PmXn (여기서, 적어도 하나의 X는 시스테인이다)은 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 검출 또는 영상화에 사용하기 위해 표지 또는 검출가능한 모이어티에 연결된다.
검출가능한 표지는 다음을 비롯하여 시험관 내 진단 분야에서 현재 사용되는 임의의 다양한 종류일 수 있다: 금속 졸, 예컨대 콜로이드성 금을 포함하는 입자 표지, 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 유형의 펩티드 킬레이팅제와 함께 제시된 동위원소, 예컨대 I125 또는 Tc99, 형광 마커, 비오틴, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함하는 발색단, 및 제시된 기질을 검출가능한 마커로 전환하는 효소 표지, 및 증폭, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 후에 나타나는 폴리뉴클레오티드 태그. 비오티닐화된 항체는 이어서 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합에 의해 검출가능할 것이다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2 디옥세탄 기질, 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄 (AMPPD), 디소듐 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일)페닐 포스페이트 (CSPD), 및 CDP 및 CDP-STAR® 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 적합한 란타나이드, 예컨대 테르븀(III) 및 유로퓸(III)의 킬레이트의 전환 후에 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는 효소 알칼리성 포스파타제일 수 있다.
사용될 수 있는 검출가능한 모이어티는 다음과 같은 방사성 물질을 포함한다: 방사성 중금속, 예컨대 철 킬레이트, 가돌리늄 또는 망간의 방사성 킬레이트, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출체, 18F, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 124I, 86Y, 89Zr, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 44Sc, 47Sc, 11C, 111In, 114mIn, 114In, 125I, 124I, 131I, 123I, 131I, 123I, 32Cl, 33Cl, 34Cl, 74Br, 75Br, 76Br, 77Br, 78Br, 89Zr, 186Re, 188Re, 86Y, 90Y, 177Lu, 99Tc, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 또는 153Sm.
검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그의 반응 산물은 표지가 입자이고 적절한 수준에서 축적되는 경우 육안으로, 또는 표준 실무에 따라 분광광도계, 광도계, 형광계 등과 같은 기구를 이용하여 검출할 수 있다.
검출가능한 모이어티는 관련 기술 분야에 알려진 방법에 따라 시스테인에 연결될 수 있다. 검출가능한 모이어티가 방사성 물질, 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 것인 경우에, 검출가능한 모이어티는 시스테인과 반응성인 킬레이팅제, 예컨대 말레이미드 함유 킬레이팅제, 예컨대 말레이미드-NODAGA 또는 말레이미드-DBCO를 통해 FBS에 연결된다. 말레이미드-NODAGA 또는 말레이미드-DBCO는 FBS의 C-말단 상의 시스테인과 반응하여 (예를 들어, PmXn 모이어티 (여기서, 적어도 하나의 X는 시스테인이다)를 통해), 각각 FBS-NODAGA 또는 FBS-DBCO를 생성할 수 있다. 다음 킬레이팅제 중 임의의 하나는 시스테인과 반응하는 반응성 모이어티를 포함하거나 포함하도록 변형될 수 있다면 사용될 수 있다: DFO, DOTA 및 그의 유도체 (CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, Oxo-DO3A), TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, 디암사르 및 유도체, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP (PRP9), NOPO, AAZTA 및 유도체 (DATA), H2데드파, H4옥타파, H2아자파, H5데카파, H6포스파, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA, 및 TRITA 기반 킬레이팅제, 및 그의 근접한 유사체 및 유도체.
특정 실시양태에서, FBS는 PET 추적자로 표지되고, 생체내 영상화제로서 사용된다. 예를 들어, FBS는 PET 추적자 64Cu로 표지될 수 있다. 64Cu는 킬레이팅제, 예컨대 말레이미드-NODAGA로 C-말단 시스테인을 갖는 FBS에 연결될 수 있다.
예시적인 분자
특정 실시양태에서, 단백질은 (i) 서열식별번호: 1-16 중 임의의 하나에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FBS 모이어티; 및 (ii) PmXn (여기서, P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1의 정수이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이다)을 포함하고, 여기서 단백질은 표적에 특이적으로 결합하고 (예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 예컨대 비아코어에 의해 결정될 때, 예를 들어 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM 미만 또는 그 이하의 Kd로), PmXn 모이어티는 비변형된 FBS 모이어티로 이루어진 단백질에 비해 FBS 모이어티의 적어도 하나의 특성을 개선한다.
특정 실시양태에서, PmXn 모이어티에 의해 부여되는 향상된 특성은 향상된 단백질 안정성, 예를 들어 적어도 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 1-15℃, 2-15℃, 3-15℃, 5-15℃, 5-15℃, 1-10℃, 2-10℃, 3-10℃, 4-10℃ 또는 5-10℃의 융점 (Tm)의 증가이다. Tm은 예를 들어 열 주사 형광 (TSF) 또는 시차 주사 열량 분석 (DSC)에 의해 결정될 수 있다. "향상된 Tm"은 Tm의 통계상 유의한 향상이다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티 및 PmXn 모이어티를 포함하는 단백질은 조성물, 예를 들어, 제약 조성물에 적어도 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml의 농도로 존재한다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티 및 PmXn 모이어티를 포함하는 단백질은 조성물, 예를 들어, 제약 조성물에, 대부분 단량체로서 존재하고, 예를 들어, 조성물 내의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 단백질이 단량체 형태이다. 단백질 용액의 단량체성 정도는 예를 들어 A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 = 280 nm, 방출 = 350 nm)을 사용하여 애질런트 (Agilent) 1100 또는 1200 HPLC 시스템에서 수퍼덱스 (Superdex) 칼럼 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정될 수 있다. 100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨 (예를 들어, pH 6.8)의 완충제를 SEC 칼럼의 적절한 유동 속도에서 사용할 수 있다. 겔 여과 표준물 (바이오-라드 래보래토리즈 (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스))을 분자량 보정을 위해 사용한다.
특정 실시양태에서, FBS 모이어티 및 PmXn 모이어티를 포함하는 단백질은 적어도 비변형된 FBS 모이어티만큼의 강력한 생물학적 활성을 갖는다. 생물학적 활성은 표적에 대한 결합 친화도 또는 검정에서의 생물학적 활성, 예를 들어 종양 세포를 파괴하는 능력일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질의 생물학적 활성은 비변형된 FBS 모이어티의 활성의 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 2배 내 또는 그 초과이다.
FBS 및 PmXn 모이어티를 포함하는 단백질은 또한 상기 특징의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 50 mg/ml 이하의 농도에서 가용성이고/이거나, 적어도 90%가 단량체 형태이고/이거나, 및/또는 적어도 비변형된 FBS만큼의 효능을 갖는 생물학적 활성을 가질 수 있다.
향상된 특성을 언급할 때, 향상은 통계상 유의한 향상이다.
핵산-단백질 기술
특이적 결합 특성을 갖는 FBS 도메인을 신속하게 제조하고 시험하는 한 방법은 브리스톨-마이어스 스퀴브 컴퍼니의 자회사인 애드넥서스의 핵산-단백질 기술이다. 핵산-단백질 융합체 (RNA- 및 DNA-단백질 융합체)를 활용하는, 프로퓨전 (Profusion)으로 불리는 상기 시험관내 발현 및 태그 부착 기술은 단백질에 대한 결합에 중요한 신규한 폴리펩티드 및 아미노산 모티프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 핵산-단백질 기술은 단백질을 그를 코딩하는 유전자 정보에 공유 커플링시키는 기술이다. RNA-단백질 기술 및 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 라이브러리 스크리닝 방법에 대한 상세한 설명에 대해서는, 본원에 참고로 포함되는 소스타크 (Szostak) 등의 미국 특허 6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018; PCT 공개 WO 00/34784; WO 01/64942; WO 02/032925; 및 문헌 [Roberts et al., Proc Natl. Acad. Sci. 94: 12297-12302 (1997)]을 참조한다.
벡터 및 폴리뉴클레오티드 실시양태
본원에 개시된 FBS 모이어티 및 PmXn 모이어티를 포함하는 임의의 다양한 단백질을 코딩하는 핵산은 화학적으로, 효소에 의해 또는 재조합 방식으로 합성될 수 있다. 코돈 사용 빈도는 세포 내에서 발현을 개선하도록 선택될 수 있다. 상기 코돈 사용빈도는 선택된 세포 종류에 따라 결정될 것이다. 특정 코돈 사용빈도 패턴이 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 박테리아, 및 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003)]; [Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002)]; [Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001)]; [Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-38 (Sep. 1996)]; 및 [Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)]을 참고한다.
핵산 조작을 위한 일반적인 기술은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 또는 [Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)] 및 그의 주기적인 최신판에 기재되어 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 포유동물, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 상기 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 대체로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주 내에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 포함된다.
본원에서 설명되는 단백질은 재조합 방식으로 직접, 및 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열로 대체된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들면 효모 인버타제 리더, 팩터 (factor) 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 알파-팩터 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 PCT 공개 WO 90/13646에 기재되어 있는 신호로 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열은 물론, 바이러스 분비 리더, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 이용가능하다. 상기 전구체 영역의 DNA는 단백질을 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 연결될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제가능하도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 것이고, 복제 기점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 조기 프로모터를 함유하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 또한 선택가능 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 핵심 영양소를 공급하는 단백질 (예를 들어, 바실루스에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)을 코딩한다.
효모에서 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주 (예를 들어, ATCC® No. 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC® 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
발현 및 클로닝 벡터는 대체로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터가 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해서 알려져 있다. 실질적으로 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시부로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT (서열식별번호: 109) 영역이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 단부에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA (서열식별번호: 110) 서열이다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 책임지는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현시에 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 특허 공개 73,657 및 PCT 공개 WO 2011/124718 및 WO 2012/059486에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는 해당 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴(ACTIN)® 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하는 시스템은 U.S. 특허 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 U.S. 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]를 참고한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 단백질 코딩 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 증강 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 폴리펩티드-코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5'의 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
진핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터도 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 보통 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때로는 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 절편을 포함한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 여기에 개시되어 있는 발현 벡터를 참조한다.
재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하기 위해 유용할 수 있는 임의의 종류의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예는 히스티딘 태그, FLAG® 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그를 포함하지만 그로 제한되지 않는다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 그의 관련 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)]에서 찾을 수 있다.
발현 구축물은 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이 숙주 세포에 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세입자 투사법; 리포펙션; 및 감염 (벡터가 감염성 물질인 경우)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포, 또는 박테리아 세포를 포함한다. 적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이 또는 바실루스(Bacillus) 종을 포함한다. 바람직하게는 사카로마이세스 종의 효모, 예컨대 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)도 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템이 문헌 [Luckow et al., Bio/Technology, 6:47 (1988)]에서 검토되었다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 단백질은 재조합 단백질을 발현시키기 위해 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조된다. FBS 단백질은 이어서 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제된다.
단백질 생산
숙주 세포는 단백질 생산을 위해 본원에서 설명되는 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절한 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
단백질을 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예컨대 햄 (Ham)의 F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 (Dulbecco)의 변형 이글 배지 (Modified Eagle's Medium) (DMEM, 시그마)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 또는 5,122,469; PCT WO90/03430; WO87/00195, 또는 미국 특허 RE30,985에 기재된 임의의 배지도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 상기 배지는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신 약물), 미량 원소 (대체로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 규정되는), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필수 보충물이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것이고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에 개시된 단백질은 또한 세포 미함유 번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 상기 목적을 위해, 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA를 생산하기 위해 시험관내 전사를 허용하고 이용되는 특정 세포 미함유 시스템 (진핵생물, 예컨대 포유동물 또는 효모 세포 미함유 번역 시스템 또는 원핵생물, 예컨대 박테리아 세포 미함유 번역 시스템)에서 mRNA의 세포 미함유 번역을 허용하도록 변형되어야 한다.
단백질은 또한 화학적 합성에 의해 (예를 들어, 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)]에 기재된 방법에 의해) 생산될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본원에 개시된 단백질은 일반적으로 단백질 화학 분야에 알려진 단백질에 대한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비-제한적인 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 또는 황산나트륨을 사용한), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 역류 분배 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제 후에, 단백질은 상이한 완충제 내로 교환되고/되거나 여과 및 투석을 포함하지만 그로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 농축될 수 있다.
정제된 단백질은 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 순수하다. 순도의 정확한 수치값과 무관하게, 단백질은 제약 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.
예시적인 용도
변형된 FBS 단백질은 PmXn 모이어티의 부가에 의해 변형되지 않은 FBS 단백질이 사용될 수 있는 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원은 질환의 치료에 유용한 변형된 FBS 모이어티를 포함하는 단백질을 제공한다. 치료될 수 있는 질병 또는 장애는 FBS 모이어티의 결합 특이성에 의해 결정될 것이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 변형된 FBS 모이어티는 임의의 관심 표적에 결합하도록 설계된다. 예시적인 표적은 예를 들어, TNF-알파, VEGFR2, PCSK9, IL-23, EGFR 및 IGF1R을 포함한다. 단지 하나의 예로서, TNF-알파에 결합하는 변형된 FBS 모이어티는 자가면역 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선 및 천식을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 변형된 FBS 단백질은 또한 암을 치료하기 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 질환, 예를 들어 암이 존재하는 대상체의 치료 방법은 대상체에게 변형된 FBS-약물 접합체를 투여하는 것을 포함한다.
단백질을 대상체에게 투여하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 포유동물, 특히 인간에게 제약상 허용된다. "제약상 허용되는" 조성물은 유의한 유해한 의학적 결과 없이 동물에게 투여되는 조성물을 의미한다. 제약상 허용되는 조성물의 예는 인테그린-결합 도메인 (RGD)이 결여된 FBS 모이어티를 포함하는 조성물 및 본질적으로 내독소 또는 발열원 비함유 또는 매우 낮은 내독소 또는 발열원 수준을 갖는 조성물을 포함한다.
본원에서 설명되는 변형된 FBS 단백질은 시험관내 또는 생체내 검출 검정에서의 그의 용도를 포함한다. 예를 들어, 이들은 샘플 내의 표적 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 샘플을 본원에서 설명되는 변형된 FBS와 접촉시키고, 여기서 상기 접촉은 FBS-표적 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 수행되고; 상기 복합체를 검출하여, 상기 샘플 내의 상기 표적을 검출하는 것을 포함한다. 검출은 임의의 관련 기술 분야에서 인정된 기술, 예컨대 방사선 촬영, 면역학적 검정, 형광 검출, 질량 분광 분석, 또는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 수행할 수 있다. 샘플은 인간 또는 다른 포유동물로부터 유래한 것이다. 진단 목적을 위해, 적절한 작용제는 전체 신체 영상화를 위한 방사성 동위원소를 포함하는 검출가능한 표지, 및 샘플 시험을 위한 방사성 동위원소, 효소, 형광 표지 및 다른 적합한 항체 태그이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 변형된 FBS는 다양한 진단 및 영상화 적용 분야에 유용하다. 특정 실시양태에서, 변형된 FBS는 생체 내에서 검출가능한 모이어티로 표지되고, 상기 표지된 FBS는 예를 들어 전체 신체 영상화를 위한 생체내 영상화제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체 내의 제시된 항원을 포함하는 종양을 검출하는 방법은 대상체에게 검출가능한 표지에 연결된 변형된 FBS를 투여하고, 적절한 시간 후에 대상체에서 표지를 검출하는 것을 포함한다.
FBS 영상화제는 제시된 항원의 증가된 수준과 연관된 장애 또는 질환, 예를 들어 종양이 항원을 선택적으로 과다발현하는 암의 진단을 위해 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 제시된 항원에 특이적으로 결합하는 변형된 FBS는 항원과 연관된 병태가 치료되고 있는 대상체에서 항원 수준을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 FBS는 변형되거나 변형되지 않은 상태로 사용될 수 있고, 검출가능한 모이어티의 공유 또는 비-공유 부착에 의해 표지될 수 있다.
제제화 및 투여
본원은 본원에서 설명되는 단백질을 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 추가로 제공하고, 여기서 조성물은 필수적으로 내독소 및/또는 발열원을 함유하지 않는다.
단백질을 포함하는 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 설명되는 단백질을 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 수용액, 동결건조된 또는 다른 건조된 제제의 형태로 보관을 위해 제조된다 (Osol, A., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당체, 이당체, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈, 플루로닉(PLURONIC)® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는, 상보적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기 분자들은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
단백질은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐과 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐을 각각 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐내에 포획될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 [Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.
지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 본원에서 설명되는 단백질을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 루프론 데포(LUPRON DEPOT)® (락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 체내에 장시간 잔류하는 경우, 이들은 37℃에서 습도에 노출되었을 때 변성되거나 응집될 수 있어서, 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변할 수 있다. 관련 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통해 분자간 S-S 결합을 형성하는 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 달성할 수 있다.
통상의 기술자는 각각의 단백질의 투여량이 단백질의 종류에 따라 결정될 것임을 이해할 것이지만, 바람직한 투여량은 약 10 mg/제곱미터 내지 약 2000 mg/제곱미터, 보다 바람직하게는 약 50 mg/제곱미터 내지 약 1000 mg/제곱미터일 수 있다.
치료 용도를 위해, 단백질은 대상체에게 제약상 허용되는 투여 형태로 투여된다. 단백질은 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 근내, 피하, 관절내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 단백질은 또한 국소 및 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양내, 종양주위, 병변내, 또는 병변주위 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 잘 알려져 있고, 임상 상황 근거로서 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 결정할 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 약 1 mg/ml 내지 25 mg/ml의 인간 혈청 알부민을 함유하는 둘베코의 포스페이트 완충 염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스를 포함한다. 본 발명의 방법은 시험관 내에서, 생체 내에서, 또는 생체 외에서 실시될 수 있다.
동시-투여되든 순차적으로 투여되든 단백질 및 하나 이상의 추가의 치료제의 투여는 치료 용도를 위해 상기 설명된 바와 같이 시행될 수 있다. 동시-투여를 위한 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 동시-투여되는 특정 치료제의 종류에 따라 결정됨을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
동결건조되기보다는 수성 투여 형태 내에 존재할 때, 단백질은 대개 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 제제화될 것이지만, 이들 범위 밖의 넓은 변동이 허용된다. 질환의 치료를 위해, 단백질의 적절한 투여량은 치료할 질병의 종류, 질병의 중증도 및 경과, 단백질이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 치료의 경과, 환자의 임상력 및 융합체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 단백질은 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료기간에 걸쳐 투여된다.
예시적인 실시양태
1. 표적에 특이적으로 결합하는 단리된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS) 단백질이며, 여기서 FBS는 비-자연 발생 FBS이고, FBS는 아미노산 서열 PmXn으로 이루어진 모이어티에 그의 C-말단에서 연결되고, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1의 정수이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, PmXn 모이어티는 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 FBS 단백질에 비해 FBS 단백질에 향상된 특성을 제공하는 것인 단리된 FBS 단백질.
2. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 P (m은 1이고, n은 0임)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
3. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 PP (m은 2이고, n은 0임)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
4. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-150인 단리된 FBS 단백질.
5. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-10인 단리된 FBS 단백질.
6. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-5인 단리된 FBS 단백질.
7. 실시양태 1에 있어서, 모이어티가 PI, PC, PID, PIE, PIDK (서열식별번호: 61), PIEK (서열식별번호: 63), PIDKP (서열식별번호: 65), PIEKP (서열식별번호: 67), PIDKPS (서열식별번호: 69), PIEKPS (서열식별번호: 71), PIDKPC (서열식별번호: 73), PIEKPC (서열식별번호: 75), PIDKPSQ (서열식별번호: 77), PIEKPSQ (서열식별번호: 79), PIDKPCQ (서열식별번호: 81), PIEKPCQ (서열식별번호: 83), PHHHHHH (서열식별번호: 87) 또는 PCHHHHHH (서열식별번호: 86)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS 단백질이 Fn3 단백질인 단리된 FBS 단백질.
9. 실시양태 8에 있어서, Fn3 단백질이 10Fn3 단백질인 단리된 FBS 단백질.
10. 실시양태 9에 있어서, 10Fn3 단백질이 인간 10Fn3 단백질인 단리된 FBS 단백질.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열식별번호: 1에 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 FBS 단백질.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 루프 또는 하나의 스캐폴드 영역에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단리된 FBS 단백질.
13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 아미노산 서열
Figure 112016100173788-pct00012
(서열식별번호: 9)을 포함하고, 여기서 (X)u, (X)v, (X)w, (X)x, (X)y 및 (X)z는 야생형 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)로 이루어지거나 또는 대응하는 야생형 서열과 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함하고, 서열은 임의로 1-10개의 스캐폴드, N-말단 및/또는 C-말단 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 FBS 단백질.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열식별번호: 1에 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 FBS 단백질의 C-말단 아미노산 잔기는 PmXn으로 이루어진 모이어티에 융합되고, FBS 단백질은 서열식별번호: 1을 포함하는 야생형 10Fn3 분자에 의해 결합되지 않은 표적에 500 nM 미만의 Kd로 특이적으로 결합하는 것인 단리된 FBS 단백질.
15. 실시양태 14에 있어서, 서열식별번호: 1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 FBS 단백질.
16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, PmXn으로 이루어진 모이어티가 펩티드 결합을 통해 FBS 단백질의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는 것인 단리된 FBS 단백질.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, PmXn이 P 또는 PC인 단리된 FBS 단백질.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열식별번호: 1에 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 FBS 단백질의 C-말단 아미노산 잔기는 펩티드 결합을 통해 프롤린에 연결되고, FBS 단백질은 서열식별번호: 1을 포함하는 야생형 10Fn3 분자에 의해 결합되지 않은 표적에 500 nM 미만의 Kd로 특이적으로 결합하는 것인 단리된 FBS 단백질.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 있어서, PmXn의 적어도 하나의 X가 시스테인이고, 시스테인은 단리된 FBS 단백질.
20. 실시양태 19에 있어서, 시스테인이 이종 모이어티에 접합되는 것인 단리된 FBS 단백질.
21. 실시양태 20에 있어서, 이종 분자가 검출가능한 모이어티인 단리된 FBS 단백질.
22. 실시양태 20 또는 21에 있어서, 이종 분자가 약물 모이어티이고, 약물 모이어티 및 FBS가 FBS-약물 접합체를 형성하는 것인 단리된 FBS 단백질.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, PmXn 모이어티에 의해 부여되는 향상된 특성이 향상된 안정성인 단리된 FBS 단백질.
24. 실시양태 23에 있어서, 향상된 안정성이 Tm의 적어도 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃ 또는 그 초과의 증가인 단리된 FBS 단백질.
하기의 대표적인 실시예는 중요한 추가의 정보, 예시 및 지침을 포함하고, 이들은 그의 다양한 실시양태 및 그의 균등물에서 본 발명의 실행시에 변형될 수 있다. 이들 실시예는 본 발명의 예시를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 10Fn3 분자의 C-말단에 대한 프롤린의 부가에 의한 열안정성 향상
자연에서, 10Fn3은 피브로넥틴 유형 III 도메인의 긴 쇄의 일부이고; 10Fn3의 바로 하류의 도메인은 11Fn3으로 명명된다. 하기 서열은 10Fn3 (이탤랙체) 및 11Fn3 (굵게 표시됨) 도메인의 야생형 서열 및 이들 사이의 연결부 (밑줄로 표시됨)를 보여준다.
Figure 112016100173788-pct00013
(서열식별번호: 90)
10Fn3 및 10Fn3과 11Fn3 사이의 서열 정렬의 결정 및 NMR 구조를 기초로 하여 (Dickinson et al., "Crystal structure of the tenth type III cell adhesion module of human fibronectin", J. Mol. Biol., 36:1079-1092 (1994)), 상기 서열의 처음 2개의 잔기, 즉 RT는 10Fn3의 최종 베타 가닥의 일부 ("가닥 G")이고, 서열의 나머지, 즉 EIDKPSQ는 구조화된 제10과 제11 피브로넥틴 유형 III 도메인 사이의 가요성 링커이다.
10Fn3을 기초로 한 조작된 단백질 도메인의 C-말단은 그의 클로닝, 발현, 및 정제를 용이하게 하기 위해 야생형 서열로부터 종종 변형된다. 애드넥틴의 상이한 조작된 C-말단의 조사 동안, RTE로부터 RTP로의 돌연변이는 몇 개의 상이한 애드넥틴의 열안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 표 4는 상기 연구에 사용된 상이한 C-말단을 제시한다.
<표 4>
10Fn3과 11Fn3 사이의 야생형 링커 및 상기 연구에서 비교된 조작된 애드넥틴 C-말단 서열. "P 및 His-태그를 갖는 짧은 조작된 C-말단" 및 "PC를 갖는 짧은 조작된 C-말단"은 RTE로부터 RTP로의 돌연변이를 함유한다.
Figure 112016100173788-pct00014
그의 C-말단에서 상이한 몇 쌍의 애드넥틴을 비교함으로써 애드넥틴의 열안정성에 대한 RTE로부터 RTP로의 돌연변이의 효과를 시험하였다. 표 5는 그의 명칭, 표적, 및 열역학적 특성을 비롯하여 상기 연구에 사용된 애드넥틴의 쌍을 제시한다. 애드넥틴 1은 표적 X에 결합하는 애드넥틴이다. 나열된 모든 애드넥틴은 프로퓨전 (mRNA-디스플레이) 기술을 사용하여 고-복합 라이브러리로부터 선택하고, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 재조작된 C-말단을 가졌다. 전체 단백질 서열을 아래에 제시한다.
<표 5>
클론 명칭, C-말단, 표적, 및 융점 (PBS (pH 7.4) 내에서 0.5 mg/mL에서 시차 주사 열량 분석에 의해 결정). 애드넥틴 PRD-1414 및 PRD-1417을 40 kDa, 2-분지형 PEG (NOF, Cat. #GL2-400MA01)에 접합하였다.
Figure 112016100173788-pct00015
상기 실시예에서 사용된 단백질의 아미노산 서열:
ADX_2382_D09:
Figure 112016100173788-pct00016
(서열식별번호: 96)
ADX_5484_A03:
Figure 112016100173788-pct00017
(서열식별번호: 97)
ADX_2987_H07:
Figure 112016100173788-pct00018
(서열식별번호: 97)
ADX_5484_A04:
Figure 112016100173788-pct00019
(서열식별번호: 98)
PRD-1414:
Figure 112016100173788-pct00020
(서열식별번호: 99)
PRD-1417:
Figure 112016100173788-pct00021
(서열식별번호: 100)
상기 각각의 서열에서 "*"는 정지 코돈, 및 각각의 애드넥틴의 C-말단을 나타낸다.
N-말단 M은 각각의 단백질의 박테리아 발현 동안 제거되었다. 정제된 PRD-1414 및 PRD-1417 단백질 내의 C 잔기는 각각의 단백질의 특성화 전에 PEG에 접합되었다.
표 5에 제시된 바와 같이, C-말단에 야생형 글루탐산 대신에 프롤린을 함유하는 C-말단 (RTE로부터 RTP로의 돌연변이)을 갖는 애드넥틴은 더 높은 열안정성을 보인다. 상기 안정성의 증가는 인간 10Fn3과 11Fn3 사이의 천연 링커에 대해 모델링된 보다 긴 C-말단이 단지 프롤린 및 헥사히스티딘 정제 태그를 함유하는 더 짧은 조작된 C-말단으로 교체될 때 몇몇 예에서 관찰되었다. 향상된 열안정성은 또한 C-말단 프롤린의 부가시에 더 짧은 조작된 C-말단 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 갖는 10Fn3 단백질에서 관찰되었다. 안정성의 증가는 상기 특정 위치에서의 프롤린의 존재에 의한 것일 수 있다.
실시예 2: C-말단 프롤린을 갖는 제2 PCSK9 애드넥틴의 안정화
본 실시예는 또 다른 PCSK9 애드넥틴 분자의 열안정성이 C-말단 프롤린의 부가에 의해서도 향상됨을 보여준다.
본 실시예에서, PEG화 (40 kDa 분지형 PEG) PCSK9 애드넥틴 ADX_2013_E01의 C-말단은 NYRTEIEKPCQ (서열식별번호: 101)로부터 NYRTPC (서열식별번호: 102)로 변형되고, 열안정성을 TSF로 측정하였다. 상기 애드넥틴의 아미노산 서열은 WO 2011/130354에 제시되어 있다. 그 결과는 NYRTEIEKPCQ (서열식별번호: 101) C-말단을 갖는 PEG화 애드넥틴의 Tm은 70℃인 반면, NYRTPC (서열식별번호: 102) C-말단을 갖는 PEG화 애드넥틴의 Tm은 76℃임을 보여준다.
따라서, 상기 PCSK9 애드넥틴의 열안정성은 C-말단 프롤린의 존재에 의해 6℃ 향상된다.
실시예 3: 열안정성에 대한 다양한 C-말단의 비교
본 실시예는 그의 C-말단에 1개의 프롤린을 갖거나 갖지 않는 애드넥틴과 그의 C-말단에 2개의 프롤린을 갖는 애드넥틴의 열안정성의 비교를 보여준다.
실시예 1에서 설명된 2개의 애드넥틴 (PCSK9에 결합하는 ADX_2392_D09 및 미오스타틴에 결합하는 ADX_2987_H07) 및 상이한 표적에 결합하는 1개의 추가의 애드넥틴 (표적 X에 결합하는 애드넥틴 1)을 표 6에 나타낸 바와 같이 그의 C-말단에서 변형하고, 그의 열안정성 및 % 단량체를 결정하였다. 상이한 표적 (X)에 대한 애드넥틴 ("애드넥틴 1")도 동일한 C-말단 서열로 변형하였다. 열안정성은 TSF에 의해 결정하고, % 단량체는 SEC에 의해 결정하였다.
<표 6>
다양한 C-말단을 갖는 애드넥틴의 단량체 비율 및 열안정성
Figure 112016100173788-pct00022
표 6에 제시된 결과는 C-말단의 종류가 % 단량체에 대한 유의한 효과를 갖지 않지만, 융점 (Tm)에 대해서는 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 실시예 1에서 설명되는 바와 같이, NYRTPH6 (서열식별번호: 105)는 두 애드넥틴 모두에 대해 NYRTH6 (서열식별번호: 104)에 비해 열안정성을 증가시킨다 (PCSK9 애드넥틴에 대해 4℃ 및 미오스타틴 애드넥틴에 대해 6℃). 또한, 제2 프롤린의 존재는 단일 프롤린에 의해 제공되는 바와 유사한 안정화 효과를 제공한다.
따라서, 1 또는 2개의 C-말단 프롤린의 존재는 C-말단 프롤린(들)이 없는 동일한 분자에 비해 애드넥틴의 열안정성을 향상시킨다.
실시예 4: C-말단 프롤린의 부가는 용해도를 향상시킨다.
본 실시예는 C-말단 프롤린의 존재가 C-말단 프롤린이 없는 동일한 탠덤 애드넥틴에 비해 탠덤 애드넥틴의 용해도를 향상시킴을 입증한다.
탠덤 애드넥틴, 즉, 링커에 의해 연결되고 NYRTE (서열식별번호: 107) C-말단 또는 NYRTP (서열식별번호: 108) C-말단을 함유하는, 상이한 표적에 각각 결합하는 2개의 애드넥틴을 이. 콜라이 BLR 세포에 발현시키고, 30℃에서 발효시켰다. 프롤린이 없는 탠덤 애드넥틴의 역가는 1.2 g/L 가용성 단백질 및 2.8 g/L의 총 단백질이었고, 이것은 발현된 단백질의 43%가 가용성임을 나타낸다. 프롤린이 존재하는 탠덤 애드넥틴의 역가는 2.56 g/L 가용성 및 2.61 g/L 총 단백질이었다. 프롤린이 없는 탠덤 애드넥틴의 불용성 분획을 재생하고, 2.5 mg/mL에서 98% 순수하고 단량체인 용액을 얻은 후에도, 상기 단백질 조성물은 그의 표적에 대한 유의한 결합을 보이지 않았고, 이것은 단백질이 적절하게 재폴딩되지 않을 수 있음을 시사한다.
따라서, 2개의 단백질 사이의 유일한 차이는 C-말단에 E 대신에 P가 존재하는 것임을 고려할 때, 이 결과는 프롤린의 존재가 탠덤 애드넥틴의 향상된 용해도를 제공함을 시사한다.
배경, 상세한 설명, 도면의 간단한 설명 및 실시예에서 언급된 각각의 문헌 (특하, 특허 출원, 학술지 논문, 초록, 실험 매뉴얼, 도서, GENBANK® 기탁 번호, SWISS-PROT® 기탁 번호, 또는 다른 개시내용 포함)의 전체 개시내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 본 발명의 개별적인 측면에 대한 단일 예시로서 의도되는 본원에 개시된 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 하고, 기능적으로 동등한 임의의 실시양태가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에서 설명되는 것 이외에, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 상기 설명 및 개시내용으로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이고, 이 역시 유사하게 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 변형 또는 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 범위 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> STABILIZED FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD MOLECULES <130> 12257-WO-PCT <140> PCT/US2015/021466 <141> 2015-03-19 <150> 62/084,270 <151> 2014-11-25 <150> 61/955,975 <151> 2014-03-20 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser 65 70 75 80 Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 3 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile 20 25 30 Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val 35 40 45 Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val 50 55 60 Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro 65 70 75 80 Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 4 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 35 40 45 Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 5 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr 20 25 30 Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly 35 40 45 Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr 50 55 60 Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser 65 70 75 80 Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 6 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly 20 25 30 Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser 35 40 45 Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr 50 55 60 Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser 65 70 75 80 Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 7 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu 20 25 30 Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys 35 40 45 Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile 50 55 60 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys 65 70 75 80 Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 8 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp 1 5 10 15 Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr 20 25 30 Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser 35 40 45 Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 9 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(33) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(58) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (64)..(83) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (87)..(106) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (113)..(132) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (140)..(159) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 9 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Leu Ile Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 145 150 155 160 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 165 <210> 10 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(32) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(57) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(82) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(105) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(131) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (139)..(158) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 10 Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Leu Leu Ile Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser 145 150 155 160 Ile Asn Tyr Arg Thr 165 <210> 11 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(31) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(56) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (62)..(81) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(104) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (111)..(130) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (138)..(157) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 11 Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 20 25 30 Leu Ile Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile 145 150 155 160 Asn Tyr Arg Thr <210> 12 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(30) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(55) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (61)..(80) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(103) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (110)..(129) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (137)..(156) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 12 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu 20 25 30 Ile Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn 145 150 155 160 Tyr Arg Thr <210> 13 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(29) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(54) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (60)..(79) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(102) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (109)..(128) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(155) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 13 Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile 20 25 30 Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 65 70 75 80 Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr 145 150 155 160 Arg Thr <210> 14 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(28) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(53) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(78) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(101) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (108)..(127) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (135)..(154) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 14 Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr 65 70 75 80 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 115 120 125 Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 145 150 155 160 Thr <210> 15 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(27) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(52) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(77) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(100) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (107)..(126) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (134)..(153) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 15 Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Ser Trp 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Val 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr 115 120 125 Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 145 150 155 160 <210> 16 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(26) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(51) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(76) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(99) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (106)..(125) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (133)..(152) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 16 Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Ser Trp Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Val Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Ile 115 120 125 Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 145 150 155 <210> 17 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp 1 5 10 15 Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr 20 25 30 Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser 35 40 45 Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 18 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(26) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(51) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(76) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(99) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (106)..(125) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <220> <221> MOD_RES <222> (133)..(152) <223> Any amino acid and this region may encompass 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, or 6-7 residues, wherein some positions may be absent <400> 18 Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Ser Trp Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Val Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Ile 115 120 125 Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 145 150 155 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Asp Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Pro Arg Asp 1 <210> 23 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile 85 90 95 Asp Lys Pro Ser Gln 100 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 26 Met Gly Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 27 Met Gly Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 28 Met Gly Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 29 Met Gly Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 30 Met Gly Arg Asp Leu 1 5 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 31 Met Gly Asp Leu 1 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 32 Met Ala Ser Thr Ser Gly 1 5 <210> 33 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 33 Met Pro Ala Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Glu Thr Pro Ser Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ile Ser Trp Thr Pro Pro Arg Val Gln Ile Thr Gly Tyr Ile 20 25 30 Ile Arg Tyr Gly Pro Val Gly Ser Asp Gly Arg Val Lys Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Pro Ser Val Ser Ser Ala Thr Ile Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Ile Ser Val Ile Ala Leu Lys Asp Asn Gln Glu Ser 65 70 75 80 Glu Pro Leu Arg Gly Arg Val Thr Thr Gly Gly 85 90 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peptide" <400> 39 Lys Asp Asn Gln Glu Ser Glu Pro 1 5 <210> 40 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 40 Leu Asp Ala Pro Thr Asp Leu Gln Val Thr Asn Val Thr Asp Thr Ser 1 5 10 15 Ile Thr Val Ser Trp Thr Pro Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Pro Gly Glu Pro Lys Glu Leu Thr 35 40 45 Val Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Thr Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gly 50 55 60 Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Gln Glu Ser 65 70 75 80 Pro Pro Leu Val Gly Thr Cys Thr Thr 85 <210> 41 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 41 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro 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Synthetic peptide" <400> 46 Gly Leu Lys Pro Gly 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Lys Gly Gly His Arg Ser Asn 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 49 Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 50 Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 51 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 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Synthetic peptide" <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 59 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(90) <223> /note="This region may encompass 1-3 "Pro" residues" <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(93) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(93) <223> /note="This region may encompass 1-3 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(100) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 60 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Xaa Xaa Xaa 100 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 61 Pro Ile Asp Lys 1 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 62 Pro Pro Ile Asp Lys 1 5 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Cys 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Pro Ile Glu Lys Pro Cys 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Pro Pro Ile Glu Lys Pro Cys 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Pro Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Pro Ile Glu Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 80 <211> 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 85 Pro His His His His His His 1 5 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 86 Pro Pro His His His His His His 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 87 Pro Cys His His His His His His 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 88 Pro Pro Cys His His His His His His 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Pro Val Gly Val Val 1 5 <210> 90 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val 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Synthetic polypeptide" <400> 98 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Thr Leu Pro His Ala Gly Arg Ala 20 25 30 His Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val 35 40 45 Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Arg Gly Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Thr Lys Val Ile His Tyr Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 85 90 95 Thr Pro His His His His His His 100 <210> 99 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 99 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Glu Gly Tyr Gly 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Val Ser Lys Gly Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr 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Xaa Xaa Xaa 145 150 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (2)..(11) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(11) <223> /note="This region may encompass 1-10 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 121 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (2)..(6) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> /note="This region may encompass 1-5 residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 122 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 123 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 123 Pro Ile 1 <210> 124 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 124 Pro Cys 1 <210> 125 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 125 Pro Ile Asp 1 <210> 126 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 126 Pro Ile Glu 1 <210> 127 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 127 Pro Xaa 1 <210> 128 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly 20 25 30 Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser 35 40 45 Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr 50 55 60 Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser 65 70 75 80 Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile 85 90 <210> 129 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" or " " <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Met" or " " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> /note="When only 1 position is present, the position may be Met or Gly. When two positions are present, the positions are Met-Gly. See specification for further explanation." <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 129 Met Gly Leu 1 <210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> VARIANT <222> (5)..(6) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 130 Pro Pro Pro Cys Cys Cys 1 5

Claims (24)

10Fn3 도메인을 포함하는 단리된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS) 단백질이며, 여기서 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 10Fn3 도메인의 위치 94에 대응하는 위치에서의 아미노산이 아미노산 서열 PmXn으로 이루어진 모이어티에 연결되고, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1의 정수이고, n은 0 또는 적어도 1의 정수이고, PmXn 모이어티는 PmXn 모이어티에 연결되지 않은 FBS 단백질에 비해 향상된 특성을 FBS 단백질에 제공하는 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 P (m은 1이고, n은 0임)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 PP (m은 2이고, n은 0임)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-150인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-10인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 PmXn으로 이루어지고, 여기서 n은 1-5인 단리된 FBS 단백질.
제1항에 있어서, 모이어티가 PI, PC, PID, PIE, PIDK (서열식별번호: 61), PIEK (서열식별번호: 63), PIDKP (서열식별번호: 65), PIEKP (서열식별번호: 67), PIDKPS (서열식별번호: 69), PIEKPS (서열식별번호: 71), PIDKPC (서열식별번호: 73), PIEKPC (서열식별번호: 75), PIDKPSQ (서열식별번호: 77), PIEKPSQ (서열식별번호: 79), PIDKPCQ (서열식별번호: 81), PIEKPCQ (서열식별번호: 83), PHHHHHH (서열식별번호: 87) 또는 PCHHHHHH (서열식별번호: 86)로 이루어진 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 LEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)wFTV(X)xATISGL(X)yYTITVYA(X)zISINYRT(서열식별번호: 16)을 포함하고, 여기서 (X)u, (X)v, (X)w, (X)x, (X)y 및 (X)z는 각각 서열식별번호: 1의 AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프 및 FG 루프에 해당하거나 또는 대응하는 야생형 루프 서열과 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함하는 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PmXn이 P 또는 PC인 단리된 FBS 단백질.
제9항에 있어서, PmXn이 P인 단리된 FBS 단백질.
제9항에 있어서, PmXn이 PC인 단리된 FBS 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PmXn의 적어도 하나의 X가 시스테인인 단리된 FBS 단백질.
제11항에 있어서, PmXn 모이어티가 PmCXn 또는 PmXn1CXn2이고, 여기서 C는 시스테인이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1의 정수인 단리된 FBS 단백질.
제12항에 있어서, 시스테인이 이종 모이어티에 접합되는 것인 단리된 FBS 단백질.
제14항에 있어서, 이종 분자가 검출가능한 모이어티인 단리된 FBS 단백질.
제14항에 있어서, 이종 분자가 약물 모이어티이고, 약물 모이어티 및 FBS가 FBS-약물 접합체를 형성하는 것인 단리된 FBS 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PmXn 모이어티에 의해 부여되는 향상된 특성이 향상된 안정성인 단리된 FBS 단백질.
제17항에 있어서, 향상된 안정성이 Tm의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃ 또는 그 초과의 증가인 단리된 FBS 단백질.
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