JP2013534252A - ヒドロキシアパタイト樹脂から樹脂を劣化させずにタンパク質を溶出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年8月18日に出願された米国仮特許出願第61/374,750号および2010年9月8日に出願された米国仮特許出願第61/380,919号の恩典を主張するものである。両仮出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、ヒドロキシアパタイト樹脂、およびタンパク質溶出におけるそれらの使用に関する。
ヒドロキシアパタイトは、親和性、イオン交換、または疎水性相互作用を伴う保持プロトコルを使用したタンパク質の分離および精製において有用であることが公知である。ヒドロキシアパタイトは、宿主細胞タンパク質、会合体、内毒素、およびDNA由来の遺伝子組換えタンパク質の精製において、特に有用である。ヒドロキシアパタイトカラムのタンパク質負荷は、一般的に、ヒドロキシアパタイト表面へのタンパク質の吸着を促進する条件である、2mM〜5mMのリン酸緩衝液を用いてpH6.5において行われる。場合によって、吸着は、少量のNaClまたはKClを含ませることによってさらに促進される。タンパク質負荷の前に、樹脂は、一般的に、負荷緩衝液と同じ強度の緩衝液および同じpHに平衡化される。平衡化緩衝液および負荷緩衝液は両方とも、ヒドロキシアパタイト表面をヒドロキソニウムイオン(H3O+)で飽和させる。残念ながら、これらのイオンは、溶出の間に典型的に遭遇する酸性条件に起因して、タンパク質の溶出の間に脱離する傾向にあり、これが、樹脂の経時的劣化の原因となる。
本明細書において説明される溶出緩衝液に含ませるためのカルシウムイオンは、典型的には水溶液である当該溶出緩衝液に可溶な任意のカルシウム塩であって、当該溶出緩衝液の他の成分、ヒドロキシアパタイト樹脂、および当該樹脂に保持されているタンパク質、ならびに多くの場合、タンパク質の抽出を試みる供給源溶液の残りの成分、に対して不活性であるカルシウム塩によって供給され得る。カルシウムのハロゲン化物塩が、使用にとって好都合であり、塩化カルシウムは特に都合が良い。本明細書の趣旨のある特定の態様において、最も良い結果は、溶出緩衝液中における約25ppm〜約260ppmのカルシウムイオン濃度によって達成されるであろう。代替の範囲は、約40ppm〜約200ppmであり、さらなる代替の範囲は、約50ppm〜約150ppmである。
およそ12グラムの40μm粒子のヒドロキシアパタイトを充填したカラムにおいて、pH6.5において5mMのリン酸イオンおよび100MのNaClを含有する適用緩衝液を使用してオボアルブミンをセラミックヒドロキシアパタイトI型に固定した。次いで、当該固定されたオボアルブミンを、pH5.6において、3.0mMの塩化カルシウム、30mMのリン酸塩、および20mMのMES(2−(N−モルホリノ)−エタンスルホン酸)を含有する溶出緩衝液を適用することにより、溶出させた(当該溶出緩衝液はNaClを含有しない)。溶出プロファイルを図1A、1B、および1Cに示しており、図1Aは、時間に対する光学濃度を示しており、図1Bは時間に対するpHを示しており、図1Cは時間に対する導電率を示している。12分にカラムの衛生化、36分にpH調節、および108分にタンパク質の負荷を実施した。154分に溶出が始まり、続いて、240分に中和を、および252分に再生を開始した。108分に始まる光学濃度における低い上昇は、カラムに固定されずに通過する少量のタンパク質を示しており、154分に始まる光学濃度のピークは、カラムからのオボアルブミンの溶出を表しており、中和段階(240分)に始まる光学濃度のピークは、オボアルブミン中の不純物質の溶出を表している。
この実施例は、低濃度リン酸塩、高濃度塩の溶出緩衝液において実施した以外、実施例1の繰り返しである。溶出緩衝液は、30mMの代わりに11mMのリン酸塩を用い、さらに550mMのNaClを含有しており、他のすべての成分および操作条件は同じである。溶出プロファイルを図2A、2B、および2Cに示しており、それぞれ、時間に対する光学濃度、時間に対するpH、および時間に対する導電率を表している。108分に始まる光学濃度の低い上昇は、図1Aと同様に、カラムに固定されずに通過する少量のタンパク質を示しており、中和段階(240分)に始まる光学濃度のピークは、やはり、オボアルブミン中の不純物質を表している。
この実施例は、溶出緩衝液のリン酸濃度を34mMに増加させ、他のすべての材料および条件は同じにおいて、実施例2を繰り返した。溶出プロファイルを図3A、3B、および3Cに示しており、それぞれ、時間に対する光学濃度、時間に対するpH、および時間に対する導電率を表している。オボアルブミンによるカラムへの過負荷に起因するオボアルブミンの破過点が、144分に認められるが、180分のピークは、高濃度リン酸溶出緩衝液によってカラムからのオボアルブミンの脱着が回復したことを示している。
この実施例は、pH5.6での、220mM(220ppm)のカルシウムイオン、22.9mMのリン酸塩、20mMのMES、および0.55MのNaClを含有する溶出緩衝液に対する繰り返し曝露におけるセラミックヒドロキシアパタイトの安定性を示している。上記の実施例と同様に、40ミクロンの粒径のセラミックヒドロキシアパタイトI型およそ12グラム(具体的には、11.97グラム)を含有するカラムを使用した。実験は、以下の一連の材料を当該カラムに34回通過させることによって実施した(タンパク質は含まれない)。
この実施例は、ヒドロキシアパタイトカラムにおいて高分子量会合体からモノクローナル抗体を精製するための、本発明の範囲内の溶出緩衝液の使用を示している。
Claims (20)
- タンパク質が固定されているヒドロキシアパタイトを含む固相から該タンパク質を溶出する方法であって、該固相に、約5.3〜約5.8のpHにおいて約25ppm〜約260ppmの濃度のカルシウムイオンおよび約2mM〜40mMの濃度のリン酸イオンを含む溶出液を通過させる工程を含む、方法。
- 溶出液がさらに、約30mM〜約2000mMの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 溶出液が、実質的に塩化ナトリウムを含有しない、請求項1記載の方法。
- カルシウムイオン濃度が約40ppm〜約200ppmである、請求項1記載の方法。
- カルシウムイオン濃度が約50ppm〜約150ppmである、請求項1記載の方法。
- リン酸イオン濃度が約15mM〜約35mMである、請求項1記載の方法。
- ヒドロキシアパタイトがセラミックヒドロキシアパタイトである、請求項1記載の方法。
- モノクローナル抗体および高分子量会合体を含む溶液において該会合体から該抗体を抽出する方法であって、
(i)該溶液を、ヒドロキシアパタイトを含む固相に適用する工程、および
(ii)該固相に、約5.3〜約5.8のpHにおいて、約50ppm〜約225ppmの濃度のカルシウムイオン、約5mM〜約40mMの濃度のリン酸イオン、約0.3M〜約1.5Nの濃度のアルカリ金属塩を含む溶出液を通過させて、該モノクローナル抗体を含有する溶出液を得る工程
を含む、方法。 - アルカリ金属塩が、ハロゲン化ナトリウム、ハロゲン化カリウム、硝酸ナトリウム、および硝酸カリウムからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- アルカリ金属塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- アルカリ金属塩が塩化ナトリウムである、請求項8記載の方法。
- ヒドロキシアパタイトからのタンパク質の溶出における使用のための溶出緩衝液であって、約5.3〜約5.8のpHにおいて約25ppm〜約260ppmの濃度のカルシウムイオンおよび約2mM〜約40mMの濃度のリン酸イオンを含む水溶液からなる溶出緩衝液。
- 水溶液がさらに、約30mM〜約2000mMの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項12記載の溶出緩衝液。
- 水溶液が実質的に塩化ナトリウムを含有しない、請求項12記載の溶出緩衝液。
- カルシウムイオン濃度が約40ppm〜約200ppmである、請求項12記載の溶出緩衝液。
- カルシウムイオン濃度が約50ppm〜約150ppmである、請求項12記載の溶出緩衝液。
- リン酸イオン濃度が約15mM〜約35mMである、請求項12記載の溶出緩衝液。
- 高分子量会合体からのモノクローナル抗体の抽出における使用のための溶出緩衝液であって、約5.3〜約5.8のpHにおいて約50ppm〜約225ppmの濃度のカルシウムイオン、約5mM〜約40mMの濃度のリン酸イオン、約0.3M〜約1.5Mの濃度のアルカリ金属塩を含む水溶液からなる溶出緩衝液。
- カルシウムイオン濃度が約50ppm〜約100ppmである、請求項18記載の溶出緩衝液。
- アルカリ金属塩が、約0.4M〜約0.8Mの濃度の水酸化ナトリウムである、請求項18記載の溶出緩衝液。
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