CN115135339A - 一种从完整的aav衣壳中分离或去除空的aav衣壳的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于在包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物中，从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法，其中该混合物在第一碱性环境中与带有伯胺基的固相表面接触，由此(i)完整的AAV衣壳与固相表面结合，而空的AAV衣壳至少部分不与固相表面结合，或(ii)完整的和空的AAV衣壳均与固相表面结合，随后空的AAV衣壳通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分洗脱，条件是第二碱性环境不从固相表面洗脱完整的AAV衣壳。

Description

一种从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法
本发明涉及一种使用固相萃取从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法。
重组腺相关病毒(AAV)的制剂通常由两个衣壳亚群组成。所需的衣壳适当地填充了其预期的治疗性的DNA有效载荷。这些被称为完整的衣壳。不纯的制备试剂还包含未填充其预期的DNA负载的衣壳。这些被称为空的衣壳。一些制剂可能含有90％或更多的空的衣壳，而另一些则少于50％。目前的临床指南建议空的AAV衣壳的含量减少到10％以下。这可以通过超速离心的方法来实现，但设备和工艺难以扩大规模，并且由于操作员的细微错误容易出现故障。许多人认为色谱法优于离心法。
用于从完整的AAV衣壳中分离空的AAV衣壳的色谱方法是已知的[1-3]。使用强阴离子交换剂，并在碱性pH条件下用盐梯度洗脱，已被证明可以充分减少许多AAV血清型的空的AAV衣壳。然而，结果有时在一个或多个方面是不充分的。首先，分离程度往往受到限制。已知有达到基线分辨率的情况，意味着对应于空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的峰完全分离，但这些是例外。各个洗脱峰通常在一定程度上重叠，有时基本上重叠，有时几乎完全重叠。这使得有必要牺牲与空的AAV衣壳重叠的完整的AAV衣壳，以消除足够的空衣壳。完整的衣壳的回收因此受到损害。
一个相关的折衷方案还涉及由强阴离子交换剂实现的有限分离：它给该技术的工业规模使用带来了负担。许多用户更喜欢在大规模色谱技术中使用阶梯梯度洗脱，因为它们更简单，并且可以节省设备、缓冲液制备、馏分收集和分析方面的资金。不幸的是，阶梯梯度受到重现性问题的影响，因为每个单独的过程变量在处理批次之间必须是不变的。在其他变量中，缓冲液在pH值和电导率方面的组成必须完全相同，色谱介质的组成必须完全相同，处理温度必须相同，等。这些参数在实际实践中都不是一成不变的，结果不可避免地会随着完整的AAV衣壳的恢复和/或空的AAV衣壳被消除的程度而变化。
线性梯度洗脱支持更好的重现性。由于材料或条件的变化，洗脱曲线可能会略有变化，但洗脱的完整的和空的衣壳的峰之间的相对关系不受这些变化的影响，并保持分离。然而，支持线性梯度洗脱的制造规模的设备更昂贵，需要更多的培训、更多的缓冲液、更多的馏分分析以及比阶梯梯度更多的时间。
第三个限制与在强阴离子交换剂上进行空-完整分离的极端化学条件有关。所需的pH值通常为9.0或更高，有时高达10.0或更高[1-3]。通常，pH越高，分离效果越好。不幸的是，由高于pH 9.0的pH值产生的化学应力会降低许多生物制品的稳定性，并且pH值越高于9，化学应力水平就越高。高度纯化的AAV衣壳的色谱图通常显示除了空的和完整的AAV衣壳外的峰，这些峰被解释为代表部分解离的衣壳和游离的衣壳蛋白。先前完好的完整AAV衣壳由于受损而释放的DNA也可能很明显。
术语强阴离子交换剂意为与带有季胺配体的色谱介质有关。形容词“强”特指它们在很宽的pH值范围内保持其全部电荷的能力，例如从大约pH 2.0到pH 12.0。商品名一般包括Q、QA、QAE，分别指季、季胺、季氨基乙基。强阴离子交换剂的其他名称包括TEAE(三乙氨基乙基)或TMAE(三甲氨基乙基)，它们对应于相同程度的胺衍生化，但命名惯例不同。TEAE和TMAE仍然描述了季胺配体。
衍生性较低的氨基色谱配体的例子以诸如DEAE(二乙氨基乙基)等名称广为人知。DEAE代表叔氨基配体。叔氨基配体是所谓的弱阴离子交换剂的例子，因为它们在相对有限的pH值范围内保持其全部电荷。DEAE配体在pH值低至7.5时开始失去电荷。它们在pH 9.0时失去了其大部分电荷，在pH 12时基本上失去了其所有电荷。pH 9.0时的低电荷转化为AAV的低容量，从而降低生产力。它还表明，与季氨基配体相比，较弱的阴离子交换配体，例如仲氨基或伯胺基配体，可能会产生更不利的结果。在这方面值得注意的是，像DEAE这样的弱交换剂很少被讨论用于分离空的和完整的AAV衣壳。
阴离子交换剂最常在固定的pH值下使用盐梯度洗脱，例如通过增加氯化钠浓度产生的盐梯度。它们有时会随着pH梯度的降低而被洗脱。强交换剂上的电荷在大约2到12的范围内保持恒定，但蛋白质上的电荷会发生变化。蛋白质的电负性随着pH的降低而变弱，而蛋白质的电正性变强。降低电负性意为降低对带正电荷的阴离子交换表面的吸引力。增加的电正性转化为增加来自带正电荷的阴离子交换表面的排斥力。这两种现象协同工作以实现随pH值下降的洗脱。将强阴离子交换剂暴露于上升的pH梯度会导致结合的组分结合得更牢固。
阳离子交换剂广泛用于AAV纯化，但最常使用盐梯度洗脱，导致空的和完整的AAV衣壳在一个峰中一起洗脱。它们也可以用pH梯度洗脱，但由于阳离子交换剂是带负电的，而阴离子交换剂是带正电的，因此阳离子交换剂的梯度洗脱需要递增的pH值。用递增的pH梯度洗脱阳离子交换剂能够在空的和完整的AAV衣壳之间实现一定程度的分离，但其分离程度不如强阴离子交换剂的盐洗脱所提供的分离。
概述
本发明是基于意外的发现，即完整的AAV衣壳与空的AAV衣壳的分离可以通过用伯胺基修饰的固相来实现。本发明的方法能够克服与去除空的AAV衣壳的已知方法相关的几个实际限制，该方法使用强(季胺)阴离子交换剂，所述阴离子交换剂在固定碱性pH下用递增的盐梯度洗脱[1-3]。本发明方法的主要实现特征是意外地发现，即，尽管不存在过量的盐，但可以通过在碱性范围内增加pH来选择性地去除大部分空的AAV衣壳。这与空的AAV衣壳在已知阴离子交换方法中的表现相反，在所述已知阴离子交换方法中，在没有过量的盐的情况下，衣壳的结合力在碱性pH值下很强[1-3]，在更高的pH值下变得更强。本文中的术语“过量的盐”是指超出用于控制操作溶液pH值的缓冲成分的盐，例如氯化钠(NaCl)或其他可添加到Tris缓冲液或双三丙烷(Bis-Tris-propane)缓冲液或其他缓冲液中以实现洗脱结合组分的盐。
在一般方面，本发明涉及一种使用固相萃取，从含有完整的和空的AAV衣壳的水性混合物中，从空的AAV衣壳中分离或去除完整的AAV的方法，其中含有完整的和空的AAV衣壳的水性混合物与带有伯胺基的固相接触。
在另一个方面，本发明涉及一种用于在包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物中，在完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法，其中所述混合物在第一碱性环境中与带有伯胺基的固相表面接触，由此
(i)完整的AAV衣壳与固相表面结合，而空的AAV衣壳至少部分不与固相表面结合，或
(ii)完整的和空的AAV衣壳都与固相表面结合，随后通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分地洗脱空的AAV衣壳，条件是第二个碱性环境不会从固相表面洗脱完整的AAV衣壳。
在本发明的一个实施方案中，第一碱性环境的pH值可以是pH>7，具体的地是pH>7至pH 8。
在本发明的另一个实施方案中，第二碱性环境的pH值可以大于第一环境的pH值。在本发明的又一个实施方案中，在空的AAV衣壳至少部分洗脱后，固相表面可以与第三碱性环境接触，所述第三碱性环境的pH值大于第二环境的pH值。
在本发明的又一个实施方案中，在空的AAV衣壳至少部分洗脱后，固相表面可以与第四碱性环境接触，第四碱性环境的pH值小于第三或第二碱性环境的pH值并且与第一、第二或第三碱性环境的盐浓度相比具有更高的盐浓度。
根据本发明，所述第二碱性环境的pH值尤其可以在pH 8.0至pH 9.0、pH 8.1至pH8.9、pH 8.2至pH 8.8、pH 8.3至8.7或pH 8.4-8.6的范围内。
根据本发明，所述第三碱性环境的pH值尤其可以在pH 8.5至pH 10.5、或pH 8.5至10.0、或pH 8.5至9.5的范围内。
所述第一、第二或第三pH值的pH范围值的重叠是虚拟的。本领域技术人员容易知道，如果所述第一碱性环境的pH值已选为pH 8(pH>7至pH 8的范围跨度)，则所述第二碱性环境的相应pH值应选自从pH 8.0到pH 9.0的范围，这意味着所述第二个碱性环境的pH值不能是pH范围的最低值，即pH 8，而是更高的值，例如8.1或8.2，等等。关于所述第二和第三碱性环境的pH范围的虚拟重叠，同样的考虑也是正确的。
在本发明方法的另一个实施方案中，盐浓度高达1M，对应于碱金属盐例如NaCl的浓度，具体地是1mM至1,000mM，或2.5mM至250mM，例如2.5mM，或5mM，或12.5mM，25mM，或50mM，或100mM，或150mM，或200mM，或250mM。
在本发明的一个具体实施方案中，碱性环境可包含镁离子浓度在1.0mM至5.0mM，特别是1.5mM至3.0mM，或2.0mM至2.5mM范围内的镁盐。
本发明的一个有利方面是这样一个事实，即完整的和空的AAV衣壳可以是任意血清型，特别是选自下组的：天然和重组血清型、嵌合型(混合型)及其组合。
本发明的方法可以应用在本领域常用的任何装置中，例如可以将带有伯胺基基团的固相表面布置在色谱装置中。通常，带有伯胺基的固相表面可以是一个整体柱、填充颗粒柱、填充纳米纤维柱、膜吸附器或水凝胶。
本发明的主题还在于，具有带有伯胺基的固相表面的固相萃取材料的用途，用于分离或去除，包含空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的水性混合物中的空的AAV衣壳。
在本发明的方法之前、或之后、或前后，有额外的处理步骤，以将空的衣壳含量减少到，比任何一个处理步骤本身可以实现的程度更大的程度。目前已知可用于减少空的衣壳的量的额外处理步骤包括，使用季胺离子交换剂的离子交换色谱法和密度梯度超速离心法。在一个实施方案中，本发明与在季阴离子交换剂上的离子交换色谱的组合，可以产生具有足够低浓度的空的衣壳的完整衣壳的部分，从而不需要额外的处理来去除空的衣壳。所述的两个步骤可以按任何顺序执行。在另一个实施方案中，在本发明的方法之后可以进行密度梯度超速离心。在另一个实施方案中，本发明与在季胺阴离子交换剂上的离子交换色谱的组合之后可以进行密度梯度超速离心。
还没有关于本发明起作用的具体机制或机理被开发出来；只知道其从根本上不同于已知的阳离子交换或阴离子交换色谱，并且与强阴离子交换剂上的盐洗脱标准相比，其实现了空的AAV衣壳与完整的AAV衣壳的出色分离。分离的优越性是指以下三个属性的任意组合：分离可以在有利于保持完整的衣壳的稳定性的温和化学条件下进行，和/或增加空的和完整的AAV衣壳之间的分离程度，和/或分离程度足以使阶梯梯度洗脱成为可行的方法。
所述方法可用于进行分析或制备应用。所述方法适用于所有AAV血清型。空的和完整的AAV衣壳之间的特定色谱条件和分离程度，可能在血清型之间、以及在血清型内的不同重组构建体之间有所不同。这是用已知的离子交换色谱方法进行的空-完整分离的众所周知的特征，并且简单地反映了不同AAV血清型之间衣壳表面化学性质的自然变化。
附图说明
图1显示通过季氨基固相与伯胺基固相的盐洗脱，分离空的AAV衣壳与完整的AAV衣壳的结果的比较。
图2显示季氨基固相盐洗脱，与通过递增的pH梯度伯胺基固相洗脱，分离空AAV衣壳与完整AAV衣壳的结果的比较。
图3显示在空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳都结合的条件下，伯胺柱的平衡和加载结果，空的AAV衣壳通过第二次洗涤步骤去除，完整的AAV衣壳通过递增的pH梯度洗脱。
图4显示在空的AAV衣壳不结合的条件下，伯胺柱的平衡和上样结果，随后在降低pH值的同时、用增加的盐浓度，分步梯度洗脱完整的AAV衣壳。
图5至图10显示一系列实验的结果。将包含空的和完整的AAV8衣壳的样品应用于pH 8.0的带有伯胺基的固相。在每个实验中，上样的柱子用更高pH的缓冲液洗涤，然后以增加的pH梯度洗脱，最终在pH 9.5时结束。
图11：从梯度中相对回收的空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳，以图形方式显示。
图12：通过比较色谱图说明了存在镁离子或缺失镁离子对空的和完整的AAV衣壳洗脱的影响。
发明内容
术语“带有伯胺的固相”是指在其表面上主要或仅带有伯胺配体的固相，其中术语伯胺基配体描述的是一个氮原子通过单个共价键与两个氢原子中的中的每一个氢原子连接，并且还通过单个共价键与碳原子相连。仲胺应不存在于固相表面或含量占极少数。叔胺和季胺应不存在或含量仅占少数。不应存在带负电荷的残基。可以存在不带电荷的疏水或氢键残基。伯胺基配体可以通过配体碳原子直接共价连接至固相。或者，伯胺基配体可以通过将配体的碳原子共价连接到与固相共价连接的所谓间隔臂(spacer arm)而间接连接到固相。伯胺基配体也可以是与固相共价连接的聚合物结构的一部分。固相可以是一种或多种多孔膜、一种或多种纤维、一种或多种多孔或无孔颗粒、或整体柱(monolithic)固相，包括由单一聚合物混合物合成的整体柱，或首先合成为宏观骨架的整体柱，在其上合成含二级配体的聚合物相。可以在外壳中(in a housing)提供任何上述固相材料以促进色谱的进行。色谱固相的外壳通常称为色谱装置，经常称为色谱柱。
带有伯胺的色谱固相是已知的并且可商购获得。以在Toyopearl NH2-750F(Tosoh生物科学)的名称下销售的色谱固相为例，其中“NH2”是指伯胺[https://www.separations.eu.tosohbioscience.com/solutions/process-media-products/by-mo de/ion-ex-change/anion-exchange/toyopearl-nh2-750f]。营销材料表明伯胺配体是多胺形式，这意味着它是一种通过重复伯胺亚基以共价键方式固定在固相上的聚合物。另一个例子以Sartobind STIC PA(Sartorius)的名称销售，其中“PA”是指伯胺[www.sartorius.com/shop/ww/en/usd/sartobind-
Figure BDA0003809991180000061
-pa/c/M_Sartobind_STIC_PA]。营销材料表明伯胺配体为多胺形式，特别是聚烯丙胺，通过重复的伯胺亚基共价固定在固相上。所有主要的色谱固相生产商都生产表面具有胺衍生物的产品，这表明该领域具有在常规或实验基础上生产含伯胺固相所需的知识和资源。
鉴于含有伯胺的色谱固相可能无法以清楚地揭示其组成的方式命名，因此拥有一种分析方法来确定给定产品是否具有实施本发明的适当特性将是有用的。进行此测定的一种简单方法是用缓冲液(例如10mM Tris、10mM双三丙烷、15mM NaCl，pH 7.2)平衡待鉴定的色谱固相，应用由蛋白质标准品组成的样品用于等电聚焦，用平衡缓冲液洗涤固相，然后应用50柱体积(CV)线性梯度，从平衡缓冲液开始，到10mM Tris、10mM双三丙烷、15mM NaCl，pH9.5结束，用10CV保持在终点缓冲区。跨越线性梯度的蛋白质洗脱表明待鉴定的固相是含伯胺的固相。由含季胺的固相组成的实验对照可以平行进行。所述蛋白质不会洗脱。用于等电聚焦的蛋白质标准品可从包括ThermoFisher、Bio-Rad和Serva在内的各种供应商处购得。
在某些情况下，根据上述鉴定测试，带有聚乙烯亚胺(PEI)的固相可能允许洗脱具有碱性等电点的蛋白质，并且它们可能允许在空的衣壳和完整的衣壳之间进行一定程度的分离。线性PEI是一种含胺聚合物，其末端仅被伯胺占据，并且在聚合物的每个重复亚单元上都有仲胺。支化PEI聚合物还在分支点带有叔胺。已知PEI固相能够实现某些蛋白质的递减pH梯度分离，但与季胺固相一样，已知的仅有递增pH梯度洗脱。
术语“平衡的”或“平衡”是指对固相和/或样品进行的化学调节步骤，以产生特定的化学环境。固相通常通过将它们暴露于包含所需pH、盐分和盐浓度的缓冲液来调节。样品通常通过滴定pH值进行调节，有时通过稀释降低盐浓度，有时通过缓冲液交换技术，包括色谱法、或通过透析、或通过切向流过滤膜渗滤。在本发明中，可以设置平衡条件以使固相结合空的AAV衣壳和完整的衣壳，或者可以设置平衡条件，以使空的衣壳的子集，所述子集可能包括大部分或所有空衣壳，在上样过程中不与固相结合。几十年来，所有这些方法和选择一种或另一种的标准在本领域中都是众所周知的。
任何给定样品中的完整的和空的AAV衣壳可属于任意血清型，包括天然和重组血清型、包括嵌合型(混合型)和新血清型。应当理解，不同血清型的衣壳具有不同的电荷特性，包括空的AAV衣壳和完整的衣壳之间的不同电荷水平的区别，并且这种差异在血清型内的不同重组构建体中也可能是明显的。这很重要，因为这意味着任何给定制剂的特定行为可能会因伯胺基固相而异，因为它们也会因强阴离子交换剂而异。反过来，这意味着当将该方法应用于任何以前未尝试过的AAV样本时，可能需要进行某种程度的优化，在强阴离子交换剂上用盐梯度分离空的和完整的AAV衣壳的已知方法也是如此。样品可以是以下的形式：细胞培养收获物、细胞裂解物、部分纯化的制备物例如来自亲和色谱柱的洗脱级分、从离子交换色谱柱洗脱的部分纯化的级分、从疏水相互作用色谱柱洗脱的部分纯化的级分、或来自用于处理AAV的任何其他纯化方法或方法组合获得的衣壳混合物。
术语“加载”是指使平衡的样品与平衡的伯胺基固相接触的过程。这通常使用色谱设备来完成，通过使样品受外力(例如受重力或泵送)来通过该设备。
术语“吸附”是指将生物产品结合到化学互补表面的过程。本发明中的互补性意为包括静电荷。AAV衣壳表面上的负静电荷介导它们吸附到固相表面的表面，所述固相表面已通过伯胺的共价固定化而呈现正电性。生物产品吸附到用于色谱法的固相上最常被称为“结合”。
术语“选择性吸附”是指允许至少一种物质吸附，同时防止一种或多种其它物质吸附的条件的应用。在本发明中，可以将操作pH值调节到碱性范围，以防止吸附不想要的空的AAV衣壳，同时允许吸附所需的完整的AAV衣壳。
术语“解吸”是指将生物产品从其先前吸附的化学互补表面释放的过程。在本发明中，这种解吸可以通过多种方式实现，包括但不限于降低生物产品(AAV)的电负性，例如通过降低pH；或通过降低固相的电正性，例如通过增加pH；或通过引入竞争物质(例如盐)来干扰静电相互作用；或这些方法的任意组合。从色谱介质中解吸生物产品通常称为洗脱。
术语“选择性解吸”指一种吸附物质通过改变条件从固相表面释放而使一种或多种其他物质仍被吸附的情况，然后另一组不同的条件导致不同物质从固相表面释放。条件的改变可以分步进行。条件的改变也可以连续的方式进行，导致弱结合的物质在连续体(continuum)的早期解吸，而强结合的物质在连续体的后期洗脱，理想情况下相互分离。
术语“洗涤”是指将加载的柱暴露于清洁缓冲液的过程，目的是从固相中置换未结合的物质。在本文中，术语“冲洗过的”具有相同的含义。在最基本的情况下，洗涤缓冲液与平衡缓冲液具有相同的配方。在更复杂的配置中，洗涤缓冲液可能具有从固相中置换一部分弱结合污染物的额外作用，以便可以在所需产物被洗脱之前将其去除。或者可能有不止一个洗涤步骤，其中第一个采用与平衡缓冲液相同的条件，但第二个采用从固相中置换出一部分弱结合污染物的条件，以便在洗脱前将其除去。
术语“洗脱”或“被洗脱”是指改变固体驻留(resides)所在的化学环境，以使伯胺基固相，与在加载和洗涤步骤后保持结合的物质之间的相互作用发生解离的过程。
从固相中去除空的AAV衣壳后，可以通过多种方法中的任一种，洗脱完整的AAV衣壳。如上所述，完整的AAV衣壳可以通过在不存在或过量盐的情况下进一步增加pH值来洗脱。去除空的AAV衣壳后，可通过在盐存在下增加pH值来洗脱完整的AAV衣壳。去除空的AAV衣壳后，可通过引入过量的盐来洗脱完整的AAV衣壳，同时保持pH不变。去除空的AAV衣壳后，可以通过在降低pH值的同时引入过量的盐来洗脱完整的AAV衣壳。
以下一系列基本方法选项的一般的、非限制性的描述，说明了如何执行该方法的变通，并为更详细地讨论操作变量提供了一个平台。应理解，在这些场景中提到的缓冲液条件旨在提供如何实施该方法的一般概念，并且需要优化缓冲液配方以适应来自不同血清型的衣壳混合物，甚至是一种血清型的不同的重组构建体。
在一个实施方案中，仅利用递增的pH梯度进行洗脱，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱(monolith)，平衡到接近中性的pH值，例如20mM Tris、20mM双三丙烷，pH7.5±0.2。通过将缓冲液交换为20mM Tris、20mM双三丙烷、pH 7.5±0.2来平衡包含空的和完整的AAV衣壳混合物的样品。将样品加载到色谱装置上。然后用线性pH梯度洗脱所述色谱装置，从平衡缓冲液到20mM Tris、20mM双三丙烷、pH 9.5±0.2的终点缓冲液，超过20个设备体积、或超过50个设备体积、或超过100个设备体积，其中设备体积的数量用作调节梯度过程中pH变化速率的手段，也称，梯度斜率。这种方法可特别用于分析目的，因为全部空的衣壳和完整的衣壳群在梯度内被洗脱。作为开发制备使用条件的起点，它也可能很有价值。它也可用于制备应用，但要意识到这种方法可能会将完整的AAV衣壳暴露于可能对衣壳稳定性产生不利影响的一定范围内的pH值。
在一个实施方案中，仅利用递增的盐梯度进行洗脱，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱，其被平衡到弱碱性值，例如20mM Hepes pH 7.5±0.2。含有空的和完整的AAV衣壳混合物的样品通过缓冲液交换平衡到相同的条件。将样品加载到色谱装置上。所述色谱装置然后用线性氯化钠梯度，从20mM Hepes、pH 7.5±0.2的平衡缓冲液，到20mMHepes、200mM NaCl、pH 7.5±0.2的终点缓冲液洗脱，洗脱超过20个设备体积、或超过50个设备体积、或超过100个设备体积，其中，设备体积的数量用作调整梯度期间盐浓度变化速率的手段，亦即，梯度斜率。这种方法也可用于分析用途，因为如上所述，在样品加载过程中，所有空的衣壳和完整的衣壳都与伯胺基固相结合。空的和完整的AAV衣壳之间的分离程度通常不如使用递增的pH梯度洗脱，但仍优于使用强阴离子交换剂在固定pH下用盐梯度洗脱的分级(fractionation)。
在一个密切相关的实施方案中，仅利用递增的盐梯度进行洗脱，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱，平衡至弱碱性pH值，例如10mM Tris、10mM双三丙烷，pH 8.7±0.2。含有空的和完整的AAV衣壳混合物的样品通过缓冲液交换平衡至相同条件并加载于固体表面。然后所述色谱装置用线性氯化钠梯度从10mM Tris、10mM双三丙烷、100mM NaCl、pH8.7±0.2的平衡缓冲液，洗脱超过20个设备体积、或超过50个设备体积、或超过100个设备体积，其中设备体积的数量用作调整梯度期间盐浓度变化率的手段，亦即，梯度斜率。这种方法也可用于分析用途，因为如上所述，在样品加载过程中，所有空的衣壳和完整的衣壳都与伯胺基固相结合。空的和完整的AAV衣壳之间的分离程度将优于在较低固定pH值下的盐梯度，并且通常优于通过强阴离子交换剂在固定pH下用盐梯度洗脱的分级，但通常差于使用递增的pH值梯度在伯胺基固相上的洗脱。
在利用混合pH-盐洗脱的实施方案中，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱，平衡至接近中性的pH值，例如20mM Hepes，pH 7.0±0.2。通过将缓冲液交换为20mMHepes，pH 7.0±0.2，平衡包含空的和完整的AAV衣壳混合物的样品。将样品加载到色谱装置上。在这些条件下，空粒子和完整的粒子都与固相结合。该装置用平衡缓冲液洗涤以去除未结合的物质。通过将化学环境暴露于具有更高pH值的缓冲液(例如20mM Tris，pH 8.5±0.2)来改变化学环境，从而将空的AAV衣壳从设备中清洗/洗脱。该缓冲液流过色谱装置，直到柱流出物的紫外吸光度达到基线。从设备中除去空的AAV衣壳后，通过暴露于pH值较低但含有过量盐的缓冲液(例如20mM Hepes、50mM NaCl、pH 7.0)再次改变化学环境。由于其温和的完整的衣壳的洗脱条件，这种方法可能有利于制备用途。它也被一些使用者认为是有利的阶梯梯度洗脱形式的一个例子。
在采用混合pH-盐洗脱的另一个实施方案中，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱，平衡到碱性pH，例如20mM Tris，pH 8.5±0.2。通过将缓冲液交换为20mM Tris，pH8.5±0.2，平衡包含空的和完整的AAV衣壳混合物的样品。将样品加载到色谱装置上。在这些条件下，完整的粒子与固相结合，但空粒子无法这样做。从设备中除去空的AAV衣壳后，通过暴露于pH值较低但含有少量盐的缓冲液(例如20mM Hepes、50mM NaCl、pH 7.0)再次改变化学环境。这种方法在程序上比以前更简单，因此对制备使用很有吸引力。然而，它可能会降低完整的AAV衣壳的结合能力，因为平衡条件接近阈值会干扰完整的衣壳的结合。
在以另一种方式用pH和盐洗脱完整的AAV衣壳的实施方案中，将色谱装置形式的伯胺基固相，例如整体柱，被平衡至接近中性的pH值，例如20mM双三丙烷，pH 8.5±0.2。通过将缓冲液交换为20mM双三丙烷,pH 8.5来平衡包含空的和完整的AAV衣壳混合物的样品。将样品加载到色谱装置上。然后用线性盐梯度洗脱色谱设备，从平衡缓冲液(pH 7.5)，到20mM双三丙烷、100mM NaCl、pH 8.5的终点缓冲液，超过20个设备体积、或超过50个设备体积、超过100个装置体积，其中装置体积的数量用作调整梯度期间盐浓度变化速率的手段，亦即，梯度斜率。初步数据表明，盐梯度支持空的和完整的AAV衣壳的分离，类似于强阴离子交换剂实现的分离，并且与强阴离子交换剂相比条件更温和，但与pH梯度相比仍然逊色。在大多数情况下，盐梯度的pH值越高，空衣壳和完整衣壳之间的分辨率就越好。
对于本领域的有经验的从业者来说显而易见的是，来自上述任何一种基本形式的一个或多个相应元素可以以其他形式应用。例如，可以应用洗脱梯度，同时改变pH值和盐浓度，两个参数上升，或者一个或另一个参数上升而另一个下降；单步洗脱可转换为多步洗脱；线性梯度洗脱可转换为阶梯洗脱；在显着减少仍然结合的量但不能完全消除它们的步骤之后，可以应用线性梯度洗脱；在导致大多数空的AAV衣壳不结合的平衡条件下加载后，可以应用线性梯度洗脱。这些变化和许多其他变化都可以在不偏离定义元素和方法的真正本质的情况下实现。
在一个实施方案中，将伯胺基固相和样品平衡到范围为pH 5.5±0.2至pH 8.5±0.2，或pH 6.0±0.2至pH 8.5±0.2，或pH 6.5±0.2至pH 8.5±0.2，或pH 7.0±0.2至pH8.5±0.2，或pH 7.5±0.2至pH 8.5±0.2的操作pH。应当理解，确切的条件可能因AAV的不同血清型变化，也可能因一个血清型内的不同重组构建体变化。对于已知耐受高pH范围的样品，pH范围可以扩大到更高。一般来说，这个范围内的pH值越高，结合的空的AAV衣壳就越少。任何以前未尝试过的AAV都需要进行简单的实验，以确定空的AAV衣壳无法结合而基本上所有完整的AAV衣壳都结合的pH值。在此范围内的pH值越低，完整的AAV衣壳将结合地越强，完整的衣壳的结合能力越高。然而，对于有经验的人员来说，空的AAV衣壳可能会与完整的AAV衣壳竞争结合空间，并且这种竞争可能会限制完整的衣壳的结合能力。这些是所有工业纯化方法开发过程中都会考虑的常规工艺优化问题。
在一些实施方案中，空的衣壳的结合在pH 8.5±0.2时未被暂停，并且特别希望避免可能危及衣壳稳定性的更高pH值，可将盐添加到平衡缓冲液中，例如2mM NaCl、或5mMNaCl、或10mM NaCl、或20mM NaCl、或之间的或更高的浓度。在适中的pH下实现暂停空的衣壳的结合的最低的盐浓度通常是最有利的。如果希望评估使用更高浓度来置换空的AAV衣壳，例如30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或之间的或更高的浓度，则可小心评估它们，以避免意外取代(displacement)和完整衣壳的损失。如果需要，可以考虑这种方法以减少空衣壳结合，特别是在酸性、中性或非常温和的碱性pH值下。
许多使样品平衡至加载样品到色谱柱上的条件的方法是本领域技术人员已知的。可以使用这些方法中的任何一种而不改变方法的本质。在这些方法中，有实验室规模的渗析法、切向流滤膜渗滤法和缓冲液交换色谱法。在某些情况下，可以通过将样品滴定至目标pH值来实现充分的样品平衡，如有必要，用水或低盐或不含盐的缓冲液稀释样品。
平衡提供了防止空的AAV衣壳结合的机会，但这样做的条件可能会削弱完整的AAV衣壳的结合，从而降低固相对于完整衣壳的能力。由于制备分离的一个特定目标是容纳所需的完整的衣壳的最大实际负载，因此洗涤提供了一种潜在的不太损耗的方法，以在洗脱前最大限度地减少空的衣壳的含量。给定最有效的洗涤条件，可以选择有利于所需完整的衣壳的高容量结合的平衡条件，这通常对应于中性或更低的pH和最少或没有额外的盐。
在一个实施方案中，用与用于平衡固相的缓冲液组成相同的缓冲液，洗涤负载有空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的混合物的伯胺固相。
在另一个实施方案中，负载有空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的混合物的伯胺固相用具有比平衡缓冲液更高的pH的缓冲液洗涤。例如，在pH 7.5下平衡和加载的伯胺固相，可能首先用，与用于平衡固相的缓冲液组成相同的缓冲液，洗涤，然后再用更高pH的缓冲液洗涤，例如pH 8.0±0.2、或pH 8.1±0.2、或pH 8.2±0.2、或pH 8.3±0.2、或pH 8.4±0.2、或pH 8.5±0.2、或pH 8.6±0.2、或pH 8.7±0.2。应当理解，确切的条件可能因不同的AAV血清型变化，也可能因一个血清型内的不同重组构建体变化。如果通过增加pH值没有完全去除空的AAV衣壳，则可以添加盐。例如，对于pH为8.5±0.2的缓冲液，NaCl可以以对应于2mM、或5mM、或10mM、或20mM或之间的或更高的浓度的量添加。
在相关实施例中，用不同于样品平衡pH条件的条件进行洗涤的方法，可以以简化整个方法的替代方式进行。样品和色谱柱可以平衡到不同的条件。具体而言，可将样品平衡至支持完整的衣壳最高容量结合的pH和/或盐浓度，而可将柱平衡至在完整的衣壳洗脱步骤之前能大量去除空的AAV衣壳的条件。例如，样品可以用50mM Hepes、pH 7.5±0.2平衡，而色谱柱用50mM Tris、pH 8.5±0.2平衡。当样品加载到色谱柱上时，它有将色谱柱至少部分重新平衡的作用，以适应样品的条件。在样品加载结束时，较高pH条件的平衡/洗涤缓冲液将立即开始置换在上样过程中结合的空的AAV衣壳，因此无需包括第二次洗涤步骤。缓冲液制备和整体方法将被简化。
在一个实施方案中，完整的AAV衣壳仅通过增加pH来洗脱。根据AAV衣壳的血清型，这可能包括单步洗脱，或多步梯度洗脱，或线性梯度洗脱至pH 8.6±0.2、或8.7±0.2、或8.8±0.2、或8.9±0.2、或9.0±0.2、或9.1±0.2、或9.2±0.2、或9.3±0.2、或9.4±0.2、或9.5±0.2，或更低、中间或更高的值。
认识到接近和超过9.0±0.2的pH值会增加破坏完整的AAV衣壳的风险，因此可以通过添加盐来缓和洗脱的pH。例如，pH达9.5±0.2的阶梯或梯度的洗脱，可以代替为在2mMNaCl、或5mM NaCl、或10mM的NaCl、或15mM NaCl、或25mM NaCl、或更低的、中间的或更高的值的存在下，以pH达8.5±0.2的阶梯或梯度进行洗脱。或者，通过添加盐，pH阶梯或梯度可在pH 8.0±0.2、或在pH 7.5±0.2、或在pH 7.0±0.2、或在pH 6.5±0.2、或在pH 6.0±0.2、或在pH 5.5±0.2，或在更低的、中间的或更高的值下进行。对本领域技术人员显而易见的是，添加的盐越多，pH越低。如果需要，可以将在任何pH值下添加的盐的量增加到2.5mM至250mM范围内的任何值，例如2.5mM、或5mM、或12.5mM、25mM、或50mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM、或更低的、中间的或更高的值。
任何上述实施方案可以在二价金属阳离子如镁和/或钙的存在下进行，其中任一种的浓度在0.1mM至10mM、或0.5mM至5mM、或1.0mM至2.75mM、或1.5mM至2.5mM、或1.75mM至2.25mM、或2.0mM±0.1mM，或更高的值，例如高达5mM。
在一个实施方案中，从分析的角度来看，包含二价金属阳离子如镁和/或钙可能是有利的，因为金属离子有助于保持空的AAV衣壳的完整性并倾向于导致空的衣壳作为单峰洗脱。这使得测量给定样本中的空的AAV衣壳的总量以及空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的相对数量变得更加容易。
在一些实施方案中，诸如镁和/或钙的二价金属阳离子的存在对于制备分离可能也是有利的，因为它们除了常常优化它们与空壳的分离之外，还稳定了完整的衣壳。
预计镁的存在通常会在AAV纯度和/或回收率方面产生更理想的结果。然而，其他实施方案可能包括二价金属离子例如镁和/或钙的缺乏或不存在。下述情况可能尤其如此：完整的AAV衣壳在所选的分离条件下表现出足够的稳定性；和，污染物的总体分布使得在不存在二价金属阳离子的情况下分级能够分离出完整的衣壳部分，与在这种二价阳离子存在下进行分离时相比，具有更少污染的空的AAV衣壳。
为了稳定完整的衣壳，和/或提高衣壳溶解度，和/或抑制衣壳和固相之间可能减少分离效率或降低完整的衣壳回收率的非特异性相互作用，和/或在分离过程中简单地降低电导率，可以在存在精氨酸或组氨酸的情况下进行任何前述实施方案效率。
在一些实施方案中，精氨酸或组氨酸可以直接取代NaCl或其他盐来进行梯度分离。精氨酸的水溶性限制在约600mM，组氨酸的溶解度限制在约200mM。精氨酸因其更高的溶解度而更便于使用，但即使组氨酸的溶解度更有限，也可以在许多情况下有效地使用它。
在不可能达到足以洗脱衣壳的精氨酸或组氨酸浓度的实施方案中，两者都可以与盐组合，例如包括精氨酸加氯化钠或组氨酸加氯化钠的组合。在一些这样的实施方案中，可以将基线水平的精氨酸添加到平衡、洗涤和/或洗脱缓冲液中，或仅添加到洗涤和洗脱缓冲液中，或仅添加到洗脱缓冲液中。这样的基线水平可能是25mM或50mM，或者在其溶解度范围内的中间浓度或更高浓度。
在另一个实施方案中，精氨酸或组氨酸可以在基线水平跨过上升的pH梯度使用，例如以5mM或10mM的浓度，或在其溶解度范围内的中间浓度或更高浓度。
任何上述实施方案可以在低分子量两性离子例如甘氨酸或丙氨酸或甜菜碱的存在下进行。此类添加剂可具有改善衣壳溶解度和稳定性而不增加导电性的效果。这种两性离子提高了极性，但对导电性没有贡献。它们也优先排除在蛋白质表面之外，这使得它们具有稳定作用。此类添加剂可能特别适用于与pH梯度结合以克服低电导率的脱溶作用，其中它们可能具有改善峰锐度和/或衣壳稳定性的作用。
在一些实施方案中，甜菜碱可在pH 5.0至pH 10.0范围内使用，而丙氨酸和甘氨酸将被限制在5.0至约8.5的范围内。pH值高于8.5时，甘氨酸和丙氨酸的氮原子开始失去正电荷，分子变为净电负性。这导致它们有助于样品的导电性，还暂停了它们的两性离子形式的其他正效应。甜菜碱上的氮原子是一种季胺，可将其电荷保持在大约pH 12左右，从而在整个范围内保持其两性离子形式。
在操作pH为8.5或更低的一个实施方案中，甘氨酸或丙氨酸的浓度可以高达2M或更高，或0.5M至2.5M，或1.0M至2.0M，或1.25M至1.75M，或1.4M到1.6M，或大约1.5M，或不同的范围。
在一个实施方案中，当pH小于10时，甜菜碱的浓度可高达2M或更高，或0.5M至2.5M，或1.0M至2.0M，或1.25M至1.75M，或1.4M到1.6M，或大约1.5M，或不同的范围。
任何上述实施方案都可以在糖存在的情况下进行，例如旨在稳定完整衣壳的糖。例子包括但不限于蔗糖、山梨糖醇、木糖、甘露糖醇、海藻糖或浓度范围为0.5％至25％或更高的其他非离子糖。
任何上述实施方案都可以在甘油存在的情况下进行，例如用于稳定完整衣壳的甘油，例如以0.5％至25％或更高的浓度。
任何上述实施方案都可以在有机添加剂的存在下进行，以使衣壳和伯胺基固相表面之间的非特异性相互作用最小化。这样的添加剂包括浓度范围为0.01％至1.0％的表面活性剂，包括非离子表面活性剂。这种添加剂还包括浓度范围为1％至10％的试剂，例如乙二醇或丙二醇。
本领域的技术人员将认识到，本发明的方法可以在除了伯胺基之外的配体上实施，这些配体要么完全缺乏更高度衍生的胺例如仲胺、叔胺或季胺，要么含有比例非常低。同样，可以认识到，通过包含疏水残基或介导衣壳和固相之间的氢键更多增加的残基来增强结果。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文中，其并入内容与本文的明确教导不矛盾。
本发明通过以下非限制性实施例进一步解释。
实施例
实施例1
通过季氨基固相与伯胺基固相的盐洗脱比较空的AAV衣壳与完整的AAV衣壳的分离。
将具有伯胺表面的100微升整体柱通过20mM双三丙烷、2mM氯化镁、pH 8.8平衡。将阳离子交换纯化的AAV 8样品施加到柱上并用平衡缓冲液洗涤。然后用50床体积的线性梯度洗脱整体柱，终点为20mM双三丙烷、2mM氯化镁、100mM NaCl，pH 8.8。除了梯度终点缓冲液中的NaCl浓度为200mM之外，在季胺(强阴离子交换单体，CIMac QA)上进行了相同的基本方法。两种色谱柱都无法完全分离空的和完整的AAV衣壳，但伯胺固相获得了更好的结果(图1)。
实施例2
通过升高pH洗脱的伯胺基固相分离空/完整的衣壳与使用盐梯度的强(季胺基)阴离子交换剂分离的比较。
将具有伯胺基表面的100微升整体柱通过10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 8.0平衡。将阳离子交换纯化的AAV 8样品施加到柱上并用平衡缓冲液洗涤。然后用100床体积的线性梯度洗脱柱子，终点为10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 9.5。将空的和完整的AAV衣壳的分离与用盐梯度洗脱的强阴离子交换(季胺)整体柱进行比较。用20mM双三丙烷、2mM氯化镁、pH 9.0平衡强阴离子交换整体柱。将阳离子交换纯化的AAV 8样品施加到柱上并用平衡缓冲液洗涤(与用于伯胺柱实验的样品相同)。然后用50柱体积的线性梯度洗脱柱子，终点为20mM双三丙烷、2mM氯化镁、200mM氯化钠、pH 9.0。比较结果如图2所示。如图所示，在不存在过量盐的情况下，采用递增的pH梯度洗脱伯胺柱显着优于使用盐梯度的强阴离子交换剂实现的分离。除了展示空的衣壳和完整的衣壳的出色分离外，其他污染物的洗脱顺序也证明了伯胺柱与强阴离子交换剂相比具有完全不同的选择性。在强阴离子交换剂上的空的AAV衣壳之前洗脱的污染物，在伯胺柱上的完整的AAV衣壳之后洗脱并更好地分离。
实施例3
在完整衣壳的pH梯度洗脱之前通过洗涤步骤去除结合的空的AAV衣壳。
将伯胺整体柱通过10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 8.0平衡。将阳离子交换纯化的AAV 8样品施加到柱上并用平衡缓冲液洗涤(与用于实施例2的样品相同)。然后用10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 8.7的洗涤步骤去除空的AAV衣壳。然后将柱恢复到其原始平衡条件并用40床体积的线性梯度洗脱，终点为10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 9.5。结果如图3所示。该实验证明了在弱碱性pH(8.0)下伯胺柱结合空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳，然后支持以递增的pH梯度(至pH 9.5)选择性去除空的AAV衣壳，均在没有过量盐的存在下。
实施例4
在空的AAV衣壳不结合的条件下进行平衡，然后通过一个步骤洗脱完整的AAV衣壳，同时增加盐浓度并降低pH值。
将伯胺整体通过10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、pH 8.5平衡。将阳离子交换纯化的AAV 8样品施加到柱子上并用平衡缓冲液洗涤(与用于实施例2和3的样品相同)。在这些条件下，空的AAV衣壳大多无法结合，并且在长时间洗涤过程中几乎完全消除。然后将完整的AAV衣壳从柱中洗脱，步骤为10mM双三丙烷、10mM Tris、2mM氯化镁、50mM NaCl、pH7.5。结果如图4所示。该实验特别记录了伯胺柱利用高度简化的阶梯梯度方法将空的AAV衣壳与完整的AAV衣壳分离的能力，以适应最简单的色谱仪器。
实施例5
以下实施例说明了本发明方法的方法，从pH 8开始，采用不同的方法通过增加pH来分离空的AAV衣壳。
据了解，不同血清型的衣壳对相同条件的反应不同，并且需要针对每种不同的产品单独调整条件。这一系列图说明了筛选来自任何血清型的衣壳以获得最有效的条件非常容易。
在一系列实验中，将含有空的和完整的AAV8衣壳的样品应用于pH 8.0的带有伯胺基的固相(20mM Tris，20mM双三丙烷)。在每个实验中，上样的柱子用更高pH的缓冲液(20mMTris、20mM双三丙烷)洗涤，然后以增加的pH梯度洗脱，在pH 9.5时结束(20mM Tris 20mM双三丙烷)。原始色谱图如图所示(图5-图10)。从梯度中空AAV衣壳和完整AAV衣壳的相对恢复如图11所示。
图5.空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。在整个洗涤过程中，两者都在pH8.3下保持结合。完整的衣壳，如其0.68的UV吸光度比所示，在应用pH洗脱梯度后立即开始洗脱。与后来洗脱的完整衣壳有明确但部分的分离，显示出明显的1.32的波长比。
图6.空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。一些空的AAV衣壳在pH 8.4时通过洗涤去除。随着pH洗脱梯度的应用，剩余的空的AAV衣壳立即开始洗脱。完整的AAV衣壳在pH梯度中保持结合和洗脱。
图7：空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。大多数空的AAV衣壳在pH 8.5下通过洗涤去除。随着pH洗脱梯度的应用，剩余的空的AAV衣壳立即开始洗脱。完整的AAV衣壳在pH梯度中保持结合和洗脱。
图8：空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。通过在pH 8.6下的洗涤去除所有空的AAV衣壳。完整的AAV衣壳在pH梯度中保持结合和洗脱。
图9：空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。所有空的AAV衣壳在pH 8.7下通过洗涤去除，但是一些完整的AAV衣壳在洗涤过程中洗脱。剩余的完整AAV衣壳在pH梯度中保持结合和洗脱。
图10：空的和完整的AAV衣壳都在pH 8.0时结合。通过在pH 8.8的洗涤去除所有空的AAV衣壳，但也去除了大部分完整的AAV衣壳。剩余的完整的AAV衣壳在pH梯度中洗脱。
图11：该图说明了在不同pH值下洗涤步骤后梯度洗脱的完整的和空的AAV衣壳的相对量。阴影垂直条表示支持最有效地消除空的AAV衣壳和最佳回收完整的衣壳的洗涤pH值。
实施例6
通过镁离子存在与否来改变选择性。
图12比较了在含伯胺固相上的两个色谱实验之间的洗脱曲线，其中一个曲线是在两种梯度缓冲液中用2mM镁离子产生的，而另一个曲线是在没有镁离子的情况下产生的。此外，用于两个实验的缓冲液是相同的。平衡缓冲液为10mM Tris、10mM双三丙烷、15mM NaCl、pH 7.0(含或不含2mM氯化镁)。梯度终点是10mM Tris、10mM双三丙烷、15mM NaCl、pH 9.5，(有或没有2mM氯化镁)。在镁的存在下，完整的衣壳在大约pH 8.77(峰中心)下洗脱。在没有镁的情况下，完整的衣壳在大约pH 9.23(峰中心)下洗脱，大约比有镁离子时高一半的pH单位。在镁离子的存在下，空的衣壳和完整的衣壳的分离也更加明显，完整的衣壳的回收率提高了约50％。
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本文引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文中，其并入内容与本文的明确教导不矛盾。
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Claims (12)

1.一种用于在包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物中，从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法，其中该混合物在第一碱性环境中与带有伯胺基的固相表面接触，由此
(i)完整的AAV衣壳与固相表面结合，而空的AAV衣壳至少部分不与固相表面结合，并且任选地结合的空的AAV衣壳通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分地洗脱，条件是第二碱性环境不会从固相表面洗脱完整的AAV衣壳；或
(ii)完整的和空的AAV衣壳均与固相表面结合，随后空的AAV衣壳通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分地洗脱，条件是第二个碱性环境不会从固相表面洗脱完整的AAV衣壳。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一碱性环境的pH值为pH>7至pH 8。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中在用所述第二环境至少部分地洗脱所述空的AAV衣壳之后，使所述固相表面与pH值大于第二环境pH值的第三碱性环境接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述固相表面与第四碱性环境接触，所述第四碱性环境的pH值小于所述第三或第二碱性环境的pH值，但与所述第一、第二或第三碱性环境的盐浓度相比具有更高的盐浓度。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二碱性环境的pH值在pH 8.0至pH9.0、pH 8.1至pH 8.9、pH 8.2至pH 8.8、pH 8.3至8.7、或pH 8.4-8.6的范围内。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第三碱性环境的pH值在pH 8.5至pH10.5、或pH 8.5至10.0、或pH 8.5至9.5的范围内。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三和/或第四碱性环境包含的盐浓度对应于至多1M的碱金属盐的浓度，例如NaCl，特别地为1mM至1,000mM，或2.5mM至250mM。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述碱性环境包含浓度范围为1.0mM至5.0mM、特别地为1.5mM至3.0mM、或2.0mM至2.5mM的镁离子。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述完整的和空的AAV衣壳具有任意血清型，特别地为选自下组的血清型：天然和重组血清型、嵌合型、混合型或其组合。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述带有伯胺基的固相表面配置在色谱装置中。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述带有伯胺基的固相表面是整体柱、填充颗粒柱、填充纳米纤维柱、膜吸附器或水凝胶。
12.具有带有伯胺基的固相表面的固相萃取材料的用途，用于从包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物中分离或去除空的AAV衣壳的用途。
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