KR20230002410A - 처리 방법, 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제 - Google Patents

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hydroxyapatite filler
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마치코 가토
도모히코 요시타케
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호야 테크노사지카루 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제를 사용한, 시료액 중에 포함되는 대전(帶電)물질의 분리를, 하이드록시아파타이트 충전제에 우수한 내구성을 부여함으로써, 복수 회에 걸쳐 사용할 수 있는 처리 방법, 상기 처리 방법을 포함하는 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제를 제공한다.
[해결 수단] 본 발명의 처리 방법은, 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계와, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 알코올을 포함하는 제2 액체와 접촉시키는 제2 단계를 포함한다.

Description

처리 방법, 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제
본 발명은, 하이드록시아파타이트 충전제의 내구성을 향상시키는 것이 가능한 처리 방법, 이러한 처리 방법이 적용된 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제에 관한 것이다.
하이드록시아파타이트의 2차 입자를 포함하는 분말 형태의 하이드록시아파타이트 충전제는, 생체적합성이 우수하므로, 종래부터, 시료액 중에 포함되는 단백질등의 대전(帶電)물질을 흡착 및 분리하는 액체 크로마토그래피용 컬럼(흡착 장치)에 사용하는 흡착제로서 널리 이용되고 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
이 액체 크로마토그래피용 컬럼에서는, 컬럼 본체 내에 충전된 흡착제, 즉, 하이드록시아파타이트 충전제에 있어서, 시료액 중에 포함되는 대전물질을, 흡착제에 흡착시킨 후에, 흡착제로부터 이탈시킴으로써 분리시키고, 이 흡착 및 분리를 반복적으로 실시함으로써, 시료액 중에 포함되는 대전물질, 즉 목적물질로서의 단리물의 분리(정제)를 복수회에 걸쳐 행할 수 있다.
그런데, 하이드록시아파타이트 충전제로 구성되는 흡착제를 사용한 대전물질(목적물질)을 반복적으로 분리하고, 분리 후 컬럼 본체에 보존액을 공급함으로써 흡착제를 보존하는 보존 처리를 실시함으로써, 컬럼 본체 내에 충전된 흡착제 중, 특히, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제에 있어서, 컬럼 본체 내에 시료액을 공급할 때, 큰 압력이 가해지게 된다. 이것에 의해, 입자형을 이루는 흡착제(분말)가, 모래형 또는 덩어리형을 이루게 된다. 반복 횟수가 증가할수록 컬럼 본체에 시료액을 공급하기 위해 더 높은 압력이 필요하게 된다. 결과적으로, 시료액이 최종적으로 컬럼 본체에 공급될 수 없게 된다. 따라서 본 발명자는, 하이드록시아파타이트의 분말(2차 입자를 포함함)로 구성되는 흡착제를, 시료액에 포함되는 대전물질(목적물질)을 반복적으로 분리하기 위해 더욱 오래 사용할 수 있게 할 여지가 있는 것을 발견하였다.
일본특표 2013-534252호 공보
본 발명의 목적은, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제를 사용한, 시료액 중에 포함되는 대전물질의 분리를, 하이드록시아파타이트 충전제에 우수한 내구성을 부여함으로써, 복수회에 걸쳐 연속하여 실시할 수 있는 처리 방법, 이러한 처리 방법이 적용된 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제를 제공하는 것에 있다.
이와 같은 목적은,하기 (1)∼(12)에 기재된 본 발명에 의해 달성된다.
(1) 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계와, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 알코올을 포함하는 제2 액체와 접촉시키는 제2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 우수한 내구성을 부여할 수 있다.
(2) 상기 알코올은, 저급 알코올인 상기 (1)에 기재된 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제에, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
(3) 상기 제2 액체 중의 상기 알코올의 함유량이 20wt% 이상인 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제에, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
(4) 상기 제2 액체는, 칼슘 이온을 더 포함하는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제에, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
(5) 상기 제2 액체 중의 상기 칼슘 이온의 농도가 1.0mM 이상 20.0mM 이하인 상기 (4)에 기재된 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제에, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
(6) 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계와,
상기 하이드록시아파타이트 충전제를 함유량이 0.05M 이하인 NaOH를 포함하는 제2 액체와 12시간 이상 접촉시키는 제2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제에 우수한 내구성을 부여할 수 있다.
(7) 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 상기 제2 액체와 접촉시키는 상기 제2 단계는, 상기 하이드록시아파타이트 충전제의 2배량 이상의 상기 제2 액체를, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 통과시킨 후에, 상기 제2 액체 중에 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 정치(靜置)하는 공정을 포함하는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법.
이로써, 흡착제에 대하여 처리액을 안정적으로 접촉시킬 수 있다.
(8) 상기 제1 단계는, 상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 공급 공정과, 상기 소정의 물질로서 인산염과 다른 염을 포함하는 인산 완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 회수 공정과, 상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 세정 공정과, 상기 소정의 물질로서 알칼리를 포함하는 알칼리 용액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 알칼리 세정 공정과, 상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 pH 평형 공정을 가지는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법.
이러한 공정을 적용함으로써, 소정의 물질을 포함하는 제1 액체가 접촉된, 하이드록시아파타이트 충전제를 준비할 수 있다.
(9) 상기 제1 단계는, 세정 공정 전에, 하이드록시아파타이트 충전제를 칼슘 이온을 포함하는 상기 제1 액체와 접촉시키는 것에 의해 Ca를 보충하는 공정을 더 포함하는 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법.
이러한 공정을 적용함으로써, 소정의 물질을 포함하는 제1 액체가 접촉된, 하이드록시아파타이트 충전제를 준비할 수 있다.
(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법에 의해 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 처리하는 처리 공정과,
목적물질을 포함하는 액체 조성물을 준비하는 조성물 준비 공정과,
상기 처리 공정에서 처리된 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 사용하여, 상기 액체 조성물로부터 상기 목적물질을 분리하는 분리 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
본 발명의 생산 방법을 적용함으로써, 목적물질을 우수한 정밀도로 정제할 수 있다.
(11) 목적물질을 포함하는 액체 조성물로부터 상기 목적물질을 분리하는 분리 공정에 있어서 이미 1회 이상 사용된 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 준비하는 충전제 준비 공정과,
상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 처리 방법에 의해, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 처리함으로써, 내구성을 향상시킨 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 공급하는 재생산 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
본 발명의 생산 방법을 적용함으로써, 내구성을 향상시킨 하이드록시아파타이트 충전제를 얻을 수 있다.
(12) 상기 (11)에 기재된 생산 방법에 의해 얻어지는 하이드록시아파타이트 충전제.
이로써, 하이드록시아파타이트 충전제를, 내구성을 향상시킨 것으로 할 수 있다.
본 발명의 처리 방법에 의하면, 하이드록시아파타이트 충전제에 우수한 내구성을 부여할 수 있다. 이에 따라, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제를 사용한, 시료액 중에 포함되는 대전물질의 분리에 적용했을 때는, 이 분리를, 복수회에 걸쳐 안정적으로 실시할 수 있다.
도 1은 본 발명의 처리 방법 및 생산 방법을 적용할 수 있는 흡착제를 구비하는 흡착 장치의 일례를 나타낸 종단면도이다.
도 2는 본 발명의 처리 방법이 적용된, 하이드록시아파타이트 충전제의 처리 방법을 나타내는 흐름도이다.
이하, 본 발명의 처리 방법, 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제를 첨부 도면에 나타낸 바람직한 실시형태에 기초하여 상세하게 설명한다.
먼저, 본 발명의 처리 방법에 대하여 설명하기에 앞서, 본 발명의 처리 방법 및 생산 방법을 적용할 수 있는 흡착제(본 발명의 하이드록시아파타이트 충전제)를 구비하는 흡착 장치의 일례에 대하여 설명한다.
그리고, 이하에서는, 흡착 장치를 사용해서 분리하는 대전물질(단리물)이 단백질인 경우, 즉, 대전물질을 구성하는 음(-)의 대전물질 및 양(+)의 대전물질 중, 음의 대전물질이 산성 단백질이며, 양의 대전물질이 염기성 단백질인 경우를 일례로 들어 설명한다.
<흡착 장치>
도 1은, 본 발명의 처리 방법 및 생산 방법을 적용할 수 있는 흡착제를 구비하는 흡착 장치의 일례를 나타낸 종단면도이다. 그리고,이하의 설명에서는, 도 1 중의 상측을 「유입측」, 하측을 「유출측」이라고 한다.
여기서, 유입측이란, 목적으로 하는 단백질 즉 단리물을 분리(정제)할 때, 예를 들면, 시료액(시료를 포함하는 액체), 용리액인 인산계 완충액 등의 액체를, 흡착 장치 내에 공급하는 측을 일컬으며, 한편, 유출측이란, 상기 유입측과는 반대측, 즉 상기 액체가 흡착 장치 내로부터 유출하는 측을 일컫는다.
단백질을 시료액으로부터 분리(정제)하기 위해 사용되는, 도 1에 나타낸 흡착 장치(1)는, 컬럼(2)과, 입자상 흡착제(충전제)(3)와, 2개의 필터 부재(4, 5)를 가지고 있다.
컬럼(2)은, 컬럼 본체(21)와, 이 컬럼 본체(21)의 유입측 단부(端部) 및 유출측 단부에, 각각 장착되는 캡(뚜껑체)(22, 23)으로 구성되어 있다.
컬럼 본체(21)는, 예를 들면 원통형 부재에 의해 구성되어 있다. 컬럼 본체(21)를 포함하여 컬럼(2)을 구성하는 각 부(각 부재)의 구성 재료로서는, 예를 들면, 각종 유리 재료, 각종 수지 재료, 각종 금속 재료, 각종 세라믹 재료 등이 있다.
컬럼 본체(21)에는 유입측 개구 및 유출측 개구를 각각 덮도록 필터 부재(4, 5)를 배치한 후, 그 유입측 단부 및 유출측 단부에, 각각 캡(22, 23)이 나사 결합에 의해 장착된다.
이와 같은 구성의 컬럼(2)에서는, 컬럼 본체(21)와 각각의 필터 부재(4, 5)에 의해, 흡착제 충전 공간(20)이 규정되어 있다. 그리고, 이 흡착제 충전 공간(20)중 적어도 일부에 (본 실시형태에서는 완전히), 흡착제(3)가 충전되어 있다.
흡착제 충전 공간(20)의 용적은, 시료액의 용량에 따라 적절하게 설정되고, 특별히 한정되지 않지만, 시료액 1mL에 대하여, 약 0.1mL 이상 100mL 이하인 것이 바람직하고, 약 1mL 이상 50mL 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 컬럼 본체(21)에 각각의 캡(22, 23)을 장착한 상태에서, 이들 사이의 액밀성(液密性)이 확보되도록 구성되어 있다.
각각의 캡(22, 23)의 거의 중앙에는, 각각, 유입관(24) 및 유출관(25)이 액밀하게 고착(고정)되어 있다. 이 유입관(24) 및 필터 부재(4)를 통하여 흡착제(3)에, 상기 액체가 공급된다. 흡착제(3)에 공급된 액체는, 흡착제(3) 사이(간극)를 통과하고, 필터 부재(5) 및 유출관(25)을 통하여 컬럼(2) 밖으로 유출한다. 이 때, 시료액(시료)에 포함되는 분리할 단백질(이하에서, 간단히 「단백질」이라고 할 수도 있음)과, 분리할 단백질 이외의 물질(분리할 단백질 이외의 이질 단백질(이하에서, 간단히 「이질 단백질」이라고 할 수도 있음)이 포함되어 있어도 됨)은, 흡착제(3)에 대한 흡착성의 차이 및 인산계 완충액과 같은 완충액 등에 대한 친화도의 차이에 기초하여 분리된다.
각각의 필터 부재(4, 5)는 흡착제 충전 공간(20)으로부터 흡착제(3)가 유출하는 것을 방지하는 기능을 가진다. 각각의 필터 부재(4, 5)는, 예를 들면, 폴리우레탄, 폴리비닐알코올, 폴리프로필렌, 폴리에테르-폴리아미드 블록 공중합체, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 합성수지로 이루어지는, 부직포, 발포체(연통공을 가지는 스폰지상 다공질체), 직포, 메쉬 등에 의해 구성되어 있다.
흡착제(3)는, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되며, 구체적으로는, 예를 들면, 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)의 2차 입자를 포함하는 분말에 의해 구성되어 있다. 분리할 단백질은, 흡착제(3)에 단백질 고유의 흡착(담지(擔持))력으로 특이적으로 흡착하고, 이 흡착력의 차이에 따라 분리할 단백질 이외의 다른 물질(이질 단백질을 포함함)으로부터 분리 및 정제된다.
일반적으로 단백질은, 구성 아미노산으로서 산성 아미노산을 비교적 많이 포함하고 음으로 대전하는 산성 단백질과, 구성 아미노산으로서 염기성 아미노산을 비교적 많이 포함하고 양으로 대전하는 염기성 단백질로 분류된다.
한편, 하이드록시아파타이트는, 결정구조 중에, 양으로 대전하는 Ca 사이트와, 음으로 대전하는 인산 사이트를 형성하고 있다.
따라서, 단백질 중 산성 단백질은, 하이드록시아파타이트가 가지는 Ca 사이트와 산성 아미노산 사이에서 이온 결합을 형성하고, 염기성 단백질은, 하이드록시아파타이트가 가지는 인산 사이트와 염기성 아미노산 사이에서 이온 결합을 형성한다. 또한, 단백질의 하이드록시아파타이트에 대한 결합(흡착) 강도는, 각각의 단백질(산성 단백질 및 염기성 단백질)의 대전량에 따라 상이하다.
그러므로, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착제(3)는, 흡착력의 차이를 이용하여 단백질(산성 단백질 및 염기성 단백질)과 그 외의 물질(예를 들면, 이질 단백질 등)을 분리할 수 있다.
하이드록시아파타이트는, 인산 칼슘계 화합물 중에서도, 특히, 생체를 구성하는 성분에 가까우므로, 단백질의 흡착 및 분리할 때 단백질의 변질(변성)을 바람직하게 방지할 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산 완충액(용리액)에 염농도 구배를 가지게 함으로써, 단백질을 흡착제(3)로부터 특이적으로 제거할 수 있는 이점도 가진다.
또한, 하이드록시아파타이트의 수산기 중 적어도 1개가 불소 원자로 치환되어 있어도 된다. 불소 원자로 치환된 하이드록시아파타이트(이하, 「불소 아파타이트」라고 함)는, 그 결정 구조 중에 불소 원자(불소 이온)가 존재함으로써, 칼슘 원자(칼슘 이온)의 이탈을 보다 확실하게 방지할 수 있다.
그리고, 이하에서는, 하이드록시아파타이트 및 불소 원자로 치환되어 있는 플루오로아파타이트를, 총칭하여 「아파타이트」라고 칭하는 경우가 있다.
전술한 바와 같이, 하이드록시아파타이트 충전제에 의해 구성되는 흡착체(3)의 형태(형상)는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 입자상(과립)인 것이 바람직하며, 또한 예를 들면 펠릿상(작은 덩어리형), 블록형(예를 들면, 인접하는 빈 구멍이 서로 연통되는 다공질체, 허니컴(honeycomb)형) 등일 수도 있다. 입자상의 흡착제(3)는 큰 표면적을 가지므로, 단백질의 분리 특성이 향상될 수 있다.
입자상 흡착제(3)의 평균 사이즈는, 특별히 한정되지 않지만, 0.5㎛ 이상 150㎛ 이하 정도인 것이 바람직하고, 10㎛ 이상 80㎛ 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 평균 사이즈의 흡착제(3)는, 필터 부재(5)의 막힘을 확실하게 방지하고 또한, 흡착제(3)의 표면적을 충분히 확보할 수 있다.
그리고, 흡착제(3)(하이드록시아파타이트 충전제)는, 전체가 2차 아파타이트 입자에 의해 구성되어 있어도 되고, 2차 아파타이트 입자가 표면적에 피복된 담체(기체(基體))에 의해 구성되어 있어도 된다. 그 중에서도, 흡착제(3) 전체가 2차 아파타이트 입자에 의해 구성되는 것이 바람직하며, 이로써 흡착제(3)의 흡착력을 보다 높일 수 있다. 그 결과, 다량의 단백질을 분리에 적합한 컬럼(2)이 얻어진다.
또한, 그 전체가 아파타이트의 2차 입자에 의해 구성된 흡착제(3)는, 예를 들면, 습식합성법이나 건식합성법을 사용하여, 아파타이트 입자(1차 입자)를 형성하고, 이러한 아파타이트 입자를 함유하는 슬러리를, 건조 그리고 조립(造粒)함으로써, 건조 입자(2차 입자)를 얻고, 또한 이 건조 입자를 소성하는 등에 의해 얻을 수 있다.
한편, 표면이 아파타이트로 피복된 담체로 구성된 흡착제(3)는, 예를 들면, 수지 등으로 구성되는 담체에, 상기 건조 입자를 충돌(하이브리다이징)시키는 방법 등에 의해 얻을 수 있다.
또한, 본 실시형태와 같이, 흡착제(3)를 흡착제 충전 공간(20)에 거의 완전히 충전하는 경우에는, 흡착제(3)는, 흡착제 충전 공간(20)의 각 부에 있어서, 대략 동일한 조성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 이로써, 흡착 장치(1)는, 단백질의 분리(정제) 능력이 특히 우수하게 된다.
또한, 흡착제 충전 공간(20)의 일부(예를 들면, 유입관(24) 측의 일부)에 흡착제(3)를 충전하고, 그 외의 부분에는 다른 흡착제를 충전하도록 해도 된다.
<분리 방법>
다음으로, 이와 같이, 아파타이트의 2차 입자를 포함하는 분말을 흡착제(3)로서 사용하는 흡착 장치(1)를 이용한 단백질의 분리 방법에 대하여 설명한다.
[S1A] 준비 공정(조성물 준비 공정)
먼저, 분리(정제)할 단백질(목적물질)과, 기타 물질(혼입물)을 함유하는 시료액(액체 조성물)을 준비한다.
단백질이 유전자변형 단백질(모노클로널 항체 등)인 경우, 시료액으로서는, 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산을 도입한 양, 토끼, 닭 등의 포유동물, 누에 등의 곤충과 같은 동물, 차이니즈 햄스터 난소세포 유래의 CHO 세포와 같은 동물 세포, 대장균과 같은 미생물 등으로부터의 분비물이나, 이들의 세포질 성분 등을 예로 들 수 있다.
또한, 단백질이 천연의 단백질인 경우, 시료액으로서는, 예를 들면, 각종 동물 유래의 혈액(혈장), 림프액, 타액, 콧물과 같은 체액 등이 있다.
또한, 단백질 중 산성 단백질로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, BSA, HAS, 피브리노겐, 펩시노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 γ-글로불린 등이 있다. 또한, 염기성 단백질로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 라이소자임, 소마틴, 시토크롬 C, 리보뉴클레아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, α-키모트립신, 히스톤, 프로타민, 폴리리신) 및 모넬린 등이 있다.
그리고, 이들 단백질(산성 단백질 및 염기성 단백질)은, 그 아미노산서열의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있음을 유의해야 한다.
또한, 시료액으로서는, 상기 미생물 등으로부터의 분비물이나, 동물 유래의 체액을 그대로 사용해도 되지만, 물이나 생리식염수와 같은 중성 완충액이나, 인산계 완충액 중에서 희석하거나, 및 필터 등의 여과막으로 여과한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 시료액에는, 복수 종류의 단백질이 포함되어 있어도 된다.
또한, 인산계 완충액으로서는, 후술하는 분획 공정[S4A]에서와 동일한 것을 사용할 수 있다.
또한, 인산계 완충액으로서 희석한 시료액을 사용하는 경우, 시료액 중에서의 염농도는, 0.5mM 이상 30mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 1mM 이상 20mM 이하 정도인 것이 더욱 바람직하다.
[S2A] 치환 공정
컬럼 내부가 치환된 유입관(24)으로부터 컬럼(2) 내에, 완충액을 공급한다.
완충액으로서는, 인산계 완충액이 바람직하게 사용된다. 이 인산계 완충액으로서는, 하기 공정[S4A]에서 용리액으로서 사용되는 것과 동일할 수 있다.
완충액으로서 인산계 완충액을 사용하는 경우, 인산계 완충액의 인산염 농도는, 0.5mM 이상 500mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 1mM 이상 200mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 컬럼(2) 내를 이와 같은 염농도의 인산계 완충액을 완충액으로 치환함으로써, 흡착제(3)를, 다음의 단백질의 분리에 보다 적합하게 할 수 있다.
그리고, 이 치환 공정[S2A]은, 분리하는 단백질의 종류 등에 의해서는 생략할 수도 있다.
[S3A] 공급 공정
다음으로, 상기 공정[S1A]에서 얻어진 시료액을, 유입관(24) 및 필터 부재(4)를 통하여 컬럼 본체(21) 내에 공급함으로써, 시료액을 컬럼(2)(흡착 장치(1)) 내를 통과시켜서, 흡착제(3)에 접촉시킨다.
결과적으로, 흡착제(3)에 대하여 흡착 능력이 높은 분리(정제)할 단백질이나, 흡착제(3)에 대하여 비교적 흡착 능력의 높은 혼입물(이물질 단백질) 등의 일부(단백질)는, 컬럼(2) 내에 유지된다. 그리고, 흡착제(3)에 대하여 흡착 능력이 낮은 혼입물은, 필터 부재(5)및 유출관(25)을 통하여 컬럼(2) 내로부터 유출한다.
[S4A] 분획 공정(회수 공정, 분리 공정)
다음으로, 유입관(24)으로부터 컬럼(2) 내에, 단백질을 용리시키기 위한 용리액으로서, 예를 들면, 인산계 완충액을 공급한다. 그리고, 용리액이 컬럼(2) 내로부터 유출관(25)을 통하여 유출한 후, 소정량씩 분획(채취)한다. 이로써, 흡착제(3)에 흡착하고 있는 단백질 및 혼입물은, 각각이 가지는 흡착제(3)에 대한 흡착력의 차이에 따라 용리액에 용해되고, 각각, 분획 내에 회수(분리 및 정제)된다. 즉, 흡착제(3)를 사용하고, 시료액(액체 조성물)으로 분리되는 것에 의해 단백질이 얻어지게 된다.
즉, 흡착제(3)에는, 단백질 및 혼입물이, 각각 고유의 흡착(유지)력으로 특이적으로 흡착되어 있으므로, 이 흡착력의 차이에 따라, 단백질과 혼입물이 분리, 정제되어, 단백질이 용해하고 있는 분획을 선택적으로 회수함으로써, 이 단백질이 정제된다.
용리액으로서 사용되는 완충액은, 인산계 완충액이 바람직하게 사용된다. 이 인산계 완충액으로서는, 예를 들면, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 인산 리튬 및 인산 암모늄 등의 인산염을 포함하는 수용액이 있다. 또한, 완충액은, 인산계 완충액 외에, MES(2-모르폴리노에탄술폰산) 완충액이나 황산일 수 있다.
인산계 완충액을 용리액으로 사용하는 경우, 이 인산계 완충액에는, 또한 인산염과는 상이한 다른 염이 포함되어 있어도 된다. 다른 염으로서는, 예를 들면, NaCl, KCl, NH4Cl, MgCl2 등이 있다.
또한, 인산계 완충액에서의 다른 염의 염농도는, 0.1M 이상 1.5M 이하인 것이 바람직하고, 0.5M 이상 1.0M 이하인 것이 보다 바람직하다. 이러한 염농도로 다른 염을 포함하는 인산계 완충액을 사용함으로써, 목적으로 하는 분획에서의, 단백질의 분리를 우수한 정밀도로 행할 수 있다.
인산계 완충액을 용리액으로 사용하는 경우, 그 pH는, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5.5∼8.5 정도, 보다 바람직하게는 6.0∼8.0 정도로 설정된다. 이로써, 단백질을 확실하게 용리시킬 수 있고, 그 정제율의 향상을 도모할 수 있다.
이 인산계 완충액의 온도도, 특별히 한정되지 않지만, 4∼50℃ 정도인 것이 바람직하고, 10∼35 ℃ 정도인 것이 보다 바람직하다. 이로써, 분리하는 단백질의 변질(변성)을 방지할 수 있다.
따라서, 상기한 pH 범위 및 온도 범위의 인산계 완충액을 사용함으로써, 목적으로 하는 단백질의 회수율의 향상을 도모할 수 있다.
인산계 완충액의 인산염 농도는, 0.5mM 이상 400mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 1mM 이상 300mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 염농도의 인산계 완충액을 사용하고, 단백질의 분리를 행함으로써, 인산계 완충액 중의 금속 이온에 의한 단백질에 대한 악영향을 방지할 수 있다.
구체적으로는, 인산염 농도가 1mM 이상 400mM 이하 정도이며, 또한, 다른 염의 염농도가 0.1M 이상 1.5M 이하 정도인 인산계 완충액이 바람직하게 사용된다. 또한, 인산계 완충액의 인산염 농도는, 단백질의 분리에 있어서 연속적 또는 단계적으로 변화시키는 것이 바람직하다. 이로써, 단백질의 분리의 효율화를 도모할 수 있다.
또한, 인산계 완충액의 유속(流速)은, 0.1mL/분 이상 10mL/분 이하 정도인 것이 바람직하고, 0.2mL/분 이상 5mL/분 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 유속으로, 분리 조작에 장시간을 요하지 않고, 목적으로 하는 단백질을 확실하게 분리하는 것, 즉 고순도의 단백질을 얻을 수 있다.
이상과 같은 조작에 의해, 소정의 획분으로, 분리할 단백질(단리물)이 회수되고 정제된다.
또한, 전술한 바와 같은, 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리를 반복적으로 실시할 때는, 이하에 나타내는 공정[S5A]∼공정[S7A]을 실시하여, 흡착제(3)를 세정 및 평형화함으로써, 흡착 장치(1)는, 재차, 상기 공정[S1A]∼공정[S4A]에 의한, 단백질의 분리에 사용된다. 이하, 흡착제(3)를 세정 및 평형화하는 공정[S5A]∼공정[S7A]에 대하여 설명한다.
[S5A] 세정 공정
다음으로, 유입관(24)으로부터 컬럼(2) 내에, 흡착제(3)에 잔존(흡착)하고 있는 단백질이나, 이질 단백질 등을 용리시킴으로써, 흡착제(3)를 세정하는 세정액(제1 세정액)으로서 예를 들면 완충액을 공급한다.
즉, 흡착제(3)에는, 상기 공정[S4A]에서 용리하지 않은 단백질이나, 이질 단백질 등의 잔류물이 흡착하고 있다. 이에 따라, 본 공정[S5A]에 있어서, 세정액을 공급함으로써, 이들을 세정액 중에 용리시킴으로써, 흡착제(3)를 세정한다.
세정액으로서 사용되는 완충액은, 인산계 완충액이 바람직하게 사용된다. 이 인산계 완충액으로서는, 상기 공정[S4A]에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하며, 그 중에서도 MES가 바람직하다.
세정액으로서 인산계 완충액을 사용하는 경우, 인산계 완충액의 인산염 농도는, 200mM 이상 700mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 300mM 이상 500mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 인산염 농도의 인산계 완충액을 세정액으로서 사용함으로써, 흡착제(3)에 잔존물로서 흡착하고 있는, 단백질이나, 이질 단백질 등을 세정액 중에 확실하게 용리시킬 수 있다.
[S6A] 알칼리 세정 공정
다음으로, 유입관(24)로부터 컬럼(2) 내에, 상기 공정[S5A]을 실시함으로써서도, 용리하지 않고, 흡착제(3)에 잔존하고 있는 단백질이나, 이질 단백질 등을 용리시킴으로써, 흡착제(3)를 더욱 세정하는 세정액(제2 세정액)으로서 예를 들면 알칼리 용액을 공급한다.
즉, 상기 공정[S5A]에서의 완충액에 의한 세정에 의해서도, 용리하지 않고, 흡착제(3)에 잔존(흡착)하고 있는 단백질이나, 이질 단백질 등을, 본 공정[S6A]에 있어서, 세정액(제2 세정액)을 공급함으로써, 이들을 세정액 중에 용리시킴으로써, 흡착제(3)를 세정한다.
세정액으로서 사용되는 알칼리 용액으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 수산화 나트륨, 탄산 나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 칼륨, 암모니아와 같은 알칼리를 포함하는 수용액 등이 있다.
알칼리 용액의 알칼리 농도는, 0.1M 이상 1.5M 이하 정도인 것이 바람직하고, 0.5M 이상 1.0M 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 알칼리 농도의 알칼리 용액을 세정액으로서 사용함으로써, 흡착제(3)에 잔존물로서 흡착하고 있는, 단백질이나, 이질 단백질 등을 세정액 중에 더욱 확실하게 용리시킬 수 있다.
[S7A] pH 평형 공정
다음으로, 유입관(24)로부터 컬럼(2) 내에, 세정이 행해진 흡착제(3)의 pH를 평형화하는 평형액으로서, 예를 들면, 완충액을 공급한다.
즉, 흡착제(3)는, 상기 공정[S6A]에서의 알칼리 용액에 의한 세정에 의해, pH가 알카리성을 나타내기 때문에, 본 공정[S7A]에 있어서, 평형액을 공급함으로써, 흡착제(3)의 pH의 평형화를 도모하고, 흡착제(3)의 pH가 중성 근방을 나타내도록 할 수 있다.
평형액으로서 사용되는 완충액은, 인산계 완충액이 바람직하게 사용된다. 이 인산계 완충액으로서는, 상기 공정[S4A]에서 설명한, 용리액으로서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
평형액으로서 인산계 완충액을 사용하는 경우, 인산계 완충액의 인산염 농도는, 200mM 이상 700mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 300mM 이상 500mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 염농도의 인산계 완충액을 평형액으로서 사용함으로써, 흡착제(3)의 pH의 평형화를 도모하고, 흡착제(3)의 pH를, 확실하게 중성 근방을 나타내도록 할 수 있다.
이상과 같은 공정[S5A]∼공정[S7A]을 실시함으로써, 흡착제(3)의 세정 및 평형화가 행해지고, 흡착 장치(1)를 다시 단백질의 분리에 제공할 수 있다.
그리고, 후술하는 처리 방법을 적용하는 경우, 흡착제(3)를 세정 및 평형화하는 상기 공정[S5A]∼공정[S7A] 중, 상기 공정[S6A] 및 상기 공정[S7A], 또는 상기 공정[S7A]에 대하여 생략할 수도 있다.
또한, 상기 공정[S5A] 전에, 유입관(24)로부터 컬럼(2) 내에, 흡착제(3)가 구비하는 칼슘 사이트에 칼슘을 보충하기 위하여, 칼슘 용액을 공급하는 Ca 보충 공정을 행하도록 해도 된다. 이하, 이 Ca 보충 공정[S8A]에 대하여 설명한다.
[S8A] Ca 보충 공정
상기 공정[S5A] 전에, 유입관(24)으로부터 컬럼(2) 내에, 흡착제(3)가 구비하는 칼슘 사이트에 칼슘을 보충하기 위하여, 칼슘 용액으로서, 예를 들면, 칼슘 함유 완충액을 공급한다.
즉, 흡착제(3)에서는, 상기 공정[S1A]∼공정[S4A]에 의한 단백질의 정제를 거침으로써, 흡착제(3)(2차 아파타이트 입자)가 구비하는 칼슘 사이트의 일부로부터 칼슘이 이탈하고 있는 경우가 있다. 이 때문에, 본 공정[S8A]에 있어서, 칼슘 함유 완충액을 공급하여, 칼슘 함유 완충액에 포함되는 칼슘을, 칼슘이 이탈한 칼슘 사이트에 접촉시킴으로써 칼슘을 보충한다.
칼슘 함유 완충액으로서 사용되는 완충액은, 특별히 한정되지 않지만, 상기 공정[S4A]에서 설명한, 용리액으로서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있으며, 그 중에서도, MES가 바람직하게 사용된다.
또한, 칼슘 함유 완충액은 상기 완충액 중에, 칼슘 염기 및 칼슘의 염 중 한쪽, 또는 양쪽을 첨가함으로써 얻어지는 것이 바람직하다. 칼슘의 염기 및 염으로서는, 예를 들면, 수산화 칼슘, 탄산 칼슘, 염화 칼슘, 질산 칼슘, 아세트산 칼슘, 락트산 칼슘이나, 이들의 수화물 등이 있다.
칼슘 함유 완충액에서의 칼슘의 함유량은, 1mM 이상 100mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 5mM 이상 70mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다.
이상과 같은 칼슘 함유 완충액을 사용함으로써, 칼슘 함유 완충액에 포함되는 칼슘을, 칼슘이 이탈한 칼슘 사이트에 확실하게 보충할 수 있다.
<처리 방법>
여기서, 이 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리가 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]을 반복적으로 실시함으로써 반복적으로 실시된다.
그러나, 전술한 바와 같이, 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리를 반복적으로 실시하면, 흡착제(3) 중 특히, 시료액 등의 액체가 공급되는 컬럼 본체(21) 내에 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 있어서, 큰 압력이 가해진다. 그리고, 이것에 기인하여, 입자형을 이루는 흡착제(3) 즉 분말이, 모래형으로 이루어지게 된다. 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 때의 압력이, 반복적으로 실시하는 횟수를 증가할수록 커지고, 최종적으로는, 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급시킬 수 없게 된다.
본 발명의 처리 방법은, 이상과 같은, 단백질의 분리를 반복적으로 실시된 흡착제(3)(아파타이트의 2차 입자를 포함하는 분말)를 준비하고, 이 흡착제(3)에 대하여, 알코올을 포함하는 처리액을 접촉시키거나, 혹은 NaOH를 포함하는 처리액을 12시간 이상 접촉시킨다. 이와 같은 흡착제(3)와 처리액이 접촉함으로써, 그 후, 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리를 다시 실시하고, 컬럼 본체(21) 내에 시료액 등의 액체를 공급했을 때, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 있어서, 큰 압력이 가해지더라도, 입자형을 이루는 흡착제(3)(분말)가, 모래형으로 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다. 따라서, 단백질을 분리할 때마다 컬럼 본체(21) 내에 액체를 공급하는 압력이 상승하고, 최종적으로 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 수 없게 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다.
그리고, 본 발명의 처리 방법을 적용하여, 상기 처리액을, 컬럼 본체(21) 내에 공급할 때도, 컬럼 본체(21) 내에 충전된 흡착제(3), 특히, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 압력이 가해지게 되지만, 처리액으로서, 알코올을 포함하는 처리액, 혹은 NaOH를 포함하는 처리액을 사용함으로써, 입자형을 이루는 흡착제(3)(분말)가, 모래형을 이루어지게 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다.
도 2는, 본 발명에 따른 하이드록시아파타이트 충전제의 처리 방법을 나타내는 흐름도이다.
본 발명의 처리 방법은, 단백질의 분리에 반복적으로 사용되는 흡착제(3)(아파타이트의 2차 입자를 포함하는 분말)에 적용되는 방법이며, 단백질의 분리가 실시된 흡착제(3) 즉 아파타이트의 2차 입자를 포함하는 분말(이하, 이 분말을 「실시 완료 분말」이라고 할 수도 있음)을 준비하는 공정[S1B]과, 실시 완료 분말을 알코올 혹은 NaOH를 포함하는 처리액과 접촉시키는 공정[S2B]을 가진다.
이하, 이들 공정에 대하여 설명한다.
[S1B] 준비 공정
단백질의 분리가 실시된 흡착제(3)(실시 완료 분말)을 준비한다.
본 실시형태에서는, 전술한 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리 방법, 즉 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]을 적용함으로써, 실시 완료 분말이 준비된다.
바꾸어 말하면, 전술한 단백질의 분리 방법, 즉 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]에 의해, 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계가 구성된다.
또한, 전술한 단백질의 분리 방법, 즉 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]에 의해, 목적물질을 포함하는 액체 조성물로부터 이 목적물질을 분리하는 분리 공정에 있어서, 이미 1회 이상 사용된 하이드록시아파타이트 충전제를 준비하는 충전제 준비 공정이 구성된다.
또한, 제1 단계를 구성하는, 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]에서의, 상기 공정[S3A](공급 공정)에서는, 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉되고, 또한, 상기 공정[S4A][분획 공정(회수 공정)]에서는, 소정의 물질로서 인산염과 인산염과는 상이한 다른 염을 포함하는 인산 완충액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉되고, 상기 공정[S5A](세정 공정)에서는, 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉되고, 상기 공정[S6A](알칼리 세정 공정)에서는, 소정의 물질로서 알칼리를 포함하는 알칼리 용액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉되고, 상기 공정[S7A](pH 평형 공정)에서는, 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산 완충액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉되고, 또한 상기 공정[S8A](Ca 보충 공정)에서는, 소정의 물질로서 칼슘 이온을 포함하는 칼슘 함유 완충액이 제1 액체로서 실시 완료 분말에 접촉된다.
[S2B] 처리 공정
실시 완료 분말(흡착제(3))에, 알코올 혹은 NaOH를 포함하는 처리액을 접촉시킨다.
이 처리 공정에서는, 전술한 바와 같이 알코올을 포함하는 처리액을 사용하는 경우와, NaOH를 포함하는 처리액을 사용하는 경우가 있다.
이에, 이하에서는, 알코올을 포함하는 처리액을 사용하는 경우와, NaOH를 포함하는 처리액을 사용하는 경우에 대하여, 각각, 개별적으로 설명한다.
[S2B-1] 알코올을 포함하는 처리액을 사용하는 경우
제2 단계에서 알코올을 포함하는 처리액을 사용하는 경우, 실시 완료 분말(흡착제(3))을 알코올을 포함하는 처리액(제2 액체)와 접촉시킨다.
전술한 바와 같이, 실시 완료 분말에 대하여, 알코올을 포함하는 처리액을 접촉시킴으로써, 그 후에, 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리(상기 공정[S1A]∼공정[S8A])를 다시 실시하고, 컬럼 본체(21) 내에 시료액 등의 액체를 공급했을 때, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 있어서, 큰 압력이 가해지더라도, 입자형을 이루는 흡착제(3)(분말)이, 모래형을 이루어지게 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다. 따라서, 단백직을 분리할 때마다 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 때의 압력이 증가하여 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 수 없는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다. 바꾸어 말하면, 실시 완료 분말에 우수한 내구성을 부여할 수 있다. 결과적으로, 실시 완료 분말(흡착제(3))을 사용한, 시료액 중에 포함되는 단백질의 분리를, 복수회에 걸쳐 안정적으로 실시할 수 있다.
처리액 중에 포함되는 알코올로서는, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 헥산올 등의 저급 알코올이 바람직하게 사용되고, 이들 저급 알코올 중 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있지만, 그 중에서도, 특히, 에탄올이 바람직하다.
처리액은, 본 실시형태에서는, 알코올을 포함하는 수용액에 의해 구성되지만, 이 처리액 중에서의 알코올의 함유량은, 20wt% 이상인 것이 바람직하고, 20wt% 이상 35wt% 이하 정도인 것이 보다 바람직하다.
나아가서는, 처리액은, 알코올 이외에, 칼슘 이온을 포함하는 것이 바람직하다. 그리고, 칼슘 이온을 포함하는 처리액은, 예를 들면, 알코올을 포함하는 수용액에, 칼슘의 염기 및 염 중 중 적어도 1종을 첨가함으로써 얻을 수 있다.
칼슘의 염기 및 염으로서는, 예를 들면, 수산화 칼슘, 탄산 칼슘, 염화 칼슘, 질산 칼슘, 아세트산 칼슘, 락트산 칼슘이나, 이들의 수화물 등이 있다.
처리액에서의 칼슘 이온의 농도는, 1.0mM 이상 20.0mM 이하 정도인 것이 바람직하고, 5.0mM 이상 15.0mM 이하 정도인 것이 보다 바람직하다.
상기한 처리액을 사용함으로써, 단백질의 분리가 실시된 하이드록시아파타이트 충전제에, 단백질의 분리를 복수회에 걸쳐 연속적으로 실시할 수 있는, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
처리액 중에 흡착제(3)를 유지하는 시간, 즉 흡착제(3)에 접촉시키는 시간은, 24시간 이상인 것이 바람직하고, 48시간 이상인 것이 보다 바람직하다. 한편, 300일 이하 정도인 것이 바람직하다.
흡착제(3)를 상기 처리액에 접촉시키는 시간을, 상기한 범위 내에 설정함으로써, 단백질의 분리가 실시된 흡착제(3)(하이드록시아파타이트 충전제)에, 단백질의 분리를 복수회에 걸쳐 연속하여 실시할 수 있는, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
[S2B-2] NaOH를 포함하는 처리액을 사용하는 경우
제2 단계에서 NaOH를 포함하는 처리액을 사용하는 경우, 실시 완료 분말(흡착제(3))을 함유량이 0.05M 이하인 NaOH를 포함하는 처리액(제2 액체)과 12시간 이상 접촉시킨다.
이와 같이, 실시 완료 분말을 함유량이 0.05M 이하인 NaOH를 포함하는 처리액과 12시간 이상 접촉시키는 것에 의해서도, 그 후에, 흡착 장치(1)를 사용한 단백질의 분리, 즉 상기 공정[S1A]∼공정[S8A]을 다시 실시하고, 컬럼 본체(21) 내에 시료액 등의 액체를 공급했을 때, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 있어서, 큰 압력이 가해지더라도, 입자형을 이루는 흡착제(3)(분말)가, 모래형을 이루어지게 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다. 따라서, 단밸직을 분리할 때마다 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 때의 압력이 증가하여 컬럼 본체(21) 내에 상기 액체를 공급할 수 없는 것을, 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다. 바꾸어 말하면, 실시 완료 분말에 우수한 내구성을 부여할 수 있다. 결과적으로, 실시 완료 분말로 구성되는 흡착제(3)를 사용하여 시료액 중의 단백질의 분리를, 복수회에 걸쳐 안정적으로 실시할 수 있다.
처리액은, 본 실시형태에서는, NaOH를 포함하는 수용액에 의해 구성되지만, 이 처리액 중에서의 NaOH의 함유량은, 0.05M 이하이면 되며, 특히, 0.0M 이상 0.01M 이하 정도인 것이 바람직하다.
이와 같이, NaOH의 함유량이 저농도로 설정된 처리액을 사용함으로써, 단백질의 분리가 실시된 하이드록시아파타이트 충전제에, 단백질의 분리를 복수회에 걸쳐 연속하여 실시할 수 있는, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
처리액 중에 흡착제(3)를 유지하는 시간, 즉 흡착제(3)에 접촉시키는 시간은, 12시간 이상이면 되며, 48시간 이상 30일 이하 정도인 것이 바람직하고, 5일 이상 10일 이하 정도인 것이 보다 바람직하다.
흡착제(3)를 상기 처리액에 접촉시키는 시간을, 상기한 범위 내에 설정함으로써, 단백질의 분리가 실시된 흡착제(3)(하이드록시아파타이트 충전제)에, 단백질의 분리를 복수회에 걸쳐 연속하여 실시할 수 있는, 우수한 내구성을 확실하게 부여할 수 있다.
그리고, 상기 공정[S2B-1]과 상기 공정[S2B-2]은 조합하여 실시할 수도 있고, 또한 상기 공정[S2B-1]의 후에 상기 공정[S2B-2]을 실시할 수도 있다 .
알코올 혹은 NaOH를 포함하는 처리액을, 흡착제(3)에 접촉시키는 방법, 즉 상기 공정[S2B-1] 또는 공정[S2B-2]을 실시하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 컬럼 본체(21) 내에 충전된 흡착제(3)(실시 완료 분말)의 2배량 이상의 처리액을, 흡착제(3)를 통과시킨 후에, 이 처리액 중에 흡착제(3)를 유지하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이로써, 흡착제(3)에 대하여 처리액을 안정적으로 접촉시킬 수 있다.
구체적으로는, 컬럼(2)의 컬럼 본체(21) 내에 있어서, 충전되어 있는 흡착제(3)에 대하여, 유입관(24)으로부터 컬럼 본체(21) 내에, 흡착제(3)의 2배량 이상의 처리액을 공급한다. 그리고, 유출관(25)으로부터, 상기 공정[6A]을 행함으로써 컬럼 본체(21) 내에 잔존하고 있는 평형액이 유출하고, 컬럼(2) 내의 전체가, 평형액으로부터 처리액으로 치환된 시점에서, 유입관(24)로부터의 처리액의 공급을 정지한다. 이와 같이 컬럼(2) 내로의 처리액의 공급이 정지됨으로써, 처리액 중에 흡착제(3)가 유지된다.
상기 처리액을 컬럼 본체(21) 내에 공급할 때도, 컬럼 본체(21) 내에 충전된 흡착제(3), 특히, 유출측 개구 부근에 위치하는 흡착제(3)에 압력이 가해지게 되지만, 처리액으로서, 상기 공정[S2B-1] 또는 공정[S2B-2]에서와 같이, 알코올을 포함하는 처리액, 혹은 NaOH를 포함하는 처리액을 사용함으로써, 입자형을 이루는 흡착제(3)(분말)가, 모래형이 되는 것을 적절하게 억제 또는 방지할 수 있다.
여기서, 처리액 중에서의 흡착제(3)의 유지란, 흡착제(3)를 처리액 중에 침지한 상태에서, 유입관(24)로부터의 처리액의 공급, 및 유출관(25)로부터의 처리액의 배출이 정지되어 있는 상태인 것을 의미하며, 예를 들면, 초음파나 쉐이커에 의한 진동을 부여한다.
그리고, 상기 공정[S2B]에서는, 처리액 중에 흡착제(3)를 유지하고 있지만, 흡착제(3)는 처리액과 접촉하고 있으면 되고, 유입관(24)으로부터 컬럼(2) 내에 대한 처리액의 공급을 계속하여, 흡착제(3)에 처리액이 통액된 상태를 유지함으로써도, 흡착제(3)를 처리할 수 있다. 다만, 처리액 중에 흡착제(3)를 유지하는 방법을 선택함으로써, 낭비되는 처리액의 감소를 도모할 수 있다. 또한, 흡착제(3)에 처리액을 통액하는 방법을 선택한 경우, 처리액의 유속은, 바람직하게는 0.1mL/분 이상 10mL/분 이하 정도로 설정되고, 보다 바람직하게는 0.2mL/분 이상 5mL/분 이하 정도로 설정된다.
전술한 바와 같은 공정[S2B], 즉 하이드록시아파타이트 충전제로서의 흡착제(3)를, 알코올 혹은 NaOH를 포함하는 처리액으로 처리함으로써, 내구성을 향상시킨 하이드록시아파타이트 충전제(흡착제(3))를 얻는 재생산 공정이 구성된다.
전술한 바와 같은 조작에 의해, 단백질의 분리에 사용된 하이드록시아파타이트 충전제(흡착제(3))에, 우수한 내구성을 부여할 수 있으므로, 이 흡착제(3)를 구비하는 흡착 장치(1)를, 전술한 분리 방법에 사용할 수 있다.
이상의 설명에서는, 대전물질로서 단백질을 예로 들었으나, 음으로 대전한 물질은, 산성 단백질 외에, 산성 아미노산, DNA, RNA, 및 음전하 리포좀 등을 예로 들 수 있다. 양의 대전물질로서는, 염기성 단백질 외에, 염기성 아미노산, 양전하 콜레스테롤 및 양전하 리포좀 등을 예로 들 수 있다.
이상, 본 발명의 처리 방법, 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제에 대하여 설명하였으나, 본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 본 발명의 처리 방법 및 생산 방법에서는, 임의의 목적을 위해 하나 이상의 공정을 추가할 수 있다.
실시예
다음으로, 본 발명의 구체적 실시예에 대하여 설명한다.
1. 흡착 장치의 제조
흡착제(하이드록시아파타이트 충전제)로서 하이드록시아파타이트(BIO-RAD사 제조, CHT 40㎛ TypeI)를, 스테인레스 컬럼(내경 4.0mm×길이 100mm, 필터 2.0㎛)의 충전 공간에 거의 가득 채워, 흡착 장치를 제조했다.
2. 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대한, 제1 액체 및 제2 액체의 접촉
(실시예 1)
<1A> 먼저, 흡착 장치를, 크로마토그래프에 장착했다. 그 후, 400mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 10CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치를 400mM 인산 나트륨 완충액으로 치환했다.
<2A> 다음으로, 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 15CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치를 평형화했다.
<3A> 다음으로, 10mM 인산 나트륨과 1.0M 염화 나트륨을 포함하는 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 10CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 흡착한 단백질을 분리하는 공정을 상정했다.
<4A> 다음으로, 400mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 10CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치를 세정했다.
<5A> 다음으로, 1.0M 수산화 나트륨 수용액(온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 10CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치를 알칼리 세정했다.
<6A> 다음으로, 20wt% 에탄올 수용액(온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 10CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치에 충전된 흡착제를 20wt% 에탄올 수용액(제2 액체) 중에 침지시켰다. 그리고, 이 상태에서, 충전제를 48시간 보존하는 것에 의해, 20wt% 에탄올 수용액(제2 액체)을 흡착제에 접촉시켰다.
이 실시예 1에서는, 상기 공정<1A>∼상기 공정<5A>에 의해, 흡착 장치가 구비하는 흡착제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계가 구성되며, 상기 공정<6A>에 의해, 흡착 장치가 구비하는 흡착제를 알코올을 포함하는 제2 액체와 접촉시키는 제2 단계가 구성된다.
(실시예 2, 비교예 1∼비교예 4)
상기 공정<6A>에 있어서의 제2 액체로서, 20wt% 에탄올 수용액 대신에, 표 1에 기재된 것을 사용한 점 이외에는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대하여, 제1 액체 및 제2 액체를 접촉시켰다.
(실시예 3∼실시예 7, 비교예 5∼비교예 9)
상기 공정 <6A>에서의 제2 액체로서, 20wt% 에탄올 수용액 대신에, 표 1에 기재된 것을 사용하고, 또한 상기 공정<6A>에 있어서, 제2 액체에 침지한 상태에서, 충전제를 보존하는 시간을, 7일로 변경한 점 이외에는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대하여, 제1 액체 및 제2 액체를 접촉시켰다.
(실시예 8)
상기 공정<4A> 전에, 하기 공정<7A>을 추가한 점 이외에는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대하여, 제1 액체 및 제2 액체를 접촉시켰다.
<7A> 다음으로, 5mM 인산 나트륨과 0.5M 염화 나트륨을 포함하는 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 5CV로 흡착 장치에 통액하고, 이어서, 10mM 염화 칼슘과 50mM·MES를 포함하는 MES완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 5CV로 흡착 장치에 통액하고, 이어서, 5mM 인산 나트륨과 0.5M 염화 나트륨을 포함하는 인산 나트륨 완충액(pH 6.5, 온도 25℃)을, 유속 0.5mL/min, 유량 5CV로 흡착 장치에 통액함으로써, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 칼슘을 보충했다.
(참고예 1)
흡착제에 대하여 제2 액체를 접촉시키는 상기 공 <6A>을 생략한 점 이외에는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대하여, 제1 액체를 단독으로 접촉시켰다.
(참고예 2)
흡착제에 대하여 제2 액체를 접촉시키는 상기 공정<6A>을 생략한 점 이외에는, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대하여, 제1 액체를 단독으로 접촉시켰다.
3. 평가
각 실시예 및 각 비교예, 각 참고예에서의, 흡착 장치가 구비하는 흡착제에 대한 제1 액체 및 제2 액체의 접촉, 즉 상기 공정<1A>∼상기 공정<7A>을, 흡착 장치에서의 내압이 상승하여, 컬럼의 내압을 초과한 시점에서 종료로 하고, 각 실시예 및 각 비교예, 각 참고예에서 반복적으로 실시했다.
각 실시예 및 각 비교예, 각 참고예에 있어서, 상기 공정<1A>∼상기 공정<7A>이 반복적으로 실시된 횟수를, 표 1에 나타내었다.
그리고, 실시예 3 및 참고예 1에 대해서는, 이 횟수의 측정을, 합계 3회 실시하였으므로, 측정된 횟수의 평균값을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pct00001
표 1로부터 밝혀진 바와 같이, 실시예 5∼실시예 7과 같이, 제2 액체(보존 액)으로서, 함유량이 0.05M 이하의 NaOH를 포함하는 것을 사용함으로써, 참고예 1에 나타낸 바와 같이, 제2 액체(보존액)에 의한 처리 즉 보존을 생략한 경우와의 비교에서는, 반복 횟수가 증가하는 경향을 나타낸다고는 할 수 없지만, 비교예 1∼비교예 8에 나타낸 바와 같이, 함유량 0.05M를 초과하는 NaOH를 포함하는 것을 사용한 경우와 비교하여, 제2 액체(보존액)에 보존하는(접촉시키는) 시간을 고려하면, 반복 횟수가 증가하는 경향을 나타내고 있으므로, 흡착제(하이드록시아파타이트 충전제)의 내구성이 향상되는 결과를 나타낸다.
또한, 실시예 1∼실시예 4, 실시예 8과 같이, 제2 액체(보존액)으로서, 알코올(에탄올)을 포함하는 것을 사용하여 처리(보존)함으로써, 비교예 1∼비교예 8에 나타낸 바와 같이, 함유량 0.05M를 초과하는 NaOH를 포함하는 것을 사용한 경우, 또한, 실시예 5∼실시예 7에 나타낸 바와 같이, 함유량이 0.05M 이하인 NaOH를 포함하는 것을 사용한 경우, 또한 예상 외이게도, 참고예 1, 2에 나타낸 바와 같이, 제2 액체(보존액)에 의한 처리(보존)을 생략한 경우와 비교하여, 제2 액체(보존 액)에 보존하는(접촉하는) 시간을 고려하면, 반복 횟수가 보다 증가하는 경향을 나타내고 있으므로, 흡착제(하이드록시아파타이트 충전제)의 내구성을, 보다 향상시킬 수 있는 결과가 얻어졌다.
1: 흡착 장치
2: 컬럼
3: 흡착제
4: 필터 부재
5: 필터 부재
20: 흡착제 충전 공간
21: 컬럼 본체
22: 캡
23: 캡
24: 유입관
25: 유출관

Claims (12)

  1. 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계와,
    상기 하이드록시아파타이트 충전제를 알코올을 포함하는 제2 액체와 접촉시키는 제2 단계
    를 포함하는 처리 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 알코올은 저급 알코올인, 처리 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 액체 중의 상기 알코올의 함유량이 20wt% 이상인, 처리 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 액체는, 칼슘 이온을 더 포함하는, 처리 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제2 액체 중의 상기 칼슘 이온의 농도가 1.0mM 이상 20.0mM 이하인, 처리 방법.
  6. 하이드록시아파타이트 충전제를 소정의 물질을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 제1 단계와,
    상기 하이드록시아파타이트 충전제를 함유량이 0.05M 이하인 NaOH를 포함하는 제2 액체와 12시간 이상 접촉시키는 제2 단계
    를 포함하는 처리 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드록시아파타이트 충전제를 상기 제2 액체와 접촉시키는 상기 제2 단계는, 상기 하이드록시아파타이트 충전제의 2배량 이상의 상기 제2 액체를, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 통과시킨 후에, 상기 제2 액체 중에 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 유지하는 공정을 포함하는, 처리 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 단계는,
    상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 공급하는 공정;
    상기 소정의 물질로서 인산염과 다른 염을 포함하는 인산완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 회수 공정;
    상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 세정 공정;
    상기 소정의 물질로서 알칼리를 포함하는 알칼리 용액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 알칼리 세정 공정; 및
    상기 소정의 물질로서 인산염을 포함하는 인산완충액을, 상기 제1 액체로서, 상기 하이드록시아파타이트 충전제에 접촉시키는 pH 평형 공정;
    을 포함하는 처리 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 단계는, 세정 공정 전에, 하이드록시아파타이트 충전제를 칼슘 이온을 포함하는 제1 액체와 접촉시키는 것에 의해 Ca를 보충하는 공정을 더 포함하는, 처리 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 처리 방법에 의해 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 처리하는 처리 공정;
    목적물질을 포함하는 액체조성물을 준비하는 조성물 준비 공정; 및
    상기 처리 공정에서 처리된 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 사용하여, 상기 액체조성물로부터 상기 목적물질을 분리하는 분리 공정;
    을 포함하는 생산 방법.
  11. 목적물질을 포함하는 액체조성물로부터 상기 목적물질을 분리하는 분리 공정에 있어서 이미 1회 이상 사용된 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 준비하는 충전제 준비 공정과,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 처리 방법에 의해, 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 처리함으로써, 내구성을 향상시킨 상기 하이드록시아파타이트 충전제를 공급하는 재생산 공정을 포함하는,
    생산 방법.
  12. 제11항에 기재된 생산 방법에 의해 얻어지는 하이드록시아파타이트 충전제.
KR1020227035690A 2020-03-17 2020-04-07 처리 방법, 생산 방법 및 하이드록시아파타이트 충전제 KR20230002410A (ko)

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