JP2022027465A - アデノ随伴ウイルスの分離方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高品質な遺伝子療法用治療剤を提供するための、空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との改善された分離方法を提供する。【解決手段】完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法であって、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、約０．５～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を含む陰イオン交換クロマトグラフィーに前記試料を供するステップ、及び段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように前記平衡化緩衝液と前記塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップを含む方法である。【選択図】なし
Description
[0001]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法のベクターとして使用することができる、一本鎖ＤＮＡのゲノムを有する小さなウイルスである。ＡＡＶベクターの製造中には、所望のＤＮＡが欠如した不完全な粒子が生成される。試料中に空のＡＡＶ粒子（ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ ｐａｒｔｉｃｌｅ）が存在すると、遺伝子療法に必要とされる用量が増加し、望ましくない免疫応答が引き起こされることがある。空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子（ｆｕｌｌ ＡＡＶ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を分離する現在の方法には、密度勾配超遠心分離及びカラムクロマトグラフィーが含まれる。しかし、そのような方法は、大規模な操作においては、改善された分離を得ることが難しい。
[0002]よって、一貫性があって高品質な遺伝子療法用治療剤を提供するための、空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離の改善に対する需要が依然として存在する。
[0003]本発明は、完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシド（ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ）との混合物から完全なＡＡＶカプシド（ｆｕｌｌ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ）を濃縮する方法を提供する。該方法は、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに該試料を供するステップ、段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように該平衡化緩衝液と該塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップを含む。
[0004]該方法は、例えば、直線勾配を含めた公知のクロマトグラフィー分離方法に優る利点を提供して、一貫して濃縮された比の完全なＡＡＶカプシドを有する生成物（流体）をもたらす。
[0014]本発明は、空アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと完全なＡＡＶカプシドとを不均一な試料から分離するための陰イオン交換クロマトグラフィー法を対象とする。本発明は、少なくとも部分的に、空のＡＡＶ粒子が完全なＡＡＶ粒子より低い伝導率で溶出するという発見に依拠している。特に、完全なＡＡＶ粒子は、２６０ｎｍで空のＡＡＶ粒子よりも大きいＵＶ吸光度を有する（図１）。この分離は、空のＡＡＶ粒子の方が大きい２８０／２６０シグナル比を生じ、一方、完全なＡＡＶ粒子は１に近い２８０／２６０シグナル比を生じるというように、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を比較することによっても観察することができる。空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離の改善をもたらすのに加え、この方法は、超遠心分離などの公知の方法と比較して、製造のニーズに合わせた規模の拡大縮小を可能にする。本発明の方法の他の利益には、例えば、迅速な処理、血清型に依存しない試料の使用、及び様々なタイプのクロマトグラフィー媒体及び緩衝液組成物の使用が含まれる。
[0015]特に、本発明は、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法であって、
完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、
約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を含む陰イオン交換クロマトグラフィーに該試料を供するステップ、及び
段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように該平衡化緩衝液と該塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップ
を含む、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法を提供する。
完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、
約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を含む陰イオン交換クロマトグラフィーに該試料を供するステップ、及び
段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように該平衡化緩衝液と該塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップ
を含む、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法を提供する。
[0016]該方法は、任意の血清型、偽型、及び／又はバリアントのＡＡＶカプシドに適している。適切な血清型には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及びそれらの組合せが含まれる。ある特定の実施形態では、試料は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、又はそれらの組合せを含む。偽型のＡＡＶ粒子も使用することができ、偽型では、ある特定の型のゲノムが、異なる血清型のカプシド内に配置されている。例えば、試料は、血清型５のカプシド内に配置された血清型２のゲノムを含む、ＡＡＶ２／５を含むことができる。
[0017]分離しようとする試料は、任意の適切な濃度を有することができる。例えば、試料は、少なくとも約１×１０１１カプシド／ｍＬ（例えば、少なくとも約１．５×１０１１カプシド／ｍＬ、少なくとも約１×１０１２カプシド／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０１２カプシド／ｍＬ、少なくとも約１×１０１３カプシド／ｍＬ）のクロマトグラフィー媒体を含有することができる。好ましくは、開始ウイルス量は、少なくとも約１×１０１２カプシド／ｍＬのクロマトグラフィー媒体である。
[0018]陰イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換膜（例えば、正に帯電した膜）、イオン交換樹脂（例えば、正に帯電した樹脂）、又はモノリスを含めた任意の適切な分離方法を使用することができる。一部の実施形態では、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーに供するステップは、試料と正に帯電した微多孔膜とを接触させることを含む。陰イオンクロマトグラフィー用のクロマトグラフィー媒体は、例えば、ムスタング（ＭＵＳＴＡＮＧ）（商標）Ｑ ＸＴアクロディスク（Ｑ ＸＴ ＡＣＲＯＤＩＳＣ）（商標）（Ｐａｌｌ、ポートワシントン、ＮＹ）、シーマック（ＣＩＭａｃ）（商標）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、スロベニア）、ポロスＨＱ（ＰＯＲＯＳ ＨＱ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）、又はポロスＸＱ（ＰＯＲＯＳ ＸＱ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）であり得る。
[0019]ある特定の実施形態では、分離方法の最終段階は、約２０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率をもたらす。初期伝導率は、任意の所望の値であり、ＡＡＶ粒子の血清型及び緩衝液の組成に依存することとなる。典型的には、初期伝導率は、０．５ｍＳ／ｃｍ以上～１０ｍＳ／ｃｍ以下の範囲（例えば、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約０．７５ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、又は約１０ｍＳ／ｃｍ）である。例えば、初期伝導率は約１ｍＳ／ｃｍであってもよく、伝導率は、約２０ｍＳ／ｃｍに達するまで各段階で増加する。一般に、段階勾配は、典型的には各増分で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍの範囲の、伝導率の漸増的変化を含む。最終伝導率をもたらす増分の数は、電気伝導率の増分の大きさに応じて変動することとなる。好ましくは、各増分は各々約１ｍＳ／ｃｍである。該方法の中での増分は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。本明細書に記載する実施形態のいずれかでは、勾配段階は、段階終了時に紫外線（ＵＶ）強度をベースラインシグナルの２５％以内（例えば、２０％以内、１５％以内）にすることを可能とする長さのものである。好ましくは、ＵＶ強度は、段階終了時にベースラインシグナルの２０％以内である。
[0020]該分離方法は、平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液の混合物を必要とする。平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液は、任意の適切なｐＨを有することができる。好ましくは、平衡化緩衝液のｐＨと塩含有緩衝液のｐＨとを含む溶出緩衝液のｐＨは塩基性である（例えば、７より大きいｐＨ）。一部の実施形態では、該ｐＨは、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上、又は１０以上である。幾つかの好ましい実施形態では、該ｐＨは、約７～１０、約７～９、約７．５～１０．５、約８～１０．５、約８～１０、約８．５～９．５、又は約９である。
[0021]平衡化緩衝液は、約１５ｍＳ／ｃｍ以下（例えば、約１２ｍＳ／ｃｍ以下、約１０ｍＳ／ｃｍ以下、約８ｍＳ／ｃｍ以下、約６ｍＳ／ｃｍ以下、約５ｍＳ／ｃｍ以下、約４ｍＳ／ｃｍ以下、約３ｍＳ／ｃｍ以下、約２ｍＳ／ｃｍ以下、約１ｍＳ／ｃｍ）の伝導率を有する、任意の適切な緩衝液である。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
[0022]一般に、平衡化緩衝液は、本明細書に記載するように、塩基性のｐＨ（例えば、少なくとも７）で作動範囲を有することとなる。平衡化緩衝液は、例えば、ビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ＴＲＩＳ－Ｃｌ、ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ビス－６ＴＲＩＳプロパン、酢酸アンモニウム、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）水和物（ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、ジグリシン（グリシルグリシン）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（４－ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、３－｛［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ｝プロパン－１－スルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４－（シクロヘキシルアミノ）－１－ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、又は２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール（ＡＭＰ）であり得る。
[0023]塩含有緩衝液（例えば、高塩濃度含有緩衝液）は、本明細書に記載するものなどの任意の適切な平衡化緩衝液であるが、無機塩が添加されたものである。好ましい実施形態では、塩含有緩衝液は、平衡化緩衝液（例えば、ＢＴＰ）と同じである。ある特定の実施形態では、塩は、約１５ｍＳ／ｃｍ以上（例えば、約２０ｍＳ／ｃｍ以上、約３０ｍＳ／ｃｍ以上、約４０ｍＳ／ｃｍ以上、約５０ｍＳ／ｃｍ以上、約６０ｍＳ／ｃｍ以上、約６５ｍＳ／ｃｍ以上、約７０ｍＳ／ｃｍ以上、約７５ｍＳ／ｃｍ以上、約８０ｍＳ／ｃｍ以上、又は約８５ｍＳ／ｃｍ以上）の伝導率をもたらす量で緩衝液中に存在する。幾つかの好ましい実施形態では、塩含有緩衝液の電気伝導率は、約５０ｍＳ／ｃｍ以上、好ましくは約８０ｍＳ／ｃｍ以上である。一般に、該緩衝液中の塩の濃度は、少なくとも１００ｍＭ（例えば、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも６００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも９００ｍＭ、少なくとも１Ｍ、少なくとも１．１Ｍ、少なくとも１．２Ｍ、少なくとも１．３Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも１．６Ｍ、少なくとも１．８Ｍ、少なくとも１．９Ｍ）である。一部の実施形態では、該緩衝液中の塩の濃度は、２Ｍ以下（例えば、１．９Ｍ以下、１．８Ｍ以下、１．６Ｍ以下、１．５Ｍ以下、１．３Ｍ以下、１．２Ｍ以下、１．１Ｍ以下、１Ｍ以下、９００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、又は２００ｍＭ同様未満である。前述の端点のいずれか２つを使用して制限的な範囲を定義することも、又は単一の端点を使用して非制限的な範囲を定義することもできる。例えば、塩濃度は、２００ｍＭ～２Ｍ、５００ｍＭ～１．５Ｍ、９００ｍＭ～１．２Ｍ、又は約１Ｍであり得る。
[0024]該塩は、任意の無機塩、例えば、第Ｉ族金属（リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、又はセシウム）、第ＩＩ族金属（ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウム）、アンモニウム、又はアルミニウムの陽イオンを含有する任意の塩である。対陰イオンは、ハロゲン化物、炭酸イオン、炭酸水素イオン、硫酸イオン、チオ硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、臭素酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素酸イオンなどであり得る。塩の具体例として、臭化リチウム、塩化リチウム、ヨウ素酸リチウム、ヨウ化リチウム、水酸化リチウム、硫酸リチウム、リン酸リチウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、重硫酸ナトリウム、臭素酸ナトリウム、塩素酸ナトリウム、硫化水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、次亜リン酸ナトリウム、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素カリウム、臭素酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、炭酸カリウム、塩素酸カリウム、水酸化カリウム、ヨウ化カリウム、リン酸カリウム、チオ硫酸カリウム、臭化ルビジウム、塩化ルビジウム、フッ化ルビジウム、ヨウ化ルビジウム、硝酸ルビジウム、硫酸ルビジウム、臭化セシウム、塩化セシウム、炭酸セシウム、硝酸セシウム、硝酸ベリリウム、硫酸ベリリウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、塩化マグネシウム、ヨウ素酸マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸カルシウム、臭化カルシウム、塩化カルシウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、臭化ストロンチウム、塩化ストロンチウム、リン酸水素ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、硫酸ストロンチウム、酢酸バリウム、臭化バリウム、塩化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、リン酸バリウム、硫酸バリウム、チオ硫酸バリウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、臭化アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、該塩は、第Ｉ族－ハロゲン化物又は第Ｉ族－酢酸塩、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、又は酢酸カリウムである。
[0025]平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液の濃度は、任意の適切な濃度で使用される。ある特定の実施形態では、平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液は各々、少なくとも５ｍＭ（例えば、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭ、又は少なくとも５０ｍＭ）の濃度で使用される。典型的には、平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液は各々、１００ｍＭ以下（例えば、９０ｍＭ以下、８５ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７５ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、又は２０ｍＭ以下）の濃度で使用される。前述の端点のいずれか２つを使用して制限的な範囲を定義することも、又は単一の端点を使用して非制限的な範囲を定義することもできる。平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液の濃度は、典型的には異なることとなり、所望の伝導率レベルに基づいて変動することとなる。一部の実施形態では、平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液の濃度は各々、１０～１００ｍＭの間、好ましくは２０～５０ｍＭの間になることとなる。
[0026]分離方法中に伝導率を漸増的に変化させることは、平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の比を変えることによって行われる。よって、溶出緩衝液中の緩衝液の比率は、所望の段階勾配の増分（例えば、約１ｍＳ／ｃｍ）に従って変化することとなる。緩衝液の混合物は、クロマトグラフィー系内で予混合又は混合することができる。平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の初期比は、所望の初期伝導率（例えば、約１ｍＳ／ｃｍ）をもたらす任意の比であり、例えば、９０：１０～１００：０の範囲内の初期比である。一部の実施形態では、平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の初期比は約９８．３：１．７である。平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の最終比は、所望の最終伝導率（例えば、約２０ｍＳ／ｃｍ）をもたらす任意の比であり、例えば、７０：３０～８５：１５の範囲内の最終比である。一部の実施形態では、平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の最終比は約８１．５：１８．５である。好ましい実施形態では、平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の初期比は約９８．３：１．７であり、平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の最終比は約８１．５：１８．５である。
[0027]本明細書で使用する場合、「約」という用語は、典型的には値の±１％、値の±５％、又は値の±１０％を指す。
[0028]溶出容量は、試料の容量及びカラムのサイズによって変動することとなる。勾配の各段階で、異なる容量を生成することができる。溶出段階の容量が不十分である場合（例えば、クロマトグラフィーデバイスの２容量未満）、溶出段階中でピークは不完全に溶出され、分離が損なわれる。
[0029]該分離方法が進行するときに、タンパク質濃度（空の及び完全なカプシド）をモニタリングするために２８０ｎｍのＵＶ波長によって、及びＤＮＡ濃度（完全なカプシド）をモニタリングするために２６０ｎｍのＵＶ波長によって、クロマトグラフィーピークの分解能をモニタリングすることができる。本明細書における実施形態のいずれかでは、各伝導率段階からの流体は収集され、タンパク質及びＤＮＡを含有する試料（ＵＶによって特定される）がさらに分析される。分析は、典型的には、試料中のカプシド（すなわちタンパク質）の総数を算出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、及びゲノムコピーの数を特定することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、ドロップレットデジタル（ＤＲＯＰＬＥＴ ＤＩＧＩＴＡＬ）（商標）ＰＣＴ（ｄｄＰＣＲ）又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ））によって実施する。ＥＬＩＳＡのＰＣＲに対する比率は、完全なカプシドの量を示すことができ、それは引き続き、透過型電子顕微鏡及び／又は分析用超遠心分離などのさらなる分析法によって確認することができる。
[0030]該分離方法は、空のＡＡＶカプシドを低伝導率で溶出させて完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすという分解能をもたらす。「濃縮された」という用語は、本発明の方法を実施した後に、流体が、開始試料と比較して空のＡＡＶ粒子より多くの完全なＡＡＶ粒子を含有することを意味する。ある特定の実施形態では、分離された試料（流体）は、空のＡＡＶカプシドに対して完全なＡＡＶカプシドが少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％）濃縮されている。好ましくは、該方法によって、最終生成物（流体）中で空のＡＡＶカプシドに対して完全なＡＡＶが少なくとも７０％濃縮される。
[0031]本明細書に記載する方法は、典型的には、より大きい製造工程の一部である。よって、製造工程のさらなる過程では、例えば、ＡＡＶ試料の作製（上流の細胞培養）、ＡＡＶの初期ろ過（浄化／タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ））、及び／又はＡＡＶの精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる）が含まれる場合がある。そのようなステップは、本発明の伝導率勾配溶出を使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離する陰イオン交換クロマトグラフィー法に先行することとなる。本発明の分離方法は、カラム（例えば、膜）の平衡化、ＡＡＶ含有試料の適用、及び／又はカラム（例えば、膜）の洗浄を含めた初期ステップをさらに含むことができ、その後、伝導率段階勾配が行われる。
[0032]本発明を以下の実施形態によってさらに説明する。
[0033]（実施形態１）完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法であって、完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を含む陰イオン交換クロマトグラフィーに該試料を供するステップ、及び段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように該平衡化緩衝液と該塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップを含む方法。
[0034]（実施形態２）陰イオン交換クロマトグラフィーに該試料を供するステップが、正に帯電した微多孔膜に該試料を接触させることを含む、実施形態（１）に記載の方法。
[0035]（実施形態３）最終段階が約２０ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらす、実施形態（１）又は（２）に記載の方法。
[0036]（実施形態４）平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の初期比が約９８．３：１．７である、実施形態（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
[0037]（実施形態５）平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の最終比が約８１．５：１８．５である、実施形態（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
[0038]以下の実施例は本発明をさらに説明するが、当然のことながら、本発明の範囲をいかなる方法であれ限定すると解釈されるべきではない。
実施例１
[0039]この実施例は、伝導率段階勾配を使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離を実現するためのプロトコルを実証する。そのステップを表１に示す。
[0039]この実施例は、伝導率段階勾配を使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離を実現するためのプロトコルを実証する。そのステップを表１に示す。
実施例２
[0040]この実施例は、空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離を実現するためのＡＫＴＡ（商標）アヴァント（Ａｖａｎｔ）プロトコルについて記載する。
[0040]この実施例は、空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子との分離を実現するためのＡＫＴＡ（商標）アヴァント（Ａｖａｎｔ）プロトコルについて記載する。
[0041]空の及び完全なウイルス粒子を含有するアフィニティー精製されたＡＡＶ試料溶液を得て、自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（ポール（ＰＡＬＬ）ムスタング（商標）Ｑアクロディスク（商標）（０．８６ｍＬ ＣＶ））での陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに適用した。溶出緩衝液は、以下を含んでいた：
８．５～９．５のｐＨ範囲で低伝導率（＜５ｍＳ／ｃｍ）の平衡化緩衝液
８．５～９．５のｐＨ範囲でより高い伝導率（＞８０ｍＳ／ｃｍ）の高塩濃度緩衝液
８．５～９．５のｐＨ範囲で低伝導率（＜５ｍＳ／ｃｍ）の平衡化緩衝液
８．５～９．５のｐＨ範囲でより高い伝導率（＞８０ｍＳ／ｃｍ）の高塩濃度緩衝液
[0042]分離を実現するために使用した方法を表２に示す。
[0043]空のカプシドと完全なカプシドの分離は、タンパク質含有量については２８０ｎｍの波長、ＤＮＡ含有量については２６０ｎｍの波長での吸光度によってモニタリングした。より高い比率の完全なＡＡＶカプシドを含有する最終溶出は、ドロップレットデジタル（商標）法ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ）を実施して、溶出されたウイルス粒子中に存在するゲノムコピーの数を測定することによって確認した。カプシド酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、溶出されたウイルス粒子中に存在する形成されたＡＡＶカプシドの総数を測定した。図２は、高い方の伝導率段階で生じた溶出ピークが、早い方の溶出ピークに対して多くの量のゲノムコピーを含有していたことを示している。
実施例３
[0044]この実施例は、膜での陰イオンクロマトグラフィーを使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離するための方法について記載する。
[0044]この実施例は、膜での陰イオンクロマトグラフィーを使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離するための方法について記載する。
[0045]ＡＡＶ５粒子を含む試料を負荷したザルトバインド（ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ）（商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、フランス）１ｍＬ膜カラムを使用した１ｍＳ／ｃｍの溶出方法を使用して、実施例２を繰り返した。その結果を図３に示す。
実施例４
[0046]この実施例は、モノリスカラムでの陰イオンクロマトグラフィーを使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子を分離するための方法について記載する。
[0046]この実施例は、モノリスカラムでの陰イオンクロマトグラフィーを使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子を分離するための方法について記載する。
[0047]ＡＡＶ５粒子を含む試料を負荷したシーマック（商標）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、スロベニア）０．１ｍＬモノリスカラムを使用した１ｍＳ／ｃｍの溶出方法を使用して、実施例２を繰り返した。その結果を図４に示す。
実施例５
[0048]この実施例は、空のＡＡＶ５粒子と、それに対する完全なＡＡＶ５粒子の、別個のクロマトグラフィーパターンを示す。
[0048]この実施例は、空のＡＡＶ５粒子と、それに対する完全なＡＡＶ５粒子の、別個のクロマトグラフィーパターンを示す。
[0049]空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離する業界の一般的な手法である超遠心分離によって、ＡＡＶ５の空の及び完全な粒子の標準を得た。本発明の伝導率段階勾配溶出方法を、空の及び完全なＡＡＶ５標準に対して実施した。図５は、空のＡＡＶ５標準を使用して生じたピークを示しており、それにおいて、空のＡＡＶ粒子は、２８０ｎｍでの吸光度の方が２６０ｎｍと比較して高く、そして１０ｍＳ／ｃｍ及び１１ｍＳ／ｃｍ付近の伝導率で溶出する。図６は、完全なＡＡＶ５標準を使用して生じたピークを示しており、それにおいて、完全な粒子は、２８０ｎｍと２６０ｎｍの両方で同等の吸光度を有しており、そして１１～１３ｍＳ／ｃｍ付近の伝導率で溶出する。
[0050]図７は、空の標準の分離クロマトグラムと完全な標準の分離クロマトグラムとの重ね合わせを示す。空のＡＡＶ５粒子は、完全なＡＡＶ５粒子と比較して低い伝導率で溶出する。これらのクロマトグラムによって、ＡＡＶ５の空の粒子と完全な粒子の分離がこの伝導率段階手法を使用して実現できることが実証される。
比較例１
[0051]この実施例は、直線勾配陰イオン交換カラムクロマトグラフィー法を使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離する方法について記載する。
[0051]この実施例は、直線勾配陰イオン交換カラムクロマトグラフィー法を使用して空のＡＡＶ粒子と完全なＡＡＶ粒子とを分離する方法について記載する。
[0052]この方法は、（ａ）ムスタング（商標）Ｑ ＸＴ０．８６ｍＬアクロディスク（商標）（Ｐａｌｌ、ポートワシントン、ＮＹ）（図８）、又は（ｂ）０．１ｍＬ分析用シーマック（商標）モノリスカラム（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、スロベニア）（図９）のいずれかを使用するときに、空のＡＡＶ５粒子と完全なＡＡＶ５粒子との一般的なＡＡＶカプシド分離のために、直線塩勾配溶出（０～２００ｍＭ）を使用した。図８及び９から分かるように、汎用される直線勾配溶出は、ポールムスタング（商標）Ｑ膜又はシーマック（商標）モノリス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）のいずれにおいても、空のＡＡＶ５ウイルスベクターと完全なＡＡＶ５ウイルスベクターとの分離を示さなかった。
[0053]本明細書に引用する、刊行物、特許出願、及び特許を含めた全ての参考文献は、各々の参考文献が参照により組み込まれると個々に且つ具体的に示され、その全体が本明細書に記述されているのと同程度に、本明細書に参照により組み込まれる。
[0054]本発明を記載する文脈での（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈での）「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び「少なくとも１つ」という用語並びに同様の指示語の使用は、本明細書に特に示さない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方に及ぶと解釈されるべきである。１つ又は複数の項目の列挙が後に続く「少なくとも１つ」という用語の使用は（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）、本明細書に特に示さない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙された項目から選択された１つの項目（Ａ又はＢ）、又は列挙された項目の２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する）」という用語は、特に断りのない限り、非制限用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に特に示さない限り、範囲内の別々の各値を個々に指す簡略な方法としての役割を果たすことが意図されるに過ぎず、別々の各値は、本明細書に個々に列挙されたもののごとく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載する全ての方法は、本明細書で特に示さない限り、又は他に文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供するあらゆる実施例又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることを意図するに過ぎず、特に請求項に記載されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中のいかなる言葉も、特許請求されていない任意の要素が本発明の実践に不可欠であると示していると解釈されるべきではない。
[0055]本発明者らの知る本発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変法は、当業者であれば前述の記載を読めば明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変法を適宜用いることを予期し、また本発明者らは、本明細書に具体的に記載したもの以外で本発明が実践されることを意図している。したがって、本発明は、適用法で許可されている通り、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変及び等価物を含む。さらに、その全ての可能な変法における上記の要素のいずれの組合せも、本明細書に特に示さない限り、又は他に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
Claims (5)
- 完全なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物から完全なＡＡＶカプシドを濃縮する方法であって、
完全なＡＡＶカプシドと空のＡＡＶカプシドとの混合物を含む試料を用意するステップ、
約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内の初期伝導率をもたらす初期比で平衡化緩衝液及び塩含有緩衝液を含む溶出緩衝液を含む陰イオン交換クロマトグラフィーに前記試料を供するステップ、及び
段階勾配の伝導率増加が各段階で約０．５～２．０ｍＳ／ｃｍとなるように前記平衡化緩衝液と前記塩含有緩衝液の比を変化させて、空のＡＡＶカプシドを溶出させ、完全なＡＡＶカプシドが濃縮された流体をもたらすステップ
を含む方法。 - 陰イオン交換クロマトグラフィーに前記試料を供するステップが、正に帯電した微多孔膜に前記試料を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 最終段階が約２０ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらす、請求項１又は２に記載の方法。
- 平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の初期比が約９８．３：１．７である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 平衡化緩衝液と塩含有緩衝液の最終比が約８１．５：１８．５である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
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