KR20220014851A - 아데노바이러스-연관 바이러스 분리 방법 - Google Patents

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Abstract

완전(full) AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물로부터 완전 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 농축하는 방법으로서, 상기 방법은 완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물을 포함하는 시료를 제공하는 단계, 상기 시료를 초기 전도율을 제공하는 초기 비율로 평형화 완충액 및 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계, 및 상기 평형화 완충액 및 상기 염-함유 완충액의 비율을 변경하여 각 스텝에서 약 0.5-2.0 mS/cm의 스텝 구배 전도율 상승을 제공하여, 빈 AAV 캡시드를 용리시키고, 완전 AAV 캡시드로 농축된 유체를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.

Description

아데노바이러스-연관 바이러스 분리 방법{ADENOVIRUS-ASSOCIATED VIRUSES SEPARATION METHOD}
아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV)는 유전자 치료법을 위한 벡터로 사용될 수 있는 단일가닥 DNA의 게놈을 갖는 작은 바이러스이다. AAV 벡터의 제조 동안, 원하는 DNA가 없는 불완전한 입자가 생성된다. 시료 중 빈 AAV 입자의 존재는 유전자 치료법을 위해 요구되는 용량을 증가시키고 원치않는 면역 반응을 유발할 수 있다. 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 현재의 방법은 밀도 구배 초원심분리 및 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 그러나, 그러한 방법은 개선된 분리로 대규모로 수행하기 어렵다.
따라서, 유전자 치료법을 위한 안정하고 더 높은 품질을 갖는 치료제를 제공하기 위해 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자의 개선된 분리에 대한 요구가 있다.
발명의 요약
본 발명은 완전(full) AAV 캡시드와 빈(empty) AAV 캡시드의 혼합물로부터 완전한 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 농축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물을 포함하는 시료를 제공하는 단계, 상기 시료를 약 0.5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm 범위의 초기 전도율을 제공하는 초기 비율로 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액에 의한 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계, 및 상기 평형화 완충액과 상기 염-함유 완충액의 비율을 변경하여 각 스텝에서 약 0.5-2.0 mS/cm의 스텝 구배 전도율 상승(step gradient conductivity increase)을 제공하여, 빈 AAV 캡시드를 용리시키고, 완전 AAV 캡시드로 농축된 유체를 제공하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 완전 AAV 캡시드의 일관되게 농축된 비율을 갖는 산물(유체)을 제공하기 위해, 공지된 크로마토그래피 분리 방법, 예를 들면, 선형 구배를 포함한 방법에 비해 잇점을 제공한다.
본 발명은 이질적인 시료로부터 빈 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 완전 AAV 캡시드의 분리를 위한 음이온 교환 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로, 빈 AAV 입자는 완전 AAV 입자보다 더 낮은 전도율에서 용리된다는 발견에 근거한다. 구체적으로, 완전 AAV 입자는 260 nm에서 빈 AAV 입자보다 더 큰 UV 흡광도를 갖는다 (도 1). 이 분리는 또한 280 nm 및 260 nm에서 UV 흡광도를 비교하는 것에 의해 관찰될 수 있어서, 빈 AAV 입자는 더 높은 280/260 신호비를 생성하나, 완전 AAV 입자는 1에 가까운 280/260 신호비를 생성한다. 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자의 개선된 분리를 제공하는 것 외에, 이 방법은 초-원심분리와 같은 공지된 방법에 비해, 제조 니즈에 따라 규모를 조정할 수 있게 한다. 본 발명의 다른 잇점들은 예를 들면, 신속한 처리, 혈청형-독립적인 시료의 사용, 및 다양한 종류의 크로마토그래피 매질 및 완충액 조성물의 사용을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물로부터 완전 AAV 캡시드를 농축하는 방법으로서, 상기 방법은
완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물을 포함하는 시료를 제공하는 단계,
상기 시료를 약 0.5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm 범위의 초기 전도율을 제공하는 초기 비율로 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계, 및
상기 평형화 완충액과 상기 염-함유 완충액의 비율을 변경하여 각 스텝에서 약 0.5-2.0 mS/cm의 스텝 구배 전도율 상승을 제공하여, 빈 AAV 캡시드를 용리시키고, 완전 AAV 캡시드로 농축된 유체를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법은 AAV 캡시드의 임의의 혈청형, 슈도타입(pseudotype), 및/또는 변이체를 위해 적합한다. 적절한 혈청형은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 시료는 AAV 혈청형 2 (AAV2), AAV 혈청형 5 (AAV5), 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정한 타입의 게놈이 상이한 혈청형의 캡시드 내에 배치된 것인 슈도타입 AAV 입자도 사용될 수 있다. 예를 들면, 시료는 혈청형 5의 캡시드 내에 배치된 혈청형 2의 게놈을 포함하는 AAV2/5를 포함할 수 있다.
분리될 시료는 적절한 농도를 가질 수 있다. 예를 들면, 시료는 적어도 약 1x1011개 캡시드/mL 크로마토그래피 매질(chromatograph medium)(예를 들면, 적어도 약 1.5x1011개 캡시드/mL, 적어도 약 1x1012개 캡시드/mL, 적어도 약 1.5x1012개 캡시드/mL, 적어도 약 1x1013개 캡시드/mL)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 개시 바이러스 부하(starting viral load)는 적어도 약 1x1012개 캡시드/mL 크로마토그래피 매질일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 이온 교환 막(예를 들면, 양으로 하전된 막), 이온 교환 수지(예를 들면, 양으로 하전된 수지), 또는 모노리스(monolith)를 포함한, 임의의 적절한 분리 방법을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 시료를 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 것은 상기 시료와 양으로 하전된 미세다공성 막을 접촉시키는 것을 포함한다. 음이온성 크로마토그래피를 위한 크로마토그래피 매질은 예를 들면, MUSTANG™ Q XT ACRODISC™ (Pall, Port Washington, NY), CIMac™ (BIA Separations, Slovenia), POROS HQ (ThermoFisher, Waltham, MA), 또는 POROS XQ (ThermoFisher, Waltham, MA)일 수 있다.
특정 구체예에서, 분리 방법의 최종 단계는 약 20 mS/cm의 전기 전도율을 제공한다. 초기 전도율은 임의의 원하는 값이고, AAV 입자의 혈청형 및 완충액 조성에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 초기 전도율은 0.5 mS/cm 이상 내지 10 mS/cm 이하 (예를 들면, 약 0.5 mS/cm, 약 0.75 mS/cm, 약 1 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 9 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 또는 약 10 mS/cm)의 범위이다. 예를 들면, 초기 전도율은 약 1 mS/cm일 수 있고, 전도율은 약 20 mS/cm에 도달할 때까지, 각 스텝으로 증가한다. 일반적으로, 스텝 구배는 통상적으로 각 증분으로, 약 0.5-2.0 mS/cm 범위의 전도율의 증가 변화를 포함한다. 최종 전도율을 제공하기 위한 증분의 개수는 전기 전도율 증분의 크기에 따라 다양할 것이다. 바람직하게는, 각 증분은 각각 약 1 mS/cm이다. 상기 방법 내에서 증분은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 본 명세서에 기재된 구체예에서, 구배 스텝들은 자외선(UV) 강도가 스텝의 종료시 기준선 신호(baseline signal)의 25% 내(예를 들면, 20% 내, 15% 내)일 수 있게 하는 길이일 수 있다. 바람직하게는, UV 강도는 스텝의 종료시, 기준선 신호의 20% 내(예를 들면, 20% 내, 15% 내)이다.
분리 방법은 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액의 혼합물을 필요로 한다. 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는, 용리 완충액은 임의의 적절한 pH를 가질 수 있다. 바람직하게는, 평형화 완충액의 pH 및 염-함유 완충액의 pH를 포함한, 용리 완충액의 pH는 염기성(예를 들면, 7보다 큰 pH)이다. 일부 구체예에서, pH는 7.5 이상, 8 이상, 8.5 이상, 9 이상, 9.5 이상, 또는 10 이상이다. 일부 바람직한 구체예에서, pH는 약 7-10, 약 7-9, 약 7.5-10.5, 약 8-10.5, 약 8-10, 약 8.5-9.5, 또는 약 9이다.
평형화 완충액은 약 15 mS/cm 이하(예를 들면, 약 12 mS/cm 이하, 약 10 mS/cm 이하, 약 8 mS/cm 이하, 약 6 mS/cm 이하, 약 5 mS/cm 이하, 약 4 mS/cm 이하, 약 3 mS/cm 이하, 약 2 mS/cm 이하, 약 1 mS/cm)의 전도율을 갖는 적절한 완충액이다. 일부 구체예에서, 평형화 완충액은 약 1 mS/cm의 전도율을 갖는다.
일반적으로, 평형화 완충액은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 염기성 pH (예를 들면, 적어도 7)를 갖는 작동 범위(operating range)를 가질 것이다. 평형화 완충액은 예를 들면, 비스-트리스 프로판 (BTP), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), TRIS-Cl, TRIS-HCl, 비스-6TRIS 프로판, 암모늄 아세테이트, 2-[[1,3-디히드록-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES), 3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), 4-(N-모르폴리노)부탄술폰산 (MOBS), 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판술폰산) 히드레이트 (HEPPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산 (EPPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (bicine), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신 (tricine), 디글리신 (gly-gly), N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄술폰산) (HEPBS), 3-{[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노}프로판-1-술폰산 (TAPS), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올 (AMPD), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산 (AMPSO), 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES), 3-(시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산 (CAPSO), 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판술폰산 (CAPS), 4-(시클로헥실아미노)-1-부탄술폰산 (CABS), 또는 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 (AMP)일 수 있다.
염-함유 완충액(예를 들면, 고 염-함유 완충액)은 임의의 적절한 평형화 완충액, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 것들이나, 무기염이 첨가된 것이다. 바람직한 구체예에서, 염-함유 완충액은 평형화 완충액(예를 들면, BTP)과 동일하다. 특정 구체예에서, 염은 완충액에 약 15 mS/cm 이상 (예를 들면, 약 20 mS/cm 이상, 약 30 mS/cm 이상, 약 40 mS/cm 이상, 약 50 mS/cm 이상, 약 60 mS/cm 이상, 약 65 mS/cm 이상, 약 70 mS/cm 이상, 약 75 mS/cm 이상, 약 80 mS/cm 이상, 또는 약 85 mS/cm 이상)의 전도율을 제공하는 양으로 존재한다. 일부 바람직한 구체예에서, 염-함유 완충액의 전기 전도율은 약 50 mS/cm 이상, 바람직하게는 약 80 mS/cm 이상이다. 일반적으로, 완충액 중 염의 농도는 적어도 100 mM (예를 들면, 적어도 200 mM, 적어도 300 mM, 적어도 500 mM, 적어도 600 mM, 적어도 800 mM, 적어도 900 mM, 적어도 1 M, 적어도 1.1 M, 적어도 1.2 M, 적어도 1.3 M, 적어도 1.5 M, 적어도 1.6 M, 적어도 1.8 M, 적어도 1.9 M)이다. 일부 구체예에서, 완충액 중 염의 농도는 2 M 이하 (예를 들면, 1.9 M 이하, 1.8 M 이하, 1.6 M 이하, 1.5 M 이하, 1.3 M 이하, 1.2 M 이하, 1.1 M 이하, 1 M 이하, 900 mM 이하, 800 mM 이하, 600 mM 이하, 500 mM 이하, 300 mM 이하, 또는 200 mM 이하)이다. 전술된 종말점 중 2개가 폐쇄형 범위를 정의하기 위해 이용될 수 있거나, 또는 하나의 종말점이 개방형 범위를 정의하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 염 농도는 200 mM 내지 2 M, 500 mM 내지 1.5 M, 900 mM 내지 1.2 M, 또는 약 1 M이다.
염은 임의의 무기염, 예를 들면, 그룹 I 금속 (리튬, 소듐, 포타슘, 루비듐, 또는 세슘), 그룹 II 금속 (베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 또는 바륨), 암모늄 또는 알루미늄의 양이온을 포함하는 임의의 염이다. 반대 음이온(counter anion)은 할로겐화물, 탄산염, 중탄산염, 황산염, 티오황산염(thiosulfate), 인산염, 질산염, 아질산염, 아세트산염, 브롬산염(bromate), 염소산염(chlorate), 요도드산염(iodate) 등이다. 염의 구체적 예는 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 리튬 아이오데이트(iodate), 리튬 아이오디드, 리튬 히드록시드, 리튬 술페이트, 리튬 포스페이트, 소듐 브로마이드, 소듐 클로라이드, 소듐 아세테이트, 소듐 비카르보네이트, 소듐 비술페이트, 소듐 브로메이트(bromate), 소듐 클로레이트(chlorate), 소듐 히드로술피드(hydrosulfide), 소듐 히드록시드, 소듐 하이포포스파이트(hypophosphite), 소듐 아이오데이트, 소듐 아이오디드, 포타슘 아세테이트, 포타슘 비카르보네이트, 포타슘 브로메이트, 포타슘 브로마이드, 포타슘 클로라이드, 포타슘 카르보네이트, 포타슘 클로레이트, 포타슘 히드록시드, 포타슘 아이오디드, 포타슘 포스페이트, 포타슘 티오술페이트, 루비듐 브로마이드, 루비듐 클로라이드, 루비듐 플루오리드, 루비듐 아이오디드, 루비듐 니트레이트, 루비듐 술페이트, 세슘 브로마이드, 세슘 클로라이드, 세슘 카르보네이트, 세슘 니트레이트, 베릴륨 니트레이트, 베릴륨 술페이트, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 브로마이드, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 아이오데이트, 마그네슘 아이오디드, 마그네슘 니트레이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 술페이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 칼슘 아이오디드, 칼슘 아이오데이트, 칼슘 니트리트(nitrite), 칼슘 니트레이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 술페이트, 스트론튬 브로마이드, 스트론튬 클로라이드, 스트론튬 히드로겐 포스페이트, 스트론튬 아이오디드, 스트론튬 니트레이트, 스트론튬 술페이트, 바륨 아세테이트, 바륨 브로마이드, 바륨 클로라이드, 바륨 아이오디드, 바륨 니트레이트, 바륨 포스페이트, 바륨 술페이트, 바륨 티오술페이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 비카르보네이트, 암모늄 브로마이드, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트, 알루미늄 클로라이드, 알루미늄 포스페이트, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 염은 그룹 I-할로겐화물 또는 그룹 I-아세테이트 염, 예를 들면, 소듐 클로라이드, 소듐 아세테이트, 포타슘 클로라이드, 또는 포타슘 아세테이트이다.
평형화 완충액 및 염-함유 완충액의 농도는 적절한 농도로 이용된다. 특정 구체예에서, 평형화 완충액 및 염-함유 완충액은 각각 적어도 5 mM (예를 들면, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 35 mM, 적어도 40 mM, 적어도 45 mM, 또는 적어도 50 mM)의 농도로 이용된다. 통상적으로, 평형화 완충액 및 염-함유 완충액은 각각 100 mM 이하 (예를 들면, 90 mM 이하, 85 mM 이하, 80 mM 이하, 75 mM 이하, 70 mM 이하, 65 mM 이하, 60 mM 이하, 55 mM 이하, 50 mM 이하, 45 mM 이하, 40 mM 이하, 35 mM 이하, 30 mM 이하, 25 mM 이하, 또는 20 mM 이하)의 농도로 이용된다. 전술된 종말점 중 2개가 폐쇄형 범위를 정의하기 위해 이용될 수 있거나, 또는 하나의 종말점이 개방형 범위를 정의하기 위해 이용될 수 있다. 평형화 완충액 및 염-함유 완충액의 농도는 통상적으로 상이할 것이고, 원하는 전도율 수준에 근거하여 변할 것이다. 일부 구체예에서, 평형화 완충액 및 염-함유 완충액의 농도는 각각 10-100 mM, 바람직하게는 20-50 mM일 것이다.
분리 방법 동안 전도율을 증분에 의해 변화시키는 것은 평형화 완충액과 염-함유 완충액의 비율을 변화시키는 것에 의해 일어난다. 따라서, 용리 완충액 중 완충액들의 비율은 원하는 스텝 구배 증분(예를 들면, 약 1 mS/cm)에 따라 변할 것이다. 완충액의 혼합물을 미리 혼합하거나 또는 크로마토그래피 시스템 내에서 혼합할 수 있다. 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 초기 비율은 원하는 초기 전도율 (예를 들면, 약 1 mS/cm)을 제공하는 임의의 비율, 예를 들면, 90:10 내지 100:0 내의 초기 비율이다. 일부 구체예에서, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 초기 비율은 약 98.3:1.7이다. 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 최종 비율은 원하는 최종 전도율 (예를 들면, 약 20 mS/cm)을 제공하는 임의의 비율, 예를 들면, 70:30 내지 85:15 내의 최종 비율이다. 일부 구체예에서, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 최종 비율은 약 81.5:18.5이다. 바람직한 구체예에서, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 초기 비율은 약 98.3:1.7이고, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 최종 비율은 약 81.5:18.5이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "약"은 통상적으로 값의 ± 1%, 값의 ± 5%, 또는 값의 ± 10%를 의미한다.
용리 부피는 시료 부피 및 컬럼 크기에 따라 다를 것이다. 구배의 각 스텝은 상이한 부피를 생성할 수 있다. 용리 스텝들이 불충분한 부피(예를 들면, 크로마토그래피 장치의 2 부피 미만)인 경우, 용리 스텝 내에서, 피크들은 불완전하게 용리되고, 분리가 저하된다.
분리 방법이 진행되면서, 크로마토그래피 피크의 분해(resolution)는 단백질 농도(빈 캡시드 및 완전 캡시드)를 모니터링하기 위해 280 nm의 UV 파장에 의해 및 DNA 농도(완전 캡시드)를 모니터링하기 위해 260 nm의 UV 파장에 의해 모니터링될 수 있다. 본 명세서에 기재된 구체예에서, 각 전도율 스텝으로부터의 유체를 수집하고, UV에 의해 확인된 바와 같이, 단백질 및 DNA를 포함하는 시료를 더 분석한다. 분석은 통상적으로 시료 중 캡시드(즉, 단백질)의 총 개수를 계산하기 위해 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 및 게놈 카피의 개수를 확인할 수 있는, PCR(polymerase chain reaction) (예를 들면, DROPLET DIGITAL™ PCT (ddPCR) 또는 정량적 PCR (qPCR))를 통해 수행된다. ELISA 대 PCR의 비율은 완전 캡시드의 양을 나타낼 수 있고, 이는 후속적으로 추가적인 분석 방법, 예를 들면, 투과 전자 현미경(TEM) 및/또는 분석 초원심분리에 의해 확인될 수 있다.
분리 방법은 또한 완전 AAV 팹티드로 농축된 유체를 제공하기 위해 더 낮은 전도율에서 빈 AAV 캡시드를 용리시키는 해법을 제공한다. 용어 "농축된(enriched)"은 출발 시료 대비 본 발명의 방법을 수행한 후, 유체가 빈 AAV 입자 대비 더 많은 완전 AAV 입자들을 포함한다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 분리된 시료(유체)는 빈 AAV 캡시드 대비 적어도 50% (예를 들면, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85%) 완전 AAV 캡시드로 농축된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 최종 산물(유체) 중 빈 AAV 캡시드 대비 적어도 70% 완전 AAV의 농축을 제공한다.
본 명세서에 기재된 방법은 더 큰 생산 공정의 일부이다. 따라서, 생산 공정의 추가적인 단계들은 예를 들면, AAV 시료의 생성(업스트림 세포 배양), AAV의 초기 여과(청정화(clarification)/TFF (tangential flow filtration)), 및/또는 AAV의 정제(예를 들면, 친화도 크로마토그래피에 의한 정제)를 포함할 수 있다. 그러한 단계들이 본 발명의 전도율 구배 용리를 이용하여 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 음이온-교환 크로마토그래피 방법을 선행할 것이다. 본 발명의 분리 방법은 컬럼(예를 들면, 막)의 평형화, AAV-함유 시료의 적용, 및/또는 컬럼(예를 들면, 막)의 세척 및 뒤이은 전도율 스텝 구배를 포함한, 초기 단계들을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 구체예에 의해 더 설명된다.
(구체예 1) 완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물로부터 완전 AAV 캡시드를 농축하는 방법으로서, 상기 방법은 완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물을 포함하는 시료를 제공하는 단계, 상기 시료를 약 0.5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm 범위의 초기 전도율을 제공하는 초기 비율로 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계, 및 상기 평형화 완충액과 상기 염-함유 완충액의 비율을 변경하여 각 스텝에서 약 0.5-2.0 mS/cm의 스텝 구배 전도율 상승을 제공하여, 빈 AAV 캡시드를 용리시키고, 완전 AAV 캡시드로 농축된 유체를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
(구체예 2) 구체예 (1)에서, 상기 시료를 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계는 양으로 하전된 미세다공성 막을 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
(구체예 3) 구체예 (1) 또는 (2)에서, 최종 단계는 약 20 mS/cm의 전도율을 제공하는 것인 방법.
(구체예 4) 구체예 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에서, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 초기 비율은 약 98.3:1.7인 것인 방법.
(구체예 5) 구체예 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에서, 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 최종 비율은 약 약 81.5:18.5인 것인 방법.
하기 실시예는 본 발명을 더 설명하나, 물론, 어떠한 방식으로도 그 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 양으로 하전된 막 컬럼에 의한 1 mS/cm 스텝 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자의 분리의 그래프이다.
도 2는 생성된 각 피크에 대한 게놈 카피 대 캡시드 비율의 데이터를 포함하는 정렬된 표 및 분리된 빈 AAV5 입자 및 완전 AAV5 입자의 크로마토그램이고, 완전 AAV5 입자들이 후기 피크(피크 3 및 4)에서 발견된다는 것을 나타낸다.
도 3은 또 다른 양으로 하전된 막 컬럼에 의한 1 mS/cm 스텝 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자의 분리의 크로마토그램이다.
도 4는 양으로 하전된 모노리스(monolith) 컬럼에 의한 1 mS/cm 스텝 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자의 분리의 크로마토그램이다.
도 5는 양으로 하전된 막 컬럼에 의한 빈 AAV5 표준을 이용하여 생성된 피크를 보여준다. 빈 AAV5 입자들은 260 nm 대비 280 nm에서 더 높은 흡광도를 갖고, 10 mS/cm 및 11 mS/cm 부근의 전도율에서 용리된다.
도 6은 양으로 하전된 막 컬럼에 의한 완전 AAV5 표준을 이용하여 생성된 피크를 보여준다. 완전 입자들은 280 nm 및 260 nm 모두에서 동등한 흡광 강도를 갖고, 11 - 13 mS/cm 부근의 전도율에서 용리된다.
도 7은 빈 AAV5 (도 5) 및 완전 AAV5 (도 6) 표준 분리 크로마토그램의 오버레이(overlay)를 보여준다.
도 8은 양으로 하전된 막 컬럼에 의한 선형 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한, 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자 분리의 실패(failed separation)를 보여준다.
도 9는 양으로 하전된 모노리스 컬럼에 의한 선형 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한, 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자 분리의 실패를 보여준다.
실시예 1
본 실시예는 전도율 스텝 구배를 이용하여 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자의 분리를 달성하기 위한 프로토콜을 보여준다. 단계들이 표 1에 표시된다.
단계 사용된 완충액 사용된 부피
(컬럼 부피)
1 - 막의 평형화 완충액 A - 평형화 완충액 10
2 - 시료의 적용 AAV 시료 용액 시료 부피에 따라 변함
3 - 막의 세척 완충액 A - 평형화 완충액 10
4 - 스텝 구배 완충액 A - 평형화 완충액
완충액 B - 염-함유 완충액
각 스텝은 스텝 당 1-2 mS/cm의 증가를 가능하게 하기 위해 A와 B의 퍼센트 혼합을 이용함
예를 들면, 초기 단계는 98%A, 2%B일 수 있음
후속 단계는 96%A, 4%B, 등으로 최종 전도율 > 20 mS/cm까지 혼합함		 스텝 당 10
실시예 2
본 실시예는 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자의 분리를 달성하기 위한 AKTA™ Avant 프로토콜을 기재한다.
빈 바이러스 입자와 완전 바이러스 입자를 포함하는 친화도-정제(affinity-purified) AAV 시료 용액을 수득하고 자동화된 FPLC(fast protein liquid chromatography) 시스템(PALL MUSTANG™ Q ACRODISC™ (0.86 mL CV)) 상에서 음이온 컬럼 크로마토그래피에 적용했다. 용리 완충액은 하기를 포함했다:
8.5 내지 9.5의 pH 범위에서 저 전도율(< 5 mS/cm)의 평형화 완충액
8.5 내지 9.5의 pH 범위에서 보다 높은 전도율(> 80 mS/cm)의 고염 완충액
분리를 달성하기 위해 사용된 방법이 표 2에 표시된다.
단계 사용된 완충액/세부사항 사용된 부피
(컬럼 부피)
1 - 막의 평형화 완충액 A - 평형화 완충액 10
2 - 시료의 적용 AAV 시료 용액 시료 부피에 따라 변함
3 - 막의 세척 완충액 A - 평형화 완충액 10
4 - 스텝 구배 완충액 A - 평형화 완충액
완충액 B - 고 염 완충액(High salt buffer)
스텝 1 = 1.7% 완충액 B, 98.3% 완충액 A
스텝 2 = 2.5% 완충액 B, 97.5% 완충액 A
스텝 3 = 3.5% 완충액 B, 96.5% 완충액 A
스텝 4 = 4.4% 완충액 B, 95.6% 완충액 A
스텝 5 = 5.4%% 완충액 B, 94.6% 완충액 A
스텝 6 = 6.4% 완충액 B, 93.6% 완충액 A
스텝 7 = 7.3% 완충액 B, 92.7% 완충액 A
스텝 8 = 8.3% 완충액 B, 91.7% 완충액 A
스텝 9 = 9.4% 완충액 B, 90.6% 완충액 A
스텝 10 = 10.4% 완충액 B, 89.6% 완충액 A
스텝 11 = 11.4% 완충액 B, 88.6% Buffer A
스텝 12 = 12.4% 완충액 B, 87.6% 완충액 A
스텝 13 = 13.4% 완충액 B, 86.6% 완충액 A
스텝 14 = 14.4% 완충액 B, 85.6% 완충액 A
스텝 15 = 15.4% 완충액 B, 84.6% 완충액 A
스텝 16 = 16.4% 완충액 B, 83.6% 완충액 A
스텝 17 = 17.5% 완충액 B, 82.5% 완충액 A
스텝 18 = 18.5% 완충액 B, 81.5% 완충액 A		 스텝 당 10
빈 캡시드와 완전 캡시드의 분리를 단백질 함량을 위한 280 nm 파장 및 DNA 함량을 위한 260 nm 파장에서의 흡광도에 의해 모니터링했다. 용리된 바이러스 입자에 존재하는 게놈의 개수를 측정하는 DROPLET DIGITAL™ PCR (ddPCR) (Bio-Rad, Hercules, CA)을 수행하여 완전 AAV 캡시드의 더 높은 비율을 포함하는 최종 용리액을 확인했다. 캡시드 ELISA를 이용하여 용리된 바이러스 입자에 존재하는 형성된 AAV 캡시드의 총 개수를 측정했다. 도 2는 더 높은 전도율 스텝들에서 생성된 용리 피크가 초기 용리 피크 대비 더 많은 양의 게놈 카피를 포함했다는 것을 보여준다.
실시예 3
본 실시예는 막에 의한 음이온 크로마토그래피를 이용하여 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 방법을 기술한다.
AAV5 입자를 포함하는 시료가 로딩된 SARTOBIND™ Q (Sartorius, France) 1 mL 막 컬럼을 이용한 1 mS/cm 용리 방법을 이용하여 실시예 2를 재현했다. 결과가 도 3에 도시된다.
실시예 4
본 실시예는 모노리스 컬럼(monolith column)에 의한 음이온 크로마토그래피를 이용하여 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 방법을 기술한다.
AAV5 입자를 포함하는 시료가 로딩된 CIMac™ (BIA Separations, Slovenia) 0.1 mL 모노리스 컬럼을 이용한 1 mS/cm 용리 방법을 이용하여 실시예 2를 재현했다. 결과가 도 4에 도시된다.
실시예 5
본 실시예는 빈 AAV5 입자 대 완전 AAV5 입자의 독특한 크로마토그래피 패턴을 보여준다.
AAV5 빈 입자 및 완전 입자 표준을 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 통상적인 업계 방식인 초원심분리를 통해 수득하였다. 본 발명의 전도율 스텝 구배 용리 방법을 빈 AAV5 표준과 완전 AAV5 표준에 수행하였다. 도 5는 빈 AAV5 표준을 이용하여 생성된 피크를 보여주고, 빈 AAV 입자들은 260 nm 대비 280 nm에서 더 높은 흡광도를 갖고, 10 mS/cm 및 11 mS/cm 부근의 전도율에서 용리되었다. 도 6은 완전 AAV5 표준을 이용하여 생성된 피크를 보여주고, 완전 입자들은 280 nm 및 260 nm 모두에서 동등한 흡광 강도를 갖고, 11 - 13 mS/cm 부근의 전도율에서 용리되었다.
도 7은 빈 표준과 완전 표준 분리 크로마토그램의 오버레이를 보여준다. 빈 AAV5 입자들은 완전 AAV5 입자들에 비해 더 낮은 전도율에서 용리된다. 이들 크로마토그램은 이러한 전도율 스텝 방식을 이용하여 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자의 분리가 달성될 수 있다는 것을 보여준다.
비교예 1
본 실시예는 선형 구배 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 빈 AAV 입자와 완전 AAV 입자를 분리하는 방법을 기술한다.
본 방법은 (a) MUSTANG™ Q XT 0.86mL ACRODISC™ (Pall, Port Washington, NY) (도 8) 또는 (b) 0.1 mL Analytical CIMac™ 모노리스 컬럼 (BIA Separations, Slovenia) (도 9)을 사용할 때 빈 AAV5 입자와 완전 AAV5 입자의 일반적인 AAV 캡시드 분리를 위해 선형 염 구배 용리 (0 - 200 mM)를 이용했다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 통상적으로 이용되는 선형 구배 용리는 PALL MUSTANG™ Q 막 또는 CIMac™ 모노리스 (BIA Separations) 상에서 빈 AAV5 바이러스 벡터와 완전 AAV5 바이러스 벡터의 분리를 보이지 않았다.
본 명세서에서 인용된 공개문헌, 특허 출원, 및 특허를 포함한 모든 참고문헌은 각 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 표시되고, 그 전체로 본 명세서에 기재된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명을 설명하는 문맥(특히, 하기 청구항의 문맥)에서 용어 "하나"("a" 및 "an") 및 "그(the)" 및 "하나 이상(at least one)" 및 유사한 기재는 본 명세서에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석된다. 하나 이상의 항목의 열거에 이어지는 용어 "하나 이상"의 사용(예를 들면, "A 및 B 중 하나 이상(at least one of A and B)")은 본 명세서에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 열거된 항목들로부터 선택된 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목들 중 2개 이상의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 해석된다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함한(including)", 및 "함유하는(containing)"은 달리 기재되지 않으면, 개방형 용어(즉, "포함하나, 그에 한정되지 않는(including, but not limited to)"을 의미함)로 해석된다. 본 명세서에서 값의 범위의 기재는, 본 명세서에서 달리 표시되지 않으면, 그 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값을 개별적으로 지칭하는 간단한 방법으로만 의도되며, 각각의 개별적인 값은 개별적으로 본 명세서에서 기재된 것처럼 본 명세서에 내포된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법들은 본 명세서에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 모든 예들, 또는 예시적 언어(예를 들면, "과 같은(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하도록 의도되며 달리 청구되지 않으면, 본 발명의 범위에 대해 한정을 부과하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 비-청구 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명을 실시하는데 있어서 본 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함한, 본 발명의 바람직한 구체예가 본 명세서에 기재된다. 그러한 바람직한 구체예의 변형은 전술된 설명을 읽으면 당해 기술 분야에서 통상의 기술를 가진 자에게 자명할 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 적합한 경우 그러한 변형을 채택할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시될 것으로 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용되는 법에 의해 허용되는, 첨부된 청구항에 기재된 대상(subject matter)의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 달리 표시되거나 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 전술된 요소들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.

Claims (5)

  1. 완전(full) 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV) 캡시드와 빈(empty) AAV 캡시드의 혼합물로부터 완전 AAV 캡시드를 농축하는 방법으로서, 상기 방법은
    완전 AAV 캡시드와 빈 AAV 캡시드의 혼합물을 포함하는 시료를 제공하는 단계,
    상기 시료를 약 0.5 mS/cm 내지 약 10 mS/cm 범위의 초기 전도율을 제공하는 초기 비율로 평형화 완충액과 염-함유 완충액을 포함하는 용리 완충액을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계, 및
    상기 평형화 완충액과 상기 염-함유 완충액의 비율을 변경하여 각 스텝에서 약 0.5-2.0 mS/cm의 스텝 구배 전도율 상승을 제공하여, 빈 AAV 캡시드를 용리시키고, 완전 AAV 캡시드로 농축된 유체를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료를 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계는 양으로 하전된 미세다공성 막을 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 최종 단계는 약 20 mS/cm의 전도율을 제공하는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형화 완충액과 염-함유 완충액의 초기 비율은 약 98.3:1.7인 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평형화 완충액 대 염-함유 완충액의 최종 비율은 약 81.5:18.5인 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6780327B1 (en) * 1999-02-25 2004-08-24 Pall Corporation Positively charged membrane
ATE490307T1 (de) * 2003-05-21 2010-12-15 Genzyme Corp Verfahren zur herstellung von präparationen rekombinanter aav-virionen, die weitgehend frei von leeren capsiden sind
CN107646052A (zh) * 2015-01-20 2018-01-30 建新公司 用于表征重组病毒颗粒的分析性超速离心法
EP3054007A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step
EP3054006A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography
MX2020000216A (es) * 2017-06-30 2020-09-03 Spark Therapeutics Inc Metodos de purificacion por columna de vectores aav.
SG11202006232SA (en) * 2017-12-29 2020-07-29 Baxalta Inc Adeno-associated virus purification methods

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