JP2023521505A - 一本鎖ｒｎａの精製方法 - Google Patents

Abstract

一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分なｐＨで、その表面上に第一級アミノ基を主に担持する又は第一級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、上昇するｐＨに前記固相の表面を曝露させることによって、吸着された前記一本鎖ＲＮＡを前記固相の表面から溶出するステップ、を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。

Description

本発明は、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡとの本質的に水性である混合物から二本鎖ＲＮＡを除去する方法に関する。

遺伝子治療用途のためのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の合成は、所望の一本鎖(ｓｓ)ＲＮＡに加えて、二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡの望ましくない亜集団を含有する調製物を生じる。これらのｄｓＲＮＡ種は、塩基鎖内の相補配列の鎖内相互作用によって合成後物（post-synthesis）を形成する。ｄｓＲＮＡ配列の形成はまた、隣接するｓｓＲＮＡ分子間における相補的配列との対合によっても起こり得、それによって、鎖内ｄｓ配列も含み得る非特異的鎖間二量体及びより高次の多量体を作出する。二本鎖ＲＮＡは、対象に注射されると、望ましくない潜在的に致死的な免疫応答を誘発するため、これを除去することは精製の格別な目標となる。

ｍＲＮＡ調製物からのｄｓＲＮＡの含有量を減少させる方法は公知である。ｄｓＲＮＡ混入のレベルは、セルロースベースのクロマトグラフィー媒体［１～３］を用いたアフィニティー吸着クロマトグラフィーによって低減することができる。吸着の精確なメカニズムは定かではないが、ｄｓＲＮＡはある条件下で結合し、一方、ｓｓＲＮＡは通過する。この方法は単純であり実験室規模では有効であるが、容量が低いため負担がかかる。低容量は、製造スケールでは、製造設備の生産性を低下させる、大量の緩衝液、大量の製造領域、及び延長されたプロセス時間を必要とする、大きいカラムに関連する。この方法はまた、処理されたｓｓＲＮＡの希釈を引き起こし、これは、後続の精製工程に負担がかかる生成物体積の増加に関連する。

あるいは、ｄｓＲＮＡのレベルは、スチレン－ジビニル－ベンゼン（ＳＤＶＢ）固相を使用する逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって減少させることができる［４－７］。ＲＰＣは、有毒な可燃性有機溶剤を使用するので、火災や爆発のリスクを軽減するために、工業規模では極めて高価な特殊機器を必要とする。ＲＰＣはまた、作業環境における有機溶剤毒性及び有害廃棄物処理問題に関連した安全の問題についてさらなる負担を課す。溶剤の問題に加えて、ＲＰＣ分離は、最良の結果を得るために高温を必要とするというさらなる負担をしばしば課す。

アニオン交換クロマトグラフィーは、低分子ｍＲＮＡ（１０００塩基未満）の精製で有用性を示している［８］。今日までに評価されているアニオン交換媒体としては、第四級アミン（ＱＡ）アニオン交換体に言及する、いわゆる強アニオン交換体が挙げられる。いわゆる弱アニオン交換体、特に第三級アミン配位子を用いるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）アニオン交換体も評価されている。

ＤＮＡ及びタンパク質混入物質を大きなｍＲＮＡ(１０００～１００００塩基）から除去することにおいてはアニオン交換クロマトグラフィーの示す有用性は限られており、上昇した動作温度においてのみである［９］。６５℃まで昇温すると、塩化ナトリウム勾配中で大きなｍＲＮＡを溶出することができる。しかしながら、高温操作は、緩衝液、試料、及びカラムがすべて、プロセスの全期間にわたって、事前に平衡化され、特定の操作温度に正確に維持されなければならず、潜在的に数年間、製品の製造寿命の間、すべてのバッチにわたって再現可能に維持されなければならないので、複合的な物流負荷を課す。

タンパク質はｐＨの低下に伴ってより電気的に陽性になり、電気的陰性度が下がり、その結果、アニオン交換体との会合を停止させる効果を有するので、タンパク質は、下降するｐＨ勾配によってアニオン交換体から溶出されることが知られている。ＲＮＡの電荷特性が約ｐＨ ２．６～ｐＨ１３．０で一定のままであるため、このアプローチは、ＲＮＡでは機能せず機能し得ない。ｐＨを上昇させることはＲＮＡをより強く結合させるので、これによるアニオン交換体からの生体分子の溶出は機能しないことが知られている。タンパク質はｐＨ勾配を増加させることによってカチオン交換体から溶出することができるが、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡはカチオン交換体に結合しないため、該方法はｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するには有用性がない。

ｓｓＲＮＡとの混合調製物からｄｓＲＮＡを除去するための新規な方法が開発されており、これは公知の方法を超える改善をあらわす。これはすべてのサイズのｍＲＮＡに関連するが、特に、１，０００～２５，０００塩基のサイズ範囲などの、大きい又は巨大なｍＲＮＡに関連する。この方法は第一級アミノ固相に結合したｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの分離を上昇ｐＨ勾配によって可能にする。ｓｓＲＮＡはｄｓＲＮＡよりも高いｐＨで溶出する。本方法はまた、ｓｓＲＮＡのサイズに応じたｓｓＲＮＡの分画を可能にする。

本発明によれば、一本鎖ＲＮＡ精製の方法が請求され、前記方法は：
一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分なｐＨで、その表面上に第一級アミノ基を主に担持する又は第一級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、
上昇するｐＨに前記固相の表面を曝露させることによって、吸着された前記一本鎖ＲＮＡを前記固相の表面から溶出するステップ、
を含む。

本発明の方法のある実施形態では、前記試料を適用した後でありかつ前記一本鎖ＲＮＡを溶出するより前に、前記一本鎖ＲＮＡの溶出に用いられた溶出緩衝液に比べてより高いイオン強度を有する洗浄緩衝液を用いて前記固相を洗浄するステップが少なくとも１つ提供されうる。

本発明の方法の別の実施形態では、前記のより高いイオン強度を低下させるために前記少なくとも１つの洗浄ステップが提供されうる。

本発明の方法のさらなる実施形態では、前記試料を適用した後でありかつ前記一本鎖ＲＮＡを溶出するより前に、一本鎖ＲＮＡは前記固相に吸着されたままに維持し残存する二本鎖ＲＮＡは脱着させる上昇したｐＨを有する洗浄緩衝液を用いる洗浄ステップが少なくとも１つ提供されうる。

前記洗浄ステップ（washing steps）は、前記試料を前記固相に適用した後の２つの後続洗浄工程として組み合わせることができる。

本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記洗浄緩衝液のイオン強度は、前記一本鎖ＲＮＡを溶出するために必要な緩衝液のイオン強度に比べて０．５Ｍ～１２Ｍ、又は１．０Ｍ～１０Ｍ、又は２．０Ｍ～８．０Ｍ、又は４．０Ｍ～６．０Ｍ高い範囲にある範囲で選択することができる。ＮａＣｌを使用する場合、イオン強度は溶液のモル濃度に相当する。例えば、ｓｓＲＮＡが溶出する対応するイオン強度が２．０Ｍ未満である場合、洗浄緩衝液のイオン強度は２．５Ｍであり得る。別の例では、ｓｓＲＮＡが溶出するイオン強度が０．５Ｍである場合、洗浄緩衝液のイオン強度は１．０Ｍであり得る。

典型的には、洗浄緩衝液のモル濃度は０．５１Ｍ～１２．０Ｍの範囲であり、一方、ｓｓＲＮＡが溶出するモル濃度は０．０１Ｍ～０．５Ｍの範囲である。

本発明の方法のさらに別の実施形態では、前記洗浄緩衝液のイオン強度はカオトロピック塩、特にグアニジニウム塩、チオシアネート、過塩素酸塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるカオトロピック塩、の濃度で調整することができる。

本発明の方法のさらなる実施形態では、前記固相の表面からの前記一本鎖ＲＮＡの溶出はｐＨ７．５～ｐＨ１２．０、又はｐＨ８．０～ｐＨ１１．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ１１、又はｐＨ９．０～ｐＨ１０．５のｐＨ範囲のｐＨを有する溶出緩衝液によって行うことができる。

本発明の方法のなおさらなる実施形態では、前記固相に前記試料を適用することは、ｐＨ約８．５未満のｐＨ値で起こり得る。

本発明の方法のなおさらなる実施形態では、前記の本質的に水性である混合物中に、前記水性混合物との前記接触より前の前記固相の表面の環境中に、前記固相の表面から前記一本鎖ＲＮＡを溶出するための緩衝液中に、並びに／又は前記試料を前記固相に適用するステップ及び／若しくは前記固相の表面から前記一本鎖ＲＮＡを溶出するステップの間に使用される別個の緩衝液中に、キレート剤が存在し得る。

本発明の別の実施の形態では、前記キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、リン酸、又はエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ －四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）及びそれらの混合物からなる群より独立して選択することができる。

典型的には、前記一本鎖ＲＮＡは１，０００塩基～２５，０００塩基の範囲のサイズである。

本発明の主題はまた、一本鎖ＲＮＡ精製のための、その表面上に主に第一級アミノ基を含む又は第一級アミノ基のみを含む固相の使用である。特に、一本鎖ＲＮＡは、ｐＨを上昇させることによって二本鎖ＲＮＡから精製又は分離することができる。

この方法の驚くべき性質は、それが先行技術の教示に反するものであるという事実によって強調される。本技術分野の既公開物では、周囲温度で強アニオン交換体（ＱＡ）及び弱アニオン交換体（ＤＥＡＥ）を用いて大型ｄｓＲＮＡから大型ｓｓＲＮＡを溶出することが不可能であると教示されている。

ｐＨを増加させることによっては任意のアニオン交換体から任意の生体分子種を溶出させることは不可能であると考えられていたということは、本発明の第２の驚くべき特徴を強調する。それは、何十年もの間、当技術分野で知られている基礎原理に反している。この原理は、酸性溶質（正味で負荷電）がｐＨの上昇に伴って強力なアニオン交換体をより強く結合することである。アニオン交換体がｐＨ勾配で溶出されるという、頻度の低い場合には、本発明の方法とは逆に、アニオン交換体はもっぱら下降ｐＨ勾配で溶出に供される。

本発明は、当該技術分野において先例のない第３の驚くべき特徴を具現化するものである。予備データは、ｐＨ勾配による第一級アミノ固相からのｓｓＲＮＡの溶出でｓｓＲＮＡ種がサイズに応じて選別され、より大きいｓｓＲＮＡ種を溶出するためにはより高いｐＨ値が必要であることを示している。注目すべきことに、ｄｓＲＮＡ種の間のサイズの識別性は比較的に悪い。

本発明はまた、当該技術分野において先例のない第４の驚くべき特徴を具現化する。実験データは、ｄｓＲＮＡが、ｓｓＲＮＡが同じ表面で挙動するのと同じ方法で第一級アミノ固相と相互作用するものでないことを示す。所与のインビトロ転写混合物中においてｓｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとは組成的に同一であり、同じ配列中に同じ数のヌクレオチド塩基を有するので、このことは予想外である。注目すべきことに、多種多様な塩が、所望のｓｓＲＮＡを溶出することなく、第一級アミノ固相からｄｓＲＮＡの大部分を退かせることができる。さらに注目すべきことに、ｓｓＲＮＡは、極めて高濃度の既知の侵襲性カオトロピック塩によってさえ溶出されない。

上昇するｐＨ勾配で溶出される第一級アミノ固相の逆説的挙動について、なぜ伝統的なアニオン交換体に基づく予測に反するのか、どのようにｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離するのか、又はどのようにｓｓＲＮＡのサイズ分画を達成するのか、を説明する理論は、いまだ展開されていない。

ｓｓＲＮＡの溶出に先立ってｄｓＲＮＡを単に退かせるだけでなく、高塩洗浄は、さもなければ安定的であるｓｓＲＮＡとタンパク質及びＤＮＡなどの混入物質との間の複合体を解離する、独特の機会を提供する。これは、本分野において認識され始めたばかりの主要な課題に対する解決策を提供する。核酸は、混入物質との安定な複合体中に存在することがしばしばある。これらの複合体のいくつかは、純粋な核酸と同じ又はほぼ同じ条件下で溶出する。したがって、これらの複合体は、混入物質が独立している場合の特性ではその可能性が排除されているはずであるにもかかわらず、純粋なｓｓＲＮＡ溶出画分であるべきものに該混入物質を持ち込む、トロイの木馬である。解離高塩洗浄は、その混入経路を止める可能性を提供する。このアプローチの錯体解離ポテンシャルは、ＮａＣｌなどの中性塩よりも強い解離ポテンシャルを具現化するグアニジンなどのカオトロピック塩で増強される。錯体解離能は、キレート剤の存在によってさらに増強することができる。

混入しているｄｓＲＮＡが高塩化学環境において第一級アミノ固相に結合することができないことはまた、アフィニティークロマトグラフィーとして当技術分野で知られている技術に匹敵するワークフローの簡素化を可能にする。アフィニティークロマトグラフィーは、抗体などの生体特異的リガンドを固相に共有結合させる技術である。その抗体の標的を担持する混入された試料が固相に適用されると、標的分子のみが捕捉され、一方、混入物質はカラムを通って流れることによって除去される。微量レベルの所望されない種を洗い流すためにカラムを洗浄した後、標的分子は、単一の高度に精製された画分中に溶出される。この場合、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡを含有する試料は、中性ｐＨで高塩中にロードされる。ｄｓＲＮＡの大部分は固相中を流れて通過する。高度に精製されたｓｓＲＮＡは、ｐＨの上昇によって濃縮画分中に溶出される。

このワークフローの単純化は、本発明の基本的な構成において使用されるものと同じ原理を使用する、わずかにプロセスを変形させたものであり、その原理がｄｓＲＮＡが高濃度の塩の存在下で第一級アミノ固相によって結合されないことであることは、本技術分野の経験者によって認識されるであろう。

本発明の最終的な驚くべき特徴は、ＲＮＡとは組成が異なる混入物質の溶出挙動が、ｄｓＲＮＡと同様に溶出するが、ｓｓＲＮＡの溶出とは異なる、ということである。そのような混入物質には、タンパク質及びＤＮＡが含まれ、その両方がｐＨ勾配においてｓｓＲＮＡよりも早く溶出する。それらの大部分はまた、ｐＨの上昇勾配によってｓｓＲＮＡからそれらの微量残基を分離する前に固相に適用される塩によっても除去される。

発明に係る一般的記載
本発明は、一般的な態様においては、二本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ）と一本鎖メッセンジャーＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)との混合物を含有する調製物からｄｓＲＮＡを除去するための固相抽出方法である。本発明はさらに、ｓｓＲＮＡ種をそのサイズに従って分離する方法に関する。

特定の態様において、本発明はｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離、及び／又は、ｓｓＲＮＡ種をそれらのサイズに従って分離することに関し、ここで、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、第一級アミノ固相への非共有相互作用によって結合する。

別の特定の態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡがｓｓＲＮＡよりも低いｐＨ値で溶出する上昇ｐＨ勾配を用いての、ｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離に関する。小さいｓｓＲＮＡ種は、大きいｓｓＲＮＡ種よりも低いｐＨ値で溶出する。

より具体的な態様では、本発明は、ｐＨ ３．５～１１．５、又はｐＨ ４．５～ｐＨ１１．５、ｐＨ ５．５～ｐＨ１１．５、ｐＨ ６．５～ｐＨ１１．５、又はｐＨ７．５～ｐＨ１１．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ１１．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ１１．０、又はｐＨ８．５～ｐＨ１０．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ１０．０、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ９．０、又はよりｐＨの高い範囲、又はよりｐＨの低い範囲、又は中間の範囲にわたるｐＨ勾配に関する。特定のｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するか、又は異なるサイズのｓｓＲＮＡ種を分画するのに必要な値が、それらのそれぞれのサイズに依存することから、ｐＨの範囲が特定される。

ある実施形態では、ｐＨ値はいわゆる線形勾配（linear gradient）を形成する特定の範囲にわたって連続的に増加させることができる。関連する実施形態において、ｐＨは不連続的に、別々のステップで増加され、いわゆる段階的勾配を形成しうる。別の関連する実施形態では、勾配は単一のステップからなってもよい。

別の実施形態において、ｐＨを増加させることによる溶出は、ｓｓＲＮＡの回収を増加させる目的で、塩の存在下で行われ得る。このような実施形態では、塩種は１０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２００ｍＭ、又は５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムであり得る。別のそのような実施形態では、塩種は同様の範囲内の濃度の塩化カリウム、又は同様の範囲内の濃度のグアニジン－ＨＣｌ、又は同様の範囲内の濃度のグアニジンチオシアネートであってもよい。溶出中の塩の含有はまた、ｓｓＲＮＡをより低いｐＨ値で溶出させる。

別の態様では、本発明は、第一級アミノ固相に結合したｓｓＲＮＡをキレート剤で洗浄する方法に関する。

ある実施形態では、キレート剤は２ｍＭ～２００ｍＭ、又は５ｍＭ～１００ｍＭ、又は１０ｍＭ～５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５ｍＭ、又はより低い、又は中間の範囲、又は最大完全飽和までのより高い範囲の濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり得る。密接に関連する実施態様において、キレート剤はクエン酸、リン酸、エチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ’、Ｎ’ －四酢酸（ＥＧＴＡ）の塩、又はトリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、又は別のキレート剤の塩であってもよく、又は、ＥＤＴＡについて説明したのと同じ範囲に渡る濃度のキレート剤の混合物であってもよい。

本発明のある実施形態では、キレート剤での処理は、ｐＨ溶出の間を含む前記方法のステップを実施するために、以下のいずれかを含むことができる：試料へのキレート剤の添加、試料の緩衝液を金属イオン非含有緩衝液へと交換すること、試料の緩衝液をキレート化緩衝液へと交換すること、及び、金属イオン非含有又はキレート化緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、キレート剤の種類及び／又はそれらの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。

ある態様では、本発明は、ｐＨを上昇させることによってｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの最終的な分離を行う前に、第一級アミノ固相を塩で洗浄してｄｓＲＮＡのサブセットを除去するｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離に関する。全てのそのような実施形態において、洗浄中の塩の濃度は、溶出中に存在する塩の濃度よりも高い。

ある実施形態では、ｐＨを上昇させることによって溶出前に固相を洗浄するために使用される塩は、最大完全飽和濃度までを含む、任意の濃度の任意の種の塩でありうる。塩が約５．０Ｍで飽和する塩化ナトリウムである、かかる実施形態の一つでは、塩の濃度は１０ｍＭ～５Ｍ、又は５０ｍＭ～５Ｍ、又は１００ｍＭ～５Ｍ、又は５００ｍＭ～５Ｍ、又は１Ｍ～５Ｍ、又は２Ｍ～５Ｍ、又は３Ｍ～５Ｍ、又は４Ｍ～５Ｍの範囲、又は中間の範囲であってもよいが、好ましくは１Ｍ～５Ｍの範囲である。密接に関連する実施形態において、塩は塩化カリウムであってもよい。ＲＮＡが、塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどによって沈殿し得ることと同様に、塩化リチウムなどの他の高濃度の中性塩によっても沈殿し得ることは、認識されるであろう。試料適用中又は溶出中のＲＮＡの沈殿は、固相クロマトグラフィー装置を通る緩衝液の流れを妨害する可能性があるため、非常に望ましくないこともさらに認識されるであろう。厳密に言えば、これは試料をロードした後に塩洗浄を行い、溶出前に過剰な塩が除去される場合には問題ではないものの、代わりに非ＲＮＡ沈殿塩を使用することによって問題を完全に回避することが好ましいことが多い。

ＲＮＡ沈殿塩が非ＲＮＡ沈殿塩で置き換えられる、ある実施形態では、塩は約６Ｍで飽和する塩酸グアニジニウムなどのカオトロピック塩であり、濃度は１０ｍＭ～６Ｍ、又は５０ｍＭ～６Ｍ、又は１００ｍＭ～６Ｍ、又は５００ｍＭ～６Ｍ、又は１Ｍ～６Ｍ、又は２Ｍ～６Ｍ、又は３Ｍ～６Ｍ、又は４Ｍ～６Ｍ、又は５Ｍ～６Ｍの範囲、又は中間の範囲であり得、好ましくは３Ｍ～４Ｍの範囲の値であり得る。塩が約１２Ｍで飽和するグアニジンチオシアネートなどのカオトロピック塩である密接に関連する実施形態では、濃度は１０ｍＭ～１２Ｍ、又は５０ｍＭ～１２Ｍ、又は１００ｍＭ～１２Ｍ、又は５００ｍＭ～１２Ｍ、又は１Ｍ～１２Ｍ、又は２Ｍ～１２Ｍ、又は３Ｍ～１２Ｍ、又は４Ｍ～１２Ｍ、又は５Ｍ～１２Ｍ、又は６Ｍ～１２Ｍ、又は７Ｍ～１２Ｍ、又は８Ｍ～１２Ｍ、又は９Ｍ～１２Ｍ、又は１０Ｍ～１２Ｍ、又は１１Ｍ～１２Ｍ、又は中間範囲であり得、好ましくは１．５Ｍ～３．０Ｍの範囲の値であり得る。これらの２つの塩の例から、他の塩を、飽和点までであるがそれを超えない範囲で同様に使用することができることが明らかであろう。

ある実施形態では、キレート剤を塩と併せて使用することができる。本発明の様々な実施形態において、塩及び／又はキレート剤による処理は、以下のいずれかを含み得る：試料への塩及びキレート剤の添加、試料の緩衝液を塩及び／又はキレート剤含有緩衝液へと交換すること、試料の緩衝液を塩及び／又はキレート剤含有緩衝液へと交換すること、並びに、ｓｓＲＮＡの溶出を含む前記方法のステップを実施するために塩含有緩衝液及び／又はキレート剤含有緩衝液を使用すること。かかる実施形態のいくつかでは、塩の種類、キレート剤、及びそれらのそれぞれの濃度は、前記方法の各ステップで異なり得る。

いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、グアニジンチオシアネートなどの高濃度の非ＲＮＡ沈殿塩にＥＤＴＡなどのキレート剤をプラスしたものに試料を平衡化することによってｓｓＲＮＡから分離され得る。固相は、同じ濃度のグアニジンチオシアネート及びＥＤＴＡを含有する緩衝液に平衡化されうる。試料を固相に適用する間、ｄｓＲＮＡの大部分は固相に結合しない。同じ濃度のグアニジンチオシアネート及びＥＤＴＡを用いた洗浄工程の終わる時点で、ｄｓＲＮＡは痕跡レベルまで減少している。次いで、グアニジンチオシアネート及びＥＤＴＡが、これらを含まない緩衝液で系から洗い流される。残存するｄｓＲＮＡは、上昇ｐＨ勾配でｓｓＲＮＡから分離される。

目的が何らかの目的のためにある量の精製ｓｓＲＮＡを単離することである準備的実施形態では、ｐＨ溶出後すぐにｓｓＲＮＡのｐＨを中和して、ｐＨ９又はそれ以上の値に近いｐＨ値への曝露を最小限にすることが最も望ましい。アルカリ条件への曝露が本発明の方法を実施するために必要とされる期間だけであったｓｓＲＮＡはその天然の組成を保ち、無期限に安定なままであることが、実験データで示されている。本質的に瞬間的である中和は、画分を中和溶液に回収することによって実施することができる。あるいは、画分回収の直後に中和溶液を添加することによって、急速中和を行ってもよい。中和は、クロマトグラフィー又は透析濾過を含む緩衝液交換法による画分回収後に行うこともできる。これらの方法の全ては、当技術分野、例えば、試料の溶出後ｐＨ中和が日常的であるアフィニティークロマトグラフィーの分野において、一般的に実施され周知である。

本発明の方法は当技術分野で通常の任意の装置を用いて実施することができ、例えば、第一級アミノ固相はクロマトグラフィー装置に配置することができる。典型的には、固相表面は他のクロマトグラフィーフォーマットの中でも、モノリス、充填粒子のカラム、充填ナノファイバーのカラム、膜吸着剤、又はヒドロゲルの形態であり得る。

本発明の方法は、分析用途又は準備（preparative）用途で実施する目的で使用することができる。これはすべてのｍＲＮＡに適用可能であるが、１０００塩基～２５，０００塩基のサイズ範囲のｍＲＮＡに特に有用である。具体的なクロマトグラフィー条件は、ＲＮＡのサイズ及び適用された試料中の混入物質分布に応じて変化し得る。任意の特定のｓｓＲＮＡ種について最良の分析又は準備結果を達成するために具体的条件を調整することは、数十年間、クロマトグラフィーの技術の実務者に知られているのと同じ実験技能を使用する。

任意の単一の処理方法単独によって達成され得るよりも大きい程度でｓｓＲＮＡを精製するために、本発明の方法には、１つ以上の追加の処理方法が、先行しても、後続しても、又は先行及び後続してもよい。

第一級アミノ固相を用いてのｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離を示し、ｄｓＲＮＡは、周囲温度でｐＨ勾配を用いてｓｓＲＮＡを溶出する前に、塩化ナトリウムステップによって除去される。 第一級アミノ固相を用いてのｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離を示し、ｄｓＲＮＡは、周囲温度でｐＨ勾配を用いてｓｓＲＮＡを溶出するより前に、６Ｍグアニジンステップによって除去される。 強アニオン交換体及び弱アニオン交換体から周囲温度でｐＨ勾配でｓｓＲＮＡを溶出するのが失敗することを示す。 第一級アミノ固相を用いて周囲温度でｐＨ勾配によりｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離することを示す。 第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離することを示し、ＤＮＡは、周囲温度でｐＨ勾配を用いてｓｓＲＮＡを溶出するより前に、塩ステップによって除去される。 周囲温度における塩とｐＨ勾配溶出との組み合わせの、ＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離に対する効果を示す。 周囲温度でｐＨ勾配により第一級アミノ固相上で小型ｓｓＲＮＡから大型ＤＮＡ及び巨大ｄｓＲＮＡを分離することを示す。 第一級アミノ固相を用いてのｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離を示し、ＤＮＡは、周囲温度でｐＨ勾配を用いてｓｓＲＮＡを溶出するより前に、キレート剤－カオトロープ組み合わせステップによって除去される。 キレート塩（chelating salts）を含めることによる、ｐＨ勾配におけるｓｓＲＮＡ溶出ｐＨの低下を示す。 塩の存在下でｐＨ勾配で溶出された、第一級アミン固相を用いた異なる時点でのインビトロ転写反応のモニタリングを示す。

用語「第一級アミノ固相」は、その表面上に第一級アミノリガンドを主に（dominantly）担持する又は第一級アミノリガンドのみを（exclusively）担持する、クロマトグラフィーを実施するのに適した固相を指す。用語「第一級アミノ固相（primary amino solid phase）」、「第一級アミノ基を担持する固相（solid phase bearing primary amino groups）」、「第一級アミン担持固相（primary amine-bearing solid phase）」、「第一級アミノ担持固相（primary amino-bearing solid phase）」又は「第一級アミン固相（primary amine solid phase）」は同義であり、交換可能である。第二級アミンは、固相の表面に存在しないか、又は存在が少数であるべきである。第三級及び第四級アミンは存在しないか、又は少数であるべきである。負に荷電した残基は不在であるべきである。非荷電疎水性又は水素結合残基が存在してもよい。

「第一級アミノ基」という用語は、２個の水素原子の各々に単一共有結合によって連結され、また、炭素原子に単一共有結合によって連結された窒素原子を表す。第一級アミノ基は、その炭素原子を介して固相に直接共有結合していてもよい。あるいは、第一級アミノ基は、固相に共有結合しているいわゆるスペーサーアームへのその炭素原子の共有結合によって、固相に間接的に結合していてもよい。第一級アミノ基はまた、第一級アミノ基を含む固相に共有結合したポリマー構造の一部であってもよく、ここで該ポリマーの繰り返しサブユニットは第一級アミノ基を含む。

「固相」は、１つ若しくは複数の多孔質膜、１つ若しくは複数の繊維、１つ若しくは複数の多孔質若しくは非多孔質の粒子、モノリス固相（単一のポリマー混合物から合成されたモノリスを含む）、又は、マクロ骨格として最初に合成されたモノリスの上に合成された第二級次リガンド担持ポリマー相を有するいわゆるヒドロゲルの形態である、クロマトグラフィー固相を指し得る。クロマトグラフィーの実施を容易にするために、これらの固相材料のいずれをもハウジング内に設けることができる。ハウジング内のクロマトグラフィー固体相は、一般にクロマトグラフィー装置と称され、クロマトグラフィーカラム、又は単にカラムと称されることが多い。

第一級アミノ基を有するクロマトグラフィー固相は公知であり、市販されている。その一例は、東ソー・バイオサイエンス社が製造するトヨパールＮＨ２－７５０Ｆという名称で販売されているものであり、ここで「ＮＨ２」とは第一級アミノ基を指す［www.separations.eu.tosohbioscience.com/solutions/process-media-products/by-mode/ion-exchange/anion-exchange/toyopearl-nh2-750f］。販売資料によれば第一級アミノ基はポリアミンの形態であり、これは、それが固相に共有結合的に固定された反復第一級アミンサブユニットを有するポリマーであることを意味する。そのようなポリマーは、典型的にはその第一級アミノ基のうち１つ以上を介して固相の表面に連結される。この結合は連結アミノ残基を第一級アミノ基から第二級アミノ基に変換し、それによって固相の表面上に第一級アミノ基と第二級アミノ基の混合物を生成する効果を有する。

別の例はＳａｒｔｏｒｉｕｓによってSartobind STIC PAの名称で製造されており、ここで「ＰＡ」は第一級アミンを指す［www.sartorius.com/shop/ww/en/usd/sartobind-stic^（R)-pa/c/M_Sartobind_STIC_PA］。販売資料によれば第一級アミノ基はポリマー、具体的にはポリアリルアミンの形態であり、固相に共有結合された反復第一級アミノサブユニットを有することを示す。上述の製品と同様に、そのようなポリマーは、典型的にはその第一級アミノ基のうち１つ以上を介して固相の表面に連結される。この結合は、連結アミノ残基を第一級アミノ基から第二級アミノ基に変換し、それによって固相の表面上に第一級アミノ基と第二級アミノ基との混合物を生成する効果を有する。

クロマトグラフィー固相のすべての主要な商業的製造者は、その表面上にアミノ誘導体を有する製品（アニオン交換体を含む）を製造しており、定期的又は実験的なベースで第一級アミン含有固相を製造するために必要な知識及び資源を示している。

第一級アミノ基を有するクロマトグラフィー固相が、その組成を明確に又は完全に明らかにする方法で命名されない場合があることを考慮すると、所与のクロマトグラフィー固相が本発明を実施するのに適切な特性を有するかどうかを決定するための単純な分析方法を有することが有用である。この決定を行うための１つの簡単な方法は、問題のクロマトグラフィー固相を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５などの緩衝液で平衡化し、次いで、それぞれ異なるサイズを有するＲＮＡ分子のサブセットを含有するいわゆるｓｓＲＮＡラダーからなる試料を注入することである。そのようなＲＮＡラダーは一般に、５０～５００塩基、又は１００～１０００塩基、又は２００～６０００塩基、又はいくつかの他の範囲のサイズをカバーし、Thermo Scientific及びNew England BioLabsなどの一般的な供給業者から市販されている。試料注入及び平衡化緩衝液での簡単な洗浄で未結合の試料成分を退かせた後、ｐＨ７．５～約ｐＨ１１の線形ｐＨ勾配で第一級アミノクロマトグラフィー装置を溶出に供する。第一級アミノ固相は図１に示すように、ｓｓＲＮＡをサイズが昇順（in order of increasing size）となる種類順に溶出させる。ｓｓＲＮＡが溶出しないか、最小のｓｓＲＮＡ種しか溶出しないことは、第二級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アミノ基のいずれか１つ又は任意の組み合わせを含む、過剰な割合の非第一級アミノ基を固相が含むことを示唆しうる。

「ＲＮＡサイズ」又は「ＲＮＡのサイズ」という用語は、ヌクレオチド鎖中の塩基の数を指す。塩基は、一般に「ｂ」と称される。したがって、１００ｂという呼称は、１００塩基のＲＮＡストランドを指す。ＲＮＡサイズは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖（ｄｓＲＮＡ）を指すＲＮＡコンホメーションとは無関係である。所与のインビトロ転写混合物とは、試薬と、ｍＲＮＡの合成中に生成される生成物及び副生成物と、の混合物を指し、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの両方を含有し得るが、これらは両方とも同じＤＮＡプラスミドに由来するので、塩基の数に関して両方とも同じサイズである。いくつかの場合において、ｓｓＲＮＡ鎖は、剪断応力又は酵素的溶解のいずれかを介して、プロセシングの間に切り抜かれるか（clipped）又は切り詰められ（truncated）、先の完全な鎖の断片亜集団の形成をもたらし得る。他の場合には、不完全な転写から切り詰め形態（truncated forms）が仮説的に生じ得る。供給源が何であれ、サイズに従ってｓｓＲＮＡを分画する本発明の方法の能力は、所望されない断片形態を除去するためのツールを提供する。

「平衡化された」又は「平衡化」という用語は、特定の化学的環境を作り出すために固相及び／又は試料に対して行われた化学的コンディショニングステップを指す。固相は、通常、所望のｐＨ及び塩組成を具体化する緩衝液にそれらを曝露することによって調整される。試料は、通常、ｐＨの滴定によって、時には塩濃度を低下させるための希釈によって、時にはクロマトグラフィーを含む緩衝液交換技術によって、又は透析によって、又はタンジェンシャルフロー濾過膜を用いた透析濾過によって、調整される。これらの方法及び１つ又は別のものを選択するための基準はすべて、何十年もの間、当技術分野で知られている。

用語「ロードする」又は「試料適用」は、平衡化された試料を平衡化され正に荷電した第一級アミノ基を主に担持する固相と接触させるプロセスを指す。これは、通常、クロマトグラフィー装置を用い、重力又はポンピングなどの外力によって試料を装置に通過させることによって行われる。

用語「吸着（adsorption）」は、生物学的産物を化学的に相補的な（chemically complementary）表面に結合させるプロセスを指す。吸着は毛管現象の物理的作用を介したスポンジによる水の取り込みと同様であるが、化学的相互作用を伴わない「吸収（absorption）」とは異なる。この場合の相補性は、静電荷を包含するものと解される。ＲＮＡの表面上の負の静電荷は、その表面上の第一級アミノ基によって電気的に陽性にされた固相の表面へのその吸着を媒介する。生物学的生成物の吸着は、多くの場合、より一般的な用語「結合（binding）」によって言及される。

用語「選択的吸着」は１種以上の他の種の吸着を防止しながら、少なくとも１種の吸着を可能にする条件を指す。本件の場合、操作条件は、ｓｓＲＮＡの結合を可能にしながら、ｄｓＲＮＡの大部分の結合を防止するように調整され得る。

用語「脱着」は、生物学的生成物を、それが以前に吸着されている化学的に相補的な表面から放出するプロセスを指す。本発明の方法では、ｓｓＲＮＡの脱着は通常、少なくともｐＨ９．０、又はｐＨ ９．５、ｐＨ １０．０以上のアルカリ性ｐＨ値を必要とする。塩は脱着を増強するために使用され得、典型的には塩の非存在下よりも低いｐＨで所与のｓｓＲＮＡ種の溶出を達成する効果を伴う。しかしながら、酸性又は中性のｐＨでは、いかなる濃度であっても塩又は塩の組み合わせが大きなｓｓＲＮＡの溶出を達成することはない。

「選択的脱離」という用語は、１つ以上の他の種が依然として吸着されたままになる条件の変化によって、１つ以上の吸着された種が固相表面から放出される状況を指す。次いで、固相表面から異なる種のサブセットを放出するために、さらに異なる条件のセットを適用することができる。１つのそのような例では、中性又は中性に近いｐＨで高濃度の塩を適用することによって、ｓｓＲＮＡは結合したままでありながら、ｄｓＲＮＡの大部分は第一級アミノ固相から除去され得る。ｄｓＲＮＡは、選択的に脱着されたと言われる。ｓｓＲＮＡは、アルカリ性ｐＨで、おそらく塩の存在下で、後続の工程において選択的に脱着される。

「洗浄（washed）」という用語は、装置内の細孔又はチャネルから非結合種を退かせる目的で、ロードされたカラムを洗浄緩衝液に曝露するプロセスを指す。用語「すすぎ（rinsed）」は、本文脈において、同じ意味を有する。最も基本的な場合、洗浄緩衝液は、平衡緩衝液と同じ組成を有する。より複雑な構成では、洗浄緩衝液は、所望の生成物を溶出するより前に、弱く結合している混入物質のサブセットが化学的に除去されるように、該サブセットを化学的に放出するという追加の役割を有し得る。あるいは１回目には平衡緩衝液と同一の条件を用いるが、２回目には溶出前の弱く結合した混入物質のサブセットの除去が可能なように、該サブセットを固相から退かせる条件を用いる、２回以上の洗浄工程があってもよい。洗浄はまた、異なる又はより制御された条件のセット下で溶出を可能にする緩衝液に移行するために使用され得る。例えば、混入物質を退かせる高塩での洗浄後、無塩洗浄を実施して、無塩ｐＨ塩勾配でｓｓＲＮＡを溶出する条件を設定することが望ましい場合がある。その洗浄がないと、デフォルトで高塩で溶出が始まり、ｐＨが上昇する間に塩濃度が下降する勾配が作り出される。

用語「溶出」は、クロマトグラフィーの分野に関連する用語「脱着」の特別な場合を表す。これは、固相が存在する化学環境を変化させて、第一級アミノ固相と、装填及び洗浄工程後に結合したままである種との間の相互作用の解離を引き起こすプロセスを指す。ｄｓＲＮＡ及びタンパク質が固相から除去されれば、ｓｓＲＮＡは、ｐＨを単純に増加させること、又は塩類と共にｐＨを増加させることによって、溶出することができる

溶出は、各工程が固相とｓｓＲＮＡとの間の相互作用の強度を低下させる１つ又は一連の工程で行うことができる。条件の変化はまた、連続的又は線形的な様式でなされ得、弱く結合した種が連続工程の初期に脱着される一方で、強く結合した種は連続工程の後期に溶出する。段階的形式であろうと線形形式であろうと、操作条件の変化は、一般に勾配と称され、特に溶出勾配と称される。段階的勾配は多くの場合、より便利であると考えられるが、線形勾配の方が典型的にはより良好な再現性を支持する。

「周囲温度」という用語は一般に、「室温」又は「常温」という表現に類似していると考えられる。それは典型的には約２０～２２℃の範囲の温度に対応するが、約１８～２５℃などのより広い範囲を含んでもよい。

用語「カオトロピック塩」は、その構成イオンの少なくとも１つが、リオトロピック及びカオトロピックイオンのＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列において高いカオトロピック順位を有する塩種を指す。リオトロピックイオンは、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の一端に存在する。カオトロピックイオンは、シリーズの反対側の端部に存在する。カオトロピックイオンは、多くの場合、生体分子によって優先的に結合されると記載される。カオトロピック塩は生体分子内及び生体分子間の非共有結合性相互作用を緩和する効果を有し、時には、多成分非共有結合性混合物中のそれぞれの要素間の相互作用を不安定化し、相互作用を解離させる程度まで緩和する効果を有する。それらは、通常、溶解度を増加させる効果を有する。カオトロピック塩の例としては、とりわけグアニジニウム塩、チオシアネート、及び過塩素酸塩が挙げられる。ある場合には、グアニジンチオシアネートの場合のように、特定の塩のアニオン及びカチオンの両方が強くカオトロピックである。このような塩は、カオトロピックアニオン又はカオトロピックカチオンのみを含む塩よりもカオトロピック電位が高い。リオトロピックイオンはＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の反対側の端に存在する。それらは、しばしば、生体分子によって優先的に排除されると記載される。リオトロピックイオンは生体分子を安定化させる効果を有し、混合物の個々の要素間の非特異的会合を促進する。強力なリオトロピックイオンは、通常、大きな生体分子の溶解度を低下させる。リオトロピック塩の例としては、とりわけ、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列における中間体を表す塩は、安定性、会合－解離、又は生体分子に対する溶解性に中程度又はほとんど影響を及ぼさない傾向がある。例としては、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどのいわゆる中性塩が挙げられる。そのような塩が安定性、会合－解離、又は溶解性に影響を及ぼし得る程度まで、それらの影響は、主にクーロン（静電）力を介して媒介される。

「多価金属カチオン」という用語は、金属の正に帯電したイオン形態であって、イオンの正味電荷が２以上であるものを指す。多価金属カチオンとしては、類似の又は異なる原子価を有する他種の中でも特に、カルシウム、マグネシウム、及び亜鉛（これらは全て２＋の正味電荷を有する）、及び３＋の正味電荷を有する第二級鉄が挙げられる。これらのイオンはすべて、配位結合を介して結合する核酸に対して親和性を有する。配位結合はイオン結合よりも１５～６０倍強く、これは、多価金属カチオンの核酸又は他の生体分子への結合が塩の飽和濃度でも持続することを意味する。多価金属カチオンは、ｄｓＲＮＡ配列の形成を促進し得、又は既存のｄｓＲＮＡ配列を安定化し得るため、ＲＮＡの精製において問題となり得る。それらはまた、複数のＲＮＡ分子の間、ＲＮＡとＤＮＡ分子の間、及びＲＮＡ、ＤＮＡ、及び混入物質であるタンパク質の間における、複合体の形成を促進し得、又は既存の該複合体（会合体）を安定化し得る。

用語「キレート剤」は、本発明の方法の文脈においては、従前存在していた多価金属カチオンとｍＲＮＡを含む核酸を含む生体分子との会合体から、金属イオンを競合的に除去することができるような、多価金属カチオンとの強い配位結合を形成する能力を有する分子を指す。

「ヌクレアーゼ」又は「ヌクレアーゼ酵素」という用語は、核酸の鎖を、理想的には個々のヌクレオチド、ダブレット、又はトリプレットに、切断する能力を有するタンパク質を指す。それらは２つの主要なクラス、すなわちＤＮＡを溶解するＤＮＡｓｅ酵素、及びＲＮＡを溶解するＲＮＡａｓｅ酵素、に分類することができる。ＲＮＡｓｅは、ｓｓＲＮＡ産物を破壊するので、厳密に避けるべきである。ＤＮＡｓｅは、ｍＲＮＡを産生するために使用されるＤＮＡプラスミド鋳型を破壊することによって精製を単純化するためにしばしば使用される。ＤＮＡｓｅ酵素はしばしば、適切に機能するために多価金属カチオン補因子の使用を必要とする。多価金属カチオンは、上記のようにＲＮＡ精製を妨害しうる。

「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」又は「タンパク質分解酵素」という用語は、他のタンパク質を切断して断片にする能力を有するタンパク質を指す。これは、タンパク質混入によって負担を被る可能性があるクロマトグラフィー工程の前にそのような混入を低減する方法として使用されることがある。トリプシンなどの多くのプロテアーゼは、適切に機能するために多価金属カチオン補因子を必要とする。多価金属カチオンは、上記のようにＲＮＡ精製を妨害しうる。この目的で一般に使用されるプロテアーゼには、多価金属カチオン補因子の非存在下でさえ良好な結果を提供するプロテイナーゼＫが含まれる。

所望又は必要であれば、後続の分析方法又は精製工程の選択において部分的に、本方法の実施の間に塩を含む、という決定がなされることがある。例えば、後続の方法が塩に対して耐性がない場合、妨害を回避するためには、第一級アミノ基を主に有する正に荷電した固相から、塩の非存在下で、又は十分に低い塩濃度で、ｓｓＲＮＡを溶出することが有利である。後続の方法が塩に非常に耐性があるのであれば、装置の溶出は、後続の工程にが耐性を有する塩種を実質的な濃度で使用することができる。

ある実施形態では、ｐＨ勾配終点緩衝液に５０ｍＭ ＮａＣｌが含まれると、終点緩衝液にＮａＣｌが存在しない場合よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡが溶出される。勾配終点緩衝液のみに５０ｍＭ ＮａＣｌが存在することは、ｓｓＲＮＡがｐＨ勾配のみで溶出されるのではなく、ＮａＣｌ増加及びｐＨ上昇の同時勾配によって溶出されることを示唆する。密接に関連する実施形態では、ｐＨ勾配終点緩衝液中に１００ｍＭ ＮａＣｌが含まれることにより、勾配終点緩衝液が５０ｍＭ ＮａＣｌを含む場合よりも低いｐＨでＲＮＡが溶出される。どちらの場合も、勾配終点の緩衝液にＮａＣｌが含まれると、ｓｓＲＮＡの回収率が有意に増加する。ｄｓＤＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離は、０ｍＭ ＮａＣｌで最も広い。これは終点緩衝液が５０ｍＭのＮａＣｌを含有する場合に減少し、終点緩衝液が１００ｍＭのＮａＣｌを含有する場合にさらに減少するが、１００ｍＭでも分離は良好なままである。同様の濃度のカオトロピック塩及びキレート化塩などの他の塩に置き換えることもできる。

ある実施形態では、第一級アミノ固相からのｐＨ勾配溶出は、ｓｓＲＮＡ種をそれらのサイズに従って分離するために実施され、ここでより小さい種はより大きい種よりも勾配においてより早く溶出する。

以下の一連の基本的な方法オプションの一般的で非限定的な説明は、本方法がどのように実行され得るかのバリエーションを示すものであり、操作変数のより詳細な議論のためのプラットフォームを提供する。これらのシナリオのそれぞれにおいて言及された緩衝液条件は、本方法がどのように実施され得るかの一般的な概念を提供することを意図しており、異なるサイズのｓｓＲＮＡ種及び異なる混入物質負荷が伴うことから緩衝液組成の最適化が必要とされることが理解される。

ある実施形態では、モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミノ固相を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、ｐＨ７．５±０．５などの中性に近いｐＨ値に平衡化する。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの混合物を含有する試料を、緩衝液交換により、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ７．５±０．５に平衡化する。次いで、クロマトグラフィー装置を、平衡化緩衝液から、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１±０．５の終点緩衝液に向かって、２０装置容量超、又は５０装置容量超、又は１００装置容量超の線形ｐＨ勾配で溶出し、ここで、装置容量の数値は、勾配中にｐＨが変化する率、言い換えると勾配の傾きを調節する手段として使用される。このアプローチは、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ＤＮＡ断片、及びタンパク質がすべて第一級アミン含有固相に結合し、勾配内で溶出し、したがって、試料（すなわち生成物及び混入物質）の総含有量の指標を提供するので、分析用途に特に有用であり得る。このアプローチはまた、準備的分離のための条件の開発の出発点として使用され得る。

異なる実施形態では、第一級アミン固相に同じ条件下でロードし、次いで３Ｍ ＮａＣｌの溶液で洗浄して、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質混入の大部分を除去することができる。次いで、過剰な塩が存在しない後続の洗浄によってＮａＣｌ自体を除去して、過剰な塩が存在しない状態でｓｓＲＮＡのｐＨ勾配溶出が始まるようにする。前述の実施形態との結果比較により、ＮａＣｌ洗浄がｓｓＲＮＡの純度を改善する程度を評価することが可能となる。ＮａＣｌの最も好ましい濃度の決定はクロマトグラフィーの技術分野において周知の日常的な活動であり、その目的は、生成物純度と生成物収率との最良のバランスを達成することである。

密接に関連する実施形態において、前述の実施形態のいずれか又は両方は、ｐＨ勾配緩衝液中に５０ｍＭ塩化ナトリウムを含み得る。他の密接に関連する実施形態では、１００ｍＭ塩化ナトリウムをｐＨ勾配緩衝液に含ませることができる。他の密接に関連する実施形態では、任意の他の塩を塩化ナトリウムの代わりに用いうる。

別の関連する実施形態では、第一級アミノ固相に同じ条件でロードし、次いで３Ｍグアニジン－ＨＣｌの溶液で洗浄して、ｐＨ勾配を用いて所望のｓｓＲＮＡ産物を溶出する前にｄｓＲＮＡの大部分を除去することができる。グアニジン洗浄に続いて、グアニジン塩無しの洗浄を行い、過剰な塩の非存在下でｓｓＲＮＡのｐＨ勾配溶出が始まるようにする。密接に関連する実施形態では、１００ｍＭ塩化ナトリウムをｐＨ勾配緩衝液に含ませることができる。別の密接に関連する実施形態において、グアニジン－ＨＣｌは、グアニジンイソチオシアネートによって置き換えられてもよい。前述の２つの実施形態との結果比較により、グアニジン洗浄がｓｓＲＮＡの純度を改善する程度を評価することが可能となる。

上記の一連処理を拡張した関連する実施形態では、ｓｓＲＮＡを溶出する前に、金属安定化複合体を解離させ、非ｓｓＲＮＡ種を固相から退かせる目的で、２０ｍＭの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などであるがこれらに限定されないキレート剤を、グアニジンと組み合わせることができる。３つの前述の実施形態との結果比較により、カオトロープ－キレート剤洗浄がｓｓＲＮＡの純度を改善する（のであればその）程度を評価することが可能となる。

他の関連する実施形態では、ｄｓＲＮＡのクリアランスを最大にするために、ｓｓＲＮＡの溶出に先立って、種々のｐＨ値での他の塩種又は複数塩種の組合せを用いた洗浄を評価することができる。基礎となる概念は一般に、ｓｓＲＮＡの溶出を引き起こさない最高ｐＨにおける最も解離性の高い塩の濃度という条件は、所望のｓｓＲＮＡの溶出に先立って望ましくない混入物質の最も大きなサブセットを除去する可能性が高い、という考えのもと、かかる条件を適用する、というものである。その後に、所望の効果の達成に必要な最小塩濃度を決定するための調整を行うことができる。

いくつかの実施形態では、線状であるｐＨ勾配は、その勾配で溶出する種間の分離の程度を変更するために、又は特にサイズの異なるｓｓＲＮＡ分子間の分画を改善するために、改変され得る。１０装置容量のｐＨ勾配で溶出することが、所望の程度の分離を生じない場合、その持続時間は２０装置容量、又は５０装置容量、若しくは１００装置容量、又はそれ以上に延長され得る。

いくつかの実施形態では所望のｓｓＲＮＡを溶出し、それをｄｓＲＮＡから分離するためのｐＨの増加は段階的に行うことができる。前の洗浄工程においてｄｓＲＮＡ含有量が十分に減少した場合、方法を単純化し、可能な限り最高の濃度及び可能な限り最低の容積で溶出されたｓｓＲＮＡを得るために、ｓｓＲＮＡを単一工程で溶出することができる。あるいは、ｐＨを上昇させるステップの連続において段階的溶出が行われてもよい。個々のステップは、比較的穏和であってもよく、又は特定の調製物の必要性に応じて大きくてもよい。いくつかの実施形態では、所望のｓｓＲＮＡを溶出するためのｐＨの上昇が単一のステップで行われ得る。

ある実施形態では、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡを含有する試料は、ｄｓＲＮＡの大部分による結合を妨げるｐＨで、第一級アミノ固相上にロードされ得る。いくつかのそのような実施形態では、ｍＲＮＡのサイズに応じて、試料ロード中のｐＨはｐＨ８．０、若しくはｐＨ８．５、若しくはｐＨ９．０、又はｓｓＲＮＡの結合を妨げないより高いｐＨであり得る。

特別な場合を代表する実施形態において、ｓｓＲＮＡは、一定のｐＨで塩勾配によって溶出され得る。これは、最初に、塩の非存在下でｓｓＲＮＡが溶出する値のすぐ下の値までｐＨを上昇させることを必要とする。次いで、塩勾配をそのｐＨで適用する。この実施形態は、固定されたｐＨでの塩勾配の標準的なアニオン交換溶出形式と表面的な類似性を有するが、大きなｍＲＮＡの塩勾配が成功するのはさもなければ上昇した動作温度においてのみであるため、ｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離する分野では依然として異彩を放つもの（distinctive）である。

クロマトグラフィーカラムに試料をロードするための条件に試料を平衡化する多くの方法は、当業者に公知である。これらの方法のいずれも、方法の真の性質を変更することなく使用することができる。これらの方法の中には、実験室規模の透析方法、タンジェンシャルフロー濾過膜による透析濾過方法、及び緩衝液交換クロマトグラフィーの方法がある。場合によっては、試料を目標ｐＨまで滴定し、必要であれば、試料を水又は低塩若しくは非塩含有緩衝液で希釈することによって、適切な試料平衡化が達成され得る。

ある実施形態では、ｓｓＲＮＡと固相の第一級アミノ基との間の水素結合と競合する糖の存在により、ｐＨを上昇させることによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、糖の非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かかる実施形態の一つにおいて、糖は、ソルビトール、又はキシリトール、又はマンニトール、トレハロース、又はスクロース、又は別の糖、又は糖の組み合わせである。かかる実施形態のいくつかでは、糖の濃度は、０．１％～２０％、又は１％～２０％、又は５％～２０％、又は１０％～２０％、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値の範囲であり得る。

関連する実施形態では、ｓｓＲＮＡと固相の第一級アミノ基との間の水素結合と競合する非イオン性カオトロープの存在により、ｐＨを上昇させることによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、カオトロープの非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かかる実施形態の一つにおいて、カオトロープは尿素である。かかる実施形態のいくつかでは、尿素の濃度が０．１Ｍ～１０Ｍ、又は１Ｍ～９Ｍ、又は２Ｍ～８Ｍ、又は４Ｍ～６Ｍ、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値の範囲であり得る。別のそのような実施形態では、カオトロープはジメチルスルホキシドである。いくつかのそのような実施形態において、ジメチルスルホキシドの濃度は、９９％までである。他の関連する実施形態において、非イオン性カオトロープはｐＨ勾配によって所望のｓｓＲＮＡを溶出する前に、洗浄ステップ中に適用され得る。

別の実施形態では、アルカリ性アミノ酸の存在により、ｐＨを上昇させることによるｄｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が増強されて、アルカリ性アミノ酸の非存在下よりも低いｐＨでｓｓＲＮＡを溶出させる、という結果が予想される。かかる実施形態の一つにおいて、アルカリ性アミノ酸は、ヒスチジン、又はヒスタミン、又はリジン、又はアルギニン、又は別のアルカリ性アミノ酸、又はアルカリ性アミノ酸の混合物である。かかる実施形態の一つにおいて、ヒスチジンの濃度は１ｍＭ～２５０ｍＭ、又は１０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５０ｍＭ～２５０ｍＭ、又は１００ｍＭ～２５０ｍＭの範囲、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。別のかかる実施形態では、リジンの濃度は１ｍＭ～１０Ｍ、又は１０ｍＭ～１０Ｍ、又は１００ｍＭ～１０Ｍ、又は１Ｍ～１０Ｍ、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。別のかかる実施形態では、アルギニンの濃度は１ｍＭ～８５０ｍＭ、又は１０ｍＭ～８５０ｍＭ、又は１００ｍＭ～８５０ｍＭ、又は４２５ｍＭ～８５０ｍＭの範囲、又はより高い、より低い、又は中間の範囲内の値であり得る。

ｍＲＮＡを含む核酸は、多価金属カチオンに対して高い親和性を有することが知られている。それらは、主に、金属イオンと、核酸の骨格に沿った負に荷電したホスファチジン酸残基との間の配位結合によって、互いに強い会合を形成する。カルシウム及びマグネシウムは両方ともこのような相互作用に関与することが知られており、両方とも２＋の電荷を有する二価の金属カチオンである。３＋の電荷をもつ３価のカチオンである第二級鉄は、核酸とより積極的に相互作用する。これらのイオンのいずれか１つが核酸と相互作用する各時点で、それは、同等数の負電荷を中和する。これは、所与のｍＲＮＡ分子上の負電荷が減少し、アニオン交換体とのｍＲＮＡの相互作用を弱めるという表面的な予想を作り出す。そうではなく、多価金属カチオンの添加は典型的には非特異的架橋の形成をもたらし、これは、ｓｓＲＮＡに、クロマトグラフィー装置から溶出しない大きな凝集体を形成させる。

ｍＲＮＡ調製には一般に多価カチオンが添加されるので、全ての実施形態において、正に荷電した第一級アミノ基を主に担持する固相上に試料をロードする前に、その含量を減少させ、好ましくは多価金属カチオンを試料から完全に排除する工程を行うこと；又は装置が溶出に供される前に、多価金属カチオンを除去するための工程を少なくとも行うこと、が推奨される。多価金属カチオンを事前に除去することにはさらなる理由が少なくとも２つある。第１の理由は、多価金属カチオンには鎖内ｄｓＲＮＡ配列及び鎖間ｄｓＲＮＡ配列の形成又は安定化を促進する傾向があり得ることである。第２の理由は、金属イオンが核酸とタンパク質との間の非特異的会合を安定化し、それらの間に安定な架橋を本質的に形成することである。配位結合はイオン結合よりも１５～６０倍強いので、配位錯体は、飽和レベルのＮａＣｌ及びグアニジニウム塩を含む非金属塩への曝露にも容易に耐える。このことは、本発明の方法から最高のｓｓＲＮＡ純度及び回収率を得るために、多価金属カチオンを可能な限り抽出することを必須にする。多価金属カチオンの効果的な抽出を考慮すると、核酸－タンパク質複合体の効果的な解離は、グアニジニウム塩などの高濃度のカオトロピック塩で、及びより低い程度で、ＮａＣｌなどの高濃度の非カオトロピック塩で、達成されうる。

核酸－金属－混入物質複合体のキレート剤による解離又はキレート剤－高塩による解離が試料調製中に実施され、及び／又はキレート化洗浄又はキレート化－カオトロープ洗浄が実施されるいくつかの実施形態では、その後、ｐＨ制御を提供するために使用される薬剤を超えて塩を含まない洗浄工程が実施され得る。これは、ｓｓＲＮＡが低塩環境で溶出されることを可能にする。

他の実施形態では、ｐＨを増加させることによって、ｓｓＲＮＡの溶出中にキレート剤濃度及び高塩濃度が維持され得る。他の実施形態では、高塩が維持されている間、キレート剤は排除されていてもよい。他の実施形態では、キレート剤が維持されている間、高塩は除去されていてもよい。

本発明の特に利益のある点は、ｓｓＲＮＡ調製物からＤＮＡプラスミドを除去するその能力が、インビトロ転写混合物又は部分的に精製されたインビトロ転写混合物のヌクレアーゼ消化の実施を不要にすることである。このことは、ヌクレアーゼ消化では酵素を活性とするためにマグネシウムイオンの添加を必要とすることからして、不釣り合いに高い価値を有する。該マグネシウムイオンは所望のｓｓＲＮＡの、それ自体及び他の試料成分との架橋に潜在的に寄与し、実際的な結果として、所望のｓｓＲＮＡ産物の回収を低減させる。ヌクレアーゼ消化を不要にすることにより、マグネシウムイオンの添加が不要となり、ｓｓＲＮＡの収率が損なわれることがなくなる。

本発明の方法がｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する能力にかかわらず、ヌクレアーゼ消化を望まれる程度まで実施し、次いで、第一級アミノ基を主に有する正に荷電した固相を過剰のキレート剤で洗浄して、残留マグネシウムイオンを退かせてもよい。このような実施形態では、５ｍＭヌクレアーゼ酵素の存在下でプラスミドＤＮＡをヌクレアーゼで消化した後、ＥＤＴＡが１０～５０ｍＭの範囲かそれ以上のＥＤＴＡを含むキレート洗浄を行うことができる。

インビトロ転写混合物から始まる、ある実施形態では、多価金属カチオンを捕捉する目的で、ＥＤＴＡを１０～５０ｍｍの最終濃度まで添加する。ｐＨがｐＨ７～ｐＨ８．０の範囲にあると仮定すると、必要に応じて試料を濾過し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に平衡化した第一級アミノクロマトグラフィー装置にロードすることができる。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で１０～２０装置容量洗浄する。次いで、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で洗浄して、グアニジン及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ１１．０に向かう線形勾配で５０装置容量で溶出する。画分回収の直後に、ｓｓＲＮＡピークを含有する容器を、１Ｍ酢酸を添加することによって中和する。

上記実施形態を拡張したある実施形態では、本発明の方法の後の中和試料を、最終精製のためにオリゴｄＴアフィニティークロマトグラフィー装置に適用する。

上記の実施形態を拡張した代替的実施形態では、中和された試料が最終精製のために疎水性相互作用クロマトグラフィー装置に適用される。

インビトロ転写混合物で始まる、ある実施形態では、混合物が最終濃度が２．０Ｍ～２．５Ｍになるように塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を添加することによって沈殿させられる。上清を廃棄し、沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で再懸濁し、必要に応じて濾過して濁りを除去する。次いで、試料を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に平衡化した第一級アミノ固相にロードする。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍグアニジンイソチオシアネート、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄して、グアニジン及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。画分回収の直後に、ｓｓＲＮＡピークを含む容器を、画分体積の５％の最終割合となるまで１Ｍ酢酸を添加することによって中和する。密接に関連する実施形態では、ＬｉＣｌの代わりにＮａＣｌ又は別の塩でｍＲＮＡが沈殿される。別の密接に関連する実施形態において、ｍＲＮＡは、約２．５％の最終割合までエタノールを添加することによって沈殿させられる。

工業プロセスの開発者はしばしば、酵素の使用を避けることを好む。これは、酵素の使用でプロセスの費用が増加するためであり、また、添加されるものは、後で除去されなければならず、そして、それが除去されたことを文書化するために試験を実施しなければならないからである。しかし、開発プログラムの初期段階での酵素の使用は企業がより早く臨床試験に参加することを可能にする便利なショートカットであり得、酵素の使用を必要としないプロセスのより進んだバージョンはその後に開発される。上記のように、インビトロ転写混合物は一般に、ｍＲＮＡの産生のための鋳型として使用されるＤＮＡプラスミドを排除するために、ＤＮＡアーゼ酵素で処理される。ＲＮＡ精製では、所与のインビトロ転写混合物中のタンパク質混入物質負荷を減少させるために、タンパク質分解酵素を用いることもできる。いくつかの実施形態では、インビトロ転写混合物をまずＤＮＡｓｅで処理してプラスミドを除去し、次いでプロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素で処理して、本発明の方法を実施する前にＤＮＡｓｅ及び大量の他のタンパク質混入物質を除去することができる。他の実施形態では、本発明の方法がＤＮＡｓｅを使用することを不要にするので、インビトロ転写混合物はプロテイナーゼＫ又は別のタンパク質分解酵素のみで処理され得る。

ある実施形態では、インビトロ転写混合物をプロテイナーゼＫで処理して、タンパク質負荷を減少させる。試料をメンブランフィルターに通して濾過して粒子を除去し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に平衡化した第一級アミノ固相にロードする。試料をロードした後、装置を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０にて１０～２０装置容量で洗浄する。次いで、カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄して、グアニジン及びＥＤＴＡを装置から洗い流し、ｓｓＲＮＡの溶出の準備をする。次いで、ｓｓＲＮＡを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ １１．０に向かう５０装置容量の線形勾配で溶出する。画分回収の直後に、ｓｓＲＮＡピークを含有する容器を、１Ｍ酢酸を添加することによって中和する。

ある実施形態では、インビトロ転写混合物を、２Ｍのグアニジンイソチオシアネート及び２０ｍＭのＥＤＴＡで処理する。必要であればｐＨを７．５±０．５に調整し、必要であれば試料を濾過して固形物を除去する。第一級アミノ固相を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０中の２Ｍグアニジンイソチオシアネート及び２０ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化する。試料を固相上にロードし、次いで、ＵＶ吸光度がゼロに近づくまで平衡化緩衝液で追跡する。次いで、固相を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、次いで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１１．０に向かうｐＨ勾配で溶出させる。勾配は、単一ステップ、一連のステップとして、又は連続（線形）フォーマットで実行されうる。画分回収の直後に、ｓｓＲＮＡピークを含有する容器を、１Ｍ酢酸を添加することによって中和する。

本発明は高温でｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの分離を実施することの必要性を後回しにできるという利点を提供するが、そうする可能性を排除するものではない。

いくつかの実施形態では、周囲温度で方法を実施する前に、３７℃、４５℃、５６℃、６０℃、７０℃、又は中間、より高い、若しくはより低い温度などの高温に、試料が平衡化されてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は３７℃、４５℃、５６℃、６０℃、７０℃、又は中間、より高い、若しくはより低い温度などの高温で実施され得る。このような実施形態では、ｓｓＲＮＡが周囲温度で溶出するよりも低いｐＨで溶出する。

いくつかの実施形態では試料が高温に平衡化され、本方法は高温で実施されうる。

ある実施形態では、本発明の方法がオリゴｄＴ(ＯｄＴ)リガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーの方法と組み合わせることができる。２つの方法は、所望の任意の順序で組み合わせることができる。

ある実施形態では、本発明の方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の方法と組み合わせることができる。２つの方法は、所望の任意の順序で組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはフェニル基からなり得る。別のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはブチル基からなり得る。別のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドはヘキシル基からなり得る。他のかかる実施形態では、ＨＩＣ固相上の疎水性リガンドは異なる脂肪族基若しくは芳香族基、又は脂肪族特性及び芳香族特性の両方を具現化する基からなり得る。

ある実施形態では、本発明の方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の方法と組み合わせることができる。２つの方法は、所望の任意の順序で組み合わせることができる。かかる実施形態の一つでは、固相表面の疎水性は、固相を合成するために使用されるスチレンジビニルベンゼン（ＳＤＶＢ）ポリマーの本来の疎水性によって付与され得る。別のかかる実施形態では、固相表面の疎水性は、固相の表面に固定されたリガンドの疎水性によって付与され得、ここで該リガンドは脂肪族炭化水素、若しくは芳香族炭化水素、又は脂肪族特性及び芳香族特性の混合を有するリガンドを表す。

ある実施形態では、本発明の方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの方法と組み合わせることができる。２つの方法は、所望の任意の順序で組み合わせることができる。

ある実施形態では、本発明の方法は、オリゴｄＴリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィー及びＲＰＣと組み合わせることができる。３つの方法は、所望の任意の順序で組み合わせることができる。

ある実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡプラスミドの調製物からｓｓＲＮＡを除去するために使用することができる。密接に関連する実施形態において、本発明の方法は、タンパク質調製物からｓｓＲＮＡを除去するために使用され得る。このような実施形態では、この方法がｍＲＮＡの合成に使用される酵素調製物から混入ｓｓＲＮＡを除去するために使用され得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＤＮＡ及びタンパク質が、主に第一級アミノ基を有する正に荷電した固相に結合する、酸性から中性のｐＨ条件及び低塩濃度で、試料をロードすることができる。次いで、それらを塩勾配で溶出させて、固相の表面に結合したｓｓＲＮＡを残しながら、混入物質に対するそれらの純度を増加させることができる。ｓｓＲＮＡを除去することのみを意図する、密接に関連する実施形態では、試料及び固相条件は、ＲＮＡが結合したままとしながらＤＮＡ及びタンパク質が固相を通って流れる、酸性から中性のｐＨでの高濃度の塩を含み得る。

ある実施形態では、本発明の方法は、試料中のｓｓＲＮＡの量を定量するための分析ツールとして使用することができる。このような実施形態では、酸性から中性のｐＨの試料を高濃度の塩と混合して、ほとんどの非ｓｓＲＮＡ分子が結合しないようにすることができる。次いで、第一級アミノ固相は、結合したｓｓＲＮＡをサイズ増加でソートするためにｐＨの勾配を増加させることによって溶出に供される。密接に関連する実施形態においては、第一級アミン固相は、アッセイの感度を最大にする目的のために、単一のピークにおいて全ｓｓＲＮＡを溶出するのに十分なアルカリ性ｐＨまで、単一のステップで溶出に供され得る。関連する実施形態において、第一級アミン固相は２５ｍＭ ＮａＯＨ、又は５０ｍＭ ＮａＯＨ、又は１００ｍＭ ＮａＯＨ、又はより高い、より低い、又は中間の濃度に向かう線形勾配で溶出に供され得る。別のそのような実施形態では、第一級アミノ固相は２５ｍＭ ＮａＯＨ、又は５０ｍＭ ＮａＯＨ、又は１００ｍＭ ＮａＯＨ、又はより高い、より低い、又は中間の濃度まで漸増ステップで溶出に供され得る。別のそのような実施形態では、第一級アミノ固相が２５ｍＭ ＮａＯＨ、又は５０ｍＭ ＮａＯＨ、又は１００ｍＭ ＮａＯＨ、又はより高い、より低い、又は中間濃度までの単一のステップで溶出に供され得る。上記の実施形態のいずれにおいても、試料を第一級アミノ固相上にロードした後、ＲＮＡと相互作用して蛍光を生成する色素を注入し、蛍光色素－ＲＮＡ複合体を蛍光モニタに通してアッセイの感度を増幅することができる。このような実施形態では、色素はリボグリーンでありうる。

ある実施形態において、本発明の方法は、その実施を容易にするためのキットの形態で提供され得る。キットは２つ以上の固相を含み得、そのうちの少なくとも１つは主に第１級アミノ基を担持する正に荷電した固相であり、キットはまた本発明の方法を説明する説明書を含みうる。このような実施形態では、第２の固相はオリゴｄＴクロマトグラフィー装置である。別のかかる実施形態では、第２の固相は疎水性相互作用クロマトグラフィー装置である。別のかかる実施形態では、第２の固相はオリゴｄＴクロマトグラフィー装置であり、第３の固相は疎水性相互作用クロマトグラフィー装置である。

本発明に従って使用される固相を用いたｍＲＮＡの精製の典型的なプロトコールにおいて、第一級アミンモノリスは以下のように使用される。

第一級アミンモノリスは、周囲温度で水性条件下で大きな一本鎖ｍＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)を精製する。第一級アミンモノリスはｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、エンドトキシンを除去し、一方、ｓｓＲＮＡをサイズの昇順に分画する（図１）。第一級アミンモノリスは、研究グレードのｓｓＲＮＡの一段階精製のために、又は多段階精製プロセスにおける高分解能捕捉段階として、使用することができる。また、インビトロ転写混合物、部分精製試料、クロマトグラフィー画分、及び製剤化された原薬の迅速な高分解能分析特性決定を可能にする。

第一級アミンモノリスは、上昇ｐＨ勾配でｓｓＲＮＡを精製するアニオン交換及び水素結合の独特の組み合わせを使用する。ＤＮＡ、タンパク質、及びｄｓＲＮＡは、ｓｓＲＮＡの前に溶出する。精製性能は、溶出前にｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質の大部分を除去する高塩洗浄によって増強される。注目すべきことに、ｓｓＲＮＡは、カオトロピック塩が飽和濃度であっても結合したままである。高塩洗浄中のキレート剤の含有は混入物質の除去をさらに増強し、残留する微量レベルの混入物質及び凝集体をｐＨ勾配により除去することを可能とする。

第一級アミンモノリスからのｓｓＲＮＡ画分は所望により、CIMmultus Oligo dTを使用するアフィニティークロマトグラフィー、CIMmultus C４ ＨＬＤを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はCIMmultus SDVBを使用する逆相クロマトグラフィー (これらのカラムのいずれかに関するより詳細な情報についてはＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓに問い合わせのこと）によってさらに精製することができる。第一級アミンモノリスはまた、高塩試料をさらなる試料調製なしでロードすることができるので、特に高塩ステップ様沈殿又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に、仕上げ方法（polishing method）として使用することができる。

第一級アミンモノリスは、ラジアルフロークロマトグラフィー装置である。これは、シリンダの外側から内側へ流れを分配するように設計されている。これは、シリンダーの物理的構造を安定化する効果を有し、また、分離性能を改善する溶出中の濃縮効果を有する。実験を実施する前には、流れの方向が装置のマーキングに沿ったものとなるように、装置をクロマトグラフに接続するよう注意すること。一部のクロマトグラフには、ソフトウェアに組み込まれているデフォルトの逆流機能があり、これにより、フロー方向が警告なしに逆になる可能性があることに注意する。実験を行う前に、この機能が無効になっていることを確認する。

第一級アミンモノリスは、２０％エタノール中で送達される。実際に使用する前に、下記のように消毒及び再生することが推奨される。また、実験結果を比較するためのベースラインを提供するために、試料なしの実行（run）を実施することが推奨される。いくつかの緩衝液成分はＵＶを吸収し、緩衝液間を移ることのいくつかは、実験結果の解釈を混乱させ得る屈折率アーチファクトを生成しうる。

試料及び調製：第一級アミンモノリスは、ＤＮＡｓｅ及び／又はプロテイナーゼＫによる消化後を含むインビトロ転写混合物、並びに塩沈殿物又は有機溶媒沈殿物から再懸濁されたｓｓＲＮＡ、又は他の精製方法からの部分的に精製されたｓｓＲＮＡを処理するために使用することができる。二価金属カチオンを含有する試料は、金属イオンの推定濃度の約１０倍のキレート剤で処理されるべきである。粒子は、注入の前に遠心分離又は濾過（０．４５μｍ）によって除去されなければならない。試料のｐＨはｐＨ６．０～８．０とする。塩分含有量は考慮されない。

緩衝液Ａ：平衡緩衝液／勾配開始緩衝液。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。
緩衝液Ｂ：高塩洗浄緩衝液。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３．０Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
緩衝液Ｃ：勾配終点緩衝液。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ １１．０。
緩衝液Ｄ：洗浄／消毒用緩衝液。２Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＯＨ．
緩衝液Ｅ：再生緩衝液。３．０Ｍ酢酸アンモニウム。

緩衝液Ａを用いてカラムを平衡化する：出てくる緩衝液（output buffer）のｐＨ及び導電率が入れる緩衝液（input buffer）と同じになるまで、ポンプで平衡化緩衝液をカラムに入れて通す。流量：１０カラム容量（ＣＶ）／分。

試料を注入する。大量の試料、特にインビトロ転写混合物のような粗試料を適用する間、操作圧力を観察する。必要に応じて流量を減らし、使用圧力を許容範囲内に維持する。

緩衝液Ａを用いた洗浄１：１０～２０ＣＶの平衡化緩衝液。後端の混入物質は後続の高塩洗浄ステップによって除去されるので、ＵＶ信号が完全にベースラインに戻るのを待つ必要はない。

緩衝液Ｂを用いた洗浄２：１０～２０ＣＶの平衡化緩衝液。グアニジンはＵＶを吸収するので、直ちにピークが生じることに留意されたい。ＤＮＡ及びｄｓＲＮＡは、典型的にはピークの頂点に接近するかなり鋭いピークとして溶出する。グアニジンピークがレベルプラトーに達するまで洗浄を続ける。

緩衝液Ａを用いた洗浄３：１０～２０ＣＶの平衡化緩衝液、又はＵＶがベースラインに戻るまで。

緩衝液Ｃに向かう溶出勾配：１００％勾配終点緩衝液に向かう５０～１００ＣＶの線形勾配、次いで、１０ ＣＶの間１００％で保持する。溶出直後に画分を中和する。

緩衝液Ｄで洗浄／消毒する。ｐＨ勾配の最後にかなりの量の物質がカラムに結合したままであるかどうかを明らかにするため、１０～２０ＣＶの消毒緩衝液で処理することが、毎回の実行後に推奨される。消毒ステップの内容物はさらなる分析のために、溶出時に収集され、中和されてもよい。カラムにインビトロ転写混合物をロードする場合、消毒工程の持続時間を１時間に延長する必要があり得る。極端な汚損の場合には、消毒期間を１６～２４時間に延長することが必要な場合がある。消毒中に最小の流速を維持することは、ＯＨイオンを連続的に補充し、単にそれらをその場で加水分解するのみならずカラムから混入物質を洗い流すので、より良好な結果をもたらす傾向がある。

カラムを再生する：２０ＣＶの緩衝液Ａ又は水を用いてカラムからＮａＯＨを洗い流し、次いで２０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄する。これはモノリスの表面から水酸化物対イオンを退かせるためであり、さもなければ水酸化物対イオンがカラムの平衡化を遅らせ、溶出中にｐＨアーチファクトを生成し得る。

保存：消毒後、緩衝液Ａ又は水でカラムを洗い流し、２０％エタノール中に保存する。

代表的なクロマトグラムを図８に示す。

変更（Variations）、最適化、トラブルシューティング

個々のステップの時間を最適化するためのガイドとしてクロマトグラムを使用する。

例えば、完全飽和までの濃度の異なるカオトロピック塩、及び異なる濃度のキレート剤を使用して、高塩洗浄の大幅な変更が可能である。プロトコールに示される濃度は、出発点として意図される。より低い濃度で同等の純度が提供される場合、かかるより少ない量とすることで材料費が低減され、緩衝液調製が単純化される。

カオトロピック塩は非カオトロピック塩に置き換えうるが、ＲＮＡを沈殿させる高濃度の塩を適用する場合には注意が必要である。これらは、とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムを含む。予備的実験結果では、１Ｍ塩化ナトリウムでの洗浄が、ｄｓＲＮＡ及びＤＮＡの大部分を除去するものの、ＵＶ吸光度をベースラインに回復させるために長期洗浄を必要とし得ることが示されている（図１）。

グアニジン及びＥＤＴＡを試料に直接添加し、カラムを高塩洗浄緩衝液に向けて平衡化するワークフロー単純化を実施することができる。試料ロードに続いて高塩緩衝液を使用した最初の洗浄を行い、次に上から緩衝液Ａを使用した第２洗浄を行い、その後溶出を行う。このアプローチはまた、ｄｓＲＮＡ及びＤＮＡが結合表面積に対して競合することを妨げるので、より高いｓｓＲＮＡ結合能力をサポートし得ることに留意されたい。このアプローチによれば、カラムの汚れも低減され得る。

高塩洗浄ステップは、完全に省略することができる。これは、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ、又はＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの相対量を決定することを目的とする試料の分析的特徴解析に好ましい場合がある。本方法は一般に、ｄｓＲＮＡとＤＮＡとを区別しない。

ｐＨ勾配からの塩の除去はｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの分離を増すが、そのようにすることは収率を低下させ、溶出が起こるｐＨも上昇させる。ＲＮＡを沈殿させる塩の使用は、その濃度が沈殿レベルを十分下回って維持される限り許容される（図６）。カオトロープのような、ＲＮＡの溶解性を促進する塩もまた、ｐＨ溶出中に使用され得るが、それらは後続の精製方法を妨害し得ることを考慮すること。

動作温度は、溶質をより早く溶出させる効果を伴って、ｐＨ勾配中に上昇し得る。制御されていない操作温度は、再現性を損なうことがある。

線形ｐＨ勾配は、段階的勾配フォーマットに変換することができる。CIMmultus dsX-βが直交精製法（orthogonal purification method）と組み合わされる場合などのいくつかの場合には、単一のｐＨステップでｓｓＲＮＡを溶出することが実用的であり得る。

不適切な洗浄の兆候としては、一連のランにわたる操作圧力の漸増、所定の種が先に行ったランにおけるより早く又は遅く溶出する選択性シフト、及び／又は、試料が注入されていないにもかかわらず溶出中にピークが現れるゴーストピークの出現、が挙げられよう。

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

実施例１．
周囲温度においてｐＨ勾配を用いて、第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するに際して、ｓｓＲＮＡを溶出する前に、塩ステップによってｄｓＲＮＡを除去する
２１ｂ～５００ｂの範囲のｄｓＲＮＡ分子を含むｄｓＲＮＡラダーと、２００ｂ～６０００ｂの範囲のｓｓＲＮＡ分子を含むｓｓＲＮＡラダーと、を含む試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いた洗浄工程を適用し、続いて、ＮａＣｌを除去するための別の洗浄工程を適用した。次いで、モノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ １１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図１に示すように、すべてのｄｓＲＮＡ種はＮａＣｌステップで溶出し、一方、ｓｓＲＮＡは結合したままであり、ｐＨ勾配の後の方で溶出した。ｄｓＲＮＡラダー内の種間で明らかなサイズ分離は観察されないが、ｓｓＲＮＡラダー内の種間では明確な分離が観察される。

実施例２．
周囲温度においてｐＨ勾配を用いて、第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するに際して、ｓｓＲＮＡを溶出する前に、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する洗浄ステップによってｄｓＲＮＡを除去する
２１ｂ～５００ｂの範囲のｄｓＲＮＡ分子を含むｄｓＲＮＡラダーと、５０００ｂのｓｓＲＮＡと、を含む試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、６Ｍグアニジン、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用いた洗浄工程を適用し、その後、グアニジン及びＥＤＴＡを除去するための別の洗浄工程を行った。次いで、モノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ １１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図２に示すように、すべてのｄｓＲＮＡ種は塩ステップで溶出し、一方、ｓｓＲＮＡは結合したままであり、ｐＨ勾配の後の方で溶出した。

実施例３．
強アニオン交換体及び弱アニオン交換体からｓｓＲＮＡを溶出するｐＨ勾配は失敗
ｐＨ勾配中のｓｓＲＮＡの挙動を、強アニオン交換体（第四級アミン、ＱＡ）及び弱アニオン交換体（第三級アミン、ＤＥＡＥ）を実験対照区として用いて、これらに対して第一級アミノ固相上におけるｐＨ勾配溶出の性能を比較することで特徴解析した。両アニオン交換体の物理的形態は、１ｍＬの体積を有するモノリス装置であった。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。約５０００ヌクレオチド塩基（５０００ｂ）のｓｓＲＮＡを含有する試料を注入し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、非結合物質を退かせた。次いで、カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ１１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図３は、ｓｓＲＮＡが強アニオン交換体又は弱アニオン交換体のいずれにおいてもｐＨ勾配内で溶出せず、１Ｍ ＮａＯＨでカラムを洗浄することによってのみ除去されたことを示す。

実施例４．
周囲温度においてｐＨ勾配を用いて、第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離する
約６０００塩基対のサイズを有するスーパーコイルｄｓＤＮＡプラスミド及び約５０００塩基のサイズを有するｓｓＲＮＡを含有する試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態である第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、モノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ １１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図４に示すように、ＤＮＡプラスミドは最初に溶出され、後に溶出されるｓｓＲＮＡから十分に分離された。

実施例５．
周囲温度においてｐＨ勾配を用いて、第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからプラスミドＤＮＡを分離するに際して、ｓｓＲＮＡを溶出する前に、塩ステップによってＤＮＡを除去する
約６０００塩基対のサイズを有するスーパーコイルｄｓＤＮＡプラスミド及び約５０００塩基のサイズを有するｓｓＲＮＡを含有する試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態である第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いた洗浄工程を適用し、続いて、ＮａＣｌを除去するための別の洗浄工程を適用した。次いで、モノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ１１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図５に示すように、ＤＮＡプラスミドは塩段階で溶出し、一方、ｓｓＲＮＡは結合したままであり、ｐＨ勾配の後の方で溶出した。

実施例６．
周囲温度における、塩とｐＨ勾配溶出との組み合わせの、ＤＮＡとｓｓＲＮＡの分離に対する効果
一連の分離を、単純なｐＨ勾配溶出と、終点緩衝液が５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ勾配溶出と、終点緩衝液が１０００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ勾配溶出と、を比較して行った。各実験において、約６０００塩基対のサイズを有するスーパーコイルｄｓＤＮＡプラスミド及び約５０００塩基のサイズを有するｓｓＲＮＡを含有する試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態である第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。第１の実験では、モノリスを１２５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５に向かう線形勾配で溶出に供した。第２の実験では、モノリスを、１２５ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．５に向かう線形勾配で溶出に供した。第３の実験では、モノリスを、１２５ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．５に向かう線形勾配で溶出に供した。図６に示すように、塩化ナトリウムを含まない場合では、ｓｓＲＮＡピークの中心はｐＨ １０．２で生じた。勾配終点緩衝液中に５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む場合では、ｓｓＲＮＡはｐＨ １０．０で溶出した。勾配終点緩衝液中に１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む場合では、ｓｓＲＮＡはｐＨ９．９で溶出した。塩化ナトリウムがｐＨ勾配にわたって５０ｍＭの濃度レベルに維持された場合、ｓｓＲＮＡはｐＨ ９．８で溶出した（図示せず）。塩化ナトリウムがｐＨ勾配にわたって１００ｍＭの濃度レベルに維持された場合、ｓｓＲＮＡはｐＨ９．６で溶出した（図示せず）。塩化ナトリウムの含有は、他の興味深い影響を引き起こした。ＤＮＡとｓｓＲＮＡとの間の分離はＮａＣｌの非存在下で最大であり、大量のＮａＣｌは、分離をさらに減少させた。しかし、ｓｓＲＮＡの収率は塩化ナトリウムの存在下で明らかに改善された。

実施例７．
ｄｓＲＮＡとＤＮＡによる反応の均一性
前述の実験の中で明らかなように、ｄｓＲＮＡ及びＤＮＡは同様に挙動し、両方とも塩洗浄によって排除され、両方ともｐＨ勾配内でｓｓＲＮＡから分離されるべきであることを示唆し、また、ＤＮＡが本発明の方法を特徴解析するためのｄｓＲＮＡ挙動のモデルとして使用され得ることを示唆する。代表的な転写混合物からｓｓＲＮＡを精製する過程で決して起こらない極端に最悪の場合における本発明の方法の能力を試験するために実験を行った。この試験は、約１３，０００塩基のサイズのｄｓＲＮＡから約１７００塩基の比較的小さなｓｓＲＮＡを分離すること、及び１３ｋｂのｄｓＲＮＡの溶出挙動を約６０００塩基対のＤＮＡプラスミドと比較することを含んでいた。第一級アミンモノリスを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化した。各実験において、試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合の材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、モノリスを１２５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５に向かう線形勾配で溶出に供した。図７に示されるように、予想と一致して、ＤＮＡ及び巨大ｄｓＲＮＡは、はるかに小さなｓｓＲＮＡの前に両方が溶出することで、大部分が共溶出した。ｓｓＲＮＡと２つのより大きな混入物質との間の分離の程度は他の実施例と比較して低くなったが、それにもかかわらず、明確な分離は明らかであった。実際には、所与のインビトロ転写混合物中のｄｓＲＮＡは、ｓｓＲＮＡと同じ数の塩基を含有する。ｓｓＲＮＡがそのサイズに従ってｐＨ勾配の後の方で溶出することを示す実施例４と比較して、これは、本発明がそれらのサイズにかかわらず、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの間の良好な分離を提供することを示唆する。この点はｐＨ勾配でｓｓＲＮＡを溶出する前に塩洗浄によってｄｓＲＮＡを容易に除去することができることを考慮すると、意味がないようであるが、本発明が塩洗浄を欠く場合であっても効果的な分離を達成しうるものであることを示す。図７の結果はまた、本発明が、ｓｓＲＮＡが１５，０００ｂ以上、おそらく２５，０００ｂ又はそれ以上てもうまく働くはずであることを示すことで注目される。

実施例８．
周囲温度においてｐＨ勾配を用いて、第一級アミノ固相を用いてｓｓＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離するに際して、ｓｓＲＮＡを溶出する前に、キレート剤－カオトロープの組み合わせステップによってＤＮＡを除去する
６０００ｂｐのスーパーコイルｄｓＤＮＡプラスミド及び５０００ｂのｓｓＲＮＡを含む試料を、モノリスクロマトグラフィー装置の形態である第一級アミン固相に適用した。第一級アミンモノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ８．０で平衡化した。試料を適用し、モノリス内のチャネルから未結合材料を退かせるために洗浄液を適用した。次いで、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、１Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用いた洗浄工程を適用し、その後、グアニジン及びＥＤＴＡを除去するための別の洗浄工程を行った。次いで、モノリスを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭビス－トリス－プロパン、２０ｍＭグリシン、ｐＨ１１．０に向かう線形勾配で溶出に供した。図８は、ＤＮＡプラスミドの大部分がグアニジン－ＥＤＴＡ（カオトロープ－キレート剤）洗浄で除去されたことを示している。残りの結合ＤＮＡは、ｐＨ勾配においてｓｓＲＮＡに先立って溶出した。

図８（１Ｍのグアニジンを使用）を図５（６Ｍのグアニジンを使用）とを比較すると、その結果は、ｓｓＲＮＡを溶出する前にＤＮＡを完全に退かせるには１Ｍのグアニジン－ＨＣｌでは不十分であることを示唆している。図５において、ｄｓＲＮＡピークは、６Ｍグアニジン洗浄ピークの最先の端に集中していた。図８ではＤＮＡはグアニジン洗浄の始めの方（toward the front of the guanidine wash）で溶出し始めるが、図５より明らかに遅く、目立った尾部がある。ｓｓＲＮＡピークの直前に溶出するＤＮＡ／ｓｓＲＮＡピークの相対的サイズは、１ＭグアニジンＨＣｌがＤＮＡ／ｄｓＲＮＡを事前に退かせないという結論をさらに支持する。しかしながら、ｓｓＲＮＡは１Ｍグアニジンでの事前洗浄後に単一のピークで溶出する（図８）のに対して、図５（６Ｍグアニジン後）ではｓｓＲＮＡピークが予想通りに観察されたものの、その後、凝集体を表すと解釈される溶出物質が後に続いたことにも留意されたい。この比較は、所望のｓｓＲＮＡの挙動を変化させることなくＤＮＡ／ｓｄＲＮＡの最良のクリアランスを提供するためにカオトロープ濃度を調整することが、プロセス最適化のルーティンの一部として有用であることを示唆する。

実施例９．
多価アニオンの含有によるｓｓＲＮＡ溶出ｐＨの低下
ＤＮＡとｓｓＲＮＡの混合物をｐＨ勾配で分画する一連の実験を行った。第一級アミン固相を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化した。次いで、試料をロードし、平衡化緩衝液で洗浄した。１２５装置容量の線形勾配を１２５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５の終点緩衝液まで適用した。第２の実験では、１００ｍＭクエン酸塩を緩衝液に添加したことを除いて、前記条件を繰り返した。第３の実験では、１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を緩衝液に添加したことを除いて、条件を繰り返した。図９に示されるように、添加剤は両方とも、ＤＮＡ及びｓｓＲＮＡが溶出するｐＨの両方を強く低下させ、観察される内ではＥＤＴＡが最も強いｐＨを低下させた。ｐＨ低下の程度も両方とも、１００ｍＭ塩化ナトリウムで達成されたよりも大きかった（図６）。塩化ナトリウムの結果と共通する点は、塩の存在が溶出勾配におけるＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの収率を増加させたことであった。別の類似点は、塩化ナトリウム、クエン酸塩、又はＥＤＴＡのいずれによる溶出もｐＨ８．０以下のｐＨ値でｓｓＲＮＡを溶出させなかったことであった。

実施例１０．
塩の存在下においてｐＨ勾配を用いた溶出に先立ち高塩洗浄を行うｓｓＲＮＡの精製
モノリスなどのクロマトグラフィー装置の形態の第一級アミン固相を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ グアニジンイソチオシアネート、８．０±０．５に平衡化する。ＵＶモニターをゼロにさせる。ＥＤＴＡ及びグアニジンイソチオシアネートを試料に添加し、試料のｐＨをｐＨ８．０±０．５に調整する。必要であれば、試料を濾過して濁りを除去する。試料を第一級アミンモノリスに適用し、モノリスを、ベースラインがゼロに戻るまで平衡化緩衝液で洗浄する。強力なキレート－カオトロープ溶液中での試料の適用及び洗浄は、微量レベルのｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質の結合防止及び／又は除去を意図するものである。次いで、モノリスを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭグアニジンイソチオシアネート、ｐＨ８．０±０．５にて少なくとも１０装置容量で洗浄する。次いで、ｓｓＲＮＡを、６５ｍＭグリシン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭグアニジンイソチオシアネート、ｐＨ１０．５±０．５に向かう線形勾配で溶出する。キレート剤の存在は多価金属カチオンの潜在的な存在による悪影響を防止するために、本方法全体を通して維持される。ｓｓＲＮＡの溶解度の低下を避けるために、実施例６に記載の１００ｍＭ塩化ナトリウム又は実施例９に記載の１００ｍＭクエン酸若しくは１００ｍＭ ＥＤＴＡの代わりに１００ｍＭグアニジンイソチオシアネートを使用する。所望であれば、並行する実験において、ｓｓＲＮＡが溶出するｐＨをさらに低下させる目的で、グアニジンイソチオシアネートの濃度を上昇させる。所望であれば、並行する実験において、カオトロピック塩であるグアニジンチオシアネートを、異なる塩で置き換える。所望であれば、並行する実験において、キレート剤の種及び濃度を変更する。

実施例１１．
ｐＨ－塩勾配の組み合わせを用いて、第一級アミン固相からインビトロ転写混合物を溶出する
以下の緩衝液を調製した：５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含有する緩衝液Ａ、ｐＨ７．０；５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２００ｍＭピロリン酸ナトリウムを含有する緩衝液Ｂ、ｐＨ８．５；１００ｍＭ水酸化ナトリウム、２．０Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液Ｃ；及び１．５Ｍ Ｈｅｐｅｓを含有する緩衝液Ｄ、ｐＨ７．０．２μｍチャネル及びベッド容積１００μＬを有し２０％エタノール中に保存される第一級アミンモノリスを、５０ＣＶの水で２ｍＬ／分（２０ＣＶ／分）の流速にて洗浄した。カラムを緩衝液Ａで平衡化し、反応の開始から３０秒で採取した２５μＬのインビトロ転写混合物試料を注入した。カラムを２０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、次いで、２０％緩衝液Ｂに向かう４０ＣＶの線形勾配を適用し、続いて、２０％緩衝液Ｂで１０ＣＶ分の勾配保持を行った。このセグメントは、ＤＮＡプラスミドを含むヌクレオチド及び二本鎖種を溶出した。５０％緩衝液Ｂに向かう１０ＣＶの線形勾配を適用してｍＲＮＡを溶出し、続いて５０％Ｂで勾配を保持した。１００％Ｂに向かう追加の１０ＣＶ線形勾配を適用し、続いて１０ＣＶ分の勾配保持を行った。カラムを緩衝液Ｃで洗浄し、次いで緩衝液ＤでｐＨ７に戻した。カラムを再平衡化し、インビトロ転写の開始４時間後に採取した試料を注入した。溶出は、前の試料と同様に行った。ランの完了後、カラムを２０％エタノールで洗浄し、その溶液中に保存した。全てのクロマトグラフィー工程は、周囲温度で行った。溶出プロファイルを図１０に示す。３０秒で採取した試料に対応するプロファイルは長破線で示す。４時間で採取した試料に対応するプロファイルは実線で示す。短い破線は導電率を示す。予想された通り、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰ、及びＧＴＰなどの構成ヌクレオチドのレベルは、新たに合成されたｍＲＮＡへのそれらの組み込みを反映して、インビトロ転写の過程にわたってより低いレベルに減少した。

参照文献
本明細書に引用される全ての参考文献は、その組み込みが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、参照により本明細書に組み込まれる。
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[9] WO 2014/144767 A1

Claims (13)

1. 一本鎖ＲＮＡを含有する試料を、少なくとも主に前記一本鎖ＲＮＡを結合させるのに十分なｐＨで、その表面上に第一級アミノ基を主に担持する又は第一級アミノ基のみを担持する固相に適用するステップ、
   上昇するｐＨに前記固相の表面を曝露させることによって、吸着された前記一本鎖ＲＮＡを前記固相の表面から溶出するステップ、
   を含む、一本鎖ＲＮＡ精製の方法。
2. 前記試料を適用した後でありかつ前記一本鎖ＲＮＡを溶出するより前に、前記一本鎖ＲＮＡの溶出に用いられた溶出緩衝液に比べてより高いイオン強度を有する洗浄緩衝液を用いて前記固相を洗浄するステップが少なくとも１つ提供される、請求項１に記載の方法。
3. 前記のより高いイオン強度を低下させるために前記少なくとも１つの洗浄ステップが提供される、請求項２に記載の方法。
4. 前記試料を適用した後でありかつ前記一本鎖ＲＮＡを溶出するより前に、一本鎖ＲＮＡは前記固相に吸着されたままに維持し残存する二本鎖ＲＮＡは脱着させる上昇したｐＨを有する洗浄緩衝液を用いる洗浄ステップが少なくとも１つ提供される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記洗浄緩衝液のイオン強度が、前記一本鎖ＲＮＡを溶出するために必要な塩のモル濃度に比べて０．５Ｍ～１２Ｍ、又は１．０Ｍ～１０Ｍ、又は２．０Ｍ～８．０Ｍ、又は４．０Ｍ～６．０Ｍ高い範囲にある、請求項２～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記洗浄緩衝液のイオン強度がカオトロピック塩、特にグアニジニウム塩、チオシアネート、過塩素酸塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるカオトロピック塩、の濃度で調整される、請求項２～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記固相の表面からの前記一本鎖ＲＮＡの溶出がｐＨ７．５～ｐＨ１２．０、又はｐＨ８．０～ｐＨ１１．５、又はｐＨ８．５～ｐＨ１１、又はｐＨ９．０～ｐＨ１０．５のｐＨ範囲のｐＨを有する溶出緩衝液によって行われる、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記固相への前記試料の適用がｐＨ約８．５未満のｐＨ値で起こる、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記の本質的に水性である混合物中に、前記水性混合物との前記接触より前の前記固相の表面の環境中に、前記固相の表面から前記一本鎖ＲＮＡを溶出するための緩衝液中に、並びに／又は前記試料を前記固相に適用するステップ及び／若しくは前記固相の表面から前記一本鎖ＲＮＡを溶出するステップの間に使用される別個の緩衝液中に、キレート剤が存在する、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、リン酸、又はエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリス（２－アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）及びそれらの混合物からなる群より独立して選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記一本鎖ＲＮＡが１，０００塩基～２５，０００塩基の範囲のサイズを有する、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 一本鎖ＲＮＡ精製のための、その表面上に主に第一級アミノ基を含む又は第一級アミノ基のみを含む固相の使用。
13. 一本鎖ＲＮＡを、ｐＨを上昇させることによって二本鎖ＲＮＡから精製する、請求項１２に記載の使用。
    

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