JP3068489B2 - 人工的に創製したアフィニティーによるクロマトグラフィー媒体中での溶質の選択的認識 - Google Patents

人工的に創製したアフィニティーによるクロマトグラフィー媒体中での溶質の選択的認識

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アフィニティー・
クロマトグラフィーの分野に属し、そして特に、特定の
吸着選択性を付与するためのクロマトグラフィー支持体
を調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】化学及
びバイオテクノロジーにおける臨床的及び実験的手順
は、しばしば、液体溶液中の類似の種の混合物から個々
の種を分離することに、しばしば頼っている。特に高性
能のモードにおいて、さまざまに異なるタイプのクロマ
トグラフィーが、これらの分離を成し遂げるために有効
かつ有用な方法である。しかしながら、これらの技術が
高いレベルまで開発されてきたにも拘らず、それらは、
特定のタイプの相互作用に限定されたままであり又は移
動速度における相異に基づいて種が分離されることがで
きるところの程度又は範囲により限定されたままであ
る。普遍的な分離媒体が、非限定の寄せ集めから他の全
ての排除までいずれかの１の選択された種を単離するた
めに、改作され、処理され、形成され、又は他の本発明
であつらえられることができるような方法は全く知られ
ていない。
【０００３】Mosbachと共同研究者らは、米国特許第
５，１１０，８３３号及び第５，４６１，１７５号によ
り例示されるように、“印刷分子 (print molecules)”
の周りでモノマーを重合させることによりポリマーを調
製する方法である、彼らが“分子刻印 (molecular impr
inting) ”と呼ぶものを、開発した。一旦、重合が完了
すると、その印刷分子は除去され、そのポリマー中にそ
の印刷分子の刻印を残す。次に、その刻印されたポリマ
ーは、その後に適用される同一の印刷分子、又は類似の
認識パラメーターをもつ他の分子又は分子の組合せを選
択的に吸着するための鋳型として役立つ。 Mosbach他
は、これらの刻印されたポリマーが、酵素、抗体又はク
ロマトグラフィー媒体と同一の機能を発揮することがで
きるということをクレームしている。
【０００４】上記モノマーは、 Mosbach他により、機能
性モノマーとして特徴付けられている。なぜなら、それ
らは、電荷をもった又はその他官能化された原子又は基
を担持しているからである。それ故、得られたポリマー
は、類似の電荷をもち又は官能化されている。使用のた
めに選択された印刷分子も、上記機能性モノマーを補完
するようなやり方で電荷をもたされ又は官能化される。
この結果は、上記ポリマーと上記印刷分子の複合体形成
である。これ故、前段落中に言及した鋳型保持効果は、
上記印刷分子と個々のモノマー又はそれらのリガンド残
基の間のこれより小さな規模の分子タイプの複合体形成
により達成され、そして実際にはそれに対して２次的な
ものである。
【０００５】Mosbach他の研究は、上記印刷分子により
残された分子刻印は、これらの分子がその刻印部位内で
の上記リガンド（単数又は複数）とのより小規模の複合
体形成により、これらの分子が位置内に引かれた後にそ
のゲルをその後に通過するような分子をさらに保持する
ことを助けるためにのみ役立つことを示唆する。この研
究からのさらなる示唆は、分子刻印を担持するポリマー
を達成するために、ある者は、まず、その印刷分子とそ
のモノマーとの間に複合体を形成しなければならないと
いうことである。両示唆は、“分子刻印”の適用を限定
する傾向をもつ。なぜなら、最近、不活性でないポリマ
ー、そして同様に、不活性でない印刷分子、すなわち、
重合前及びポリマー自体の中での両方において複合体を
形成するモノマー及び印刷分子が、知られているからで
ある。
【０００６】機能性モノマーの使用の他の欠点は、その
機能性モノマーの全てではないがほとんどが、そのポリ
マー・ゲル中にランダムに分布し、そしてそれらの官能
部位のかなりの割合が、その印刷分子との複合体がその
ゲルを形成するための重合の間に存在する位置以外の位
置にあるであろうということである。これらの追加の官
能部位のために、そのゲルは、特に巨大分子、例えば、
１以上の方法でそのゲルへのその分子の付着を許容する
多くの吸着部位をもつタンパク質について、ひじょうに
僅かな特異性を示すであろう。これは、非特異的吸着を
導き、そしてその機能性モノマー上の電荷は、これ故、
そのポリマー・ゲルがイオン交換体として振る舞うこと
を引き起こすであろう。この理由のために、機能性モノ
マーに基づくポリマー・ゲルのいずれも、タンパク質に
ついて高特異的であることは示されていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】今般、分子の高程度選択
性吸着が、非官能化ポリマー、すなわち、その吸着分子
と複合体を形成しないモノマーから作られたポリマーに
おいて達成されることができることが発見された。従っ
て、事前に選択された分子種について選択性をもつ水不
溶性ポリマー・マトリックスの形態におけるアフィニテ
ィー・クロマトグラフィー媒体が、その分子種の存在中
でそのモノマーを重合させ、次に得られた不溶性ポリマ
ー・マトリックスからそれらの種を抽出することによ
り、それらの分子種に対して化学的及び物理的に不活性
である非イオン性モノマーから形成される。このよう
に、このポリマーは、(Mosbach他の“印刷分子”に対応
する）分子種とモノマーとの間の事前の複合体形成いず
れの実質的な程度を伴わずに形成される。同様に、これ
故、このように形成されたポリマーの使用の間に、その
ポリマー中のその吸着分子種と個々のサブユニットとの
間のいずれの静電相互作用又は他の形態の複合体形成を
実質的に欠いている。本発明の利点は、吸着剤ゲルであ
って、サイズから独立した実質的に全ての分子種に対し
て選択的であり、イオン性又は非イオン性である種、官
能基を担持するものと官能基を欠くものを含む特徴的な
３次元分子形状をもつものが調製されることができると
いうことである。本発明のさらなる特徴及び利点は、以
下の説明から明らかになるであろう。
【０００８】本発明における使用のためのゲルは、いず
れかの慣用材料、特に、電気泳動又はクロマトグラフィ
ー・ゲルの形成において有用であることが知られている
もの、又はこのような材料の化学的アナログから形成さ
れることができる。但し、これらの材料は、それらの生
来の形態において又はイオン化により、電荷をもつ基を
含むことはない。従って、アミン基又はカルボン酸基を
含むゲルは除外される。一方、エステル化された酸基、
アミド基、ヒドロキシル基及び他の非イオン性基を含む
ゲルは、本発明の範囲内に在る。ゲル形成性材料の例
は、アクリルアミド、アガロース、メタクリレート、デ
ンプン、及びさまざまな置換アクリルアミド、アクリレ
ート及びメタクリレートのいずれかである。但し、これ
らの置換基は、非イオン性である。置換基の例は、ヒド
ロキシル基及びアルキル基である。置換されたアクリル
アミドの特定の例は、Ｎ−メチルオール・アクリルアミ
ドである。置換されたメタクリレートの特定の例は、メ
チル・メタクリレート及び２−ヒドロキシエチル・メタ
クリレートである。このゲル形成性材料は、モノマー、
例えば、アクリルアミド、メタクリレート又は置換メタ
クリレート、又は非架橋ポリマー、例えば、ゲルを形成
するために架橋されることができるアガロースであるこ
とができる。これらのゲル形成性材料の組合せも使用さ
れることができる。例は、アクリルアミド又は置換アク
リルアミドと組合されたアガロース、メタクリレート又
は置換メタクリレートと組合されたアガロース、並びに
アクリルアミド−メタクリレート組合せである。
【０００９】それに対しそのゲルが特異的吸着性を示す
であろう非反応性種を包含することとは別に、そのゲル
混合物は、常法により配合され、そして反応に供され
る。架橋剤及び重合又は架橋触媒も、所望の密度、多孔
度及びコンシステンシーのゲルを達成するために適宜包
含されることができる。例えば、ポリアクリルアミド・
ゲルは、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、ピペ
ラジンジアクリルアミド、エチレン・ジアクリレート、
ジアリル酒石酸ジアミド( diallyltartardiamide）、又
はＮ，Ｎ′−ビスアクリルイル−シスタミンと架橋され
ることができる。アガロース・ゲルは、ジビニル・スル
ホン又はビス−エポキシドと架橋されることができる。
ポリアクリルアミドを形成するための重合開始剤（触
媒）の例は、（組合せにおける）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−
テトラメチル−エチレンジアミンと過硫酸アンモニウ
ム、リボフラビン、及びβ−ジメチルアミノプロピオニ
トリルである。
【００１０】そのゲル濃度、すなわち、そのゲル形成性
溶液中、存在する場合、架橋剤を含む、モノマー又はプ
レポリマーの濃度は、広く変化することができる。但
し、その得られたゲルは、その中でそのゲルが使用され
るであろうクロマトグラフィー媒体の特定の形態のため
に十分な構造的完全性をもつ。上記ゲルは、それがその
分離カラムの全体を満たす場合、細孔性又はマクロ孔性
(macroporous) であることができ、又はそれがそのカラ
ム内への挿入の前にそのカラムの外側に形成され、そし
て粒状化されることができる場合、そのゲルは、細孔
性、マクロ孔性又は非孔性(nonporous) であることがで
きる。そのゲル濃度は、特にアクリルアミド・ゲルを用
いる場合、便利には、モノマー又はプレポリマー及び架
橋剤の重量（グラム）を、その溶液の容量（ミリリッタ
ー）で割って１００を掛けたものとして表される。この
結果は、記号“Ｔ”((重量／容量）パーセント）で表さ
れる。本発明の好ましい態様においては、Ｔは、約１％
〜約６０％のレンジにある。より好ましいものは、Ｔが
約２％〜約３０％のレンジ内のものであり、そして最も
好ましいものは、Ｔが約３％〜約１０％のレンジ内のも
のである。架橋剤が存在するとき、その架橋剤濃度は、
便利には、架橋剤の重量を、モノマー又はプレポリマー
と架橋剤の合計重量で割り１００を掛けたものとして表
される。この結果は、記号“Ｃ”((重量／重量）パーセ
ント）で表される。本発明の好ましい態様においては、
Ｃは約０．２％〜約６０％のレンジにある。低架橋剤量
を用いる本発明の態様においては、Ｃの特に好ましいレ
ンジは、約１％〜約１０％である。高架橋剤量を用いる
態様においては、Ｃの特に好ましいレンジは、約３０％
〜約５５％である。
【００１１】本発明に従って上記ゲルにその特徴的な認
識能力を与える種は、区別され得る３次元形状をもち、
そしてゲル形成のために必要な条件下でそのゲル形成溶
液中のいずれかの成分と反応せず又は複合体を形成せ
ず、又は最大でもほんの僅かにそれと反応し又は複合体
を形成するであろう、いずれかの物質であることができ
る。これらの種は、イオン性又は非イオン性のいずれが
あることができる。本発明を適用することができる種
は、１００ダルトン未満の分子量をもつ小さな分子か
ら、ウィルス及びバクテリアのような体までのレンジに
ある。現在のところ好ましい種は、少なくとも約１０
０、そして好ましくは、約１００〜約１，０００，００
０の分子量をもつ単一分子種である。核酸及び炭水化物
を含む有機化合物が特に重要であり、そして生物学的分
子、特にタンパク質が、最も重要である。好ましいタン
パク質は、約３，０００〜約３００，０００のレンジ内
の分子量をもつもの、そして特に好ましいものは、約１
０，０００〜約１００，０００のレンジ内の分子量をも
つものである。使用されることができるタンパク質のタ
イプの例は、酵素、免疫グロブリン及び他のグロブリ
ン、保存タンパク質、輸送タンパク質、収縮性タンパク
質、ホルモン、球状及び繊維状タンパク質、並びに単純
タンパク質及び抱合タンパク質である。
【００１２】そのゲル形成の間にそのゲル形成性溶液中
に存在する選択性規定性種の量は、臨界的ではなく、そ
してかなり変化することができる。しかしながら、高濃
度又は低濃度間の選定は、その得られたゲルの吸着能力
に影響を及ぼすことができる。典型的な適用において
は、その選択性規定性種対そのゲル形成性材料（すなわ
ち、上記モノマー又はプレポリマー、プラス存在する場
合には、架橋剤）の重量比は、約０．００３：１〜約
５：１、好ましくは、約０．０３：１〜約０．５：１の
レンジにあるであろう。
【００１３】ゲル形成後に、その選択性規定性種が、そ
の無傷のゲルの化学的組成及び構造並びにその３次元立
体形状を残すようなやり方で、除去される。多くの場
合、これは、バッファー溶液でそのゲルを単に洗浄する
ことにより達成されることができる。そのゲルとその吸
着された種との間の吸着アフィニティーが特に強い場合
には、高イオン強度をもつバッファーが、洗浄溶液とし
てより有効に働くであろう。強く吸着されたタンパク質
である種については、変性剤を含ませることができる。
例は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウリル・サルコ
シン、デオキシコレート、及びウレアである。同一の脱
着剤を、液体サンプルからの上記種の吸着の後に、定量
目的のためにその吸着した種を除去し又は反復使用のた
めにそのゲルを再生させるために、使用することができ
る。
【００１４】脱着は、上記種を分解する酵素によっても
達成されることができる。これは、より強く吸着される
ような分子に有用である。これが有用であることができ
るであろうゲルの１のタイプは、その中でそのゲル形成
性成分の中の１の上記選択性規定性種と限定された程度
に反応するようなゲルである。例えば、ジビニル・スル
ホンは、架橋剤として使用されるとき、ヘモグロビン分
子内のアミノ基と反応するであろう。その時、後者は、
選択性規定性種として使用される。この反応は、いくつ
かのヘモグロビン分子がそのゲル床に共有結合されるよ
うになり、そしてそれ故に単なる洗浄により除去される
ことができないようになることをもたらすであろう。こ
の効果は、ほんの小さなものである。なぜならそのヘモ
グロビンのほとんどは、このやり方では反応しないであ
ろうし、そしてそのゲルは、適当な数の認識部位を伴っ
て残されるであろうからである。にも拘らず、少量の共
有結合ヘモグロビンは、酵素反応により除去されること
ができる。
【００１５】本発明の適用は、広く変化する。このよう
に調製されたゲルは、一般に、同定又は定量目的のため
に、又はそれらの種の精製又は濃縮された溶液を得るた
めに、生物学的混合物から又は化学的混合物から１の又
はいくつかの種の簡単な単離のために使用されることが
できる。これらのゲルは、液体溶液から１以上の特定の
種を除去するために使用されることもできる。バイオセ
ンサーを含む他の使用は、当業者に直ちに明らかなもの
となるであろう。本発明は、上記印刷分子としての単一
分子種の使用に限定されるものでないことに留意すべき
である。本発明の範囲内にあるゲルは、２以上の別個の
分子種の周囲に形成されることができ、その得られたゲ
ルは、これらの種の全てに対して選択性を示す。
【００１６】以下の実施例は、説明のために提供され、
そしていかなる方法によるかを問わず、本発明を規定し
又は限定することを意図されるものではない。
【００１７】
【実施例】
実施例１ 本実施例は、シトクロームＣについての特異的アフィニ
ティーをもつポリアクリルアミド・ゲルの調製並びに２
つの他のタンパク質、ミオグロビン及びリボヌクレアー
ゼに対するシトクロームＣの選択的吸着性におけるその
有効性について説明する。シトクロームＣ（１０mg）
を、１mLの脱イオン水に溶解し、そしてアクリルアミド
（５７mg）、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド
（３mg）及び１０μＬの１０％（重量／容量、すなわ
ち、１０mg溶質／１００μＬ溶液）水性過硫酸アンモニ
ウム溶液を添加した。従ってこの溶液は、６％の全モノ
マー濃度（Ｔ）及び５％の架橋剤濃度（Ｃ）をもってい
た。この溶液を１分間脱気し、そして１０μＬの５％
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン
（ＴＥＭＥＤ）を添加した。重合を、一夜進行せしめ
た。
【００１８】得られたゲルを１００−メッシュのネット
に通し、そしてそのくびれにガラス・ウール・サポート
を装備したパスツール・ピペット（内径５mm；カラム内
ゲル長４．０cm）内に充填した。次に、このゲル充填カ
ラムを、１０％（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウム
を含む、酢酸の１０％（容量／容量）溶液で一夜洗浄し
た。次にこのカラムを、その溶出を準備するために１０
mLの０．０１Ｍリン酸ナトリウム（pH６．２）で平衡に
した。第２カラムを、シトクロームＣを含まずに、第１
カラムと同じやり方で調製した。
【００１９】ウマのミオグロビン（１．０mg／mL）、リ
ボヌクレアーゼＡ（４mg／mL）及びシトクロームＣ
（１．０mg／mL）から成る出発タンパク質混合物を、テ
スト混合物として使用した。両カラムを平衡にした後、
約５０μＬの上記テスト混合物を、各々のカラムに適用
した。次に、非吸着タンパク質を、それらのカラムを平
衡にするために使用したものと同一のバッファーを用い
て溶出した。これらのカラムから溶出された非吸着タン
パク質を、１−mL画分に集めた。非吸着タンパク質を、
０．０１リン酸ナトリウム（pH６．２）で平衡とされて
いたBio-Rad CBS HPLCカラム（内径７．９mm×長さ２
０．３mm、 Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califor
nia, USAから入手）を使用した。高性能カチオン交換ク
ロマトグラフィーにより分析した。各分析のために、約
７５μＬの、非吸着タンパク質の１−mL画分をそのカラ
ムに適用した。同一の分析を、いずれのカラムへの適用
の前にそのテスト混合物自体についても行った。これら
のクロマトグラムを、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの５
−mLの塩化ナトリウム・グラジエントを用いて顕出し
た。検出を２２０nmにおいて行った。
【００２０】このクロマトグラムのトレースを図１ａ，
１ｂ及び１ｃに示す。図１ａは、テスト混合物を表し；
図１ｂは、シトクロームＣの使用によらず調製されたゲ
ルからの非吸着タンパク質画分を表し；そして図１ｃ
は、シトクロームＣの使用により調製したゲルからの非
吸着タンパク質画分を表す。上記タンパク質のピーク
は、ミオグロビン(myoglobin) について“Ｍ”、リボヌ
クレアーゼ (ribonuclease) について“Ｒ”、そしてシ
トクロームＣについて“Ｃ”で標識してある。図１ａと
図１ｂとの比較は、これらの２つのクロマトグラムが同
一であり、シトクロームＣの使用によらず調製されたゲ
ルがそのテスト混合物中の３つのタンパク質のいずれを
も吸着しないことを示している。図１ａと図１ｃとの比
較は、シトクロームＣのピークが図１ｃにおいてほとん
ど完全に消失していることを示し、シトクロームＣの使
用により調製したゲルがシトクロームＣを選択的に吸着
したことを示している。
【００２１】実施例２ 本実施例は、ヘモグロビンとミオグロビンについて特定
のアフィニティーをもつポリアクリルアミド・ゲルの調
製、並びにシトクロームＣ及びリボヌクレアーゼに対す
るこれらの２つのタンパク質の選択的吸着におけるその
ゲルの効果について説明している。実施例１の手順を繰
り返して（ＴとＣの同一の値をもつポリアクリルアミド
・ゲルを作り出した）。但し、１０mgのヘモグロビン
を、それからそのゲルが形成されるところのモノマー混
合物中１０mgのシトクロームＣと置換し、そしてそのテ
スト混合物は、他の３つのタンパク質に加えてヘモグロ
ビン（１５mg／mL）を含んでいた。（そのカラムを通過
する前）テスト混合物と（そのテスト混合物の適用及び
溶出後にそのカラムから流出する）非吸着タンパク質画
分の両方を、ＣＢ−Ｓ ＨＰＬＣカラム上で分析した。
上記結果を、図２ａ（テスト混合物）と図２ｂ（非吸着
タンパク質画分）のクロマトグラムのトレース中に示
す。ここで、上記タンパク質ピークは、ミオグロビンに
ついて“Ｍ”、ヘモグロビンについて“Ｈｂ”、リボヌ
クレアーゼについて“Ｒ”、そしてシトクロームＣにつ
いて“Ｃ”で標識してある。非吸着タンパク質画分中の
ミオグロビン・ピークとヘモグロビン・ピークの両方の
非存在は、そのゲルがミオグロビンとヘモグロビンの両
方を選択的に吸着したことを示している。ミオグロビン
の吸着は、ヘモグロビンが、ミオグロビンの構造と類似
の構造をもつ４つのサブユニットから成るという事実に
因る。
【００２２】実施例３ 本実施例は、それに対しそれらのタンパク質が特異的に
吸着するポリアクリルアミド・ゲルからのタンパク質の
脱着のために必要な条件について調べるための実験を報
告する。カラムは、実施例１と２中に記載したように調
製した。１は、（実施例１に従って）シトクロームＣに
ついての特異的アフィニティーをもつものであり、そし
て１は、（実施例２に従って）ヘモグロビンについて特
異的なアフィニティーをもつものである。６mLの、０．
０１Ｍリン酸ナトリウム（pH６．２）により各カラムを
平衡にした後、シトクロームＣ（１００μＬの、５mg／
mL溶液）を上記シトクロームＣ−特異的カラムに適用
し、そしてヘモグロビンとミオグロビン（個々の実験に
おいて、各１００μＬの５mg／mL溶液）を、上記ヘモグ
ロビン−特異的カラムに適用した。各カラムからのタン
パク質の溶出を、以下の３つの溶液の各々の６mLアリコ
ートにより試みた： （ａ）０．０１Ｍリン酸ナトリウム（pH６．２）（上記
平衡バッファー）； （ｂ）さらに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム（pH６．２）；及び （ｃ）１０％（重量／容量）のドデシル硫酸ナトリウム
を含む酢酸の１０容量パーセント溶液。
【００２３】０．５mLの溶出画分を、ＣＢ−Ｓ ＨＰＬ
Ｃカラムを使用して各テストから集め、そして分析し
た。シトクロームＣ、ヘモグロビンとミオグロビンのい
ずれも、上記平衡バッファー単独を用いてそれらの対応
カラムから溶出した。シトクロームＣは、溶液（ｂ）
（上記平衡バッファー、プラス０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム）を用いて上記シトクロームＣ−特異的カラムから溶
出されたが、溶液（ｂ）は、上記ヘモグロビン−特異的
カラムからヘモグロビン又はミオグロビンのいずれの溶
出ももたらさなかった。３つのタンパク質、シトクロー
ムＣ、ヘモグロビンとミオグロビンの全てが、溶液
（ｃ）によりそれらの対応カラムから溶出された。
【００２４】実施例４ 本実施例は、ヘモグロビンについて特異的なアフィニテ
ィーをもつアガロース・ゲルの調製、及びトランスフェ
リンに対するヘモグロビンの選択的吸着におけるその効
果を説明する。低融点アガロース(Hispanagar, Spainか
ら得られた“ＥＸＴＲＡ ＬＭ−２”，３００mg）を、
１０mLの水に添加し、そして煮沸により溶解させた。次
にその温度を３７℃に下げ、そして１０mLの１Ｍ炭酸ナ
トリウム（pH１１）を添加した。その溶液を撹拌しなが
ら、水素化ホウ素ナトリウム（５０mg）、ヘモグロビン
（水中約３０mg／mL溶液１mL）、及びジビニル・スルホ
ン（６００μＬ）を添加した。撹拌を１６時間続け、そ
して得られたゲル粒子を、その上清のpHが６に降下する
まで遠心分離により水で洗浄した。約１１ｇのそのゲル
粒子を、ＨＰＬＣカラム管（内径６mm；ゲル長１．５c
m）内に充填し、７mLの、１０％酢酸中１０％ドデシル
硫酸ナトリウムで洗浄し、そして最後に、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム、pH７．０で平衡にした。同様に、第２
カラム（対照）を、第１カラムと同じやり方であるがヘ
モグロビンを用いずに調製した。
【００２５】出発タンパク質溶液を、５００μＬの、２
０mMトリス・バッファー（トリス（ヒドロキシメチル）
アミノエタン）、pH８．５中に溶解させた２mgのトラン
スフェリンと、２５０μＬのヘモグロビン溶液（水中
１．５重量％のヘモグロビン）とを併合することにより
テスト混合物としての使用のために調製した。各カラム
に３μＬのテスト混合物を適用し、そしてそれらのカラ
ムを、０．０５mL／分の流速において０．０５Ｍリン酸
ナトリウム（pH７．０）で溶離した。これらの溶出タン
パク質を、２２０nmにおける検出を用いて、先の実施例
において使用したＣＢ−Ｓ ＨＰＬＣカラムにより集
め、そして分析した。上記結果を、図３ａと図３ｂのク
ロマトグラムのトレース中に示す。ここで、（ヘモグロ
ビンの非存在中で調製された）ブランク・カラムは図３
ａにより表され、そしてヘモグロビン−特異的カラムは
図３ｂにより表される。上記ピークを、“Ｔｆ”（トラ
ンスフェリン）と“Ｈｂ”（ヘモグロビン）として各ト
レースにおいて同定した。上記２トレースの間の比較
は、ヘモグロビン特異的カラムからの溶出が、上記ブラ
ンク・カラムからの溶出のヘモグロビン・ピークよりも
トランスフェリン・ピークに対してかなり小さいヘモグ
ロビン・ピークを示すことを示している。これは、上記
ヘモグロビン−特異的カラムが、トランスフェリンに対
してヘモグロビンを選択的に吸着することを示してい
る。
【００２６】実施例５ 本実施例は、ヘモグロビンについて特異的アフィニティ
ーをもつ２−ヒドロキシエチルメタクリレート／アクリ
ルアミド・ゲルの調製、及びヘモグロビンを選択的に吸
着するその効果について説明している。モノマー溶液
を、０．８５％（重量／容量）ＮａＣｌを含む４９５．
８μＬの、１０mMリン酸ナトリウム（pH６．２）中に
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（１２．０mg）
と２−ヒドロキシエチルメタクリレート（４．２μＬ）
を溶解することにより調製した。アクリルアミド（１
３．５mg）と過硫酸アンモニウム（５μＬの、水中１０
％（重量／容量）溶液）を、その後、ヘモグロビン（４
０μＬの、水中１．５重量パーセント溶液）を、添加し
た。得られた混合物を脱気し、次に、５μＬの、Ｎ，
Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンの５％
（容量／容量）溶液を補い、そして重合のために一夜室
温において維持された０．６mL試験管に移した。得られ
たゲルを、その試験管内にガラス棒を挿入することによ
り小さな粒子に粉砕し、次に実施例１におけるようなパ
スツール・ピペット内に上記粒子を充填した。このカラ
ムを、０．８５％（重量／容量）ＮａＣｌを含む１０mM
リン酸ナトリウム・バッファー（pH６．２）、水及び１
０％（容量／容量）酢酸中の１０％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（重量／容量）で洗浄し、そして１０mMリン酸ナト
リウム、pH７．０で平衡にした。従って、このゲルは、
６％の合計モノマー濃度（Ｔ）及び４０％の架橋剤濃度
（Ｃ）において形成されていた。２−ヒドロキシエチル
メタクリレートとアクリルアミドの合計に対する２−ヒ
ドロキシエチルメタクリレート含量は、約２５重量パー
セントであった。上記カラムを、実施例４において使用
したものと同じテスト・タンパク質混合物を用いてテス
トし、そしてこれらの結果は、そのカラムが、トランス
フェリンに対してヘモグロビンを選択的に吸着したこと
を示した。
【００２７】実施例６ 本実施例は、本発明に従って調製したゲル上に吸着され
たタンパク質を脱着するためのプロテイナーゼの使用を
示す。本実施例におけるタンパク質は、リボヌクレアー
ゼ−特異的・ゲル上に吸着されたリボヌクレアーゼであ
る。アクリルアミド（０．０５８２ｇ）、Ｎ，Ｎ′−メ
チレンビスアクリルアミド（０．００１８ｇ）及びリボ
ヌクレアーゼ（０．００３ｇ）を、１mL ０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム、pH７．０中に溶解した。２０μＬの、
過硫酸アンモニウムの１０％（重量／容量）溶液の添加
と脱気の後、２０μＬの５％（容量／容量）ＴＥＭＥＤ
溶液を添加した。この重合を３０分間進行させて、Ｔ＝
６％及びＣ＝３％の組成をもつゲルを作り出した。一旦
形成させると、ゲルを６０−メッシュのネットに透過さ
せてそのゲルを粒状物に粉砕し、そしてそれらのゲルを
４．５cmの高さまでパスツール・ピペット内に充填し
た。次に、これら粒状物を、 Savinase (Novo Nordisk
A/S, Denmarkから得られたプロテイナーゼ）の溶液０．
８mLで洗浄し、そして３mLの、１０mMリン酸ナトリウ
ム、pH７．０で平衡にした。ヘモグロビン（１０mg／m
L）とリボヌクレアーゼ（３mg／mL）のサンプル溶液約
５０μＬを適用した。次にこのカラムを１０mMリン酸ナ
トリウム、pH７．０で洗浄し、そして５００μＬ画分
を、実施例２に記載したようにカチオン交換クロマトグ
ラフィーにより集め、そして分析した。
【００２８】これらの結果を、図４ａ，４ｂと４ｃのク
ロマトグラム・トレースに示す。図４ａは、いずれかの
カラムの通過に先立つサンプル自体のクロマトグラムで
あり（“Ｈｂ”はヘモグロビンを指し、そして“Ｒ”は
ミオグロビンを指す。）；図４ｂは、（リボヌクレアー
ゼの非存在中で調製した）ブランク・カラムから集めた
画分のクロマトグラムであり；そして図４ｃは、リボヌ
クレアーゼの存在中で調製したカラムから集めた画分の
クロマトグラムである。リボヌクレアーゼのピークは、
図４ａと４ｂ中に存在するが、図４ｃ中に存在せず、リ
ボヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼの存在中で調製さ
れたカラムによってのみ特異的に吸着されたことを示し
ている。
【００２９】実施例７ 本実施例は、２つのひじょうに類似したタンパク質の中
の１のみが吸着されることにより、本実施例が高程度の
吸着特異性を示す。ウマ・ミオグロビンに特異的なゲル
を、実施例２に記載されたやり方に類似のやり方で調製
した。但し、ウマ・ミオグロビンを実施例２のヘモグロ
ビンと置換した。分離及び分析を、ウマとクジラのミオ
グロビン、リボヌクレアーゼとシトクロームＣのテスト
混合物を使用して、実施例２におけるように行った。こ
れらの結果を、図５ａ（上記ウマ・ミオグロビン・カラ
ムから集めた画分）及び図５ｂ（ブランク・カラムから
集めた画分）中に示す。これらのクロマトグラム中、
“Ｍ（Ｈ）”は、ウマ・ミオグロビンを指し、“Ｍ
（Ｗ）”は、クジラ・ミオグロビンを指し、“Ｒ”は、
リボヌクレアーゼを指し、そして“Ｃ”は、シトクロー
ムＣを指している。上記２つのクロマトグラムの間の比
較は、上記ウマ・ミオグロビン・カラムがウマ・ミオグ
ロビンについての特異性をもち、そしてクジラ・ミオグ
ロビンを吸着しなかったことを示している。これは、ひ
じょうに高程度の特異性を示す。なぜなら、上記２つの
ミオグロビンのアミノ酸組成が、その１５３アミノ酸の
中のたった２０において、そしてその３次元構造がほん
の僅かに影響されるような方法で相違しているからであ
る。
【００３０】実施例８ 本実施例は、 Mosbach他の教示に従う機能性モノマーの
使用がそのゲルの選択性を減少させることを立証する。
先に説明したように、これは、そのゲル中のポリマー鎖
全体にわたる機能性モノマー残基のランダムな分布、並
びに存在する場合ひじょうに少ない機能性モノマーがそ
の溶質中の補完基に対応する位置を占有するという事実
に因る。それ故、このカラムは、本実施例中に提示され
る実験におけるように、その残基が電荷をもつ場合に、
イオン交換基として作用する。塩は、その静電相互作用
を抑制するために添加されることができるが、特異的な
相互作用は失われ、そして非特異的な疎水性相互作用
が、その塩濃度の増加と共に増加する程度に生じるであ
ろう。
【００３１】アクリルアミド（０．１１４ｇ）、Ｎ，
Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（０．０１２ｇ）、
及びアクリル酸（０．１１４mL）を、４mLの０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム、pH７．０中に溶解した。このpHを、
２Ｍ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した（アクリル酸
の存在は、そのpHを低下させた。）。過硫酸アンモニウ
ムの１０％（重量／容量）溶液４．０μＬの添加後、ヘ
モグロビンの１．５％溶液０．１mLを添加した。脱気
後、ＴＥＭＥＤの５％（容量／容量）溶液４０μＬを添
加して、その重合を開始させ、これを一夜進行せしめ
た。先の実施例におけるように、ブランク対照カラム
を、同じ方法であるがヘモグロビンを存在させずに調製
した。
【００３２】Ｔ＝６％及びＣ＝５％の組成をもったゲル
を、３０−メッシュのネットに通して、粒状物を作り、
これを次にパスツール・ピペット内に充填して５．５cm
の高さをもつカラムを作った。１のカラムを、ヘモグロ
ビンを脱着するために１０％酢酸中１０％ＳＤＳで洗浄
した。しかしながら、このカラムからのＳＤＳの除去は
ひじょうに困難であり、これは、このアクリル酸含有床
の１つの欠点である。それ故、第２カラムを、８０％
（容量／容量）エチレン・グリコールを含む０．０２Ｍ
リン酸ナトリウム・バッファー、pH７．０及び０．５Ｍ
塩化ナトリウムで洗浄した。次にこのカラムを、０．０
１Ｍリン酸ナトリウム、pH６．２、プラス０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌで洗浄し、そしてこれに、１０μＬのタンパク質
サンプル（２mg／mLのトランスフェリン及び１５mg／mL
のヘモグロビン）を適用した。このカラムを、０．５Ｍ
ＨＣｌを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH６．２
バッファーで溶出し、そしてこの溶出物を、先の実施例
におけるように分析した。
【００３３】クロマトグラムを、図６ａ（いずれかのカ
ラムに適用する前のサンプル、ここで、“Ｔｆ”は、ト
ランスフェリンを指し、そして“Ｈｂ”はヘモグロビン
を指す。）、図６ｂ（その溶出のために０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH６．２を
使用したブランク・カラムから集めた画分）及び図６ｃ
（第２カラムから集めた画分）中に提示する。上記３つ
の図の比較は、その刻印されたカラムがヘモグロビンと
トランスフェリンの両方を吸着したことを示す。従っ
て、ヘモグロビンについてのカラムの特異性は、その機
能性モノマーのアクリル酸がそのゲル床内に取り込まれ
たときに完全に失われた。
【００３４】以上、主に説明の目的をもって説明してき
た。本発明の材料、比率、操作条件、手順及び他のパラ
メーターを、本発明の本質及び範囲から逸脱せずにさま
ざまな方法でさらに修正し又は置換することができるこ
とは当業者に直ちに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａは、ゲル・アフィニティー・カラムを通
過する前のタンパク質の混合物を含むテスト・サンプル
のクロマトグラムである。図１ｂは、同一テスト・サン
プルの非吸着タンパク質のクロマトグラムであり、この
画分は上記混合物中のタンパク質の中のいずれか１の存
在中で調製されなかったゲル・アフィニティー・カラム
（すなわち、ブランク・カラム）にそのサンプルを通過
させることにより得られたものである。図１ｃは、同一
テスト・サンプルの異なる非吸着タンパク質画分のクロ
マトグラムであり、この画分は、本発明に従って混合物
中のタンパク質の中の１（ピーク“Ｃ”）の存在中で調
製されたゲル・アフィニティー・カラムに上記サンプル
を通過させることにより得られたものである。
【図２】図２ａは、ゲル・アフィニティー・カラムを通
過する前のタンパク質の混合物を含む他のテスト・サン
プルのクロマトグラムである。図２ｂは、上記混合物中
のタンパク質の中の１（ピーク“Ｈｂ”）の存在中で調
製されたアフィニティー・カラムにサンプルを通過させ
ることにより得られた同一テスト・サンプルの非吸着タ
ンパク質画分のクロマトグラムである。
【図３】図３ａは、サンプル中のタンパク質の中のいず
れかの存在中で調製されなかったゲル・アフィニティー
・カラムに通過された後の、タンパク質のさまざまな組
合せを含む第３のテスト・サンプルのクロマトグラムで
ある。図３ｂは、サンプル中のタンパク質の中の１（ピ
ーク“Ｈｂ”）の存在中で調製されたゲル・アフィニテ
ィー・カラムに通過された後の、同一テスト・サンプル
のクロマトグラムである。
【図４】図４ａは、さらに他のテスト・サンプルのクロ
マトグラムである。図４ｂは、ブランク・カラムにサン
プルを通過させた後に集められた画分のクロマトグラム
である。図４ｃは、サンプル中のタンパク質の中の１
（ピーク“Ｒ”）の存在中で調製されたゲル・アフィニ
ティー・カラムにサンプルを通過させた後に集められた
画分のクロマトグラムである。
【図５】図５ａは、さらに他のテスト・サンプルのクロ
マトグラムであり、そして図５ｂは、サンプル中のタン
パク質の中の１（ピーク“Ｍ（Ｈ）”）の存在中で調製
されたゲル・アフィニティー・カラムに通過させた後に
集められた画分のクロマトグラムである。
【図６】図６ａ，６ｂ及び６ｃは、 Mosbach他の従来技
術の教示を提示する。図６ａは、テスト・サンプルのク
ロマトグラムであり、図６ｂは、ブランク・カラムにサ
ンプルを通過させる間に集められた画分のクロマトグラ
ムであり、そして図６ｃは、 Mosbach他に従って調製さ
れたカラムにサンプルを通過させる間に集められた画分
のクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平６−510474（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−500833（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/48 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 事前に選択された種についての選択的ア
    フィニティーをもつアフィニティー・クロマトグラフィ
    ー媒体であって、その媒体が： （ａ）その事前に選択された種の存在中、重合性物質か
    ら不溶性ポリマー・マトリックスを形成し、その重合性
    物質が非イオン性であり、そしてそれに対してその事前
    に選択された種が不活性であり；そして（ｂ）その不溶
    性ポリマー・マトリックスからその事前に選択された種
    を抽出する、により形成されることを特徴とするアフィ
    ニティー・クロマトグラフィー媒体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その重合性物質が、アク
    リルアミド、アガロース、メタクリレート、置換アクリ
    ルアミド及び置換メタクリレートから成る群から選ばれ
    るメンバーであることを特徴とするアフィニティー・ク
    ロマトグラフィー媒体。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、（ａ）が、１重量％〜６
    ０重量％の重合性物質濃度において水性溶液中で行われ
    ることを特徴とするアフィニティー・クロマトグラフィ
    ー媒体。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、（ａ）が、その重合性物
    質と架橋剤の合計に対して０．２重量％〜６０重量％の
    レンジの量において存在する架橋剤の存在中で行われる
    ことを特徴とするアフィニティー・クロマトグラフィー
    媒体。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その重合性物質がアクリ
    ルアミドであり、そして（ａ）が、さらに、Ｎ，Ｎ′−
    メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルア
    ミド、Ｎ，Ｎ′−ビスアクリルイルシスタミン、及び
    Ｎ，Ｎ′−ジアリル酒石酸ジアミド (N,N′-diallyltar
    tardiamide)から成る群から選ばれたメンバーの存在中
    で、行われることを特徴とするアフィニティー・クロマ
    トグラフィー媒体。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その重合性物質がアガロ
    ースであり、そして（ａ）が、さらに、ジビニル・スル
    ホン及びビス・エポキシドから成る群から選ばれたメン
    バーの存在中で行われることを特徴とするアフィニティ
    ー・クロマトグラフィー媒体。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その重合性物質が、２−
    ヒドロキシエチルメタクリレートとアクリルアミドの混
    合物であり、そして（ａ）が、さらに、Ｎ，Ｎ′−メチ
    レンビスアクリルアミドの存在中で行われることを特徴
    とするアフィニティー・クロマトグラフィー媒体。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その事前に選択された種
    が、タンパク質であるようなアフィニティー・クロマト
    グラフィー媒体。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載のアフィニティー・クロ
    マトグラフィー媒体であって、その事前に選択された種
    が、ウィルス、バクテリア、核酸、又は炭水化物である
    ようなアフィニティー・クロマトグラフィー媒体。
  10. 【請求項１０】 事前に選択された種をその種を含む液
    体から分離する方法であって、請求項１〜９のいずれか
    １項に記載のアフィニティー・クロマトグラフィー媒体
    を含むカラムにその液体を通過させることを含むような
    方法。
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