JPS615100A - 蛋白質の分離および固定用吸着剤 - Google Patents
蛋白質の分離および固定用吸着剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
生化学および生物工学の分野において、高分子並びに「
低分子」の分離用に、また例えば技術的に応用可能な酵
素並びに病気の診断用抗源および抗体の固定用に、さま
ざまな種類の吸着剤が使用されている。本発明はこのカ
テゴリーの吸着剤に属するが、いくつかの特徴的な点で
従来の吸着剤と異なっている。
低分子」の分離用に、また例えば技術的に応用可能な酵
素並びに病気の診断用抗源および抗体の固定用に、さま
ざまな種類の吸着剤が使用されている。本発明はこのカ
テゴリーの吸着剤に属するが、いくつかの特徴的な点で
従来の吸着剤と異なっている。
本発明の物質は1〜1000μm程の直径を有する特に
有用な球状の形をした粒子から成る細かく分割された吸
着剤である。これら粒子は重合体ネットから成り、この
ネットは全体的に粒子に浸透しており、またはその表面
を被覆しており、かつ置換基または架橋結合を含んでお
り、この置換基または架橋結合は、チオエーテルのイオ
ウからエチレン橋を経て分離されたスルホン基を有する
鎖の形の特徴的な原子連続体X−5O□−(1,H2−
CH,−3−Yを有する。さらに、チオエーテルのSの
一方は基Yに結合しており、この基Yはエーテル結合し
ている鎖の一端に位置し、他端には基Xが位置しており
、このXは2つ以上の炭素原子を有し、このようにして
重合体ネットが構成されている。これら基YおよびXは
ネットの別の枝に共に結合することもでき、この場合5
−so□−CHz CHz Sはネット内で2つの
重合体の鎖間に架橋結合を生成する。
有用な球状の形をした粒子から成る細かく分割された吸
着剤である。これら粒子は重合体ネットから成り、この
ネットは全体的に粒子に浸透しており、またはその表面
を被覆しており、かつ置換基または架橋結合を含んでお
り、この置換基または架橋結合は、チオエーテルのイオ
ウからエチレン橋を経て分離されたスルホン基を有する
鎖の形の特徴的な原子連続体X−5O□−(1,H2−
CH,−3−Yを有する。さらに、チオエーテルのSの
一方は基Yに結合しており、この基Yはエーテル結合し
ている鎖の一端に位置し、他端には基Xが位置しており
、このXは2つ以上の炭素原子を有し、このようにして
重合体ネットが構成されている。これら基YおよびXは
ネットの別の枝に共に結合することもでき、この場合5
−so□−CHz CHz Sはネット内で2つの
重合体の鎖間に架橋結合を生成する。
本発明の物質のきわ立った特徴はその吸着性にあり、こ
の特性はいわゆる疎水性吸着剤のそれと同種のものであ
る。例えば、蛋白質の吸着は例えば塩化アルカリ、硫酸
アルカリおよび硫酸マグネシウムのような高濃度の水性
構造有機性塩の存在の下で増加する。しかしながら、明
らかに本発明の吸着剤は、例えば8〜18個の炭素原子
を含むアルキル基を基本的に内在する疎水性吸着剤によ
る場合以外の蛋白質を好ましく吸着する。しかしながら
、予期しないことは、このようにして構造全体を比較的
親水性にする水酸基がYの端部に位置することである。
の特性はいわゆる疎水性吸着剤のそれと同種のものであ
る。例えば、蛋白質の吸着は例えば塩化アルカリ、硫酸
アルカリおよび硫酸マグネシウムのような高濃度の水性
構造有機性塩の存在の下で増加する。しかしながら、明
らかに本発明の吸着剤は、例えば8〜18個の炭素原子
を含むアルキル基を基本的に内在する疎水性吸着剤によ
る場合以外の蛋白質を好ましく吸着する。しかしながら
、予期しないことは、このようにして構造全体を比較的
親水性にする水酸基がYの端部に位置することである。
この結果、 502 CH2CH2S CH2CH
20H基は例えば血清蛋白(これは疎水性アルキル化ゲ
ル上に容易に吸着されない)用の優れた吸着剤を生成す
る。この基の吸着力はXの性質によって弱めることも強
めることもできる。この特徴的な連続状の基が次のよう
に2続になると吸着力が増加する。
20H基は例えば血清蛋白(これは疎水性アルキル化ゲ
ル上に容易に吸着されない)用の優れた吸着剤を生成す
る。この基の吸着力はXの性質によって弱めることも強
めることもできる。この特徴的な連続状の基が次のよう
に2続になると吸着力が増加する。
−SO□−CH2−CH2−5−CH2−CH2−3o
。−CHz−CH2−5−C)12−CHzOHイオン
発生基が導入されると、例えば−8O□−CO□−CH
2−5−CIl□−CH2−C0OHのようになると、
吸着特性は変化する。
。−CHz−CH2−5−C)12−CHzOHイオン
発生基が導入されると、例えば−8O□−CO□−CH
2−5−CIl□−CH2−C0OHのようになると、
吸着特性は変化する。
このような変性吸着剤でも、蛋白質および核酸に対して
クロマトグラフィーを扱う分野において現在使用されて
いる多くの分離用化合物にとって有効な補体である。
クロマトグラフィーを扱う分野において現在使用されて
いる多くの分離用化合物にとって有効な補体である。
すなわち、本発明の吸着剤は、核酸、ヌクレオチド、蛋
白質、血清蛋白およびポリペプチドのような生体高分子
の分別用に用いることができる。
白質、血清蛋白およびポリペプチドのような生体高分子
の分別用に用いることができる。
本発明の基Yの他の例としては、置換芳香族炭化水素お
よび複素環配位子を挙げることができる。これらのいく
つかは下記実施例に述べられている。疎水性の強いMY
、例えばC,、l12.。+(n≧6)は特に有益なも
のである。疎水性相互作用および−SO□−によって強
化されたーS−に基づく吸着性の組合わせ効果は、蛋白
質の固定に利用することができる。
よび複素環配位子を挙げることができる。これらのいく
つかは下記実施例に述べられている。疎水性の強いMY
、例えばC,、l12.。+(n≧6)は特に有益なも
のである。疎水性相互作用および−SO□−によって強
化されたーS−に基づく吸着性の組合わせ効果は、蛋白
質の固定に利用することができる。
本発明の1つの具体例は、中心までずっと浸透可能な蛋
白質用ネットを構成する粒子から成る、ということが上
記事項から明らかである。第2の具体例によれば、粒子
の表層のみが蛋白質に対して浸透可能であり、この場合
、粒子は吸着特性を有する基を含む必要がない。第3の
具体例は不浸透性核を包囲する多少厚い層のネットから
成る。この核は任意に生成することができ、例えば繊維
並びにホース、ビーカーまたは他の容器の内面から成る
ものである。
白質用ネットを構成する粒子から成る、ということが上
記事項から明らかである。第2の具体例によれば、粒子
の表層のみが蛋白質に対して浸透可能であり、この場合
、粒子は吸着特性を有する基を含む必要がない。第3の
具体例は不浸透性核を包囲する多少厚い層のネットから
成る。この核は任意に生成することができ、例えば繊維
並びにホース、ビーカーまたは他の容器の内面から成る
ものである。
高分子を浸透させるために、かつ特徴的な吸収性を適切
に発現させるために、重合体ネットは特有の性質を持っ
ていなければならない。即ち、重合体ネットは親水性で
あり、かつ重合体に対して浸透性がなければならず、ま
た損傷させることなく、蛋白質を吸着するpH範囲内に
おいて、好ましくはp114〜8の範囲内において、し
かし望ましくは広い範囲内において耐性がなければなら
ない。また、重合体ネットの化学的性質は吸着特性にか
かわる基を充分に受入れるものでなければならない。重
合体ネットに関して、本発明はこれらの要件により次の
ような親水性重合体に限定される。即ち、例えばポリビ
ニルアルコール5ポリヒドロキシメタン、多糖類および
架橋ヘキシトールのようなポリアルコール並びに架橋ポ
リアクリルアミドのようなポリアミド。さらに架橋ポリ
アミンおよび多酸も挙げることができるが、この場合、
無機基の存在により吸着がさらに複雑になることが認め
られる。さらにゲルネットは、グリセロール置換基のよ
うな親水基、または次の基CH。
に発現させるために、重合体ネットは特有の性質を持っ
ていなければならない。即ち、重合体ネットは親水性で
あり、かつ重合体に対して浸透性がなければならず、ま
た損傷させることなく、蛋白質を吸着するpH範囲内に
おいて、好ましくはp114〜8の範囲内において、し
かし望ましくは広い範囲内において耐性がなければなら
ない。また、重合体ネットの化学的性質は吸着特性にか
かわる基を充分に受入れるものでなければならない。重
合体ネットに関して、本発明はこれらの要件により次の
ような親水性重合体に限定される。即ち、例えばポリビ
ニルアルコール5ポリヒドロキシメタン、多糖類および
架橋ヘキシトールのようなポリアルコール並びに架橋ポ
リアクリルアミドのようなポリアミド。さらに架橋ポリ
アミンおよび多酸も挙げることができるが、この場合、
無機基の存在により吸着がさらに複雑になることが認め
られる。さらにゲルネットは、グリセロール置換基のよ
うな親水基、または次の基CH。
05tCH2CH2CH2NH−
によって置換されたシリカゲルから成る。
本発明の特に有用な吸着剤は架橋寒天である。吸収特性
基の導入は次のように有利に行なうことができる。まず
、重合体の母材をジビニルスルポンと反応させ、次にこ
のようにして架橋し同時に活性化した生成物を次の化合
物で変換する。メルカプタン、例えばメルカプトエタノ
ール ■覆永売0−CHz−C11z−3Oz−Cllz−C
flz−3−CHz−Cll□−OH:またはシスティ
ン: またはチオフェノール: #O−Ctl z −CIl z−5Oz−CHz −
CHz −S−○またはチオ置換複素環式化合物、例え
ば6−チオアプニン: また、上記ジビニルスルホンで活性化した母材はジチオ
ール、例えば次の化合物と反応させることができる。
基の導入は次のように有利に行なうことができる。まず
、重合体の母材をジビニルスルポンと反応させ、次にこ
のようにして架橋し同時に活性化した生成物を次の化合
物で変換する。メルカプタン、例えばメルカプトエタノ
ール ■覆永売0−CHz−C11z−3Oz−Cllz−C
flz−3−CHz−Cll□−OH:またはシスティ
ン: またはチオフェノール: #O−Ctl z −CIl z−5Oz−CHz −
CHz −S−○またはチオ置換複素環式化合物、例え
ば6−チオアプニン: また、上記ジビニルスルホンで活性化した母材はジチオ
ール、例えば次の化合物と反応させることができる。
■−0−CH2−CHz−5(lz−CH=CHz±H
3−CIl□−CIl2−3H→■−0−CH2−CH
2−3O□−CHz−CHz−3−CHz−C112−
3ll後者の生成物はさらにジビニルスルホン(DVS
)と反応して、次の新しい架橋生成物を得る。
3−CIl□−CIl2−3H→■−0−CH2−CH
2−3O□−CHz−CHz−3−CHz−C112−
3ll後者の生成物はさらにジビニルスルホン(DVS
)と反応して、次の新しい架橋生成物を得る。
■−〇−Cll Z−C)I z−3Oz−C)12−
CI(z−3−CH2−C)l Z−3−C)l z−
CYIz−5O2−C)+ 2−C112■ また、2度活性化した母材をメルカプトエタノールと反
応させて次の生成物を得ることもできる。
CI(z−3−CH2−C)l Z−3−C)l z−
CYIz−5O2−C)+ 2−C112■ また、2度活性化した母材をメルカプトエタノールと反
応させて次の生成物を得ることもできる。
■−C1h−CIl□−5Oz−C1lz−CHz−5
−CHz−C1h−5−CHz−CHz−CHz−3o
□C1+□ 鳥 It O−C11□−C112−3 置換重合体ネットの上記のすべての変更例は、本発明の
すべての吸着剤を生成する。
−CHz−C1h−5−CHz−CHz−CHz−3o
□C1+□ 鳥 It O−C11□−C112−3 置換重合体ネットの上記のすべての変更例は、本発明の
すべての吸着剤を生成する。
去犯側士
ブフナ炉斗内で粒状アガロースゲルを脱イオン水で洗浄
した。中間溶液からゲルを吸引し、1gのゲルを秤量し
て丸底フラスコ内の0.5mAのNazCO3溶液中に
QQ5した。0.1mAのジビニルスルボンを加え、得
られた混合物を攪拌しながら室温で一晩反応させた。
した。中間溶液からゲルを吸引し、1gのゲルを秤量し
て丸底フラスコ内の0.5mAのNazCO3溶液中に
QQ5した。0.1mAのジビニルスルボンを加え、得
られた混合物を攪拌しながら室温で一晩反応させた。
このようにして得られた活性化ゲルをプフナ炉斗に移し
て、脱イオン水で洗浄した。
て、脱イオン水で洗浄した。
1mAの0.1モルNaHCO:+溶液および0.1m
Aのメルカプトエタノールを加えながら、上記活性化ゲ
ルを反応容器に投入した。15時間接触させた後、ゲル
をブフナ炉斗に移し、脱イオン水で洗浄した。
Aのメルカプトエタノールを加えながら、上記活性化ゲ
ルを反応容器に投入した。15時間接触させた後、ゲル
をブフナ炉斗に移し、脱イオン水で洗浄した。
蛋白質吸着能についてゲルを試験した。0.5モルのに
2S04を含むpl+7.6の0.1モルトリス−HC
j!緩衝液中においてゲルをクロマトグラフの床に充填
した。
2S04を含むpl+7.6の0.1モルトリス−HC
j!緩衝液中においてゲルをクロマトグラフの床に充填
した。
各分量の人間の血清をゲル床において種々のクロマトグ
ラフィーの実験に分けた。90吸収単位(280nm)
を床に導入すると、3s、ii位が吸着され、その後硫
酸カリウムを含まない緩衝液で床を洗浄することにより
、そのうちの26単位が脱着された。残部は30%のイ
ソプロパツールを含む緩衝液により脱着された。
ラフィーの実験に分けた。90吸収単位(280nm)
を床に導入すると、3s、ii位が吸着され、その後硫
酸カリウムを含まない緩衝液で床を洗浄することにより
、そのうちの26単位が脱着された。残部は30%のイ
ソプロパツールを含む緩衝液により脱着された。
次の実験では、1300の吸収単位の透析した人間の血
清を供給した。280単位が吸着され、そのうちの24
0単位が硫酸塩を含まない緩衝液で洗浄した時に脱着さ
れた。
清を供給した。280単位が吸着され、そのうちの24
0単位が硫酸塩を含まない緩衝液で洗浄した時に脱着さ
れた。
従って、それぞれ39%および23%の血清蛋白が吸着
されたわけである。ゲルの電気泳動分析によれば、免疫
グロブリンが吸着材の主成分であり、また血清アルブミ
ンは、メルカプトエタノールと結合したジビニルスルホ
ンで活性化した寒天ゲルに全く吸着されず、またはほん
のわずがだけ吸着されたことがわかった。
されたわけである。ゲルの電気泳動分析によれば、免疫
グロブリンが吸着材の主成分であり、また血清アルブミ
ンは、メルカプトエタノールと結合したジビニルスルホ
ンで活性化した寒天ゲルに全く吸着されず、またはほん
のわずがだけ吸着されたことがわかった。
実施例2
アガロース粒子の代りにセルロース粉末を使用し、かつ
ビニルスルホンの含有量を活性化に基づいて20%引上
げたことを除いて、実施例1と同様にして効力検定を行
った。
ビニルスルホンの含有量を活性化に基づいて20%引上
げたことを除いて、実施例1と同様にして効力検定を行
った。
吸着試験の結果によれば、血清蛋白の吸着能力は対応す
る量のアガロースゲルの約30%であった。
る量のアガロースゲルの約30%であった。
天施貫盈
エピクロロヒドリンで処理したポリアクリルアミド(市
販のニーパーガイド(Eupergite)C1を用い
て、効力検定を行った。pH9の0.1モルのNaHC
O+中においてNa5Hで1晩処理することにより、オ
キシランゲルをSHに変換し、その後実施例1における
寒天ゲルのように処理した。
販のニーパーガイド(Eupergite)C1を用い
て、効力検定を行った。pH9の0.1モルのNaHC
O+中においてNa5Hで1晩処理することにより、オ
キシランゲルをSHに変換し、その後実施例1における
寒天ゲルのように処理した。
ポリアクリルアミド誘導体の吸着能力は、ゲル床の1ミ
リリットル当りアガロ1−ス誘導体の約半分であったの ス11丸先 メルカプトエタノールの代りにエタノールアミンを用い
たことを除いて、実施例1と同じ方法で効力検定を行っ
た。吸着試験の結果によれば、ごく少量の血清蛋白が吸
着されたにすぎず、かつ蛋白質は硫酸塩を含まない緩衝
液中でも緩衝液中に含まれるイソプロパツールによって
も脱着されなかった。
リリットル当りアガロ1−ス誘導体の約半分であったの ス11丸先 メルカプトエタノールの代りにエタノールアミンを用い
たことを除いて、実施例1と同じ方法で効力検定を行っ
た。吸着試験の結果によれば、ごく少量の血清蛋白が吸
着されたにすぎず、かつ蛋白質は硫酸塩を含まない緩衝
液中でも緩衝液中に含まれるイソプロパツールによって
も脱着されなかった。
尖施開】
0、1mβのメルカプトエタノールの代りにo、imx
のグリシンを用いたことを除いて、実施例1と同じ操作
を繰返した。1つの血清試験からのすべての蛋白質が実
施例1と同様に生成されたゲル床を通過した。
のグリシンを用いたことを除いて、実施例1と同じ操作
を繰返した。1つの血清試験からのすべての蛋白質が実
施例1と同様に生成されたゲル床を通過した。
実施例6
メルカプトエタノールの代りに2.3−ジメルカプトエ
タノールを用いたことを除いて、実施例1と同じ方法で
効力検定を行った。吸着試験の結果によれば、100吸
着単位の血清蛋白をカラムに導入すると、32単位が吸
着され、そのうちの15単位がX2SO4を除去した緩
衝液により溶出された。
タノールを用いたことを除いて、実施例1と同じ方法で
効力検定を行った。吸着試験の結果によれば、100吸
着単位の血清蛋白をカラムに導入すると、32単位が吸
着され、そのうちの15単位がX2SO4を除去した緩
衝液により溶出された。
Claims (7)
- (1)親水性分子重合体ネットにより全体的に、または
部分的に浸透または表面被覆されている固相を有する分
離および固定用吸着剤において、下記構造式で表わされ
る連続鎖を有する置換基または架橋結合が上記重合体ネ
ットに結合されていることを特徴とする吸着剤。 Y−S−CH_2−SO_2−CH_2−CH_2−X
−(式中、Yは未置換の、またはアルキル基、アシル基
、ヒドロキシル基またはアミノ基で置換された、少なく
とも1つの窒素原子を有する複素芳香族環、またはニト
ロ基を有するフェニル基の形のπ電子系であり、Xはエ
ーテルの酸素、チオエーテルのイオウまたは窒素である
。) - (2)固相が1mm以下の直径を有する粒子から成るこ
とを特徴とする特許請求の範囲第(1)項記載の吸着剤
。 - (3)分子重合体ネットが架橋ポリヒドロキシ重合体で
あることを特徴とする特許請求の範囲第(1)項または
第(2)項のいずれかに記載の吸着剤。 - (4)架橋ポリヒドロキシ重合体が多糖類であることを
特徴とする特許請求の範囲第(3)項に記載の吸着剤。 - (5)架橋ポリヒドロキシ重合体が寒天またはアガロー
スであることを特徴とする特許請求の範囲第(3)項記
載の吸着剤。 - (6)分子重合体ネットが架橋ポリアミドであることを
特徴とする特許請求の範囲第(1)項または第(2)項
のいずれかに記載の吸着剤。 - (7)架橋ポリアミドがポリアクリルアミドであること
を特徴とする特許請求の範囲第(6)項記載の吸着剤。
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JPH044018B2 JPH044018B2 (ja) | 1992-01-27 |
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