JPS615100A - 蛋白質の分離および固定用吸着剤 - Google Patents

蛋白質の分離および固定用吸着剤

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JPS615100A JP60105769A JP10576985A JPS615100A JP S615100 A JPS615100 A JP S615100A JP 60105769 A JP60105769 A JP 60105769A JP 10576985 A JP10576985 A JP 10576985A JP S615100 A JPS615100 A JP S615100A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生化学および生物工学の分野において、高分子並びに「
低分子」の分離用に、また例えば技術的に応用可能な酵
素並びに病気の診断用抗源および抗体の固定用に、さま
ざまな種類の吸着剤が使用されている。本発明はこのカ
テゴリーの吸着剤に属するが、いくつかの特徴的な点で
従来の吸着剤と異なっている。
本発明の物質は１〜１０００μｍ程の直径を有する特に
有用な球状の形をした粒子から成る細かく分割された吸
着剤である。これら粒子は重合体ネットから成り、この
ネットは全体的に粒子に浸透しており、またはその表面
を被覆しており、かつ置換基または架橋結合を含んでお
り、この置換基または架橋結合は、チオエーテルのイオ
ウからエチレン橋を経て分離されたスルホン基を有する
鎖の形の特徴的な原子連続体Ｘ−５Ｏ□−（１，Ｈ２−
ＣＨ，−３−Ｙを有する。さらに、チオエーテルのＳの
一方は基Ｙに結合しており、この基Ｙはエーテル結合し
ている鎖の一端に位置し、他端には基Ｘが位置しており
、このＸは２つ以上の炭素原子を有し、このようにして
重合体ネットが構成されている。これら基ＹおよびＸは
ネットの別の枝に共に結合することもでき、この場合５
−ｓｏ□−ＣＨｚ　　ＣＨｚ　　Ｓはネット内で２つの
重合体の鎖間に架橋結合を生成する。
本発明の物質のきわ立った特徴はその吸着性にあり、こ
の特性はいわゆる疎水性吸着剤のそれと同種のものであ
る。例えば、蛋白質の吸着は例えば塩化アルカリ、硫酸
アルカリおよび硫酸マグネシウムのような高濃度の水性
構造有機性塩の存在の下で増加する。しかしながら、明
らかに本発明の吸着剤は、例えば８〜１８個の炭素原子
を含むアルキル基を基本的に内在する疎水性吸着剤によ
る場合以外の蛋白質を好ましく吸着する。しかしながら
、予期しないことは、このようにして構造全体を比較的
親水性にする水酸基がＹの端部に位置することである。
この結果、　５０２　　ＣＨ２ＣＨ２Ｓ　　ＣＨ２ＣＨ
２０Ｈ基は例えば血清蛋白（これは疎水性アルキル化ゲ
ル上に容易に吸着されない）用の優れた吸着剤を生成す
る。この基の吸着力はＸの性質によって弱めることも強
めることもできる。この特徴的な連続状の基が次のよう
に２続になると吸着力が増加する。
−ＳＯ□−ＣＨ２−ＣＨ２−５−ＣＨ２−ＣＨ２−３ｏ
。−ＣＨｚ−ＣＨ２−５−Ｃ）１２−ＣＨｚＯＨイオン
発生基が導入されると、例えば−８Ｏ□−ＣＯ□−ＣＨ
２−５−ＣＩｌ□−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨのようになると、
吸着特性は変化する。
このような変性吸着剤でも、蛋白質および核酸に対して
クロマトグラフィーを扱う分野において現在使用されて
いる多くの分離用化合物にとって有効な補体である。
すなわち、本発明の吸着剤は、核酸、ヌクレオチド、蛋
白質、血清蛋白およびポリペプチドのような生体高分子
の分別用に用いることができる。
本発明の基Ｙの他の例としては、置換芳香族炭化水素お
よび複素環配位子を挙げることができる。これらのいく
つかは下記実施例に述べられている。疎水性の強いＭＹ
、例えばＣ，、ｌ１２．。＋（ｎ≧６）は特に有益なも
のである。疎水性相互作用および−ＳＯ□−によって強
化されたーＳ−に基づく吸着性の組合わせ効果は、蛋白
質の固定に利用することができる。
本発明の１つの具体例は、中心までずっと浸透可能な蛋
白質用ネットを構成する粒子から成る、ということが上
記事項から明らかである。第２の具体例によれば、粒子
の表層のみが蛋白質に対して浸透可能であり、この場合
、粒子は吸着特性を有する基を含む必要がない。第３の
具体例は不浸透性核を包囲する多少厚い層のネットから
成る。この核は任意に生成することができ、例えば繊維
並びにホース、ビーカーまたは他の容器の内面から成る
ものである。
高分子を浸透させるために、かつ特徴的な吸収性を適切
に発現させるために、重合体ネットは特有の性質を持っ
ていなければならない。即ち、重合体ネットは親水性で
あり、かつ重合体に対して浸透性がなければならず、ま
た損傷させることなく、蛋白質を吸着するｐＨ範囲内に
おいて、好ましくはｐ１１４〜８の範囲内において、し
かし望ましくは広い範囲内において耐性がなければなら
ない。また、重合体ネットの化学的性質は吸着特性にか
かわる基を充分に受入れるものでなければならない。重
合体ネットに関して、本発明はこれらの要件により次の
ような親水性重合体に限定される。即ち、例えばポリビ
ニルアルコール５ポリヒドロキシメタン、多糖類および
架橋ヘキシトールのようなポリアルコール並びに架橋ポ
リアクリルアミドのようなポリアミド。さらに架橋ポリ
アミンおよび多酸も挙げることができるが、この場合、
無機基の存在により吸着がさらに複雑になることが認め
られる。さらにゲルネットは、グリセロール置換基のよ
うな親水基、または次の基ＣＨ。
０５ｔＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ− によって置換されたシリカゲルから成る。
本発明の特に有用な吸着剤は架橋寒天である。吸収特性
基の導入は次のように有利に行なうことができる。まず
、重合体の母材をジビニルスルポンと反応させ、次にこ
のようにして架橋し同時に活性化した生成物を次の化合
物で変換する。メルカプタン、例えばメルカプトエタノ
ール ■覆永売０−ＣＨｚ−Ｃ１１ｚ−３Ｏｚ−Ｃｌｌｚ−Ｃ
ｆｌｚ−３−ＣＨｚ−Ｃｌｌ□−ＯＨ：またはシスティ
ン： またはチオフェノール： ＃Ｏ−Ｃｔｌ　ｚ　−ＣＩｌ　ｚ−５Ｏｚ−ＣＨｚ　−
ＣＨｚ　−Ｓ−○またはチオ置換複素環式化合物、例え
ば６−チオアプニン： また、上記ジビニルスルホンで活性化した母材はジチオ
ール、例えば次の化合物と反応させることができる。
■−０−ＣＨ２−ＣＨｚ−５（ｌｚ−ＣＨ＝ＣＨｚ±Ｈ
３−ＣＩｌ□−ＣＩｌ２−３Ｈ→■−０−ＣＨ２−ＣＨ
２−３Ｏ□−ＣＨｚ−ＣＨｚ−３−ＣＨｚ−Ｃ１１２−
３ｌｌ後者の生成物はさらにジビニルスルホン（ＤＶＳ
）と反応して、次の新しい架橋生成物を得る。
■−〇−Ｃｌｌ　Ｚ−Ｃ）Ｉ　ｚ−３Ｏｚ−Ｃ）１２−
ＣＩ（ｚ−３−ＣＨ２−Ｃ）ｌ　Ｚ−３−Ｃ）ｌ　ｚ−
ＣＹＩｚ−５Ｏ２−Ｃ）＋　２−Ｃ１１２■ また、２度活性化した母材をメルカプトエタノールと反
応させて次の生成物を得ることもできる。
■−Ｃ１ｈ−ＣＩｌ□−５Ｏｚ−Ｃ１ｌｚ−ＣＨｚ−５
−ＣＨｚ−Ｃ１ｈ−５−ＣＨｚ−ＣＨｚ−ＣＨｚ−３ｏ
□Ｃ１＋□ 鳥 Ｉｔ　Ｏ−Ｃ１１□−Ｃ１１２−３ 置換重合体ネットの上記のすべての変更例は、本発明の
すべての吸着剤を生成する。
去犯側士 ブフナ炉斗内で粒状アガロースゲルを脱イオン水で洗浄
した。中間溶液からゲルを吸引し、１ｇのゲルを秤量し
て丸底フラスコ内の０．５ｍＡのＮａｚＣＯ３溶液中に
ＱＱ５した。０．１ｍＡのジビニルスルボンを加え、得
られた混合物を攪拌しながら室温で一晩反応させた。
このようにして得られた活性化ゲルをプフナ炉斗に移し
て、脱イオン水で洗浄した。
１ｍＡの０．１モルＮａＨＣＯ：＋溶液および０．１ｍ
Ａのメルカプトエタノールを加えながら、上記活性化ゲ
ルを反応容器に投入した。１５時間接触させた後、ゲル
をブフナ炉斗に移し、脱イオン水で洗浄した。
蛋白質吸着能についてゲルを試験した。０．５モルのに
２Ｓ０４を含むｐｌ＋７．６の０．１モルトリス−ＨＣ
ｊ！緩衝液中においてゲルをクロマトグラフの床に充填
した。
各分量の人間の血清をゲル床において種々のクロマトグ
ラフィーの実験に分けた。９０吸収単位（２８０ｎｍ）
を床に導入すると、３ｓ、ｉｉ位が吸着され、その後硫
酸カリウムを含まない緩衝液で床を洗浄することにより
、そのうちの２６単位が脱着された。残部は３０％のイ
ソプロパツールを含む緩衝液により脱着された。
次の実験では、１３００の吸収単位の透析した人間の血
清を供給した。２８０単位が吸着され、そのうちの２４
０単位が硫酸塩を含まない緩衝液で洗浄した時に脱着さ
れた。
従って、それぞれ３９％および２３％の血清蛋白が吸着
されたわけである。ゲルの電気泳動分析によれば、免疫
グロブリンが吸着材の主成分であり、また血清アルブミ
ンは、メルカプトエタノールと結合したジビニルスルホ
ンで活性化した寒天ゲルに全く吸着されず、またはほん
のわずがだけ吸着されたことがわかった。
実施例２ アガロース粒子の代りにセルロース粉末を使用し、かつ
ビニルスルホンの含有量を活性化に基づいて２０％引上
げたことを除いて、実施例１と同様にして効力検定を行
った。
吸着試験の結果によれば、血清蛋白の吸着能力は対応す
る量のアガロースゲルの約３０％であった。
天施貫盈 エピクロロヒドリンで処理したポリアクリルアミド（市
販のニーパーガイド（Ｅｕｐｅｒｇｉｔｅ）Ｃ１を用い
て、効力検定を行った。ｐＨ９の０．１モルのＮａＨＣ
Ｏ＋中においてＮａ５Ｈで１晩処理することにより、オ
キシランゲルをＳＨに変換し、その後実施例１における
寒天ゲルのように処理した。
ポリアクリルアミド誘導体の吸着能力は、ゲル床の１ミ
リリットル当りアガロ１−ス誘導体の約半分であったの ス１１丸先 メルカプトエタノールの代りにエタノールアミンを用い
たことを除いて、実施例１と同じ方法で効力検定を行っ
た。吸着試験の結果によれば、ごく少量の血清蛋白が吸
着されたにすぎず、かつ蛋白質は硫酸塩を含まない緩衝
液中でも緩衝液中に含まれるイソプロパツールによって
も脱着されなかった。
尖施開】 ０、１ｍβのメルカプトエタノールの代りにｏ、ｉｍｘ
のグリシンを用いたことを除いて、実施例１と同じ操作
を繰返した。１つの血清試験からのすべての蛋白質が実
施例１と同様に生成されたゲル床を通過した。
実施例６ メルカプトエタノールの代りに２．３−ジメルカプトエ
タノールを用いたことを除いて、実施例１と同じ方法で
効力検定を行った。吸着試験の結果によれば、１００吸
着単位の血清蛋白をカラムに導入すると、３２単位が吸
着され、そのうちの１５単位がＸ２ＳＯ４を除去した緩
衝液により溶出された。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）親水性分子重合体ネットにより全体的に、または
    部分的に浸透または表面被覆されている固相を有する分
    離および固定用吸着剤において、下記構造式で表わされ
    る連続鎖を有する置換基または架橋結合が上記重合体ネ
    ットに結合されていることを特徴とする吸着剤。 Ｙ−Ｓ−ＣＨ＿２−ＳＯ＿２−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−Ｘ
    −（式中、Ｙは未置換の、またはアルキル基、アシル基
    、ヒドロキシル基またはアミノ基で置換された、少なく
    とも１つの窒素原子を有する複素芳香族環、またはニト
    ロ基を有するフェニル基の形のπ電子系であり、Ｘはエ
    ーテルの酸素、チオエーテルのイオウまたは窒素である
    。）
  2. （２）固相が１ｍｍ以下の直径を有する粒子から成るこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の吸着剤
    。
  3. （３）分子重合体ネットが架橋ポリヒドロキシ重合体で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項または
    第（２）項のいずれかに記載の吸着剤。
  4. （４）架橋ポリヒドロキシ重合体が多糖類であることを
    特徴とする特許請求の範囲第（３）項に記載の吸着剤。
  5. （５）架橋ポリヒドロキシ重合体が寒天またはアガロー
    スであることを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記
    載の吸着剤。
  6. （６）分子重合体ネットが架橋ポリアミドであることを
    特徴とする特許請求の範囲第（１）項または第（２）項
    のいずれかに記載の吸着剤。
  7. （７）架橋ポリアミドがポリアクリルアミドであること
    を特徴とする特許請求の範囲第（６）項記載の吸着剤。
JP60105769A 1984-05-17 1985-05-17 蛋白質の分離および固定用吸着剤 Granted JPS615100A (ja)

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JPH044018B2 JPH044018B2 (ja) 1992-01-27

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EP (1) EP0168363B1 (ja)
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