JPH03127993A - マクロファージ活性化因子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マクロファージ活性化因子（以下、ＭＡＦと
略）に関し、より詳しくはヒトリンパ球系細胞の培養上
清から純粋に分離されたＭＡＦ及びその製造方法に関す
る。

一般にマクロファージ活性化因子と総称される物質はリ
ンパ球系細胞、特にＴリンパ球系細胞の産生ずるリンホ
カインの一種であり、マクロファージ又は単球あるいは
これらの細胞株に作用し、マクロファージまたは単球あ
るいはこれらの細胞株の細胞内のグルコース代謝活性を
促進させる作用、０２−産生を増加させる作用、Ｈ，０
□産生を促進させる作用等を有し、これらの細胞を活性
化させる。このように活性化されたマクロファージ又は
単球あるいはこれらの細胞株は、抗菌活性、腫瘍細胞障
害活性を増加させることから、本発明のＭＡＦは抗腫瘍
剤、抗菌剤として医薬への応用が期待される。

〔従来の技術〕

ＭＡＦ作用のある物質を医薬としてヒトへ応用する場合
、その産生細胞はヒト由来であることが好ましい。従来
、ヒト由来のＴリンパ球クローンをインターロイキン２
（以下ＩＬ−２と略）存在下で培養することによってＭ
ＡＦ作用のある物質が産生されること（Ｄ、　Ｇｅｍ５
ａ、　ｅｔ　ａｌ；Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

Ｌは８８３　（１９８３）　）、及びヒトＴリンパ球と
ヒトＴリンパ球系腫瘍細胞とを融合することによって得
たヒトＴ細胞ハイブリドーマがＭＡＦ作用のある物質を
産生ずること（特公昭６０−１１８８９、特許第１．３
６４，２６４号）等が報告されているが、その作用が単
一成分に由来するのか複数成分に由来するのか明らかで
ない。さらに、これら培養上清中に含まれるＭＡＦ作用
のある物質は極めて微量であり、その精製は、非常に困
難である。

ＭＡＦ作用のある物質の精製の試みはＨ，Ｋｕｔｓｕｋ
ａｂｅら（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０３６６Ｈ１
９８８））によりヒトＴ細胞白血病細胞株ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ細胞培養上清からヒト末梢血単球由来マクロファー
ジのｈＯ□放出を促進する物質についての報告があるが
約１３００倍程度に部分精製されたにすぎず、単離に至
っていない。

また、Ｔリンパ球系の細胞株ＨＵ↑−１０２の培養上清
から５Ｏ５−ＰＡＧＥの分子量４６，０００．等電点ｐ
Ｈ５，２のＤＩＦと呼ばれる物質が得られた報告（１，
Ｌ。

０１ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ；　Ｂｌｏｏｄ、　　６３５
１０（１９８４））があるが、その−次構造についての
情報は全くない。

このようにＭＡＦ作用をになう物質について様々な情報
はあるが、単離されたＭＡＦは得られていない。

さらに、マクロファージ活性化の指標がＩｎ　ｖｉｔｒ
ｃにおける活性で定義されているため、個々のＭＡＦ作
用を担う物質が単一成分に由来するか複数成分に由来す
るのか明らかでない。

一方、本発明でマクロファージ活性化の指標として用い
たマクロファージ様細胞株のＮＥＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕ
ｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）還元能を有する物質とし
て、リンホトキシン（Ｈ，Ｈｅｍｎ＋ｉ　ｅｔ　ａｌ；
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３８６６４（１９８７））あるいは腫瘍壊死因子（Ｋ
、Ｔａｋｅｄａｅｔ　ａｌ；　Ｎａｔｕｒｅ、３２３３
３８（１９８６））及びインターフェロン−７（Ｕ、　
Ｐｅ５ｔａ　ｅｔ　ａｌ；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋
　　４８８２（１９８８））が知られているが、本発明
のＭＡＦとは構造および免疫学的性質が異なる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、ヒトＴ細胞ハイプリドーマが本発明のＭ
ＡＦを効率良く産生ずる刺激条件、培養条件および精製
法について鋭意研究を重ねた結果、純粋なＭＡＦを単離
精製する方法を見出し、その同定に初めて成功し、本発
明を完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は以下を特徴とするマクロファージ活
性化因子及びその製造方法である。

１、　ヒトリンパ球系細胞が産生し、分子量２５．００
０±４，０００ダルトン及び等電点ｐｏ　６．２±０．
５であり、１．６　Ｘ　１０”単位／ｍｇ蛋白質より大
きい特異活性を有することを特徴とするマクロファージ
活性化因子。

２、　１ｉｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　、　
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｙｓ及び、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓから選ばれた少なくとも一種以上のアミ
ノ酸配列を有することを特徴とする上記１記載のマクロ
ファージ活性化因子。

３、　ヒトリンパ球系細胞をＰＭＡ及び／又はＣｏｎＡ
で刺激し、培養することを特徴とする上記ｌ又は２記載
のマクロファージ活性化因子の生産方法。

４、上記３記載のマクロファージ活性化因子の生産方法
に従って得た培養上清を、 ■　限外濾過装置等を使用して濃縮し、■　■の濃縮液
をｐＨ６，０〜８．０の条件下で強陰イオン交換体と接
触させ、有用物質を該イオン交換体に吸着させた後、０
．０５〜０．３Ｍの無機塩溶液で溶出される分画を集め
、 ■　■の溶出分画をｐＨ６，０〜８．０の条件下で弱陰
イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換体に
吸着させた後、０．０５〜０．３Ｍの無機塩溶液で溶出
される分画を集め、 ■　■の分画をｐｔｔ　６．０〜８．０の条件下でダイ
ワガンドクロマトグラフィー担体と接触させ、有用物質
を咳担体に吸着させた後、０．３〜１．０　Ｍの無機塩
溶液で溶出される分画を集め、■　■の分画を濃縮しゲ
ル濾過担体と接触させ、相対溶出位置が１．１２５〜１
．３７５の分画を取得し、■　■の溶液をｐＨ（６，０
〜８．０の条件下で高速液体クロマトグラフィーシステ
ムの強陰イオン交換体に接触させ、有用物質を吸着させ
た後、０．１０〜０．１２Ｍの無機塩溶液で溶出される
分画を集めるという操作を行う上記１又は２に記載のマ
クロファージ活性化因子の精製方法。

さらに本発明について詳しく説明する。

本発明で使用するヒトＴ細胞ハイブリドーマは特公昭６
０−１１８８９号公報、特許第１，３６４．２６４号記
載のエメチンーアクチマイシンＤ法で取得しＦ４−２９
−４株を選択した。このＦ４−２９−４株は工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄第
１１０４１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１０４１）　）。

本発明でヒトＴ細胞ハイブリドーマからＭＡＦを効率よ
く産生させるにあたっては、種々の免疫刺激物質でその
細胞を前もって処理することが好ましい。このような免
疫刺激物質としては、コンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）
　、フイトヘマアグルチニン（Ｐ）ＩＡ）　、アメリカ
ヤマゴポウマイトーゲン（ＰＷＭ）、精製ツベルクリン
タンパク質（ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒ
ｉｖａｔｉｖｅ　ｏｆ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ、　ＰＰ
Ｄ）、ジフテリアトキソイド、ヘルペスウィルス、スタ
フィロコッカスエンテロトキシンＡ　（ＳＥＡ）、ホル
ボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ
）、レバミゾール、レンチナン、ビシバニール、カルシ
ウムイオノホア等のマイトジェン、細菌菌体成分、生理
活性物質を挙げることができる。これらの免疫刺激物質
は単独で用いてもよいし、あるいは任意に組み合わせて
もよい。

本発明で使用し得るこれら免疫刺激物質として特に好ま
しいものは、ホルボール−１２−ミリステート−１３−
アセテート（ＰＭＡ）　、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ
）等のマイトジェンである。

本発明においてはヒトＴ細胞ハイブリドーマを好ましく
は０〜４００ｎｇ／ａｆのＰＭＡ濃度あるいはＯ〜２０
０μｇ／ｘｄのＣｏｎＡ濃度あるいは両者の混合条件下
に０．１〜２４時間前培養することが好ましい。

より好ましくは培養上清を取得する前にヒトＴ細胞ハイ
ブリドーマを、基礎培地例えばダルベツコ変法イーグル
、ＲＰＭＩ−１６４０５ＡＳＰ１０３、ＭＥパ等に必要
ならば血清、例えば牛胎児血清、新生中血清、仔牛血清
、大血清、馬血清、モルモット血清、及び細胞成長因子
類、例えばインターロイキン２、ソマトメジンＣ−、ヒ
トＥＧＦ等、各種成長因子類、例えばトランスフェリン
、インシュリン、アルブミン、亜セレン類ナトリウム等
、ホルモン類、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、抗生物
質、無機塩類等を添加しＩ　Ｘ　１０’〜ｌＸｌ０”個
／−まで、好ましくはｌＸｌ０’　−ｌＸｌ０’個／　
ｔｔｒｌまで培養した細胞培養液中に、最終濃度０〜２
００ｎｇ／ｄになるようにＰＭＡ及び／またはＣｏｎＡ
　Ｏ〜４００　ｕｇ／１ｔｒｌを添加して０．１〜２４
時間好ましくは０．５〜８時間培養した後に、免疫刺激
物質を含まない培地に交換し更に３〜７２時間、より好
ましくは１２〜３６時間培養する。

このようにして得られた細胞培養液を遠心分離して細胞
を除去し培養上清を取得する。

上記細胞の培養条件は、種々の条件で培養後培養上清を
回収し、ＭＡＦ活性を測定することにより、至適培養条
件を決定できる。

本発明では、ヒトＴ細胞ハイブリドーマＦ４−２９４株
を使用し、ＲＰ旧−１６４０（［１ｉｏｃｅ１１社製）
を基礎培地として、最終濃度１０％の牛脂児血清（Ｇｅ
ｎｅｒａｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）を加えてｌ×１０６個／ｄまでになるよう
にＦ４−２９−４細胞を１０ｆｆジヤーフアーメンクー
あるいは１０之スピナーフラスコで培養し、次に最終濃
度２０ｎｇ／成になるまでＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ社製）及
び２０μｇ／ｍになるまでＣｏｎＡ　（生化学工業社製
）を添加して、３時間前培養し、次に連続遠心機を使用
して細胞を回収し、ＰＢＳ　（リン酸緩衝生理食塩水）
で洗浄し、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０にＩ　Ｘ
　１０’個／戚になるように再懸濁し、１０ｆジャーフ
ァーメンタ−あるいは１０１スピナーフラスコで更に２
４時間培養し、連続遠心機を使用して培養上清を回収す
る。

本発明に於て使用できる基礎培地としては、糖類、アミ
ノ酸、ビタミン類、ホルモン類、タンパク質、成長因子
、核酸またはその前駆体、無機塩類、重金属類等から選
ばれた一種以上を含有する基礎培地またはその基礎培地
に動物血清等を添加した培地から適宜選択して用いるこ
とができる。

このような基礎培地としては上記したような市販されて
いるＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、ダルベツコ
変法ＭＥＭ培地等が挙げられる。また上記動物血清とし
ては、上記したような牛脂児血清、新生牛血清、牛血清
、馬血・清、ヤギ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワト
リ血清、ヒト血清等を挙げることができ、それらは基礎
培地に適宜加えて用いることができるが、好ましくは２
０％まで添加して用いることができる。

なお、基礎培地、血清の種類と濃度、細胞密度、培養時
間及び刺激物質の種類、濃度、刺激時間、さらには培養
装置等についてはその他普通に使用されるものであれば
、目的に応じて種々選択して、好適な条件を選んで用い
ることができ、ここに記載したものに限定するものでは
ない。

本発明によって得られた培養上清に含まれるＭＡＦ作用
を有する物質は、各種の分離操作により、単離精製する
ことができる。このような方法としては、蛋白沈澱によ
る方法、電気泳動による方法、ゲル濾過あるいは分子篩
クロマトグラフィーによる方法、限外濾過による方法、
高速液体クロマトグラフィーによる方法、逆相クロマト
グラフィーによる方法、イオン交換クロマトグラフィー
による方法、アフィニティークロマトグラフィーによる
方法、吸着クロマトグラフィーによる方法、ダイリガン
トクロマトグラフィーによる方法などが挙げられる。

上記蛋白沈澱による方法では硫酸アンモニウム、リン酸
ナトリウム等の塩析剤を用いることが好ましい。

電気泳動に用いることのできる分離剤としては、例えば
ポリアクリルアミド、アガロース等が挙げられる。

ゲル濾過あるいは分子篩クロマトグラフィーに用いるこ
とのできる分離剤としては、デキストランゲル、ヒドロ
キシプロピルデキストランゲル、アクリルアごドブキス
トランゲル、親水ポリマーポリアクリルアミドゲル、全
多孔性シリカ等が挙げられる。

逆相クロマトグラフィーに用いることのできる分離剤と
しては、球状シリカゲル基体上に直鎖炭化水素（炭素数
１．４．８．１８など）やフェニル基、シアノプロピル
基が結合されたものを使用する方法が挙げられる。

イオン交換クロマトグラフィー法では、例えばアミノエ
チル、ジエチルアミノエチル、あるいは第四級アミノエ
チル基を官能基として有する陰イオン交換体、カルボキ
シメチルあるいはスルホプロピル基を官能基として有す
る陽イオン交換体を用いることができる。

アフィニティークロマトグラフィーに利用できるものと
しては、ＣｏｎＡ−セファロース、レンチルセファロー
スのようなレクチン結合担体、あるいは抗体結合担体等
を挙げることができ、特に抗体としてモノクローナル抗
体を用いたものは好適に使用することができる。

ダイリガントクロマトグラフィーに利用できるものとし
ては、レッドセファロース、ブルーセファロースのよう
な色素結合担体を挙げることができる。

吸着クロマトグラフィーに用いることができるものとし
ては、フェニルセファロース、オクチルセファロースな
どが挙げられる。

本発明に於けるＭＡＦの精製法としては、下記の手段が
用いられる。

（１）　　ヒトＴ細胞ハイブリドーマＦ４−２９−４株
のＰＭ＾、ＣｏｎＡ処理培養上清をペリコンカセット及
び／又はベリコンラボカセット（日本ミリボアリ旦テッ
ド社製）を用い約１００倍濃縮を行なう。

（２）上記濃縮液をｐＨ６，８〜７，６の緩衝液に対し
て透析、脱塩処理し、同しｐＨ領域の緩衝液で平衡化し
た強陰イオン交換体、例えばＱＡＥ−トヨパール５５０
Ｃ（東ソー社製）と接触させ、吸着物を０．０５〜０．
５Ｍの無機塩、例えば塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐ
Ｈ６，８〜７．６）を用いて溶出する分画を集める。

（３）　　この溶出液を脱塩し、再度弱陰イオン交換体
、例えばＤＥＡＩＥ−１−ヨパール６５０５　（東ソー
社製）と接触させ、吸着物を０．０５〜０．５Ｍの無機
塩、例えば塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ６．８〜
７．６）を用いて濃縮溶出し、溶出分画を集める。

（４）　　この溶出液をｐＨ６〜８の緩衝液に対し透析
脱塩し、同ｐＨＴｉＩ域の緩衝液で平衡化したダイリガ
ントクロマトグラフィー担体、例えばＡＰ−Ｒｅｄ　）
ヨバール６５０ＭＬ　　（東ソー社製）に接触させ、次
いで吸着部分を０．３〜１．０Ｍ好ましくは０．４〜０
．６Ｍの無機塩、例えば塩化カリウムを含む緩衝液（ｐ
Ｈ６〜８）を用いて溶出する分画を集める。

（５）　　この溶出液を分子篩クロマトグラフィーの目
的で、ゲル濾過剤例えばセファクリルＳ−３００＋１Ｒ
（ファルマシア社製）を充填したカラムに供与し、０．
０１〜０．１５Ｍの無機塩含有緩衝液にて溶出せしめ、
相対溶出位置が１．１２５〜１．３７５　、好ましくは
１．１８８〜１．３１３である分画を集める。

なお相対溶出位置はＶｅ／Ｖｏであられされる数値であ
り、Ｖｅはカラムに供与した目的試料の溶出する液量を
示し、Ｖｏはカラム内の空隙の溶液量を示す。

（６）上記溶出分画の脱塩を行い、ｐｎを６〜８に調整
し、同ｐＨ領域の緩衝液で平衡化したＦＰＬＣシステム
（ファルマシア社製）を用いる強陰イオン交換体、例え
ばＭｏｎｏＱ　）ＩＲ５１５（ファルマシア社製）と接
触させ、吸着物を０から０．２Ｍの無機塩、例えば塩化
ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ６〜８）を用いて塩濃度
を連続的に高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出さ
せ、０．１０−０．１２Ｍの塩濃度の緩衝液にて溶出さ
れる分画を集める。

（７）更に蛋白構造を解析する目的で、非極性の充填剤
に対イオンを含む溶離液を用いてイオン成分を中性物質
に交換し、分配平衡の差を利用して分離する高速液体ク
ロマトグラフィーの一種である逆相クロマトグラフィー
を用いて、実質的に不純物を含まないＭＡＦを得ること
ができる。例えばＹＭＣＡＰ−８０３Ｃ４カラム（ＹＭ
Ｃ社製）の場合、カラムを０．１χトリフルオロ酢酸で
平衡化しておき、これに前工程で得た活性分画を通液し
て吸着後、０．１χトリフルオロ酢酸を含む０％から１
００ｚのアセトニリトルによる直線的濃度勾配溶出法に
より溶出させ、中和後、透析し、活性測定を行なうこと
により、純ＭＡＦを得ることができる。以上の精製法に
おいて、本発明物質の確認追跡は活性をマーカーとして
行なう。

かくして得られたＭＡＦ活性物質は、５Ｏ５−ＰＡＧＥ
（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｎ＋ｉｄｅ　ｇｅｌ　
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分子量２０〜３０
にダルトンであり、２−メルカプトエタノール処理でも
その分子量に変化はない。

シ＝ｌＩ！密度勾配等電点電気泳動法により測定した等
電点はｐＨ６，２±０．５である。

また、抗ヒドリンホトキシン抗血清（兎で作製）抗ヒト
腫瘍壊死因子抗血清（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）あるいは抗
ヒトインターフェロン−γモノクローナル抗体（日本ケ
ミカルリサーチ社製）の添加によってもその活性は中和
されない。

さらに、リジンエンドペプチダーゼ処理後にμＢｏｎｄ
ａａｐｈｅｒｅＣ１Ｂカラム（日本ウォーターズ社製）
の逆相クロマトグラフィーを行って得たフラグメントの
アミノ酸配列分析を行った結果、少なくともＩｌｅ−Ｉ
ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　、　Ｇｉｎ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＡｌａＡｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ及び／
又はＧｉｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
の配列が含まれる。

これらのアごノ酸配列を構造既知のタンパク質データベ
ース（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ　、ＳＤＣソフトウェア−開発
全社製）でホモロジー検索した結果、これら配列を含む
タンパク質は見いだされなかった。

以上の特徴から本発明により得られるＭＡＦは新規物質
であり、生化学用、薬理学用試薬として用いてもよく、
また医薬品として用いる場合には、医薬品製造の慣用的
技術に従って製剤化できる。

すなわち、このようにして得られた本発明ＭＡＦは、そ
れを医薬として用いる場合、通常の蛋白製剤に許容され
る方法で投与することができる。

このような形態の代表的なものは、静脈内投与、筋肉内
投与、経鼻、皮下あるいは皮肉投与、さらには経口投与
することもできる。非経口投与のための調剤としては無
菌溶液または非水溶液剤、懸濁剤またはエマルジョン剤
としてもよい。それらはまた無菌水、生理的食塩水ある
いは使用直前に無菌注射用媒体に溶解して用いられる凍
結乾燥製剤の形のものであってもよい。

本発明により得られたＭＡＦは種々の感染症の治療剤、
抗腫瘍剤として有用である。

本発明により得られるＭＡＦを上記したような治療目的
に用いる場合、その投与量、投与回数、投与間隔は、患
者の症状に応じて適宜選択して決めることができる。

本発明のＭＡＦの活性測定方法は以下に示す通りである
。すなわち、ヒトマクロファージ様細胞株Ｕ９３７細胞
を牛胎児血清（以下ＦＣＳと略）１０χと１．２５　Ｘ
　１０−　”　ＭのＲｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　（Ｓ
ｉｇｍａ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１．２
５　Ｘ　１０’個／　ｍａｌとなる様に懸濁する。９６
穴タイタープレート（仕度ベークライト社製）に２０μ
ｌ／ウエ）１で試料溶液をまき、次に前記Ｕ９３７細胞
懸濁液を８０μｌ／ウエルでまく。このタイタープレー
トを３７°ｃ、　５Ｘｃｏｚ−９５χＡｉｒのインキュ
ベーター中で４８時間培養する。次に１１０ｎｇ／ｍｆ
のホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート
（Ｓｉｇｍａ社製）を各ウェルに１０μｌづつ加え更に
９０分間培養し、ニトロブルーテトラゾリウム溶液（Ｎ
ＢＴ　Ｓ１２■／成ナ力ライテスク社製）を各ウェル１
０μｌづつ加え１５分間培養する。培養上清を除去し、
各ウニ謄ともリン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略）
５０μｌに再懸濁し、血算盤を用いて顕微鏡下で青色に
染まった細胞数と全細胞数を測定するＭＡＦ活性は以下
の式で表される。

ＭＡＦ活性（Ｘ）　＝　（青色に染まった細胞数／全細
胞数）Ｘ１００ なお活性の単位表示は５０％の活性を５０単位と規定し
、５０Ｘの活性を示すサンプルの希釈倍数を検量線より
求め、その希釈倍数に５０（単位）を乗じた値で表示す
ると定義した。例えば、サンプルの希釈列を取った検量
線で５０２の活性を示す希釈倍数が２０であった場合、
そのサンプルの原液に含まれるの単位数は、５０　Ｘ　
２０単位／成、すなわち１０００単位／Ｉ１１と表示す
ることになる。

ここで用いた原理はＮＢＴがＯ２−により還元され青色
のホルマザンを形成することを利用している。

なお、蛋白質の定量はＢＣＡ　’″Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
ｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて
行った。

以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する本発
明は以下の実施例に限定されるものではない。

ＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマの作製は特公昭６
０−１１８８９号公報、特許第１，３６４，２６４号記
載の方法に準拠して行った。すなわちヒト末梢血リンパ
球（以下ＰＢＬと略）１０６個／ｄを（ＩＯＸＦＣ３，
５Ｘ１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノール、２ｍＭグ
ルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＲＰ
ＭＩ培地と略）中、フィトヘムアグルニニン−Ｐ　（Ｐ
ＨＡ−Ｐ　、シグマ社製品）５μｇ７ｍｌにより４日間
処理後、ラクトース０．１）１によって細胞に結合した
ＰＨＡ−Ｐを可及的に除去した。

他方、ＲＰＭＩ培地中で増殖したヒトＴリンパ球系腫瘍
細胞ＣＥＭ−１１（ＣＣＲＦ−ＣＥＨのクローニング株
）２×１０６個／ｄにエメチン塩酸塩（ナカライテスク
社製）　５　Ｘｌ０−５Ｍ　、及びアクチノマイシンＤ
　（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃ、）　０．
２５　ｕ　ｇ／ｍｌを添加し３７°Ｃ，２時間処理した
後培養液中のエメチン塩酸塩及びアクチノマイシンＤを
遠心（２００Ｘｇ　、５ｍ１ｎ）除去した。

上記のように調製したＰＢＬとＣＥＭ４１を１０：１の
割合で混合後、遠心分離して得た細胞ベレットに、０．
５ｍｆの４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６０
００、シグマ社製）及び、５μｇ／ｒｄポリーＬ−アル
ギニン含有？ＩＥＭ培地を加え、３７°Ｃ１１分間ゆっ
くり撹拌して融合させ、１０成の無血清無添加ＲＰＭＩ
−１６４０培地をゆっくり添加し、遠心（１５０Ｘｇ　
、５ｍ１ｎ）した。この細胞ペレットにＲＰＭＩ培地を
加え細胞数を２５０個／ｒｎ１とし、その１００　ｇ　
１　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌとしてマイトマイシンＣ処
理したＣＥＭ−１１（２Ｘ１０’　個／ｄ）含有ＲＰＭ
Ｉ培地１００μＡと混合し、９６穴タイタープレートに
加え、５ＸＣＯｚ−９５！Ａｉｒの雰囲気下、３７°Ｃ
で約３〜４週間培養後、増殖した融合細胞を上記マイト
マイシンＣ処理ＣＥＭ４１をｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌと
して限界希釈法によりクローン化し、各クローンの増殖
後、ＭＡＦの測定を行い、Ｆ４−２９−４株を選択した
。

本発明に使用した活性測定系において上記Ｆ４２９−４
株の産生ずるＭＡＦ活性は７２時間培養上清で約ｌＯχ
であった。

Ｆ４−２９−４株のＭＡＦ産生の効率を上げるために、
免疫刺激物質の種類、濃度、刺激時間及び刺激後の培養
時間について検討した。

まず、Ｆ４−２９−４株を１０χＦＣＳを含むＲＰ旧−
１６４０培地中でＩ　Ｘ　１０ｂ個／ｍｆｆ１ニなるま
で３７°Ｃ１５ＩＣＯＺ−９５ＸＡｉｒの条件で培養し
た。

免疫刺激物質はＣｏｎＡ及び／又はＰＭＡを使用しＡｓ
ａｄａ　らの方法（Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　
７７１５０（１９８３））を参考にして、その濃度を選
択した。ＣｏｎＡ最終濃度はＯ〜２００　ｕｇ／ｍｌ、
ＰＭＡ最終濃度はＯ〜２００ｎｇ／ｄとし、２５Ｃ１の
プラスチック培養フラスコ（コーニング社製）に５Ｘ１
０’個のＦ４−２９−４１１１胞を１０χＦＣ３存在下
で上記刺激物質を加えて、３時間、３７°Ｃ１５χＣＯ
２−９５χＡｉｒ下で刺激した後、細胞を遠心分離（１
５０Ｘｇ　、５ｍ１ｎ）で回収した。この細胞をＰＢＳ
に懸濁後、再度上記条件で遠心分離して細胞を取得した
。同様の洗浄操作を繰り返した後に細胞をＩ　Ｘ　１０
ｈ／ｄになるようにＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し
、２５ｃ１のプラスチック培養フラスコに５−づつ移し
、３７゛Ｃ１５χＣ０ｔ−９５ＸＡｉｒ下で、２４時間
培養した。培養上清を遠心分離（１５０ｘｇ　、５ｍ１
ｎ）で回収し、活性測定に供した。その典型的な結果を
第１表に示す。

１に芝 ＣｏｎＡ　（μｇ／ｄ） ＰＭＡ（ｎｇ／ｌ１１） 活性（％） ０ ０ ２．５ ０ ００ ００ ０ ０ ２１．０ ０ １２．５ ００ ００ ０ ０ ３７．５ その結果ＣｏｎＡ２０　ｕ　ｇ／ｍｌとＰＭＡ２０ｎｇ
／ｍの同時刺激時に高い活性が得られ、その他の免疫刺
激物質の添加量において、この条件を越える値はえられ
なかった。

次にＣｏｎＡ２０　ｕ　ｇ／ｍｌ及びＰＭＡ２０ｎｇ／
ｍＮの同時添加で、その刺激時間及び刺激後の培養時間
について検討した。まずＦ４−２９−４細胞をＩ　Ｘ　
１０’個／ｄまで上記の方法で培養した。このようにし
て得られた６０−の細胞懸濁液を５ｍｉづつ２５ｃｍ”
のプラスチック培養フラスコに入れ、最終濃度２０μｇ
／ｒＲ１のＣｏｎＡと２０ｎｇ／ｄのＰＭＡを加え３７
°Ｃ５ＸＣＯｚ−９５χＡｉｒで０．１〜１６時間刺激
した。各々の刺激時間終了後、細胞を上記した遠心操作
（１５０ｘｇ　、５ｍ１ｎ）で回収し、ＰＢＳに懸濁し
遠心（１５０ｘｇ、５ｍ１ｎ）操作で洗浄後、Ｆｅ２を
含まないＲＰＭ１４６４０で０．１〜７２時間培養し、
ＭＡＦ産生をさせ、所定の培養時間の終了後、遠心分離
（２００Ｘｇ　、５ｍ１ｎ）を行い、培養上清を回収し
た。この培養上清の活性を測定した典型的な結果を第２
表に示す。

第一３ヒー麦 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ｈｒ） Ｐｒｏｄｕｃ　Ｌｉｏｎ　（ｈｒ） 活性（Ｘ） ２２±３ １８±５ １５±４ ２４　　　　　　２±２ １６　　　　　　　　４８　　　　　　　３±２７２　
　　　　２±２ 第１表及び第２表の結果よりＭＡＦ産生のためのＦ４−
２９−４細胞の培養条件は、ＣｏｎＡ２０　ｕ　ｇａｒ
ｎｅｔ、ＰＭＡ２０ｎｇ／−でＩ　Ｘ　１０’個／ｄの
Ｆ４−２９−４細胞を３時間刺激しＰＢＳで洗浄後、血
清無添加のＲＰＭＩ−１６４０培地で２４時間培養する
こととした。

遣ｕ直貴１１　Ｆ４−２９−４　　　　　（Ｄ　　　　
　　　と　　　上’　　の越盪 実施例２の結果に従って、Ｆ４−２９−４細胞を１０１
ジャーファーメンタ−あるいは１０ｆスピナーフラスコ
を用いてＩ　Ｘ　１０’個／ｍの細胞濃度になるまで１
０χＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養（約７２
時間）し、ＰＭＡを終濃度２０ｎｇ／　ｍｌ及びＣｏｎ
Ａを終濃度２０ａｇ／ＩＲ１になるまで添加して４時間
刺激した。次に連続遠心機（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、製）を使用し、２００
　Ｘ　ｇで刺激細胞を回収し、ＰＢＳｌｏｆｆｉで洗浄
後、細胞をＩ　Ｘ　１０’個／ｄとなるようにＲＰＭＩ
−１６４０培地に懸濁し、１ＯＮジャーファーメンタ−
あルイは１０１，２．ピナーフラスコテ３７°Ｃ，５Ｘ
ＣＯｔ−９５ＸＡｉｒの条件下で２４時間培養した。培
養後連続遠心機（２００Ｘ　ｇ）を用いて細胞と培養上
清を分離し、培養上清を取得した。この培養上清はペリ
コンカ４ット（日本ξリポアリミテッド社製、ＰＴＧＣ
ＮＭＷＬ。

１０．０００）　　とベリコンラボカセット（日本ミリ
ボアリミテッド社製、ＵＦｍｅｎｂｌａｎｅＮＭＷＬｌ
ｏ、　０００）を順次使用して１００倍濃縮液とした。

同様の操作を行い培養上清１７０１分の濃縮液を作製し
、以下の実施例の出発材料とした。

尖施拠玉　ｙ込」」重Ｅ；に 実施例３で得たＦ４−２９−４細胞培養上清１００　ｔ
＠濃縮液を８０００Ｘｇ　、６０分間遠心した上清を取
り、０．０５ＸＰＥＧ−６０００含有５Ｉｌ１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に対して透析し、同緩衝液で
平衡化したＱＡＥＴｏｙｏｐｅａｒｌ　５５０Ｃ（東ソ
ー社製）カラム（直径４．７ｃｍｘ高さ４７　ｃｍ　）
に通液し、０．ＩＭ　ＮａＣ］を含む同緩衝液で溶出を
行い、１．４１の溶出液を得た。（第一工程） 次ニコノ溶出液を０．０５ＸＰＥＧ−６０００含有５＋
ｎＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析し
、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
　６５０Ｓ　　（東ソー社製）カラム（直径２．５ｃｍ
Ｘ高さ５ｃｍ）に通液し、０６１ＭＮａＣｌを含む同緩
衝液で溶出を行い、溶出分画１００ｄを得た。（第二工
程） 第二工程で得た溶出液を０．０５χＰＥＧ−６０００含
有２０ｍＭ’Ｊン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）に
対して透析し、同緩衝液で平衡化したＡＦ−Ｒｅｄ　Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０？ＩＬ　（東ソー社製）カラ
ム（直径１．６ｃｍＸ高さ８ｃｍ）に通液し、０．５Ｍ
　ＫＣＩを含む同緩衝液で溶出させ、７５ｍ１の溶出分
画を得た。（第三工程）第三工程で得た７５ｄの溶出分
画を第一工程と同じ緩衝液に対して透析し、同緩衝液で
平衡化した口ＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　カラム（直径
１．６ｃｍｘ高さ１．５ｃｍ）に通液し、ＬＭ　ＮａＣ
１を含む同緩衝液で濃縮目的で溶出し１３ｄの溶出分画
を得た。この溶出液を、０．１χＰ［ＥＧ−６０００及
び０．１５Ｍ　ＮａＣ１含有１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ
　５３００１１Ｒ（ファルマシア社製）カラム（直径２
．６ｃｍｘ高さ９０ｃｍ）に通液し相対溶出位置１．１
８８〜１．３１３の分画４５　ｍｌを集めた。この工程
を終了した段階での比活性は４．８　Ｘ　１０’単位／
ｍｇ蛋白質であった。

（第四工程） 上記第四工程溶出液４５ｍ１を０．０５χＰＥＧ−６０
００含有５ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
対して透析し、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ　ＨＲ
５１５カラム（ファルマシア社製）に通液し吸着後、同
緩衝液と０．２ＭＮａＣ１を含む同緩衝液により連続的
に塩濃度を高めていく直線濃度勾配溶出法により溶出さ
せ０．１０〜０．１２Ｍの塩濃度で溶出した分画３ｍｌ
を集めた。

（第五工程） 上記第五工程（最終工程）終了段階でＭＡＦの比活性が
１．６　Ｘ　１０’単位／ｍｇ蛋白質である本発明ＭＡ
Ｆを得た。

かくして得られた本発明ＭＡＦの物理化学的性質に関し
て以下の実施例に述べる方法を用いて解析した。

実施斑災　公ヱ旦 分子量の測定はＰｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシ
ア社製）を使用したＳＯ３電気泳動法で行った。

すなわち、本発明ＭＡＦ０．５μｇをそのまま、あるい
は２−メルカプトエタノールで処理した後、０、１’ｌ
！ＳＤＳを含む１０−１５χポリアクリルアミドゲルに
付与し、０．１χＳＤＳを含むバッフアーストリラプス
（ファルマシア社製）でそれぞれ電気泳動を行った。バ
イオランド社製分子量マーカー（ホスホリラーゼＢ；分
子３ｔ９２，５００、牛血清アルブミン：分子ｉ６６．
２００、オフ７．ＩＬ／プｚン；分子量４５，０００、
カルボニックアンヒドラーゼ：分子量３１，０００、ソ
イビーン　トリプシンインヒビターｉ　分子ｆｆ１２１
，５００゜リゾチーム；分子量１４，４００）を用いて
分子量検量線を作製し、銀染色法（Ｊ、　Ｈｅｕｋｅｓ
ｈｏｖｅｎ　＆　Ｒ。

Ｄｅｒｎｉｃｋ；　Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｅｓｉｓ＋　６
１０３（１９８５））により分子量を測定した。

その結果、本発明ＭＡＦの分子量は２５，０００±４．
０００ダルトンで電気泳動的に単一であり、２−メルカ
プトエタノール処理でも同様の分子量を示した。

尖施明五　葺蒐嘉 本発明ＭＡＦの等電点は、ショ糖密度勾配等電点電気泳
動法で測定した。

すなわち、４０％両性ファルマライト３−１０　（ファ
ルマシア社製；ｐＨ３〜１０）を３．８ｚ含む５０！（
Ｗ／Ｖ）　シヨ＃！溶液と同１ｚを含む水溶液とを用い
て、冷却用ジャケットを装着した内径１ｃｉｌ、高さ２
６Ｃ１１のガラスカラム内に段階的な密度勾配を作製し
、本発明物質２μｇをこの密度勾配のほぼ中央に付与し
た。

陽極側に１ｚリン酸、陰極側に１．６ｚエチレンシア≧
ンを含む５０％シー！糖溶液を用い、４°Ｃの冷却水通
水下で５００ｖ、２４時間泳動を行った。泳動終了後１
、Ｏｄづつ分取してｐＨを測定した後に、１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，２）を１００μｌづつ加え、直ちに０．
０５＄ＰＥＧ−６０００を含むＰＢＳに対して透析し、
各分画について活性測定した結果を第１図に示した。そ
の結果、本発明ＭＡＦの等電点はｐＨ６，２±０．５で
あった。

裏施尉１蓋亘且遣坐五捉 本発明ＭＡＦの部分構造解析のために本発明ＭＡＦ２０
μｇを０．１！）リフルオロ酢酸で平衡化したＹＭＣＡ
Ｐ−８０３［Ｓ−５３００人Ｃ４（ＹＭＣ社製）〕カラ
ム（直径０．４６ｃｍｘ高さ２６ｃｍ）を装着したＦＰ
ＬＣシステム（ファルマシア社製）に通液し、吸着後０
．１！トリフルオロ酢酸を含む０〜１００Ｘアセトニト
リルによる直線濃度勾配溶出をし、アセトニトリル４２
〜４８％の分画１−を得た。

この分画の一部を取り、中和後０．０５χＰＥＧ−６０
００含有ＰＢＳに対して透析し、活性測定を行い、ＭＡ
Ｆ活性の残存することを確認した。

一方、残りの分画（約１０μｇ）は遠心エバポレーター
（ヤマト科学社製）で乾固させた後に、０．１χ８口５
１５０μｌに溶解し、終濃度２５ｍＭとなるようにＬＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて全量を蒸留水
で１００１！調製した。この溶液にＥｎｄｏｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製）
を０，１　μｇ加えて３７°Ｃ１２４時間処理を行った
。この反応液を０．１χトリフルオロ酢酸で平衡化した
μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８（日本ウォーターズ社
製）カラム（直径３．９　ｔｍａ×高さ１５　ｃｍ　）
に通液して吸着させた後に、０．１Ｘ）リフルオロ酢酸
を含む０〜６０％のアセトニリトルの直線濃度勾配溶出
を行い、ピーク分取を行った。

得られた８ビークを個々に気相式プロティンシーケンサ
−ＰＳＱ−１（島津社製）にかけ、得られたＰＴＨ（フ
ェニルチオヒダントイン）ア旦ノ酸をＩＩＰＬｃ（島津
社製）で分析しアミノ酸を同定した。

その結果少なくともｌｌ５−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ。

Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇ
ｉｎ−Ｌｙｓ　、　Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓの配列が確認された。これらのアミノ酸
配列を構造既知タンパク質データベース（ＮＢＲＦ−Ｐ
ＤＢ、ＳＤＣソフトウェア−開発全社製）とホモロジー
検索を行ったが、上記配列を含む既知タンパク質は見い
だされなかった。

実脇讃Ｉ４　　ヒ　　　　Ｌに・　る ■ヒト末梢血単球の調製 ヒト末梢血単球の調製はＭ、　ｌｉｇｕｃｈｉら（Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　３１４６９１９８７）の方法に従
って行った。

すなわち、正常ヒト末梢血から２００Ｘｇ　、１０分間
遠心し、ＰＢＬ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　
１ｅｕｃｏｃｙｔｅ）を取得する。このＰＢＬをＰＢＳ
　２　ｄに懸濁し、密度１．０６４のＰｅｒｃｏｌｌ−
ｓａｌｉｎｓ溶液１０ｄ上に重層し、室温で５００Ｘｇ
、２０分間遠心し、中間層の細胞を分取した。

この細胞をＰＢＳ　１０ｄに再懸濁し、１５０　Ｘｇ　
、５分間遠心した後に再度ＰＢＳ２ｄに懸濁した。次に
再度１０ｍ１！のＰｅｒｃｏｌｌ−ｓａｌ　ｉｎｅに重
層し、同様の分離操作を行って、ＰＢＳ　１０戚に懸濁
して遠心（１５０Ｘ　ｇ、５分間）により洗浄しｌ×１
０６個／ｄとなるようにｌ０ＸＦＣ５と２ｍＭグルタξ
ンを含むＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した。

■ヒト末梢血単球のＨ，Ｏ□産生能の測定ヒト末梢血単
球のＨ，Ｏ□産生能の測定はＥ、　Ｐｉｃｋ＆　Ｄ、　
Ｍｉｚｅｌの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ＋　４６２１１（１９８９））を一部変更して行
った。すなわち、■で得た末梢血単球懸濁液を９６穴タ
イタープレートのウェルアタリ１００ＩＪｌツツまき、
３７’Ｃ，１時間、５ｚＣｏ！−９５ＸＡｉｒ下で培養
した後に培養液を除去し、１０！ＦＣ５と２ｍＭグルタ
壽ンを含むＲＰＭＩ−１６４０に溶解したサンプル液１
００μｆを加えテ３７°Ｃ１４８時間、５ｚＣＯ□−９
５ＸＡｉｒ下で培養した。この培養液を除去した後、Ｒ
ａｎｋｓ’　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ　　（ギブコ社製）にフェノールレッド（０，１
ｇ／　ｌ　）　、ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓＦｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ　（９５００Ｕｎｔｔｓ／ｆ　Ｓｉｇｎ＋ａ社
製）　、ＰＭＡ（１００μｇｅｌ）を含む溶液１００μ
ｌを加え、３７°Ｃ５１４時間、５χＣ（ｈ−９５ｚＡ
ｉｒ下で培養し、反応させた。１０μｌのＬＭ　ＮａＯ
Ｈを添加して反応を停止し、マイクロプレートフォトメ
ーター（コロナ社製）で６１０ｎｍの吸収を測定し、酸
化型フェノールレッドの定量を行ない、Ｈ，０□添加に
よる検量線より８２０２量を求めた。

結果を第３表に示す。

勇工；Ｌ−麦 ＭＡＦ　（２００Ｕ） Ｈ，Ｏ，（ｎｍｏｌ／ｈｒ／１０’ｃｅｌｌｓ）＋ ０．３２ ０．７５ この結果本発明ＭＡＦ添加により、ヒト末梢血単球の１
１□０□産生の促進されることが認められた。

裏豊班生　症比監よｉ主租 ヒトマクロファージ様細胞を活性化してＮＢＴ還元能を
示す既知物質として知られているリンホトキシン（ＬＴ
）（Ｈ，Ｈｅｍｍ１　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、＋　１３８６６４　（１９８７）　）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）　（に、　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔａｌ；　
Ｎａｔｕｒｅ、　３２３　３３８（１９８６））　、イ
ンターフェロン−Ｔ　（ＩＦＮ　　ｒ）（１１，Ｐｅ５
ｔａ　ｅｔ　ａｌ；　Ｃａｎｃｅｒ、、４８８２（１９
８８））との異同を各々に対する抗体を使用して、その
中和活性で比較した。

すなわち、本発明ＭＡＦ２０単位の示すＭＡＦ活性と同
程度の活性を示すリンホトキシン（２，０００単位）、
腫瘍壊死因子（２００単位）、インターフェロン−γ（
５００単位〉を完全に中和する抗ヒドリンホトキシン抗
血清（αＬＴ）　　（兎で作製）、抗ヒト腫瘍壊死因子
抗血清（ｔｘ　ＴＮＦ）　（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、抗
ヒトインターフェロン−γモノクローナル抗体（αＩＦ
Ｎ−γ）　（日本ケミカルリサーチ社製）と本発明ＭＡ
Ｆ２０単位を３７゛Ｃ１３０分間前処理した。次に、こ
の処理溶液をＭＡＦ活性測定系に加えて活性を測定した
。

結果を第４表に示す。

夷ユニＬ−友 ａｍｐｌｅ 活性 （％） Ｔ αＬＴ ＬＴ＋αＬＴ ＴＮＦ αＴＮＦ ＴＮＦ＋αＴＮＦ ＩＦＮ−γ α■ＦＮ−γ ｒＦＮ−γ＋αＩＦＮ− ＡＦ ＭＡＦ÷αＬＴ ＭＡＦ＋αＴＮＦ ＭＡＦ＋αＩＦＮ−γ その結果、ここで用いた抗体は本発明ＭＡＦの活性にな
んら影響を与えず、本発明ＭＡＦと上記既知物質では、
免疫学的性質の異なることが判明した。

なお、本明細書においてペプチド及びアミノ酸の表示は
ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法の略号
ないし当該分野で慣用されているそれに従うものとする
。

〔発明の効果〕

本発明により、新規マクロファージ活性化因子が得られ
たことから、抗菌剤、抗腫瘍剤として医薬への応用が可
能になった。更に、本発明によりマクロファージ活性化
因子の一次構造が判明したことで、遺伝子操作の手法を
用いたマクロファージ活性化因子の大量生産も可能にな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ＭＡＦの等重点電気泳動を行った際の各
分画のｐＨと活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトリンパ球系細胞が産生し、分子量２５，０００
   ±４，０００ダルトン及び等電点ｐＨ６．２±０．５で
   あり、１．６×１０ｂ単位／ｍｇ蛋白質より大きい特異
   活性を有してなることを特徴とするマクロファージ活性
   化因子。 ２、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ
   −Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
   Ｌｙｓ及び、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
   −Ｌｙｓから選ばれた少なくとも一種以上のアミノ酸配
   列を有することを特徴とする請求項１記載のマクロファ
   ージ活性化因子。 ３、ヒトリンパ球系細胞をＰＭＡ及び／又はＣｏｎＡで
   刺激し、培養することを特徴とする請求項１又は２に記
   載のマクロファージ活性化因子の生産方法。 ４、請求項３記載のマクロファージ活性化因子の生産方
   法に従って得た培養上清を、 （１）限外濾過装置等を使用して濃縮し、 （２）（１）の濃縮液をｐＨ６．０〜８．０の条件下で
   強陰イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換
   体に吸着させた後、０．０５〜０．３Ｍの無機塩溶液で
   溶出される分画を集め、 （３）（２）の溶出分画をｐＨ６．０〜８．０の条件下
   で弱陰イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交
   換体に吸着させた後、０．０５〜０．３Ｍの無機塩溶液
   で溶出される分画を集め、 （４）（３）の分画をｐＨ６．０〜８．０の条件下でダ
   イリガントクロマトグラフィー担体と接触させ、有用物
   質を該担体に吸着させた後、０．３〜１．０ｎの無機塩
   溶液で溶出される分画を集め、 （５）（４）の分画を濃縮しゲル濾過担体と接触させ、
   相対溶出位置が１．１２５〜１．３７５の分画を取得し
   、 （６）（５）の溶液をｐＨ６．０〜８．０の条件下で高
   速液体クロマトグラフィーシステムの強陰イオン交換体
   に接触させ、有用物質を吸着させた後、０．１０〜０．
   １２Ｍの無機塩溶液で溶出される分画を集めるという操
   作を行う請求項１又は２に記載のマクロファージ活性化
   因子の精製方法。