JPH01304894A - 組換えヒトインターロイキン‐2の精製方法 - Google Patents

組換えヒトインターロイキン‐2の精製方法

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JPH01304894A
JPH01304894A JP9323589A JP9323589A JPH01304894A JP H01304894 A JPH01304894 A JP H01304894A JP 9323589 A JP9323589 A JP 9323589A JP 9323589 A JP9323589 A JP 9323589A JP H01304894 A JPH01304894 A JP H01304894A
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JP
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extract
guanidine
recombinant human
human
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JP9323589A
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English (en)
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Fazal R Khan
ファザル アール・カーン
Herminia J Umagat
ハーミニア ジェイ・ウマガット
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/55IL-2

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えヒトインターロイキン−2および逆相
液体クロマトグラフィーによる該蛋白質の精製方法に関
するものである。
インターロイキン−2(rL−2) は、リンパ球反応
性の調節および抗原特異性エフェクターニー9フ8球の
長期間インビトロ培養の助成が可能な可溶性蛋白質であ
る。従来、IL−2は、主とじて該蛋白質を合成できる
咄乳類細胞から、このような細胞がマイトゲンにより刺
激を受けた後において、調製されていた。例えば門or
ganら(Science19鉦1007(1976)
 )およびRu5cettiら(J、Immunol。
皿13H1977) )は、フィトヘマグルチニンによ
り刺激を受けた貯留正常ヒトリンパ球からIL−2を回
収し、一方、G11lisら(Nature 268:
154 (1977))は、コンカナバリンAにより刺
激を受けた正常DBA/2マウス牌臓細胞を該蛋白質の
供給源として使用した。更に最近においては、5ter
n  (米国特許第4.490,289号〕は、IL−
2の供給源としての誘導化されたヒト悪性細胞類の使用
を記述している。
組換えDNA法の使用によりIL−2を製造するための
努力もなされてきた。例えば、Taniguchiら(
Nature 302:305(1983) )は、J
urkat白血病細胞株由来のメツセンジャーRNAか
ら調製されたヒトIL−2をコードする相補DNA(c
DNA)のクローニングおよび発現を記述している。T
aniguchiらは、IL−2rDNAのE、col
i中での発現の仕事が進行中であり、かつE、coli
系から大量にIL−2を製造することが近々可能となる
であろうと述べていたが、この著者らによるI L−2
の発現は、培養サルCO8細胞中にて行なわれた。また
、Taniguchi らは、ヒトIL−2をコードす
るcDNAのヌクレオチド配列を開示している。
Rosenberg ら(Science 22赴14
12(1984) )は、Jurkat細胞株から単離
した遺伝子を用いてE、coli中でI L−2を発現
した。更に最近には、5ouzaら〔ヨーロッパ特許誉
開番号第136489号〕は、IL−2のアミノ酸配列
およびその性質を有するポリペプチドをコードする構造
遺伝子を含む化学合成りNA配列の微生物類中でのクロ
ーニングおよび発現を記述している。5ouzaらは、
また、アミノ酸配列が天然I L−2ポリペプチドとは
異なるIL−2ポリペプチド類似体を製造する合成遺伝
子類の使用を開示している。5ouzaらの特許出願中
に与えられた実施”例においては、E、coliが宿主
生物である。゛ 組換えヒトI L−2が、E、coli中ヤ発現される
場合、それは一般に不溶性凝集体の形態で生成される。
該IL−2は、これらの凝集体(封入体と称される)か
ら抽出され、次いで何らかの方法で精製されなければな
らない。Weirら(J、Chrom’atogr。
別虹209 (1987))は、このようなI L−2
を精製するために、ゲル口過クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーおよび逆相高性能液体クロマ
トグラフィー(HPLC)の組合せを使用した。
Ko thsら〔米国特許第4.569,790号〕は
、細菌の溶解物から還元剤の存在下、可溶化剤により不
溶性分画を抽出し、次いで再酸化工程の後にゲル口過も
しくは逆相HPLCまたはこれら2つの組合せによって
、細菌から組換えIL−2を精製した。使用された可溶
化剤は、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(SOS)
またはラウリルサルコシンナトリウムであった。
本発明は、組換えヒ)IL−2を含む細菌細胞の抽出物
を均質に精製する方法を提供するもので、直列的な2つ
のカラムの逆相液体クロマトグラフィー系を用いること
を特徴とするものである。
本発明の好適な実施態様において、組換えヒトIL−2
は、以下を含む方法により精製される:(a)  組換
えヒトIL−2の発現を支配することができるベクター
を含有する、培養された細菌細胞を破壊して、該I L
−2を含有する細菌細胞溶解物を生成し; (b)  該細菌細胞溶解物から不溶性分画を単離し;
(c)  該細菌細胞溶解物から単離された該不溶性分
画を、約4から7Mグアニジン−o c 1?8液を用
いて抽出して、IL−2含有抽出物を得;(cI)  
該I L−2含有抽出物をグアニジン−HCl非含有緩
衝液により約10から約1 、000倍に希釈し;(e
)  該希釈IL−2含有抽出物を、第1の逆相液体ク
ロマトグラフィーカラムにかけ、これにより該I L−
2は、該第1のカラムに保持され;(f)  該I L
−2を該第1のカラムから増加するアセトニトリル勾配
により溶出し、かつIL−2含有分画を貯留し; (g)  8g第1のカラムからの該貯留IL−2分画
を第2の逆相液体クロマトグラフィーカラムにかけ、こ
れにより該I L−2は、該第2のカラムに保持され;
および (h)  該I L−2を該第2のカラムから増加する
アセトニトリル勾配により溶出し、かつrL−2含有分
画を貯留する。
該グアニジン−HCI非含有緩衝液は、生物学系におい
て使用するのに適したものであればいかなる緩衝液でも
よい。多くのこのような緩衝液が当業者に知られている
。このような緩衝液の例は、トリス (ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン(トリス)を含有する緩衝液である。
最も好ましくは、IL−2含有抽出物は、0.OIM 
)リス−〇CI (p H7,9)、0.035M N
aC1のようなグアニジン−HCl非含有緩衝液により
約40倍に希釈される。
本発明の他の好適な実施態様において、上記抽出工程(
c)は、工程(b)の該単離された不溶性分画を約1.
75Mグアニジン−HClを含む溶液により抽出し、該
抽出物を廃棄することを含む工程により行なわれる。
本発明の更に他の好適な実施態様において、上記工程(
d)の該希釈1t、−2含有抽出物は、該第1の逆相カ
ラムにかける以前に、約4時間から約2日間の範囲の期
間、約2から8℃にて保持される。
好ましくは、該抽出物は、約8ないし24時間保持され
る。
更に他の実施態様において、上記第2の逆相カラムから
の貯留I L−2は、カルボキシメチルイオン交換カラ
ムにおけるクロマトグラフィーにより、アセトニトリル
およびエンドトキシンを除去するために更に精製される
本発明は、以下の詳細な記述および次の図面を参照する
ことにより更に容易に理解されるであろう。ここで: 第1図は、組換えヒ)IL−2の精製に対する第1の逆
相液体クロマトグラフィーカラムからの溶出のプロフィ
ールであり、280nmにおける吸光度を、時間および
該蛋白質の溶出に用いた緩衝液/アセトニトリルの段階
的勾配の関数として示している。該I L−2を含むピ
ークは、両端の矢印で示しである。
第2図は、組換えヒトIL−2の精製に対する第2の逆
相カラムからの溶出のプロフィールであり、280nm
における吸光度を、時間および該蛋白質の溶出に用いた
緩衝液/アセトニトリル勾配の関数として示しである。
該IL−2は、第1図に示された精製工程から得られた
貯留I L−2含有分画の形態で酸カラムにかけられた
第3図は、ヒ)IL−2産生E、coli細胞からの不
純抽出物由来の試料(レーン1)、第1図に示された精
製工程から回収された貯留I L−2含有分画由来の試
料(レーン2)および第2図に示された精製工程から回
収された貯留IL−2含有分画由来の試料についてのS
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。同じ
ゲル系内にかけられたI L−2バンドの位置および標
準分子量マーカー蛋白質の位置が示されている。マーカ
ー蛋白質の分子量は、キロダルトン(KD)により示さ
れており、ここでIKD=1,000ダルトンである。
本発明は、直列的な2つのカラムの逆相液体クロマトグ
ラフィー系を使用することにより、組換えヒトIL−2
の優れた精製を達成する。この系を用いて得られた該I
L−2は、SOSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
および分析用逆相HP L Cにおいて均質である。本
発明のクロマトグラフィー系は、ダラム量の蛋白質が精
製できること、ならびに該系が反復クロマトグラフィー
およびカラムの循環処理についての自動化が容易である
ことにおいて優れている。
ここで使用されているように“組換えヒトIL−2”な
る用語は、ヒトIL−2遺伝子、または天然のヒトIL
−2のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同等であり、
かつ天然のヒトI L−2と同等な生物学的活性を有す
るアミノ酸配列を持った蛋白質をコードしているこのよ
うな遺伝子の修飾物を含有する微生物により産生される
非グリコジル化蛋白質を意味している。アミノ酸配列の
実質的な同等性は、IL−2蛋白質の生物学的活性に実
質的に逆行する効果を有することなく天然のヒ)IL−
2のアミノ酸配列とは1個またはそれ以上のアミノ酸が
削除、追加および/または置換によって異なっている修
飾遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を意味す
る。
ヒトIL−2を含む微生物、例えば細菌は、ヒトI L
−2遺伝子が発現制御配列に機能的に結合された組換え
ベクターまたはプラスミドを含む微生物類である。この
ような微生物類は、該ヒ1−IL−2遺伝子を発現する
ことができる。それらは、当分野でよく知られた方法、
例えばそのような組換えベクターまたはプラスミドを用
いた形質転換によって得られる。該微生物類は、当分野
でよく知られた方法を用いて適切な培地中で生育するこ
とができる。充分な量の細胞が蓄積された後には、該細
胞を培地から、例えば遠心分離により分離することがで
きる。このようにして得られた微生物を濃縮された形態
で含む細胞ペーストは、細胞破壊に適している。
組換えI L−2を産生ずる該微生物類は、当分野で通
常に採用されている方法、例えば超音波処理、フレンチ
プレッシャーセルもしくはガラリン(Gaul in)
ホモジナイザー破壊(APV Gaulin、 Eve
rettMassachusetts、 U、S、A、
)、または、他の機械的手段(charmらのMeth
、Enz)+mo1.22,476−556(1971
) )、浸透性ショックあるいは反復的な凍結および解
凍等により破壊することができる。このような破壊の主
な目的は、次に続く抽出および可溶化工程を容易にする
ことにある。必要であれば、破壊に先立って、フェニル
メチルスルフォニルフルオライド等のプロテアーゼ阻害
剤を細胞ペーストに加えておくこともできる。
破壊に続き、細胞溶解物の不溶性分画が可溶性成分から
単離される。この単離は、該溶解物を約s、oooから
約12.000X gにおいて約1時間遠心分離するこ
とにより、好適に行なうことができる。
好ましくは、不溶性分画の単離の問および後の精製工程
の間、温度は約2−8 ’Cに保たれる。
該細胞溶解物の不溶性分画の抽出は、2つの工程におい
て実施することができる。第1の工程においては、はと
んどのI L−2を不溶性物質中に残したまま、組換え
IL−2以外の細菌性蛋白質が抽出される。この抽出は
、約1.75から2Mのグアニジン−HClの溶液を用
いることにより行なわれる。
該抽出工程の間、振とうまたは撹拌等の機械的揺動を加
えることが好ましい。先行する抽出工程においても不純
性細菌性蛋白質を除去することから、このような工程も
また、約pH8の緩衝液を用いて実施することができる
。いかなる場合においても、このような工程からの可溶
性抽出物は、廃棄される。
該IL−2のほとんどを含む残留不溶性物質は、次いで
約4から7Mのグアニジン−〇CI、好ましくは7Mグ
アニジン−HCl溶液により抽出される。このような方
法により得られた該抽出物は、グアニジン−HCI非含
有緩衝液により約10から約1 、000倍に希釈され
る。下記の実施例においては、10mM トリス−HC
l、  0.035M NaC1,pH7,9を含む緩
衝液が使用されたが、同様ないかなる緩衝液も適用可能
である。
該抽出物の希釈に続いて、不純性蛋白質を主に含む柔毛
様物質が保持操作において発生する。この物質の量は、
希釈後2日までは時間と共に増加する。該柔毛性物質は
、遠心分離または口過により除去され、廃棄される。こ
の方法において、不純性蛋白質は、I L−2の損失を
ほとんどまたは全く伴わずに除去される。該希釈抽出物
は、ここで、更に精製する前に、好ましくは2−8℃に
て4時間から約2日間保持される。
逆相クロマトグラフィーは、適当な担持担体に対して結
合されたアルキル鎖を含む樹脂を使用して行なわれる。
好適なカラム材料は、商品となっている。好ましいカラ
ム材料は、VYDAC(Hesperia。
Ca1ifornia、 U、S、八、)のC4および
C18シリカ担持材料である。これらの材料は、平均粒
径10から30μmに分類されている250−300オ
ングストロームの細孔直径のシリカ粒子の表面にシロキ
サン(シリコン−酸素−シリコン)結合により共有的に
結合されているブチルまたはオクタデシルシラン基を含
んでいる。
該希釈IL−2含有抽出物の精製は、2つの逆相クロマ
トグラフィーカラムを使用して行なわれる。
好ましくは、第1のカラムは、より低い背圧とより大き
い流速とを生むためにより大きい20−30μmの粒子
サイズの担持材料を収容している。第2のカラムは、よ
り高い分解能のために、10−20μmの粒子サイズを
有するより細かい担持材料を収容している。
該希釈IL−2含有抽出物を第1のカラムにかけるのに
先立って、該抽出物は、好ましくは酢酸等の適切な酸を
用いて酸性化される。該抽出物のpHは約3.5が好ま
しい。本質的ではないが、該希釈抽出物は、また、第1
の逆相カラムへかける前に、限外口過により約10倍に
濃縮されることも−できる。
該カラムからの蛋白質類の溶出は、当分野においてよく
知られた方法により行なわれる。例えば、増加するアセ
トニトリルの線形、凹状または凸状の勾配を使用するこ
とができる。好ましくは、以下においてより完全に説明
するように段階的勾配が使用される。このような段階的
勾配の利点は、自動化プログラム操作に容易に適用し得
ることにある。このような操作を通して、比較的大量の
I L−2が、循環的なカラムの平衡化および再生、試
料の適用および溶出を経て製造され得る。
該カラムからの蛋白質類の溶出は、公知の検出方法によ
り都合よく監視することができる。例えば、5tein
ら[Methods in Enzymology 7
8:435(1981)]により記述された方法等の自
動化ケイ光検出系を採用することができる。好ましくは
、280ナノメータにおける紫外吸収の監視等の非破壊
的方法が使用される。好ましい自動化UV吸収検出器は
、Waters Associates(Milfor
d、Massachusetts。
U、S、A、)から入手可能である。
溶出物中のI L−2の存在は、分画分別物の標準I 
L−2バイオアツセイまたは、好ましくは既知I L−
2を標準として用いる分析的HPLCにより監視するこ
とができる。
本発明に従って逆相クロマトグラフィー工程を2工程に
て実施することにより、分析的逆相HPLCにより、お
よびSOSポリアクリルアミドゲル電気泳動により示さ
れるように組換えヒトI L−2が微生物から均質に精
製された。このようなI L−2の均質性は、該逆相カ
ラムからIL−2に近接して溶出する不純性蛋白質類の
ピークがある場合においても一定の手順において達成さ
れた。
Kothsら〔米国特許筒4,569,790号〕は、
本発明において使用される逆相カラムは、また、細菌性
エンドトキシン不純物を効果的に除去し得ることを示し
た。しかしながら、いくらかのエンドトキシン不純物が
、精製I L−2中に存在することもあり得る。さらに
、該IL−2貯留物中には、アセトニI−IJルが存在
し得る。これら両不純物は、当分野において知られてい
る方法により除去し得る。
例えば、それらは5ephadex@G−50(Pha
rmacia。
Uppsala、 Sweden)中でのゲル口過クロ
マトグラフィーにより除去し得る。別法として、好まし
くは逆相クロマトグラフィーの後に、精製I L−2中
に残ったいかなるエンドトキシンおよびアセトニトリル
も、カルボキシメチル樹脂中でのイオン交換クロマトグ
ラフィーにより除去される。CM−Fractogel
@ (東洋曹達、東京、日本)が好適であるが、カルボ
キシメチルセルローズまたは、他のカルボキシメチル−
置換樹脂がこの目的の為に使用可能である。該IL−2
は、このようなカラムから標準的方法により溶出される
所望により、生物活性の損失に対して精製IL−2を安
定化するために、該蛋白質にマンニトールを加えること
ができる。この目的のため、マンニトールは、約1から
50■/ mlの濃度において使用される。約5■/ 
mlの濃度が好ましい。
本発明の方法により製造される組換えヒトIL−2の総
画収率は、回収された全抽出IL−2蛋白質について、
通常、約45から約60パーセントまでの範囲にある。
該精製IL−2の比生物活性は、典型的には、蛋白質ミ
リグラムあたり、約1.6X10’活性単位である。
〔実施例〕
本発明の方法を更に以下の実施例によって説明する。
二五I冗柾汰 IL−2のバイオアッセーをG11lisらのJ、 I
mmunol。
120:2027(197B)中に述べられた方法の比
色修飾を用いて行なった。このアッセーにおいて、CT
LL細胞を、ターゲット細胞として使用した。CTLL
細胞は、生育においてIL−2依存性のマウス細胞毒性
リンパ様細胞系の細胞である(Gillisら、J、E
xp。
Med、皿468(1977)) 、CTLL細胞は、
寄託番号^TCCTIB 214(cTLL−2)のも
とにAmerican Type Cu1tureCo
llection、12301 Parklawn D
rive、Rockville。
MarylancL (1,S、A、からまたはImm
unex Corp、5eattle。
Washington、U、S、A、から入手可能であ
る。細胞を、5%(vol/vol)の牛胎児血清、2
5mM HEPES緩衝液、50ug/m1のゲンタマ
イシン(Schering/ PloughInc、+
B1oomfield+New Jersey+U、S
、A、)および200単位/dの粗ヒトIL−2が追加
されたRPMI−1640培地(Gibco Labo
ratories、Grand l5land+ Ne
wYork、U、S、A、)中で保持した。
I L−2バイオアツセーのために、CTLL細胞を、
ベックマン モデルJ−68遠心分離器(Beckma
nInstruments、Inc、+Pa1o Al
to+Ca1ifornia、U、S、A、)中、50
0Xgで10分間沈澱させることによって!L−2含有
の保存培地から除去し、IL−2非含有HB101培地
(Hana Biologicals、 Berkel
ey、 Ca1if。
rnia、U、S、A、)中で2回洗浄した。細胞を、
50 u g/雁のゲンタマイシンが追加されたHBI
OI培地中に再懸濁し、2X10’細胞/dの濃度に調
整した。
測定されるべき試料を半分の領域のマイクロタイタープ
レー) (costar Nα3696)中の列の第一
の穴中のHBIOI中に希釈させて0.1 dの最終容
量にした。引続く列の穴には、0.051n1のHBI
OI培地が含まれていた。2倍希釈の試料を、0.05
dの分別量を末端の穴まで順次移すことによって調製し
た。
IL−2非含有0.05dの培地で満たしたいくつかの
穴を、負の対照として供した。全部の穴に0.05dの
細胞懸濁液を植えた。直ちにプレートを合成樹脂のふた
でおおい、空気中に5%のCO!を含有する加湿室中、
37゛Cで20時間培養した。
バイオアッセーは、刺激された細胞によるグルコース代
謝の最終生成物として生じた乳酸(LA)の比色測定に
基づいている。LAのこの比色測定のための試薬類は、
シグマ社(Sigma Chemical Co、+S
t、Louis、Missouri、U、S、A、)か
ら入手したものである。溶液Aは、pH9,2の0.6
 Mのグリシン、80mMのヒドラジン緩衝液中に、1
.6mg/dのβ−ニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドおよび0.3%(wt/vol)のゼチランを
含有していた。溶液Bは、水中に、166単位/dの乳
酸デヒドロゲナーゼ、0.5■/!nItのP−ヨード
ニトロテトラゾリウム バイオレット、および0.03
■/Idのフェナジン メトスルフェートを含有してい
た。リン酸緩衝液中に希釈されたLAの標準溶液が、測
定のための正の対象として供された。0.35Hの1(
cIの溶液が、反応を停止するために使用された。個々
の穴に0.5 dの溶液Aを含む96−穴のマイクロタ
イター プレートが、バイオロジカル アッセー マイ
クロタイター プレートの対応する穴から得られた0、
015dの試料中のLAの量を測定するための反応プレ
ートとして使用された。
反応プレートの個々の穴に0.05−の溶液Bを追 ・
加して反応を開始した。テトラゾリーム染料の還元のた
めに充分な時間が経過した後、個々の穴に0.05dの
HCI溶液を添加することによって反応を停止させた。
次いで個々の穴中の反応溶液中の550nmにおける光
学密度を、マイクロプレート分光測光器を用いて測定し
た。
IL−2活性の単位は、アッセーにおける最大応答の半
値を生ずるI L−2の量として定義される。
I L−24度は、50%のエンドポイントの穴中の希
釈度の逆数として計算される。ナショナル インスティ
チュート オブ、ヘルス ビューロー オブ バイオロ
ジカル レスポンス モデファイアーズ(Nation
al   In5titutes  of  Heal
th  Bureau  ofBiological 
Re5ponse Modifiers(BRMP))
参考試薬ヒトI L−2(Jurkat)材料を、標準
として使用した。
カラム分画を、スペクトラ フィジックス社(Spec
tra Physics)のモデルsp 8700溶媒
搬送システムおよび280nmにセットしたウォーター
ズモデル440吸光測定器(Waters As5oc
iates、Milford。
Massachusetts、 U、S、A、)を使用
して分析用HPLCによって分析した。カラムは、C4
担持材料を含んでおり4.6 nmm直径X15c長長
床寸法を持っていた。
カラムを、緩衝液(0,OIMのリン酸、0.4Mのグ
アニジン−HCl、 0.05Mの塩化リチウム、pH
2,5)とアセトニトリルとの95 : 5(vol/
vol)の混合溶液を用いて平衡化させた。
試料を適用した後、蛋白質を、増加するアセトニトリル
の以下の勾配を用い、ld/分の流速で、段階的に溶出
させた: 95:5      0−3 50:50      6−12 35 : 65      15−253−6および1
2−25分の間隔中、アセトニトリルの濃度が、直線勾
配によって示されたレベルまで増加した。
試料中のI L−2の濃度を、I L−2ピークの積分
面積と同一の条件下でクロマトグラフされた既知のIL
−2標準試料によってもたらせられたピークの積分面積
とを比較することによって測定した。
ドデシル硫酸ナトリウム(SOS)ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動分析を、Laemmli (Nature
 22互680(1970) )の方法を使用して行な
った。ゲルを、クマシーブリリアントプルー染料または
銀着色剤(Switzer らのAnal、Bioch
em、 98:23H1979))のいずれかを使用し
て染色した。
±L−2優漣■ 組換えヒトI L−2を、発現プラスミドpRC233
/IL−2/Δtetにより形質転換したE、coli
細胞中に生成させた。該プラスミドおよびその構築のた
めの方法は、JuらのJ、Bfol、Chem、262
:5723(1987)中に詳細に述べられており、こ
こに参考のために加える。ヒトIL〜2を発現しうるい
かなる他の公知の発現プラスミドにより形質転換したE
、coliも使用することができる。該プラスミドを含
む形質転換体を標準条件下で培養させた。
形質転換E、coli細胞のペーストを、5mMのエチ
レンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を含有する30m
Mのトリス−HCl (p H8,0)中に均一に懸濁
させ〔緩衝液A、31ni/Hの細胞ペースト]、2−
8℃で撹拌した。懸濁?夜を、約7,000psi(4
,8X10’パスカルに近似)で、2回または3回ガウ
リンホモジナイザーに該ホモジナイザーの出口温度を、
冷却コイルを使用して2−8℃に保持しつつ、通過させ
た。
細胞溶解物を、GSAローターを有するツルパル(So
rvall)RC−5B遠心分離器(Dupont、W
ilmington。
Delaware、 Ll、S、A、)中、12.0O
OX gで15=30分間遠心分離し、可溶性蛋白質を
含有している上澄液を1舎でた。ペレットを、緩衝液A
中に懸濁させ(1m1/gの細胞ペースト)、約4℃で
30−60分間撹拌した。前記と同様に遠心分離の後、
上澄液を捨てた。
前記と同様にしてペレットを1.75Mのグアニジン−
HCl中に懸濁させ(1−2mg/g細胞ペースト)、
2−8 ’Cで30−40分間混合した。上澄液を捨て
、更にペレットを7Mのグアニジン−HCl中に懸濁さ
せ(2,5m/g細胞ヘースト)、2−8℃テロ0−9
0分間撹拌した。前記と同様に抽出物を遠心分離し、更
に得られた上澄液を、抽出希釈緩衝液(0,OIMのト
リス−17CI (p H7,9)、0.035MのN
aC1〕を使用して40倍に希釈し、更に約4℃で24
時間放置した。
該溶液を放置している間、柔毛性の破片が発生した。希
釈された上澄液を、沈澱した柔毛性の破片から注意深く
傾瀉し、次いで2.5および1.2μmフィルターを通
して口過し、その後に、ミリボアーベリコン系(Mil
lipore−Pellicon system)(M
illipore、 Bedford、 Massac
husetts+ U、S、A、)中で10倍に濃縮し
た。
工・−12クロマトブーツ − VYDACC4またはC18樹脂(250−300オン
グストロームの細孔サイズ、20−30μmの粒径)で
10cmの高さの床に充填された18cm (内径)の
カラムを緩衝液(0,OIMのリン酸、0.4Mのグア
ニジン−HCl。
0.05Mの塩化リチウム、pH2,5)およびアセト
ニトリルの95 : 5(vol/vol)混合液で平
衡化させた。
口過されたI L−2の抽出物のpHを、酢酸で3.5
に調整した。引続き、1gの蛋白質を含有する量の抽出
物を、カラム材料の上にポンプで送った。
蛋白質を、増加するアセトニトリルの以下の段階勾配を
用い、400d/分の流速でカラムから溶出させた。
95:5         0−18 30ニア0        、 32−45カラム溶出
液を、280nmの波長において監視した。3I!、の
分画を集め、次いで前記したと同様にHPLCで分析し
た。IL−2を含有する分画(第1図中の溶出プロフィ
ール参照)を貯留し、次いで更にI L−2の精製に使
用した。第1のカラムからのIL−2蛋白質の総回収率
は、75%であった。
前記調製用HPLCカラムからのIL−2貯留物を、−
70℃に冷却することによってその有機相と水相とに分
離させた。約400■の蛋白質を含有する体積の水相を
、VYDACC18樹脂(300オングストロームの細
孔サイズ、10−20μmの粒径)で25cmの高さの
床に充填された5cm(内径)のIIPLcカラムにか
けた。このカラムは、あらかじめ緩衝液(0,01Mの
リン酸、0.05Mの塩化リチウムおよび0.4Mのグ
アニジン−HCl、、p H2,5)およびアセトニト
リルの80 i 20(vol/vol)混合液で平衡
化されていた。
蛋白質を、増加するアセトニトリルの以下の段階勾配を
用い、80d/分の流速でカラムから溶出させた。
80 : 20      0−5 50 : 50      10−2040 : 60
      25−405−IOおよび20−25分の
間隔中、アセトニトリルの濃度が、直線勾配によって示
されたレベルまで増加した。
カラム溶出液を、280nmの波長において監視し、約
450 dの分画を集め、更に前記したと同様にHPL
Cによって分析した。IL−2を含有する分画を貯留し
た(第2図参照)。
これおよび以前の調製用逆相カラムからのIL−2貯留
物の分別物を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析に付し、結果を第3図中に示した。
レーン1−3は、それぞれ第1回目の逆相カラムにかけ
る前の粗E、coli抽出物からの試料、第1番目のカ
ラムからのIL−2貯留物からの試料および第2番目の
カラムからのIL−2貯留物からの試料を含有していた
。約20ugのLL−2がそれぞれのレーン中に存在し
ていた。
第3図から分かる様に、第2番目のカラムからのIL−
2は、SDSゲル中に単一の蛋白質のバンドとして移動
した。
第2番目のカラムからのI L−2蛋白質の総回収率は
、62%であった。
セ ニ )ル゛よびエン゛ キシンの、第2番目の調製
用逆相カラムからのI L−2貯留物を、−70℃で相
分離し、液相を、0.05Mの酢酸ナトリウム(pH3
,5)および50■/dのマンニトールを含有する緩衝
液で5倍に希釈した。次いで希釈されたI L−2を、
あらかじめ希釈緩衝液で平衡化されたけ一フラクトゲル
(商標)カラム(10cm幅、34cm高)にかけた。
カラム材料上にI L−2が負荷させた後、カラムを、
5床容量の希釈緩衝液で洗浄した。次いで結合したIL
−2を、0.05Mの酢酸ナトリウム(pH3、5) 
、50mg/ mlのマンニトールおよび0.2 Mの
NaClを含有する緩衝液を用いてカラムから溶離させ
た。カラムを50d/分の流速で稼働させ、2,700
雁の分画を集めた。カラム溶出液の吸光度を280nm
の波長で監視した。回収された蛋白質のピークを貯留し
た。
T L−2を含有する貯留分画を、2−8℃で、5.0
00ダルトンの分子量をしゃ断するYM5フィルター(
Amicon、Div、W、R,Grace & Co
、、Danvers、Massachusetts、 
U、S、A、から入手可能)を使用する限外口過によっ
て5−10■/−の最終蛋白質濃度に濃縮させた。濃縮
された蛋白質溶液を、5(bnMの酢酸ナトリウム(p
H3,5)および5■/dマンニトールを含有する緩衝
液に対してdiafiltered した。
最終のエンドトキシンを含まないI L−2のバイオア
ッセイは、IL−2の比活性が1.6X10’活性単位
/■蛋白であったことを示した。
当業者には自明なように、本発明の精神および範囲を離
れることなくその多くの修飾および変形が可能である。
ここに記述された特定の実施態様は、例示のためにのみ
提供されたものであり、本発明は添付された特許請求の
範囲の文言によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明における第1のカラムからの溶出の概
要を示す図、第2図は、本発明における第2のカラムか
らの溶出の概要を示す図、第3図は、本発明の各工程に
おける試料の電気泳動による分析結果を示す図である。 出願人 エフ・ホフマン・う・ロシュ・ラント・コンパ
ニー・アクチェンゲゼルシャフト代理人 弁理士 平 
木 祐 輔 rlL−2− KD =−−94 舗−−1− 一一一

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、(a)組換えヒトIL−2の発現を支配することが
    できるベクターを含有する、培養された細菌細胞を破壊
    して、該IL−2を含有する細菌細胞溶解物を生成し; (b)該細菌細胞溶解物から不溶性分画を単離し; (c)該細菌細胞溶解物から単離された該不溶性分画を
    、約4から7Mグアニジン−HCl溶液を用いて抽出し
    て、IL−2含有抽出物を得;(d)該IL−2含有抽
    出物をグアニジン−HCI非含有緩衝液により約10か
    ら約1,000倍に希釈し;(e)該希釈IL−2含有
    抽出物を、第1の逆相液体クロマトグラフィーカラムに
    かけ、これにより該IL−2は、該第1のカラムに保持
    され;(f)該IL−2を該第1のカラムから増加する
    アセトニトリル勾配により溶出し、かつIL−2含有分
    画を貯留し; (g)該第1のカラムからの該貯留IL−2含有分画を
    第2の逆相液体クロマトグラフィーカラムにかけ、これ
    により該IL−2は、該第2のカラムに保持され;およ
    び (h)該IL−2を該第2のカラムから増加するアセト
    ニトリル勾配により溶出し、かつIL−2含有分画を貯
    留することからなることを特徴とする組換えヒトIL−
    2の精製方法。 2、該IL−2含有抽出物が、該グアニジン−HCl非
    含有緩衝液により約40倍に希釈されることを特徴とす
    る請求項1に記載の方法。 3、抽出工程(c)が、該単離された不溶性分画を約1
    .75Mグアニジン−HClを含む溶液により抽出し、
    抽出物を廃棄することを含む工程により行なわれること
    を特徴とする請求項1または2に記載の方法。 4、工程(d)における該希釈IL−2含有抽出物が該
    第1のカラムにかける以前に約4時間から約2日間の範
    囲の期間、約2から8℃にて保持されることを特徴とす
    る請求項1ないし3のいずれかに記載の方法。 5、該希釈IL−2含有抽出物が約8ないし24時間の
    期間保持されることを特徴とする請求項4に記載の方法
    。 6、該第2のカラムからの該貯留IL−2が、カルボキ
    シメチルイオン交換カラムにおけるクロマトグラフィー
    により、アセトニトリルおよびエンドトキシンを除去す
    べく更に精製される請求項1ないし5のいずれかに記載
    の方法。 7、請求項1ないし6のいずれかに記載の方法により調
    製された組換えヒトIL−2。
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