JPH01304894A - 組換えヒトインターロイキン‐２の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えヒトインターロイキン−２および逆相
液体クロマトグラフィーによる該蛋白質の精製方法に関
するものである。

インターロイキン−２（ｒＬ−２）　は、リンパ球反応
性の調節および抗原特異性エフェクターニー９フ８球の
長期間インビトロ培養の助成が可能な可溶性蛋白質であ
る。従来、ＩＬ−２は、主とじて該蛋白質を合成できる
咄乳類細胞から、このような細胞がマイトゲンにより刺
激を受けた後において、調製されていた。例えば門ｏｒ
ｇａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９鉦１００７（１９７６）
　）およびＲｕ５ｃｅｔｔｉら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

皿１３Ｈ１９７７）　）は、フィトヘマグルチニンによ
り刺激を受けた貯留正常ヒトリンパ球からＩＬ−２を回
収し、一方、Ｇ１１ｌｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ　２６８：
１５４　（１９７７））は、コンカナバリンＡにより刺
激を受けた正常ＤＢＡ／２マウス牌臓細胞を該蛋白質の
供給源として使用した。更に最近においては、５ｔｅｒ
ｎ　　（米国特許第４．４９０，２８９号〕は、ＩＬ−
２の供給源としての誘導化されたヒト悪性細胞類の使用
を記述している。

組換えＤＮＡ法の使用によりＩＬ−２を製造するための
努力もなされてきた。例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（
Ｎａｔｕｒｅ　３０２：３０５（１９８３）　）は、Ｊ
ｕｒｋａｔ白血病細胞株由来のメツセンジャーＲＮＡか
ら調製されたヒトＩＬ−２をコードする相補ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）のクローニングおよび発現を記述している。Ｔ
ａｎｉｇｕｃｈｉらは、ＩＬ−２ｒＤＮＡのＥ、ｃｏｌ
ｉ中での発現の仕事が進行中であり、かつＥ、ｃｏｌｉ
系から大量にＩＬ−２を製造することが近々可能となる
であろうと述べていたが、この著者らによるＩ　Ｌ−２
の発現は、培養サルＣＯ８細胞中にて行なわれた。また
、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　らは、ヒトＩＬ−２をコードす
るｃＤＮＡのヌクレオチド配列を開示している。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２赴１４
１２（１９８４）　）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞株から単離
した遺伝子を用いてＥ、ｃｏｌｉ中でＩ　Ｌ−２を発現
した。更に最近には、５ｏｕｚａら〔ヨーロッパ特許誉
開番号第１３６４８９号〕は、ＩＬ−２のアミノ酸配列
およびその性質を有するポリペプチドをコードする構造
遺伝子を含む化学合成りＮＡ配列の微生物類中でのクロ
ーニングおよび発現を記述している。５ｏｕｚａらは、
また、アミノ酸配列が天然Ｉ　Ｌ−２ポリペプチドとは
異なるＩＬ−２ポリペプチド類似体を製造する合成遺伝
子類の使用を開示している。５ｏｕｚａらの特許出願中
に与えられた実施”例においては、Ｅ、ｃｏｌｉが宿主
生物である。゛ 組換えヒトＩ　Ｌ−２が、Ｅ、ｃｏｌｉ中ヤ発現される
場合、それは一般に不溶性凝集体の形態で生成される。

該ＩＬ−２は、これらの凝集体（封入体と称される）か
ら抽出され、次いで何らかの方法で精製されなければな
らない。Ｗｅｉｒら（Ｊ、Ｃｈｒｏｍ’ａｔｏｇｒ。

別虹２０９　（１９８７））は、このようなＩ　Ｌ−２
を精製するために、ゲル口過クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーおよび逆相高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）の組合せを使用した。

Ｋｏ　ｔｈｓら〔米国特許第４．５６９，７９０号〕は
、細菌の溶解物から還元剤の存在下、可溶化剤により不
溶性分画を抽出し、次いで再酸化工程の後にゲル口過も
しくは逆相ＨＰＬＣまたはこれら２つの組合せによって
、細菌から組換えＩＬ−２を精製した。使用された可溶
化剤は、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）
またはラウリルサルコシンナトリウムであった。

本発明は、組換えヒ）ＩＬ−２を含む細菌細胞の抽出物
を均質に精製する方法を提供するもので、直列的な２つ
のカラムの逆相液体クロマトグラフィー系を用いること
を特徴とするものである。

本発明の好適な実施態様において、組換えヒトＩＬ−２
は、以下を含む方法により精製される：（ａ）　　組換
えヒトＩＬ−２の発現を支配することができるベクター
を含有する、培養された細菌細胞を破壊して、該Ｉ　Ｌ
−２を含有する細菌細胞溶解物を生成し； （ｂ）　　該細菌細胞溶解物から不溶性分画を単離し；
（ｃ）　　該細菌細胞溶解物から単離された該不溶性分
画を、約４から７Ｍグアニジン−ｏ　ｃ　１？８液を用
いて抽出して、ＩＬ−２含有抽出物を得；（ｃＩ）　　
該Ｉ　Ｌ−２含有抽出物をグアニジン−ＨＣｌ非含有緩
衝液により約１０から約１　、０００倍に希釈し；（ｅ
）　　該希釈ＩＬ−２含有抽出物を、第１の逆相液体ク
ロマトグラフィーカラムにかけ、これにより該Ｉ　Ｌ−
２は、該第１のカラムに保持され；（ｆ）　　該Ｉ　Ｌ
−２を該第１のカラムから増加するアセトニトリル勾配
により溶出し、かつＩＬ−２含有分画を貯留し； （ｇ）　　８ｇ第１のカラムからの該貯留ＩＬ−２分画
を第２の逆相液体クロマトグラフィーカラムにかけ、こ
れにより該Ｉ　Ｌ−２は、該第２のカラムに保持され；
および （ｈ）　　該Ｉ　Ｌ−２を該第２のカラムから増加する
アセトニトリル勾配により溶出し、かつｒＬ−２含有分
画を貯留する。

該グアニジン−ＨＣＩ非含有緩衝液は、生物学系におい
て使用するのに適したものであればいかなる緩衝液でも
よい。多くのこのような緩衝液が当業者に知られている
。このような緩衝液の例は、トリス　（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（トリス）を含有する緩衝液である。

最も好ましくは、ＩＬ−２含有抽出物は、０．ＯＩＭ　
）リス−〇ＣＩ　（ｐ　Ｈ７，９）、０．０３５Ｍ　Ｎ
ａＣ１のようなグアニジン−ＨＣｌ非含有緩衝液により
約４０倍に希釈される。

本発明の他の好適な実施態様において、上記抽出工程（
ｃ）は、工程（ｂ）の該単離された不溶性分画を約１．
７５Ｍグアニジン−ＨＣｌを含む溶液により抽出し、該
抽出物を廃棄することを含む工程により行なわれる。

本発明の更に他の好適な実施態様において、上記工程（
ｄ）の該希釈１ｔ、−２含有抽出物は、該第１の逆相カ
ラムにかける以前に、約４時間から約２日間の範囲の期
間、約２から８℃にて保持される。

好ましくは、該抽出物は、約８ないし２４時間保持され
る。

更に他の実施態様において、上記第２の逆相カラムから
の貯留Ｉ　Ｌ−２は、カルボキシメチルイオン交換カラ
ムにおけるクロマトグラフィーにより、アセトニトリル
およびエンドトキシンを除去するために更に精製される
。

本発明は、以下の詳細な記述および次の図面を参照する
ことにより更に容易に理解されるであろう。ここで： 第１図は、組換えヒ）ＩＬ−２の精製に対する第１の逆
相液体クロマトグラフィーカラムからの溶出のプロフィ
ールであり、２８０ｎｍにおける吸光度を、時間および
該蛋白質の溶出に用いた緩衝液／アセトニトリルの段階
的勾配の関数として示している。該Ｉ　Ｌ−２を含むピ
ークは、両端の矢印で示しである。

第２図は、組換えヒトＩＬ−２の精製に対する第２の逆
相カラムからの溶出のプロフィールであり、２８０ｎｍ
における吸光度を、時間および該蛋白質の溶出に用いた
緩衝液／アセトニトリル勾配の関数として示しである。

該ＩＬ−２は、第１図に示された精製工程から得られた
貯留Ｉ　Ｌ−２含有分画の形態で酸カラムにかけられた
。

第３図は、ヒ）ＩＬ−２産生Ｅ、ｃｏｌｉ細胞からの不
純抽出物由来の試料（レーン１）、第１図に示された精
製工程から回収された貯留Ｉ　Ｌ−２含有分画由来の試
料（レーン２）および第２図に示された精製工程から回
収された貯留ＩＬ−２含有分画由来の試料についてのＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。同じ
ゲル系内にかけられたＩ　Ｌ−２バンドの位置および標
準分子量マーカー蛋白質の位置が示されている。マーカ
ー蛋白質の分子量は、キロダルトン（ＫＤ）により示さ
れており、ここでＩＫＤ＝１，０００ダルトンである。

本発明は、直列的な２つのカラムの逆相液体クロマトグ
ラフィー系を使用することにより、組換えヒトＩＬ−２
の優れた精製を達成する。この系を用いて得られた該Ｉ
Ｌ−２は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
および分析用逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにおいて均質である。本
発明のクロマトグラフィー系は、ダラム量の蛋白質が精
製できること、ならびに該系が反復クロマトグラフィー
およびカラムの循環処理についての自動化が容易である
ことにおいて優れている。

ここで使用されているように“組換えヒトＩＬ−２”な
る用語は、ヒトＩＬ−２遺伝子、または天然のヒトＩＬ
−２のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同等であり、
かつ天然のヒトＩ　Ｌ−２と同等な生物学的活性を有す
るアミノ酸配列を持った蛋白質をコードしているこのよ
うな遺伝子の修飾物を含有する微生物により産生される
非グリコジル化蛋白質を意味している。アミノ酸配列の
実質的な同等性は、ＩＬ−２蛋白質の生物学的活性に実
質的に逆行する効果を有することなく天然のヒ）ＩＬ−
２のアミノ酸配列とは１個またはそれ以上のアミノ酸が
削除、追加および／または置換によって異なっている修
飾遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を意味す
る。

ヒトＩＬ−２を含む微生物、例えば細菌は、ヒトＩ　Ｌ
−２遺伝子が発現制御配列に機能的に結合された組換え
ベクターまたはプラスミドを含む微生物類である。この
ような微生物類は、該ヒ１−ＩＬ−２遺伝子を発現する
ことができる。それらは、当分野でよく知られた方法、
例えばそのような組換えベクターまたはプラスミドを用
いた形質転換によって得られる。該微生物類は、当分野
でよく知られた方法を用いて適切な培地中で生育するこ
とができる。充分な量の細胞が蓄積された後には、該細
胞を培地から、例えば遠心分離により分離することがで
きる。このようにして得られた微生物を濃縮された形態
で含む細胞ペーストは、細胞破壊に適している。

組換えＩ　Ｌ−２を産生ずる該微生物類は、当分野で通
常に採用されている方法、例えば超音波処理、フレンチ
プレッシャーセルもしくはガラリン（Ｇａｕｌ　ｉｎ）
ホモジナイザー破壊（ＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ、　Ｅｖｅ
ｒｅｔｔＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、
）、または、他の機械的手段（ｃｈａｒｍらのＭｅｔｈ
、Ｅｎｚ）＋ｍｏ１．２２，４７６−５５６（１９７１
）　）、浸透性ショックあるいは反復的な凍結および解
凍等により破壊することができる。このような破壊の主
な目的は、次に続く抽出および可溶化工程を容易にする
ことにある。必要であれば、破壊に先立って、フェニル
メチルスルフォニルフルオライド等のプロテアーゼ阻害
剤を細胞ペーストに加えておくこともできる。

破壊に続き、細胞溶解物の不溶性分画が可溶性成分から
単離される。この単離は、該溶解物を約ｓ、ｏｏｏから
約１２．０００Ｘ　ｇにおいて約１時間遠心分離するこ
とにより、好適に行なうことができる。

好ましくは、不溶性分画の単離の問および後の精製工程
の間、温度は約２−８　’Ｃに保たれる。

該細胞溶解物の不溶性分画の抽出は、２つの工程におい
て実施することができる。第１の工程においては、はと
んどのＩ　Ｌ−２を不溶性物質中に残したまま、組換え
ＩＬ−２以外の細菌性蛋白質が抽出される。この抽出は
、約１．７５から２Ｍのグアニジン−ＨＣｌの溶液を用
いることにより行なわれる。

該抽出工程の間、振とうまたは撹拌等の機械的揺動を加
えることが好ましい。先行する抽出工程においても不純
性細菌性蛋白質を除去することから、このような工程も
また、約ｐＨ８の緩衝液を用いて実施することができる
。いかなる場合においても、このような工程からの可溶
性抽出物は、廃棄される。

該ＩＬ−２のほとんどを含む残留不溶性物質は、次いで
約４から７Ｍのグアニジン−〇ＣＩ、好ましくは７Ｍグ
アニジン−ＨＣｌ溶液により抽出される。このような方
法により得られた該抽出物は、グアニジン−ＨＣＩ非含
有緩衝液により約１０から約１　、０００倍に希釈され
る。下記の実施例においては、１０ｍＭ　トリス−ＨＣ
ｌ、　　０．０３５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，９を含む緩
衝液が使用されたが、同様ないかなる緩衝液も適用可能
である。

該抽出物の希釈に続いて、不純性蛋白質を主に含む柔毛
様物質が保持操作において発生する。この物質の量は、
希釈後２日までは時間と共に増加する。該柔毛性物質は
、遠心分離または口過により除去され、廃棄される。こ
の方法において、不純性蛋白質は、Ｉ　Ｌ−２の損失を
ほとんどまたは全く伴わずに除去される。該希釈抽出物
は、ここで、更に精製する前に、好ましくは２−８℃に
て４時間から約２日間保持される。

逆相クロマトグラフィーは、適当な担持担体に対して結
合されたアルキル鎖を含む樹脂を使用して行なわれる。

好適なカラム材料は、商品となっている。好ましいカラ
ム材料は、ＶＹＤＡＣ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、八、）のＣ４および
Ｃ１８シリカ担持材料である。これらの材料は、平均粒
径１０から３０μｍに分類されている２５０−３００オ
ングストロームの細孔直径のシリカ粒子の表面にシロキ
サン（シリコン−酸素−シリコン）結合により共有的に
結合されているブチルまたはオクタデシルシラン基を含
んでいる。

該希釈ＩＬ−２含有抽出物の精製は、２つの逆相クロマ
トグラフィーカラムを使用して行なわれる。

好ましくは、第１のカラムは、より低い背圧とより大き
い流速とを生むためにより大きい２０−３０μｍの粒子
サイズの担持材料を収容している。第２のカラムは、よ
り高い分解能のために、１０−２０μｍの粒子サイズを
有するより細かい担持材料を収容している。

該希釈ＩＬ−２含有抽出物を第１のカラムにかけるのに
先立って、該抽出物は、好ましくは酢酸等の適切な酸を
用いて酸性化される。該抽出物のｐＨは約３．５が好ま
しい。本質的ではないが、該希釈抽出物は、また、第１
の逆相カラムへかける前に、限外口過により約１０倍に
濃縮されることも−できる。

該カラムからの蛋白質類の溶出は、当分野においてよく
知られた方法により行なわれる。例えば、増加するアセ
トニトリルの線形、凹状または凸状の勾配を使用するこ
とができる。好ましくは、以下においてより完全に説明
するように段階的勾配が使用される。このような段階的
勾配の利点は、自動化プログラム操作に容易に適用し得
ることにある。このような操作を通して、比較的大量の
Ｉ　Ｌ−２が、循環的なカラムの平衡化および再生、試
料の適用および溶出を経て製造され得る。

該カラムからの蛋白質類の溶出は、公知の検出方法によ
り都合よく監視することができる。例えば、５ｔｅｉｎ
ら［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７
８：４３５（１９８１）］により記述された方法等の自
動化ケイ光検出系を採用することができる。好ましくは
、２８０ナノメータにおける紫外吸収の監視等の非破壊
的方法が使用される。好ましい自動化ＵＶ吸収検出器は
、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｉｌｆｏｒ
ｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）から入手可能である。

溶出物中のＩ　Ｌ−２の存在は、分画分別物の標準Ｉ　
Ｌ−２バイオアツセイまたは、好ましくは既知Ｉ　Ｌ−
２を標準として用いる分析的ＨＰＬＣにより監視するこ
とができる。

本発明に従って逆相クロマトグラフィー工程を２工程に
て実施することにより、分析的逆相ＨＰＬＣにより、お
よびＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により示さ
れるように組換えヒトＩ　Ｌ−２が微生物から均質に精
製された。このようなＩ　Ｌ−２の均質性は、該逆相カ
ラムからＩＬ−２に近接して溶出する不純性蛋白質類の
ピークがある場合においても一定の手順において達成さ
れた。

Ｋｏｔｈｓら〔米国特許筒４，５６９，７９０号〕は、
本発明において使用される逆相カラムは、また、細菌性
エンドトキシン不純物を効果的に除去し得ることを示し
た。しかしながら、いくらかのエンドトキシン不純物が
、精製Ｉ　Ｌ−２中に存在することもあり得る。さらに
、該ＩＬ−２貯留物中には、アセトニＩ−ＩＪルが存在
し得る。これら両不純物は、当分野において知られてい
る方法により除去し得る。

例えば、それらは５ｅｐｈａｄｅｘ＠Ｇ−５０（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中でのゲル口過クロ
マトグラフィーにより除去し得る。別法として、好まし
くは逆相クロマトグラフィーの後に、精製Ｉ　Ｌ−２中
に残ったいかなるエンドトキシンおよびアセトニトリル
も、カルボキシメチル樹脂中でのイオン交換クロマトグ
ラフィーにより除去される。ＣＭ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ
＠　（東洋曹達、東京、日本）が好適であるが、カルボ
キシメチルセルローズまたは、他のカルボキシメチル−
置換樹脂がこの目的の為に使用可能である。該ＩＬ−２
は、このようなカラムから標準的方法により溶出される
。

所望により、生物活性の損失に対して精製ＩＬ−２を安
定化するために、該蛋白質にマンニトールを加えること
ができる。この目的のため、マンニトールは、約１から
５０■／　ｍｌの濃度において使用される。約５■／　
ｍｌの濃度が好ましい。

本発明の方法により製造される組換えヒトＩＬ−２の総
画収率は、回収された全抽出ＩＬ−２蛋白質について、
通常、約４５から約６０パーセントまでの範囲にある。

該精製ＩＬ−２の比生物活性は、典型的には、蛋白質ミ
リグラムあたり、約１．６Ｘ１０’活性単位である。

〔実施例〕

本発明の方法を更に以下の実施例によって説明する。

二五Ｉ冗柾汰 ＩＬ−２のバイオアッセーをＧ１１ｌｉｓらのＪ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ。

１２０：２０２７（１９７Ｂ）中に述べられた方法の比
色修飾を用いて行なった。このアッセーにおいて、ＣＴ
ＬＬ細胞を、ターゲット細胞として使用した。ＣＴＬＬ
細胞は、生育においてＩＬ−２依存性のマウス細胞毒性
リンパ様細胞系の細胞である（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ、Ｅ
ｘｐ。

Ｍｅｄ、皿４６８（１９７７））　、ＣＴＬＬ細胞は、
寄託番号＾ＴＣＣＴＩＢ　２１４（ｃＴＬＬ−２）のも
とにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ
ｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭａｒｙｌａｎｃＬ　（１，Ｓ、Ａ、からまたはＩｍｍ
ｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、５ｅａｔｔｌｅ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｕ、Ｓ、Ａ、から入手可能であ
る。細胞を、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の牛胎児血清、２
５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、５０ｕｇ／ｍ１のゲンタマ
イシン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／　ＰｌｏｕｇｈＩｎｃ、＋
Ｂ１ｏｏｍｆｉｅｌｄ＋Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ＋Ｕ、Ｓ
、Ａ、）および２００単位／ｄの粗ヒトＩＬ−２が追加
されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ＋　Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）中で保持した。

Ｉ　Ｌ−２バイオアツセーのために、ＣＴＬＬ細胞を、
ベックマン　モデルＪ−６８遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａ
ｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、＋Ｐａ１ｏ　Ａｌ
ｔｏ＋Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）中、５０
０Ｘｇで１０分間沈澱させることによって！Ｌ−２含有
の保存培地から除去し、ＩＬ−２非含有ＨＢ１０１培地
（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｂｅｒｋｅｌ
ｅｙ、　Ｃａ１ｉｆ。

ｒｎｉａ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）中で２回洗浄した。細胞を、
５０　ｕ　ｇ／雁のゲンタマイシンが追加されたＨＢＩ
ＯＩ培地中に再懸濁し、２Ｘ１０’細胞／ｄの濃度に調
整した。

測定されるべき試料を半分の領域のマイクロタイタープ
レー）　（ｃｏｓｔａｒ　Ｎα３６９６）中の列の第一
の穴中のＨＢＩＯＩ中に希釈させて０．１　ｄの最終容
量にした。引続く列の穴には、０．０５１ｎ１のＨＢＩ
ＯＩ培地が含まれていた。２倍希釈の試料を、０．０５
ｄの分別量を末端の穴まで順次移すことによって調製し
た。

ＩＬ−２非含有０．０５ｄの培地で満たしたいくつかの
穴を、負の対照として供した。全部の穴に０．０５ｄの
細胞懸濁液を植えた。直ちにプレートを合成樹脂のふた
でおおい、空気中に５％のＣＯ！を含有する加湿室中、
３７゛Ｃで２０時間培養した。

バイオアッセーは、刺激された細胞によるグルコース代
謝の最終生成物として生じた乳酸（ＬＡ）の比色測定に
基づいている。ＬＡのこの比色測定のための試薬類は、
シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋Ｓ
ｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）か
ら入手したものである。溶液Ａは、ｐＨ９，２の０．６
　Ｍのグリシン、８０ｍＭのヒドラジン緩衝液中に、１
．６ｍｇ／ｄのβ−ニコチンアミド　アデニン　ジヌク
レオチドおよび０．３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゼチランを
含有していた。溶液Ｂは、水中に、１６６単位／ｄの乳
酸デヒドロゲナーゼ、０．５■／！ｎＩｔのＰ−ヨード
ニトロテトラゾリウム　バイオレット、および０．０３
■／Ｉｄのフェナジン　メトスルフェートを含有してい
た。リン酸緩衝液中に希釈されたＬＡの標準溶液が、測
定のための正の対象として供された。０．３５Ｈの１（
ｃＩの溶液が、反応を停止するために使用された。個々
の穴に０．５　ｄの溶液Ａを含む９６−穴のマイクロタ
イター　プレートが、バイオロジカル　アッセー　マイ
クロタイター　プレートの対応する穴から得られた０、
０１５ｄの試料中のＬＡの量を測定するための反応プレ
ートとして使用された。

反応プレートの個々の穴に０．０５−の溶液Ｂを追　・
加して反応を開始した。テトラゾリーム染料の還元のた
めに充分な時間が経過した後、個々の穴に０．０５ｄの
ＨＣＩ溶液を添加することによって反応を停止させた。

次いで個々の穴中の反応溶液中の５５０ｎｍにおける光
学密度を、マイクロプレート分光測光器を用いて測定し
た。

ＩＬ−２活性の単位は、アッセーにおける最大応答の半
値を生ずるＩ　Ｌ−２の量として定義される。

Ｉ　Ｌ−２４度は、５０％のエンドポイントの穴中の希
釈度の逆数として計算される。ナショナル　インスティ
チュート　オブ、ヘルス　ビューロー　オブ　バイオロ
ジカル　レスポンス　モデファイアーズ（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　　ｏｆ　　Ｈｅａｌ
ｔｈ　　Ｂｕｒｅａｕ　　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ（ＢＲＭＰ））
参考試薬ヒトＩ　Ｌ−２（Ｊｕｒｋａｔ）材料を、標準
として使用した。

カラム分画を、スペクトラ　フィジックス社（Ｓｐｅｃ
ｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ）のモデルｓｐ　８７００溶媒
搬送システムおよび２８０ｎｍにセットしたウォーター
ズモデル４４０吸光測定器（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ
ｉａｔｅｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を使用
して分析用ＨＰＬＣによって分析した。カラムは、Ｃ４
担持材料を含んでおり４．６　ｎｍｍ直径Ｘ１５ｃ長長
床寸法を持っていた。

カラムを、緩衝液（０，ＯＩＭのリン酸、０．４Ｍのグ
アニジン−ＨＣｌ、　０．０５Ｍの塩化リチウム、ｐＨ
２，５）とアセトニトリルとの９５　：　５（ｖｏｌ／
ｖｏｌ）の混合溶液を用いて平衡化させた。

試料を適用した後、蛋白質を、増加するアセトニトリル
の以下の勾配を用い、ｌｄ／分の流速で、段階的に溶出
させた： ９５：５　　　　　　０−３ ５０：５０　　　　　　６−１２ ３５　：　６５　　　　　　１５−２５３−６および１
２−２５分の間隔中、アセトニトリルの濃度が、直線勾
配によって示されたレベルまで増加した。

試料中のＩ　Ｌ−２の濃度を、Ｉ　Ｌ−２ピークの積分
面積と同一の条件下でクロマトグラフされた既知のＩＬ
−２標準試料によってもたらせられたピークの積分面積
とを比較することによって測定した。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動分析を、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ
　２２互６８０（１９７０）　）の方法を使用して行な
った。ゲルを、クマシーブリリアントプルー染料または
銀着色剤（Ｓｗｉｔｚｅｒ　らのＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　９８：２３Ｈ１９７９））のいずれかを使用し
て染色した。

±Ｌ−２優漣■ 組換えヒトＩ　Ｌ−２を、発現プラスミドｐＲＣ２３３
／ＩＬ−２／Δｔｅｔにより形質転換したＥ、ｃｏｌｉ
細胞中に生成させた。該プラスミドおよびその構築のた
めの方法は、ＪｕらのＪ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２
：５７２３（１９８７）中に詳細に述べられており、こ
こに参考のために加える。ヒトＩＬ〜２を発現しうるい
かなる他の公知の発現プラスミドにより形質転換したＥ
、ｃｏｌｉも使用することができる。該プラスミドを含
む形質転換体を標準条件下で培養させた。

形質転換Ｅ、ｃｏｌｉ細胞のペーストを、５ｍＭのエチ
レンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する３０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ８，０）中に均一に懸濁
させ〔緩衝液Ａ、３１ｎｉ／Ｈの細胞ペースト］、２−
８℃で撹拌した。懸濁？夜を、約７，０００ｐｓｉ（４
，８Ｘ１０’パスカルに近似）で、２回または３回ガウ
リンホモジナイザーに該ホモジナイザーの出口温度を、
冷却コイルを使用して２−８℃に保持しつつ、通過させ
た。

細胞溶解物を、ＧＳＡローターを有するツルパル（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ）ＲＣ−５Ｂ遠心分離器（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｌａｗａｒｅ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）中、１２．０Ｏ
ＯＸ　ｇで１５＝３０分間遠心分離し、可溶性蛋白質を
含有している上澄液を１舎でた。ペレットを、緩衝液Ａ
中に懸濁させ（１ｍ１／ｇの細胞ペースト）、約４℃で
３０−６０分間撹拌した。前記と同様に遠心分離の後、
上澄液を捨てた。

前記と同様にしてペレットを１．７５Ｍのグアニジン−
ＨＣｌ中に懸濁させ（１−２ｍｇ／ｇ細胞ペースト）、
２−８　’Ｃで３０−４０分間混合した。上澄液を捨て
、更にペレットを７Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中に懸濁さ
せ（２，５ｍ／ｇ細胞ヘースト）、２−８℃テロ０−９
０分間撹拌した。前記と同様に抽出物を遠心分離し、更
に得られた上澄液を、抽出希釈緩衝液（０，ＯＩＭのト
リス−１７ＣＩ　（ｐ　Ｈ７，９）、０．０３５ＭのＮ
ａＣ１〕を使用して４０倍に希釈し、更に約４℃で２４
時間放置した。

該溶液を放置している間、柔毛性の破片が発生した。希
釈された上澄液を、沈澱した柔毛性の破片から注意深く
傾瀉し、次いで２．５および１．２μｍフィルターを通
して口過し、その後に、ミリボアーベリコン系（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ−Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ、）中で１０倍に濃縮し
た。

工・−１２クロマトブーツ　− ＶＹＤＡＣＣ４またはＣ１８樹脂（２５０−３００オン
グストロームの細孔サイズ、２０−３０μｍの粒径）で
１０ｃｍの高さの床に充填された１８ｃｍ　（内径）の
カラムを緩衝液（０，ＯＩＭのリン酸、０．４Ｍのグア
ニジン−ＨＣｌ。

０．０５Ｍの塩化リチウム、ｐＨ２，５）およびアセト
ニトリルの９５　：　５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合液で平
衡化させた。

口過されたＩ　Ｌ−２の抽出物のｐＨを、酢酸で３．５
に調整した。引続き、１ｇの蛋白質を含有する量の抽出
物を、カラム材料の上にポンプで送った。

蛋白質を、増加するアセトニトリルの以下の段階勾配を
用い、４００ｄ／分の流速でカラムから溶出させた。

９５：５　　　　　　　　　０−１８ ３０ニア０　　　　　　　　、　３２−４５カラム溶出
液を、２８０ｎｍの波長において監視した。３Ｉ！、の
分画を集め、次いで前記したと同様にＨＰＬＣで分析し
た。ＩＬ−２を含有する分画（第１図中の溶出プロフィ
ール参照）を貯留し、次いで更にＩ　Ｌ−２の精製に使
用した。第１のカラムからのＩＬ−２蛋白質の総回収率
は、７５％であった。

前記調製用ＨＰＬＣカラムからのＩＬ−２貯留物を、−
７０℃に冷却することによってその有機相と水相とに分
離させた。約４００■の蛋白質を含有する体積の水相を
、ＶＹＤＡＣＣ１８樹脂（３００オングストロームの細
孔サイズ、１０−２０μｍの粒径）で２５ｃｍの高さの
床に充填された５ｃｍ（内径）のＩＩＰＬｃカラムにか
けた。このカラムは、あらかじめ緩衝液（０，０１Ｍの
リン酸、０．０５Ｍの塩化リチウムおよび０．４Ｍのグ
アニジン−ＨＣｌ、、ｐ　Ｈ２，５）およびアセトニト
リルの８０　ｉ　２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合液で平衡
化されていた。

蛋白質を、増加するアセトニトリルの以下の段階勾配を
用い、８０ｄ／分の流速でカラムから溶出させた。

８０　：　２０　　　　　　０−５ ５０　：　５０　　　　　　１０−２０４０　：　６０
　　　　　　２５−４０５−ＩＯおよび２０−２５分の
間隔中、アセトニトリルの濃度が、直線勾配によって示
されたレベルまで増加した。

カラム溶出液を、２８０ｎｍの波長において監視し、約
４５０　ｄの分画を集め、更に前記したと同様にＨＰＬ
Ｃによって分析した。ＩＬ−２を含有する分画を貯留し
た（第２図参照）。

これおよび以前の調製用逆相カラムからのＩＬ−２貯留
物の分別物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析に付し、結果を第３図中に示した。

レーン１−３は、それぞれ第１回目の逆相カラムにかけ
る前の粗Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物からの試料、第１番目のカ
ラムからのＩＬ−２貯留物からの試料および第２番目の
カラムからのＩＬ−２貯留物からの試料を含有していた
。約２０ｕｇのＬＬ−２がそれぞれのレーン中に存在し
ていた。

第３図から分かる様に、第２番目のカラムからのＩＬ−
２は、ＳＤＳゲル中に単一の蛋白質のバンドとして移動
した。

第２番目のカラムからのＩ　Ｌ−２蛋白質の総回収率は
、６２％であった。

セ　ニ　）ル゛よびエン゛　キシンの、第２番目の調製
用逆相カラムからのＩ　Ｌ−２貯留物を、−７０℃で相
分離し、液相を、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３
，５）および５０■／ｄのマンニトールを含有する緩衝
液で５倍に希釈した。次いで希釈されたＩ　Ｌ−２を、
あらかじめ希釈緩衝液で平衡化されたけ一フラクトゲル
（商標）カラム（１０ｃｍ幅、３４ｃｍ高）にかけた。

カラム材料上にＩ　Ｌ−２が負荷させた後、カラムを、
５床容量の希釈緩衝液で洗浄した。次いで結合したＩＬ
−２を、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３、５）　
、５０ｍｇ／　ｍｌのマンニトールおよび０．２　Ｍの
ＮａＣｌを含有する緩衝液を用いてカラムから溶離させ
た。カラムを５０ｄ／分の流速で稼働させ、２，７００
雁の分画を集めた。カラム溶出液の吸光度を２８０ｎｍ
の波長で監視した。回収された蛋白質のピークを貯留し
た。

Ｔ　Ｌ−２を含有する貯留分画を、２−８℃で、５．０
００ダルトンの分子量をしゃ断するＹＭ５フィルター（
Ａｍｉｃｏｎ、Ｄｉｖ、Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ
、、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　
Ｕ、Ｓ、Ａ、から入手可能）を使用する限外口過によっ
て５−１０■／−の最終蛋白質濃度に濃縮させた。濃縮
された蛋白質溶液を、５（ｂｎＭの酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ３，５）および５■／ｄマンニトールを含有する緩衝
液に対してｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ　した。

最終のエンドトキシンを含まないＩ　Ｌ−２のバイオア
ッセイは、ＩＬ−２の比活性が１．６Ｘ１０’活性単位
／■蛋白であったことを示した。

当業者には自明なように、本発明の精神および範囲を離
れることなくその多くの修飾および変形が可能である。

ここに記述された特定の実施態様は、例示のためにのみ
提供されたものであり、本発明は添付された特許請求の
範囲の文言によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明における第１のカラムからの溶出の概
要を示す図、第２図は、本発明における第２のカラムか
らの溶出の概要を示す図、第３図は、本発明の各工程に
おける試料の電気泳動による分析結果を示す図である。 出願人　エフ・ホフマン・う・ロシュ・ラント・コンパ
ニー・アクチェンゲゼルシャフト代理人　弁理士　平　
木　祐　輔 ｒｌＬ−２− ＫＤ ＝−−９４ 舗−−１− 一一一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）組換えヒトＩＬ−２の発現を支配することが
   できるベクターを含有する、培養された細菌細胞を破壊
   して、該ＩＬ−２を含有する細菌細胞溶解物を生成し； （ｂ）該細菌細胞溶解物から不溶性分画を単離し； （ｃ）該細菌細胞溶解物から単離された該不溶性分画を
   、約４から７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液を用いて抽出し
   て、ＩＬ−２含有抽出物を得；（ｄ）該ＩＬ−２含有抽
   出物をグアニジン−ＨＣＩ非含有緩衝液により約１０か
   ら約１，０００倍に希釈し；（ｅ）該希釈ＩＬ−２含有
   抽出物を、第１の逆相液体クロマトグラフィーカラムに
   かけ、これにより該ＩＬ−２は、該第１のカラムに保持
   され；（ｆ）該ＩＬ−２を該第１のカラムから増加する
   アセトニトリル勾配により溶出し、かつＩＬ−２含有分
   画を貯留し； （ｇ）該第１のカラムからの該貯留ＩＬ−２含有分画を
   第２の逆相液体クロマトグラフィーカラムにかけ、これ
   により該ＩＬ−２は、該第２のカラムに保持され；およ
   び （ｈ）該ＩＬ−２を該第２のカラムから増加するアセト
   ニトリル勾配により溶出し、かつＩＬ−２含有分画を貯
   留することからなることを特徴とする組換えヒトＩＬ−
   ２の精製方法。 ２、該ＩＬ−２含有抽出物が、該グアニジン−ＨＣｌ非
   含有緩衝液により約４０倍に希釈されることを特徴とす
   る請求項１に記載の方法。 ３、抽出工程（ｃ）が、該単離された不溶性分画を約１
   ．７５Ｍグアニジン−ＨＣｌを含む溶液により抽出し、
   抽出物を廃棄することを含む工程により行なわれること
   を特徴とする請求項１または２に記載の方法。 ４、工程（ｄ）における該希釈ＩＬ−２含有抽出物が該
   第１のカラムにかける以前に約４時間から約２日間の範
   囲の期間、約２から８℃にて保持されることを特徴とす
   る請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。 ５、該希釈ＩＬ−２含有抽出物が約８ないし２４時間の
   期間保持されることを特徴とする請求項４に記載の方法
   。 ６、該第２のカラムからの該貯留ＩＬ−２が、カルボキ
   シメチルイオン交換カラムにおけるクロマトグラフィー
   により、アセトニトリルおよびエンドトキシンを除去す
   べく更に精製される請求項１ないし５のいずれかに記載
   の方法。 ７、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法により調
   製された組換えヒトＩＬ−２。