JPH04320693A - タンパクの精製方法 - Google Patents
タンパクの精製方法Info
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- JPH04320693A JPH04320693A JP8676491A JP8676491A JPH04320693A JP H04320693 A JPH04320693 A JP H04320693A JP 8676491 A JP8676491 A JP 8676491A JP 8676491 A JP8676491 A JP 8676491A JP H04320693 A JPH04320693 A JP H04320693A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌によって産生さ
れたヒトC型肝炎ウイルスコア抗原タンパクまたはその
コア抗原領域を含むタンパクの精製法に関する。
れたヒトC型肝炎ウイルスコア抗原タンパクまたはその
コア抗原領域を含むタンパクの精製法に関する。
【0002】
【従来の技術】ヒトC型肝炎は、ヒトC型肝炎ウイルス
によって引き起こされる肝炎であり、輸血後の非A非B
型肝炎のほとんどは、この肝炎であると言われている。
によって引き起こされる肝炎であり、輸血後の非A非B
型肝炎のほとんどは、この肝炎であると言われている。
【0003】そして、その多くは更に肝ガンへと病状が
進行する。ヒトC型肝炎ウイルスは、遺伝子の長さ約1
0Kb(約1万ヌクレオチド)のRNAウイルスとされ
、フラビウイルスとの類似性から5′末端から約1.5
Kbの部分が構造タンパク遺伝子部分に相当し、残りが
非構造タンパク遺伝子部分に相当すると考えられている
。 又、約1.5Kbの構造タンパク遺伝子部分は、コア抗
原遺伝子部分、膜タンパク遺伝子部分、外皮タンパク遺
伝子部分に機能的に分かれているものと考えられている
。
進行する。ヒトC型肝炎ウイルスは、遺伝子の長さ約1
0Kb(約1万ヌクレオチド)のRNAウイルスとされ
、フラビウイルスとの類似性から5′末端から約1.5
Kbの部分が構造タンパク遺伝子部分に相当し、残りが
非構造タンパク遺伝子部分に相当すると考えられている
。 又、約1.5Kbの構造タンパク遺伝子部分は、コア抗
原遺伝子部分、膜タンパク遺伝子部分、外皮タンパク遺
伝子部分に機能的に分かれているものと考えられている
。
【0004】C型肝炎ウイルスの遺伝子の非構造タンパ
ク遺伝子領域および構造タンパク遺伝子領域について、
前者は、カイロン社によるヨーロッパ特許(EP031
8216)での報告があり、後者は、カイロン社による
ヨーロッパ特許(EP0388232) での報告およ
び下遠野らの平成2年7月3日日本ガン学会における口
頭発表による報告等がある。
ク遺伝子領域および構造タンパク遺伝子領域について、
前者は、カイロン社によるヨーロッパ特許(EP031
8216)での報告があり、後者は、カイロン社による
ヨーロッパ特許(EP0388232) での報告およ
び下遠野らの平成2年7月3日日本ガン学会における口
頭発表による報告等がある。
【0005】その後の国内外の研究により、ヒトC型肝
炎ウイルス遺伝子の構造タンパク遺伝子領域のうちのコ
ア抗原遺伝子部分でコードされるタンパク(コア抗原)
は、その他の抗原性を有する領域(C─100抗原等)
よりも抗原性が強く、特異性も高く、且つヒトC型肝炎
ウイルス感染の初期診断が可能であるタンパクであるこ
とが明らかにされた。(Muraiso.K,et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,172,(2),511−16(1990
) )近年輸血後非A非B型肝炎患者の血液中に存在す
る抗体を検出する診断薬に使用できるタンパク試料とし
て、又、ヒトC型肝炎ウイルスに関する分子生物学的、
免疫学的研究に使用できるタンパク試料として、高度に
純化したタンパク試料の供給が強く望まれている。その
ためには、ヒトC型肝炎ウイルスコア抗原領域を含むタ
ンパクを大腸菌および酵母等で大量産生させる製造方法
、産生された該タンパクを産生細胞から抽出する方法、
および、得られた抽出物から該タンパクを純化する精製
方法とを確立することが必要である。
炎ウイルス遺伝子の構造タンパク遺伝子領域のうちのコ
ア抗原遺伝子部分でコードされるタンパク(コア抗原)
は、その他の抗原性を有する領域(C─100抗原等)
よりも抗原性が強く、特異性も高く、且つヒトC型肝炎
ウイルス感染の初期診断が可能であるタンパクであるこ
とが明らかにされた。(Muraiso.K,et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,172,(2),511−16(1990
) )近年輸血後非A非B型肝炎患者の血液中に存在す
る抗体を検出する診断薬に使用できるタンパク試料とし
て、又、ヒトC型肝炎ウイルスに関する分子生物学的、
免疫学的研究に使用できるタンパク試料として、高度に
純化したタンパク試料の供給が強く望まれている。その
ためには、ヒトC型肝炎ウイルスコア抗原領域を含むタ
ンパクを大腸菌および酵母等で大量産生させる製造方法
、産生された該タンパクを産生細胞から抽出する方法、
および、得られた抽出物から該タンパクを純化する精製
方法とを確立することが必要である。
【0006】大腸菌で産生されたヒトC型肝炎ウイルス
のコア抗原タンパクまたはその抗原領域を含むタンパク
を大腸菌から抽出する方法および抽出物から該タンパク
を純化する精製方法については現在まで報告がないが、
大腸菌で産生されたタンパクを抽出し、精製した他のタ
ンパクの例は数多くなされている。
のコア抗原タンパクまたはその抗原領域を含むタンパク
を大腸菌から抽出する方法および抽出物から該タンパク
を純化する精製方法については現在まで報告がないが、
大腸菌で産生されたタンパクを抽出し、精製した他のタ
ンパクの例は数多くなされている。
【0007】大腸菌で産生された可溶性タンパクは、一
般に菌を集菌後、変性剤および界面活性剤を含んでいな
い通常の緩衝液でタンパクを抽出し、続いて、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
沈殿(分画)等の精製手段を用いて精製できる。又、大
腸菌で産生された不溶性又は難溶性タンパクの精製法と
しては、菌を集菌後、内容物を変性剤又は界面活性剤を
含んだ緩衝液で抽出した後、該抽出物に対して、SPS
−ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、目的のタンパ
ク部分のゲルを切り出しゲルから電気泳動的にタンパク
を抽出する方法、および菌を集菌後、変性剤又は界面活
性剤を含んだ緩衝液で内容物を抽出し、同緩衝液存在下
で、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーを行なっ
た例が報告されている。
般に菌を集菌後、変性剤および界面活性剤を含んでいな
い通常の緩衝液でタンパクを抽出し、続いて、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
沈殿(分画)等の精製手段を用いて精製できる。又、大
腸菌で産生された不溶性又は難溶性タンパクの精製法と
しては、菌を集菌後、内容物を変性剤又は界面活性剤を
含んだ緩衝液で抽出した後、該抽出物に対して、SPS
−ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、目的のタンパ
ク部分のゲルを切り出しゲルから電気泳動的にタンパク
を抽出する方法、および菌を集菌後、変性剤又は界面活
性剤を含んだ緩衝液で内容物を抽出し、同緩衝液存在下
で、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーを行なっ
た例が報告されている。
【0008】具体例としては、組換えレニンタンパクを
大腸菌で産生させ、集菌し、変性剤を含んでいない緩衝
液に懸濁させ、リゾチーム処理、超音波処理、低速遠心
分離による沈殿を行なった後、該沈殿物を6Mグアニジ
ン塩酸を含有した緩衝液で可溶化し、同緩衝液存在下で
ゲル濾過して、95%以上の純度をもつ組換えレニンタ
ンパクを精製した例(Imai,T.,et al,J
.Biochem,100,425(1986))等が
挙げられる。
大腸菌で産生させ、集菌し、変性剤を含んでいない緩衝
液に懸濁させ、リゾチーム処理、超音波処理、低速遠心
分離による沈殿を行なった後、該沈殿物を6Mグアニジ
ン塩酸を含有した緩衝液で可溶化し、同緩衝液存在下で
ゲル濾過して、95%以上の純度をもつ組換えレニンタ
ンパクを精製した例(Imai,T.,et al,J
.Biochem,100,425(1986))等が
挙げられる。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、大腸菌
で産生されるヒトC型肝炎ウイルスのコア抗原タンパク
又はそのコア抗原領域を含むタンパク(以下、C−タン
パクと略す。)の抽出方法及び精製方法に付いて検討し
た。その結果、C−タンパクは該タンパクのコア抗原領
域の性質に起因して水に難溶性であり、変性剤非存在下
あるいは界面活性剤非存在下では該タンパクを効率よく
抽出できないことを見い出した。
で産生されるヒトC型肝炎ウイルスのコア抗原タンパク
又はそのコア抗原領域を含むタンパク(以下、C−タン
パクと略す。)の抽出方法及び精製方法に付いて検討し
た。その結果、C−タンパクは該タンパクのコア抗原領
域の性質に起因して水に難溶性であり、変性剤非存在下
あるいは界面活性剤非存在下では該タンパクを効率よく
抽出できないことを見い出した。
【0010】又、上記の方法で得られた抽出物に対して
変性剤非存在下、又は、界面活性剤非存在下でのイオン
交換クロマログラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等の精製手段を用いて精製を進めても大腸菌内のその他
の不純タンパクおよび核酸等と凝集するために有効に精
製できないことがわかった。そして、界面活性剤存在下
でのC−タンパクの抽出では、抽出はできるものの、該
抽出物を使用すると、後に続く精製工程を進めることが
容易でないことがわかった。
変性剤非存在下、又は、界面活性剤非存在下でのイオン
交換クロマログラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等の精製手段を用いて精製を進めても大腸菌内のその他
の不純タンパクおよび核酸等と凝集するために有効に精
製できないことがわかった。そして、界面活性剤存在下
でのC−タンパクの抽出では、抽出はできるものの、該
抽出物を使用すると、後に続く精製工程を進めることが
容易でないことがわかった。
【0011】さらに、C−タンパクの変性剤存在下での
抽出を検討した結果、尿素存在下で大腸菌で産生される
C−タンパクを抽出すると抽出中にC−タンパクが大腸
菌内のプロテアーゼにより分解されることがわかった。
抽出を検討した結果、尿素存在下で大腸菌で産生される
C−タンパクを抽出すると抽出中にC−タンパクが大腸
菌内のプロテアーゼにより分解されることがわかった。
【0012】又、展開緩衝液中に尿素を含有させて、該
タンパク生産菌の抽出液に対して、イオン交換クロマト
グラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを行なっ
たところ、上記の変性剤非存在下の場合と同様に、C−
タンパクと大腸菌内のその他の不純タンパクおよび核酸
等と凝集するために、C−タンパクとクロマトグラフィ
ーを妨害する成分との分離ができず、得られたC−タン
パク画分に対して、さらなる精製手段を加えても、有効
に精製できないこともわかった。
タンパク生産菌の抽出液に対して、イオン交換クロマト
グラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを行なっ
たところ、上記の変性剤非存在下の場合と同様に、C−
タンパクと大腸菌内のその他の不純タンパクおよび核酸
等と凝集するために、C−タンパクとクロマトグラフィ
ーを妨害する成分との分離ができず、得られたC−タン
パク画分に対して、さらなる精製手段を加えても、有効
に精製できないこともわかった。
【0013】C−タンパク精製法として、従来技術で紹
介したSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用
した精製法を適用した場合、ある程度精製できるものの
、産生したC−タンパクと分子量の近い大腸菌由来の不
純タンパクも精製タンパク試料に含まれてしまうこと、
工業的な大量精製法として適当でないこと等の問題点が
わかった。
介したSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用
した精製法を適用した場合、ある程度精製できるものの
、産生したC−タンパクと分子量の近い大腸菌由来の不
純タンパクも精製タンパク試料に含まれてしまうこと、
工業的な大量精製法として適当でないこと等の問題点が
わかった。
【0014】さらに、従来技術で紹介した組換えレニン
タンパクの抽出及び精製法は、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行なう前に、該タンパク抽出物に対して煩雑な前
処理を行わなければならず、工業的な大量精製法という
点で不適である。
タンパクの抽出及び精製法は、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行なう前に、該タンパク抽出物に対して煩雑な前
処理を行わなければならず、工業的な大量精製法という
点で不適である。
【0015】本発明者らは、大腸菌で産生されたC−タ
ンパクをいかなる変性剤を含んだ緩衝液で大腸菌から抽
出すれば効率よく且つ、C−タンパクが大腸菌内のプロ
テアーゼに分解されずに済むか、そして更に抽出物から
C−タンパクを精製するために、クロマトグラフィーを
妨害する成分を除去するのにいかなる精製手段で行なえ
ばよいか、又、その精製手段が操作的に簡便で、工業的
な大量精製法に適しているかどうか等について、数多く
の研究を行なった。鋭意研究の結果、大腸菌によって産
生されたC−タンパクを2─メルカプトエタノール及び
グアニジン塩酸を含有する緩衝液で抽出した後、グアニ
ジン塩酸を含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマト
グラフィーを行ない、C−タンパク画分を分取すること
で、かかる目的を達成し得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
ンパクをいかなる変性剤を含んだ緩衝液で大腸菌から抽
出すれば効率よく且つ、C−タンパクが大腸菌内のプロ
テアーゼに分解されずに済むか、そして更に抽出物から
C−タンパクを精製するために、クロマトグラフィーを
妨害する成分を除去するのにいかなる精製手段で行なえ
ばよいか、又、その精製手段が操作的に簡便で、工業的
な大量精製法に適しているかどうか等について、数多く
の研究を行なった。鋭意研究の結果、大腸菌によって産
生されたC−タンパクを2─メルカプトエタノール及び
グアニジン塩酸を含有する緩衝液で抽出した後、グアニ
ジン塩酸を含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマト
グラフィーを行ない、C−タンパク画分を分取すること
で、かかる目的を達成し得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
【0016】
【課題を解決するための手段】本発明は、大腸菌によっ
て産生されたヒトC型肝炎ウイルスコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原その領域を含むタンパクを2−メルカ
プトエタノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液で
抽出した後、グアニジン塩酸を含有する緩衝液存在下で
ゲル濾過クロマトグラフィーを行って分取することを特
徴とするタンパクの精製方法である。
て産生されたヒトC型肝炎ウイルスコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原その領域を含むタンパクを2−メルカ
プトエタノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液で
抽出した後、グアニジン塩酸を含有する緩衝液存在下で
ゲル濾過クロマトグラフィーを行って分取することを特
徴とするタンパクの精製方法である。
【0017】本発明においてヒトC型肝炎ウイルスコア
抗原タンパクとは、ヒトC型肝炎ウイルス遺伝子の構造
タンパク遺伝子領域のうちコア抗原遺伝子部分でコード
されるタンパクであり、少なくともヒトC型肝炎ウイル
ス遺伝子の開始コドンの最初の塩基(アデニン)から始
まる360個の塩基がコードするタンパクを指す。例え
ば開始コドンから始まる482塩基のDNA塩基配列が
コードする161個のアミノ酸をヒトC型肝炎ウイルス
由来タンパクとして含むタンパクが例示される。
抗原タンパクとは、ヒトC型肝炎ウイルス遺伝子の構造
タンパク遺伝子領域のうちコア抗原遺伝子部分でコード
されるタンパクであり、少なくともヒトC型肝炎ウイル
ス遺伝子の開始コドンの最初の塩基(アデニン)から始
まる360個の塩基がコードするタンパクを指す。例え
ば開始コドンから始まる482塩基のDNA塩基配列が
コードする161個のアミノ酸をヒトC型肝炎ウイルス
由来タンパクとして含むタンパクが例示される。
【0018】本発明のタンパクは、上記コア抗原遺伝子
部分でコードされるタンパクの端部が不可避的に切断さ
れた場合、或いは付加的に例えばベクター由来のペプチ
ドが連結されている場合も含む。
部分でコードされるタンパクの端部が不可避的に切断さ
れた場合、或いは付加的に例えばベクター由来のペプチ
ドが連結されている場合も含む。
【0019】本発明において使用されるC−タンパクを
産生するための大腸菌は、特に制限されるものではない
。大腸菌でのC−タンパクの産生方法は、ヒトC型肝炎
ウイルスコア抗原をコードする遺伝子を大腸菌で遺伝子
発現が可能なベクターに組込んで組換えベクターを得、
該組換えベクターで大腸菌を形質転換された大腸菌を使
用して、C−タンパクを産生する方法である。ヒトC型
肝炎ウイルスのコア抗原領域を含むタンパクを大腸菌で
産生させる方法の具体例としては、ヒトC型肝炎ウイル
スコア抗原をコードする遺伝子断片をベクターpET−
3d に挿入して得た組換えベクターpKMR3を用い
て、大腸菌BL21(DE3)を形質転換させ、該形質
転換体をラクトースを含まない栄養培養で培養後、IP
TG(イソプロピルチオガラクトシド)を添加して、引
き続き培養することで産生させる方法(Muraiso
.K,et al,Biochem.Biophys,
Res.Commun.,172(2),511−16
(1990)が挙げられる。
産生するための大腸菌は、特に制限されるものではない
。大腸菌でのC−タンパクの産生方法は、ヒトC型肝炎
ウイルスコア抗原をコードする遺伝子を大腸菌で遺伝子
発現が可能なベクターに組込んで組換えベクターを得、
該組換えベクターで大腸菌を形質転換された大腸菌を使
用して、C−タンパクを産生する方法である。ヒトC型
肝炎ウイルスのコア抗原領域を含むタンパクを大腸菌で
産生させる方法の具体例としては、ヒトC型肝炎ウイル
スコア抗原をコードする遺伝子断片をベクターpET−
3d に挿入して得た組換えベクターpKMR3を用い
て、大腸菌BL21(DE3)を形質転換させ、該形質
転換体をラクトースを含まない栄養培養で培養後、IP
TG(イソプロピルチオガラクトシド)を添加して、引
き続き培養することで産生させる方法(Muraiso
.K,et al,Biochem.Biophys,
Res.Commun.,172(2),511−16
(1990)が挙げられる。
【0020】上記の方法で、C−タンパクを産生させた
大腸菌を遠心分離することで、大腸菌ペレットを得る。 そして、該大腸菌ペレットを2─メルカプトエタノール
及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液に懸濁する。該緩
衝液中に含有される2─メルカプトエタノールの濃度は
、1mM〜100mMの範囲であればいかなる濃度でも
良いが、40mM〜60mMが好適である。
大腸菌を遠心分離することで、大腸菌ペレットを得る。 そして、該大腸菌ペレットを2─メルカプトエタノール
及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液に懸濁する。該緩
衝液中に含有される2─メルカプトエタノールの濃度は
、1mM〜100mMの範囲であればいかなる濃度でも
良いが、40mM〜60mMが好適である。
【0021】又、グアニジン塩酸の濃度は、1M〜8M
の範囲であればいかなる濃度でも適用できるが、5M〜
6Mが好適である。
の範囲であればいかなる濃度でも適用できるが、5M〜
6Mが好適である。
【0022】又、緩衝液のpHは、5〜9の範囲であれ
ばいかなるpHでも適用できるが、6〜8が好適である
。
ばいかなるpHでも適用できるが、6〜8が好適である
。
【0023】該緩衝液の種類としては、上記のpHで緩
衝作用を示すものであれば何んら制限されず例えば、リ
ン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等が好適に使用される
。
衝作用を示すものであれば何んら制限されず例えば、リ
ン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等が好適に使用される
。
【0024】又、該緩衝液の濃度は、5mM〜100m
Mの範囲で適用できるが、10mM〜50mMが好適で
ある。
Mの範囲で適用できるが、10mM〜50mMが好適で
ある。
【0025】次に、細胞懸濁液に対して、ダイノミル破
砕機、超音波破砕装置等を使用し、細胞の破砕を行ない
、該破砕物を遠心分離し、その上清を得ることでC−タ
ンパクと大腸菌の不純タンパク等とが混合した抽出物を
得る。さらに、該抽出物を使用して、グアニジン塩酸を
含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィー
を行なう。ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する緩衝
液に含有されるグアニジン塩酸の濃度は、1M〜8Mの
範囲であればいずれの濃度でも良いが、2M〜4Mが好
適である。
砕機、超音波破砕装置等を使用し、細胞の破砕を行ない
、該破砕物を遠心分離し、その上清を得ることでC−タ
ンパクと大腸菌の不純タンパク等とが混合した抽出物を
得る。さらに、該抽出物を使用して、グアニジン塩酸を
含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィー
を行なう。ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する緩衝
液に含有されるグアニジン塩酸の濃度は、1M〜8Mの
範囲であればいずれの濃度でも良いが、2M〜4Mが好
適である。
【0026】該緩衝液のpHは、5〜9の範囲であれば
いずれのpHでも適用できるが、細胞懸濁時に使用した
緩衝液のpHと合わせることが望ましい。
いずれのpHでも適用できるが、細胞懸濁時に使用した
緩衝液のpHと合わせることが望ましい。
【0027】該緩衝液の種類としては、上記のpHで緩
衝作用を示すものであれば、何ら制限されず、細胞懸濁
時に使用した緩衝液の種類と合わせることが望ましい。
衝作用を示すものであれば、何ら制限されず、細胞懸濁
時に使用した緩衝液の種類と合わせることが望ましい。
【0028】該緩衝液の濃度は、5mM〜100mMの
範囲で適用できるが、10mM〜50mMが好適である
。
範囲で適用できるが、10mM〜50mMが好適である
。
【0029】ゲル濾過クロマトグラフィーに使用できる
担体としては、担体のタンパク分画範囲内にC−タンパ
クの分子量が入っているものであれば、特に限定されな
い。例えば Sephacryl S−200 HR
, Sephacryl S−300 HR( p
harmacia 社製)が好適である。ゲル濾過クロ
マトグラフィーの操作および分取方法は特に限定されず
、一般の公知の方法で行なえる。分取されたフラクショ
ンをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
検定し、そのデータを元にして、C−タンパク画分を集
める。
担体としては、担体のタンパク分画範囲内にC−タンパ
クの分子量が入っているものであれば、特に限定されな
い。例えば Sephacryl S−200 HR
, Sephacryl S−300 HR( p
harmacia 社製)が好適である。ゲル濾過クロ
マトグラフィーの操作および分取方法は特に限定されず
、一般の公知の方法で行なえる。分取されたフラクショ
ンをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
検定し、そのデータを元にして、C−タンパク画分を集
める。
【0030】大腸菌内に存在するクロマログフィーを妨
害する成分が除かれた上記画分に対して、更にイオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の
公知の方法で精製を進めることができる。具体的に例示
すれば、該画分を、尿素を含有する緩衝液に交換した後
、該交換液に硫酸アンモニウムを最終濃度0.5M〜2
Mになるように添加し、溶解後、さらに該硫酸アンモニ
ウム溶解液を、疎水性担体を充填したカラムにかけ、カ
ラムを出発用緩衝液で洗浄後硫酸アンモニウムの逆濃度
勾配で吸着画分を溶出させ、分取されたフラクションを
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検定し
、その結果をもとにして、C−タンパク画分を集める疎
水性クロトグラフィーが挙げられる。
害する成分が除かれた上記画分に対して、更にイオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の
公知の方法で精製を進めることができる。具体的に例示
すれば、該画分を、尿素を含有する緩衝液に交換した後
、該交換液に硫酸アンモニウムを最終濃度0.5M〜2
Mになるように添加し、溶解後、さらに該硫酸アンモニ
ウム溶解液を、疎水性担体を充填したカラムにかけ、カ
ラムを出発用緩衝液で洗浄後硫酸アンモニウムの逆濃度
勾配で吸着画分を溶出させ、分取されたフラクションを
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検定し
、その結果をもとにして、C−タンパク画分を集める疎
水性クロトグラフィーが挙げられる。
【0031】
【発明の効果】本精製方法は、大腸菌で産生されたヒト
C型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原
領域を含むタンパクを大腸菌から高収率で、且つ、大腸
菌内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出でき、更
に抽出物から緩衝液を交換することなく直接即ち、操作
的に簡便で、且つ迅速に該タンパクを精製するためのク
ロマトグラフィーを妨害する成分を除去することができ
る有用な精製法である。本精製法で得られた画分は、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー等の公知の方法でさらに精製を進めることが可能であ
る。
C型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原
領域を含むタンパクを大腸菌から高収率で、且つ、大腸
菌内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出でき、更
に抽出物から緩衝液を交換することなく直接即ち、操作
的に簡便で、且つ迅速に該タンパクを精製するためのク
ロマトグラフィーを妨害する成分を除去することができ
る有用な精製法である。本精製法で得られた画分は、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー等の公知の方法でさらに精製を進めることが可能であ
る。
【0032】
【実施例】以下、実施例をあげて説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。 実施例1 ヒトC型肝炎ウィルスコア抗原領域を含む組換えタンパ
ク(分子量23kd;以下、corexタンパクと略す
)を産生する大腸菌HCVKMR3からのcorexタ
ンパクの精製 プラスミドpKMR3で形質転換されたBL21(DE
3)大腸菌HCVKMR3(微工研菌寄第11569号
;FERM P−11569)を20リットルのM9
ZB倍地(NH4 Cl 0.3%,KH2 PO4
0.3%,Na2 HPO4 0.6%,Na
Cl 0.5%,MgSO4 1mM,バクトト
リプトン1%,グルコース0.1%,アンピシリン50
μg/ml)で培養し、OD600 が0.4となった
時点で、IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を
最終濃度が0.4mMになるように添加し、引続き、3
7℃で2時間培養することで、corexタンパクを生
産させた。
これに限定されるものではない。 実施例1 ヒトC型肝炎ウィルスコア抗原領域を含む組換えタンパ
ク(分子量23kd;以下、corexタンパクと略す
)を産生する大腸菌HCVKMR3からのcorexタ
ンパクの精製 プラスミドpKMR3で形質転換されたBL21(DE
3)大腸菌HCVKMR3(微工研菌寄第11569号
;FERM P−11569)を20リットルのM9
ZB倍地(NH4 Cl 0.3%,KH2 PO4
0.3%,Na2 HPO4 0.6%,Na
Cl 0.5%,MgSO4 1mM,バクトト
リプトン1%,グルコース0.1%,アンピシリン50
μg/ml)で培養し、OD600 が0.4となった
時点で、IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を
最終濃度が0.4mMになるように添加し、引続き、3
7℃で2時間培養することで、corexタンパクを生
産させた。
【0033】その後、細胞を8000rpm,4℃で連
続遠心し、ペレットを凍結することにより保存用に回収
した。
続遠心し、ペレットを凍結することにより保存用に回収
した。
【0034】湿潤重量は、20gであった。次に湿潤重
量5gの凍結HCVKMR3ペレットを解凍し、ペレッ
ト1gにつき、抽出用緩衝液4mlの比率で懸濁した。
量5gの凍結HCVKMR3ペレットを解凍し、ペレッ
ト1gにつき、抽出用緩衝液4mlの比率で懸濁した。
【0035】抽出用緩衝液の組成は、3Mグアニジン塩
酸、40mMメルカプトエタノール、pH7.0の10
mMリン酸緩衝液とした。
酸、40mMメルカプトエタノール、pH7.0の10
mMリン酸緩衝液とした。
【0036】該懸濁物を超音波処理によりcorexタ
ンパクを抽出し、遠心分離(15000rpm,30m
in,4℃)し、上清(19ml)を得た。
ンパクを抽出し、遠心分離(15000rpm,30m
in,4℃)し、上清(19ml)を得た。
【0037】上清の全タンパク量は、1860mgであ
った。
った。
【0038】次に、該上清画分19mlに対して、展開
緩衝液を2Mグアニジン塩酸、pH7.0の20mMリ
ン酸緩衝液とし、担体として、SephacrylS−
300HR(pharmacia(株)社製)を使用し
てゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。
緩衝液を2Mグアニジン塩酸、pH7.0の20mMリ
ン酸緩衝液とし、担体として、SephacrylS−
300HR(pharmacia(株)社製)を使用し
てゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。
【0039】使用カラムは内径4cm,長さ150cm
で担体容量は、1.8リットルであった。流速は36m
l/hrで行なった。カラムからの溶出液を7ml画分
毎に集め、その後、集めた各フラクションをSDS−ポ
リアクリルアミド電気泳動によって検定し、その結果を
もとにしてcorexタンパク画分を集めた。
で担体容量は、1.8リットルであった。流速は36m
l/hrで行なった。カラムからの溶出液を7ml画分
毎に集め、その後、集めた各フラクションをSDS−ポ
リアクリルアミド電気泳動によって検定し、その結果を
もとにしてcorexタンパク画分を集めた。
【0040】該corexタンパク画分は、80ml中
にたんぱく質60mgを含有していた。次に、上記co
rexタンパク画分に対して疎水性クロマトグラフィー
を行うために、緩衝液変換を行なった。
にたんぱく質60mgを含有していた。次に、上記co
rexタンパク画分に対して疎水性クロマトグラフィー
を行うために、緩衝液変換を行なった。
【0041】corexタンパク画分を6M尿素を含ん
だ10mMリン酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対
して、2回透析することで、緩衝液変換を行なった。 尚、1回の透析時間は5hrで、4℃で行なった。
だ10mMリン酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対
して、2回透析することで、緩衝液変換を行なった。 尚、1回の透析時間は5hrで、4℃で行なった。
【0042】続いて、該透析液に硫酸アンモニウム濃度
0.8Mになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。
0.8Mになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。
【0043】最後に該溶解液に対して、第二段階のクロ
マトグラフィーとして、疎水性クロマトグラフィーを行
なった。
マトグラフィーとして、疎水性クロマトグラフィーを行
なった。
【0044】まず、出発用緩衝液を0.8M硫酸アンモ
ニウム、6M尿素を含んだ10mMリン酸緩衝液(pH
7.0)とし、担体としてButyl−Toyopea
rl(東ソ−(株)社製)を使用するカラムを作製した
。
ニウム、6M尿素を含んだ10mMリン酸緩衝液(pH
7.0)とし、担体としてButyl−Toyopea
rl(東ソ−(株)社製)を使用するカラムを作製した
。
【0045】上記の溶解液85mlを、作成したカラム
にかけた。尚、作製したカラムは、内径1.4cm,長
さ18cmで担体容量25mlのものであった。又、流
速は14ml/hrで行なった。
にかけた。尚、作製したカラムは、内径1.4cm,長
さ18cmで担体容量25mlのものであった。又、流
速は14ml/hrで行なった。
【0046】カラムにかけた後、出発用緩衝液100m
lでカラムを洗浄し、末吸着画分を溶出した。洗浄後、
吸着画分を0.8M→OM硫酸アンモニウム直線勾配で
溶出させた。(勾配の全容量は、300mlで行なった
。)カラムからの溶出液を2ml画分毎に集め、その後
、集めた各フラクションをSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって検定し、その結果をもとに、co
rexタンパク画分を集めた。その画分は、56ml中
にタンパク4mgを含有していた。
lでカラムを洗浄し、末吸着画分を溶出した。洗浄後、
吸着画分を0.8M→OM硫酸アンモニウム直線勾配で
溶出させた。(勾配の全容量は、300mlで行なった
。)カラムからの溶出液を2ml画分毎に集め、その後
、集めた各フラクションをSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって検定し、その結果をもとに、co
rexタンパク画分を集めた。その画分は、56ml中
にタンパク4mgを含有していた。
【0047】以上の精製法により、HCVKMR3
5gにつきcorexタンパク4mgを得た。SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による評価では、純度
95%以上であった。
5gにつきcorexタンパク4mgを得た。SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による評価では、純度
95%以上であった。
【0048】図1にcorexタンパクの各精製工程で
の純度をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べた結果を示す。
の純度をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べた結果を示す。
【0049】Lane1:corexタンパクを産生し
ているHCVKMR3のペレットをグアニジン塩酸を含
有した緩衝液で懸濁、続いて超音波処理した処理液を遠
心分離し、得た上清。
ているHCVKMR3のペレットをグアニジン塩酸を含
有した緩衝液で懸濁、続いて超音波処理した処理液を遠
心分離し、得た上清。
【0050】Lane2:上記処理液を遠心分離し、得
た沈殿物 Lane3:Lane1の上清に対して、ゲル濾過クロ
マトグラフィーを行なって得られたcorexタンパク
画分 Lane4:Lane3のcorexタンパク画分に対
し緩衝液交換、硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性
クロマトグラフィーを行なって得られたcorexタン
パク画分(精製タンパク試料) 比較例1 実施例1で得られた凍結HCVKMR3ペレット5gを
解凍し、ペレット1gにつき抽出用緩衝液4mlの比率
で懸濁した。抽出用緩衝液の組成は、pH7.0の10
mMリン酸緩衝液とした。
た沈殿物 Lane3:Lane1の上清に対して、ゲル濾過クロ
マトグラフィーを行なって得られたcorexタンパク
画分 Lane4:Lane3のcorexタンパク画分に対
し緩衝液交換、硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性
クロマトグラフィーを行なって得られたcorexタン
パク画分(精製タンパク試料) 比較例1 実施例1で得られた凍結HCVKMR3ペレット5gを
解凍し、ペレット1gにつき抽出用緩衝液4mlの比率
で懸濁した。抽出用緩衝液の組成は、pH7.0の10
mMリン酸緩衝液とした。
【0051】該懸濁物を超音波処理によりcorexタ
ンパクを抽出し、遠心分離し、上清(15ml)を得た
。上清の全タンパク量は、1100mgであった。
ンパクを抽出し、遠心分離し、上清(15ml)を得た
。上清の全タンパク量は、1100mgであった。
【0052】得られた上清(15ml)を20mMリン
酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対して、2回透析
することで、緩衝液交換した。
酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対して、2回透析
することで、緩衝液交換した。
【0053】尚、1回の透析時間は5hrで、4℃で行
なった。
なった。
【0054】次に、該交換液に対して、展開用緩衝液を
20mMリン酸緩衝液(pH7.0)とし、担体として
Sephacryl S−300HR(pharma
cia社製)を使用したゲル濾過クロマトグラフィーを
行なった。
20mMリン酸緩衝液(pH7.0)とし、担体として
Sephacryl S−300HR(pharma
cia社製)を使用したゲル濾過クロマトグラフィーを
行なった。
【0055】使用カラムは、内径4cm、長さ150c
mで担体容量は、1.8リットルであった。流速は36
ml/hrで行なった。
mで担体容量は、1.8リットルであった。流速は36
ml/hrで行なった。
【0056】カラムからの溶出液を7ml画分毎に集め
、その後、集めたフラクションをSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって検定し、そのデータを元に
して、corexタンパク画分を集めた。該corex
タンパク画分は白濁しており、150ml中にタンパク
質900mgを含有していた。
、その後、集めたフラクションをSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって検定し、そのデータを元に
して、corexタンパク画分を集めた。該corex
タンパク画分は白濁しており、150ml中にタンパク
質900mgを含有していた。
【0057】次に、上記corexタンパク画分に対し
て、疎水性クロマトグラフィーを行うために、まず最終
濃度6Mになるように粉末尿素を添加、溶解した。
て、疎水性クロマトグラフィーを行うために、まず最終
濃度6Mになるように粉末尿素を添加、溶解した。
【0058】次に、該溶解液を6M尿素を含んだ10m
Mリン酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対して、2
回透析することで、緩衝液交換を行なった。尚、1回の
透析時間は5hrで4℃で行なった。
Mリン酸緩衝液(pH7.0)2リットルに対して、2
回透析することで、緩衝液交換を行なった。尚、1回の
透析時間は5hrで4℃で行なった。
【0059】続いて、該透析液に硫酸アンモニウム濃度
0.8Mになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。
0.8Mになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。
【0060】最後に該溶解液に対して、疎水性クロマト
グラフィーを行なった。まず、出発用緩衝液を0.8M
硫酸アンモニウム、6M尿素を含んだ10mMリン酸緩
衝液(pH7.0)とし、担体としてButyl−To
yopearl(東ソ−(株)社製)を使用するカラム
を作製した。上記の溶解液170mlを作製したカラム
にかけた。
グラフィーを行なった。まず、出発用緩衝液を0.8M
硫酸アンモニウム、6M尿素を含んだ10mMリン酸緩
衝液(pH7.0)とし、担体としてButyl−To
yopearl(東ソ−(株)社製)を使用するカラム
を作製した。上記の溶解液170mlを作製したカラム
にかけた。
【0061】尚、作製したカラムは、内径1.4cm,
長さ18cmで担体容量25mlのものであった。又、
流速は14ml/hrで行なった。
長さ18cmで担体容量25mlのものであった。又、
流速は14ml/hrで行なった。
【0062】カラムにかけた後、出発用緩衝液100m
lでカラムを洗浄し未吸着画分を溶出した。
lでカラムを洗浄し未吸着画分を溶出した。
【0063】洗浄後、吸着画分を0.8→0M硫酸アン
モニウム直線勾配で溶出させた。(勾配の全容量は、3
00mlで行なった。)カラムからの溶出液を3ml画
分毎に集め、その後集めたフラクションをSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって検定し、そのデー
タを元にcorexタンパク画分を集めた。
モニウム直線勾配で溶出させた。(勾配の全容量は、3
00mlで行なった。)カラムからの溶出液を3ml画
分毎に集め、その後集めたフラクションをSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって検定し、そのデー
タを元にcorexタンパク画分を集めた。
【0064】その画分は、100ml中にタンパク22
mgを含有していた。SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による評価では、純度約6%以下であった。
mgを含有していた。SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による評価では、純度約6%以下であった。
【0065】図2に、比較例1で行なったcorexタ
ンパクの各精製工程での純度をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。
ンパクの各精製工程での純度をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。
【0066】Lane1:corexタンパクを産生し
ているHCVKMR3のペレットを2−メルカプトエタ
ール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液で懸濁、続
いて超音波処理した処理液を遠心分離し、得た上清La
ne2:上記処理液を遠心分離し、得た沈殿物Lane
3:Lane1の上清に対して、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを行なって得られたcorexタンパク画分La
ne4:Lane3のcorexタンパク画分に対し緩
衝液交換硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性クロマ
トグラフィーを行なって得られたcorexタンパク画
分である。
ているHCVKMR3のペレットを2−メルカプトエタ
ール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液で懸濁、続
いて超音波処理した処理液を遠心分離し、得た上清La
ne2:上記処理液を遠心分離し、得た沈殿物Lane
3:Lane1の上清に対して、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを行なって得られたcorexタンパク画分La
ne4:Lane3のcorexタンパク画分に対し緩
衝液交換硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性クロマ
トグラフィーを行なって得られたcorexタンパク画
分である。
【0067】以上の結果よりcorexタンパクを産生
しているHCVKMR3のペレットを2−メルカプトエ
タール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液を使用し
て抽出した場合、抽出効率が低く、抽出操作後、遠心分
離した沈殿物にかなりcorexタンパクが残っている
、(デンシドメトリーによる分析で、約40%程のco
rexタンパクが残っていることが判った)又、得られ
た上清に対して、グアニジン塩酸を含有しない展開用緩
衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィーを行なった
場合、corexタンパクが核酸および他の不純タンパ
クと凝集するため、効果的に精製されず、上記ゲル濾過
クロマトグラフィーのcorexタンパク画分に対して
、実施例1と同様な疎水性クロマトグラフィーを行なっ
ても、得られたcorexタンパク画分の該タンパクの
純度は悪いものになっていることがわかった。
しているHCVKMR3のペレットを2−メルカプトエ
タール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液を使用し
て抽出した場合、抽出効率が低く、抽出操作後、遠心分
離した沈殿物にかなりcorexタンパクが残っている
、(デンシドメトリーによる分析で、約40%程のco
rexタンパクが残っていることが判った)又、得られ
た上清に対して、グアニジン塩酸を含有しない展開用緩
衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィーを行なった
場合、corexタンパクが核酸および他の不純タンパ
クと凝集するため、効果的に精製されず、上記ゲル濾過
クロマトグラフィーのcorexタンパク画分に対して
、実施例1と同様な疎水性クロマトグラフィーを行なっ
ても、得られたcorexタンパク画分の該タンパクの
純度は悪いものになっていることがわかった。
【0068】実施例1と比較例1の比較から、本発明に
よりcorexタンパクが該タンパクを産生しているH
CVKMR3から高収率で抽出され、該抽出物に対して
、本法の方法で精製することで、該タンパクと大腸菌内
の核酸および他の不純タンパクとの凝集が阻止される。
よりcorexタンパクが該タンパクを産生しているH
CVKMR3から高収率で抽出され、該抽出物に対して
、本法の方法で精製することで、該タンパクと大腸菌内
の核酸および他の不純タンパクとの凝集が阻止される。
【0069】又、本法によって得られたcorexタン
パク画分は、公知の一般的な方法でさらに精製できるこ
とが判明した。
パク画分は、公知の一般的な方法でさらに精製できるこ
とが判明した。
【0070】比較例2
実施例1で得られた凍結HCVKMR3ペレットを解凍
し、ペレット1gにつき、表1に示す組成の各々の緩衝
液4mlの割合でそれぞれ懸濁し、該懸濁物を超音波処
理後遠心分離(15000rpm,4℃,30min)
し、上清4mlと沈殿物を得た。
し、ペレット1gにつき、表1に示す組成の各々の緩衝
液4mlの割合でそれぞれ懸濁し、該懸濁物を超音波処
理後遠心分離(15000rpm,4℃,30min)
し、上清4mlと沈殿物を得た。
【0071】
【表1】
【0072】得られた沈殿物および上清をそれぞれ別々
にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルを
クーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデン
シドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上の
corexタンパクのバンドの濃さを上清と沈殿とで比
較し、上清に抽出された割合を抽出効率として求め、そ
れぞれ表2に示した。
にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルを
クーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデン
シドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上の
corexタンパクのバンドの濃さを上清と沈殿とで比
較し、上清に抽出された割合を抽出効率として求め、そ
れぞれ表2に示した。
【0073】又、上清を電気泳動したゲル上のcore
xタンパクのバンドの濃さを表1の1〜5の緩衝液間で
比較した。表1の緩衝液5を使用して得られた上清のc
orexタンパクのバンドの濃さを100%とし、表1
の緩衝液1〜4を用いて、抽出して得られた上清のco
rexタンパクのバンドの濃さをcorexタンパク相
対量として表わした。(表2)
xタンパクのバンドの濃さを表1の1〜5の緩衝液間で
比較した。表1の緩衝液5を使用して得られた上清のc
orexタンパクのバンドの濃さを100%とし、表1
の緩衝液1〜4を用いて、抽出して得られた上清のco
rexタンパクのバンドの濃さをcorexタンパク相
対量として表わした。(表2)
【0074】
【表2】
【0075】表1の1.2で示されている変性剤を含有
しない緩衝液を使用した場合、表2に示す通り、抽出効
率が低い。
しない緩衝液を使用した場合、表2に示す通り、抽出効
率が低い。
【0076】又、表1の緩衝液3,緩衝液4を使用した
場合、抽出効率は100%であるが、緩衝液5で抽出し
た時のcorexタンパク量を100%とした場合、c
orexタンパク相対量はそれぞれ30%,60%と少
ない。
場合、抽出効率は100%であるが、緩衝液5で抽出し
た時のcorexタンパク量を100%とした場合、c
orexタンパク相対量はそれぞれ30%,60%と少
ない。
【0077】これは、抽出操作時に大腸菌内のプロテア
ーゼによりcorexタンパクが分解されていることが
原因と考えられる。
ーゼによりcorexタンパクが分解されていることが
原因と考えられる。
【図1】実施例1のSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたcorexタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。
気泳動で調べたcorexタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。
【図2】比較例1のSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたcorexタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。
気泳動で調べたcorexタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項1】 大腸菌によって産生されたヒトC型肝
炎ウイルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原領域を
含むタンパクを2−メルカプトエタノール及びグアニジ
ン塩酸を含有する緩衝液で抽出した後、グアニジン塩酸
を含有する緩衝液存在下でゲル濾過クロマトグラフィー
を行って分取することを特徴とするタンパクの精製方法
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8676491A JP3040190B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | タンパクの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8676491A JP3040190B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | タンパクの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04320693A true JPH04320693A (ja) | 1992-11-11 |
JP3040190B2 JP3040190B2 (ja) | 2000-05-08 |
Family
ID=13895816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8676491A Expired - Fee Related JP3040190B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | タンパクの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3040190B2 (ja) |
-
1991
- 1991-04-18 JP JP8676491A patent/JP3040190B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3040190B2 (ja) | 2000-05-08 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100303 Year of fee payment: 10 |
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LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |