CN105622761B - 一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用 - Google Patents

一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用，将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体。本发明核心内容是将凝集素蛋白单体通过分子生物学和基因工程技术改造成为凝集素蛋白寡聚复合体。本发明通过凝血实验效果检测证明：所述凝集素蛋白寡聚复合体和原单体蛋白相比具有显著增强的凝血活性，且其效果随复合体中单体数目的增加而增加，表明所述各凝集素蛋白寡聚复合体具有更强的结合糖链的能力。本发明利用基因工程手段克隆构建并表达了凝集素蛋白寡聚复合体，实现了各凝集素蛋白寡聚复合体的大量重组表达。

Description

一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用。
背景技术
凝集素是生物体中能够与糖链物质特异性识别并结合的一类蛋白质分子。在生物体中，凝集素的功能涉及细胞与细胞间的识别与交流，细胞信号的传导，病原体的侵染及其与宿主间的相互作用，疾病的发生及免疫系统的调节等方面。凝集素在医学上被广泛用于抗病毒药物的研发，在农业生产领域，也可被用作抵抗病虫害的生物制剂等。
在病毒侵染宿主过程中，病毒糖蛋白与宿主细胞受体蛋白间的识别与互作是介导病毒进入宿主细胞的第一步。研究表明，一些凝集素分子能够竞争性结合病毒表面的糖蛋白，而减少和抑制其与宿主细胞表面受体蛋白间的结合，从而阻止病毒侵染宿主细胞。凝集素与病毒糖蛋白间的结合效力越强，对病毒侵染宿主细胞的抑制能力也就越强，而凝集素与糖蛋白间的结合效力与凝集素分子上具有的糖链结合位点数相关，即糖链结合位点数越多，其结合糖蛋白的能力也越强。
此前已有研究发现来自于Microcystis aeruginosa的凝集素microvirin(MVN)具有较强的抵抗艾滋病病毒(HIV)侵染的能力，MVN可以特异性的结合含甘露糖结构的糖链，且该凝集素单体蛋白上仅有一个糖链结合位点，因此，如果构建具有多个MVN单体的凝集素寡聚复合体蛋白，将会使其分子具有更多的糖链结合位点，从而增强其结合病毒和阻抑病毒侵染宿主细胞的能力。
发明内容
本发明的目的是应用分子生物学与基因工程技术，提供一种新的凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法。
本发明的另一目的是提供上述方法构建的凝集素蛋白寡聚复合体。
本发明的又一目的是利用上述凝集素蛋白寡聚复合体构建方法构建的凝集素蛋白寡聚复合体在实际中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案来实现：
一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法，将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体。上述的凝集素为包含MVN在内的所有类型的凝集素。本发明所述的构建方法适用于所有凝集素的蛋白寡聚复合体的构建，并不仅限于MVN。
优选的，所述的凝集素蛋白寡聚复合体为凝集素蛋白单体按串联顺序排列的凝集素蛋白二聚体、凝集素蛋白三聚体、凝集素蛋白四聚体及四个以上凝集素蛋白单体组成的复合体，且各凝集素蛋白单体之间具有间隔序列。
所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间。
所述的凝集素蛋白二聚体为MVN-Di2、MVN-Di6和MVN-Di10；所述的凝集素蛋白三聚体为MVN-Tri2、MVN-Tri6和MVN-Tri10；所述的MVN四聚体为MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10；
上述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体的构建过程为：
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di2的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示的MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI2 Rev、MVN-BamHI2 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di2中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di2中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di6的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI6 Rev、MVN-BamHI6 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di6中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di6中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di10的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI10 Rev、MVN-BamHI10 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di10中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di10中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di10的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri2的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev、MVN-EcorI2 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di2中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri2中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri6的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6 Rev、MVN-EcorI6 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di6中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri6中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri10的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI10 For/MVN-EcorI10 Rev、MVN-EcorI10For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di10中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri10中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri10的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev、MVN-SacI2 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI6 For/MVN-SacI6 Rev、MVN-SacI6 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体：以SEQ ID No.1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev、MVN-SacI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体。
上述引物的序列分别为：
MVN-NdeI For GGAATTCCATATGCCGAACTTCTCTCACACCTG
MVN-XhoI Rev CCGCTCGAGACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-BamHI2 For CGCGGATCCATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-BamHI2 Rev CGCGGATCCACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-EcorI2 For CGCGAATTCATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-EcorI2 Rev CGCGAATTCACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-SacI2 For CGCGAGCTCATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-SacI2 Rev CGCGAGCTCACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-BamHI6 For CGCGGATCC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-BamHI6 Rev CGCGGATCC ACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-EcorI6 For CGCGAATTC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-EcorI6 Rev CGCGAATTC ACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-SacI6 For CGCGAGCTC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-SacI6 Rev CGCGAGCTC ACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-BamHI10 For CGCGGATCC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-BamHI10 Rev CGCGGATCC ACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-EcorI10 For CGCGAATTC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
MVN-EcorI10 Rev CGCGAATTC ACCGATTTCCAGCTGAGAGTC
MVN-SacI10 For CGCGAGCTC ATGCCGAACTTCTCTCACACC
上述的方法构建的凝集素蛋白寡聚复合体，所述的二聚体为MVN-Di2、MVN-Di6和MVN-Di10；所述的三聚体为MVN-Tri2、MVN-Tri6和MVN-Tri10；所述的四聚体为MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10；
所述MVN-Di2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，
所述MVN-Di6的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，
所述MVN-Di10的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述MVN-Tri2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，
所述MVN-Tri6的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，
所述MVN-Tri10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述MVN-Tetra2的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，
所述MVN-Tetra6的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，
所述MVN-Tetra10的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
上述凝集素蛋白寡聚复合体的编码基因，该编码基因为下述核苷酸序列之一：
(1)编码序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸；
(2)序列表中SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。
用于表达上述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
上述的凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，其中所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间。
所述的转基因重组菌是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达凝集素蛋白寡聚复合体的转基因重组菌。
一种制备凝集素蛋白寡聚复合体的方法，培养含有凝集素蛋白寡聚复合体系列编码基因的细胞系或培养上述的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物并进行纯化得到目标产物。
所述的凝集素蛋白寡聚复合体在抵抗病毒侵染及细胞凝集效应中的应用。
上述凝集素单体蛋白的编码基因为SEQ ID No.1(GI:327533543)。
上述各MVN蛋白寡聚复合体载体的构建，以来自于Microcystis aeruginosa的MVN蛋白单体为基本单位，将多个MVN单体的核酸序列依次顺序克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中，从而获得MVN二聚体、三聚体、四聚体等更多的寡聚蛋白复合体表达序列；MVN单体表达载体是以单个MVN单体片段插入NdeI和XhoI两个酶切位点之间，MVN二聚体载体以两个MVN单体片段插入NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，MVN三聚体载体以三个MVN单体片段插入NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，MVN四聚体载体以四个MVN单体片段插入NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间；串联MVN蛋白寡聚复合体序列中每个MVN单体序列间含有一定数量氨基酸残基的间隔序列，为了达到不同的蛋白复合体空间结构，间隔序列可含有不同数量和种类的氨基酸残基。
MVN的单体MVN-Mono的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
MVN二聚体MVN-Di2，MVN-Di6和MVN-Di10中Di代表二聚体，2、6和10分别代表组成蛋白寡聚体的各单体间的间隔序列所含氨基酸个数。
MVN三聚体MVN-Tri2，MVN-Tri6和MVN-Tri10中Tri代表三聚体，2、6和10分别代表组成蛋白寡聚体的各单体间的间隔序列所含氨基酸个数。
MVN四聚体MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10中Tetra代表四聚体，2、6和10分别代表组成蛋白寡聚体的各单体间的间隔序列所含氨基酸个数。
MVN复合体MVN-Di2、MVN-Tri2和MVN-Tetra2的各单体间氨基酸序列为GS；MVN复合体MVN-Di6、MVN-Tri6和MVN-Tetra6的各单体间氨基酸序列为GSGSGG；MVN复合体MVN-Di10、MVN-Tri10和MVN-Tetra10的各单体间氨基酸序列为GGSGGSGGSG。
包含上述重组表达载体的转基因重组表达菌株。该重组菌是将上述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达各蛋白复合体的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述各转基因重组菌在进行诱导表达和纯化后可产生相应的各MVN蛋白寡聚复合体产物。
本发明的有益效果
本发明经过研究发现，各MVN蛋白寡聚复合体产物都能够在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，寡聚复合体蛋白的凝血活性得到明显增强，和糖配体间的结合效力均强于其单体蛋白，随着复合体中MVN单体数目的增加，复合体分子结合糖链的效力也不断加强。
本发明提出了MVN蛋白寡聚复合体在抗病毒药物研发中的应用。MVN蛋白寡聚复合体由于具有比单体更强的糖链结合效力，也将具有更高的病毒颗粒(如HIV)结合力和更强的抑制病毒侵染的能力，因而可将这种MVN蛋白寡聚复合体用于生产高效的抗病毒类药物。
附图说明
图1为各MVN蛋白寡聚复合体在大肠杆菌中表达后的重组蛋白SDS-PAGE电泳图
注：M，蛋白质分子量标准；1，MVN-Mono；2，MVN-Di2；3，MVN-Di6；4，MVN-Di10；5，MVN-Tri2；6，MVN-Tri6；7，MVN-Tri10；8，MVN-Tetra2；9，MVN-Tetra6；10，MVN-Tetra10
图2为各MVN蛋白寡聚复合体重组蛋白对兔血红细胞的凝集效应比较。
注：1X，未稀释MVN蛋白寡聚复合体溶液；2X，2倍稀释MVN蛋白寡聚复合体溶液；4X，4倍稀释MVN蛋白寡聚复合体溶液；8X，8倍稀释MVN蛋白寡聚复合体溶液；16X，16倍稀释MVN蛋白寡聚复合体溶液；Neg，不含任何蛋白的阴性对照
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。
实验材料和试剂
1、菌株和载体：
MVN单体基因序列由NCBI数据库(GI:327533543)中获得，进而由南京钟鼎生物技术有限公司化学合成其单体DNA基因序列(SEQ ID No.1)大肠杆菌Top10、BL21(DE3)菌株均购自天根生化生物科技有限公司，表达载体pET30a(+)购自Novagen公司。
2、酶类及其他生化试剂：
DNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司，protein marker和限制性内切酶、T4连接酶购自Thermo Scientific公司；AxyPrep DNA胶回收试剂盒和AxyPrep载体提取试剂盒为Axygen公司产品。其他常规试剂购自上海生工或南京寿德公司。
3、本发明中所使用的生物化学与分子生物学技术、基因工程技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的部分进行，包括：[美]J.沙姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。
实施例1各MVN蛋白寡聚复合体表达载体的构建
从NCBI数据库中获取MVN基因序列(GI:327533543)，交由生物技术公司合成其DNA序列(SEQ ID No.1)作为后续PCR扩增的模板。设计两端含有不同酶切位点序列及单体间间隔序列的MVN基因扩增引物，引物的种类和序列如下表(单下划线表示酶切位点序列，双下划线处为添加的单体间间隔序列)：
PCR扩增采用Takara公司提供的PCR试剂盒，以cDNA为模板，P1-F和P1-R进行PCR扩增。PCR循环参数：预变性98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s共进行35个循环；72℃再延伸10min。
采用Axygen公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化。将纯化后的目的基因和接纳载体pET30a(+)分别进行双酶切，双酶切后的目的基因和载体进行切胶回收并连接。
将连接产物转化大肠杆菌TOP10。将转化后的细胞涂布于含有Kana的LB琼脂平板，培养过夜。从平板上挑取菌落PCR验证，阳性克隆送样测序，得到完全正确的克隆菌株。
MVN单体MVN-Mono表达载体构建：以上述公司合成的MVN单体基因序列(SEQ IDNo.1)为模板，由上游引物MVN-NdeI For和下游引物MVN-XhoI Rev扩增所获的MVN片段经NdeI和XhoI酶切后连接至pET30a(+)载体。
MVN-Di2，MVN-Di6和MVN-Di10(二聚体)表达载体构建：先将MVN扩增片段(MVN-NdeI For/MVN-BamHI2 Rev，MVN-NdeI For/MVN-BamHI6 Rev和MVN-NdeI For/MVN-BamHI10Rev)经NdeI和BamHI酶切后连接至pET-30a载体，构成各自的中间载体Ⅰ；再将MVN扩增片段(MVN-BamHI2 For/MVN-XhoI Rev，MVN-BamHI6 For/MVN-XhoI Rev和MVN-BamHI10 For/MVN-XhoI Rev)经BamHI和XhoI酶切后分别对应连接至上述中间载体Ⅰ中，构成各MVN二聚体表达载体。
MVN-tri2，MVN-tri6和MVN-tri10(三聚体)表达载体构建：在上述中间载体Ⅰ的基础上，先将MVN扩增片段(MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev，MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6Rev和MVN-BamHI10 For/MVN-EcorI10 Rev)经BamHI和EcorI酶切后分别对应连接至中间载体Ⅰ，构建各自的中间载体Ⅱ；再将MVN扩增片段(MVN-EcorI2 For/MVN-XhoI Rev，MVN-EcorI6 For/MVN-XhoI Rev和MVN-EcorI10 For/MVN-XhoI Rev)经EcorI和XhoI酶切后分别对应连接至各中间载体Ⅱ中，构建各MVN三聚体表达载体。
MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10(四聚体)表达载体构建：在上述中间载体Ⅱ的基础上，先将MVN扩增片段(MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev，MVN-EcorI6For/MVN-SacI6 Rev和MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev)经EcorI1和SacI酶切后对应连入各中间载体Ⅱ中，构成各中间载体Ⅲ；再将MVN扩增片段(MVN-SacI2 For/MVN-XhoI Rev，MVN-SacI6 For/MVN-XhoI Rev和MVN-SacI10 For/MVN-XhoI Rev)经SacI和XhoI酶切后分别对应连接至中间载体Ⅲ中，构建各MVN四聚体表达载体。
上述各表达载体的详细构建过程为：
MVN二聚体MVN-Di2表达载体构建：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI2 Rev、MVN-BamHI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di2中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di2中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di2的重组表达载体；
表达所述二聚体MVN-Di6的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI6 Rev、MVN-BamHI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di6中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di6中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di6的重组表达载体；
表达所述二聚体MVN-Di10的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI10 Rev、MVN-BamHI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di10中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di10中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di10的重组表达载体；
表达所述三聚体MVN-Tri2的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev、MVN-EcorI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di2中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri2中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri2的重组表达载体；
表达所述三聚体MVN-Tri6的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6 Rev、MVN-EcorI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di6中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri6中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri6的重组表达载体；
表达所述三聚体MVN-Tri10的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-BamHI10 For/MVN-EcorI10 Rev、MVN-EcorI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di10中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri10中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri10的重组表达载体；
表达所述四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev、MVN-SacI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体；
表达所述四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-EcorI6 For/MVN-SacI6 Rev、MVN-SacI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体；
表达所述四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体：以MVN基因序列(SEQ ID No.1)为模板采用两对引物MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev、MVN-SacI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体。
抽提含有各正确目的片段的菌株的质粒载体，继而将载体转化进表达工程菌BL21(DE3)用于各MVN蛋白寡聚复合体的表达。
实验例2各MVN蛋白寡聚复合体在大肠杆菌中的诱导与表达：
将经鉴定后的各重组表达载体转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中。置于37℃培养箱中培养至长成大小合适的菌落。挑取含有重组载体的转化子分别接种至含kana(50μg/mL)的LB液体培养液，置摇床37℃，250r/min震荡培养过夜。按1％接种量(v/v)转接至新鲜LB(400mL)培养液中，37℃，250r/min振荡培养至对数期(OD600≈0.6-0.8)，分别加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mmol/L，置25℃摇床，250r/min诱导表达3h。
实施例3各重组表达蛋白的纯化：
取适量实施例2方法进行诱导表达的重组菌培养液，4800g/min离心20min收集菌体，菌体重悬于裂解液10mL(pH7.5 50mM NaCl；50mM Tris-HCl；1％Triton)缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品13000r/min,4℃离心20min取上清即为粗酶液。
由于各表达载体表达产物C端均带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和纯化。首先用洗脱液平衡柱子(pH8.0 50mM NaCl 50mM Tris-HCl)，将粗酶液负载上柱；采用5倍体积洗脱液(pH 8.0 50mM NaCl 50mM Tris-HCl10mM咪唑)进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液(pH 8.0 50mM NaCl 50mM Tris-HCl 250mM咪唑)收集目的蛋白。保存目的蛋白于-80℃，用于后续实验。
实验例4各MVN蛋白寡聚复合体的凝血活性检测：
取新鲜兔子静脉血与等体积1X抗凝剂溶液充分混合，置于4℃中待用。1000X抗凝剂母液配方如下：
二水合柠檬酸三钠：8g
柠檬酸：0.5g
葡萄糖：20.5g
氯化钠：4.2g
蒸馏水定容至1000ml。
血细胞的清洗：
取20μl兔子静脉血与1X抗凝剂的混合液，于1000g离心5min，弃去上清液，加1ml新鲜的1×抗凝剂溶液，使血细胞重新悬浮于抗凝剂溶液中。
再重复上一操作两次，并最终将血细胞溶解于1ml新鲜抗凝剂溶液中待用。
凝集素凝血活性测试：
在V形96孔板上加入梯度稀释的纯化MVN蛋白寡聚复合体溶液每孔25μl，再将上述经洗涤后的血细胞溶液依次点入含有不同浓度MVN蛋白复合体溶液中，每孔加血细胞溶液25μl，充分混匀后在室温下放置30min-1h，观察比较各孔中血细胞的凝集效果。
凝血实验效果检测证明：所述MVN蛋白寡聚复合体和原单体蛋白相比具有显著增强的凝血活性，且其效果随复合体中单体数目的增加而增加，由于凝集素凝集血细胞的作用是通过其与细胞表面的糖链结构的结合来实现的，因而该结果也表明所述各MVN蛋白寡聚复合体具有更强的结合糖链的能力。

Claims (7)

1.一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法，其特征在于将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体；
所述的凝集素蛋白寡聚复合体为凝集素蛋白单体按串联顺序排列的凝集素蛋白二聚体、凝集素蛋白三聚体、凝集素蛋白四聚体及四个以上凝集素蛋白单体组成的复合体，且各凝集素蛋白单体之间具有间隔序列；
所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间；
所述的凝集素蛋白二聚体为MVN-Di2、MVN-Di6和MVN-Di10；所述的凝集素蛋白三聚体为MVN-Tri2、MVN-Tri6和MVN-Tri10；所述的凝集素蛋白四聚体为MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10；上述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体的构建过程为：
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示的MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI2 Rev、MVN-BamHI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di2中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di2中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI6 Rev、MVN-BamHI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di6中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di6中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-NdeI For/MVN-BamHI10 Rev、MVN-BamHI10 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di10中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN-Di10中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN-Di10的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev、MVN-EcorI2 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di2中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri2中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6 Rev、MVN-EcorI6 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di6中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri6中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI10 For/MVN-EcorI10 Rev、MVN-EcorI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Di10中间载体Ⅰ，构建MVN-Tri10中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri10的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev、 MVN-SacI2 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri2中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra2中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI6 For/MVN-SacI6 Rev、 MVN-SacI6 For/MVN-XhoIRev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri6中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra6中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体；
表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev、 MVN-SacI10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN-Tri10中间载体Ⅱ，构建MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN-Tetra10中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra10的重组表达载体；
所述引物的序列分别为：
2.采用权利要求1所述的方法构建的凝集素蛋白寡聚复合体，其特征在于所述的二聚体为MVN-Di2、MVN-Di6和MVN-Di10；所述的三聚体为MVN-Tri2、MVN-Tri6和MVN-Tri10；所述的四聚体为MVN-Tetra2，MVN-Tetra6和MVN-Tetra10；
所述MVN-Di2的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，
所述MVN-Di6的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示，
所述MVN-Di10的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述MVN-Tri2的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，
所述MVN-Tri6的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示，
所述MVN-Tri10的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；
所述MVN-Tetra2的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示，
所述MVN-Tetra6的氨基酸序列如SEQ ID No. 11所示，
所述MVN-Tetra10的氨基酸序列如SEQ ID No. 12所示。
3.权利要求2所述凝集素蛋白寡聚复合体的编码基因，其特征在于：该编码基因为下述核苷酸序列之一：
（1）编码序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的多核苷酸；
（2）序列表中SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。
4.用于表达权利要求2中所述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间。
6.根据权利要求4所述的转基因重组菌，其特征在于所述的转基因重组菌是将权利要求5中所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达凝集素蛋白寡聚复合体的转基因重组菌。
7.一种制备MVN蛋白寡聚复合体的方法，其特征在于：培养含有凝集素蛋白寡聚复合体系列编码基因的细胞系或培养如权利要求6所述的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物并进行纯化得到目标产物。
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